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靶序列的扩增

阅读:741发布:2021-05-18

专利汇可以提供靶序列的扩增专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本公开涉及用于从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法、 试剂 盒 和产品。本公开的某些实施方案提供了从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法,该方法包括在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增该基因组DNA,由此扩增该靶DNA序列。,下面是靶序列的扩增专利的具体信息内容。

1.从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法,所述方法包括在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增所述基因组DNA,由此扩增所述靶DNA序列。
2.如权利要求1的方法,其中所述扩增包括聚合酶链式反应。
3.如权利要求1或2所述的方法,其中所述方法包括以所述一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增所述基因组DNA,并随后以所述一种或更多种简并寡核苷酸引物和所述一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增所述基因组DNA。
4.如权利要求3所述的方法,其中所述方法包括向以所述一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增的基因组DNA添加所述一种或更多种靶DNA序列特异引物,并随后以所述一种或更多种靶DNA序列特异引物和所述一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增。
5.如权利要求1至4中任一项所述的方法,其中所述一种或更多种简并寡核苷酸引物包括相同通式的核苷酸序列。
6.如权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述一种或更多种简并寡核苷酸引物包括包括6至12个连续随机核苷酸的核苷酸序列。
7.如权利要求2至6中任一项所述的方法,其中所述方法包括聚合酶链式反应,所述聚合酶链式反应包括一个或更多个低严格性扩增的循环和一个或更多个进一步的较高严格性扩增的循环。
8.如权利要求7所述的方法,其中所述方法包括对于所述一个或更多个低严格性扩增的循环以所述一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增,并且对于所述一个或更多个较高严格性扩增的循环以所述一种或更多种简并寡核苷酸引物和所述靶DNA序列特异引物扩增。
9.如权利要求1至8中任一项所述的方法,其中所述方法包括聚合酶链式反应,所述聚合酶链式反应包括一个或更多个退火温度低于35℃的循环和一个或更多个进一步的退火温度高于50℃的循环。
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述方法包括聚合酶链式反应,所述聚合酶链式反应包括一个或更多个退火温度为20℃至35℃的循环进行1至8个循环和一个或更多个进一步的退火温度为52℃至65℃的循环进行5至25个循环。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述一种或更多种靶DNA序列特异引物包括50℃至64℃的熔解温度和18%至65%的GC含量。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述方法包括1pg至6ng的待扩增基因组DNA的量。
13.如权利要求1至12中任一项所述的方法,其中所述方法包括0.1至4μM浓度的所述一种或更多种简并寡核苷酸引物。
14.如权利要求1至13中任一项所述的方法,其中所述方法包括0.05至4μM浓度的所述一种或更多种靶DNA特异引物。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法,其中所述方法包括以另外的靶DNA序列特异引物进一步扩增经扩增的靶DNA序列一轮或更多轮。
16.如权利要求15所述的方法,其中所述另外的靶DNA序列特异引物与所述一种或更多种靶DNA序列引物不同。
17.如权利要求16所述的方法,其中所述另外的靶DNA序列引物为嵌套引物。
18.如权利要求1至17中任一项所述的方法,其中所述方法包括扩增两个或更多个靶DNA序列。
19.如权利要求1至18中任一项所述的方法,其中所述基因组DNA包括来自一个或更多个胚细胞的DNA,来自卵母细胞或其极体的DNA,来自精子的DNA,来自一个或更多个生殖细胞的DNA,来自一个或更多个体细胞的DNA,来自一个或更多个人或动物细胞的DNA,来自一个或更多个植物细胞的DNA,来自一个或更多个生物细胞的DNA,来自用于筛查疾病的一个或更多个细胞的DNA,来自一个或更多个癌细胞的DNA,用于法医检测的DNA,线粒体DNA,染色体外DNA,无细胞DNA,来自包括一个或更多个细胞的样品的DNA,来自包括无细胞DNA的样品的DNA,来自细胞裂解物的DNA,来自活检的DNA,来自组织样品的DNA,来自细胞样品的DNA,来自体液的DNA,来自血液样品的DNA,来自的DNA,来自福尔林固定样品的DNA,来自石蜡包埋样品的DNA,以及来自拭子的DNA。
20.如权利要求1至19中任一项所述的方法,其中所述基因组DNA包括来自1至50个细胞的DNA。
21.如权利要求1至20中任一项所述的方法,其中所述基因组DNA包括来自单个细胞的DNA。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法,其中所述方法还包括评估所述经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容。
23.如权利要求22所述的方法,其中所述评估核苷酸内容包括检测是否存在多态性、突变、缺失、插入、易位、甲基化状态,和/或表观遗传变化。
24.如权利要求22或23中任一项所述的方法,其中所述方法包括对所述经扩增的靶DNA序列的全部或部分测序、将所述经扩增的靶DNA序列的链杂交至一种或更多种寡核苷酸、实时PCR、以及高分辨率熔解分析中的一种或更多种。
25.从基因组扩增靶DNA序列的方法,所述方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增所述靶DNA序列,由此扩增所述靶DNA序列。
26.从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法,所述方法包括:
以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA;以及
对于至少一个或更多个扩增所述基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增所述靶DNA序列,
由此扩增所述靶DNA序列。
27.如权利要求25或26所述的方法,其中所述扩增包括聚合酶链式反应。
28.从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法,所述方法包括:
以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行所述基因组DNA的全基因组扩增;以及
对于所述全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增所述靶DNA序列,
由此扩增所述靶DNA序列。
29.如权利要求28所述的方法,其中所述全基因组扩增包括采用聚合酶链式反应扩增。
30.如权利要求1至29中任一项所述的方法,其中所述方法用于植入前遗传筛查、植入前遗传诊断、产前筛查、疾病筛查、癌症筛查、遗传标记筛查,和/或法医筛查。
31.权利要求1至29中任一项的方法扩增的靶DNA序列。
32.评估从基因组DNA扩增的靶DNA序列的核苷酸内容的方法,所述方法包括评估权利要求31的靶DNA序列的核苷酸内容。
33.评估基因组DNA中靶DNA序列的核苷酸内容的方法,所述方法包括:
在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增所述基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容,以便评估所述靶DNA序列的核苷酸内容。
34.评估基因组DNA中靶DNA序列的核苷酸内容的方法,所述方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增所述靶DNA序列,并评估经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容,以便评估所述靶DNA序列的核苷酸内容。
35.评估基因组DNA中靶DNA序列的核苷酸内容的方法,所述方法包括:
以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA;以及
对于至少一个或更多个扩增所述基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增所述靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容,以便评估所述靶DNA序列的核苷酸内容。
36.评估基因组DNA中靶DNA序列的核苷酸内容的方法,所述方法包括:
以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行所述基因组DNA的全基因组扩增;
对于所述全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增所述靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容,以便评估所述靶DNA序列的核苷酸内容。
37.如权利要求32至36中任一项所述的方法,其中所述评估核苷酸内容包括确定所述经扩增的靶DNA的核苷酸内容。
38.如权利要求32至37中任一项所述的方法,其中所述方法包括检测是否存在多态性、突变、缺失、插入、易位、甲基化状态,和/或表观遗传变化。
39.如权利要求32至38中任一项所述的方法,其中所述方法包括对所述经扩增的靶DNA序列的全部或部分测序、将所述经扩增的靶DNA序列的链杂交至一种或更多种寡核苷酸、实时PCR、以及高分辨率熔解分析中的一种或更多种。
40.如权利要求32至39中任一项所述的方法,其中所述方法用于植入前遗传筛查、植入前遗传诊断、产前筛查、疾病筛查、癌症筛查、遗传标记筛查,和/或法医筛查。
41.确定基因组DNA中靶DNA序列的核苷酸序列的方法,所述方法包括:
在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增所述基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
确定所述经扩增的靶DNA序列的核苷酸序列,
由此确定所述靶DNA序列的核苷酸序列。
42.植入前遗传筛查胚胎的方法,所述方法包括:
在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述胚胎的基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胚胎。
43.植入前遗传筛查胚胎的方法,所述方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述胚胎的基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述胚胎的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列,并评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胚胎。
44.植入前遗传筛查胚胎的方法,所述方法包括:
以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述胚胎的基因组DNA;
对于至少一个或更多个扩增所述基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述胚胎的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胚胎。
45.植入前遗传筛查胚胎的方法,所述方法包括:
以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行来自所述胚胎的基因组DNA的全基因组扩增;
对于所述全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述胚胎的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胚胎。
46.植入前遗传筛查卵母细胞的方法,所述方法包括:
在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自卵母细胞或其极体的基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述卵母细胞。
47.植入前遗传筛查卵母细胞的方法,所述方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述卵母细胞或极体的基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述卵母细胞或其极体的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列,并评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述卵母细胞。
48.植入前遗传筛查卵母细胞的方法,所述方法包括:
以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述卵母细胞或其极体的基因组DNA;
对于至少一个或更多个扩增所述基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述卵母细胞或极体的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述卵母细胞。
49.植入前遗传筛查卵母细胞的方法,所述方法包括:
以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行来自所述卵母细胞或其极体的基因组DNA的全基因组扩增;
对于所述全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述卵母细胞或极体的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述卵母细胞。
50.如权利要求46至50中任一项所述的方法,其中所述方法用于筛查所述卵母细胞的受精适宜性。
51.筛查精子的方法,所述方法包括:
在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自一个或更多个精子的基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述精子。
52.筛查精子的方法,所述方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述一个或更多个精子的基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述一个或更多个精子的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列,并评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述精子。
53.筛查精子的方法,所述方法包括:
以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自一个或更多个精子的基因组DNA;
对于至少一个或更多个扩增所述基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述一个或更多个精子的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述精子。
54.筛查精子的方法,所述方法包括:
以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行来自一个或更多个精子的基因组DNA的全基因组扩增;
对于所述全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述一个或更多个精子的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述精子。
55.如权利要求51至54中任一项所述的方法,其中所述方法用于筛查所述精子的受精适宜性。
56.产前筛查胎儿的方法,所述方法包括:
在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述胎儿的基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胎儿。
57.产前筛查胎儿的方法,所述方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述胎儿的基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述胎儿的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列,并评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胎儿。
58.产前筛查胎儿的方法,所述方法包括:
以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述胎儿的基因组DNA;
对于至少一个或更多个扩增所述基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述胎儿的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胎儿。
59.产前筛查胎儿的方法,所述方法包括:
以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行来自一个或更多个精子的基因组DNA的全基因组扩增;
对于所述全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述胎儿的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胎儿。
60.如权利要求56至59中任一项所述的方法,其中所述方法用于筛查所述胎儿的遗传病症。
61.用于进行权利要求1至30或32至60中任一项的方法的试剂盒。
62.权利要求31的靶DNA序列用于植入前遗传筛查,植入前遗传诊断,产前筛查,疾病筛查,癌症筛查,遗传标记筛查,多态性、突变、缺失、插入、易位、扩张、倒位、甲基化状态,和/或表观遗传改变的筛查,和/或法医筛查的用途。
63.组合产品,所述产品包括以下组分:
(i)用于全基因组扩增的一种或更多种简并寡核苷酸引物;
(ii)用于扩增靶DNA序列的一种或更多种引物;以及
(iii)用于在全基因组扩增期间扩增所述靶DNA序列的一种或更多种试剂和/或说明书

说明书全文

靶序列的扩增

优先权主张

[0001] 本申请主张2016年3月31日提交的澳大利亚临时专利申请号2016901197的优先权,通过引用将其内容在此并入。

技术领域

[0002] 本公开涉及用于从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法、试剂盒和产品。

背景技术

[0003] 扩增存在于基因组DNA中的特异靶序列的能被用在各个领域,例如用于研究目的、重组DNA技术、遗传筛查,以及用于法医分析。
[0004] 尽管靶特异扩增被广泛使用,但其带有数个缺点,尤其是在起始基因组材料的量受限的情况下。例如,靶特异扩增通常导致受限的基因组材料的快速耗尽,并且典型地是仅允许分析特异扩增的序列。结果,通常难以从该基因组DNA的剩余物获得其他重要遗传信息。
[0005] 全基因组扩增(WGA)为这样的方法,其部分地被开发来处理具有有限基因组DNA用于分析的问题。全基因组扩增使得能够仅采用非常少量的起始材料扩增整个基因组,这样可提供有限样品的永存,以便可在该样品上进行其他期望的分析。
[0006] 已经为全基因组扩增开发了各种方法,包括简并寡核苷酸PCR(DOP-PCR),引物延伸预扩增(PEP)和多重置换扩增(MDA)。DOP-PCR和PEP基于标准PCR技术,而MDA为非PCR扩增技术,其利用一些聚合酶的链置换能力。然后可以例如通过诸如比较基因组杂交(CGH)分析、SNP分析、以及测序技术的技术分析通过全基因组扩增扩增的基因组DNA。
[0007] 但是,尽管全基因组扩增提供了扩增基因组DNA用于分析的能力,从所扩增的基因组DNA扩增特异靶序列带有数个缺点,例如如下的一个或更多个:在WGA过程中引入的等位基因脱扣(allele drop out)和/或偏倚事件、不均一序列覆盖的可能性、特异区域的呈现(representation)过度或不足、重复性,以及将错误引入该特异靶序列。
[0008] 因此,亟需为从全基因组扩增的DNA扩增特异靶序列提供改进的方法和/或产品。发明内容
[0009] 本公开涉及用于从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法、试剂盒和产品。
[0010] 本公开的某些实施方案提供从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法,该方法包括在一种或更多种靶DNA序列特异引物的存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增所述基因组DNA,由此扩增所述靶DNA序列。
[0011] 本公开的某些实施方案提供了从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法,该方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增所述靶DNA序列,由此扩增所述靶DNA序列。
[0012] 本公开的某些实施方案提供从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA;以及
对于至少一个或更多个扩增该基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异引
物扩增所述靶DNA序列,
由此扩增所述靶DNA序列。
[0013] 本公开的某些实施方案提供从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行所述基因组DNA的全基因组扩增;以及
对于所述全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增所述靶DNA序列,
由此扩增所述靶DNA序列。
[0014] 本公开的某些实施方案提供通过本文描述的方法扩增的靶DNA序列。
[0015] 本公开的某些实施方案提供评估通过本文描述的方法从基因组DNA扩增的靶DNA序列的核苷酸内容(nucleotide content)的方法。
[0016] 本公开的某些实施方案提供评估基因组DNA中靶DNA序列的核苷酸内容的方法,该方法包括:在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增所述基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容,以便评估所述靶DNA序列的核苷酸内容。
[0017] 本公开的某些实施方案提供了评估基因组DNA中靶DNA序列的核苷酸内容的方法,该方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增所述靶DNA序列,并评估经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容。
[0018] 本公开的某些实施方案提供评估基因组DNA中靶DNA序列的核苷酸内容的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA;以及
对于至少一个或更多个扩增所述基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异
引物扩增所述靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容,以便评估所述靶DNA序列的核苷酸内容。
[0019] 本公开的某些实施方案提供评估基因组DNA中靶DNA序列的核苷酸内容的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行所述基因组DNA的全基因组扩增;
对于所述全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增所述靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容,以便评估所述靶DNA序列的核苷酸内容。
[0020] 本公开的某些实施方案提供确定基因组DNA中靶DNA序列的核苷酸序列的方法,该方法包括:在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增所述基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
确定所述经扩增的靶DNA序列的核苷酸序列,
由此确定所述靶DNA序列的核苷酸序列。
[0021] 本公开的某些实施方案提供植入前遗传筛查(pre-implantation genetic screening)胚胎的方法,该方法包括:
在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述胚胎的基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胚胎。
[0022] 本公开的某些实施方案提供了植入前遗传筛查胚胎的方法,该方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述胚胎的基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述胚胎的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列,并评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胚胎。
[0023] 本公开的某些实施方案提供植入前遗传筛查胚胎的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述胚胎的基因组DNA;
对于至少一个或更多个扩增所述基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异
引物扩增来自所述胚胎的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胚胎。
[0024] 本公开的某些实施方案提供植入前遗传筛查胚胎的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行来自所述胚胎的基因组DNA的全基因组扩增;
对于所述全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述胚胎的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胚胎。
[0025] 本公开的某些实施方案提供植入前遗传筛查卵母细胞的方法,该方法包括:在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自卵母细胞或其极体的基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述卵母细胞。
[0026] 本公开的某些实施方案提供了植入前遗传筛查卵母细胞的方法,该方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述卵母细胞或极体的基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述卵母细胞或其极体的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列,并评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述卵母细胞。
[0027] 本公开的某些实施方案提供植入前遗传筛查卵母细胞的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述卵母细胞或其极体的基因组DNA;
对于至少一个或更多个扩增所述基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异
引物扩增来自所述卵母细胞或极体的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述卵母细胞。
[0028] 本公开的某些实施方案提供植入前遗传筛查卵母细胞的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行来自所述卵母细胞或其极体的基因组DNA的全基因组扩增;
对于全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述卵母细胞或极体的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述卵母细胞。
[0029] 本公开的某些实施方案提供筛查精子的方法,该方法包括:在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自一个或更多个精子的基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述精子。
[0030] 本公开的某些实施方案提供了筛查精子的方法,该方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自一个或更多个精子的基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述一个或更多个精子的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列,并评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述精子。
[0031] 本公开的某些实施方案提供筛查精子的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自一个或更多个精子的基因组DNA;
对于至少一个或更多个扩增所述基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异
引物扩增来自所述一个或更多个精子的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述精子。
[0032] 本公开的某些实施方案提供筛查精子的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行来自一个或更多个精子的基因组DNA的全基因组扩增;
对于所述全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述一个或更多个精子的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述精子。
[0033] 本公开的某些实施方案提供产前筛查胎儿的方法,该方法包括:在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述胎儿的基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胎儿。
[0034] 本公开的某些实施方案提供了胎儿的产前遗传筛查的方法,该方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述胎儿的基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述胎儿的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列,并评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胎儿。
[0035] 本公开的某些实施方案提供产前筛查胎儿的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述胎儿的基因组DNA;
对于至少一个或更多个扩增所述基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异
引物扩增来自所述胎儿的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胎儿。
[0036] 本公开的某些实施方案提供产前筛查胎儿的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行来自一个或更多个精子的基因组DNA的全基因组扩增;
对于所述全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自所述胎儿的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胎儿。
[0037] 本公开的某些实施方案提供用于进行本文描述的方法的试剂盒。
[0038] 本公开的某些实施方案提供如本文描述扩增的靶DNA序列用于植入前遗传筛查,植入前遗传诊断,产前筛查(prenatal screening),疾病筛查,癌症筛查,遗传标记筛查,多态性、突变、缺失、插入、易位、扩张(expansion)、倒位、甲基化状态和/或表观遗传改变的筛查,和/或法医筛查的用途。
[0039] 本公开的某些实施方案提供组合产品,该产品包括如下组分:(i)用于全基因组扩增的一种或更多种简并寡核苷酸引物;
(ii)用于扩增靶DNA序列的一种或更多种引物;以及
(iii)用于在全基因组扩增期间扩增所述靶DNA序列的一种或更多种试剂和/或说明
书。
[0040] 其他的实施方案在本文有描述。附图简要说明
[0041] 某些实施方案通过以下附图阐述。应理解,以下的描述仅是出于描述具体实施方案的目的,而无意对描述进行限制。
[0042] 图1显示单个细胞经全基因组扩增和基因靶向后的扩增产物。泳道2至5显示作为以0.25μM终引物浓度进行的全基因组扩增和基因靶向的结果的单细胞产物。泳道5的细胞扩增失败。泳道7至10显示作为以0.1μM终引物浓度进行的全基因组扩增和基因靶向的结果的单细胞产物。与对照细胞相比,在带有基因靶向的扩增的细胞中看到的较弱的扩增(泳道12至15)。
[0043] 图2显示单个细胞和30pg gDNA经全基因组扩增后的扩增产物。与泳道11至18中的对照样品相比,由于存在0.5μM终浓度的基因特异引物,泳道2至9显示较弱的扩增。
[0044] 图3显示联合的全基因组扩增和基因靶向的单细胞产物种入(seeded into)两个基因特异PCR中后第二轮PCR生成的扩增子电泳图。与对照(泳道9至12)相比,由于添加0.25μM基因特异引物(泳道2至4),D4S43PCR凝胶显示靶D4S43标记的富集扩增。类似地,与对照(泳道8至11)相比,由于添加终浓度0.25μM和0.1μM的基因特异引物,Y染色体PCR显示靶基因的富集扩增(泳道1至3和4至7)。用分子量标准DMW-100M(Geneworks)对样品进行电泳。
[0045] 图4显示联合的全基因组扩增和基因靶向的单细胞产物种入两个基因特异PCR中后第二轮PCR生成的扩增子的电泳图。与对照(泳道6至9)相比,由于添加0.5μM基因特异引物(泳道2至5),D4S43PCR凝胶显示靶D4S43标记的富集扩增。类似地,与对照泳道5至8相比,由于添加终浓度0.5μM的基因特异引物,Y染色体PCR显示靶基因的富集扩增(泳道1至4)。用分子量标准DMW-100M(Geneworks)对样品进行电泳。
[0046] 图5显示了,采用下一代测序,与仅全基因组扩增比较的在联合的全基因组扩增和基因靶向扩增后HBB的覆盖广度。在联合的全基因组扩增和基因靶向扩增后,产物种入两个基因特异PCR。将第二轮PCR扩增子与带有基因靶向扩增的全基因组扩增的DNA合并以生成1:20最终稀释。对仅全基因组PCR产物(WGA)、联合的全基因组扩增和基因靶向扩增的产物(WGA+TSE)以及该1:20稀释的合并物测序。该图显示,当将第二轮HBB PCR产物的1:20稀释物合并回联合的带有基因靶向扩增的全基因组扩增的样品时,实现了两HBB靶向序列(外显子1和2以及外显子3)的100%覆盖广度。绘出了均值。
[0047] 图6显示,采用下一代测序,在联合的全基因组扩增和基因靶向扩增以及进一步的HBB PCR产物合并后,与全基因组扩增和基因靶向扩增相比,对于HBB的外显子1和2以及外显子3的覆盖深度。在联合的全基因组扩增和基因靶向扩增后,产物种入两个HBB特异PCR。将第二轮HBB PCR扩增子与带有基因靶向扩增的全基因组扩增的DNA合并以生成1:20最终稀释。对联合的全基因组扩增和基因靶向扩增产物(WGA+TSE)和1:20稀释的合并DNA测序。
当对1:20稀释的合并DNA测序时得到>60x的HBB序列平均覆盖深度。
[0048] 图7显示了,采用下一代测序,与仅全基因组扩增比较的在联合的全基因组扩增和基因靶向扩增后对靶向基因HLA的覆盖广度。在联合的全基因组扩增和基因靶向扩增后,将产物种入一个HLA特异PCR。将该第二轮HLA PCR扩增子与带有基因靶向扩增的全基因组扩增的DNA合并以生成1:20和1:10最终稀释。对仅全基因组扩增的PCR产物(WGA)、联合的全基因组扩增和基因靶向扩增的产物(WGA+TSE)、该1:20和1:10稀释的合并DNA以及第二轮HLA PCR扩增子(扩增子)测序。该图显示,当将第二轮HLA PCR产物的1:20和1:10稀释物合并回联合的带有基因靶向扩增的全基因组扩增的样品时,以及单独的HLA PCR产物,实现了HBB的100%覆盖广度。绘出了均值。
[0049] 图8显示了,采用下一代测序,在联合的全基因组扩增和基因靶向扩增后对HLA的覆盖深度。在联合的全基因组扩增和基因靶向扩增后,将产物种入HLA特异PCR。将该第二轮HLA PCR扩增子与带有基因靶向扩增的全基因组扩增的DNA合并以生成1:20和1:10最终稀释。对联合的全基因组扩增和基因靶向扩增的产物(WGA+TSE)、该1:20和1:10稀释的合并DNA以及第二轮HLA PCR扩增子(扩增子)测序。当对该1:20和1:10稀释的合并DNA以及第二轮HLA PCR扩增子测序时,获得>60x的HLA平均覆盖深度。

具体实施方式

[0050] 本公开涉及用于从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法、试剂盒和产品。
[0051] 本公开基于这样的判定,即有可能在全基因组扩增期间扩增特异靶DNA序列。
[0052] 本公开的某些实施方案针对具有一个或更多个优点组合的方法和产品。例如,本文公开的一些实施方案的一些优点包括如下的一个或更多个:当从全基因组扩增的DNA扩增靶DNA序列时等位基因脱扣的可能性的降低;改善的分析从全基因组扩增的DNA扩增的靶DNA序列的能力;降低与从全基因组扩增的DNA扩增的靶DNA序列的扩增相关的偏倚(bias);降低用于从全基因组扩增的DNA扩增靶DNA序列的PCR循环的次数;从全基因组扩增的DNA扩增特异靶DNA序列的时间上的改进;减少的耗材和/或人力资源使用;降低的成本;和/或提供商业选择。
[0053] 本公开的某些实施方案提供从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法。
[0054] 术语“扩增(amplifying)”或诸如“扩增(amplification)”和“扩增的(amplified)”的变体指拷贝核酸以产生该核酸的全部或部分的更多拷贝的过程。例如,核酸的扩增可以采用聚合酶链式反应(PCR)、诸如采用适当聚合酶的多重置换扩增的等温方法或滚换扩增来从酶学上实现。也考虑其他类型的扩增方法。用于进行扩增的方法在本文中有描述。
[0055] 术语“基因组DNA”指源自生物体的全部或部分DNA,包括染色体DNA、细胞DNA、线粒体DNA、以及病毒DNA。该基因组DNA可以例如从原核或真核细胞DNA、病毒DNA、体细胞DNA、生殖细胞DNA、配子DNA、极体DNA、胚细胞DNA,或胎儿DNA分离、加工或提取。该术语包括源自外显子DNA、内含子DNA、非编码DNA、编码RNA的DNA、非重复DNA、重复DNA、转座子DNA、染色体外DNA、细胞器DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA、病毒DNA、质粒DNA、核DNA、核外DNA、细胞质DNA、cDNA和无细胞DNA的DNA。也考虑其他类型的DNA。
[0056] 术语“靶DNA序列”指待扩增的DNA的特定区域或部分。例如,该靶DNA序列可以为基因的全部或部分、基因座、编码区、一个或更多个外显子和/或一个或更多个内含子、SNP、待评估突变的区域、等位基因区域,或编码RNA的DNA的全部或部分。也考虑其他类型的靶DNA序列。
[0057] 本公开的某些实施方案提供从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法,该方法包括在一种或更多种靶DNA序列特异引物的存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA,由此扩增该靶DNA序列。
[0058] 在某些实施方案中,该扩增包括聚合酶链式反应。用于采用聚合酶链式反应的方法如本文所描述。用于进行扩增的方法例如在Fakruddin等,(2013)J Pharm Bioallied Sci5(4):245-252中有描述。
[0059] 在某些实施方案中,该扩增包括等温扩增反应。进行等温扩增的方法在本领域中是已知的,例如环介导等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖扩增(HDA),以及切刻酶扩增反应(NEAR)。在某些实施方案中,该扩增包括采用多重置换扩增的反应。用于进行多重置换扩增WGA的方法在本领域是已知的,例如Dean等(2002)Proc Natl.Acad.Sci USA 99:5261中所描述。在某些实施方案中,该扩增包括采用滚换扩增的反应。也考虑其他类型的扩增。用于扩增的方法例如在Walker等(1992)Nucleic Acids Res.20:1691-1696;
Walker等(1993)PCR Methods Appl.3:1-6;Notomi等(2000)Nucleic Acids Res.28:e63;
Tomita N等(2008)Nat.Protoc.3:877-882;Lizardi等(1998)Nat.Genet.19:225-232;
Blanco等(1989)J.Biol.Chem.264:8935-8940;以及Dean等.(2001)Genome Res.11:1095-
1099,和Fakruddin等(2013)J Pharm Bioallied Sci 5(4):245-252中有描述。
[0060] 在某些实施方案中,该靶DNA序列包括基因的全部或部分、基因座、编码区、一个或更多个外显子和/或一个或更多个内含子、待评估突变的区域、等位基因区域、具有SNP或其他类型多态性的区域,或编码RNA的DNA的全部或部分、待评估是否存在突变的区域、标记DNA,和/或用于鉴定DNA的存在或类型的区域。也考虑其他类型的靶DNA序列。
[0061] 在某些实施方案中,该基因组DNA包括来自一个或更多个胚细胞的DNA,来自卵母细胞或其极体的DNA,来自精子的DNA,来自一个或更多个生殖细胞的DNA,来自一个或更多个体细胞的DNA,来自一个或更多个人或动物细胞的DNA,来自一个或更多个植物细胞的DNA,来自一个或更多个微生物细胞的DNA,来自用于筛查疾病的一个或更多个细胞的DNA,来自一个或更多个癌细胞的DNA,用于法医检测的DNA,线粒体DNA,染色体外DNA,无细胞DNA,来自包括一个或更多个细胞的样品的DNA,来自包括无细胞DNA的样品的DNA,来自细胞裂解物的DNA,来自活检的DNA,来自组织样品的DNA,来自细胞样品的DNA,来自体液的DNA,来自血液样品的DNA,胎儿DNA,无细胞DNA,来自的DNA,来自福尔林固定样品的DNA,来自石蜡包埋样品的DNA,以及来自拭子的DNA。也考虑其他类型的DNA。用于在扩增反应中获得或使用DNA的方法在本领域中是已知的。
[0062] 在某些实施方案中,该基因组DNA包括来自裂解的细胞的DNA。在某些实施方案中,该基因组DNA包括非纯化DNA。在某些实施方案中,该基因组DNA包括提取的DNA。在某些实施方案中,该基因组DNA包括经加工的DNA。在某些实施方案中,该基因组DNA包括纯化的DNA或部分纯化的DNA。在某些实施方案中,该基因组DNA包括无细胞DNA。
[0063] 在某些实施方案中,该方法包括少于0.5pg、少于1pg、少于2.5pg、少于5pg、少于10pg、少于25、少于50pg、少于100pg、少于250pg、少于500pg、少于1ng、少于2.5ng、少于5ng或少于10ng的量的待扩增基因组DNA。也考虑其他的量。
[0064] 在某些实施方案中,该方法包括至少0.5pg、至少1pg、至少2.5pg、至少5pg、至少10pg、至少25pg、至少50pg、至少100pg、至少250pg、至少500pg、至少1ng、至少2.5ng、至少
5ng或至少10ng的量的待扩增基因组DNA。也考虑其他的量。
[0065] 在某些实施方案中,该方法包括0.5pg至10ng,1pg至10ng、2.5pg至10ng、5pg至10ng、10pg至10ng、25pg至10ng、50pg至10ng、100pg至10ng、250pg至10ng、500pg至10ng、1ng至10ng、2.5ng至10ng、5ng至10ng、0.5pg至5ng、1pg至5ng、2.5pg至5ng、5pg至5ng、10pg至
5ng、25pg至5ng、50pg至5ng、100pg至5ng、250pg至5ng、500pg至5ng、1ng至5ng、2.5ng至5ng、
0.5pg至2.5ng、1pg至2.5ng、2.5pg至2.5ng、5pg至2.5ng、10pg至2.5ng、25pg至2.5ng、50pg至2.5ng、100pg至2.5ng、250pg至2.5ng、500pg至2.5ng、1ng至2.5ng、0.5pg至1ng、1pg至
1ng、2.5pg至1ng、5pg至1ng、10pg至1ng、25pg至1ng、50pg至1ng、100pg至1ng、250pg至1ng、
500pg至1ng、0.5pg至500pg、1pg至500pg、2.5pg至500pg、5pg至500pg、10pg至500pg、25pg至
500pg、50pg至500pg、100pg至500pg、250pg至500pg、0.5pg至250pg、1pg至250pg、2.5pg至
250pg、5pg至250pg、10pg至250pg、25pg至250pg、50pg至250pg、100pg至250pg、0.5pg至
100pg、1pg至100pg、2.5pg至100pg、5pg至100pg、10pg至100pg、25pg至100pg、50pg至100pg、
0.5pg至50pg、1pg至50pg、2.5pg至50pg、5pg至50pg、10pg至50pg、25pg至50pg、0.5pg至
25pg、1pg至25pg、2.5pg至25pg、5pg至25pg、10pg至25pg、0.5pg至10pg、1pg至10pg、2.5pg至
10pg、5pg至10pg、0.5pg至5ng、1pg至5ng、2.5pg至5pg、0.5pg至2.5pg、1pg至2.5pg,或0.5pg至1pg的量的待扩增基因组DNA。也考虑其他的量。
[0066] 在某些实施方案中,该方法包括1pg至6ng的量的待扩增基因组DNA。
[0067] 在某些实施方案中,该基因组DNA包括来自1至50个细胞的DNA。在某些实施方案中,该基因组DNA包括来自单个细胞、1至10个细胞、1至20个细胞、1至50个细胞、多于10个细胞、少于10个细胞、多于50个细胞、少于50个细胞、多于100个细胞,或少于100个细胞的DNA。也考虑来自其他细胞数量的DNA。
[0068] 细胞类型的实例包括一个或更多个胚细胞,卵母细胞或其极体,精子,一个或更多个生殖细胞,一个或更多个体细胞,一个或更多个人或动物细胞,一个或更多个植物细胞,一个或更多个来自微生物的细胞,一个或更多个用于疾病、状况或状态筛查的细胞,一个或更多个癌细胞或癌前细胞,来自活检的细胞,一个或更多个胎儿细胞,来自组织样品的细胞,体液中的/来自体液的细胞,血液样品中的/来自血液样品的细胞,羊水中的/来自羊水的细胞,福尔马林固定样品中的/来自福尔马林固定样品的细胞,石蜡包埋样品中的/来自石蜡包埋样品的细胞,以及拭子中的/来自拭子的细胞。也考虑其他类型的细胞和其他来源的细胞。获得细胞的方法在本领域中是已知的。
[0069] 术语“简并寡核苷酸引物(degenerate oligonucleotide primer)”指其核苷酸序列的全部或部分为部分简并的序列(partially degenerate sequence)的寡核苷酸。这样的引物可潜在地结合很多序列。通常,这类寡核苷酸或者具有这样的核苷酸序列部分,其在特定位置具有超过一个基的可能性,和/或该寡核苷酸具有这样的核苷酸序列部分,其具有可与一种或更多种其他碱基形成碱基对的碱基。用于设计包括简并寡核苷酸引物在内的引物的方法和程序在本领域中是已知的。
[0070] 在某些实施方案中,采用简并寡核苷酸引物的基因组DNA扩增导致基因组DNA的全基因组扩增(whole genome amplification,WGA)。
[0071] 该简并寡核苷酸引物可以包括DNA、RNA、DNA或RNA的变体、糖-磷酸骨架的变体,和/或一个或更多个碱基的变体,例如被修饰碱基或甲基化碱基。也考虑其他类型的变体。
[0072] 能够与不止一种碱基结合的简并碱基的实例包括2-基嘌呤、5-甲基异脱胞嘧啶(Me isodC)、5-硝基吲哚、肌苷脱氧(Inosine deoxy)、肌苷核糖(Inosine ribo)、异脱氧苷dG。也考虑其他的碱基。
[0073] 用于设计简并引物的方法在本领域中是已知的,包括诸如iCODEHOP(COnsensus-DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers),NCBI Primer-BLAST和HYDEN(HighlY DEgeNerate primers)的程序。用于产生简并寡核苷酸引物的方法在本领域中是已知的,包括化学合成。
[0074] 在某些实施方案中,该一种或更多种简并寡核苷酸引物在其3'端包括一个或更多个确定/固定核苷酸的序列。在某些实施方案中,该简并寡核苷酸引物在其3'端和在其5'端包括一个或更多个确定/固定核苷酸的序列。
[0075] 在某些实施方案中,该一种或更多种简并寡核苷酸引物包括包括6至12个连续随机核苷酸的核苷酸序列。例如,用在WGA中的简并寡核苷酸引物为具有序列5’-CTCGAGNNNNATGTGG-3’(SEQ ID  NO.5)(其中N=A、C、G或T)的引物、具有序列5’-CGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3’(SEQ ID NO.6)(其中N=A、C、G或T)的引物,或具有序列5’-CCGACCGAGNNNNNNATGTGG-3’(SEQ ID NO.7)(其中N=A、C、G或T)的引物。也考虑具有其他序列的引物。
[0076] 在某些实施方案中,该简并寡核苷酸引物具有至少12个碱基、至少13个碱基、至少14个碱基、至少15个碱基、至少16个碱基、至少17个碱基、至少18个碱基、至少19个碱基、至少20个碱基,或至少25个碱基的大小。也考虑其他的大小。
[0077] 在某些实施方案中,该简并寡核苷酸引物具有少于25个碱基、少于20个碱基、少于19个碱基、少于18个碱基、少于17个碱基、少于16个碱基、少于15个碱基、少于14个碱基、少于13个碱基或少于12个碱基的大小。也考虑其他的大小。
[0078] 在某些实施方案中,该简并寡核苷酸具有12至25个碱基、13至25个碱基、14至25个碱基、15至25个碱基、16至25个碱基、17至25个碱基、18至25个碱基、19至25个碱基、20至25个碱基、21至25个碱基、22至25个碱基、23至25个碱基、24至25个碱基、12至24个碱基、13至24个碱基、14至24个碱基、15至24个碱基、16至24个碱基、17至24个碱基、18至24个碱基、19至24个碱基、20至24个碱基、21至24个碱基、22至24个碱基、23至24个碱基、12至23个碱基、
13至23个碱基、14至23个碱基、15至23个碱基、16至23个碱基、17至23个碱基、18至23个碱基、19至23个碱基、20至23个碱基、21至23个碱基、22至23个碱基、12至22个碱基、13至22个碱基、14至22个碱基、15至22个碱基、16至22个碱基、17至22个碱基、18至22个碱基、19至22个碱基、20至22个碱基、21至22个碱基、12至20个碱基、13至20个碱基、14至20个碱基、15至
20个碱基、16至20个碱基、17至20个碱基、18至20个碱基、19至20个碱基、12至19个碱基、13至19个碱基、14至19个碱基、15至19个碱基、16至19个碱基、17至19个碱基、18至19个碱基、
12至18个碱基、13至18个碱基、14至18个碱基、15至18个碱基、16至18个碱基、17至18个碱基、12至17个碱基、13至17个碱基、14至17个碱基、15至17个碱基、16至17个碱基、12至16个碱基、13至16个碱基、14至16个碱基、15至16个碱基、12至15个碱基、13至15个碱基、14至15个碱基、12至14个碱基、13至14个碱基或12至13个碱基的大小。也考虑其他的大小。
[0079] 使用简并寡核苷酸引物的方法在本领域中是已知的,例如在Telenius,H.,Carter,N.P.,Bebb,C.E.等(1992)“Degenerate oligonucleotide-primed PCR:general amplification of target DNA by a single degenerate primer”Genomics 13:718中有描述。
[0080] 在某些实施方案中,该一种或更多种简并寡核苷酸引物包括一组具有相同通用核苷酸序列(general nucleotide sequence)的引物。在某些实施方案中,该一种或更多种简并寡核苷酸引物包括具有相同通式的核苷酸序列。在某些实施方案中,该一种或更多种简并引物包括一组具有不同通用核苷酸序列的引物。在某些实施方案中,该一种或更多种简并寡核苷酸引物是不同的。
[0081] 在某些实施方案中,该方法包括该一种或更多种简并寡核苷酸引物的浓度为至少0.1μM、至少0.25μM、至少0.5μM、至少1μM、至少2.5μM,或至少5μM。也考虑其他的浓度。
[0082] 在某些实施方案中,该方法包括该一种或更多种简并寡核苷酸引物的浓度为少于0.1μM、少于0.25μM、少于0.5μM、少于1μM、少于2.5μM,或少于5μM。也考虑其他的浓度。
[0083] 在某些实施方案中,该方法包括该一种或更多种简并寡核苷酸引物的浓度为0.05至5μM、0.1至5μM、0.25至5μM、0.5至5μM、1至5μM、2.5至5μM、0.05至4μM、0.1至4μM、0.25至4μM、0.5至4μM、1至4μM、2.5至4μM、0.05至2.5μM、0.1至2.5μM、0.25至2.5μM、0.5至2.5μM、1至2.5μM、0.05至1μM、0.1至1μM、0.25至1μM、0.5至1μM、0.05至0.5μM、0.1至0.5μM、0.25至0.5μM、0.05至0.25μM、0.1至0.25μM,或0.05至0.1μM。也考虑其他的浓度。
[0084] 在某些实施方案中,该方法包括0.1至4μM浓度的该一种或更多种简并寡核苷酸引物。
[0085] 在某些实施方案中,所述一种或更多种靶DNA序列特异引物具有至少12个碱基、至少13个碱基、至少14个碱基、至少15个碱基、至少16个碱基、至少17个碱基、至少18个碱基、至少19个碱基、至少20个碱基,或至少25个碱基的大小。也考虑其他的大小。
[0086] 在某些实施方案中,该一种或更多种靶DNA序列特异引物具有少于25个碱基、少于20个碱基、少于19个碱基、少于18个碱基、少于17个碱基、少于16个碱基、少于15个碱基、少于14个碱基、少于13个碱基或少于12个碱基的大小。也考虑其他的大小。
[0087] 在某些实施方案中,该一种或更多种靶DNA序列特异引物具有12至25个碱基、13至25个碱基、14至25个碱基、15至25个碱基、16至25个碱基、17至25个碱基、18至25个碱基、19至25个碱基、20至25个碱基、21至25个碱基、22至25个碱基、23至25个碱基、24至25个碱基、
12至24个碱基、13至24个碱基、14至24个碱基、15至24个碱基、16至24个碱基、17至24个碱基、18至24个碱基、19至24个碱基、20至24个碱基、21至24个碱基、22至24个碱基、23至24个碱基、12至23个碱基、13至23个碱基、14至23个碱基、15至23个碱基、16至23个碱基、17至23个碱基、18至23个碱基、19至23个碱基、20至23个碱基、21至23个碱基、22至23个碱基、12至
22个碱基、13至22个碱基、14至22个碱基、15至22个碱基、16至22个碱基、17至22个碱基、18至22个碱基、19至22个碱基、20至22个碱基、21至22个碱基、12至20个碱基、13至20个碱基、
14至20个碱基、15至20个碱基、16至20个碱基、17至20个碱基、18至20个碱基、19至20个碱基、12至19个碱基、13至19个碱基、14至19个碱基、15至19个碱基、16至19个碱基、17至19个碱基、18至19个碱基、12至18个碱基、13至18个碱基、14至18个碱基、15至18个碱基、16至18个碱基、17至18个碱基、12至17个碱基、13至17个碱基、14至17个碱基、15至17个碱基、16至
17个碱基、12至16个碱基、13至16个碱基、14至16个碱基、15至16个碱基、12至15个碱基、13至15个碱基、14至15个碱基、12至14个碱基、13至14个碱基或12至13个碱基的大小。也考虑其他的大小。
[0088] 用于设计和产生引物的方法在本领域中是已知的。通常,采用化学合成从核苷亚磷酰胺生成引物/寡核苷酸,但是也考虑化学合成的其他方法。
[0089] 在某些实施方案中,该一种或更多种靶DNA序列特异引物包括至少50℃、至少55℃、至少60℃或至少65℃的熔解温度。也考虑其他的熔解温度。
[0090] 确定熔解温度的方法在本领域中是已知的。本文引述的熔解温度是作为在所使用的扩增条件下的某个温度(Tm)提供的。应当理解,该Tm值依赖于多个因素,包括盐浓度和Mg2+浓度,并且本领域已知各种不同类型的计算来确定Tm。
[0091] 在某些实施方案中,该一种或更多种靶DNA序列特异引物包括低于50℃、低于55℃、低于60℃或低于65℃的熔解温度。也考虑其他的熔解温度。
[0092] 在某些实施方案中,该一种或更多种靶DNA序列特异引物包括范围从45℃至65℃、50℃至65℃、55℃至65℃、60℃至65℃、45℃至60℃、50℃至60℃、55℃至60℃、45℃至55℃、
50℃至55℃或45℃至50℃的熔解温度。也考虑其他的熔解温度。
[0093] 在某些实施方案中,该一种或更多种靶DNA序列特异引物包括至少18%、至少20%、至少25%、至少30%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%,或至少
65%的GC含量。也考虑其他水平的GC含量。确定GC含量的方法在本领域中是已知的。
[0094] 在某些实施方案中,该一种或更多种靶DNA序列特异引物包括少于18%、少于20%、少于25%、少于30%、少于40%、少于45%、少于50%、少于55%、少于60%,或少于
65%的GC含量。也考虑其他水平的GC含量。
[0095] 在某些实施方案中,该一种或更多种靶DNA序列特异引物包括18%至65%、20%至65%、25%至65%、25%至65%、30%至65%、35%至65%、40%至65%、45%至65%、50%至
65%、55%至65%、60%至65%、18%至60%、20%至60%、25%至60%、25%至60%、30%至
60%、35%至60%、40%至60%、45%至60%、50%至60%、55%至60%、18%至55%、20%至
55%、25%至55%、25%至55%、30%至55%、35%至55%、40%至55%、45%至55%、50%至
55%、18%至50%、20%至50%、25%至50%、30%至50%、35%至50%、40%至50%、45%至
50%、18%至45%、20%至45%、25%至45%、30%至45%、35%至45%、40%至45%、18%至
40%、20%至40%、25%至40%、30%至40%、35%至40%、18%至35%、20%至35%、25%至
35%、30%至35%、18%至30%、20%至30%、25%至30%、18%至25%、20%至25%,或18%至20%的GC含量。也考虑其他水平的GC含量。
[0096] 在某些实施方案中,该一种或更多种靶DNA序列特异引物包括50℃至64℃的熔解温度和18%至65%的GC含量。
[0097] 在某些实施方案中,该方法包括该一种或更多种靶DNA序列特异引物的浓度为至少0.05μM、至少0.1μM、至少0.25μM、至少0.5μM、至少1μM、至少2.5μM,或至少5μM。也考虑其他的浓度。
[0098] 在某些实施方案中,该方法包括该一种或更多种靶DNA序列特异引物的浓度为少于0.05μM、少于0.1μM、少于0.25μM、少于0.5μM、少于1μM、少于2.5μM,或少于5μM。也考虑其他的浓度。
[0099] 在某些实施方案中,该方法包括该一种或更多种靶DNA序列特异引物的浓度为0.05至5μM、0.1至5μM、0.25至5μM、0.5至5μM、1至5μM、2.5至5μM、0.05至4μM、0.1至4μM、0.25至4μM、0.5至4μM、1至4μM、2.5至4μM、0.05至2.5μM、0.1至2.5μM、0.25至2.5μM、0.5至2.5μM、
1至2.5μM、0.05至1μM、0.1至1μM、0.25至1μM、0.5至1μM、0.05至0.5μM、0.1至0.5μM、0.25至
0.5μM、0.05至0.25μM、0.1至0.25μM,或0.05至0.1μM。也考虑其他的浓度。
[0100] 在某些实施方案中,该方法包括0.05至4μM浓度的该一种或更多种靶DNA序列特异引物。
[0101] 在某些实施方案中,提供用于扩增的基因组DNA。在某些实施方案中,通过含有DNA的细胞的方式提供用于扩增的基因组DNA。在某些实施方案中,基因组DNA从细胞释放,用于扩增。
[0102] 在某些实施方案中,该基因组DNA大体上为非纯化DNA。在某些实施方案中,该基因组DNA为裂解的细胞基因组DNA。在某些实施方案中,该基因组DNA来自裂解的细胞。在某些实施方案中,该基因组DNA大体上为非纯化DNA。在某些实施方案中,该基因组DNA为部分纯化的或基本上纯化的。
[0103] 在某些实施方案中,该方法包括细胞的裂解步骤。在某些实施方案中,该方法在扩增前包括细胞的裂解步骤。裂解细胞的方法在本领域中是已知的。
[0104] 在某些实施方案中,该方法不包括分开的裂解步骤。在某些实施方案中,该方法包括同时裂解细胞和扩增基因组DNA。在某些实施方案中,扩增来自细胞的基因组DNA在没有分开的裂解步骤情况下发生。在某些实施方案中,使得来自细胞的基因组DNA在没有分开的裂解步骤情况下可用于扩增。
[0105] 在某些实施方案中,使得来自细胞的基因组DNA可用于扩增作为扩增过程的一部分。
[0106] 在某些实施方案中,该方法包括对于至少一个或更多个以靶DNA特异引物扩增的循环以该一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA。
[0107] 在某些实施方案中,该方法包括在以该一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA期间以该一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增。
[0108] 在某些实施方案中,该方法包括在扩增基因组DNA之前添加该一种或更多种简并寡核苷酸引物和靶DNA序列特异引物。
[0109] 在某些实施方案中,该方法包括同时添加该一种或更多种简并寡核苷酸引物和靶DNA序列特异引物。
[0110] 在某些实施方案中,该方法包括添加该一种或更多种简并寡核苷酸引物,随后添加靶DNA序列特异引物。
[0111] 在某些实施方案中,该方法包括以该一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA,随后以该一种或更多种简并寡核苷酸引物和该一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增基因组DNA。
[0112] 在某些实施方案中,该方法包括向以该一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增的基因组DNA添加该一种或更多种靶DNA序列特异引物,随后以该一种或更多种靶DNA序列特异引物和该一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增。
[0113] 在某些实施方案中,该方法包括聚合酶链式反应,该聚合酶链式反应包括一个或更多个低严格性扩增的循环和一个或更多个进一步的较高严格性扩增的循环。
[0114] 在某些实施方案中,该方法包括对于一个或更多个低严格性扩增的循环以该一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增。
[0115] 在某些实施方案中,该方法包括对于一个或更多个低严格性扩增的循环以该一种或更多种简并寡核苷酸引物和靶DNA序列特异引物扩增。
[0116] 在某些实施方案中,该方法包括对于该一个或更多个低严格性扩增的循环以该一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增,并且对于该一个或更多个较高严格性扩增的循环以该一种或更多种简并寡核苷酸引物和靶DNA序列特异引物扩增。
[0117] 在某些实施方案中,该扩增包括聚合酶链式反应,该聚合酶链式反应包括退火温度低于35℃的一个或更多个循环。
[0118] 在某些实施方案中,该方法包括对于该一个或更多个退火温度低于35℃的循环以该一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增。
[0119] 在某些实施方案中,该扩增包括聚合酶链式反应,该聚合酶链式反应包括退火温度低于35℃的1至8个循环。
[0120] 在某些实施方案中,该方法包括对于该1至8个退火温度低于35℃的循环以该一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增。
[0121] 也考虑其他的温度和循环条件。
[0122] 在某些实施方案中,该扩增包括聚合酶链式反应,该聚合酶链式反应包括一个或更多个退火温度为20℃至35℃的循环。
[0123] 在某些实施方案中,该方法包括对于该一个或更多个退火温度为20℃至35℃的循环以该一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增。
[0124] 在某些实施方案中,该扩增包括聚合酶链式反应,该聚合酶链式反应包括1至8个退火温度为20℃至35℃的循环。也考虑其他的温度和循环条件。
[0125] 在某些实施方案中,该方法包括对于1至8个退火温度为20℃至35℃的循环以该一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增。
[0126] 在某些实施方案中,该扩增包括聚合酶链式反应,该聚合酶链式反应包括一个或更多个退火温度高于48℃或50℃的循环。
[0127] 在某些实施方案中,该方法包括对于一个或更多个退火温度高于48℃或50℃的循环以该一种或更多种简并寡核苷酸引物和该一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增。
[0128] 在某些实施方案中,该扩增包括聚合酶链式反应,该聚合酶链式反应包括5至25个退火温度高于48℃或50℃的循环。也考虑其他的温度和循环条件。
[0129] 在某些实施方案中,该方法包括对于5至25个退火温度高于48℃或50℃的循环以该一种或更多种简并寡核苷酸引物和该一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增。
[0130] 在某些实施方案中,该扩增包括聚合酶链式反应,该聚合酶链式反应包括一个或更多个退火温度为48℃至68℃、52℃至65℃或52℃至62℃之一的循环。
[0131] 在某些实施方案中,该方法包括对于一个或更多个退火温度为48o至68℃、52℃至65℃或52℃至62℃之一的循环以该一种或更多种简并寡核苷酸引物和该一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增。
[0132] 在某些实施方案中,该扩增包括聚合酶链式反应,该聚合酶链式反应包括5至25个退火温度为48℃至68℃、52℃至65℃或52℃至62℃之一的循环。也考虑其他的温度和循环条件。
[0133] 在某些实施方案中,该方法包括对于5至25个退火温度为48℃至68℃、52℃至65℃或52℃至62℃之一的循环以该一种或更多种简并寡核苷酸引物和该一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增。
[0134] 在某些实施方案中,该扩增包括聚合酶链式反应,该聚合酶链式反应包括一个或更多个退火温度低于35℃的循环和一个或更多个进一步的退火温度高于50℃的循环。也考虑其他的温度和循环条件。
[0135] 在某些实施方案中,该扩增包括聚合酶链式反应,该聚合酶链式反应包括以该一种或更多种简并寡核苷酸引物进行的一个或更多个退火温度低于35℃的循环和以该一种或更多种简并寡核苷酸引物和该一种或更多种靶DNS特异引物进行的一个或更多个进一步的退火温度高于48℃或50℃的循环。也考虑其他的温度和循环条件。
[0136] 在某些实施方案中,该扩增包括聚合酶链式反应,该聚合酶链式反应包括一个或更多个退火温度为20℃至35℃的循环,和一个或更多个进一步的退火温度为48℃至68℃、52℃至65℃或52℃至62℃之一的循环。也考虑其他的温度。
[0137] 在某些实施方案中,该扩增包括聚合酶链式反应,该聚合酶链式反应包括以该一种或更多种简并寡核苷酸引物进行的一个或更多个退火温度为20℃至35℃的循环和以该一种或更多种简并寡核苷酸引物和该一种或更多种靶DNA特异引物进行的一个或更多个进一步的退火温度为48℃至68℃、52℃至65℃或52℃至62℃之一的循环。也考虑其他的温度。
[0138] 在某些实施方案中,该扩增包括聚合酶链式反应,该聚合酶链式反应包括1至8个退火温度为20℃至35℃的循环,和5至25个退火温度为48℃至68℃、52℃至65℃或52℃至62℃之一的循环。也考虑其他的温度和循环条件。
[0139] 在某些实施方案中,该扩增包括聚合酶链式反应,该聚合酶链式反应包括以简并寡核苷酸引物进行的1至8个退火温度为20℃至35℃的循环和以该一种或更多种简并寡核苷酸引物和该一种或更多种靶DNA特异引物进行的5至25个退火温度为48℃至68℃、52℃至65℃或52℃至62℃之一的循环。
[0140] 聚合酶的实例在本文有描述。
[0141] 在某些实施方案中,该方法包括使用如下的一种或更多种:Taq聚合酶(可例如从New England Biolabs获得)、Phi29聚合酶(可例如从New England Biolabs获得)、Pfu DNA聚合酶(可例如从Promega获得)、Bst DNA聚合酶(可例如从New England Biolabs获得)、VentRTM和Deep VentRTMDNA聚合酶(可例如从New England Biolabs获得)、9°Nm DNA聚合酶(可例如从New England Biolabs获得)、Herculase II Fusion DNA聚合酶(可从Agilent Technologies获得)、KAPA HiFi(可从Kapa Biosystems获得)、KAPA2G Robust(可从Kapa Biosystems获得)、DNA聚合酶I的Klenow片段(可例如从New England Biolabs获得)、PhiPRDl DNA聚合酶(Jung等,(1987),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:8287)、噬菌体M2 DNA聚合酶(Matsumoto等(1989)Gene 84:247)、T4DNA聚合酶(可例如从New England Biolabs获得)和T5DNA聚合酶(Chatterjee等,(1991)Gene 97:13-19)。也考虑并且可商业上获得其他类型的聚合酶。可以为特定的聚合酶选择适合的反应条件。
[0142] 在某些实施方案中,该方法包括使用在72℃具有每秒1至50个核苷酸延伸能力(processivity)的聚合酶。具有所需延伸能力的聚合酶在本领域中是已知的。
[0143] 在某些实施方案中,该方法包括使用具有至少每个模板核苷酸285×10-6个错误的-6保真性的聚合酶。在某些实施方案中,该方法包括使用具有高于每个模板核苷酸285×10个错误的保真性的聚合酶。具有所需保真性的聚合酶在本领域中是已知的。
[0144] 在某些实施方案中,该方法包括一轮或更多轮的进一步扩增经扩增的靶DNA序列。
[0145] 在某些实施方案中,该一轮或更多轮的进一步扩增包括10至40个循环。在某些实施方案中,该一轮或更多轮的进一步扩增包括退火温度为48℃至68℃、52℃至65℃或52℃至62℃之一的循环。在某些实施方案中,该一轮或更多轮的进一步扩增包括10至40个退火温度为48℃至68℃、52℃至65℃或52℃至62℃之一的循环。
[0146] 在某些实施方案中,该方法包括以一种或更多种另外的靶DNA序列特异引物对经扩增的靶DNA序列的一轮或更多轮的进一步扩增。
[0147] 在某些实施方案中,该另外的靶DNA序列特异引物与所述一种或更多种靶DNA序列引物相同。
[0148] 在某些实施方案中,该另外的靶DNA序列特异引物与所述一种或更多种靶DNA序列引物不同。
[0149] 在某些实施方案中,该另外的靶DNA序列引物为嵌套引物(nested primers)。
[0150] 用于设计和产生该另外的引物(包括嵌套引物)的方法在本领域中是已知的。
[0151] 在某些实施方案中,该方法包括扩增两个或更多个靶DNA序列。
[0152] 在某些实施方案中,该方法包括从基因组DNA扩增两个或更多个靶DNA序列,其通过在特异于该两个或更多个靶DNA序列的引物存在下以该一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA来进行。
[0153] 在某些实施方案中,该方法包括通过在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA来从基因组DNA扩增靶DNA序列,并随后扩增一个或更多个其他的靶DNA序列。
[0154] 在某些实施方案中,该方法还包括评估经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容。评估核苷酸内容的方法在本领域中是已知的。
[0155] 在某些实施方案中,评估核苷酸内容包括检测是否存在多态性、突变、缺失、插入、易位、甲基化状态,和/或表观遗传变化(epigenetic change)。也考虑评估核苷酸内容的其他方法。
[0156] 在某些实施方案中,评估核苷酸内容包括对经扩增的靶DNA序列的全部或部分测序。
[0157] 在某些实施方案中,该方法还包括通过对经扩增的靶DNA序列的全部或部分测序、将经扩增的靶DNA序列的链杂交至一种或更多种寡核苷酸、实时PCR、以及高分辨率熔解分析的一种或更多种来评估核苷酸内容。也考虑其他的方法。
[0158] 在某些实施方案中,该方法可以用于遗传筛查、植入前遗传筛查、植入前遗传诊断、产前筛查、疾病筛查、癌症筛查、遗传标记筛查,和/或法医筛查。也考虑其他的用途。
[0159] 本公开的某些实施方案提供了从本文描述的基因组DNA扩增靶DNA序列的方法,其通过对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增该靶DNA序列来进行。
[0160] 本公开的某些实施方案提供了从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法,该方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增该靶DNA序列,由此扩增该靶DNA序列。
[0161] 本公开的某些实施方案提供从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA;以及
对于至少一个或更多个扩增基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异引物
扩增该靶DNA序列,
由此扩增该靶DNA序列。
[0162] 扩增方法在本文有描述。在某些实施方案中,该扩增包括聚合酶链式反应,如本文所描述的。
[0163] 本公开的某些实施方案提供采用全基因组扩增从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法,如本文所描述的。
[0164] 本公开的某些实施方案提供了从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法,其通过以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行基因组DNA的全基因组扩增;并且对于全基因组扩增的至少一部分还以一种更多种靶DNA序列特异引物扩增该靶DNA序列来进行。
[0165] 本公开的某些实施方案提供从基因组DNA扩增靶DNA序列的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行基因组DNA的全基因组扩增;以及
对于全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增该靶DNA
序列,
由此扩增该靶DNA序列。
[0166] 在某些实施方案中,该全基因组扩增包括采用聚合酶链式反应扩增。
[0167] 用于全基因组扩增的方法在本文中有描述。例如,可以按Arneson N.,Hughes S.,Houlston R.and Done S.(2007)"PCR-Based Whole Genome Amplification,"Chapter 18,PCR(eds.Hughes and Moody).Scion Publishing Ltd.,Oxfordshire,UK,2007中的描述进行全基因组扩增。
[0168] 本公开的某些实施方案提供通过本文描述的方法扩增的靶DNA序列。
[0169] 在某些实施方案中,靶DNA序列还可以被扩增。在某些实施方案中,靶DNA序列还可以被相同引物扩增。在某些实施方案中,靶DNA序列还可以被一种或更多种其他的靶DNA序列特异引物扩增。以一种或更多种其他的/另外的靶DNA序列特异引物扩增的方法在本文中有描述。
[0170] 某些实施方案提供按本文描述扩增的靶DNA序列的用途。
[0171] 本公开的某些实施方案提供靶DNA序列用于遗传筛查,遗传诊断,植入前遗传筛查,植入前遗传诊断,产前筛查,疾病筛查,癌症筛查,遗传标记筛查,多态性、突变、缺失、插入、易位、扩张、倒位、甲基化状态,和/或表观遗传改变的筛查,和/或法医筛查的用途。也考虑其他的用途。
[0172] 本公开的某些实施方案提供评估通过本文描述的方法从基因组DNA扩增的靶DNA序列的核苷酸内容的方法。用于评估核苷酸内容的方法在本文中有描述。
[0173] 本公开的某些实施方案提供通过评估通过本文描述的方法扩增的靶DNA序列的核苷酸内容来评估靶DNA序列的核苷酸内容的方法。
[0174] 本公开的某些实施方案提供评估基因组DNA中靶DNA序列的核苷酸内容的方法,该方法包括:在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增该基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估该经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容,以便评估该靶DNA序列的核苷酸内容。
[0175] 本公开的某些实施方案提供了评估基因组DNA中靶DNA序列的核苷酸内容的方法,该方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增该靶DNA序列,并评估经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容,以便评估该靶DNA序列的核苷酸内容。
[0176] 本公开的某些实施方案提供评估基因组DNA中靶DNA序列的核苷酸内容的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增基因组DNA;和
对于至少一个或更多个扩增基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异引物
扩增该靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估该经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容,以便评估该靶DNA序列的核苷酸内容。
[0177] 本公开的某些实施方案提供评估基因组DNA中靶DNA序列的核苷酸内容的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行基因组DNA的全基因组扩增;
对于全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增该靶DNA
序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估该经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容,以便评估该靶DNA序列的核苷酸内容。
[0178] 用于评估核苷酸内容的方法在本文中有描述。在某些实施方案中,评估核苷酸内容包括确定经扩增的靶DNA的全部或部分的核苷酸序列。
[0179] 在某些实施方案中,用于评估核苷酸内容的方法包括检测是否存在多态性、突变、缺失、插入、易位、甲基化状态,和/或表观遗传变化。
[0180] 在某些实施方案中,用于评估核苷酸内容的方法包括对经扩增的靶DNA序列的全部或部分测序、将经扩增的靶DNA序列的链杂交至一种或更多种寡核苷酸、实时PCR、以及高分辨率熔解分析中的一种或更多种。也考虑其他的方法。
[0181] 在某些实施方案中,用于评估核苷酸含量的方法被用于遗传筛查、遗传诊断、植入前遗传筛查、植入前遗传诊断、产前筛查、疾病筛查、癌症筛查、遗传标记筛查,和/或法医筛查。也考虑其他的用途。
[0182] 本公开的某些实施方案提供了确定基因组DNA中靶DNA序列的全部或部分序列的方法,其通过按本文描述扩增该靶DNA序列并确定经扩增的靶DNA序列的全部或部分核苷酸序列来进行。
[0183] 本公开的某些实施方案提供确定基因组DNA中靶DNA序列的核苷酸序列的方法,该方法包括:在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增所述基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
确定经扩增的靶DNA序列的核苷酸序列,
由此确定该靶DNA序列的核苷酸序列。
[0184] 在某些实施方案中,该方法包括确定经扩增的靶DNA序列中基本上全部核苷酸的核苷酸序列。在某些实施方案中,该方法包括确定经扩增的靶DNA序列中一个或更多个核苷酸的核苷酸序列。
[0185] 确定DNA的核苷酸序列的方法在本领域中是已知的。实例包括基于双脱氧链终止法的技术,下一代测序(Next-Generation Sequencing)方法,鸟枪法测序,与一种或更多种寡核苷酸的杂交、实时PCR、以及高分辨率熔解分析。也考虑其他的方法。
[0186] 在某些实施方案中,本文描述的方法被用于遗传筛查或诊断。
[0187] 本公开的某些实施方案提供遗传筛查或诊断的方法,其通过按本文描述扩增靶DNA序列并评估经扩增的靶DNA序列用于筛查或诊断来进行。
[0188] 本公开的某些实施方案提供胚胎的遗传筛查或诊断的方法。也考虑并在本文中描述了对其他细胞的遗传筛查或诊断。
[0189] 本公开的某些实施方案提供遗传筛查胚胎的方法,该方法包括:在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自该胚胎的基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估经扩增的靶DNA序列以筛查该胚胎。
[0190] 用于从胚胎获得一个或更多个细胞用于分析的方法在本领域中是已知的。在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自胚胎的基因组DNA以产生经扩增的靶DNA序列的方法在本文中有描述。
[0191] 在某些实施方案中,评估经扩增的靶DNA序列包括确定经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容。
[0192] 在某些实施方案中,评估经扩增的靶DNA序列包括检测是否存在多态性、突变、缺失、插入、易位、甲基化状态,和/或表观遗传变化。
[0193] 在某些实施方案中,该评估包括对经扩增的靶DNA序列的全部或部分测序、将经扩增的靶DNA序列的链杂交至一种或更多种寡核苷酸、实时PCR、以及高分辨率熔解分析中的一种或更多种。也考虑其他的方法。
[0194] 在某些实施方案中,本文描述的方法被用于胚胎筛查,例如植入前遗传筛查。
[0195] 本公开的某些实施方案提供植入前遗传筛查胚胎的方法,例如用于植入的适宜性、是否存在遗传疾病,和/或是否存在所期望的和/或不希望的突变。也考虑其他类型的筛查。
[0196] 本公开的某些实施方案提供植入前遗传筛查胚胎的方法,该方法包括:在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自所述胚胎的基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估经扩增的靶DNA序列以筛查该胚胎。
[0197] 本公开的某些实施方案提供了植入前遗传筛查胚胎的方法,该方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自该胚胎的基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自该胚胎的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列,并评估经扩增的靶DNA序列以筛查该胚胎。
[0198] 本公开的某些实施方案提供植入前遗传筛查胚胎的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自该胚胎的基因组DNA;
对于至少一个或更多个扩增基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异引物
扩增来自该胚胎的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胚胎。
[0199] 本公开的某些实施方案提供植入前遗传筛查胚胎的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行来自该胚胎的基因组DNA的全基因组扩增;
对于全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自该胚胎的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估经扩增的靶DNA序列以筛查该胚胎。
[0200] 在某些实施方案中,本文描述的方法被用于卵母细胞筛查,例如遗传筛查。例如,可对卵母细胞筛查其受精的适宜性(suitability)、植入的适宜性、是否存在遗传疾病、其线粒体内容或基因组,和/或是否存在期望的和/或不希望的突变。也考虑其他类型的筛查。
[0201] 本公开的某些实施方案提供遗传筛查卵母细胞的方法。
[0202] 用于获得卵母细胞或其极体用于分析的方法在本领域中是已知的。在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自卵母细胞(或其极体)的基因组DNA以产生经扩增的靶DNA序列的方法在本文中有描述。
[0203] 在某些实施方案中,评估经扩增的靶DNA序列包括确定经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容。
[0204] 在某些实施方案中,评估经扩增的靶DNA序列包括检测是否存在多态性、突变、缺失、插入、易位、甲基化状态,和/或表观遗传变化。
[0205] 在某些实施方案中,该评估包括对经扩增的靶DNA序列的全部或部分测序、将经扩增的靶DNA序列的链杂交至一种或更多种寡核苷酸、实时PCR、以及高分辨率熔解分析中的一种或更多种。也考虑其他的方法。
[0206] 在某些实施方案中,本文描述的方法被用于卵母细胞的植入前遗传筛查。
[0207] 在某些实施方案中,该方法被用于筛查卵母细胞的受精适宜性。
[0208] 本公开的某些实施方案提供植入前遗传筛查卵母细胞的方法。
[0209] 本公开的某些实施方案提供植入前遗传筛查卵母细胞的方法,该方法包括:在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自卵母细胞或其极体的基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估经扩增的靶DNA序列以筛查该卵母细胞。
[0210] 本公开的某些实施方案提供了植入前遗传筛查卵母细胞的方法,该方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自该卵母细胞或极体的基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自该卵母细胞或其极体的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列,并评估经扩增的靶DNA序列以筛查该卵母细胞。
[0211] 本公开的某些实施方案提供植入前遗传筛查卵母细胞的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自该卵母细胞或其极体的基因组DNA;
对于至少一个或更多个扩增基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异引物
扩增来自该卵母细胞或极体的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述卵母细胞。
[0212] 本公开的某些实施方案提供植入前遗传筛查卵母细胞的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行来自该卵母细胞或其极体的基因组DNA的全基因组扩增;
对于全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自该卵母细胞或极体的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述卵母细胞。
[0213] 用于进行全基因组扩增的方法在本文中有描述。
[0214] 在某些实施方案中,本文描述的方法被用于精子筛查,例如遗传筛查。例如,可以对精子筛查其用于受精的适宜性、是否存在遗传疾病,和/或是否存在期望的和/或不希望的突变。也考虑其他类型的筛查。
[0215] 本公开的某些实施方案提供遗传筛查精子的方法。
[0216] 本公开的某些实施方案提供遗传筛查精子的方法,该方法包括:在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自一个或更多个精子的基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估经扩增的靶DNA序列以筛查该精子。
[0217] 获得精子用于分析的方法在本领域中是已知的。在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自精子的基因组DNA以产生经扩增的靶DNA序列的方法在本文中有描述。
[0218] 在某些实施方案中,评估经扩增的靶DNA序列包括确定经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容。
[0219] 在某些实施方案中,评估经扩增的靶DNA序列包括检测是否存在多态性、突变、缺失、插入、易位、甲基化状态,和/或表观遗传变化。
[0220] 在某些实施方案中,该评估包括对经扩增的靶DNA序列的全部或部分测序、将经扩增的靶DNA序列的链杂交至一种或更多种寡核苷酸、实时PCR、以及高分辨率熔解分析中的一种或更多种。
[0221] 本公开的某些实施方案提供了遗传筛查精子的方法,该方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自一个或更多个精子的基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自该一个或更多个精子的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列,并评估经扩增的靶DNA序列以筛查该精子。
[0222] 本公开的某些实施方案提供遗传筛查精子的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自一个或更多个精子的基因组DNA;
对于至少一个或更多个扩增基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异引物
扩增来自该一个或更多个精子的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述精子。
[0223] 本公开的某些实施方案提供筛查精子的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行来自一个或更多个精子的基因组DNA的全基因组扩增;
对于全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自该一个或更多个精子的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述精子。
[0224] 在某些实施方案中,本文描述的方法被用于筛查精子的受精适宜性。
[0225] 在某些实施方案中,本文描述的方法被用于胎儿筛查,例如遗传筛查。例如,可以对胎儿卵母细胞筛查是否存在遗传疾病、是否存在遗传标记、是否存在染色体含量(chromosomal content),和/或是否存在期望的和/或不希望的突变。也考虑其他类型的筛查。
[0226] 本公开的某些实施方案提供筛查胎儿的方法。
[0227] 本公开的某些实施方案提供产前筛查胎儿的方法。
[0228] 本公开的某些实施方案提供产前筛查胎儿的方法,该方法包括:在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自该胎儿的基因组DNA,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估经扩增的靶DNA序列以筛查该胎儿。
[0229] 从胎儿获得基因组DNA的方法在本领域中是已知的,包括羊水取样、绒毛膜取样和获得无细胞DNA。在一种或更多种靶DNA序列特异引物存在下以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增该基因组DNA以产生经扩增的靶DNA序列的方法在本文中有描述。
[0230] 在某些实施方案中,评估经扩增的靶DNA序列包括确定经扩增的靶DNA序列的核苷酸内容。
[0231] 在某些实施方案中,评估经扩增的靶DNA序列包括检测是否存在多态性、突变、缺失、插入、易位、甲基化状态,和/或表观遗传变化。
[0232] 在某些实施方案中,该评估包括对经扩增的靶DNA序列的全部或部分测序、将经扩增的靶DNA序列的链杂交至一种或更多种寡核苷酸、实时PCR、以及高分辨率熔解分析中的一种或更多种。
[0233] 在某些实施方案中,本文描述的方法被用于筛查胎儿的遗传病症。
[0234] 本公开的某些实施方案提供了胎儿的产前遗传筛查的方法,该方法包括对于以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自该胎儿的基因组DNA的至少一个或更多个循环以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自该胎儿的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列,并评估经扩增的靶DNA序列以筛查该胎儿。
[0235] 本公开的某些实施方案提供产前筛查胎儿的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物扩增来自该胎儿的基因组DNA;
对于至少一个或更多个扩增基因组DNA的循环还以一种或更多种靶DNA序列特异引物
扩增来自该胎儿的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估经扩增的靶DNA序列以筛查该胎儿。
[0236] 本公开的某些实施方案提供产前筛查胎儿的方法,该方法包括:以一种或更多种简并寡核苷酸引物进行来自一个或更多个精子的基因组DNA的全基因组扩增;
对于全基因组扩增的至少一部分还以一种或更多种靶DNA序列特异引物扩增来自该胎儿的靶DNA序列,以产生经扩增的靶DNA序列;以及
评估所述经扩增的靶DNA序列以筛查所述胎儿。
[0237] 本公开的某些实施方案提供用于进行本文描述的方法的试剂盒。
[0238] 在某些实施方案中,该试剂盒包括本文中描述的一种或更多种组分,例如缓冲剂、试剂、酶、溶液、dNTPs、对照和/或说明书中的一个或更多个。
[0239] 例如,用于扩增靶DNA序列的试剂盒可以含有用于全基因组扩增的一种或更多种简并寡核苷酸引物,用于扩增靶DNA序列的一种或更多种引物,以及任选地用于在全基因组扩增期间扩增靶DNA序列的一种或更多种试剂和/或说明书。
[0240] 本公开的某些实施方案提供包括本文描述的一种或更多种组分的组合产品。
[0241] 在某些实施方案中,组合产品被用于进行本文描述的方法。
[0242] 本公开的某些实施方案提供组合产品,该产品包括如下组分:(i)用于全基因组扩增的一种或更多种简并寡核苷酸引物;
(ii)用于扩增靶DNA序列的一种或更多种引物;以及
(iii)用于在全基因组扩增期间扩增靶DNA序列的一种或更多种试剂和/或说明书。
[0243] 在某些实施方案中,该组合产品任选地还包括本文中描述的一种或更多种组分,例如缓冲剂、试剂、酶、溶液、dNTPs、对照和/或说明书中的一个或更多个。
[0244] 标准技术和设备可以用于重组DNA技术、寡核苷酸合成、分子生物学和酶学反应。前述技术和操作通常可以按本领域中已知的和/或可商业上获得的方法进行,并且例如如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(4th ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))和Ausubel等Current Protocols in Molecular Biology(2003)John Wiley&Sons中所描述,通过引用将它们并入本文。
[0245] 进一步通过以下实施例描述本公开。应理解,以下的描述仅是出于描述具体实施方案的目的,而无意对以上描述进行限制。实施例
实施例1-全基因组扩增和基因靶向规程
[0246] 以下的规程用于本文描述的全基因组扩增(WGA)和基因靶向研究。
[0247] 1.材料与方法
[0248] 第一轮全基因组扩增和基因靶向规程:(i)向6.5μl PCR级H2O添加1μl细胞裂解酶(耐热蛋白酶;EmbryoCellectTM试剂盒,RHS;
编号RHS1001);这称为细胞裂解酶Dil 1。
(ii)通过混合表1中的试剂生成细胞裂解混合物:
表1
组分 用于1个裂解反应的体积
PCR级H2O 2.7
细胞裂解缓冲液 0.15
细胞裂解酶Dil 1 0.15
总体积 3
(iii)向细胞或DNA管添加3μl细胞裂解混合物。将溶液轻敲至管底或短暂离心旋转。不要涡旋。
就此,单个细胞通常含有大约6pg DNA。
(iv)以表2中的参数将样品在热循环仪中温育:
表2
温度(℃) 持续时间 循环次数
75℃ 10分钟 1个循环
95℃ 5分钟 1个循环
4℃ 保持 1个循环
(v)按表3中所给出的为所需数量的样品制备主混合物(mastermix),采用所列出的商业试剂:
表3
(vi)其他适合的WGA DNA聚合酶在本文中有描述。例如Cat.#600675,KAPA HiFi;Kapa Biosystems Cat#KK2101,KAPA2G Robust PCR试剂盒;Kapa Biosystems Cat.#KK5004,Herculase II Fusion DNA聚合酶(Cat#600675)和AmpliTaq DNA聚合酶ThermoFisher Scientific Cat.#N8080171。
(vii)等分主混合物22μL至含有基因组DNA或裂解的细胞的PCR管。
(viii)让样品按表4中的程序运行:
表4
(ix)保持在4℃使得能向该PCR添加基因特异引物。
(x)用PCR级H2O将基因特异引物稀释至所需的工作储备浓度(10μM、5μM、2μM)。
(xi)在4℃保持期间,在样品处于上时:向每个管添加1.4μL正向基因特异引物,向每个管添加1.4μL反向基因特异引物。短暂离心样品管并放回进热循环仪中。
(xii)让样品按表5中显示的程序运行:
表5
(xiii)通过在1%琼脂糖凝胶上以100v运行30分钟来观察扩增产物。
[0249] 第二轮基因特异PCR规程:(i)用PCR级水将第一轮PCR生成的PCR产物稀释1/50至大约1ng/μL的浓度。
(ii)制备表6中给出的主混合物:
表6
试剂 1×
H2O 16.4
5×KAPA2G Buffer A 5
MgCl2(25mM) 1
dNTPs(10mM) 0.5
正向引物(表8) 0.5
反向引物(表8) 0.5
KAPA 2G聚合酶 0.1
模板 1.0
每管主混合物等份 24μL
每管终体积 25μL
(iii)将带有dNTPS的KAPA2G Robust试剂盒(Kapa Biosystems,USA,MA;编号KK5004或KK5005)用于特异扩增靶DNA。
(iv)向每个PCR管等分主混合物(24μL)。
(v)添加1μL 1/50稀释的模板DNA。
(vi)让样品按表7中显示的PCR程序运行:
表7
(vii)通过在2%琼脂糖凝胶上以100v运行30分钟来观察扩增产物。
表8所用的基因特异引物:
(viii)每种正向和反向引物在25μL溶液+2.8μL添加物中的最终主混合物浓度(总体积
27.8μL):
(ix)10μM工作储备液:0.5035μM;5μM工作储备液:0.2518μM;2μM工作储备液:0.1007μM。
[0250] 如果需要,可以确定扩增产物的DNA序列。
[0251] 上述试剂的一种或更多种可以并入试剂盒或组合产品中,它们还可以包括说明书。
[0252] 按上文描述对靶DNA序列的扩增具有各种用途,例如用于植入前遗传筛查、植入前遗传诊断、产前筛查、遗传筛查、筛查疾病、筛查癌症、筛查遗传标记,和/或法医筛查。实施例2-采用单个细胞验证靶向基因在WGA PCR中的富集
[0253] 进行研究以验证用于富集靶基因的规程。
[0254] 将两套基因特异引物(P)(0.5μM、0.25μM或0.1μM浓度)添加至WGA(多重PCR;图1和图2),并采用从可购得细胞系(Coriell;47,XY,+15或48,XXY,+21)手动分选的单个细胞按实施例1中描述进行第一轮全基因组扩增和基因靶向(gene targeting)。
[0255] 如所看到的,扩增过程导致基因组DNA的全基因组扩增和靶向基因的特异扩增,在测试的所选引物浓度观察到靶向基因的扩增。注意到在基因特异引物(P)存在下WGA扩增比对照WGA稍弱。这些结果证实能够采用重叠WGA和基因特异扩增从单个细胞扩增靶向基因。
[0256] 该数据还证实,至少0.1μM的引物浓度可用于从单个细胞扩增靶向基因。
[0257] 为了评估全基因组扩增,采用EmbryoCellectTM阵列按EmbryoCellectTMTDS规程将WGA样品杂交以证实单个细胞的核型。对于所测试的所有单个细胞都获得了正确的非整倍性结果(表9)。表9:与DNA的基因靶向扩增联合的全基因组扩增后单细胞样品的EmbryoCellectTM阵列结果
单细胞样品 WGA引物 基因特异引物 核型 aCGH结果 阵列SD 比率+15 比率+21
GM04965-45 是 0.5μM 48,XXY,+21 48,XXY,+21 0.06 - 1.44
GM04965-46 是 0.5μM 48,XXY,+21 48,XXY,+21 0.07 - 1.38
GM04965-41 是 0.25μM 48,XXY,+21 48,XXY,+21 0.08 - 1.45
GM04965-42 是 0.25μM 48,XXY,+21 48,XXY,+21 0.07 - 1.31
GM04965-43 是 0.1μM 48,XXY,+21 48,XXY,+21 0.05 - 1.45
GM04965-44 是 0.1μM 48,XXY,+21 48,XXY,+21 0.05 - 1.37
GM04965-103 是 - 48,XXY,+21 48,XXY,+21 0.06 - 1.31
GM04965-104 是 - 48,XXY,+21 48,XXY,+21 0.04 - 1.35
GM04965-105 是 - 48,XXY,+21 48,XXY,+21 0.06 - 1.42
GM04965-106 是 - 48,XXY,+21 48,XXY,+21 0.05 - 1.34
GM07189-61 是 0.5μM 47,XY,+15 47,XY,+15 0.10 1.39 -
GM07189-56 是 0.25μM 47,XY,+15 47,XY,+15 0.05 1.31 -
GM07189-58 是 0.1μM 47,XY,+15 47,XY,+15 0.06 1.36 -
GM07189-59 是 0.1μM 47,XY,+15 47,XY,+15 0.06 1.29 -
GM07189-74 是 - 47,XY,+15 47,XY,+15 0.04 1.32 -
GM07189-75 是 - 47,XY,+15 47,XY,+15 0.07 1.26 -
GM07189-76 是 - 47,XY,+15 47,XY,+15 0.05 1.27 -
GM07189-77 是 - 47,XY,+15 47,XY,+15 0.04 1.31 -
[0258] 随后在基因特异PCR中对WGA产物测试靶向基因的存在。当与对照中缺少的带相比产生了正确大小的带时,观察到基因富集(图3和图4)。
[0259] 这些结果证实能够在全基因组扩增期间扩增目的靶序列。
[0260] 能够在全基因组扩增期间扩增目的靶序列提供了多个优点。例如,能够扩增靶序列提供了例如如下优点的一个或更多个:(i)当采用全基因组扩增时降低等位基因脱扣可能性,(ii)改善的分析从全基因组扩增的DNA扩增的靶DNA序列的能力,(iii)降低与从全基因组扩增的DNA扩增的靶DNA序列的扩增相关的偏倚,(iv)减少用于从基因组DNA扩增靶DNA序列的PCR循环的次数,(v)从全基因组扩增的DNA扩增特异靶DNA序列的时间上的改进,以及(vi)减少的耗材和/或人力资源使用和/或降低的成本。实施例3-HBB基因的靶向序列富集(TSE)
[0261] 为了进一步证实该规程能够有效扩增其他靶序列,还为了评估该规程在遗传筛查和/或诊断中的用途,例如该规程用于植入前遗传诊断和植入前遗传筛查,进行了采用该规程对编码β珠蛋白的HBB基因的靶向序列富集的分析。
[0262] 采用多细胞样品(5-细胞)进行采用两引物组的联合的全基因组扩增和HBB基因靶向扩增。然后将PCR产物种入两特异HBB PCR中;主要扩增外显子1和2,和扩增外显子3。将第二轮HBB PCR扩增子二者与带有HBB基因靶向扩增的全基因组扩增的DNA合并以生成1:20最终稀释。将仅WGA的PCR产物、联合的全基因组扩增和HBB基因靶向扩增的产物以及该1:20稀释的合并DNA作为单独索引的样品在40样品多重MiSeq运行中测序;读长2×75bp。将下一代测序数据以生物信息学比对至hg19。为每个样品计算HBB的广度和深度并进行比较。当对1:20稀释的合并DNA测序时获得>60x的平均覆盖深度。
[0263] 图5显示了,采用下一代测序,与仅全基因组扩增比较的在联合的全基因组扩增和基因靶向扩增后HBB的覆盖广度。在联合的全基因组扩增和基因靶向扩增后,产物种入两个基因特异HBB PCR。将第二轮PCR扩增子与带有基因靶向扩增的全基因组扩增的DNA合并以生成1:20最终稀释。对联合的全基因组扩增和基因靶向扩增产物(WGA+TSE)和1:20稀释的合并物测序。将下一代测序数据通过生物信息学比对至hg19,并对每个样品在1×的深度确定覆盖率。该图显示,当将第二轮HBB PCR基因特异产物的1:20稀释物合并回联合的带有基因靶向扩增的全基因组扩增的样品时,实现了HBB的100%覆盖广度。绘出了均值。
[0264] 图6显示了对HBB基因的覆盖深度的分析。当对1:20稀释的合并DNA测序时得到>60×的HBB平均覆盖深度。这是适合于用于SNP确定的遗传分析的深度。
[0265] 联合的全基因组扩增和序列特异扩增可用于实现靶DNA序列的100%覆盖广度,并增加覆盖深度,适合于用于SNP检测的遗传分析。
[0266] 此外,我们还在相关的实验中证明以多至4个引物组成功多重扩增。实施例4-用于主要组织相容性复合体、I、A类的基因的靶向序列富集
[0267] 为了进一步评估该规程有效扩增其他靶序列,还为了进一步评估该规程在遗传筛查和/或诊断中的用途,例如植入前遗传诊断和植入前遗传筛查,进行了采用该规程对编码主要组织相容性复合体,I、A类蛋白的靶向序列富集的分析。
[0268] 采用多细胞样品(5-细胞)进行合并的全基因组扩增和人白细胞抗原(HLA)基因靶向扩增。接着将该PCR产物种入一个基因特异的HLA PCR。将该第二轮HLA PCR扩增子与带有HLA基因靶向扩增的全基因组扩增的DNA合并以生成1:20和1:10最终稀释。将仅WGA的PCR产物、联合的全基因组扩增和HLA基因靶向扩增的产物、该1:20和1:10稀释的合并DNA以及第二轮HLA PCR扩增子作为单独索引的样品在40样品多重MiSeq运行中测序;读长2×75bp。将下一代测序数据以生物信息学比对至hg19。为每个样品计算HLA的广度和深度,并进行比较。当对该1:20和1:10稀释的合并DNA以及第二轮PCR扩增子测序时,获得>60×的HLA平均覆盖深度。
[0269] 图7显示了,采用下一代测序,与仅全基因组扩增比较的在联合的全基因组扩增和基因靶向扩增后对HLA的覆盖广度。在联合的全基因组扩增和基因靶向扩增后,将产物种入一个HLA特异PCR。将该第二轮PCR扩增子与带有基因靶向扩增的全基因组扩增的DNA合并以生成1:20和1:10最终稀释。对仅WGA的PCR产物、联合的全基因组扩增和基因靶向扩增的产物、该1:20和1:10稀释的合并DNA以及第二轮PCR扩增子测序。将下一代测序数据通过生物信息学比对至hg19,并对每个样品在1×的深度确定外显子2和外显子3的覆盖率。当对该1:20和1:10稀释的合并DNA以及第二轮PCR扩增子测序时,获得>60×的平均覆盖深度。
[0270] 图8显示了对HLA基因的覆盖深度的分析。
[0271] 当对该1:20和1:10稀释的合并DNA以及第二轮HLA PCR扩增子测序时,获得>60×的平均覆盖深度。这是适合于用于SNP检测的遗传分析的深度。实施例5-胚胎的PGS
[0272] 本文描述的靶基因富集规程的一个用途是用于胚胎转移进子宫前的植入前遗传筛查。
[0273] 该筛查需要通过活检从胚胎取出一个至几个细胞。从胚胎取出细胞的方法在本领域中是已知的。接着将这些细胞放进管中,并且由于该活检材料中有限量的DNA,该DNA需要被扩增以生成足够的DNA用于下游技术。
[0274] 接着可将该靶向序列富集规程用于确定胚胎的染色体互补物(chromosome complement)。此外,靶向序列富集规程可用于特异基因和/其他目的基因座的胚胎植入前遗传筛查。
实施例6-通用规程、试剂盒和产品
[0275] 用于进行靶向序列富集的利用各种试剂盒的通用规程、组分和说明书如下:
[0276] 1.试剂盒内容物
[0277] 用于进行靶向序列富集的试剂盒可以含有以下组分:·PCR级H2O
·细胞裂解酶(Cell Lysis Enzyme)
·细胞裂解缓冲液(Cell Lysis Buffer)
·聚合酶
·PCR缓冲液
·DOP引物
[0278] 2.规程概述
[0279] 基于简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)的全基因组扩增(WGA)从来自单个细胞的总DNA或它们的DNA等同物生成代表性扩增。该基于DOP-PCR的WGA可重复地扩增来自单个细胞的总DNA,在不足3小时产生微克量的被扩增DNA。该规程可成功地用在细胞的和纯化的基因组DNA输入上。
[0280] 该规程涉及以下的一般步骤:
[0281] (i)样品收集·将样品放入PCR管内<2μl缓冲液中
·在管上标记样品位置
[0282] (ii)裂解·在样品上方添加3μl裂解溶液
·轻敲PCR管以让裂解溶液在样品上翻滚
·根据裂解程序温育15分钟
[0283] 应理解,一些情况下可以略去细胞裂解步骤,例如允许在无细胞DNA上使用该规程,或者可以通过采用细胞直接进入扩增规程而完成该规程,在扩增前没用单独的裂解步骤。
[0284] (iii)全基因组扩增和靶向序列富集·向裂解的样品添加22μl PCR主混合物
·采用WGA PCR程序和序列特异引物进行PCR
·通过琼脂糖凝胶电泳评估WGA
[0285] 3.输入说明
[0286] (i)细胞数量
[0287] 本文描述的规程适合于单个细胞或其DNA等同物,以及小量的细胞(例如<10个细胞)。
[0288] (ii)细胞收集方法
[0289] 流式分选、稀释和显微操作为与该规程相容的收集方法。单个细胞应该用最小量的转移缓冲液(<2μl)转移至PCR管。细胞在管内的位置应该使用永久记号笔在管的外部以圆点标记,以便能够容易地进行裂解步骤的细胞定位
[0290] (iii)DNA稀释
[0291] 建议将DNA在10mM Tris-HCl(pH 8.0)(无EDTA)中稀释至终浓度30pg/μl。
[0292] (iv)相容的缓冲液
[0293] 建议的细胞转移缓冲液包括10 mM Tris-HCl(pH 8.0)(无EDTA)和PBS(无Mg2+,Ca2+并且无BSA)。
[0294] 4.规程;DOP-PCR全基因组扩增
[0295] (i)细胞裂解
[0296] 在这个可选步骤中,通过添加细胞裂解混合物并在PCR热循环仪中短时温育,细胞被裂解,并让DNA成为可溶的。
[0297] 耗材:·0.2mL或0.5mL无菌PCR管
·PCR级H2O
·细胞裂解酶(Cell Lysis Enzyme)
·细胞裂解缓冲液(Cell Lysis Buffer)
·细胞或DNA样品
[0298] 制备:·从储藏处取出PCR级H2O和细胞裂解缓冲液并解冻至室温。
·从储藏处取出细胞裂解酶并保存在4℃冷(cold block)内。
·充分混合试剂,接着短暂离心以将内容物收集在管底。
·计算细胞裂解混合物(Cell Lysis Mix)所需的试剂体积。
[0299] 过程:
[0300] 通过在4℃冷块内合并以下试剂制备细胞裂解酶稀释液1(Cell  Lysis EnzymeDilution 1):
[0301] 充分混合,接着短暂离心
[0302] 通过在4℃冷块内合并以下试剂制备用于所需数量反应的细胞裂解混合物(CellLysis Mix)。
[0303] 用于裂解单个细胞/多细胞样品的步骤:(a)在位于PCR管内的细胞样品上方添加3μl细胞裂解混合物。通过在试验台上轻敲管,确保裂解混合物在管上标记的样品位置上滚动。不要混合或涡旋。
(b)如果需要将内容物收集在管底,在微型离心机中短暂离心。
(c)以其他样品重复。
[0304] 用于无模板对照(NTC)制备的步骤:(a)向标记NTC的1个无菌PCR管添加3μl的细胞裂解混合物。
(b)向标记NTC的管添加1μl PCR级H2O。
[0305] 用于在WGA PCR前的DNA样品制备的步骤(如果需要):(a)向所需数量的无菌空PCR管添加3μl细胞裂解混合物。
(b)向每个含有细胞裂解混合物的管添加1μl 30pg/μl DNA样品。进行下一步。
[0306] 在编程如下的热循环仪中温育所有样品和NTC:
[0307] 将所有样品置于冷块内。
[0308] (ii)全基因组扩增和靶向序列富集
[0309] 在该步骤中,在基于简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)的全基因组扩增(WGA)前,生成主混合物,并添加至裂解样品中。这生成来自细胞的总DNA或它们的DNA等同物的代表性扩增。
[0310] 耗材:·1.5mL管
·PCR级H2O
·WGA PCR缓冲液
·DOP引物
·WGA聚合酶
·裂解的样品和NTC(来自细胞裂解)
·序列特异引物
使用各种不同的DOP引物是可能的。DOP引物的实例包括这样的DOP引物,其一部分核苷酸序列允许在特定位置具有不止一个碱基的可能性,还可以使用可与一个或更多个其他碱基形成碱基对的DOP引物。
制备:
·在使用者提供的PCR级H2O中将序列特异引物稀释至所需浓度。
·从储藏处取出PCR级H2O、WGA PCR缓冲液和引物并解冻至室温。
·从储藏处取出WGA聚合酶并保存在4℃冷块内。
·充分混合试剂,接着短暂离心以将内容物收集在管底。
·计算WGA主混合物所需的试剂体积。
[0311] 过程:·通过将以下试剂按它们所列出的顺序合并在1.5mL管中,为所需数量的反应制备WGA主混合物。
·充分混合,接着在微型离心机中短暂旋转下去。
·将22μl PCR主混合物转移至各个含有裂解模板的管(细胞裂解混合物中的样品或
NTC)。为了防止从样品取出任何DNA,不要将吸管端插入裂解的样品混合物中。不要混合或涡旋该PCR管。在微型离心机中短暂离心或旋转,以将内容物收集在管底。
·将22μl PCR主混合物转移至含有DNA模板(在细胞裂解混合物中)的各个管。为了防止从样品取出任何DNA,不要将吸管端插入裂解的样品混合物中。充分混合,接着短暂离心以将内容物收集在管底。
·在编程如下的热循环仪中温育所有样品和NTC:
[0312] (iii)用于在带有TSE PCR的WGA之前稀释序列特异引物的步骤
[0313] 过程:·建议采用30pg gDNA模板优化用在WGA PCR中的每个引物组。
·用PCR级H2O将序列特异引物稀释至所需的工作储备浓度(working stock 
concentration)。
·作为指导,采用工作储备浓度2μM,、5μM和10μM滴定引物浓度。采用半定量PCR(低数量的PCR循环,其中靶向的带在凝胶上刚刚可见。不要运行PCR至平台期)或替代方法证实序列富集,以定下最佳工作储备引物浓度。
·作为实例,可将针对靶区域的嵌套PCR用于证实发生了靶向序列富集。
·通过在琼脂糖凝胶上运行WGA产物以确保PCR扩增子对于DOPlifyTM WGA为典型大小
和量,也提供对已使用了最佳引物浓度的证实。
·在PCR程序的保持(HOLD)步骤期间,向每个在WGA混合物中含有DNA模板的管转移1.4μl 5’(正向)引物和1.4μl 3’(反向)引物。添加至样品的多重组(multiplexed set)中所有引物的体积总计不应超过2.8μl。为了防止取出任何样品DNA,不要将吸管端插入样品混合物中。相反,将引物吸移至PCR管的侧部,刚刚在样品主混合物水平上方。
·短暂离心以将内容物收集在管底。
·继续WGA PCR程序。
·完成PCR后,将DNA在4℃短期保存或在-20℃长期保存。
·可以例如通过凝胶电泳评估WGA DNA的质量。WGA DNA产物应表现为弥散产物(a 
smear of products),范围从200bp至2000bp。NTC应表现为干净的,存在引物二聚体(primer dimers)。
·失败的WGA扩增由存在引物二聚体、但没有更大的扩增产物的迹象来指示。
·不佳的WGA扩增由具有较低强度的弥散(smears)指示,或者由具有比预期的大小范
围(对相同琼脂糖凝胶上其他样品观察到的)明显更大或更小的PCR产物的弥散指示。
·采用序列特异PCR和作为模板的全基因座扩增的DNA证实靶向序列富集。由于向WGA PCR添加了基因特异引物,与对照相比琼脂糖凝胶将显示靶序列的富集的扩增。
[0314] 尽管已参考具体实施方案描述了本公开,但应理解,本公开可以以很多其他形式体现。还应理解,本文描述的本公开容许不同于具体描述的那些的改动和修饰。应理解本公开包括所有这样的改动和修饰。本公开还包括本说明书中单独或集中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物,以及任何两个或更多个步骤或特征的任意和所有组合。
[0315] 还应注意的是,用在本文时,单数形式的“a”、“an”和“the”包括复数方面,除非上下文已另有说明。
[0316] 在整个说明书中,除非上下文另有要求,否则词语“包括(comprise)”或诸如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”的变体将被理解为暗示涵盖所述元素或整数或成组的元素或整数,但不排除任何其他元素或整数或成组的元素或整数。
[0317] 对本说明书中的任何现有技术的引用不是,也不应被视为承认或以任何形式暗示该现有技术构成任何国家的公知常识的一部分。
[0318] 包括进本文中使用的主题标题仅仅是为了便于读者参考,不应该用于限制在整个公开内容或权利要求中找到的主题。该主题标题不应用于解释权利要求的范围或权利要求限制。
[0319] 本文提供的说明涉及几个可以享有共同特点和特征的实施方案。应理解,一个实施方案的一个或更多个特征可以与其他实施方案的一个或更多个特征组合。此外,这些实施方案的单个特征或特征组合可以构成另外的实施方案。
[0320] 本文描述的所有方法都可以适当的顺序进行,除非本文另有说明或者显然与上下文矛盾。除非另有申明,本文提供的任何以及全部实例或示例性语言(例如,“例如”)仅旨在更好地阐述该示例实施方案,无意限制所主张的发明的范围。说明书中的任何语言都不应理解为表示任何非权利要求元素是必要的。
[0321] 未来的专利申请可以基于本申请提交,例如通过从本申请要求优先权,通过要求分案状态和/或通过要求继续状态。应理解,所附权利要求仅以示例的方式提供,并且不旨在限制任何此类未来申请中可要求保护的范围。也不应认为权利要求限制对本公开的理解(或排除其他理解)。将来可以向示例权利要求添加或从中省略特征。
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