生产抗体片段的方法
阅读：1022发布：2020-06-27
专利汇可以提供生产抗体片段的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种生产目标 抗原 抗体 片段 的方法，包括：至少两次将包含所述目标抗原的免疫混合物施予软骨鱼；从软骨鱼采集 血液样本 ；从血液样本从提取RNA；对所述RNA进行逆转录以获得互补DNA，并且可选地扩增cDNA以获得扩增的cDNA的混合物，然后进行纯化。也公开了从鲨鱼生产抗体片段的方法；从该方法获得抗体片段；和包括该抗体片段的 试剂 盒 。，下面是生产抗体片段的方法专利的具体信息内容。
1.一种生产目标抗原抗体片段的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)至少两次将包含所述目标抗原的免疫混合物施予软骨鱼；
b)从所述软骨鱼采集血液样本；
c)从所述血液样本中提取RNA；
d)对所述RNA进行逆转录以获得互补DNA，并且可选地将cDNA扩增以获得扩增的cDNA的混合物，然后将其纯化；
e)将在所述步骤d)中获得的所述cDNA插入到载体以生成重组质粒；并且将所述重组质粒引入细菌细胞以形成重组细胞；和
f)培养所述重组细胞并且从所述培养的重组细胞提取所述抗体片段。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述软骨鱼是鲨鱼。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述软骨鱼是竹鲨。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述免疫混合物包括所述目标抗原和弗氏佐剂。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤a)中，每个月一次将所述免疫混合物施予所述软骨鱼，持续至少三个月。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体片段是单域抗体。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组质粒包括紧密素域。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步骤e)中，所述载体和cDNA的摩尔比的范围是大约5:1到大约9:1。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤e)包括：
-将所述cDNA插入载体以生成重组质粒；
-利用酒精通过沉淀纯化所述重组质粒；和
-将所述纯化的重组质粒引入到所述细菌细胞以形成重组细胞。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌细胞是大肠杆菌细胞。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标抗原是荧光分子或有机染料。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述cDNA通过使用至少一个引子而扩增，所述引子包括选自由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:
5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和任何以上的组合构成的组的序列。
13.一种从鲨鱼生产目标抗原的抗体片段的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)至少两次将包含所述目标抗原的免疫混合物施予所述鲨鱼；
b)从所述鲨鱼采集血液样本；和
c)从所述血液样本提取RNA；以及
d)对所述RNA进行逆转录以获得互补DNA，并且可选地扩增所述cDNA以获得扩增cDNA的混合物，然后将其纯化。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述鲨鱼是竹鲨。
15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，每个月一次将所述免疫混合物施予所述鲨鱼，持续至少三个月。
16.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述免疫混合物包括所述目标抗原和弗氏佐剂。
17.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述目标抗原是荧光分子或有机染料。
18.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，还包括将所述cDNA插入到载体以形成重组质粒，其中所述重组质粒包括紧密素域；并且将所述重组质粒引入大肠杆菌细胞以形成重组细胞。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，还包括培养所述重组细胞并且提取所述抗体片段的步骤。
20.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述抗体片段是单域抗体。
21.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述抗体片段具有加强在488nm、421nm或525nm的绿色萤光蛋白信号的功能。
22.一种从权利要求1所述的方法获得的抗体片段。
23.根据权利要求22所述的抗体片段，其特征在于，所述抗体片段是来源于竹鲨的单域抗体。
24.一种试剂盒，其特征在于，包括从权利要求1所述的方法获得的抗体片段或编码所述抗体片段的DNA序列。
生产抗体片段的方法
技术领域
背景技术
[0002] 单克隆抗体(mAbs)广泛使用于生物技术和生物医药方面，从免疫诊断学中的目标蛋白的亲和纯化到疾病治疗。mAbs具有五种免疫球蛋白类，尺寸是150kDa。它们主要的结构由两个同一的重链(VH)和两个轻链(VL)组成。mAbs是单特异性抗体，和由几种不同的免疫细胞制成的多克隆抗体相反，mAbs由同一免疫细胞制成，即是由唯一母细胞的所有克隆体制成。但是，常规抗体的高成本和低稳定性限制了该抗体在药物开发或诊断学中的应用。
[0003] 1993年，Hamers-Casterman偶然想到来源于骆驼的重链抗体，该抗体不具有轻链抗体(HCAbs)。1995年，发现了软骨鱼的免疫球蛋白新抗原受体，也称为IgNAR，其结构和功能与HCAbs相似。重链抗体仅由两种重链组成，尽管仅具有可变的重链域，其也能连接抗原。最近，已经开发出了单域抗体(sdAb，也称为纳米抗体)。sdAb是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。sdAb来源于骆驼科HcAbs的VHH片段和软骨鱼IgNAR的VNAR片段。
[0004] 和常规抗体相比，sdAb是具有高稳定性、高特异性、高溶解性和隐蔽表位识别性的最小的抗体。它们在多种诊断和药物应用中具有潜在用途。将荧光蛋白融合到sdAb生成所谓的荧光蛋白基因质粒(chromobody)，其具有增加的荧光和改善的光谱特性。Chromobody可以用于识别和跟踪在活体细胞中的不同区室的目标。因此，他们能增加使用活细胞显微术的可能性并且有助于新功能的研究。在诊断生物探针应用中，预期sdAb能用作工具。由于它们的尺寸小，它们能在生物探针表面更密集地耦合。除了它们在指向不容易接近的表位上的优势，它们的构象稳定性也使得其具有更高的抵抗力来应对表面再生的情况。当前，一些从骆驼获得的sdAb已经进入治疗人类疾病的临床试验。但是，由于养育骆驼的成本很高，这极大地阻碍了sdAb的开发。
[0005] 因为单克隆抗体有大的复合结构并且需要特定的转译后糖基化，现时还未能成功地通过简单微生物宿主生产。因此，它们必须要在哺乳动物细胞系中生产，其培养过程复杂并且成本高(由于介质昂贵、发酵时间长、结垢问题、使用气体等)。得到的抗体利用酶联免疫吸附测定(ELISAs)进行筛选以得到期望的特异性。但是，基于ELISA的筛选的生产量低，因为在mAb生产的初步阶段期间，只有有限的杂交瘤上清液的数量(～100μl)能用于筛选并且这通常仅足够对仅一个或两个抗原测试mAb。虽然如今mAbs在温和的条件下很好地生产和纯化，但是它们仍然容易受到聚集、脱氨和氧化影响。
[0006] 通过使用能在微生物宿主(例如，Fab区域、可变域或sdAb)中生成的抗体的特殊部分，能减少与尺寸相关的对抗体的限制。受进化驱动的工程技术的强大高生产量技术是分子展示技术(molecular display):生成大的(多)肽库并且随后用于筛选具有期望的生物和物理化学性质的变体。最常用的展示技术是噬菌体展示技术(phage display)。因丝状噬菌体的粘性，经常需要利用严苛条件(例如，具有洗涤剂的缓冲剂)进行几次集中清洗步骤，称为“生物淘洗”的艰难过程，以移除非特异性噬菌体。
[0007] 因此，仍强烈需要能有效降低成本的方法来高效地生产sdAb，且提供生产抗体的多样性。发明内容
[0008] 本发明提供了能有效降低成本的方法来生产高亲和力的sdAb。具体地但不排他地，该方法利用细菌生产和抗体工程以生成sdAb。发明人建立了低成本和高效平台以对来源于鲨鱼的功能性sdAb进行筛选和生产，以使得它们在生物医药中的应用更显著。该平台基于耦合有荧光-激活细胞分选(FACS)技术的细菌展示技术。该平台能用于识别具有期望性质的目标sdAb并且能用于制造具有细胞特异性的亲和配体。
[0009] 在第一方面，本发明涉及一种生产目标抗原抗体片段的方法，该方法包括如下步骤：
[0010] a)至少两次，优选至少六次，将包含所述目标抗原的免疫混合物施予软骨鱼；
[0011] b)从软骨鱼采集血液样本；
[0012] c)从血液样本中提取RNA；
[0013] d)对RNA进行逆转录以获得互补DNA，并且可选地将cDNA扩增以获得扩增的cDNA的混合物，然后将其纯化；
[0014] e)将在步骤d)中获得的cDNA插入到载体以生成重组质粒；并且将所述重组质粒引入细菌细胞以形成重组细胞；和
[0015] f)培养重组细胞并且从培养的重组细胞提取抗体片段。
[0016] 优选地，抗体片段是单域抗体。软骨鱼可为鲨鱼、鳐、魟或优选地竹鲨。
[0017] 在第二方面，本发明提供一种从鲨鱼生产目标抗原的抗体片段的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0018] a)至少两次将包含所述目标抗原的免疫混合物施予鲨鱼；
[0019] b)从鲨鱼采集血液样本；和
[0020] c)从血液样本提取RNA；以及
[0021] d)对RNA进行逆转录以获得互补DNA，并且可选地扩增cDNA以获得扩增cDNA的混合物，然后将其纯化。
[0022] 优选地，该方法包括将cDNA引入细菌表面表达载体的步骤。在实施例中，该cDNA对应的抗体片段具有诸如加强在488nm、421nm或525nm的绿色萤光蛋白信号(GFP)信号的功能，优选地，该cDNA对应的抗体片段能够加强在488nm、421nm和525nm的GFP信号的功能。
[0024] 在另外的方面中，本发明属于一种确定样本中是否存在目标抗原和/或目标抗原的数量的方法，包括如下步骤：
[0025] -根据以上方法生产目标抗原的抗体片段；
[0026] -将抗体片段加入到样本，并且可选地培养混合物一段时间；和
[0027] -进行定量或定性分析以确定混合物中是否存在目标抗原和/或目标抗原的数量。
[0028] 如本文描述的方法中获得的抗体片段，尤其是单域抗体，具有有利的尺寸和隐蔽表位识别性质，使得它们在大量疾病状态的诊断和治疗中具有优势。因此，本发明提供用于生物技术和生物医药应用中的合适且有效的方法和试剂盒，本发明可用于开发诊断试剂盒和癌症免疫治疗。本发明的抗体片段可开发为生物探针。
[0029] 除非特别指明，所属领域的技术人员能理解的是可对本文描述的发明进行变形和改进。本发明包括所有这样的变形和改进。本发明也包括说明书单独或组合地参照或描述的所有步骤和特征以及任何步骤或特征的组合。通过考虑下述详细说明和附图，本发明的其他特征和方面将显而易见。
附图说明
[0030] 图1显示用于养殖鲨鱼的系统的示意图。
[0031] 图2A是本发明的实施例中使用的竹鲨相片。图2B显示本发明的实施例中从竹鲨采集血液的方式。
[0033] 图4A、4B和4C显示经施予含有RBC的免疫混合物的所有鲨鱼的血浆中的目标IgNAR的蛋白质表达。目标IgNAR对GFP和老鼠RBC膜蛋白具有特异性。所有血浆用抗角鲨IgNAR抗体(1:3000)作为第一抗体和抗兔IgG-HRP结合抗体(1:2000)作为第二抗体处理。图4A显示在第一个鲨鱼样本中获得结果。图4B显示在第二个鲨鱼样本中获得的结果。图4C显示在第三个鲨鱼样本中获得的结果。
[0034] 图5显示经施予包含胎鼠肝脏细胞的免疫混合物的鲨鱼的血浆中的IgNAR的蛋白质表达。IgNAR特异性地结合胎鼠肝脏细胞的约40kDa和约65kDa蛋白质。孵育抗体分别用免疫的鲨鱼血浆(1:100)、抗角鲨IgNar抗体(1:3000)温育，并且随后用抗兔IgG-HRP结合抗体(1:3000)温育。
[0035] 图6显示从四个设计引子制备的cDNA产物的表达。
[0036] 图7显示10个克隆的插入物(pMD-1到pMD-10)的蛋白质序列匹配，其中3个鲨鱼sdAb来自RCSBPDB(2Z8V:C、3MOQ:A和5L8L)。
[0037] 图8图解了本发明的实施例中使用的载体的序列排序。
[0038] 图9是图解了在连接(ligation)后将sdAb并入图4的载体的示意图。
[0039] 图10A是显示紧密素(intimin)和sdAb DNA融合的示意图。图10B显示在外膜紧密素-sdAb融合的建议模式——N-端LysM域在外周胞质，在外膜具有连接件，同时C-端D00和sdAb域暴露于细胞外环境。
[0040] 图11显示通过电泳法获得的结果。
[0042] 图13显示对应于第一个实验设计，经由蛋白质印迹分析在不同IPTG诱导条件下的蛋白质表达。
[0043] 图14显示紧密素-sdAb在重组大肠杆菌细胞的表达。
[0044] 图15显示重组大肠杆菌细胞的六个菌落表达紧密素-sdAb，该表达显示为大约75kDa，其和紧密素sdAb的期望尺寸接近。
[0045] 图16显示从流式细胞术分析得到的图表，其中活细胞用荧光PE-myc抗体(9B11)着色。
[0046] 图17A到17F显示IPTG诱导和GFP着色后大肠杆菌的表达，具体地，生成GFP-阳性sdAb的细胞根据阴性对照被控制并且通过FACS筛选。图17A显示了在第一轮通过FACS筛选的FITC信号的阳性种群。图17B、C、D、E和F来自图17A中使用的同一样本，并且显示通过FACS筛选的第三轮的结果。图17B和图17C显示FITC信号中的阳性种群。图17D显示APC信号中的阳性种群。图17E显示亮紫421信号中的阳性种群。图17F显示图17C中的FITC-阳性种群的子种群并且显示APC和亮紫421信号的阳性种群。
[0047] 图18显示具有sdAb表达的不同菌株的平均值和百分数值的两次FACS对比。
具体实施方式
[0048] 除非另外限定，本文使用的所有术语具有和所属领域的技术人员普遍理解的相同的意义。
[0049] 如本文使用的“包括”意指包括下述元素但不排除其他元素。“基本上由...组成”意指由各个元素和经常出现且不可避免的杂质组成的物质，该杂质示例为从用于获得诸如微量的其他组分或溶剂的物质的各个制备或方法得到的副产品和成分。“由...组成”意指该物质仅由，即通过各个元素形成。如本文使用的，除非上下文明确地另有所指，单数涵盖复数。
[0050] 本发明第一方面提供一种生产目标抗原抗体片段的方法，包括如下步骤：
[0051] a)至少两次将包含所述目标抗原的免疫混合物施予软骨鱼；
[0052] b)从软骨鱼采集血液样本；
[0053] c)从血液样本中提取RNA；
[0054] d)对RNA进行逆转录以获得互补DNA(cDNA)，并且可选地将cDNA扩增以获得扩增的cDNA的混合物，然后将其纯化；
[0055] e)将在步骤d)中获得的cDNA插入到载体以生成重组质粒；并且将重组质粒从重组细胞引入细菌细胞；和
[0056] f)培养重组细胞并且从培养的重组细胞提取抗体片段。
[0057] 如本文使用的，术语“抗体片段”指的是完整的抗体分子的一部分(即，全长抗体的一部分)，特别是抗体分子的活性部分。抗体片段能被编码抗体片段序列的多核苷酸序列表达。优选地，抗体片段是单域抗体(sdAb)，其包括单个单体可变域或由单个单体可变抗体域组成。sdAb也可称为纳米抗体。一般而言，sdAb尺寸为12kDa到15kDa并且具有结合特异性抗原的亲和性。sdAb在60℃～80℃高温和一定尿素浓度(鲨鱼血清中含有高达约350mM尿素)下保持活性。小的分子尺寸和高的对抗原特异性使得sdAb是诊断和治疗应用中的有效工具。和常规抗体相比，sdAb具有更高的稳定性和特异性，具体地用于结合不能被整个完整的抗体结合的隐藏抗原。
[0058] 术语“抗原”指的是能与抗体或抗体片段结合的物质。一般而言，抗原可为内生的并且在常规或异常条件下产生。异常条件意指主体，具体地是当哺乳动物或人类患有诸如癌症和炎症疾病的病痛或疾病的条件。抗原可为诸如有机染料或荧光分子的人工合成物质，其能与对应的抗体结合。在一个实施例中，抗原是在遭受疾病的主体中生成的代谢产物。在另一个实施例中，抗原是诸如绿色荧光蛋白(GFP)的有机染料或荧光分子。
[0059] 术语“软骨鱼”指的是由软骨而非骨头构成骨架的鱼类。一般而言，软骨鱼可为选自板鳃亚纲(Elasmobranchii)或全头亚纲类(Holocephali)的种类。如本文使用的软骨鱼可为鲨鱼、鳐(skate)或魟(ray)。在一个实施例中，软骨鱼是选自由护士鲨(nurse shark)、多刺鲨鱼(spiny dogfish)和竹鲨(bamboo shark)构成的组的鲨鱼。优选地，鲨鱼是来自斑竹属(Chiloscyllium)的竹鲨。竹鲨能为阿拉伯斑竹鲨Chiloscyllium arabicum、缅甸斑竹鲨Chiloscyllium burmensis、灰斑竹鲨Chiloscyllium griseum、网尾斑竹鲨Chiloscyllium hasselti、印度斑竹鲨Chiloscyllium indicum、条纹斑竹鲨Chiloscyllium plagiosum或点纹斑竹鲨Chiloscyllium punctatum。在实施例中，竹鲨是点纹斑竹鲨。相对于其他种类的鲨鱼，竹鲨的尺寸相对小，因此操作员能容易地饲养竹鲨。
也归因于竹鲨的尺寸小，和骆驼相比更容易将免疫混合物施予竹鲨并且从它们身上采集血液样本。于是，使用软骨鱼，特别是竹鲨节省生产抗体片段的成本。同样，这种方式可更快地从动物模型获得sdAb。
也归因于竹鲨的尺寸小，和骆驼相比更容易将免疫混合物施予竹鲨并且从它们身上采集血液样本。于是，使用软骨鱼，特别是竹鲨节省生产抗体片段的成本。同样，这种方式可更快地从动物模型获得sdAb。
[0060] 词组“免疫混合物”指的是包含用于引发软骨鱼，具体地是鲨鱼，的免疫应答的目标抗原的混合物。免疫混合物优选地包括如上所述的目标抗原和可选的弗氏佐剂(Freund’s Adjuvant,FA)。弗氏佐剂可为完整或不完整的弗氏佐剂。完整的弗氏佐剂(CFA)包括在矿物油中失活和干燥的分枝杆菌，不完整的弗氏佐剂(ICFA)不包括分枝杆菌组分但仅包括在矿物油的水。FA用于诱导激活免疫应答或增加免疫应答的活性。
[0061] 将免疫混合物施予软骨鱼的步骤a)可被称为免疫接种。在实施例中，持续至少两个月或三个月每个月至少一次将免疫混合物施予软骨鱼，特别是鲨鱼。在第一次免疫接种中，免疫混合物可为包括或由目标抗原和CFA组成的混合物。对于随后的免疫接种，即第二次和第三次免疫接种，免疫混合物可为包括或由目标抗原和ICFA组成的混合物。在另一个实施例中，至少四次、至少五次，或至少六次地每月一次将免疫混合物施予软骨鱼，特别是鲨鱼。用于第一次免疫接种的免疫混合物优选地包括或由目标抗原和CFA组成。对于剩余的免疫接种，免疫混合物可为包括或由目标抗原和ICFA组成。
[0062] 免疫接种后，从软骨鱼采集血液样本。优选地，麻醉软骨鱼以进行免疫接种和血液采集。在步骤b)，采集约1到约5ml、约2到约4ml，或约2到约3ml的血液样本，优选地使用包含或利用诸如柠檬酸钠的抗凝剂洗涤的注射器。
[0063] 接着血液样本进行分离以分离血液细胞和血浆。血液样本可被离心以获得两个单独的层。在一个实施例中，血液样本以至少一分钟以最高转速离心以获得两个单独的层。上层，即血浆层，优选地包括从血液细胞，特别是从白血球，释放的免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)，并且下层包含分离的血液细胞。在一个实施例中，进行蛋白质印迹分析以确定软骨鱼是否生成期望的抗体。
[0064] 为了从采集血液样本提取RNA，RNA优选地是包括编码抗体片段的序列的RNA，步骤c)包括溶解分离的血液细胞以释放RNA的步骤。可选地，出现在血浆层的免疫球蛋白新抗原受体(IgNAR)分别隔离以进行诸如，特别是蛋白质印迹分析的蛋白质分析以确认软骨鱼是否已经成功地生成期望抗体。
[0065] 本发明的该方法可包括抗体片段的一步扩增或两步扩增。对于一步扩增，从血液样本中提取RNA后，提取的RNA进行逆转录以构成互补DNA(cDNA)，之后继续使用引子对cDNA进行扩增，并且进一步纯化扩增的DNA产物。生成的cDNA优选是编码期望的抗体的DNA序列。具体地，可进行聚合酶链反应(PCR)以扩增抗体片段。在一个实施例中，用于抗体片段扩增的引子包括或由选自如下所述SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和任何以上的组合组成的组的序列。优选地，使用多于一个引子。
[0066] F1R1:F1GGGTAGACCAAACACCAAGAAC(SEQ ID NO:1)
[0067] R1GAGGAGACTGACTATTGGTGGAG(SEQ ID NO:2)
[0068] F2R2:F2AAAAGAGACGGACGAATCACTGACC(SEQ ID NO:3)
[0069] R2CGGTCAGTCCGGTGCC(SEQ ID NO:4)
[0070] F3R3:F3WTTCACAGTCASARKGGTSCC(SEQ ID NO:5)
[0071] R3ATGGCCSMACGGSTTGAACAAACAC(SEQ ID NO:6)
[0072] F4R4:F4GGGAAGCTTGCCGCACGGGTTGAACAAACACCG
[0073] (SEQ ID NO:7)
[0074] R4GGCGAATTCCACAGTCAGAGGGGTGCCGCCTCC
[0075] (SEQ ID NO:8)
[0076] 利用缓冲溶液和离心进行纯化以移除不希望的杂质，诸如不反应的引子、dNTP、酶和其他杂质。所属领域的技术人员了解可行的和通过市场可得到的方法来纯化扩增的DNA，诸如PCR清洁套件(PCR Clean-up kit)和凝胶清洁套件(Gel Clean-up kit)。
[0077] 对于优选的两步扩增，还包括利用重组DNA技术来扩大生产规模以及筛选期望的抗体片段的步骤e)和f)。
[0078] 优选地，步骤e)包括以下步骤:
[0079] -将步骤d)获得的cDNA插入到载体以生成重组质粒；
[0080] -可选地利用酒精通过沉淀纯化所述重组质粒；和
[0081] -将重组质粒或纯化的重组质粒引入细菌细胞以形成重组细胞。
[0082] 术语“载体”指的是复制子，当中另一个多核苷酸节段插入其中以实现多核苷酸节段的复制和/或表达。在本发明中，载体包括紧密素域(intimin domain)，紧密素域编码用于在细菌细胞的外膜，特别是在大肠杆菌的外膜进行蛋白质表达的紧密素。优选地，载体包括显示为SEQ ID NO:9的序列，其对应于截短的紧密素基因。在一个实施例中，载体是来源于大肠杆菌的pET32(a+)表达载体，并且被修饰为包括SEQ ID NO:9。修饰可通过在相应的位点利用诸如EcoRI和HindIII消化酶进行。
[0083] 在步骤d)获得的cDNA，特别是编码抗体片段的DNA序列，随后经由连接被插入到载体以生成重组质粒。优选地，cDNA被诸如EcoRI和HindIII的酶消化以生成与载体连接的切割位点。插入后，cDNA优选地和紧密素域诸如sdAb融合，转换后，cDNA可在转化的细菌细胞的外细胞膜上表达并且由此被目标抗原识别。
[0084] 在一个实施例中，载体和cDNA的摩尔比范围是约5:1到约9:1。具体地，载体和cDNA的摩尔比例范围是约9:1或9:1。使用的载体的量越大，获得的转换效率越高。
[0085] 连接后，在将重组质粒引入到细菌细胞之前，将重组质粒沉淀纯化。具体地，沉淀通过将重组质粒产品与酒精和盐混合而进行。盐可为柠檬酸钠或类似物。随后将混合物进行离心并且丢弃包含溶解的杂质的上清液。可重复该步骤以获得更高纯度的重组质粒。所属领域的技术人员知道用于纯化DNA序列的合适方法，例如能使用商业试剂盒。
[0086] 随后，纯化重组质粒被引入到细菌细胞，优选地是大肠杆菌细胞以形成用于复制的重组细胞。这样的引入能称为转换。在具体实施例中，大肠杆菌细胞是能表达ShuffleT7蛋白质的菌株。所属领域的技术人员知道合适的方法来进行转换。例如，通过操作电泳法、热冲击或物理注射进行转换。也可通过使用纳米针进行纯化的重组质粒的物理注射。
[0087] 转换后，温育重组细胞一段时间以使cDNA链在细菌细胞中有效地复制。温育的长度取决于细菌的生长速率、温育条件和待生产的抗体片段的期望数量。所属领域的技术人员能调节培养重组细胞的参数。最后，采集细菌细胞并且溶解细胞以提取抗体片段。
[0088] 本发明提供从鲨鱼生产抗体片段的方法，具体地是从竹鲨生产单域抗体的方法。和来源于骆驼的sdAb的相比，本发明的方法实现了以低的成本大量生产来源于鲨鱼的sdAb。养鱼、重组DNA技术和细菌展示技术的组合使得该方法以有效的方式生产sdAb。从该方法获得的sdAb可用于多种范畴。
[0089] 在第二方面，本发明涉及一种从鲨鱼生产生产目标抗原的抗体片段的方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0090] a)至少两次将包含所述目标抗原的免疫混合物施予鲨鱼；
[0091] b)从鲨鱼收集血液样本；和
[0092] c)从血液样本提取RNA；以及
[0093] d)对RNA进行逆转录以获得互补DNA，并且可选地扩增cDNA以获得扩增cDNA的混合物，然后将其纯化。
[0094] 抗体片段和目标抗原如上所述。具体地，抗体片段可为单域抗体(sdAb)。优选地，鲨鱼是来自斑竹鲨属(Chiloscyllium)的竹鲨。竹鲨能为阿拉伯斑竹鲨、缅甸斑竹鲨、灰斑竹鲨、网尾斑竹鲨、印度斑竹鲨、条纹斑竹鲨或点纹斑竹鲨。在一个实施例中，竹鲨是点纹斑竹鲨。
[0095] 在一个实施例中，免疫混合物，如上所述，包括目标抗原和弗氏佐剂，每个月一次将免疫混合物施予向鲨鱼，持续至少三次、至少四次、至少五次或至少六次。优选地，每个月一次对鲨鱼施予免疫混合物，持续六次以进行特定目标抗原的免疫接种。在一个具体实施例中，目标抗原是荧光分子或有机染料。
[0096] 免疫接种后，从鲨鱼采集血液样本以用于提取RNA。如早先提及的，利用如上所述的引子对提取的RNA进行逆转录和扩增，从而生成cDNA。
[0097] 该方法还包括将cDNA插入到载体以形成重组质粒的步骤，cDNA编码期望的抗体片段，其中载体包括紧密素域；并且将重组质粒引入到大肠杆菌细胞以形成重组细胞。重组细胞随后被温育。最后，从温育的重组细胞提取抗体片段。
[0098] 在一个实施例中，cDNA对应的抗体片段具有加强在488nm、421nm或525nm的绿色萤光蛋白信号的功能。优选地，该cDNA能够加强在488nm、421nm和525nm的GFP信号的功能。
[0099] 在第三方面，本发明提供从本文描述的方法获得的抗体片段。优选地，抗体片段是来自于鲨鱼，特别是竹鲨，的单域抗体。现在市场上的sdAb是从骆驼科的动物生成，诸如骆驼和无峰驼。但是，养育骆驼科的动物的成本异常地高并且由此阻碍了sdAb的发展。对于本发明，竹鲨(即尺寸小的鲨鱼)的应用是有利于生成sdAb的动物模型。竹鲨能被人工饲养并且养育成本相对低。另外，根据本发明从该鲨鱼获的IgNAR具有高的稳定性并且能引发更强的免疫应答性。强的免疫应答性归因于高的尿素浓度以及竹鲨和人类之间的低同源性。于是，来自软骨鱼的sdAb，特别是来源于鲨鱼的sdAb与从骆驼获得的sdAb不同，在引发免疫应答具有显著优势并且对抗原具有高的特异性。
[0100] 具体地，来源于鲨鱼IgNAR的单变量新抗原受体域抗体片段(VNARs)代表最小的已知基于免疫球蛋白的蛋白质支架。作为单域，它们展现出有利的尺寸和隐蔽表位识别性质，使得它们可用于大量疾病状态的诊断和治疗。因此，根据该方法生产的抗体片段适合在生物技术和生物医药应用中，例如开发诊断试剂盒和癌症免疫治疗。
[0101] 在第四方面，提供了包括抗体片段的试剂盒。可选地，试剂盒另外包括说明使用抗体片段和/或原抗体片段的使用手册。试剂盒可另外包括另一个抗体以作为用于研究或诊断目的的第二抗体。
[0102] 同样，可理解的是通过重组载体或重组细胞的方式提供抗体片段。例如，本发明提供了一种包括紧密素域和抗体片段的重组载体，并且一种包括重组载体的重组细胞。
[0103] 在另外的方面中，本发明提供了一种确定样本中是否存在目标抗原和/或目标抗原的数量的方法，包括如下步骤：
[0104] -根据如上所述的方法生产目标抗原的抗体片段；
[0105] -将抗体片段加入到样本，并且可选地培养混合物一段时间；和
[0106] -进行定量或定性分析以确定混合物中是否存在目标抗原和/或目标抗原的数量。
[0107] 优选地，样本是从受试者获得的生物样本，受试者可为哺乳动物或人类样本。在实施例中，受试者是患有疾病的患者，诸如炎性疾病、神经免疫疾病、胃肠疾病、心血管疾病、免疫疾病、损伤、细菌感染、癌症等。生物样本可以是从受试者获得的血液、血浆、血清、唾液、尿液、粪便等。
[0108] 优选地，样本是血液样本、血浆样本、血清样本或唾液样本。可选地处理样本以分解细胞，以从细胞释放抗原。抗体片段的加入允许抗体片段结合在样本中的抗原。温育、可选的洗涤或冲洗的条件是可调节的，这是能被所属领域的技术人员所理解的。最后，进行定量或定性分析以确定混合物中存在目标抗原和/或目标抗原的数量。
[0109] 在一个实施例中，定量或定性分析可选自：凝胶电泳法、蛋白质印迹分析、流式细胞术分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光-激活细胞分选(FACS)，或其他本领域的合适分析。于是，本发明提供用于诊断目的或研究应用的有效定量或定性方法。具体地，有利于确定受试者是否携带目标抗原并且确定受试者的健康状态。
[0110] 更进一步地，本发明提供了一种通过使用根据本发明生产的sdAb的诊断方法。获得的sdAb能用于检测样本中抗原的存在，其中样本为从人类或患有特定疾病的患者获得的生物样本。在一个实施例中，获得的sdAb与荧光蛋白或染料融合或结合以形成复合物。当复合物与在样本中的抗原上结合，操作人能测量荧光水平或光吸收度以确定在样本中是否存在/不存在和/或目标抗原在样本中的数量。于是，本文公开的根据该方法生产的sdAb能用作生物探针。即，其涉及抗体片段在生产用于诊断的药物或生产生物探针的用途。尤其有利的是，该方法提供临床用途和科学研究的优势。
[0111] 并且，生成的sdAb可在治疗中用于在受试者中连接目标抗原或目标细胞的。例如，其能开发为阻止过度表达的癌症细胞或阻止连接到它的目标抗原引发免疫应答以对抗目标抗原。考虑到小的分子尺寸(穿过血脑屏障的高渗透性)，对目标抗原的高特异性和低细胞毒性，生成的sdAb能在治疗神经免疫疾病的治疗中使用。生成的sdAb也可用于光热疗法或化学疗法。即涉及抗体片段在生产药物的用途。
[0112] 实施例
[0113] 实施例1
[0114] 从竹鲨制备sdAb
[0115] 鲨鱼养殖
[0116] 竹鲨被放置在大的室内水箱(250L)内，流通有大约21℃的海水供给。竹鲨每天用冰鲜的虾肉和鳗鱼粉饲养一次。图1显示养殖鲨鱼的系统。具体地，鱼缸连接到过滤系统。过滤系统具有泵、连接到蛋白质分离器的鼓式过滤器，和用于从水流中过滤有机废物的生物过滤器。可提供UV消毒器以防止鱼类疾病并且控制鱼缸中的藻类生长。
[0117] 在实施例中，在免疫接种和采集血液之前，竹鲨用甲磺酸三卡因(MS-222)麻醉。具体地，在50L海水中加入5gMS-222，即大约0.1g/LMS-222，并且在持续空气和水流中向竹鲨提供海水。在麻醉后持续监视被麻醉的竹鲨的状态。三分钟后，将免疫混合物施予竹鲨或采集血液。在免疫接种或采集血液后，将竹鲨转移至另一个鱼缸以有助其恢复。在麻醉后的免疫接种和血液采集的操作时间优选地控制在10分钟内。
[0118] 免疫接种
[0119] 竹鲨每个月用免疫混合物进行免疫接种，免疫混合物包含抗原和完整或不完整弗氏佐剂(CFA或ICFA)。免疫混合物经由侧鳍皮下施药到竹鲨。竹鲨至少用一种抗原进行六次免疫接种。
[0120] 在该实施例中，使用胎鼠肝细胞的全部细胞蛋白质、绿色荧光蛋白(GFP)和鼠红细胞的完整细胞膜蛋白质作为抗原。包含完整胎鼠肝细胞的细胞蛋白质的免疫混合物通过下述步骤制备：
[0121] -以每一百万细胞20μlRIPA缓冲溶液将RIPA缓冲溶液加入到3.0x107胎鼠肝细胞，用于溶解细胞和提取蛋白质，并且将混合物放在5分钟冰上；
[0122] -经由离心从溶解的细胞分离出完整的细胞蛋白质；和
[0123] -利用2.5ml注射器和其连接体将600μl的分离的完整的细胞蛋白质和600μl弗氏佐剂(以体积比为1:1)混合1小时直到形成白色乳化体，其中白色乳化体是用于注射的免疫混合物。
[0124] 弗氏佐剂可为CFA或ICFA。具体地，CFA用于制备在第一次免疫接种中使用的免疫混合物，并且ICFA用于制备随后的免疫接种的免疫混合物。当混合分离的完整细胞蛋白质和弗氏佐剂时，很重要的是不要将气泡引入混合物中。混合后，剩余大约1000μl。每个鲨鱼注射500μl免疫混合物。
[0125] 包含绿色荧光蛋白(GFP)的免疫混合物通过将荧光蛋白和弗氏佐剂混合而制备。具体地，400μgGFP溶在600μlPBS中。GFP溶液随后与600μl弗氏佐剂混合。根据以上制备包含胎鼠肝细胞的完整细胞蛋白质的免疫混合物相似的方法制备包含鼠红细胞(RBC)的完整细胞膜蛋白质的免疫混合物。
[0126] 四条鲨鱼分成两组，并且将包含GFP或RBC蛋白质的免疫混合物施予每组的竹鲨。额外一组包含两条鲨鱼，将包含RBC-蛋白质的免疫混合物施予鲨鱼六次，然后将包含胎鼠肝细胞的完整细胞蛋白质的免疫混合物施予鲨鱼。
[0127] 参见图2A和2B，制备的免疫混合物从背侧在胸和胸鳍之间的位置经由皮下注射施药到每条竹鲨。
[0128] 血液采集
[0129] 在最后一次施予免疫混合物后的两个星期后，从免疫竹鲨的尾静脉处采集血液样本。通过触诊鲨鱼并且将针管放在软骨之前，利用微负压在注射器缓慢推进针管直到获得椎骨阻碍，就能找到竹鲨的尾静脉。具体地，针管以相对于竹鲨身体的30°到90°的角度指向前方，并且插入直到针管嘴碰到软骨(对于10kg鲨鱼大约是4cm)以穿透血管。
[0130] 从每条竹鲨获得2到3ml的血液。1kg竹鲨包括大约20-30ml血液，即获取基于总重量大约2-3％的血液。采集血液的注射器针筒具有大约200μl柠檬酸钠以阻止血液凝结。血液随后立即转移到血液采集管。一般而言，每条鲨鱼的1到1.5ml血液用于RT-PCR和cDNA扩增。从竹鲨获得的血液中，大约75％是血浆。每个样本需要在约80μl完整血液中的至少5
2x10白细胞(55％血浆和45％人类血液的形成元素)。
2x10白细胞(55％血浆和45％人类血液的形成元素)。
[0131] 在1,000g5分钟的条件下，进行离心分离血液样本中的血液细胞和血浆。分离的血浆和抗凝的完整血液细胞在-80℃保存直到使用。100μl抗凝的完整血液细胞与750μ1Trizol混合，并且混合物通过几次上下移液而变得均匀。
[0132] 因为淋巴细胞生成了IgNAR抗体并且将其释放到血浆，分离的血浆可用于检测是否生成了目标-特异性IgNAR。图3显示六次免疫接种后，IgNAR在鲨鱼血浆中的蛋白质表达。血浆样本用1:1000抗角鲨IgNAR抗体和1:2000抗兔IgG-HRP结合抗体温育。
[0133] 图4A到4C显示目标IgNAR在利用包含RBC的免疫混合物免疫的所有鲨鱼血浆中的蛋白质表达。目标IgNAR对GFP和鼠RBC膜蛋白质具有特异性。相似地，图5显示利用包含胎鼠肝细胞的免疫混合物免疫的鲨鱼的血浆中的IgNAR蛋白质表达。
[0134] 实施例2
[0135] 制备单-域抗体片段
[0136] 采集和提取所用可用于IgNAR的序列。基于已识别的序列，制备四组用于扩增的引子，引子如下所示：
[0137] F1R1:F1GGGTAGACCAAACACCAAGAAC(SEQ ID NO:1)
[0138] R1GAGGAGACTGACTATTGGTGGAG(SEQ ID NO:2)
[0139] F2R2:F2AAAAGAGACGGACGAATCACTGACC(SEQ ID NO:3)
[0140] R2CGGTCAGTCCGGTGCC(SEQ ID NO:4)
[0141] F3R3:F3WTTCACAGTCASARKGGTSCC(SEQ ID NO:5)
[0142] R3ATGGCCSMACGGSTTGAACAAACAC(SEQ ID NO:6)
[0143] F4R4:F4GGGAAGCTTGCCGCACGGGTTGAACAAACACCG
[0144] (SEQ ID NO:7)
[0145] R4GGCGAATTCCACAGTCAGAGGGGTGCCGCCTCC
[0146] (SEQ ID NO:8)
[0147] 基于序列匹配特别地设计F1R1和F2R2。F3R3来自于Zielonk等，JBiotechno2014。基于其他三个引子设计F4R4并加入HindIII和EcoRI。
[0148] 进行逆转录PCR(RT-PCR)以获得互补DNA(cDNA)产物。表1和表2概述了RT-PCR的参数。
[0149] 表1.PCR系统的参数
[0150]
[0151]
[0152] 表2.热循环的条件
[0153]
[0154] 扩增后，对产物进行琼脂糖凝胶电泳法以确定cDNA产物。通过4个引子制备的cDNA产物的表达如图6所示。
[0155] sdAbcDNA产物随后利用清洁套件纯化以移除不反应的引子和dNTP、酶和其他杂质。优选地，使用PCR清洁套件。随后纯化的cDNA利用TakaRa强力TA-克隆试剂盒(TakaRa Mighty TA-Cloning Kit)连接到pMD20-T载体。连接反应后，如TakaRa强力TA-克隆试剂盒的说明书所述转移到DH5a活细胞。使用蓝/白筛(blue-white screen)来筛选转化的DH5a细胞。挑选十个白色的菌落并送至测序。具有334至348bp之间长度的十个克隆的插入物与已知的三十四个鲨鱼sdAb匹配，并且之后确认为sdAb。图7显示十个克隆的插入物的序列对比，这些克隆的插入物在由RCSB PDB衍生的3个鲨鱼sdAb中。互补性确定区域(complementarity determining regions,CDR)和高变环(hypervariable loops,HV)显示在它们相关位置。在空盒显示同一或保守的残基。使用寡核苷酸引子序列指示的保守末端用于建立序列库。
[0156] 接着，根据下述方式使用酶EcoRI和HindIII消化纯化的sdAb DNA。在随后的连接中，使用同样的方式来消化载体。
[0157] 表3.双重消化sdAb的方式
[0158]组分 50μl反应混合物
DNA 1μg
10XCutSmart缓冲液 5μl
HindIII-HF 1μl(或20单位)
EcoRI-HF 1μl(或20单位)
无核酸酶水 将反应混合物增加到50μl
DNA 1μg
10XCutSmart缓冲液 5μl
HindIII-HF 1μl(或20单位)
EcoRI-HF 1μl(或20单位)
无核酸酶水 将反应混合物增加到50μl
[0159] 消化的产物随后通过使用另一清洁套件纯化。该步骤中的清洁套件优选是获得高度纯化的凝胶清洁套件。得到的sdAb DNA是线性sdAb片段。
[0160] 实施例3
[0161] 制备包含sdAb DNA的质粒
[0162] 制备载体
[0163] 用pET32(a+)载体连接在示例2中获得的sdAb。具体地，由广州IGE生物技术公司合成和克隆包括截短的紧密素基因的pET32(a+)-Int。
[0164] 截短的紧密素基因的序列显示为SEQ ID NO:9。该序列具有1-559残基并且长度是1677bp。图8图解了载体的序列排序。
[0165] 用酶EcoRI和HindIII在相应的位点消化载体以连接在示例2中获得的sdAb。图9图解了连接后sdAb的并入，即sdAbDNA连接到被酶剪切的相同位点。图10a是显示紧密素和sdAb DNA的融合的示意图。具体地，紧密素-sdAb融合包括N-端信号肽(SP)、LysM和β-域，并且分泌的D00-D3Ig-类似物、血凝素-类似物域，以及sdAb域，其中sdAb域代替原來放在截短的紧密素基因的D0-D3。图10b是在外膜中的紧密素-sdAb融合的建议模式——N-端LysM域在外周胞质，在外膜具有连接件(linker)，同时C-端D00和sdAb域暴露于细胞外环境。图10b指示了在侧面相接紧密素和sdAb域的His-tag和myc-tag表位。
[0166] sdAbDNA和载体的连接
[0167] 根据下述步骤进行连接：
[0168] -可选地在室温融化和再悬浮T4DNA连接酶缓冲液；
[0169] -将2μl10×T4DNA连接酶缓冲液、100ng消化的载体(具有大约7149bp的长度)、在示例2中获得的42.8ngsdAb(具有大约345bp的长度)、1μl的T4DNA连接酶和将反应体积加至20μl的无核酸酶水加入放置在冰上的微型离心管；
[0170] -通过上下移液温和地混合该混合物，并且可选地进行短暂的离心；和
[0171] -如果具有粘性末端，则可选地在16℃培养混合物过夜，或在室温培养1小时并且随后在16℃培养3小时。
[0172] sdAb(插入物)和载体的摩尔比例是9:1。基于下述电穿孔结果，该摩尔比例实现了最好的连接效率。
[0173] 表4.将连接产物直接加入电转感受态细胞后获得的电穿孔结果
[0174]
[0175] 进行琼脂糖凝胶电泳法以确定sdAb已插入到载体中。图11显示从电泳法获得的结果。连接的混合物中的质粒被转移到T7细胞，并且使细胞在LB/Amp板上生长以形成可见的菌落。随后随机地挑选菌落并且进行5mlLB培养以进行质粒微量提取法(plasmid Miniprep)。然后，用EcoRI和HindIII对获得的质粒进行双酶切。最后，用琼脂糖凝胶电泳法处理消化的混合物(1％凝胶，以100V进行50分钟)。
[0176] 沉淀DNA
[0177] 在电穿孔之前，通过DNA沉淀处理连接的产物以增加连接效率，移除不需要的盐，和增加DNA浓度。进行下述步骤：
[0178] -通过混合50μl连接的DNA样本(ligated DNA sample)、100μl1.5M的柠檬酸钠溶液(pH5.2)以及350μl100％的乙醇为每个连接的样本制备反应混合物；
[0179] -将混合物保持在-20℃2小时，随后在室温下保持15分钟；
[0180] -以最大速度离心20分钟，废弃上清液，将500μl70％乙醇加入到残留物以移除杂质，并且将其保持在室温15分钟，其中这一步骤至少进行两次；
[0181] -以最大速度离心20分钟，废弃上清液；和
[0182] -在室温或经由干燥机干燥留物。
[0183] 用106库来筛选GFP阳性sdAb。这个库是来自抗GFP的sdAb免疫库。扩增的sdAb基因节段克隆到pET32(a+)载体的EcoRI和HindIII位点，生成约1x106的大肠杆菌的展示免疫库。
[0184] 沉淀DNA后，获得了包含sdAb基因序列的纯化的重组DNA质粒。
[0185] 实施例4
[0186] 将重组质粒引入到细胞
[0187] 制备电转感受态细胞
[0188] 在1000ml瓶中，ShuffleT7感受态大肠杆菌细胞在500ml LB培养基中，在30℃和剧烈摇动的情况下生长。用3/500体积的新鲜LB培养基接种细胞过夜，直到它们达到早期指数增长阶段(A600＝0.4)。通常花费大约4小时到5小时达早期指数增长阶段。温育后，培养的细胞在冰-水内或在冰上冷却20分钟，同时频繁地摇晃该瓶。随后通过在800g、4℃离心二十分钟来收集细胞。丢弃上清液，而收集的沈淀物用250ml冰冷的10％丙三醇温和地再悬浮。再次离心混合物。重复地加入丙三醇和进行离心两次。之后，细胞用1ml冷10％丙三醇再悬浮。该悬浮液可立即用于电穿孔，或分成数份(40μl/管)冷藏并且在使用前以-80℃保存。
[0189] 电穿孔
[0190] 如果电转感受态细胞保存在-80℃，则在电穿孔之前将细胞放置在冰上解冻10分钟。1μl质粒DNA(1pg到100ng)通过移液管穿过细胞加入到细胞并且将其放置在冰上1-5分钟。转移细胞和质粒DNA的混合物到冷的0.2cm电穿孔试管的底部。在转移过程中应避免起泡。使用BIO-RAD微脉冲发生器并且设置为“Ec2”：0.2cm，2.5kV，6.1ms。根据设置对细胞和质粒DNA的混合物施加脉冲。于是，对混合物施加12.5kV/cm的脉冲，且时间常数为4.5-5ms。之后，4℃的960μlSOB培养基(SuperOptimalBroth)(SOC)介质加入到试管中，并且用吸管温和但快速地混合混合物。随后将细胞悬浮液从试管转移到10ml有盖管(snap-cap tube)并且在30℃温育1小时，温育期间转速为250rpm。最后，在预热的选择性板(selective plate)上铺展稀释份或所有温育的悬浮液，优选为每板约100μl。
[0191] 基于电穿孔效率和菌落数，发现最佳的用于电穿孔至T7细胞的数量为1ng的质粒DNA。虽然用NaAc-EtOH方法进行沉淀后DNA恢复率低，但是当转移1ng质粒到大肠杆菌细胞时，电穿孔效率是可接受的(107cfu；1至2x104菌落)。
[0192] 表5.电穿孔后获得的转化效率。#1-4是通过NaAc-EtOHDNA沉淀方法获得的转化的质粒的结果。#5-7是通过微量制备(MiniPrep)获得的转化的质粒的结果。
[0193]
[0194] 在另一个实施例中，当不沉淀而直接使用连接反应时，没有必要进行热激活或纯化反应混合物。但是，反应混合物应该以100倍稀释到30-60pgDNA/μl。
[0195] IPTG诱导
[0196] 为了确定是否成功地將质粒转化入大肠杆菌细胞，将电穿孔产物的温育悬浮液铺展在抗生素选择板上并且以30℃温育24小时。随后挑选一些菌落进行DNA提取和纯化(例如通过微量制备(MiniPrep)以确认转化。具体地，从板上随机挑选一些菌落，并且进行PCR扩增。然後，显示出sdAb插入的菌落继续进行另外的IPTG诱导和FACS分析。
[0197] 为了调查重组细胞的蛋白质表达，挑选單個菌落并且在具有抗生素的10ml液体介质中进行再悬浮。悬浮液随后在37℃温育直到OD600达到0.4-0.8。同时设定对照参考。将诸如10μl的100mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)贮备液加入到悬浮液中。混合物在37℃温育2小时。IPTG诱导后，将细胞溶解以确认蛋白质的表达或进行流式细胞分析。
[0198] 如表6和7所示，有两组条件用来诱导IPTG。之后的流式细胞分析显示在37℃进行的IPTG诱导比在25℃进行的产生更好的蛋白质表达。具体地，在37℃的PE-A种群的峰值比在25℃的显示出更强的位移。在37℃用0.1mM的诱导物进行2小时的诱导给出了最好的结果，因为种群的约40％具有蛋白质表达。于是，建议使用如下的IPTG条件：在OD600＝0.5开始；0.1mMIPTG，37℃，持续2小时。
[0199] 表6.第一组最佳IPTG诱导条件：
[0200]
[0201] 表7.第二组最佳IPTG诱导条件。
[0202]
[0203] 确定蛋白质表达
[0204] 用考马司(Coomassie)着色的蛋白质凝胶、蛋白质印迹分析或活性试验确认蛋白质表达。确认在两种总的细胞提取物(溶解+不溶解)的蛋白质表达，同样地确认在单独的可溶组分中确定。
[0205] 进行SDS-PAGE凝胶电泳法和蛋白质印迹分析之前，采集诱导的细胞进行细胞溶解。收获的细胞以12,000rpm离心1分钟，以形成上清液和细胞残余物。丢弃上清液并且在-70℃将残余物冻成一团。接着，用80μl的10mM TrisHCl(pH8.0)再悬浮1mlOD6001.5的细菌细胞培养物，并且將其与20μl的SDS-尿素缓冲液(5x)混合。煮沸混合物5分钟。最后的尿素浓度是4M。煮沸的样本以14,000g离心5分钟以沉淀不溶解的物质。將得到的产物加载在
10％SDS-PAGE凝胶上。用考马司在凝胶着色蛋白质的方法如LawrenceA.等在J.Vis.Exp.(30)，2009中描述般的执行。
10％SDS-PAGE凝胶上。用考马司在凝胶着色蛋白质的方法如LawrenceA.等在J.Vis.Exp.(30)，2009中描述般的执行。
[0206] 图12基于在SDS-PAGE凝胶中利用考马司G-250(Coomassie G-250)对蛋白质进行着色的结果显示在重组大肠杆菌细胞中的紧密素的表达。
[0207] 对于蛋白质印迹分析，10μl样本-SDS加载染料和分子重量标记物一起加载到10％SDS-PAGE凝胶的孔中，凝胶随后以150V进行50分钟。转移到PVDF膜后，PVDF膜在室温用具有5％牛奶的TBST浸泡(封闭)1小时。随后膜在37℃利用抗角鲨IgNar抗体(1:3000，具有5％牛奶的TBST，1:1250的25％叠氮化钠)温育1小时，膜随后利用TBST重复清洗并且另外在37℃用抗兔IgG-HRP结合的抗体(1:2000，具有5％牛奶的TBST)温育1小时。第二次温育后，膜再次利用TBST重复清洗。最后，蛋白质表达能通过使用ECL化学发光系统检测。优选地，膜在检测前能着色。在另一个示例中，第一次温育在4℃用抗-c-Myc抗体(1:50)过夜；并且第二次温育在37℃用抗-鼠IgG-HRP结合的抗体(1:3000)处理1小时。
[0208] 例如，图13显示对应于第一次试验设计，经由蛋白质印迹分析在不同IPTG诱导条件下的蛋白质表达。图14显示紧密素-sdAb在重组大肠杆菌细胞中的表达。图15显示重组大肠杆菌细胞的六个克隆体表达紧密素-sdAb，该表达显示为大约75kDa，其和紧密素sdAb的期望尺寸相近。第一次温育在37℃用抗角鲨IgNar抗体(1:3000)处理1小时，并且第二次温育在37℃利用抗兔IgG-HRP结合的抗体(1:2000)处理1小时。
[0209] 流式细胞术分析
[0210] 用荧光激活细胞分选筛选对抗原具有特异性的IgNAR的目标序列。将分选出的细菌送至测序。
[0211] 对于标准流式细胞术分析，诱导的重组细胞(1.5ml，1.0的OD600)通过在2,300g离心5分钟来收获。采集的细胞利用1ml磷酸盐缓冲溶液(PBS)(PBS已过滤灭菌)清洗并且利用PBS再悬浮以形成具有200μl最终体积的悬浮液。接着，悬浮液在30℃黑暗中用GFP(最后浓度为0.06mg/ml)或抗体(例如，PE-Myc鼠9B11，稀释200x)温育30分钟。温育后，细胞用1mlPBS清洗两次并且在250μlPBS中再悬浮。在每次试验中，血细胞计数器(Gallios，Beckman Coulter)分析至少100,000个细胞。
[0212] 图16显示从流式细胞术分析获得的图表，其中活细胞用荧光PE-myc抗体(9B11)着色。具体地，其展现出紧密素-sdAb能在大肠杆菌的外膜表达。
[0213] 图17显示IPTG诱导和GFP着色后大肠杆菌的表达。另外，同样筛选具有APC和亮紫-421信号的种群进行另外的选择。图17A显示在第一轮通过FACS筛选的FITC信号的阳性种群。图17B、C、D、E和F来自在图17A使用的相同样本，尤其是相同的原始种群，并且显示通过FACS筛选的第三轮的结果。在图17B、C、D和E的种群水平是相同的。图17F显示在图17C中的FITC-阳性种群的子种群并且显示APC和亮紫421信号阳性种群，其表明其连接到sdAb后，GFP的光谱移动。图17A和图17B通过FlowJo软件生成，其他的通过SonySH800软件生成。
[0214] 图18显示具有sdAb表达的不同菌株的平均值和百分数值的两次FACS对比。根据结果，FITC信号性能最好的10个GFP-阳性菌株是No.44、46、50、51、52、53、65、70、82和83，菌株如SEQ ID NO:10-20中列举的序列所示。
[0215] 大量生产
[0216] 挑选的大肠杆菌细胞可用于大量生产已确定了的sdAb。具体地，温育的重组细胞能利用IPTG诱导，并且通过离心采集。细胞团随后在溶解缓冲液中再悬浮，并且IgNAR通过快速蛋白质液相色谱法纯化。于是，纯化的sdAb可用于各种应用中。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 血液样本分析测试系统 | 2020-05-11 | 293 |
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