免疫层析装置
阅读：632发布：2020-05-11
专利汇可以提供免疫层析装置专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 的课题是在含有亚硝 酸化 合物和 有机酸 等的 免疫层析 装置中，通过抑制装置保持期间的亚 硝酸 的产生以提高保存 稳定性 ，且通过抑制装置保持期间的亚硝酸的产生以提高该装置在使用时的亚硝酸生成效率，高灵敏度地对检测对象进行检测。本发明涉及一种免疫层析装置，其用于检测检体中的检测对象、并且含有亚硝酸化合物以及有机酸或有机酸衍 生物 ，依次配置试样滴加部件、标记物质保持部件、层析介质部件以及吸收部件以将试样展开，在标记物质含有部位的更上游侧具有含有亚硝酸化合物的部位、以及含有有机酸等的部位，含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位在厚度方向上实质上不 接触 。，下面是免疫层析装置专利的具体信息内容。
1.一种免疫层析装置，其用于检测检体中的检测对象，并且含有亚硝酸化合物以及有机酸或有机酸衍生物，包括：试样滴加部件、具有标记物质含有部位的标记物质保持部件、具有检测部的层析介质部件、以及吸收部件，
依次配置所述试样滴加部件、所述标记物质保持部件、所述层析介质部件以及所述吸收部件以将试样展开，
在所述标记物质含有部位的更上游侧具有：含有所述亚硝酸化合物的部位、以及含有所述有机酸或有机酸衍生物的部位，
含有所述亚硝酸化合物的部位与含有所述有机酸或有机酸衍生物的部位在厚度方向上实质上不接触。
2.根据权利要求1所述的免疫层析装置，其中，所述有机酸或有机酸衍生物是由下述通式(1)表示的含氮杂环化合物，
[化1]
(式(1)中，R1、R2各自独立地表示氢原子、羰基、或者可具有取代基的烷基，烷基可以相互结合而形成环，也可以形成脂环式烃环或芳香族烃环。
A表示单键或双键，X表示-C(＝O)-或-(CH2)n-，Y表示碳原子或氮原子，n是1或2。
Z表示氢原子、羟基、可以具有取代基的烷基、-C(＝O)R3、或者-O-C(＝O)R3。R3表示可以具有取代基的烷基、烷氧基。)。
3.根据权利要求1或2所述的免疫层析装置，其中，所述有机酸或有机酸衍生物是选自由邻苯二甲酰亚胺、N-乙酰基邻苯二甲酰亚胺、N-(叔丁氧羰基氧基)邻苯二甲酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-乙酰氧基琥珀酰亚胺、以及乙内酰脲所组成的组中的至少一者。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的免疫层析装置，其中，所述亚硝酸化合物是亚硝酸盐。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的免疫层析装置，其中，所述检测对象是革兰氏阳性菌。
6.根据权利要求5所述的免疫层析装置，其中，所述革兰氏阳性菌是溶血性链球菌。
7.一种免疫层析试剂盒，包含权利要求1至6中任一项所述的免疫层析装置、以及用于稀释并展开检体的检体稀释液。
8.一种免疫层析检测方法，其中使用权利要求7所述的免疫层析试剂盒来检测检体中的检测对象，所述方法包括以下步骤(i)至(v)：
(i)将由检体稀释液稀释检体而得的检体含有液滴加到试样添加部件中的步骤；
(ii)通过由亚硝酸化合物与有机酸或有机酸衍生物的反应而生成的亚硝酸，从检体中的检测对象提取出被检测物质的步骤；
(iii)在标记物质保持部件中对被检测物质进行标记的步骤；
(iv)使检体含有液在层析介质部件上移动，并在检测部中对检测对象进行检测的步骤；
(v)通过吸收部件吸收检体含有液的步骤。
1.(修改后)一种免疫层析装置，其用于检测检体中的检测对象，并且含有亚硝酸化合物以及有机酸或有机酸衍生物，包括：试样滴加部件、具有标记物质含有部位的标记物质保持部件、具有检测部的层析介质部件、以及吸收部件，
依次配置所述试样滴加部件、所述标记物质保持部件、所述层析介质部件以及所述吸收部件以将试样展开，
在所述标记物质含有部位的更上游侧具有：含有所述亚硝酸化合物的部位、以及含有所述有机酸或有机酸衍生物的部位，
含有所述亚硝酸化合物的部位与含有所述有机酸或有机酸衍生物的部位在厚度方向上实质上不接触，
所述有机酸或有机酸衍生物是由下述通式(1)表示的含氮杂环化合物，
[化1]
(式(1)中，R1、R2各自独立地表示氢原子、羰基、或者可具有取代基的烷基，烷基可以相互结合而形成环，也可以形成脂环式烃环或芳香族烃环。
A表示单键或双键，X表示-C(＝O)-或-(CH2)n-，Y表示碳原子或氮原子，n是1或2。
Z表示氢原子、羟基、可以具有取代基的烷基、-C(＝O)R3、或者-O-C(＝O)R3。R3表示可以具有取代基的烷基、烷氧基。)。
2.(修改后)根据权利要求1所述的免疫层析装置，其中，所述有机酸或有机酸衍生物是选自由邻苯二甲酰亚胺、N-乙酰基邻苯二甲酰亚胺、N-(叔丁氧羰基氧基)邻苯二甲酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-乙酰氧基琥珀酰亚胺、以及乙内酰脲所组成的组中的至少一者。
3.(修改后)根据权利要求1或2所述的免疫层析装置，其中，所述亚硝酸化合物是亚硝酸盐。
4.(修改后)根据权利要求1至3中任一项所述的免疫层析装置，其中，所述检测对象是革兰氏阳性菌。
5.(修改后)根据权利要求4所述的免疫层析装置，其中，所述革兰氏阳性菌是溶血性链球菌。
6.(修改后)一种免疫层析试剂盒，包含权利要求1至5中任一项所述的免疫层析装置、以及用于稀释并展开检体的检体稀释液。
7.(修改后)一种免疫层析检测方法，其中使用权利要求6所述的免疫层析试剂盒来检测检体中的检测对象，所述方法包括以下步骤(i)至(v)：
(i)将由检体稀释液稀释检体而得的检体含有液滴加到试样添加部件中的步骤；
(ii)通过由亚硝酸化合物与有机酸或有机酸衍生物的反应而生成的亚硝酸，从检体中的检测对象提取出被检测物质的步骤；
(iii)在标记物质保持部件中对被检测物质进行标记的步骤；
(iv)使检体含有液在层析介质部件上移动，并在检测部中对检测对象进行检测的步骤；
(v)通过吸收部件吸收检体含有液的步骤。
8.(删除)
免疫层析装置
技术领域
背景技术
[0003] 特别是最近关于基于免疫层析法的简便的检测工具也受到关注，持续进行研究开发，其中该检测工具用于检查有无感染流感病毒或细菌这样的病原体。
[0005] 利用亚硝酸的提取法具有多糖体的提取效率高和亚硝酸便宜且容易操作这样的优点。然而，亚硝酸自身为不稳定而易分解的化合物，因此，具有必须在提取前才将亚硝酸钠等亚硝酸化合物和醋酸等有机酸混合以制备本次亚硝酸的这种缺点。
[0006] 另外，在经常地进行诊断的情况下，每次都制备亚硝酸对于医生及检测技师等来说成为大的负担。而且，由于还包括混合工序，因此也可能因试剂的混合错误等而无法进行正确的安全诊断。
[0007] 为了克服该问题，关于用于简化从溶血性链球菌中提取多糖抗原的工序的简便的检测工具也正在进行研究开发。
[0008] 例如，在专利文献1中，提出了一种从生物(特别是链球菌A组或B组)中提取多糖抗原的简化的提取方法，其中，使用了将以下物质组合而成的试剂盒：a.渗入测定量的亚硝酸盐并干燥的第一吸收性物质、b.渗入测定量的中和碱及缓冲液并干燥的第二吸收性物质、c.测定量的酸的水溶液(参照专利文献1)。
[0009] 关于用于检测链球菌科等的微生物/细菌性生物体中特征性的碳水化合物抗原的分析装置及方法，有已经上市出售的那些，例如作为免疫层析试剂，有クイックビューDipStick StrepA(DSファーマバイオメディカル)及ストレップAテストパック·プラスOBC(三和化学研究所)等，另外，作为玻片乳胶聚集法试剂，已知有AストレプトAD“生研”(デンカ生研)等。
[0010] 但是，对免疫层析试剂的市售品而言，通常为了在检体的试验中判定为阳性，需要在直接法中使溶链菌浓度为1×106CFU/mL以上。
[0011] 因此，在溶链菌浓度低于1×106CFU/mL的情况下，存在尽管为阳性但是也会判定为阴性这样的问题，或者存在由于以不溶性载体标记抗体的免疫层析试剂与通常的酶免疫测定法(EIA)相比灵敏度较低，因而在阳性的情况下所观察到的线不清晰这样的问题，此外，存在尽管试样液中不存在被检测物质(抗原等)但是仍然判定为阳性的所谓产生假阳性这样的问题。
[0012] 另外，对采用不溶性载体(金胶体颗粒以及着色乳胶颗粒等)标记抗体的免疫层析法而言，根据测定试样、测定环境、测定条件等，有时产生不溶性载体的聚集、发生非特异性反应、展开速度慢等问题无法解决。
[0013] 因此，在采用了各种测定试样、测定环境、测定条件的免疫层析法中，寻求一种不发生不溶性载体的聚集、不会发生非特异性反应、展开速度快的检测试剂。
[0014] 为了解决上述问题，本发明人迄今为止开发了一种在采用免疫层析法检测细菌时，使所使用的试样提取液或检查设备中含有环状寡糖和/或亚硝酸盐的检查试剂(参照专利文献2)。
[0015] 上述检查试剂为这样的检查试剂，其中，即使在作为试样提取液的展开液因检测设备展开中所保持的有机酸或在检查中生成的亚硝酸导致pH条件发生变化，检体或免疫层析设备中的蛋白质成分等也不会变性·析出而出现在判定线上诱发非特异性的反应，且不会引起抗体固定颗粒胶体的聚集，检查精度高且展开速度快。
[0016] 另外，上述检查设备无需每次在使用时都制备亚硝酸，能够在存在环状寡糖的情况下在检查设备上生成亚硝酸，因而可提高检查效率、检查精度并且省力。
[0017] 现有技术文献
[0018] 专利文献
[0019] 专利文献1：日本特表平7-503543号公报
[0020] 专利文献2：日本特开2015-34719号公报
发明内容
[0021] 发明所要解决的课题
[0022] 然而，从保存稳定性这样的观点出发，发现上述检查设备具有以下需要改善的方面。
[0023] 已知的是，在含有有机酸及亚硝酸盐的常规检查设备中，由于在检查设备的保存期间，一部分的有机酸和亚硝酸盐在检查设备内扩散，使得两者相接触，可能会产生亚硝酸。若在检查设备的保存期间，亚硝酸的产生持续进行，则在实际使用检查设备时，亚硝酸的产生变得不充分，检测对象的提取效率降低，检测灵敏度下降。因此，在这方面存在提高检查设备的保存稳定性的余地。
[0024] 此外，虽然上述检查设备中所含有的环状寡糖对于稳定亚硝酸盐而言是必要的，但是另一方面，由于环状寡糖是具有粘性的物质，因而也是根据测定试样、测定环境而容易引起假阳性的物质。因此，也期望在不使用环状寡糖的情况下能够使设备保持期间的亚硝酸盐稳定的方法。
[0025] 因此，本发明的目的及课题在于提供一种能够提高保存稳定性、高灵敏度地对检测对象进行检测的免疫层析装置、免疫层析试剂盒以及使用其的免疫层析检测方法。
[0026] 特别地在于提供一种免疫层析装置、免疫层析试剂盒以及使用其的免疫层析检测方法，在用于检测检体中的检测对象、且含有亚硝酸化合物以及有机酸或有机酸衍生物的该免疫层析装置中，通过抑制该装置保持期间的亚硝酸的产生，从而提高保存稳定性。
[0027] 另外，提供一种能够通过提高免疫层析装置的保存稳定性以提高该装置在使用时的亚硝酸生成效率、高灵敏度地对检测对象进行检测的免疫层析装置、免疫层析试剂盒以及使用其的免疫层析检测方法。
[0028] 用于解决课题的手段
[0029] 为了解决上述问题，本发明人进行了深入的研究。结果，在用于检测检体中的检测对象、且含有亚硝酸化合物以及有机酸或有机酸衍生物的免疫层析装置中，通过使含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸或有机酸衍生物的部位具有特定的位置关系，从而可提供一种能够抑制在该装置保存期间亚硝酸的产生的、保存稳定性高的免疫层析装置，其中该亚硝酸是由于亚硝酸化合物与有机酸或有机酸衍生物在装置内扩散、两者接触而产生的。
[0030] 也就是说，本发明如下所述。
[0031] 1.一种免疫层析装置，其用于检测检体中的检测对象、并且含有亚硝酸化合物以及有机酸或有机酸衍生物，包括：试样滴加部件、具有标记物质含有部位的标记物质保持部件、具有检测部的层析介质部件、以及吸收部件，
[0032] 依次配置所述试样滴加部件、所述标记物质保持部件、所述层析介质部件以及所述吸收部件以将试样展开，
[0033] 在所述标记物质含有部位的更上游侧具有：含有所述亚硝酸化合物的部位、以及含有所述有机酸或有机酸衍生物的部位，
[0034] 含有所述亚硝酸化合物的部位与含有所述有机酸或有机酸衍生物的部位在厚度方向上实质上不接触。
[0035] 2.根据上述1所述的免疫层析装置，其中，所述有机酸或有机酸衍生物是由下述通式(1)表示的含氮杂环化合物，
[0036] [化1]
[0037]
[0039] A表示单键或双键，X表示-C(＝O)-或-(CH2)n-，Y表示碳原子或氮原子，n是1或2。
[0041] 3.根据上述1或2所述的免疫层析装置，其中，所述有机酸或有机酸衍生物是选自由邻苯二甲酰亚胺、N-乙酰基邻苯二甲酰亚胺、N-(叔丁氧羰基氧基)邻苯二甲酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-乙酰氧基琥珀酰亚胺、以及乙内酰脲所组成的组中的至少一者。
[0042] 4.根据上述1至3中任一项所述的免疫层析装置，其中，所述亚硝酸化合物是亚硝酸盐。
[0043] 5.根据上述1至4中任一项所述的免疫层析装置，其中，所述检测对象是革兰氏阳性菌。
[0044] 6.根据上述5所述的免疫层析装置，其中，所述革兰氏阳性菌是溶血性链球菌。
[0045] 7.一种免疫层析试剂盒，包含上述1至6中任一项所述的免疫层析装置、以及用于稀释并展开检体的检体稀释液。
[0046] 8.一种免疫层析检测方法，其中使用上述7所述的免疫层析试剂盒来检测检体中的检测对象，所述方法包括以下步骤(i)至(v)：
[0047] (i)将由检体稀释液稀释检体而得的检体含有液滴加到试样添加部件中的步骤；
[0048] (ii)通过由亚硝酸化合物与有机酸或有机酸衍生物的反应而生成的亚硝酸，从而从检体中的检测对象提取出被检测物质的步骤；
[0049] (iii)在标记物质保持部件中对被检测物质进行标记的步骤；
[0050] (iv)使检体含有液在层析介质部件上移动，并在检测部对检测对象进行检测的步骤；
[0051] (v)通过吸收部件吸收检体含有液的步骤。
[0052] 发明的效果
[0053] 在本发明中，在用于检测检体中的检测对象、并且含有亚硝酸化合物以及有机酸或有机酸衍生物的免疫层析装置中，通过使含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸或有机酸衍生物的部位具有特定的位置关系，从而可提供一种能够抑制在该装置保存期间亚硝酸的产生的、保存稳定性高的免疫层析装置、免疫层析试剂盒以及使用其的免疫层析检测方法，该亚硝酸是由于有机酸或有机酸衍生物与亚硝酸化合物在装置内扩散并接触而产生的。
[0054] 此外，在本发明中，如上所述，由于能够抑制装置保存期间的亚硝酸的产生，因而能够提高本发明的装置或试剂盒使用时的亚硝酸生成效率、并且高灵敏度地对检测对象进行检测。
[0056] [图1]图1是用于说明本发明一个实施方式的免疫层析装置的结构的剖面图。
[0057] [图2]图2是用于说明本发明其他实施方式的免疫层析装置的结构的剖面图。
[0058] [图3]图3(a)至图3(d)是用于说明本发明一个实施方式的免疫层析装置等的结构的一部分的截面图。
[0059] [图4]图4(a)、图4(b)是用于说明本发明其他实施方式的免疫层析装置的结构的一部分的截面图。
具体实施方式
[0060] 以下，对本发明进行详细说明。
[0061] 本发明的一个实施方式基于以下的免疫层析装置、免疫层析试剂盒、免疫层析检测方法(以下，有时也称作免疫层析检测系统)：它们用于从检体中的检测对象提取出被检测物质(抗原)，通过与该被检测物质(抗原)特异性结合的结合物质(抗体)的反应(抗原-抗体反应)，并且使所形成的复合体在层析介质上展开，由此利用各种检测手段来对检测对象进行确认。
[0062] 作为与该抗原最特异性地反应而结合的抗体，可以任意地使用与其特异性结合的(例如)单克隆抗体及多克隆抗体或者其它的公知的抗体。
[0063] 通过预先对上述抗体赋予标记，从而可进行检测对象的检测。作为标记，可以任意使用酶、发色物质、荧光物质或放射性物质等。例如，只要能表现出操作简单、测试时间也短这样的免疫层析检测法的特色、且考虑抗体及抗原等的种类进行决定即可。
[0064] 另外，检测手段的特征在于：为了表现出操作简单、能以较短的时间进行判定这样的免疫层析检测方法的特色，具有以目视判定即能够准确地判定这样的性能。另一方面，在要求时间、精度等的情况下，可以使其带有分光光度检测及放射线检测等各种检测手段来进行检测。
[0065] 作为本发明中的检测对象，只要是这样的细菌即可应用：通过由本发明的免疫层析检测系统所生成的亚硝酸从该细菌中提取出特异性抗原多糖体。特别地，在包含具有厚的肽聚糖层的革兰氏阳性菌的检测对象中优选使用。
[0066] 例如，可列举出：葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、杆菌、炭疽菌、蜡样芽孢杆菌、白喉棒状杆菌、利斯特菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌及产气荚膜梭菌等。其中，优选用于作为球菌类的葡萄球菌、链球菌及肺炎球菌。最优选用于链球菌，尤其是溶血性链球菌。
[0067] 作为含有上述检测对象的检体，不仅为(例如)唾液、鼻涕、鼻拭子、鼻腔抽吸液、痰、咽拭子、肺泡灌洗液、直肠拭子、便悬浊液、尿及羊水等活体试样，也可以为食品提取液、清水、废水及培养液等之类的试样，没有特别限定。
[0068] 其中，本发明中，在这些检体中所含的成为原因的细菌在含有革兰氏阳性菌、特别是溶链菌的情况下是有用的。本发明中，将在从呼吸系统疾病患者等采样而得的唾液等中所含的溶链菌作为检测对象，并将从溶链菌提取出的多糖体作为被检测物质，可对检测对象的溶链菌进行检测。
[0069] 以下，依次对用于实施本发明的免疫层析装置、免疫层析试剂盒以及免疫层析检测方法的方案进行说明，但是本发明不限于下述的实施方式。
[0070] <免疫层析装置>
[0071] 本发明的免疫层析装置为用于检测检体中的检测对象、且含有亚硝酸化合物以及有机酸或有机酸衍生物(以下也统称为有机酸等)的免疫层析装置，其包括：试样滴加部件、具有标记物质含有部位的标记物质保持部件、具有检测部的层析介质部件、以及吸收部件，依次配置试样滴加部件、标记物质保持部件、层析介质部件以及吸收部件以将试样展开，在标记物质含有部位的更上游侧具有：含有亚硝酸化合物的部位、以及含有有机酸等的部位，含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位在厚度方向上实质上不接触。
[0072] 通过使含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位具有上述的位置关系，从而可抑制在上述装置保存期间有机酸等与亚硝酸化合物在装置内扩散接触，也就是可抑制亚硝酸的产生。
[0073] 通过使含有上述亚硝酸化合物的部位与含有上述有机酸等的部位具有上述的位置关系，从而可抑制在上述装置保存期间亚硝酸化合物与有机酸等在装置内扩散接触，据推测这是因为：亚硝酸化合物与有机酸等的反应受到了限制。
[0074] 在本说明书中，“部件”与“部位”具有不同的含义。例如，“含有亚硝酸化合物(有机酸等)的部件”指的是含有亚硝酸化合物(有机酸等)的“部件”整体，“含有亚硝酸化合物(有机酸等)的部位”指的是在含有亚硝酸化合物(有机酸等)的部件当中，实际含有亚硝酸化合物(有机酸等)的区域。需要说明的是，“部位”不仅是部件的一部分区域，有时也表示部件整体。
[0075] 另外，在本说明书中，有时将具有含有亚硝酸化合物的部位的部件称为亚硝酸化合物含有部件，有时将具有含有有机酸等的部位的部件称为有机酸等含有部件。
[0076] 在本说明书中，“试样展开方向”指的是试样在从滴加至试样滴加部件起直到被吸收部件吸收为止所展开(移动)的方向，例如，在图1所示的免疫层析装置中，指的是箭头(右箭头)所表示的方向。另外，在本发明中，“上游侧”指的是与上述“试样展开方向”完全相反的方向，以吸收部件为基准，为试样滴加部件方向(侧)。
[0077] 以下，参照附图对本发明的免疫层析装置进行具体说明。
[0078] 作为本发明的免疫层析装置的一个实施方式，如图1所示，由至少包括试样滴加部件(1)、具有标记物质含有部位的标记物质保持部件(2)、具有检测部(4)的层析介质部件(3)、以及吸收部件(5)的多个部件构成。
[0079] 而且，上述装置中，依次配置试样滴加部件(1)、标记物质保持部件(2)、具有检测部(4)的层析介质部件(3)、以及吸收部件(5)各部件以将试样展开，从而构成免疫层析装置的各部件相互连结设置。
[0080] 需要说明的是，在上述装置的任意位置处也可以具备除了上述部件以外的其他部件，例如如图2所示，在试样滴加部件(1)与标记物质保持部件(2)之间也可以设置其他部件(例如，有机酸等含有部件7等)。作为各部件相连结的方式，如图1所示，各部件可以彼此重叠而进行连结，或者在各部件彼此不重叠的情况下，部件的侧面可以在试样展开方向一侧上彼此接触而进行连结。
[0081] 在免疫层析装置中，试样滴加部件(1)指的是具有滴加含有检体的试样(以下，也简称为试样)的部位(以下，也称为试样滴加部位11)的部件，为由图1中的符号1所表示的部件。
[0082] 试样滴加部位11指的是试样滴加部件(1)当中的滴加试样的一部分区域。试样滴加部件(1)中的试样滴加部位11的位置没有特别的限制，例如可以是试样滴加部件(1)的两端或其附近，也可以是试样滴加部件(1)的中心或其附近。除了后述的亚硝酸化合物或有机酸等以外，在试样滴加部件(1)中也可以含有其它的不损害本发明效果的任何试剂。
[0083] 试样添加部件(1)由虽然试样迅速被吸收，但是保持力弱，试样迅速移动这样性质的多孔片材构成。作为多孔片材，可列举出(例如)纤维素滤纸、玻璃纤维滤纸、聚氨酯、聚醋酸酯、醋酸纤维素、尼龙、以及棉布等。作为试样滴加部件(1)的形状，可以使用片状。
[0084] 标记物质保持部件(2)指的是具有含有通过标记成分对试剂成分进行了标记而得的标记物质的部位(以下，也称为标记物质含有部位21)的部件，为由图1中的符号2所表示的部件。
[0085] 标记物质含有部位21指的是标记物质保持部件(2)当中的实际含有标记物质的区域。标记物质含有部位21可以如图1所示那样占据标记物质保持部件(2)的一部分区域，也可以占据标记物质保持部件(2)的部件整个区域。
[0086] 当标记物质含有部位21占据标记物质保持部件(2)的一部分区域时，标记物质保持部件(2)中的标记物质含有部位21的位置没有特别的限制，例如可以是标记物质保持部件(2)的两端或其附近，也可以是标记物质保持部件(2)的中央或其附近。除了后述的亚硝酸化合物或有机酸等以外，标记物质保持部件(2)中也可以含有其它的不损害本发明效果的任何试剂。
[0087] 作为标记成分，例如有金属颗粒、乳胶颗粒、酶、以及荧光化合物等，这些当中，优选为金属颗粒。作为试剂成分，其为具有识别分析物的能力的颗粒或分子，优选为单克隆抗体或多克隆抗体或者它们的片段(第一试剂)。
[0088] 作为金属颗粒，可任意地优选使用金、银、铂、锗、铑及钯之类的贵金属的单颗粒以及复合颗粒。这些当中，金对色相的变化敏感，特别优选。
[0089] 金属颗粒的平均粒径优选为1nm至500nm，更优选为10nm至250nm，进一步优选为35nm至100nm。需要说明的是，将具有上述平均粒径的金纳米尺寸的各种金颗粒称为金纳米颗粒。
[0090] 在免疫层析检测方法中，考虑该金的粒径、粒度分布及色调等，制成在金颗粒的表面上担载铂颗粒而成的金复合颗粒，由此可以制成免疫层析检测方法的标记，可以用于提高作为蛋白质的染色剂的有用性。进而，若使用具有可与金属颗粒表面键合的官能团以及可与抗体结合的反应基团的金标记扩增剂这样的所谓的增敏剂，则可以提高测定灵敏度。
[0091] 作为标记物质保持部件(2)，例如通常使用玻璃纤维或纤维素的膜等。作为标记物质保持部件(2)的形状，可使用片状。
[0092] 本发明的免疫层析装置在标记物质含有部位21的更上游侧具有：含有亚硝酸化合物的部位、以及含有有机酸等的部位。通过使本发明的免疫层析装置具有这样的结构，从而能够使亚硝酸化合物与有机酸等在标记物质含有部位21的更上游侧发生反应而产生亚硝酸，并从检测对象中提取出被检测物质。因此，检测对象能够在被检测物质被提取出了的状态下向标记物质含有部位21移动，并对被检测物质(例如多糖体)进行标记。
[0093] 含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位可以存在于同一部件内，也可以分别存在于不同的部件。在不同的部件中存在含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位的方式指的是这样的方式：在标记物质含有部位21的更上游侧含有亚硝酸化合物及有机酸等的任意一者，并且在含有上述任意一者的部件的更上游侧的部件中含有亚硝酸化合物及有机酸等的另外一者。
[0094] 需要说明的是，当在同一部件内存在含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位时，含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位必然不会是同一位置。这是因为在装置保存期间会进行亚硝酸化合物与有机酸等的反应。
[0095] 另外，作为存在含有亚硝酸化合物的部位及/或含有有机酸等的部位，其并不仅限于上述试样滴加部件(1)和标记物质保持部件(2)这两个部件。当在试样滴加部件(1)和标记物质保持部件(2)的部件之间具备其他部件时，也可使该部件含有亚硝酸化合物或有机酸等。在这种情况下，该部件的数量可以是一个，也可以是多个。
[0096] 例如，如图2所示，在试样滴加部件(1)与标记物质保持部件(2)的部件之间可具备有机酸等含有部件7。
[0097] 在本发明的免疫层析装置中，只要含有亚硝酸化合物的部位存在于标记物质含有部位的更上游侧，则含有亚硝酸化合物的部位可以比含有有机酸等的部位更位于试样展开方向的上游侧，相反地，也可以比含有有机酸等的部位更位于试样展开方向的下游侧。但是，如上所述，含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位不是同一位置。
[0098] 当含有亚硝酸化合物的部位比含有有机酸等的部位更位于试样展开方向的上游侧时，亚硝酸化合物在装置内向含有有机酸等的部位移动，两者接触并反应而生成了亚硝酸。另外，当含有亚硝酸化合物的部位比含有有机酸等的部位等位于试样展开方向的下游侧时，有机酸等在装置内向含有亚硝酸化合物的部位移动，两者接触并反应而生成了亚硝酸。
[0099] 其中，含有亚硝酸化合物的部位优选为试样滴加部件(1)的部件内的任意位置，含有有机酸等的部位优选为有机酸等含有部件7的部件内的任意位置。
[0100] 另外，关于在含有亚硝酸化合物的部位或含有有机酸等的部位当中的存在于下游侧的任一部位与标记物质保持部件(2)内的标记物质含有部位21之间的物理距离，其最短距离优选为20mm至40mm。这是因为，若小于20mm，则提取效率下降，灵敏度降低，若超过40mm，则检测时间变长。
[0101] 本发明的特征在于具有以下结构：含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位在厚度方向上实质上不接触。通过具有上述结构，能够抑制在装置的保存期间亚硝酸化合物与有机酸等在装置内接触，也就是说，能够抑制装置保持时的亚硝酸的产生，能够提高装置的保存稳定性。
[0102] 在此，“厚度方向”指的是在本发明的免疫层析装置中，上述的试样滴加部件、标记物质保持部件、层析介质部件、以及吸收部件等各个部件的厚度方向。当上述部件为片状部件时，表示该片材的厚度方向。例如，在图1所示的免疫层析装置中，指的是箭头(上下箭头)所表示的方向。
[0103] 需要说明的是，当上述各个部件层叠配置时，上述“厚度方向”指的是“部件的层叠方向”，即指的是上述各个部件层叠的方向。或者，“厚度方向”也指的是与试样展开方向垂直的方向。
[0104] 此外，“接触”指的是含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位物理性地接触。
[0105] 然后，“含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位在厚度方向上实质上不接触”指的是含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位在厚度方向上接触的区域在试样展开方向上的长度(以下也称为重叠长度)为0.5mm以下的情况。
[0106] 在本发明中，厚度方向上接触的区域在试样展开方向上的长度优选为0.3mm以下，更优选为0.1mm以下，进一步优选为0mm。厚度方向上接触的区域在试样展开方向上的长度为0mm指的是含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位在厚度方向上根本不接触。
[0107] 若厚度方向上接触的区域在试样展开方向上的长度为0.5mm以下，则能够防止在装置保持期间有机酸等与亚硝酸化合物在装置内扩散而两者相接触。
[0108] 以下，对于含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位在厚度方向上实质上不接触的结构，列举出具体例子进行说明，但是本发明的实施方式并不限于以下的例子。
[0109] 图3(a)、图3(b)及图3(c)所示的方案是表示含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位在厚度方向上实质上不接触的、本发明实施方式的结构的具体例子。
[0110] 图3(a)及图3(b)所示的方案是这样的方案，其中，虽然包括含有亚硝酸化合物的部位的“部件A”与包括含有有机酸等的部位的“部件B”彼此在厚度方向上接触并重叠，但是含有亚硝酸化合物的部位a与含有有机酸等的部位b彼此在厚度方向上不接触。
[0111] 图3(c)所示的方案是这样的方案，其中，包括含有亚硝酸化合物的部位的“部件A”与包括含有有机酸等的部位的“部件B”经由“部件C”而重叠。这是这样的方案：“部件A”与“部件B”彼此在厚度方向上不接触重叠，且含有亚硝酸化合物的部位a与含有有机酸等的部位b彼此在厚度方向上不接触。需要说明的是，部件C不能阻碍试样的展开，并优选由具有使试样迅速移动这样的性质的多孔片材构成。
[0112] 另一方面，图3(d)所示的方案是这样的方案，其中，包括含有亚硝酸化合物的部位的“部件A”与包括含有有机酸等的部位的“部件B”彼此在厚度方向上接触并重叠，且含有亚硝酸化合物的部位a与含有有机酸等的部位b彼此在厚度方向上接触。
[0113] 该图3(d)的方案由于是含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位在厚度方向上实质上接触的方案，因而不同于本发明实施方式的结构。
[0114] 另外，图4(a)及图4(b)所示的方案是表示含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位在厚度方向上实质上不接触的、本发明实施方式的结构的具体例子。
[0115] 图4(a)及图4(b)所示的方案是这样的方案，其中，包括含有亚硝酸化合物的部位的“部件A”与包括含有有机酸等的部位的“部件B”彼此在厚度方向上不重叠，并且“部件A”与“部件B”在试样展开方向上接触。在这些方案中，含有亚硝酸化合物的部位a与含有有机酸等的部位b彼此在厚度方向上不接触。图4(b)中，含有亚硝酸化合物的部位a与含有有机酸等的部位b彼此在试样展开方向上接触，但是在厚度方向上不接触。
[0116] 本发明中的亚硝酸化合物是与酸反应而生成亚硝酸的化合物，其只要不对检测带来不良影响即可，没有特别的限定。优选为亚硝酸盐。作为亚硝酸盐，可列举出(例如)亚硝酸钠、亚硝酸钾、亚硝酸钙以及亚硝酸镁等无机亚硝酸盐；亚硝酸甲酯、亚硝酸乙酯、亚硝酸丁酯以及亚硝酸戊酯等有机亚硝酸化合物。此外，也可以将它们混合后使用。优选为无机亚硝酸盐，它们当中，优选为亚硝酸的碱金属盐，最优选为亚硝酸钠。
[0117] 本发明的免疫层析装置中的亚硝酸化合物的含量优选为50mmol至200mmol/装置，更优选为75mmol至175mmol/装置。
[0118] 作为本发明的有机酸或有机酸衍生物，其与亚硝酸化合物反应而生成亚硝酸，其只要不使存在于本发明装置内的蛋白质等变性析出即可，没有特别的限制。
[0119] 作为有机酸，可列举出(例如)有机磺酸、有机羧酸、以及有机磷酸等。具体而言，可列举出：乙酸、酒石酸、衣康酸、草酸、琥珀酸、柠檬酸、邻苯二甲酸、羟基乙酸、氯乙酸、氟乙酸、苯甲酸、以及苯磺酸等。另外，也可以为诸如多元磺酸、多元羧酸、聚苯乙烯、以及聚丙烯酸等固定化酸，没有任何的限制。
[0120] 作为有机酸衍生物，可列举出：有机酸酰亚胺、有机酸酰胺、有机酸酯、以及有机酸酐等。
[0121] 这些有机酸或有机酸衍生物不仅可以使用低分子化合物，也可以使用低聚物状或聚合物状的物质，或者也可以包含两种以上。
[0122] 这些当中，从免疫层析装置的保存稳定性或后述的pH的观点来看，优选为具有羰基的含氮杂环化合物，更优选为由下述通式(1)表示的含氮杂环化合物。
[0123] [化2]
[0124]
[0125] 式(1)中，R1、R2各自独立地表示氢原子、羰基、或者可具有取代基的烷基，烷基可以相互结合而形成环，也可以形成脂环式烃环或芳香族烃环。
[0126] A表示单键或双键，X表示-C(＝O)-或-(CH2)n-，Y表示碳原子或氮原子，n是1或2。
[0127] Z表示氢原子、羟基、可以具有取代基的烷基、-C(＝O)R3、或-O-C(＝O)R3。R3表示可以具有取代基的烷基、烷氧基。
[0128] 作为本发明的由通式(1)表示的化合物，具体而言，可列举出：邻苯二甲酰亚胺、N-乙酰基邻苯二甲酰亚胺、N-(叔丁氧羰基氧基)邻苯二甲酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-乙酰氧基琥珀酰亚胺、N-苄氧羰基氧基琥珀酰亚胺、二(N-琥珀酰亚胺基)碳酸酯、以及乙内酰脲等。
[0129] 这些当中，优选为选自由邻苯二甲酰亚胺、N-乙酰基邻苯二甲酰亚胺、N-(叔丁氧羰基氧基)邻苯二甲酰亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-乙酰氧基琥珀酰亚胺、以及乙内酰脲所组成的组中的至少一者。
[0130] 进一步，更优选为N-乙酰氧基琥珀酰亚胺以及乙内酰脲，特别优选为N-乙酰氧基琥珀酰亚胺。
[0131] 作为有机酸和/或有机酸衍生物，也可以将它们混合使用。
[0132] 通过使用由上述通式(1)表示的含氮杂环化合物，从而可将亚硝酸生成时的pH范围设定得较宽，因而是优选的。也就是说，例如在使用柠檬酸作为有机酸的情况下，有机酸与亚硝酸化合物反应时的pH范围被限制在6.8至7.0附近，但是通过使用由上述通式(1)表示的含氮杂环化合物，可将pH范围较宽地设定在6.5至8.0附近。由此，即使(例如)由于检体的成分而使展开液的pH发生变化，也能够有效地产生亚硝酸。
[0133] 本发明的免疫层析装置中的有机酸等的含量优选为10mmol/装置至40mmol/装置，更优选为20mmol/装置至30mmol/装置。通过在上述范围内，从而能够有效地产生亚硝酸。
[0134] 层析介质部件(3)在膜载体上制作有检测部(4)。作为膜载体，只要为可以利用毛细管现象吸收试样并使其移动的物质就没有特别限定。
[0135] 作为层析介质部件(3)，可以从由(例如)硝基纤维素、醋酸纤维素、尼龙、聚醚砜、聚乙烯醇、聚酯、玻璃纤维、聚烯烃、纤维素及由这些混合纤维构成的人工聚合物所组成的组中进行选择并使用。作为层析介质部件(3)的形状，可以使用片状。
[0136] 在检测部(4)中，硝基纤维素片材上担载固定有单克隆抗体或多克隆抗体或者它们的片段(第二试剂)。
[0137] 吸收部件(5)通常使用由具有迅速地吸收过量的试样的能力的材料即玻璃纤维以及纤维素纤维等所构成的滤纸，另外，若使用具有保持所吸收的液体不逆流的能力的材料，则更优选(日本特开2012-189346号公报)。作为吸收部件(5)的形状，可以使用片状。
[0138] 如上所述，也可以在本发明装置的任意位置处具备除了上述以外的其他部件。作为这些部件，可以由具有虽然试样迅速地被吸收，但是保持力弱，检体(检体试样)迅速地移动这样的性质的多孔片材构成。
[0139] 作为多孔片材，可列举出(例如)纤维素滤纸、玻璃纤维滤纸、聚氨酯、聚醋酸酯、醋酸纤维素、尼龙、以及棉布等。作为这些部件的形状，可以使用片状。
[0140] 另外，本发明的免疫层析装置可以含有背板(6)。背板(6)为基材。通过在背板(6)的单面上涂布粘结剂或粘贴胶带而使单面具有粘结性。在该粘结面上密合地设置试样滴加部件(1)、标记物质保持部件(2)、具有检测部(4)的层析介质部件(3)、以及吸收部件(5)的一部分或全部。
[0141] 此外，在本发明的免疫层析装置含有除了上述部件以外的部件(例如亚硝酸化合物含有部件或有机酸等含有部件等)的情况下，也是同样的。背板(6)若为通过粘结剂而对于试样液具有不透过性、非透湿性这样的物质，则作为基材没有特别限定。
[0142] 关于检测部(4)中所使用的试剂成分(第二试剂)及标记试剂中所使用的试剂成分(第一试剂)，它们中的一者或两者可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体。以下的情况是优选的：检测部(4)中所使用的试剂成分(第二试剂)为多克隆抗体，标记试剂中所使用的试剂成分(第一试剂)为单克隆抗体。
[0143] 单克隆抗体及多克隆抗体或者它们的片段为公知的，容易获得，可以利用公知的方法制备。作为抗体产生动物种类，例如为人、小鼠、大鼠、兔子、山羊及马等。作为免疫球蛋白，可以为IgG、IgM、IgA、IgE及IgD中的任一者。
[0144] 这些当中，优选将来源于兔子的抗体用于标记物质保持部件(2)中所使用的试剂成分(第一试剂)以及检测部(4)中所使用的试剂成分(第二试剂)这两者。
[0145] 本发明的免疫层析装置通常在制成产品之前进行干燥处理。干燥温度例如为20℃至50℃，干燥时间为0.5小时至1小时。
[0146] <免疫层析试剂盒>
[0147] 本发明的免疫层析试剂盒包含上述免疫层析装置、以及用于稀释检体的检体稀释液。
[0148] 在本发明的免疫层析试剂盒中，检体稀释液也可以作为展开液使用。当使用检体稀释液作为展开液时，可以将预先混合了检体和检体稀释液(展开液)后的检体含有液作为试样，供给、添加到试样添加部件中并使其展开。或者，也可以先将检体供给、添加到试样添加部件中，然后再将检体稀释液(展开液)供给、添加到试样添加部件中并使它们展开。
[0149] 通常，当展开液的pH条件为酸性时，亚硝酸化合物与有机酸等反应而生成亚硝酸的生成效率较高，能够提高抗原的提取效率。另一方面，当pH条件为酸性时，可能会发生诸如以下问题：存在于免疫层析装置或后述的检体稀释液中的、(例如)酪蛋白等蛋白质或其盐或者检体中所含的高粘性蛋白质等析出，或者发生标记物质的凝集从而导致展开不良。
[0150] 因此，作为本发明中的展开液的pH条件，其为生成亚硝酸的pH，并优选为既不会使酪蛋白等蛋白质或检体中所含的高粘性蛋白质等析出、又不会发生标记物质的凝集的pH。作为上述pH条件，pH为6.5至8.5，优选为6.6至8.0，最优选为6.8至7.5。
[0151] 若为上述pH，则难以发生蛋白质的析出或标记物质的凝集。需要说明的是，如上所述，为了在上述pH范围内有效地生成亚硝酸，作为有机酸或有机酸衍生物，优选使用由上述通式(1)表示的有机酸或有机酸衍生物。
[0152] 另外，在本发明的免疫层析试剂盒中，除了上述试剂以外，在不损害本发明效果的范围内，检体稀释液中或免疫层析装置的各部位也可以含有各种试剂，例如非离子性表面活性剂等表面活性剂、盐、缓冲剂、其他各种添加剂等。
[0153] 作为可用于本发明免疫层析试剂盒中的非离子性表面活性剂，可列举出(例如)聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯/聚氧丙烯烷基醚、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(商品名“Tween”系列)、聚氧乙烯对叔辛基苯基醚(商品名“Triton”系列)、聚氧乙烯对叔壬基苯基醚(商品名“TritonN”系列)、烷基聚葡萄糖苷、脂肪酸二乙醇酰胺、以及烷基单缩水甘油醚等。另外，也可在不产生不良影响的范围内配合使用非离子性表面活性剂以外的离子性表面活性剂等。
[0154] 作为在本发明的检体稀释液或免疫层析装置中使用的非离子性表面活性剂的含量，其优选在0.2质量％至2.0质量％的范围内，更可优选在0.5质量％至1.5质量％的范围内含有。
[0155] 若小于0.2质量％，则表现出以下倾向：展开变得不稳定，无法进行准确的判定，或者无法抑制非特异性反应，准确的判定变得有些困难。若超过2.0质量％，则该浓度在所需浓度以上，不仅不会给非特异性反应的抑制带来更好的影响，而且在技术上是没有意义的，在经济上是浪费的。
[0157] 作为在本发明的检体稀释液或免疫层析装置中所使用的盐的浓度，优选为1mM至500mM的范围，更优选为5mM至200mM的范围，进一步优选为10mM至50mM的范围。若浓度低于
1mM，例如若低至0.1mM，则蛋白质的提取作用变得不充分。若超过500mM，例如若高至1M、2M，则该量在技术上没有意义，该浓度在所需浓度以上，在经济上是浪费的。
1mM，例如若低至0.1mM，则蛋白质的提取作用变得不充分。若超过500mM，例如若高至1M、2M，则该量在技术上没有意义，该浓度在所需浓度以上，在经济上是浪费的。
[0158] 作为在本发明的检体稀释液或免疫层析装置中所使用的盐，可以仅为1种，也可以配合使用2种以上。
[0159] 作为在本发明的检体稀释液或免疫层析装置中所使用的缓冲剂，只要为具有即使试样的添加或试样的蒸发或稀释导致浓度发生变化、来自外部的一些异物混入也不会产生致命的影响这样的作用(缓冲作用)的物质就没有特别限制。
[0160] 在本发明中，作为缓冲剂，可列举出(例如)磷酸缓冲液(磷酸+磷酸钠)、醋酸缓冲液(醋酸+醋酸钠)、柠檬酸缓冲液(柠檬酸+柠檬酸钠)、硼酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液(三(羟甲基)氨基甲烷+盐酸)、TE缓冲液(Tris+乙二胺四乙酸)、TAE缓冲液(Tris+醋酸+乙二胺四乙酸)、TBE缓冲液(Tris+硼酸+乙二胺四乙酸)或HEPES缓冲液(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌嗪基]乙烷磺酸)、以及Bicine缓冲液(N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸缓冲剂)等。
[0161] 优选为磷酸缓冲液、Tris-盐酸缓冲液及醋酸缓冲液等，更优选为Tris-盐酸缓冲液。在本发明的免疫层析检测系统中，只要在不产生不良影响的范围内也可使用2种以上的缓冲剂，没有任何限制。
[0162] 作为本发明中所使用的缓冲剂的浓度，优选为10mM至500mM的范围，更优选为10mM至300mM的范围，进一步优选为30mM至100mM的范围。
[0163] 若浓度低于10mM，则缓冲作用变得不充分，蛋白质成分的析出抑制及标记颗粒的聚集抑制也变得不充分。若超过500mM，则该浓度在所需浓度以上，在经济上是浪费的。
[0164] 另外，缓冲液的pH范围最佳为7.1至9.8。
[0165] 在本发明的检体稀释液或免疫层析装置中，添加并使用可抑制基于生物亲和性的副反应或抑制非特异性反应的公知的添加剂，例如用于促进抗原抗体反应或者抑制非特异性反应的蛋白质(例如牛血清白蛋白、明胶以及酪蛋白等)、高分子化合物(例如聚乙二醇、甲基纤维素、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇以及右旋糖苷等)、离子性表面活性剂或聚阴离子(例如右旋糖苷硫酸、肝素、聚苯乙烯磺酸以及硫酸软骨素等)、或抗菌剂等中的1种或者2种以上也是可以且有效的，没有任何妨碍。
[0166] 另外，将这些用于促进抗原抗体反应或者抑制非特异性反应的蛋白质、高分子化合物、离子性表面活性剂或聚阴离子、或者抗菌剂等的1种或者2种以上保持在构成固定相的层析介质部件上的移动相的移动路径上也是可以且有效的，没有任何妨碍。
[0167] 作为本发明的检体稀释液或免疫层析装置中所含的上述添加剂的浓度，优选为0.01质量％至20质量％的范围，更优选为0.1质量％至10质量％的范围，进一步优选为0.5质量％至5质量％的范围。若小于0.01质量％，则无法抑制非特异性反应，无法进行准确的判定。若超过20质量％，则该浓度在所需浓度以上，在经济上是浪费的。
[0168] 检体稀释液通常使用水作为溶剂，除了上述非离子性表面活性剂、盐以及缓冲剂等以外，也可以添加(例如)用于促进抗原抗体反应或抑制非特异性反应的蛋白质、高分子化合物(PVP等)、离子性表面活性剂或聚阴离子、或者抗菌剂、螯合剂等的1种或2种以上。
[0169] 加入的顺序没有特别限定，即使同时加入也没问题。可以将所检测的检体与检体稀释液预先进行混合而得的检体含有液供给·滴加到试样滴加部件上并使其展开，也可以先将检体供给·滴加到试样滴加部件上之后，再将检体稀释液供给·滴加到试样滴加部件上并使其展开。
[0170] 在使免疫层析装置含有各种试剂的情况下，作为其方法，可以为这样的形式：例如，采用使其涂布或含浸于含有各种试剂的部位中以后使之干燥的方法以使其担载或保持在该部位中。
[0171] 另外，在不使各个部件的整体而是在其一部分中点状地含有各种试剂的情况下，可列举出(例如)在将部件遮蔽之后通过喷雾装置进行喷雾的方法等。
[0172] 将本发明的典型的试剂盒构成中的判定原理解释为以下的1至4。
[0173] 1.将由检体稀释液对检体进行稀释处理而得的检体含有液作为试样，向免疫层析装置的试样滴加部件(1)(试样滴加部件11)中滴加预定量(通常为0.1ml至2ml)的检体含有液。一旦滴加检体含有液，则检体含有液被试样滴加部件(1)迅速吸收，并开始快速地向标记物质保持部件(2)移动。
[0174] 2.保持在比标记物质含有部位21更位于试样展开方向的上游侧的任何位置处的亚硝酸化合物溶解于移动过来的检体含有液的水分中，并与检体一起移动。
[0175] 3.接下来，溶解并含有亚硝酸化合物的检体含有液与有机酸等接触，该有机酸等保持在比标记物质含有部位21更位于试样展开方向的上游侧的任何位置处，从而亚硝酸化合物与有机酸等发生反应而生成亚硝酸。当在检体中存在(例如)作为检测对象的溶链菌等时，该亚硝酸提取出该菌体表面的多糖体(被检测物质)。
[0176] 4.然后，含有亚硝酸的检体含有液向标记物质含有部位21移动。当检体含有液通过标记物质含有部位21时，在标记物质含有部位21中保持的标记试剂(第一试剂)溶解于检体含有液的水分中，将被检测物质(例如多糖体等)标记，并与检体一起移动。
[0177] 5.接下来，溶解于检体含有液的水分中的标记试剂通过层析介质部件(3)上的检测部(4)。在此，当在检体含有液中存在被检测物质(例如多糖体)时，利用抗原·抗体的特异性结合反应，通过检测部(4)中所担载固定的抗体(第二试剂)和标记试剂(第一试剂)以三明治状夹持的方式将该被检测物质固定于检测部，使检测部(4)着色，从而可对检测对象进行检测。当检体中不存在被检测物质(例如多糖体)时，溶解于检体含有液的水分中的标记试剂(第一试剂)即使通过了层析介质部件(3)上的检测部(4)也不会发生特异性结合反应，因此不会使检测部(4)着色。
[0178] 6.最后，检体含有液向吸收部件(5)移动并被吸收。
[0179] 如此地，可以准确地判定检体中有无被检测物质(例如多糖体)。
[0180] <免疫层析检测方法>
[0181] 本发明的免疫层析检测方法包括以下步骤(i)至(v)，使用上述的免疫层析试剂盒来检测检体中的检测对象。
[0182] (i)将由检体稀释液稀释检体而得的检体含有液滴加到试样添加部件中的步骤；
[0183] (ii)通过由亚硝酸化合物与有机酸或有机酸衍生物的反应而生成的亚硝酸，从而从检体中的检测对象中提取出被检测物质的步骤；
[0184] (iii)在标记物质保持部件中对被检测物质进行标记的步骤；
[0185] (iv)使检体含有液在层析介质部件上移动，并在检测部中对检测对象进行检测的步骤；
[0186] (v)通过吸收部件来吸收检体含有液的步骤。
[0187] 对于各步骤的细节，其在判定原理上与上述内容相同。
[0188] 实施例
[0189] 下面，列举出实施例对本发明的有效性进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。
[0190] (试验例1)
[0191] 本试验中，在本发明的免疫层析装置中通过使含有亚硝酸化合物的部位与含有有机酸等的部位具有特定的位置关系，从而根据加速稳定性试验来确认该装置的保存稳定性是否提高。
[0192] [实施例1]
[0193] <免疫层析试剂盒的制作>
[0194] 在本实施例中，制作了检体稀释液、以及由包含亚硝酸钠的试样滴加部件(1)、包含邻苯二甲酰亚胺的有机酸等含有部件(7)、标记物质保持部件(2)、具有检测部(4)的层析介质部件(3)和吸收部件(5)构成的免疫层析试剂盒。
[0195] (1)在层析介质部件(3)上的检测部(4)的制作
[0196] 使用由硝基纤维素构成的片材(ミリポア社制、商品名：HF120、250mm×25mm)作为膜。用含有5质量％的异丙醇的10mM磷酸缓冲液(pH7.4)稀释源自于兔子的抗溶链菌多克隆抗体(第二试剂)(Meridian公司制)以使得浓度为1.0mg/ml，利用抗体涂布机(BioDot公司制)将该稀释了的溶液150μL以1mm的宽度涂布在膜上，在50℃下干燥30分钟，在室温下干燥一晚，从而在层析介质部件(3)上制作了检测部(4)。
[0197] (2)标记物质溶液的制作
[0198] 在金胶体悬浊液(田中贵金属工业公司制：平均粒径40nm)0.5mL中，加入用磷酸缓冲液(pH7.4)稀释成0.1mg/mL浓度的源自于兔子的抗溶链菌单克隆抗体(第一试剂)抗体(Virostat公司制)0.1mL，在室温下静置10分钟。接着，加入含有10质量％的牛血清白蛋白的磷酸缓冲液(pH7.4)0.1ml，充分搅拌后，以8000×g进行离心分离15分钟，除去上清液后，加入含有1质量％的牛血清白蛋白的磷酸缓冲液(pH7.4)0.1mL，制作了标记物质溶液。
[0199] (3)包含亚硝酸钠的试样滴加部件(1)的制作
[0200] 在12×100mm的玻璃纤维结合垫(メルク社制)上，将含有4mol亚硝酸钠的水溶液0.6mL涂布至整个垫上，冻干，制作了试样滴加部件(1)。
[0201] (4)包含邻苯二甲酰亚胺的有机酸等含有部件(7)的制作
[0202] 在12×100mm的玻璃纤维结合垫(メルク社制)上，将含有1mol邻苯二甲酰亚胺的水溶液0.6mL涂布至整个垫上，冻干，制作了包含邻苯二甲酰亚胺的有机酸等含有部件(7)。
[0203] (5)免疫层析用试验片的制作
[0204] 在上述制作的标记物质溶液200μl中加入100μl的25质量％海藻糖水溶液和80μl的含有5质量％的酪蛋白(最终浓度：1质量％)的磷酸缓冲液(pH9.0)，将所得物均匀地添加到12×100mm的玻璃纤维垫(ミリポア社制)上之后，通过真空干燥机进行干燥，制作了标记物质保持部件(2)。
[0205] 接着，沿着试样展开方向，以依次连结的方式在由背板制成的基材上贴合试样滴加部件(1)、有机酸等含有部件(7)、标记物质保持部件(2)、具有检测部(4)的层析介质部件(3)以及吸收部件(5)(图2所示的顺序)。
[0206] 需要说明的是，将试样滴加部件(1)与有机酸等含有部件(7)在部件厚度方向上接触的区域在试样展开方向上的长度定为0mm。也就是说，试样滴加部件(1)与有机酸等含有部件(7)以在试样展开方向上相接触的方式进行连结。然后，用剪切机以宽度为5mm的方式进行剪切，制成了免疫层析用试验片。
[0207] 下表1中示出了试样滴加部件(1)与有机酸等含有部件(7)在厚度方向上接触的区域在试样展开方向上的长度(重叠长度)。
[0208] (6)检体稀释液的制作
[0209] 将由0.5质量％的Tween20、0.6质量％的聚乙烯基吡咯烷酮(平均分子量36万)、1质量％的牛血清白蛋白和含有150mM氯化钠的20mM的Tris缓冲溶液(pH8.0)制成的液体作为用于稀释检体并滴加到免疫层析试验片中而使其展开的检体稀释液。
[0210] <测定(加速稳定性试验)>
[0211] 使用上述制作的免疫层析用试验片以及检体稀释液，在以下的加速稳定性试验中测定检体中有无存在作为检测对象的溶链菌，进行了免疫层析用试验片的保存稳定性的评价。
[0212] 将上述制作的免疫层析用试验片在50℃下培育0小时(未培育)或2周，其后以成为2×106组织/mL的方式加入失活的A组β溶血性链球菌(溶链菌)，并将所得物作为阳性检体试样，并进行了测定。
[0213] 将150μL的检体试样滴加到免疫层析用试验片的试样滴加部位并使其展开，15分钟后进行目视判定。将可目视确认到测试线的红线的情况设为“+”，将可鲜明地目视确认到红线的情况设为“++”，将可隐约地目视确认到红线的情况设为“±”，将无法目视确认到红线的情况设为“-”。表2中示出了使用阳性检体试样时的结果。
[0214] 另外，将未加入上述溶链菌的检体稀释液作为阴性检体试样，并且也进行了测定。表3中示出了使用阴性检体试样时的结果。
[0215] [比较例1、2]
[0216] 除了将免疫层析用试验片的制作条件变更为表1中所记载的条件(试样滴加部件(1)与有机酸等含有部件(7)的重叠长度)以外，与实施例1同样地制作了免疫层析试剂盒，并进行了测定。其结果示于表2中。
[0217] 需要说明的是，由于将亚硝酸钠涂布于试样滴加部件(1)的整个垫上，并将邻苯二甲酰亚胺涂布于有机酸等含有部件(7)的整个垫上，因而试样滴加部件(1)的垫(部件)与试样滴加部件(1)的垫(部件)的重叠长度实质上相当于含有亚硝酸钠的部位与含有邻苯二甲酰亚胺的部位的重叠长度。
[0218] [表1]
[0219] 表1
[0220]结构 试样滴加部件(1)与有机酸等含有部件(7)的重叠长度(mm)
实施例1 0
比较例1 1
比较例2 2
实施例1 0
比较例1 1
比较例2 2
[0221] [表2]
[0222] 表2
[0223]培育时间 0小时 2周
实施例1 ++ ±
比较例1 ++ -
比较例2 ++ -
实施例1 ++ ±
比较例1 ++ -
比较例2 ++ -
[0224] [表3]
[0225] 表3
[0226]培育时间 0小时 2周
实施例1 - -
比较例1 - -
比较例2 - -
实施例1 - -
比较例1 - -
比较例2 - -
[0227] 在实施例1中，由于试样滴加部件(1)与有机酸等含有部件(7)在部件的厚度方向上实质上不接触，因而即使当在50℃下培育2周时，也能够检测出阳性检体，可知保持稳定性高。
[0228] 另一方面，在比较例1及2中，由于试样滴加部件(1)与有机酸等含有部件(7)在部件的厚度方向上接触(重叠长度超过0.5mm)，因而当在50℃下培育2周时，无法检测出阳性检体，可知不具有充分的保存稳定性。
[0229] (试验例2)
[0230] 本试验中，在本发明的免疫层析装置中，对有机酸或有机酸衍生物的种类进行各种变更，并与试验例1同样地进行了加速稳定性试验。在50℃下培育0小时(未培育)、2周或4周后，进行加速稳定性试验。
[0231] [实施例2]
[0232] 与实施例1同样地制作了免疫层析用试验片，并进行了加速稳定性试验，不同之处在于：在有机酸等含有部件(7)中，在整个垫上涂布0.6mL的含有N-乙酰基邻苯二甲酰亚胺的水溶液，而不是含有邻苯二甲酰亚胺的水溶液。结果示出于表4中。
[0233] [实施例3]
[0234] 与实施例1同样地制作了免疫层析用试验片，并进行了加速稳定性试验，不同之处在于：在有机酸等含有部件(7)中，在整个垫上涂布0.6mL的含有N-(叔丁氧羰基氧基)邻苯二甲酰亚胺的水溶液，而不是含有邻苯二甲酰亚胺的水溶液。结果示出于表4中。
[0235] [实施例4]
[0236] 与实施例1同样地制作了免疫层析用试验片，并进行了加速稳定性试验，不同之处在于：在有机酸等含有部件(7)中，在整个垫上涂布0.6mL的含有N-羟基琥珀酰亚胺的水溶液，而不是含有邻苯二甲酰亚胺的水溶液。结果示出于表4中。
[0237] [实施例5]
[0238] 与实施例1同样地制作了免疫层析用试验片，并进行了加速稳定性试验，不同之处在于：在有机酸等含有部件(7)中，在整个垫上涂布0.6mL的含有N-乙酰氧基琥珀酰亚胺的水溶液，而不是含有邻苯二甲酰亚胺的水溶液。结果示出于表4中。
[0239] [实施例6]
[0240] 与实施例1同样地制作了免疫层析用试验片，并进行了加速稳定性试验，不同之处在于：在有机酸等含有部件(7)中，在整个垫上涂布0.6mL的含有乙内酰脲的水溶液，而不是含有邻苯二甲酰亚胺的水溶液。结果示出于表4中。
[0241] [表4]
[0242] 表4
[0243]
[0244] 实施例2至6中的有机酸或有机酸衍生物均是由上述通式(1)所表示的化合物。在任意一个实施例中，即使当在50℃下培育2周时，也都能够检测出阳性检体，可知保存稳定性高。特别地，在实施例5(N-乙酰氧基琥珀酰亚胺)及实施例6(乙内酰脲)中，即使当在50℃下培育4周时，也能够检测出阳性检体，可知保存稳定性特别高。
[0245] 采用特定的实施方式对本发明详细地进行了说明，但是对本领域技术人员显而易见的是，可在不脱离本发明的意图和范围的情况下进行各种变更及变形。需要说明的是，本申请基于2016年3月4日申请的日本专利申请(日本特愿2016-042707)，其全文以引用方式并入本文。
[0246] 符号的说明
[0247] 1 试样滴加部件
[0248] 11 试样滴加部位
[0249] 2 标记物质保持部件
[0250] 21 标记物质含有部位
[0251] 3 层析介质部件
[0252] 4 检测部
[0253] 5 吸收部件
[0254] 6 背板
[0255] 7 有机酸等含有部件
[0256] A、B、C 部件
[0257] a 含有亚硝酸化合物的部位
[0258] b 含有有机酸等的部位
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