技术领域
[0001] 本
发明属于动物遗传育种技术领域，更具体地，涉及一种鸡卷羽性状的分子鉴定方法。
背景技术
[0002] 卷羽鸡，又称麒麟鸡、翻毛鸡，是产于粤西一带的特色鸡种，据宋代学者周去非所著《岭外代答》一书记载，至今已有840多年历史。该鸡种部分
皮肤裸露，
散热性能良好，是一个适合热带高温环境饲养的特色肉鸡品种。
羽毛作为禽类一个重要的外貌特征，其独特的卷羽性状与片羽(正常羽)具有显著差异；卷羽作为
家禽羽型中重要的一种类型，有利于鸡体表的散热，适合热带或我国南方地区饲养，对于抗热应激鸡种的培育有着重要的作用，可利用卷羽性状通过基因工程技术培育卷羽鸡新品种以及对纯种巻羽鸡的选育，因此有必要对卷羽性状进行准确而有效的分子鉴定。目前已存在的参照基因组序列把鸡作为一种重要的模式
生物去理解基因组进化、群体遗传、表型特征的遗传
基础，由于
鸟纲之间联系紧密，对鸡表型变化的分子和遗传基础的阐明对应用于其他野生鸟类有着重要意义，因而，对鸡的遗传和基因组研究可以为鸟类的发展和进化提供信息。本发明为揭示禽类卷羽性状的分子鉴定机制提供了参考，为禽类卷羽新品种的培育提供了基础。
[0003] 本
发明人课题组通过克隆卷羽麒麟鸡KRT75L4基因序列与PCR扩增直接测序法测序在KRT75L4存在15bp缺失，说明麒麟鸡的卷羽性状与KRT75L4基因的变异有关；由于卷羽鸡与片羽鸡相比，仅在KRT75L4基因处缺失有15bp的
片段，因此针对KRT75L4基因两端设计引物的普通的PCR难以区分如此细微的条带，且无法适用于杂合的半卷羽性状的鉴定。由于鸡的品种众多，开发一种普遍适用的检测引物无疑具有重要意义。
发明内容
[0004] 本发明所要解决的技术问题是克服现有鸡卷羽性状鉴定中存在的
缺陷和不足，提供一种可快速鉴定鸡卷羽性状的方法和
试剂盒。
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种用于鉴定鸡巻羽性状的PCR引物。
[0006] 本发明的第二目的是提供一种鸡巻羽性状的分子鉴定方法。
[0007] 本发明的第三个目的是提供一种鸡卷羽性状检测试剂盒。
[0008] 本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
[0009] 一种用于鉴定鸡巻羽性状的PCR引物，所述引物包含上游引物F和下游引物R，其序列依次如SEQ ID NO：1～2所示。
[0010] 本发明通过比较不同品种鸡KRT75L4基因的同源性，设计了
覆盖卷羽鸡 15bp缺失片段的PCR扩增引物，经过大量预实验，设计筛选出了一对普遍适用于不同品种鸡KRT75L4基因的扩增引物，其序列如SEQ ID NO：1～2所示，所述扩增引物的扩增产物大小为540bp；由于鸡KRT75L4基因的序列长达17.29kb (如SEQ ID NO：4所示)，而缺失突变的15bp位于其
2089～2103bp处，考虑到KRT75L4基因在不同品种鸡中的
碱基差异性，如何在17.29kb中选择出一对特异性强，扩增效率高，扩增产物大小合适，普遍适用在众多鸡品种的扩增引物是决定本发明检测方法适用性广的决定因素，同时还要考虑在扩增产物中除缺失片段15bp处存在本发明需要的酶切位点外，其它地方不存在相同的酶位点。
[0011] 本发明还
请求保护所述PCR引物在鉴定鸡巻羽性状和/或制备卷羽性状检测试剂盒中的应用。
[0012] 一种鸡巻羽性状的分子鉴定方法，包括如下步骤：
[0013] S1.提取待测样本血液DNA；
[0014] S2.以S1所述DNA为模板，利用上述PCR引物进行PCR扩增反应；
[0015] S3.将S2的PCR扩增产物用限制性内切酶NaeI进行酶切反应，酶切产物
电泳检测；
[0016] S4.根据S3的电泳情况进行结果判定：若扩增产物为一条带，则待测样本为卷羽鸡；若扩增产物为两条带，则待测样本为片羽鸡；若扩增产物为三条带，则待测样本为卷羽与片羽杂交品种。
[0017] 所述Pdil(Nael)酶识别5’GCC↓GGC序列从而将片羽基因切成319bp、221bp 的两段。
[0018] 本发明鸡巻羽性状的分子鉴定方法是根据鸡卷羽性状在KRT75L4基因存在 15bp缺失，通过寻找有且仅有在这15bp的片段上的酶切位点，从而对PCR扩增产物进行酶切验证，由于卷羽鸡种缺失了15bp，因此其PCR扩增产物不存在酶切位点，酶切电泳结果为一条带；由于片羽鸡中存在着正常的KRT75L4基因序列，因此，其PCR扩增产物可以限制性内切酶识别，酶切电泳结果显示为两条带；半卷羽鸡(卷羽鸡和片羽鸡杂交)由于存在基因杂合，因此其等位基因有一个可被酶切位点识别，另一个无法识别，所以酶切电泳结果显示为三条带。
[0019] 具体为巻羽出现540一条条带；片羽出现319bp和221bp两条条带，其杂交 F1代的半巻羽出现540bp、319bp和221bp三条条带。
[0020] 优选地，步骤S2所述PCR扩增反应体系为：模板DNA 1.5μL，上下游引物各1μL，2×Taq-Neo PCR Mix 25μL，加灭菌三蒸
水21.5μL至总体积50μL。
[0021] 优选地，步骤S2所述PCR扩增反应程序为：94℃2min；94℃1min，62℃30s， 72℃1min共34个循环；72℃5min。
[0022] 优选地，步骤S3所述酶切反应体系为：PCR扩增产物10μL，灭菌三蒸水 18μL，10×Buffer Tango 2μL，Nael2μL，混匀后于37℃孵育1小时。
[0023] 优选地，步骤S1所述样本为怀乡鸡、麒麟鸡、贵妃鸡、文昌鸡、来航鸡、芦花鸡或其杂交一代F1和杂交二代F2。
[0024] 卷羽是家禽羽型中重要的一种类型，有利于鸡体表的散热，适合热带或我国南方地区饲养，对于抗热应激鸡种的培育有着重要的作用，可利用卷羽性状通过基因工程技术培育卷羽鸡新品种以及对纯种巻羽鸡的选育。因此，上述鸡卷羽性状的分子鉴定方法在禽类遗传育种中的应用亦在本发明保护范围内。
[0025] 本发明还提供一种鸡卷羽性状检测试剂盒，所述试剂盒包含SEQ ID NO：1～ 2所述PCR扩增引物及限制性内切酶NaeI。
[0026] 优选地，所述试剂盒还包含PCR扩增反应及酶切反应所需试剂。
[0027] 更优选地，所述PCR扩增反应所需试剂为2×Taq-Neo PCR Mix，灭菌三蒸水；所述酶切反应所需试剂为10×Buffer Tango，灭菌三蒸水。
[0028] 目前已存在的参照基因组序列把鸡作为一种重要的模式生物去理解基因组进化、群体遗传、表型特征的遗传基础，由于鸟纲之间联系紧密，对鸡表型变化的分子和遗传基础的阐明对应用于其他野生鸟类有着重要意义，因而，对鸡的遗传和基因组研究可以为鸟类的发展和进化提供信息。本发明为揭示禽类卷羽性状的分子鉴定机制提供了参考，为禽类卷羽新品种的培育提供了基础。
[0029] 与
现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0030] (1)本发明有效地利用了巻羽性状的分子特征，大大节省了成本，同时达到了快速准确鉴定的预期效果，对巻羽性状的鉴定节约了大量的时间及资源，克服了传统PCR扩增无法区分基因型的缺陷和不足；本发明建立的鸡巻羽性状的分子鉴定方法的准确率可达100％，具有较大的应用前景。
[0031] (2)本发明为培育卷羽鸡特色新品种提供了理论依据，对进一步研究卷羽形成的具有重要意义，同时为国内卷羽鸡卷羽性状的鉴定与分离提供了依据。
附图说明
[0032] 图1为不同品种卷羽鸡(白羽和黄羽)和片羽鸡中KRT75L4基因的核苷酸序列信息。
[0033] 图2为本发明卷羽性状主效基因的缺失位点图；TC代表天长三黄鸡，TH淮南麻黄鸡，WC代表文昌鸡，AJ代表兴义矮脚鸡，JN代表济宁百日鸡，QL代表麒麟鸡，HX代表怀乡鸡，LH代表芦花鸡，GF代表贵妃鸡，F1代表卷羽麒麟鸡与片羽鸡杂交一代，F2代表卷羽鸡与片羽鸡杂交二代中的片羽鸡，F2'代表卷羽鸡与片羽鸡杂交二代中的卷羽鸡，YF1代表元宝卷羽鸡与片羽鸡杂交一代。
[0034] 图3为本发明Pdil(Nael)酶切结果；M是DNA Marker 2000，F是卷羽鸡， P是片羽鸡，F1是杂交F1代。
具体实施方式
[0035] 以下结合
说明书附图和具体
实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0036] 除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
[0037] 实施例1鸡卷羽性状的分子鉴定方法
[0038] 1、PCR引物设计
[0039] 根据比较不同品种卷羽鸡(白羽和黄羽)和片羽鸡中KRT75L4基因的核苷酸序列信息(如图1，仅给出了部分比对信息)，在卷羽鸡与片羽鸡相比较缺失 15bp的片段上设计覆盖15bp缺失片段的PCR扩增引物，经过大量预实验，设计筛选出了一对普遍适用于不同品种鸡KRT75L4基因的扩增引物，其序列如表 1所示，所述扩增引物的扩增产物大小为540bp，其扩增产物序列如SEQ ID NO： 3所示(15bp缺失片段位于其213～227bp处)；由于鸡KRT75L4基因的序列长达17.29kb(如SEQ ID NO：4所示)，而缺失突变的15bp位于其2089～2103bp 处，考虑到KRT75L4基因在不同品种鸡中的碱基差异性，如何在17.29kb中选择出一对特异性强，扩增效率高，扩增产物大小合适，普遍适用在众多鸡品种的扩增引物是决定本发明检测方法适用性广的决定因素，同时还要考虑在扩增产物中除缺失片段15bp处存在本发明需要的酶切位点外，其它地方不存在相同的酶位点，最终筛选到用限制性内切酶NaeI对PCR扩增产物进行酶切。
[0040] 表1KRT75L4基因PCR扩增引物
[0041]
[0042] 2、PCR验证
[0043] (1)随机挑选性状已知的卷羽鸡(白羽和黄羽)和不同品种的片羽鸡翅静脉采集血液提取DNA用于PCR验证，其中还包括卷羽鸡×贵妃鸡和卷羽鸡×怀乡鸡杂交F1、F2代，F2代中的卷羽和片羽均选自同一个家系后代，所用具体样本见表2，用步骤1所述引物进行PCR反应；
[0044] 表2PCR验证所用样本
[0045]
[0046]
[0047] (2)所述PCR扩增体系：模板DNA 1.5μL，上下游引物各1μL，2×Taq-Neo PCR Mix 25μL，加灭菌三蒸水21.5μL至总体积50μL；
[0048] (3)PCR扩增反应程序为：94℃2min；94℃1min，62℃30s，72℃1min 共34个循环；72℃5min；
[0049] (4)取3μL的PCR扩增产物用浓度为1.0％琼脂糖凝胶电泳检测片段大小以及
亮度，将条带清楚明亮的PCR产物送上海生工生物(广州测序部)进行回收纯化和双向测序。测序结果应用Chromas
软件进行分析，在DNAMAN或者 Blast上进行序列比对分析(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)，比对结果如图2所示；
[0050] (5)将PCR扩增产物进行酶切反应，Pdil(Nael)酶切体系：PCR扩增产物10μL，灭菌三蒸水18μL，10×Buffer Tango 2μL，Pdil(Nael)2μL，混匀后于 37℃孵育1小时用1％琼脂糖凝胶电泳检测；酶切后的电泳图如图3所示，验证结果如表3所示，本发明上述选取的不同鸡品种的卷羽性状均可通过本发明的分子鉴定方法
鉴别出来，成功率、准确率可达100％。表明本发明的建立的鸡卷羽性状的分子鉴定方法完全可用于实际检测。
[0051] 表3不同品种验证结果
[0052]
[0053]
[0054] “+”，指存在该缺失，“-”，指不存在该缺失；QF2，麒麟鸡与贵妃鸡杂交F2代。
[0055] 对比例1
[0056] 1、设计如下所述针对KRT75L4基因的扩增引物
[0057]
[0058] 2、对实施例1中的208只鸡样本进行试验验证
[0059] PCR反应体系与实施例1相同；
[0060] PCR反应程序为94℃2min；94℃1min，58℃30s，72℃2min共34个循环；72℃5min；
[0061] 结果显示，设计的PCR引物无法全部扩增出上述208样本中的目的片段，无法适用于实际检测需求。
[0062] 对比例2
[0063] 1、设计如下所述针对KRT75L4基因的扩增引物
[0064]
[0065]
[0066] 2、对实施例1中的208只鸡样本进行试验验证
[0067] PCR反应体系与实施例1相同；
[0068] PCR反应程序为94℃2min；94℃1min，57℃30s，72℃2min共34个循环；72℃5min；
[0069] 结果显示，设计的PCR引物无法全部扩增出上述208样本中的目的片段，且扩增的目前片段中缺失的15bp片段上不存在唯一的酶切位点，无法进行下一步的酶切验证，无法适用于实际检测需求。
[0070] 本鉴定技术的开发，所建资源群体成为具有良好的研究材料。
[0071] 本测序鉴定技术的开发，为表型性状的分子鉴定提供了重要参考依据。
[0072] 上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
