一种集成微流控芯片及其用于活细胞控制与分析的应用
专利汇可以提供一种集成微流控芯片及其用于活细胞控制与分析的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种适用于不同种类细胞 定位 、培养和相互作用的集成微流控芯片，由流动层、控制层和 覆盖 层 ( 自上而下 )三层组成。其中，流动层主要由一个微米级管道网络和四个圆形腔组成，通过细管道将相邻的腔体两两连接，该层总共有十个进出样口。控制层由数个单管道末端封闭的微 阀 开关 组成，可以分别 对流 动层不同管道 位置 的样品输入和输出进行时间和空间的控制。本发明的集成微流控芯片具有制备材料优质、制备方法重复性强、应用范围广的优点。可开展对多种类细胞的定位共培养及相互作用研究。，下面是一种集成微流控芯片及其用于活细胞控制与分析的应用专利的具体信息内容。
1、一种集成微流控芯片，其特征在于，该集成微流控芯片自上而下设 有流动层、控制层和覆盖层，其中，流动层主要由一个微米级管道网络和四 个圆形细胞培养腔组成，流动层周边设有八个进样口和两个出样口，中间设 有四个圆形细胞培养腔，圆形细胞培养腔之间通过细管道相连；控制层设有 二十八个进气口，进气口上分别连接单个管道末端封闭的微阀开关；覆盖层 则是对控制层的管道进行封装。
2、如权利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于，所述集成微流 控芯片的材料为聚二甲基硅氧烷，或者是已知的弹性高分子材料、玻璃及其 硅相结合的芯片材料。
3、如权利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于，所述的控制层 进气口上的微阀开关，分别用于对流动层不同管道位置的样品输入和输出进 行时间和空间的控制。
4、权利要求1所述的集成微流控芯片的制备方法，其特征在于：该方 法首先将流动层和控制层的设计结构制成光掩膜；然后进行光刻胶涂膜、紫 外曝光、显影，制备芯片模子；最后将聚二甲基硅氧烷或其他已知的弹性高 分子材料覆盖于芯片模子表面，烘烤固化，显微镜下将流动层和控制层校对 粘合，再将控制层与覆盖层粘合封装，制成集成微流控芯片。
5、权利要求1所述的集成微流控芯片用于活细胞控制与分析的应用。
6、如权利要求5所述的应用，其特征在于，对两种以上不同种类的细 胞在集成微流控芯片的不同区域进行定位接种和共培养以及开展多种细胞 的相互作用研究。
7、如权利要求5所述的应用，其特征在于，通过细管道将相邻的圆形 细胞培养腔直接两两连接，便于不同区域培养的不同种类细胞的相互作用。
技术领域
本发明涉及一种微流控芯片，尤其是一种集成微流控芯片，应用该集成 微流控芯片能够进行时间与空间控制不同种类细胞的定位培养及相互作用 研究。
背景技术
由于在高通量、微型化、集成化、自动化和便携化等方面的巨大发展潜 力，近十几年来，微流控芯片技术受到了国内外生物化学、分析化学、分子 毒理学、环境医学和预防医学等领域的高度重视，也成为21世纪最为重要的 前沿技术之一。目前，基于微流控芯片技术的基因分析、蛋白质(酶)分析、 核酸分析、免疫分析等方面的应用，已取得很大的进展。此外，基于微流控 芯片技术的单细胞研究也正在有条不紊地进行。国外已初步实现了微米级管 道或腔内的多种类型活细胞培养【R.Gomez-Sjoberg，A.A.Leyrat，D.M. Pirone，et al.，Anal.Chem.2007，79(22)：8557-8563.】及其实时分析；同时产 生了一批以基于活细胞的药物筛选与分析系统、细胞传感器等为代表分析设 备【P.J.Lee，P.J.Hung，V.M.Rao，et al.，Biotechnol.Bioeng.2006，94(1)： 5-14.】，其简单、快捷、高通量和高敏感性优势，在很大程度上促进了生命 科学研究进展，同时也进一步加速了该技术的多元化、市场化，从而服务于 社会。
然而，微流控芯片技术在细胞生物学领域的应用仍处于发展阶段，尤其 涉及到细胞精确控制与定位以及细胞-细胞相互作用方面。针对细胞的控制 与定位，现多采用表面化学修饰法来实现细胞的黏附与脱离【E.E.Hui，S.N. Bhatia，PNAS 2007，104(14)：5722-5726.】，且这种方法具有不可逆性和非重 复性。关于细胞相互作用的微流控芯片，目前也仅实现了简单的平行单管道 水平【A.P.Wong，R.Perez-Castillejos，L.J.Christopher，et al.，Biomaterials 2008， 29(12)：1853-1861.】。因此，建立一种多功能集成的微流控芯片分析系统与 平台，实施细胞的精确控制与定位，开展细胞相互作用研究，不仅有利于研 究工作的简单、高效、快速的展开，同时也有利于加快所获得技术成果的市 场化应用。
发明内容
为了实现上述任务，本发明采用如下的技术解决方案：
一种集成微流控芯片，其特征在于，该集成微流控芯片自上而下设有流 动层、控制层和覆盖层，其中，流动层主要由一个微米级管道网络和四个圆 形细胞培养腔组成，流动层周边设有八个进样口和两个出样口，中间设有四 个圆形细胞培养腔，圆形细胞培养腔之间通过细管道相连；控制层设有二十 八个进气口，进气口上分别连接单个管道末端封闭的微阀开关；覆盖层则是 对控制层的管道进行封装。
上述集成微流控芯片的制备方法，其特征在于，采用软光刻技术，首先 将流动层和控制层的设计结构制成光掩膜；然后进行光刻胶涂膜、紫外曝光、 显影，制备芯片模子；最后将聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其它已知的弹性 高分子材料覆盖于芯片模子表面，烘烤固化，显微镜下将流动层和控制层校 对粘合，再将控制层与覆盖层粘合封装，制成集成微流控芯片。
本发明具有如下优点：
1、本发明的集成微流控芯片选用聚二甲基硅氧烷(PDMS)或其它已 知的弹性高分子材料，相对于以往芯片材料(如硅、玻璃和石英等)而言， 具有更好的生物兼容性、电绝缘隔离性、热隔离性等性能，且具有优异的透 光性。以上优点便于开展活细胞为基础的相关研究。
2、本发明的集成微流控芯片的控制层微阀开关结构，可以在特定时间 对流动层特定区域进行流体的进样和出样，以及时间和空间控制各种不同类 型细胞在各自培养区的定位以及共培养。
3、本发明的集成微流控芯片具有两两连接相邻微型细胞培养区的微米 级管道设计。相邻细胞培养区的连通，便于研究不同培养区的同型和异型细 胞相互作用。
4、本发明的集成微流控芯片可开展两种以上不同类型细胞的相互作用 研究，突破了以往的两种细胞相互作用研究模式，有利于探索生理或病理情 况下各种生物体和组织器官内不同种类细胞的协作与拮抗。
附图说明
图1是集成微流控芯片的流动层和控制层平面结构示意图，其中标号分 别表示：1、2为流动层管道进样口，3、4为流动层管道出样口，5、6、7和8 为控制层微阀开关的进气口，9、10、11和12为微型细胞培养区，13为相邻 培养区的连接管道，14为控制层的微阀开关。
图2是微阀开关关闭状态的微流控芯片截面图，其中标号分别表示：21 为流动层单个管道，22为关闭状态的控制层微阀开关，23为控制层微阀开关 的进气管道，24为控制层微阀开关的进气口。
图3是流动层管道半关闭状态的微流控芯片截面图，其中标号分别表示： 31为半开启状态的微阀开关，32为低气压气体进入微阀开关管道。
图4是流动层管道完全关闭状态的微流控芯片截面图，其中标号分别表 示：41为完全开启状态的微阀开关，42为较高气压气体进入微阀开关管道。
图5是集成微流控芯片内定位接种第一种细胞的示意图，其中51为关闭 状态的微阀开关，52为完全开启状态的微阀开关，53为第一种细胞。
图6是集成微流控芯片内定位接种第一种细胞后清洗的示意图，其中61 为清洗液进入路线。
图7是集成微流控芯片内定位接种第二种细胞的示意图，其中71为第二 种细胞。
图8是集成微流控芯片内定位接种第二种细胞后清洗的示意图，其中81 为清洗液进入路线。
以下结合附图和发明人给出的实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施方式
如图1所示，本实施例制备的集成微流控芯片，由流动层、控制层和覆 盖层(自上而下)三层组成。其中，流动层周边设有八个进样口(如图标号 1、2处，每处4个)以及两个出样口(如图标号3、4处)，中间设有四个圆形 细胞培养腔(如图标号9、10、11、12)，通过细管道13将相邻的腔体两两连 接以进行细胞相互作用研究。
控制层设有共二十八个进气口(如图标号5、6、7、8处，每处7个)，分 别连接单个管道末端封闭的微阀开关。
微流控芯片的制作(以PDMS微流控芯片的制作为例)：
1、采用软光刻技术制备芯片模子，首先将流动层和控制层的设计结构 制成光掩膜；然后进行光刻胶(SU-8)涂膜、使用曝光机进行紫外曝光， 随后用显影剂进行显影，从而制备出芯片模子，其中流动层模子的厚度为40 μm；控制层模子的厚度为25μm。
2、微流控芯片的制备：将聚二甲基硅氧烷(PDMS)预聚物分别覆盖 于流动层和控制层模子表面，其中流动层所用PDMS预聚物(合成橡胶∶交联 剂，比例为5∶1)，控制层所用PDMS预聚物(合成橡胶∶交联剂，比例为20∶1)， 分别烘烤固化，然后将流动层和控制层在显微镜下校对粘合。将该双层以控 制层表面粘合于涂有均匀PDMS预聚物(合成橡胶∶交联剂，比例为5∶1)的 覆盖层的玻片上封装。最后放入烘箱内烘烤，加速层层粘合，从而制备出 PDMS集成微流控芯片。
实施例2：
控制层进气口上的微阀开关对流动层管道的控制如图2所示，进气口24 未进气时，微阀开关管道23内处于大气压状态，微阀开关22则处于关闭状态， 此时流动层管道21畅通，管道内样品可任意出入；当较低压强(20psi)气 体32进入微阀开关管道时(图3所示)，微阀开关31膨胀而呈现凸起，使流动 层管道处于半关闭状态；进一步，如图4所示，当较高压强(40psi)气体42 进入微阀开关管道时，微阀开关41与流动层管道完全紧贴，封闭了流动层管 道，从而达到控制流动层管道内样品出入的目的。
实施例3：
本实施例以微流控芯片内进行肝癌细胞和成纤维细胞定位培养为例。
1、首先将制备的实施例1中的微流控芯片进行高压灭菌，然后对流动层 管道和腔体进行清洗(采用微量注射泵进样，清洗液选用0.01M的PBS， pH＝7.4，流速25μL/min，时间15min)，再对流动层管道和腔体的表面进行 包被修饰(包被修饰物选用多聚-L-赖氨酸，100μg/mL，37℃，2h)，再清洗 (同样采用微量注射泵进样，清洗液选用0.01M的PBS，pH＝7.4，流速 25μL/min，时间15min)，无菌气体吹干，待用。
2、制备肝癌细胞和成纤维细胞悬液，本实施例中选用肝癌细胞系细胞 (HepG2细胞)和成纤维细胞系细胞(NIH 3T3细胞)，通过常规体外细胞培 养，进行细胞数目的扩增。临用时将细胞分别消化，离心，重悬，细胞密度 调整为106个细胞/mL。
3、细胞进样，首先对肝癌细胞进行进样(如图5所示)，将肝癌细胞培 养区和细胞进样路线的微阀开关关闭，其它细胞培养区和管道的微阀开关开 启，形成单一通路，配合微量注射泵，将肝癌细胞接种于特定的培养区内； 开启肝癌细胞培养区微阀开关(如图6所示)，使肝癌细胞定位于该区域，然 后对进样路线中的周边管道进行清洗(DMEM细胞培养液)，以便于进行下 一种细胞的进样，防止不同种类细胞的交叉污染。静置20min，促进细胞贴 壁。第二步，成纤维细胞进样(如图7所示)，将成纤维细胞培养区和细胞进 样路线的微阀开关关闭，其它细胞培养区和相关管道的微阀开关开启，配合 微量注射泵，将成纤维细胞接种于特定的培养区内；开启成纤维细胞培养区 微阀开关(如图8所示)，关闭该培养区，然后对进样路线中的周边管道进行 清洗，并静置10min。
4、芯片内细胞的培养，参照生物体体内状态，尽量保障相对静态的细 胞生长环境，采用隔时微量进样方式，配合微量注射泵进样功能，对芯片内 细胞进行营养的供给(细胞培养液)，每2小时进样一次，每次1min，进样速 率为5μL/min，此时4个细胞培养区的微阀开关均为关闭状态。细胞生长和细 胞行为则通过倒置显微镜进行定时观察、记录。
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