本发明涉及一种具有免疫调节和抗疲劳功能的组合物，及其制备方法、用途和质量控制方法。

一般人体在两种状态下容易得病，一是人体对外界环境适应力下降，机体处于疲劳及虚弱状态，一是受到外界环境如病原体的侵害，免疫机能下降。而传统的预防疾病的方法只是单纯服用滋补药物以提高机体状况，增强对环境的适应能力，或提高机体的免疫能力，以提高人体抗病能力。
西洋参为五加科植物西洋参Panax quinquefolium L.的干燥根，被誉为“扶正固本”及“适应原样药物”的代表，对一般机体可起滋补强壮作用，增强抗病能力，患病机体出现生理功能紊乱和失调时，它具有调整及治疗作用。西洋参在我国自古被奉为保健上品，现代医学对西洋参的研究表明西洋参具有明显的抗疲劳和免疫增强作用。
松果菊为菊科植物紫花松果菊Echinacea purpurea的干燥全草，又名紫锥菊，是美洲和欧洲近年来销量最大的药用植物之一，具有明显的免疫促进和免疫调节作用。在欧美，历史上将紫锥菊做为血液清洁剂及免疫增强剂而广泛应用，并用于治疗蛇毒、免疫力低下、白细胞减少及各类炎症，多用于预防感冒及流行性感冒。现代医学研究表明，紫锥菊可对免疫系统产生许多非特异性效应，如可激活补体替代途径，提高白细胞的数量并增强白细胞的活性，促进非特异性T—细胞的活化，增强巨噬细胞的吞噬能力等，因而具有明显的提高机体免疫功能的作用。在欧美人们经常服用紫锥菊以预防疾病和增强体质。
但是，紫锥菊没有抗疲劳和适应原样作用，所以它对体质虚弱的人只能起到辅助而片面的作用。而加入西洋参就可以有效地提高人体对外界环境变化的应激能力，增强对环境的适应能力，有效地消除机体的虚弱状态和提高人体素质，所以两种植物配合使用，可以在功能上有协调作用，而更好的发挥免疫调节和抗疲劳功能。

本申请就是将西洋参与紫锥菊配伍，提供一种能同时发挥免疫调节和抗疲劳功能的组合物。通过研究，还进一步制定了本产品的质量控制方法。
产品的原料组成及制备工艺：西洋参总皂甙类粗提物1-2份，紫锥菊40-70％乙醇提取物3-5份，产品原料的优选配比为：西洋参总皂甙类粗提物1份，紫锥菊40-70％乙醇提取物3.5份，优选使用紫锥菊50％乙醇提取物。
本产品可以制成药剂学的任意剂型，如片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液，优选剂型为软胶囊。
对于软胶囊，其原辅料配方如下：西洋参总皂甙类粗提物  1-2份紫锥菊40-70％乙醇提取物  3-5份，聚乙二醇400   5-10份甘油  1-3份大豆色拉油  1-3份水    1-3份其中聚乙二醇400、甘油、大豆色拉油可以用其他相应的药剂学可接受的辅料代替。
产品及原料的质量控制方法本方法适用于以西洋参、紫锥菊或西洋参总皂甙类提取物、紫锥菊乙醇提取物为原料制成的组合物的质量控制。
一、组合物中功效成分总皂甙、人参皂甙Rb1的含量测定1.分光光度法测定组合物中人参皂甙的含量西洋参中所含人参皂甙，经大孔吸附树脂预处理小柱净化，在酸性条件下与香草醛发生反应，用分光光度法进行定量。
标准曲线的制定：取人参皂甙Re标准品，配制成浓度为1g/L的标准溶液，取标准溶液不同体积，分别用70％乙醇定容至1.0ml，精密加入香草醛乙醇溶液0.5ml，80％硫酸溶液5ml，摇匀，置60℃±1℃水浴中加热显色至颜色相对稳定时，取出立即放入冰浴中冷却，比色，于544nm处测定吸收度，以吸收度对浓度回归得回归方程。
样品的测定：取组合物适量，精密称取，以适量水提取，再定容至100ml备用，取此样品溶液0.5-1ml，过大孔树脂柱(该柱已用丙酮，水淋洗净化)，用70％乙醇洗脱人参总皂甙，收集洗脱液，待用。
将上述洗脱液精密加入香草醛乙醇溶液0.5ml，80％硫酸溶液5ml，摇匀，置60℃±1℃水浴中加热，显色稳定后取出立即放入冰浴中冷却，比色，于544nm处测定吸收度，以回归方程计算以人参皂甙Re计的人参皂甙含量。
2.高效液相法测定产品中的人参皂甙Rb1的含量采用高效液相色谱法可将人参皂甙Rb1与其它成分分离而定量。人参皂甙Rb1在203nm处有吸收峰，可对Rb1进行定量测定。
色谱条件：色谱柱：ODS柱(5m，4.6×250nm)；流动相：乙腈-0.05％磷酸溶液(99∶400)，流速：1ml/min，检测波长：203nm。
标准曲线的测定：精密称取人参皂甙Rb1对照品10.0mg，用流动相溶解并定容至10ml容量瓶中，即为对照品溶液。分别吸取对照品溶液不同体积进样，测定得到峰面积的数据，以峰面积对浓度回归得回归方程。
样品的测定：精密称取组合物适量，用水溶解，取水溶液过滤，滤液适量，用水饱和的正丁醇萃取，合并正丁醇相，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，滤过，滤液用甲醇定容，过0.35-0.50μm的微孔滤膜，精密吸取适量，注入液相色谱仪中，在203nm测定峰面积的数据，按回归方程计算样品中人参皂甙Rb1的含量。
二、对组合物中紫锥菊的定性鉴别对紫锥菊的化学成分及药理研究表明，紫锥菊含有多糖、咖啡酸衍生物、挥发油、多聚乙炔、烷基酰胺等成分，但任何一种单一成分或组分的保健作用均不明显，而各组分的协同作用却很强，所以目前紫锥菊的功效成分还无法确定。在国外有些生产紫锥菊制剂的公司将菊苣酸作为紫锥菊的指标成分，但菊苣酸很不稳定，目前又没有市售标准品，因此现在无法对紫锥菊进行定量测定。但我们对紫锥菊进行了定性鉴别，以监控含有紫锥菊提取物产品的质量。
紫锥菊中含多糖类成分菊糖，菊糖是菊科植物的特征性成分之一，该成分与α-萘酚、浓硫酸反应可以生成紫色化合物而显色，用以检验菊科植物。
紫锥菊中含有多种咖啡酰类衍生物，其中咖啡酸、绿原酸是其成分组成。在天然植物中，绝大多数植物或只含有咖啡酸，或只含有绿原酸，同时含有这两种成分的植物还未见报道，所以可同时用这两种成分对紫锥菊进行定性鉴别，以突出其特征性。紫锥菊中的咖啡酸、绿原酸，经薄层色谱分离后，用碘显色，在与对照品对应的位置上，显相同颜色的斑点。
使用此两种方法可对紫锥菊提取物进行定性鉴别。
1.紫锥菊的颜色反应：取组合物适量，以水提取，吸取水溶液适量置于试管中。加α-萘酚乙醇溶液3滴，摇匀后沿管壁缓缓加入浓硫酸1ml，在硫酸层和供试液层之间界面处出现明显的紫红色环。
2.紫锥菊的薄层层析：取组合物适量，以水提取，取水溶液适量，滤过，以氯仿萃取，弃去氯仿液，水层用稀盐酸溶液调至pH3.0，再用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收乙酸乙酯至干，残渣用甲醇适量溶解，即为供试品溶液。制备咖啡酸、绿原酸浓度为1.0-2.0mg/ml的甲醇溶液作为对照品溶液。取供试品溶液和对照品溶液各适量，点于硅胶G的薄层上，以乙酸乙酯-甲酸-水(10∶1∶9)的下层溶液展开，取出，挥去展开剂，以碘显色，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，为样品中检出的咖啡酸和绿原酸。
1、2两种定性鉴别方法同样适于对紫锥菊的醇提取物进行定性鉴别。
三、紫锥菊原料的质量标准为更好地控制产品质量，应对原料质量进行控制。对原料西洋参的质量控制采用已有的方法和标准即可，对原料紫锥菊可以采用以下定性方法进行控制。
1、取紫锥菊粉末适量，加60-75％乙醇振摇后放置数小时，滤过，取滤液2ml，加1％试液1～2滴，即产生深蓝色沉淀。
2、取上述滤液1ml，置于试管内，加α-茶酚乙醇溶液3滴，摇匀后沿管壁缓缓加入浓硫酸1ml在硫酸层和供试液层之间界面处出现明显的紫红色环。
3、取紫锥菊粉末适量，加水提取，滤过，取滤液5ml，加乙醇使含醇量达70-80％，振摇，静置，滤过，用70-80％乙醇适量洗涤沉淀，取适量沉淀物，用水溶解，加盐酸少量，沸水浴加热20-30分钟后用氢氧化钠试液调pH＞7，加Fehling溶液少量，沸水浴上加热数分钟，即产生砖红色沉淀。
4、薄层色谱鉴别：取紫锥菊粉末适量，用60-75％乙醇溶液提取，置75-85℃水浴上浓缩至小体积，用吸管取出，定容至1ml，即为样品液，另取紫锥菊对照药材1.0克，同法操作制备对照品溶液。取上述两种溶液各适量，分别点于硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(5∶5∶1)混合液展开，待展开剂展至板前沿时取出，使展开剂自然挥干。在紫外光灯(365nm)下观察层析板，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点。
方法1、4两种定性鉴别方法同样适于对紫锥菊的醇提取物及含紫锥菊醇提取物的组合物进行定性鉴别。
在定性鉴别和含量测定中所述的提取可以是加热回流、超声波提取。
具体实施方案(一).制备该组合物软胶囊取西洋参原料粉碎成粗粉，加入8倍量70％乙醇加热回流提取三次，每次2小时，滤过，合并滤液，减压浓缩至无醇昧，加入20倍量去离子水稀释，滤过，滤液上D101大孔吸附树脂，先用去离子水洗脱至无多糖反应，然后用70％乙醇洗脱至无皂甙反应为止，将70％乙醇洗脱液减压浓缩，浓缩液喷粉干燥，即为西洋参提取物，备用。
将紫锥菊全草置于粉碎机上粉碎成粗粉，加入8倍量的50％乙醇加热回流提取2小时，滤过，滤液备用，残渣继续用6倍量50％的乙醇提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，滤液胃减压浓缩罐中减压浓缩，喷粉干燥，即得紫锥菊提取物原粉，备用。
按以下配方备料：西洋参提取物  6.4g紫锥菊提取物  21.3g聚乙二醇400   42.6g
甘油        8.5g大豆色拉油  10.6g水          10.6g原辅料总量为100g，制成100粒胶囊，每粒胶囊净含量为1g。
按以上比例称取紫锥菊提取物、西洋参提取物，混合均匀，置搅拌机器中，开动搅拌机，缓慢加入聚乙二醇400混合均匀，再逐步加入甘油和食用油，混合均匀后再加入去离子水，迅速搅拌混合均匀，用均质机进行均质，即为软胶囊内容物。
以明胶、甘油和水制成软胶囊囊皮，将软胶囊内容物置软胶囊灌装机中灌装，每粒调整为含内容物1.0g的软胶囊，将软胶囊置干燥箱中干燥后，压入铝塑包装中，每板10粒。
产品的功效成份及含量：每100g中含：紫锥菊提取物21.3g，总皂甙4270mg人参皂甙Rb1 480mg保健功能：免疫调节、抗疲劳适宜人群：免疫力低下者、易疲劳者不适宜人群：少年儿童食用方法及食用量：每日2-3次，每次2粒规格：1g/粒(二).该组合物软胶囊中某些成分或组分的定性鉴别及含量测定产品中功效成分总皂甙、人参皂甙Rb1的含量应符合以下规定：总皂甙(以人参皂Re计)≥40000mg/kg；人参皂甙Rb1≥4000mg/kg。
1.分光光度法测定产品中的人参皂甙含量标准曲线的制定：取人参皂甙Re标准品，配制成浓度为1g/L的标准溶液，取标准溶液0、20、40、60、80、100μl(相当于0、20、40、60、80、100g)，分别用70％乙醇定容至1.0ml，精密加入香草醛乙醇溶液0.5ml，80％硫酸溶液5ml，摇匀，置60℃±1℃水浴中加热10分钟，取出立即放入冰浴中冷却15分钟，用1cm比色皿进行比色，于544nm处测定吸收度，以吸收度对浓度回归得回归方程。
样品的测定：取样品5粒，取出内容物，混合均匀，精密称取内容物0.5g，置100ml容量瓶中，加50ml水溶解，超声波振荡提取20min，再定容至100ml备用，此为待测样品溶液。
取上述样品溶液0.5ml，过大孔树脂柱(该柱已用丙酮，水淋洗净化)，样液完全通过后，用2.5ml水，分4次淋洗柱子，用吸耳球吹去水份，用70％乙醇1.0ml洗脱人参总皂甙，收集洗脱液，待用。
将上述洗脱液精密加入香草醛乙醇溶液0.5ml，80％硫酸溶液5ml，摇匀，置60℃±1℃水浴中加热10分钟，取出立即放入冰浴中冷却15分钟，用1cm比色皿进行比色，于544nm处测定吸收度，以回归方程计算含量。
含量范围：每克胶囊内容物中，总皂甙的含量≥42.7mg。
2.高效液相法测定产品中的人参皂甙Rb1的含量色谱条件：色谱柱：ODS柱(5m，4.6×250nm)；流动相：乙腈-0.05％磷酸溶液(99∶400)，流速：1ml/min，检测波长：203nm。
标准曲线的测定：精密称取人参皂甙Rb1对照品10.0mg，用流动相溶解并定容至10ml容量瓶中，即为对照品溶液。分别吸取对照品溶液2μl、4μl、6μl、8μl、10μl进样，测定得到峰面积的数据，以峰面积对浓度回归得回归方程。
样品的测定：取样品5粒，取出内容物，混合均匀，精密称取内容物0.5g，置10ml容量瓶中，用水溶解，并定容，吸取下层水相，过滤，取滤液5ml，置分液漏斗中，用水饱和的正丁醇萃取3次，每次10ml，合并正丁醇相，减压回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解，滤过，滤液置10ml容量瓶中，用甲醇定容，过0.45μm的微孔滤膜，精密吸取20μl，注入液相色谱仪中，测定，按回归方程计算样品中人参皂甙Rb1的含量。
含量范围：每克胶囊内容物中人参皂甙Rb1的含量≥54.8mg。
3.胶囊中紫锥菊提取物的定性鉴别(1).紫锥菊的颜色反应：取1粒胶囊的内容物，置试管中，加水10ml，70℃加热提取10分钟，吸取下层溶液2ml置于试管中。加α-萘酚乙醇溶液3滴，摇匀后沿管壁缓缓加入浓硫酸1ml，在硫酸层和供试液层之间界面处出现明显的紫红色环。
(2).紫锥菊的薄层层析：取样品10粒，取出内容物，称取5.0g，用50ml去离子水加热提取，取下层溶液40ml，滤过，置分液漏斗中，用氯仿萃取3次，每次20ml，弃去氯仿液，水层用稀盐酸溶液(1-3ml)调pH3.0，再用乙酸乙酯萃取3次，每次20ml，合并乙酸乙酯液，减压回收乙酸乙酯至干，残渣用甲醇2ml溶解，即为供试品溶液。分别制备咖啡酸、绿原酸浓度为2.0mg/ml的甲醇溶液作为对照品溶液。以样品液20μl，对照品溶液各10μl，点于硅胶G的薄层上，以乙酸乙酯-甲酸-水(10∶1∶9)的下层溶液10ml展开，取出，挥去展开剂，以碘显色，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，为样品中检出的咖啡酸和绿原酸。
(三)、紫锥菊的定性鉴别1、取紫锥菊粉末0.5g，置三角瓶中，加70％乙醇30ml，振摇后放置8小时，滤过，得供试滤液，取滤液2ml，置试管中，加1％二氯化铁试液1～2滴，即产生深蓝色沉淀。
2、取上述滤液1ml，置于试管内，加α-茶酚乙醇溶液3滴，摇匀后沿管壁缓缓加入浓硫酸1ml在硫酸层和供试液层之间界面处出现明显的紫红色环。
3、取本品粉末1g，置圆底烧瓶中，加水50ml热回流1小时，滤过，取滤液5ml，加乙醇使含醇量达80％，振摇，静置20分钟，滤过，用80％L醇洗涤沉淀，取适量沉淀物，用水溶解，加盐酸少量，沸水浴加热30分钟后用氢氧化钠试液调pH＞7，加Fehling溶液少量，沸水浴上加热数分钟，即产生砖红色沉淀。
4、薄层色谱鉴别：取本品粉末1.0克，用70％乙醇溶液回流提取，置75-85℃水浴上浓缩至约1ml，用吸管取出，定容至1ml，即为样品液，另取对照药材1.0克，同法操作制备对照品溶液。取上述两种溶液各20μl，分别点于硅胶G薄层板上，以正丁醇-冰醋酸-水(5∶5∶1)混合液展开，待展开剂展至板前沿时取出，使展开剂自然挥干。在紫外光灯(365nm)下观察层析板，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝色荧光斑点。
组合物抗疲劳作用试验报告1.材料和方法1.1样品：该组合物软胶囊(按本申请所述方法制备)。
1.2实验动物：选用中国医科大学实验动物部提供的昆明种雄性小鼠(批准号辽实动第：007号)，体重18-22g。
1.3剂量选择：厂家推荐成人(体重以60kg计)摄入定型产品量为6.0g/60kg.bw.d，以厂家最低日推荐成人摄入量的10、20、和30倍设置灌胃剂量，即1.0、2.0、3.0s/kg.bw.d，各剂量组以蒸馏水稀释，蒸馏水作空白对照，各剂量组小鼠灌胃量为0.2mL/10g.bw.d，连续灌胃30天。
1.4实验方法：1.4.1负重游泳试验末次给予受试物30min后，置小鼠在游泳箱中游泳，水深约30cm，水温(25±0.5)℃，鼠尾根部负荷5％体重的铅皮。记录小鼠自游泳开始至死亡时间，作为小鼠游泳时间(min)。
1.4.2血清尿素氮测定末次给予受试物30min后，在温度为(30±0.5)℃的水中游泳90min，摘眼球采血，进行尿素氮含量测定(试剂盒：北京中生生物工：程高技术公司卫药准字D-81-8号)。
1.4.3肝糖原测定：末次给予受试物30min后处死小鼠取肝脏，经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取肝脏75mg，每管加入225μL试剂盒提供的碱溶液，用簿膜封住管口，扎一透气孔，沸水浴20分，冷却斤加入7.2mL蒸馏水，充分混匀，按试剂说明书操作，(试剂盒：南京市建成生物工程研究所提供)，用722分光光度汁在620nm波长进行比色测定，按说明书提供的公式换算肝糖原。
1.4.4血乳酸测定末次给予受试物30min后采血20μL，再在温度为(30±0.5)℃的水中游泳10min，分别于游泳后立即(游泳后0min)和游泳后休息30min各采血20μL，采用山东省科学院生物研究所生产的生物传感分析仪测定以上三个时间点的血乳酸值。(溶血剂及测定液均由该所提供)。
1.5实验数据用t检验进行统计。
2.结果2.1该组合物对小鼠负重游泳时间及小鼠体重的影响表1.该组合物对小鼠负重游泳时间及小鼠体重的影响剂量组        动物数        始重         终重        增重            游泳时间P                        p(g/kg.bw)      (只)         (g)          (g)          (g)              (min)空白对照        10       19.6±1.1    32.9±3.7  13.4±3.5    ---    4.02±3.77        ---1.0           10       19.1±1.0    31.8±3.5  12.7±3.3   0.6110  5.27±2.17       0.54302.0           10       19.4±0.8    31.7±2.6  12.4±2.5   0.4660  10.66±6.36ΔΔ  0.00243.0           10       19.2±1.1    32.2±3.5  13.0±3.1   0.7380  6.34±4.80       0.2620p：各实验组与空白对照组比较ΔΔ与空白对照组比较P＜0.01由表1可见，经口给予该组合物30天，各剂量组小鼠增重与空白对照组比较无显著性差异(P＞0.05)，中剂量组游泳时间长于空白对照组，且差异有极显著性(P＜0.01)，说明该组合物能延长小鼠负重游泳时间而对小鼠增重无影响。
2.2该组合物对小鼠血清尿素氮及小鼠体重的影响表2.该组合物对小鼠游泳后血清尿素氮及小鼠体重的影响剂量组         动物数         始重         终重         增重             血清尿素氮P                        p(g/kg.bw)       (只)          (g)           (g)         (g)               (moL/L)空白对照         10        19.2±1.2     32.2±1.6   13.1±2.3   ---    9.35±1.22        ---1.0            10        19.8±1.4     31.9±2.3   12.1±2.7  0.3830  7.07±0.86ΔΔ   0.00002.0            10        19.8±1.3     32.9±1.7   13.0±2.5  0.9390  6.30±0.67ΔΔ   0.00003.0            10        19.3±1.1     31.8±1.1   12.6±2.8  0.6640  5.99±0.69ΔΔ   0.0000p值：各实验组与空白对照组比较ΔΔ与空白对照组相比P＜0.01由表2可见，经口给予小鼠不同剂量的该组合物30天，各剂量组小鼠增重与空白对照组比较无显著性差异(P＞0.05)，高、中、低剂量组小鼠游泳后血清尿素氮均低于空白对照组，且与空白对照组比较差异有高度显著性差异(P＜0.01)，说明该组合物具有抑制小鼠游泳后血清尿素氮的升高的作用而对小鼠增重无影响。
2.3该组合物对小鼠肝糖原含量及小鼠体重的影响表3.该组合物对小鼠肝糖原含量及小鼠体重的影响剂量组         动物数         始重         终重         增重               肝糖原P                       p(g/kg.bw)       (只)           (g)          (g)          (g)             (mg/g肝组织)空白对照         10         20.0±1.3    32.7±3.4    12.7±2.8   ---    45.31±11.33     ---1.0            10         18.9±0.8    31.7±3.2    12.8±3.1  0.9940  42.10±7.85     0.45302.0            10         19.8±1.1    32.7±2.8    13.0±2.8  0.7550  46.43±9.41     0.79103.0            10         19.5±1.1    32.3±2.6    12.8±2.8  0.9300  44.65±8.82     0.8770p值：为实验组与空白对照组比较由表3可见、经口给予小鼠不同剂量的该组合物30天，各剂量组小鼠增重与空白对照组比较无显著性差异(P＞0.05)，各剂量组肝糖原含量与空白对照组相比差异未见有显著性(P＞0.05)，说明该组合物对肝糖原储备的作用及小鼠体重均未见影响。
2.4该组合物对小鼠血乳酸值及小鼠体重的影响表4.该组合物对小鼠游泳后血乳酸升高值*及小鼠体重的影响剂量组      动物数     始重      终重       增重              游泳前   游泳后Omin     升高值P                                           p(g/kg.bw)    (只)      (g)        (g)        (g)             (mmoL/L)    (mmoL/L)    (mmoL/L)空白对照      10    19.5±1.2  32.3±2.6  12.8±2.5   ---    3.2±1.3    4.8±0.8    1.5±1.0     ---1.0         10    19.6±1.1  31.9±3.2  12.3±3.6  0.7570  3.1±1.0    4.0±0.9    0.9±0.5Δ  0.03952.0         10    19.6±1.2  32.4±3.9  12.8±3.1  0.9940  2.9±1.0    3.7±0.6    0.8±0.4Δ  0.01113.0         10    19.0±1.0  31.5±3.4  12.4±3.3  0.817   3.2±1.1    4.2±0.7    1.0±0.5    0.0556*升高值：游泳后立即(游泳后0min)采血的血乳酸测定值与游泳前血乳酸测定值的差值p值：各实验组与空白对照组比较Δ与空白对照组相比P＜0.05由表4可见，经口给予小鼠不同剂量的该组合物30天，各剂量组小鼠增重与空白对照组比较无显著性差异(P＞0.05)，中、低剂量组小鼠游泳后血乳酸的升高值均低于空白对照组，且与空白对照组比较差异有显著性(P＜0.05)，说明该组合物能减少游泳时血乳酸的产生而对小鼠增重无影响。
表5.该组合物对小鼠游泳后休息30min血乳酸降低值*的影响剂量组     动物数  游泳后0min  休息30min  降低值(差值)p(g/kg.bw)    (只)   (mmoL/L)    (mmoL/L)    (mmoL/L)空白对照      10    4.8±0.8    3.5±1.1    1.2±1.0      --1.0         10    4.0±0.9    3.0±1.0    1.0±0.3    0.29602.0         10    3.7±0.6    2.9±0.6    0.8±0.3    0.10803.0         10    4.2±0.7    3.4±0.4    0.9±0.4    0.1660*降低值：游泳后立即(游泳后0min)采血测定血乳酸的值与游泳后休息30min采血测定血乳酸值的差。
p值：各实验组与空白对照组比较由表5可见，游泳后休息30min血乳酸的降低值，高、中、低剂量组与空白对照组相比无显著性差异(p＞0.05)，说明该组合物对血乳酸降低值未见影响。
3小结经口给予小鼠该组合物1.0、2.0、3.0g/kg.bw.d，连续灌胃30大，能延长小鼠负重游泳时间，减少小鼠游泳时血清尿素氮的产生，减少游泳时血乳酸的产生。由此判定该组合物具有抗疲劳作用。
该组合物免疫调节作用实验报告1.材料与方法1.1样品：该组合物胶囊。
1.2实验动物：选用白求恩医科大学医学实验动物部提供的昆明种小鼠(批准号医动字第：10-5107)。选健康雄性小鼠48只，体重18-22g，分为4组，每组12只，作为免疫一组，进行脏器/体重比值测定、迟发型变态反应、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验、半数溶血值(HC50)的测定和抗体生成细胞检测：昆明种健康雌性小鼠48只，体重18-22g，分为4组，每组12只，作为免疫二组，进行碳廓清实验：昆明种健康雄性小鼠48只，体重18-22g，分为4组，每组12只，作为免疫三组，进行ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验和NK细胞活性测定。
1.3剂量选择：该组合物厂家推荐量为每人(成人)每日6.0g，成人体重按60kg计，则每人(成人)每日6.0g/60kg体重，即0.10g/kg体重。以人体推荐量的10倍，即每日1.0g/kg体重作为小鼠的中剂量，上、下各设一个剂量组：3.0g/kg体重作为高剂量，为人体推荐量的30倍，0.10g/kg体重作为低剂量，为人体推荐量。各剂量组受试物以蒸馏水配制，空白对照约以蒸馏水灌胃，连续灌胃30天后测各项免疫指标。
1.4实验方法：1.4.1脏器/体重比值测定小鼠称正后脱臼处死，取脾脏和胸腺，去尽筋膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脾脏/体重比值和胸腺/体重比值。
1.4.2迟发型变态反应(足跖增厚法DTH)取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(V/V，用生理盐水配制)压积SRBC(2000tr/min，10min)0.2mL，致敏后4天，测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次取平均值。然后在测量部位皮下注射20％(V/V，用生理盐水配制)压积SRBC 20μL，于注射后24h测量左后足跖部厚度，以攻击前后足跖厚度的差值(足跖肿胀度)来表示DTH的程度。
1.4.3 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中，制成细胞悬液。用Hank’s液洗3次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，计数活细胞数，调整细胞浓度为2×106个/mL。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，在其中一孔加50μL ConA液(相当于5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％CO2 37℃CO2培养箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPM1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后将此液体移入比色杯中，在722分光光度计上比色测定，波长570nm。淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示。
1.4.4抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(V/V，用生理盐水配制)压积SRBC0.2mL。将SRBC免疫5天后的小鼠处死，取脾，制成细胞悬液。将琼脂糖加热溶解后，与等量双倍Hank’s液混合，分装小试管，每管0.5mL，再向管内加10％(V/V，用SA液配制)压积SRBC 50L、脾细胞悬液201。迅速混匀后，倾倒于已刷琼脂糖薄层的玻片上，待琼脂凝固后，交玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5h，然后用SA缓冲液稀释的补体(1∶10)加入到玻片架凹槽内，继续温育1.5h后，计数溶血空斑数。
1.4.5半数溶血值(HC50)的测定取羊血，生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(V/V，用生理盐水配制)压积SRBC 0.2mL进行免疫。5天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000r/min离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释400倍，取1mL直试管内，依次加入10％(V/V，用SA缓冲液配制)压积SRBC 0.5mL，补体1ml(用SA缓冲液按1∶10稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置37℃恒温水浴中保温30min后，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取上清1ml，加都氏试剂3ml。同时取10％(V/V，用SA缓冲液配制)的压积SRBC 0.25mL，加都氏试剂至4mL于另一试管中，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空白，分别测定各管光密度值。溶血素的量以数溶血值(HC50)表示，按下式计算。
样品HC50＝样品光密度值/SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数1.4.6小鼠碳廓清实验小鼠尾静脉注射1∶3.5稀释的印度墨汁，待墨汁注入，立即汁时。注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并将其加到2mLNaCO3溶液中。用722分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD)，以Na2CO3溶液作空白对照。将小鼠处死，取肝脏和脾脏称重。按下式计算吞噬指数a：κ＝(1gOD1-1God2)/(t2-t1)1.4.7小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验(半体内法)
小鼠腹腔注射20％(V/V用生理盐水配制)压积鸡红细胞(2000r/min，10min)悬液1mL，间隔30min，颈椎脱臼处死，取腹腔巨噬细胞洗液1mL，滴于载玻片上，放入垫有湿纱布的搪瓷盒内，移置37℃孵箱温育30min。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以甲醇固定，4％(V/V)Giemsa。孵毕，于生理盐水中漂洗，以除去未贴片细胞。晾干，以甲醇固定，4％(V/V)Giemsa-磷酸缓冲液染色，再用蒸馏水漂洗晾干。油镜下计数，每片计数100巨噬细胞，按下式计算吞噬和吞噬指数：吞噬率％＝吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100吞噬指数＝被吞噬鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数1.4.8NK细胞活性测定(乳酸脱氢酶LDH测定法)实验前半小时将靶细胞YAC-1进行传代培养，应用前以Hank’s液洗3次，用含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。受试小鼠拉颈处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank’s液洗3次，1500r/min离心10min，再用2mL含10％小牛血清的RPMI1640完全培养液重悬，用台酚兰染色计数(活细胞数应在95％以上)，调整细胞浓度为2×107个/mL，使效靶比为50∶1。取靶细胞利效应细胞各100μL，加入U形96孔培养板中：靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1％NP40各100μL；上述各项均设二个平行孔，37℃，5％CO2培养箱中培养4h，将96孔板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100L置酶标板中，加入LDH基质液100μL，反应10min，然后每孔加入1mol的HCL溶液30μL终止反应，在酶标仪490nm处测OD值，NK活性按下式计算：NK细胞活性％＝(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)×100LDH基质液的配制：乳酸钠5×10-2mol/L，硝基氯化四氮唑6.6×10-4mol/L，吩嗪二甲酯硫酸盐2.8×10-4mol/L，氧化型辅酶I1.3×10-3mol/L，将上述试剂溶于0.2mol/L的Tris-HCl冲液中(pH8.2)。
1.5实验数据用SPSS软件方差分析方法进行统计。
2结果2.1该组合物对小鼠体重的影响表6.该组合物对免疫一组小鼠体重影响动物数    始重        终重      增重组别(只)      (g)        (g)        (g)       P空白对照组    12    20.2±1.3  36.2±3.8  16.0±4.7   ---低剂量组      12    20.1±1.1  38.1±4.2  18.1±4.3  0.333中剂量组      12    20.5±1.1  36.2±5.5  15.6±5.9  0.841高剂量组      12    20.0±0.9  36.1±4.9  16.1±5.2  0.978p值：各实验组与空白对照组比较由表6可见，经统计学处理，小鼠的初始体重在低、中、高剂量组和空白对照组间比较无显著性差异(p＞0.05)，即小鼠的初始体重在各组间较为均衡。经口给予该组合物30天，各剂量组小鼠增重在低、中、高剂量组和空白对照组间比较无显著性差异(p＞0.05)。即该组合物对小鼠体重增重无影响。
表7该组合物对免疫二组小鼠体重影响动物数    始重       终重       增重组别(只)      (g)        (g)        (g)        P空白对照组    12    20.5±1.1  34.6±5.8  14.1±5.7    ---低剂量组      12    19.6±0.9  33.4±4.7  13.9±4.8   0.901中剂量组      12    20.0±1.1  34.0±4.4  14.0±4.3   0.965高剂量组      12    19.8±1.1  34.2±4.6  14.4±5.3   0.885p值：各实验组与空白对照组比较由表7可见，经统计学处理，小鼠的初始体重在低、中、高剂量组和空白对照组间比较无显著性差异(p＞0.05)，即小鼠的初始体重在各组间较为均衡。经口给予该组合物30天，各剂量组小鼠增重在低、中、高剂量组和空白对照组间比较无显著性差异(p＞0.05)。即该组合物对小鼠体重增重无影响。
表8该组合物对免疫三组小鼠体重影响动物数     始重         终重     增重组别(只)       (g)         (g)       (g)       P空白对照组    12    20.5±0.8   35.8±4.4  15.3±4.2   ---低剂量组      12    20.5±1.2   37.8±4.9  17.3±5.4  0.287中剂量组      12    20.7±0.7   34.5±4.7  13.8±4.7  0.419高剂量组      12    19.8±1.0   36.1±3.6  16.4±3.6  0.579p值：各实验组与空白对照组比较由表8可见，经统计学处理，小鼠的初始体重在低、中、高剂量组和空白对照组间比较无显著性差异(p＞0.05)，即小鼠的初始体重在各组间较为均衡。经口给予该组合物30天，各剂量组小鼠增重在低、中、高剂量组和空白对照组间比较无显著性差异(p＞0.05)。即该组合物对小鼠体重增重无影响。
2.2该组合物对小鼠脏器/体重比值的影响表9.  该组合物对小鼠脏器/体重比值的影响动物数  脾脏/体重比值      胸腺/体重比值组别                              P1P2(只)     (mg/g)             (mg/g)空白对照组    12    5.56±1.19         3.22±0.32    ---低剂量组      12    5.65±0.95  0.830  3.02±0.40   0.288中剂量组      12    5.07±0.79  0.250  3.24±0.60   0.900高剂量组      12    5.89±1.11  0.436  3.11±0.42   0.546脾脏/体重比值P1值：各实验组与空白对照组比较胸腺/体重比值P2值：各实验组与空白对照组比较同表9可见，经口给予小鼠不同剂量的该组合物30天，经统计学处理，其脾脏/体重比值和胸腺/体重比值在低、中、高剂量组与空白对照组间比较无显著性差异(P＞0.05)，即该组合物对小鼠的脏器体重比值无影响。
2.3该组合物对小鼠细胞免疫功能的影响2.3.1该组合物对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响表10该组合物对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响组别          动物数(只)       足跖肿胀度(mm)      P空白对照组        12            0.78±0.18        ---低剂量组          12            0.74±0.16       0.617中剂量组          12            0.75±0.17       0.675高剂量组          12            0.78±0.21       0.976P值：各实验组与空白对照组比较由表10可见，经口给予小鼠不同剂量的该组合物30天，经统计学处理，其足跖肿胀度在低、中、高剂量组与空白对照组间比较无显著性差异(p＞0.05)，即该组合物对小鼠的迟发型变态反应无影响。
2.3.2该组合物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响表11.该组合物对ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验的影响组别           动物数(只)     淋巴细胞增殖能力(OD差值)      P空白对照组         12              0.144±0.026            ---低剂量组           12              0.150±0.028           0.602中剂量组           12              0.148±0.027           0.711高剂量组           12              0.170±0.031*          0.025p值：务实验组与空白对照组比较*p＜0.05由表11可见，经口给予小鼠不同剂量的该组合物30天，经统计学处理，其淋巴细胞的增殖能力在高剂量组与空白对照组间比较有显著性差异(P＜0.05)，在低、中剂量组与空白对照组间比较无显著性差异(P＞0.05)，即高剂量的该组合物能提高ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化能力。
2.4该组合物对体液免疫的影响表12.该组合物对小鼠抗体生成细胞数的影响组别          动物数(只)       溶血空斑数(×103全脾)      P空白对照组        12                222.3±58.8          ---低剂量组          12                251.8±69.5         0.289中剂量组          12                282.8±58.4*        0.033高剂量组          12                269.3±80.6         0.094p值：各实验组与空白对照组比较p＜0.05由表12可见，经口给予小鼠不同剂量的该组合物30天，经统计学处理，其抗体生成细胞数在中剂量组与空白对照组间比较有显著性差异(p＜0.05)，在低、高剂量纠与空白对照组间比较无显著性差异(p＞0.05)，即中剂量的该组合物能提高小鼠的抗体生成细胞数。
表13.该组合物对小鼠半数溶血值HC50的影响组别               动物数(只)       样品HC50P空白对照组            12            172±50      ---低剂量组              12            187±48     0.428中剂量组              12            185±44     0.478高剂量组              12            169±33     0.859p值：各实验组与空白对照组比较由表13可见，经口给予小鼠不同剂量的该组合物30天，经统计学处理，其半数溶血值在低、中、高剂量组与空白对照组间比较无显著性差异(p＞0.05)，即该组合物对小鼠的半数溶血值无影响。
2.5.1该组合物对小鼠单核—巨噬细胞碳廓清功能的影响表14.该组合物对小鼠单核—巨噬细胞碳廓清功能的影响组别             动物数(只)         吞噬指数(a)     P空白对照组           12              6.35±1.19    ---低剂量组             12              5.69±1.46   0.226中剂量组             12              6.35±1.12   0.989高剂量组             12              6.69±1.43   0.519P值：各实验组与空白刘照组比较由表14可见，经口给予小鼠不同剂量的该组合物30天，经统计学处理，其碳廓清功能在低、中、高剂量组与空白对照纽间比较无显著性差异(P＞0.05)，即该组合物对小鼠单核—巨噬细胞的碳廓清功能无影响。
表15.该组合物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡纤细胞的能力的影响组别           动物数(只)       吞噬率(％)      P1吞噬指数    P2空白对照组        12              38±10               0.46±0.09   ---低剂量组          12              37±10      0.708    0.44±0.10  0.576中剂量组          12              40±8       0.598    0.48±0.07  0.576高剂量组          12              38±10      0.843    0.45±0.10  0.771吞噬率(％)p1值：各实验组与空白对照组比较吞噬指数    P2值：各实验组与空白对照组比较由表15可见，经口给予小鼠该组合物30天，经统计学处理，其吞噬率在低、中、高剂量组与空白对照组间比较均无显著性差异(P＞0.05)，其吞噬指数在低、中、高剂量组与空白对照组间比较均无显著性差异(p＞0.05)，即该组合物对小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力无影响。
2.6该组合物对小鼠NK细胞活性的影响表16该组合物对小鼠NK细胞活性的影响组别             动物数(只)        NK细胞活性(％)        P2空白对照组          12                16.5±2.9          ---低剂量组            12                16.5±3.2         0.974中剂量组            12                16.1±2.1         0.760高剂量组            12                16.7±3.0         0.875p值：各实验组与空白对照组比较由表16可见，经口给予小鼠不同剂量的该组合物30天，经统计学处理，其NK细胞活性在低、中，高剂量组与空白对照组间比较无显著性差异(p＞0.05)，即该组合物对小鼠的NK细胞活性无影响。
3小结    经口给予小鼠不同剂量的该组合物30天，能增强conA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化能力，增加小鼠的抗体生成细胞数；对小鼠的体重增长、脏器/体重比值、迟发型变态反应、半数溶血值、单核—巨噬细胞碳廓清的功能、腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的能力和NK细胞的活性无影响。由此判定，该组合物具有免疫调节作用。