技术领域
[0001] 本
发明涉及一种羊水细胞培养基，属于细胞培养基技术领域。
背景技术
[0002] 羊膜腔穿刺术是最常用的侵袭性产前诊断技术。医生可以通过
抽取羊水得到
胎儿的
皮肤、肠胃道、泌尿道等的游离细胞，利用这些游离细胞进一步分析胎儿的
染色体是否异常。该手术一般在16～22周时进行，此时羊水中活细胞比例较高。抽取羊水主要是分析胎儿的染色体组成，其中最重要且常见的就是唐氏综合征。有些单基因
疾病，如乙型海洋性贫血、血友病等，也可以通过检验羊水细胞内的基因(DNA组成)得到诊断。
[0003] 羊膜腔穿刺术中医生可以通过抽取羊水得到胎儿的皮肤、肠胃道、泌尿道等的游离细胞，而羊水中的胎儿细胞较少，不能满足诊断需求，因此需要对于羊水中的细胞进行培养，扩增培养胎儿细胞后，再进行各项检查。用于培养羊水中胎儿细胞的培养基即为羊
水培养基，羊水培养基一般由
基础培养基和各种添加剂组成，添加剂用于刺激羊水细胞的快速增殖。目前市面上常见的羊水培养基对于羊水细胞的培养效果较差，
细胞增殖慢，培养后获得的细胞团较少。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种羊水细胞培养基，该培养基能够促进羊水细胞的增殖，培养后获得较多的细胞团。
[0005] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
[0006] 一种羊水细胞培养基，包括基础培养基和羊水细胞培养添加剂，还包括人胚胎滋养层细胞培养液；所述人胚胎滋养层细胞培养液的用量为30-70mL/L。
[0007] 本发明中的羊水细胞培养基中添加了30-70mL/L人胚胎滋养层细胞培养液，得到的羊水培养基能够有效刺激羊水细胞的生长，获得更多的细胞团。
[0008] 优选的，所述羊水细胞培养添加剂为胰岛素、胰高血糖素、氢化可的松、亚硒酸钠、集落刺激因子、雌二醇、
硝酸铁、
柠檬酸铁、
成纤维细胞因子、神经生长因子、表皮细胞生长因子、
白蛋白、维生素中的一种或多种。更为优选的，所述羊水细胞培养添加剂各组分的用量为：胰岛素1-5mg/L；胰高血糖素1-5mg/L；氢化可的松1-5nmol/L；亚硒酸钠10-30nmol/L；集落刺激因子1-10μg/L；雌二醇1-5nmol/L；硝酸铁1-5mg/L；柠檬酸铁1-5mg/L；成纤维细胞因子0.1-20μg/L；神经生长因子0.1-20μg/L；表皮细胞生长因子0.1-20μg/L；白蛋白1-5mg/L；维生素1-5mg/L。
[0009] 本发明中的基础培养基可以为本领域常用的细胞培养基，优选的，所述基础培养基为F12/DMEM培养基。
[0010] 具体的，所述人胚胎滋养层细胞培养液由包括如下步骤的方法制备：
[0011] 1)利用完全培养基培养人胚胎滋养层细胞；
[0012] 2)去除完全培养基，利用无血清培养基培养人胚胎滋养层细胞；
[0013] 3)取上层培养液过滤，即得。
[0014] 本发明中获得人胚胎滋养层细胞培养液是通过细胞培养获得的天然组成成分，是一种高效的多因子混合物，对于羊水细胞的培养具有良好的效果，其刺激羊水细胞生长的效果明显优于一般培养基成分。其中人胚胎滋养层细胞购自于专业原代细胞分离培养公司(上海博湖、江苏齐氏、南京赛泓瑞等)。
[0015] 优选的，步骤1)中培养人胚胎滋养层细胞36-60h。优选的，步骤1)中培养人胚胎滋养层细胞24-48h。
[0016] 优选的，步骤1)中所述完全培养基为：同人胚胎滋养层细胞一起采购获得的人胚胎滋养层细胞完全培养基。
[0017] 优选的，步骤2)中所述无血清培养基为F12/DMEM。
[0018] 优选的，步骤3)中所述过滤是使用0.22μm滤膜进行过滤。过滤可以除去细胞及其它杂质，这些物质会对羊水培养造成影响。
[0019] 优选的，所述羊水细胞培养基中人胚胎滋养层细胞培养液为50mL/L。培养液过多或过少均会造成培养效果变差，影响培养效果。
[0020] 本发明中的白蛋白可以为本领域常用的白蛋白，优选为人血白蛋白。
[0021] 优选的，所述维生素为维生素B1。
具体实施方式
[0022] 下述
实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0023] 以下实施例中使用的物质来源如下所示：集落刺激因子购自索莱宝；成纤维细胞因子购自索莱宝；神经生长因子购自sigma；表皮生长因子购自sigma；使用的维生素为维生素B1，购于上海源叶
生物科技有限公司。
[0024] 人胚胎滋养层细胞
试剂盒购自江苏齐氏生物科技有限公司，其中包含人胚胎滋养层细胞和供其生长的完全培养基。
[0025] 实施例1
[0026] 本实施例中的羊水细胞培养基，包括如下组分：胰岛素2mg/L；胰高血糖素2mg/L；氢化可的松1nmol/L；亚硒酸钠10nmol/L；集落刺激因子2μg/L；雌二醇1nmol/L；硝酸铁2mg/L；柠檬酸铁5mg/L；成纤维细胞因子0.5μg/L；神经生长因子1μg/L；表皮细胞生长因子2μg/L；人血白蛋白5mg/L；维生素2mg/L；人胚胎滋养层细胞培养液50mL/L，余量为基础培养基F12/DMEM。
[0027] 所述人胚胎滋养层细胞培养液由包括如下步骤的方法制得：人胚胎滋养层细胞购自于专业原代细胞分离培养公司；
[0028] 1)人胚胎滋养层细胞计数达到5×105个细胞/mL时，转入T25培养瓶(以相同
密度的扩大比例)中培养，37℃条件下，在二
氧化
碳培养箱中，利用完全培养液培养48h。
[0029] 2)培养48h后，利用无血清培养基更换上清液中的完全培养基，更换时需洗涤多次，以充分去除完全培养基；使用无血清培养(F12/DMEM)基继续培养36h。
[0030] 3)培养后，离心去除人胚胎滋养层细胞，取上清培养液使用0.22μm滤膜进行过滤，即得。
[0031] 人胚胎滋养层细胞传代能达到10代左右，10代后需要使用新的人胚胎滋养层细胞制备过滤液。
[0032] 实施例2
[0033] 本实施例中的羊水细胞培养基，包括如下组分：
[0034] 胰岛素1mg/L；胰高血糖素5mg/L；氢化可的松5nmol/L；亚硒酸钠30nmol/L；集落刺激因子10μg/L；雌二醇5nmol/L；硝酸铁1mg/L；柠檬酸铁1mg/L；成纤维细胞因子0.1μg/L；神经生长因子20μg/L；表皮细胞生长因子20μg/L；人血白蛋白1mg/L；维生素5mg/L；人胚胎滋养层细胞培养液70mL/L，余量为基础培养基F12/DMEM。
[0035] 所使用的人胚胎滋养层细胞培养液同实施例1。
[0036] 实施例3
[0037] 本实施例中的羊水细胞培养基，包括如下组分：
[0038] 胰岛素5mg/L；胰高血糖素1mg/L；氢化可的松3nmol/L；亚硒酸钠20nmol/L；集落刺激因子1μg/L；雌二醇3nmol/L；硝酸铁5mg/L；柠檬酸铁3mg/L；成纤维细胞因子20μg/L；神经生长因子0.1μg/L；表皮细胞生长因子0.1μg/L；人血白蛋白3mg/L；维生素1mg/L；人胚胎滋养层细胞培养液30mL/L，余量为基础培养基F12/DMEM。
[0039] 所使用的人胚胎滋养层细胞培养液同实施例1。
[0040] 对比例1
[0041] 本对比例中所使用的羊水细胞培养基为Gibco培养基(型号为11269-016羊水培养基)。
[0042] 对比例2
[0043] 本对比例中的羊水细胞培养基，包括如下组分：胰岛素2mg/L；胰高血糖素2mg/L；氢化可的松1nmol/L；亚硒酸钠10nmol/L；集落刺激因子2μg/L；雌二醇1nmol/L；硝酸铁2mg/L；柠檬酸铁5mg/L；成纤维细胞因子0.5μg/L；神经生长因子1μg/L；表皮细胞生长因子2μg/L；人血白蛋白5mg/L；维生素2mg/L；余量为基础培养基F12/DMEM。
[0044] 试验例
[0045] 将实施例1和对比例1-2中的培养基同时用于同一批次获得的羊水细胞，具体为：
[0046] 1、羊水在洁净环境下采集与离心，弃去上清，分别补充上述实施例1与对比例1、2相同体积的培养基，
[0047] 2、置于37℃CO2培养箱中进行培养。
[0048] 依据细胞形态与生长情况对细胞克隆团数目进行统计。利用
显微镜目镜中的标尺对细胞克隆团的直径进行测量。
[0049] 统计结果如表1和表2所示，表1为不同培养基获得的细胞克隆团总数，表2为不同培养基所获得细胞克隆团的直径。
[0050] 表1两种培养基获得细胞克隆团总数
[0051] 实施例1 对比例1 对比例2
第一瓶 17 16 10
第二瓶 18 15 9
第三瓶 19 17 11
第四瓶 22 20 13
第五瓶 25 22 15
[0052] 表2两种培养基所获得细胞克隆团的直径
[0053]
[0054]
[0055] 从表1中可以看出本发明中的羊水细胞培养基所获得的细胞克隆团数目高于对比例1约10％；与对比例2相比，细胞克隆团数目高出70％以上。从表2可以看出本发明中的羊水细胞培养基所获得的细胞克隆团平均直径与对比例1基本无差异，与对比例2相比，细胞克隆团平均直径较大。
