技术领域
[0001] 本
发明属于基因诊断技术领域，具体涉及角蛋白12(KRT12)基因在检测圆锥角膜中的应用。
[0002] 发明背景
[0003] 圆锥角膜(keratoconus)是一种原发性变性
疾病，以角膜扩张、中央变薄向前突出，呈圆锥形为特征的一种眼病。它常造成高度不规则近视散光，晚期会出现急性角膜
水肿，形成瘢痕，视
力显著下降。多于青春期发病，缓慢发展。圆锥角膜在临床并不少见。世界范围普通人群的患病率为0.5‰～2.3‰，欧美为0.1‰～0.5‰，日本为0.7‰～0.8‰，中国0.4‰，不同种族之间存在差异，虽然其发病率相对并不高，但由于它主要响影青壮年，因此它对社会所造成的健康危害远高于它的发病率及临床症状所表现出来的严重程度。
[0004] 原发性圆锥角膜的确切病因和发病机制尚不明了,可能是多因素的结果,如遗传学说、胶原学说、基因学说、基质学说、代谢与发育障碍学说等。较多学者认为本病为常
染色体隐性遗传。圆锥角膜可独立发生，也可作为眼部或全身综合征的伴发症状。根据病情的进展，在疾病的早期，单纯眼镜就可矫正。当角膜不规则散光明显增大时，应要配戴硬性角膜
接触镜(RGP)来矫正视力。但RGP不能阻止病情发展，当RGP不能配戴或矫正视力差时需要做角膜移植手术，给患者及全社会带来沉重的经济负担。在早期及中期可行角膜胶原交联手术来加固角膜硬度，一定程度上减缓圆锥角膜进展速度。这种现状促使进一步去发现和了解该病新的致病基因，为后续基因诊断、产前诊断及
基因治疗提供
基础。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种KRT12基因在制备检测圆锥角膜诊断制品中的应用，从而弥补
现有技术的不足。
[0006]
申请人从一个圆锥角膜家系中，发现该家系的KRT12基因存在遗传上的致病突变，经检测为与圆锥角膜疾病相关的SNP位点，从而促成了本发明。
[0007] 本发明首先提供KRT12基因新的用途，是在制备用于检测圆锥角膜营诊断制品中的应用；
[0008] 上述的诊断制品，作为
实施例的优选，是检测圆锥角膜的引物或探针。
[0009] 本发明再一个方面提供一种与圆锥角膜疾病相关的SNP位点，为KRT12基因编码区域由起始密码子起第1456位与1457位之间,插入了
碱基为GAT；
[0010] 检测上述SNP位点的引物对，其引物信息如下：
[0011]
[0012] 本发明还提供一种用于检测圆锥角膜的
试剂盒，包含有上述的引物对中任一种或几种。
[0013] 其中用于检测上述SNP位点的引物信息如下：
[0014] KRT12-8.1L：CAACCAGTGTTGGATTAATATTTG SEQ ID NO:15
[0015] KRT12-8.1R：CCAGGTCCAGAAGGATATAAGG SEQ ID NO:16
[0016] 本发明提供了KRT12基因的新的用途，从而提供了一种有效的进行圆锥角膜疾病基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者及
胎儿绒毛或
羊水进行KRT12基因突变位点的快速检测。
具体实施方式
[0017] KRT12基因由7108个核苷酸碱基组成，位于17q12，可转录成大约1485bp的mRNA(NM_000223.3)，直接翻译形成494个
氨基酸组成的
蛋白质。
[0018] 下面结合实施例对本发明进行详细的描述。
[0019] 实施例1：从圆锥角膜患者中筛选KRT12基因的突变位点
[0020] 1、提取外周血基因组DNA：
[0021] 在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，
抽取第一个家系成员外周静脉血2-5ml，放入EDTA抗凝管内，-80℃冻存备用；冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500μL放于离心管，加入等体积TE(pH8.0)，混匀，4℃，10000rpm离心10分钟，弃上清。
[0022] 加入180μL TE、20μLSDS(10％)、8μL蛋白酶K(l0mg/ml)混匀，置于37℃水浴过夜。从水浴中取出样品，瞬时离心沉淀样本。在反应管中加入等体积的Tris-饱和酚(约300μL)，充分混匀，室温下10000rpm离心10分钟，吸取上清液(约300μL)至一新离心管中。重复酚抽提一次，吸取上清液至一新离心管中。
[0023] 加入等体积的Tris饱和酚:氯仿
混合液(酚、氯仿各150μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。
[0024] 加入等体积的Tris饱和酚:氯仿:异戊醇混合液(酚、氯仿、异戊醇各100μL)，混匀，室温10000rpm离心10分钟，转移上清液至一新离心管。
[0025] 加入l/10体积3mol/L、pH5.2
醋酸钠(约30μL)，2倍体积预冷100％
乙醇，轻轻混合，可见白色絮状沉淀。室温10000rpm离心10分钟，使DNA沉淀于管底，弃上清。
[0026] 向DNA沉淀加入70％乙醇，漂洗一次，室温7000rpm离心5分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μL TE(pH8.0)，4℃过夜溶解DNA。
[0027] 对提取的DNA行琼脂糖胶
电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA纯度及浓度。
[0028] 2.直接测序法验证该家系内患者KRT12基因的突变
[0029] PCR扩增目的
片段：反应条件与反应体系：
[0030] (1)PCR反应条件：94℃3min；94℃40sec，55±2℃40se,72℃60sec，30-35cycles；72℃10min。
[0031] (2)反应体系：(TAKARA LA Taq polymerase)
[0032]
[0033]
[0034] 应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板与该KRT12引物的扩增反应。1456位与1457位之间,插入了碱基为GAT
[0035] PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，该家系中三名患者的KRT12基因编码区域由起始密码子起第1456位与1457位之间发生了杂合突变，插入了碱基为GAT，引起KRT12蛋白第486位由谷氨酰胺突变为精氨酸，第487位突变为终止密码子。应用突变预测程序Mutation Taster预测发现，该突变导致了KRT12蛋白功能“disease causing”级的损坏，从而引起了该家系中圆锥角膜的发生。多次测序结果表明该突变位点并不是因为扩增或测序错误引进的。在200例正常当地人群及该家系中正常人的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查,未发现该突变。
[0036] 在山东省眼科研究所暨青岛眼科医院收集诊断明确的圆锥角膜散发患者一名，提取其外周血基因组DNA，应用该患者的DNA模板与KRT12-8.1L和KRT12-8.1R引物进行PCR扩增，应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，该患者的KRT12基因存在本发明中发现的SNP突变，即编码区域由起始密码子起第1456位与1457位之间发生了杂合突变，插入了碱基为GAT，引起KRT12蛋白第486位由谷氨酰胺突变为精氨酸，第487位突变为终止密码子。
[0037] 上述结果表明KRT12基因可以用来检测患者是否具有潜在患圆锥角膜的危险。通过将检测者的KRT12基因的各外显子片段于正常的对应片段比较，确定待检测者的患病
风险。
