技术领域
[0001] 本
发明属于
生物技术检测领域，具体涉及一种基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒。
背景技术
[0002] 禽腺病毒(Fowl Adenovirus，FAdV)属于腺病毒科禽腺病毒属，分为5个种(A-E)，12个血清型。虽然在世界各地均有报道，FAdV感染一般引起亚临床状况，而急性感染主要引起包涵体
肝炎、心包积液以及肌胃糜烂等。自2013年，国内鸡群由FAdV引起的
包涵体肝炎、心包积液病例逐渐增多。到2015年，FAdV感染在国内多个省份鸡群爆发。目前国内FAdV爆发不仅发生在3-4周龄肉鸡，还发生于10-20周龄的蛋鸡，给养鸡业造成了严重经济损失。病毒分离鉴定发现，目前高致病性血清4型FAdV(FAdV-4)在国内鸡群流行较广泛。然目前尚无针对FAdV-4血清学抗体检测的快速方法及其试剂盒。
发明内容
[0003] 本发明的目的是在于提供一种基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒。
[0004] 本发明的原理和最核心的关键技术是科学合理的构建了禽腺病毒F2基因的原核表达质粒，之后将该质粒转化入BL21细胞进行原核表达并纯化并进一步将纯化的蛋白作为包被
抗原建立试剂盒，检测血清4型禽腺病毒特异性抗体。
[0005] 实现本发明目的的技术方案是：
[0006] 本发明所述的一种基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，包括包被有纤突蛋白基因F2表达产物的ELISA酶标板，阳性阴性对照，HRP标记的兔抗鸡二抗，样品稀释液、显色液以及洗涤液。
[0007] 进一步地，所述包被有表达F2蛋白的ELISA酶标板，是通过将纯化的F2基因原核表达产物包被于96孔ELISA酶标板而制备。
[0008] 本发明所述基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，可以通过下述步骤得到：
[0009] (1)禽腺病毒分离:取疑似禽腺
病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后按1:5的比例加入PBS制成悬液；经0.45um微孔滤器过滤后，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为血清4型禽腺病毒后，－20℃保存；
[0010] (2)禽腺病毒基因组的制备：首先将血清4型禽腺病毒分离毒株病毒经细胞裂解液裂解，随后用酚、氯仿、异戊醇进行病毒基因组抽提，最后用无
水乙醇沉淀，溶于30uL灭菌超纯水，即得禽腺病毒基因组，置-20℃备用；
[0011] (3)PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体以及FAdV-4病毒F2蛋白基因
片段：设计出扩增血清4型禽腺病毒F2基因的引物以及pGEX-6p-1线性化载体的引物；以pGEX-6p-1原核表达载体以及禽腺病毒基因组为模板，利用相应引物分别PCR扩增出线性化的pGEX-6p-1载体以及禽腺病毒F2基因序列；
[0012] (4)p-FAdV-F2重组表达载体构建：利用重组酶ExnaseTM II将线性化的pGEX-6p-1载体以及禽腺病毒F2基因的PCR产物进行快速体外重组克隆，重组克隆经序列验证后，命名为p-FAdV-F2，挑取细菌克隆进行质粒制备，并进行PCR鉴定，鉴定的阳性克隆转化到BL21细胞中进行诱导表达。
[0013] (5)F2原核表达质粒的表达及其产物的免疫
反应性鉴定：扩增阳性克隆的BL21细胞，并以1：100接种于加AMP的LB培养基中，250rpm摇3h以后加入IPTG进行诱导表达，5h后收集细菌，用PBS重悬后40Hz，间隔8s进行
破碎，破碎完成后离心分上清和沉淀。图3为本发明SDS-PAGE分析GST-F2的表达示意图，SDS-PAGE分析破碎后的上清和沉淀，可见表达产物部分在上清中，部分在沉淀中以包涵体的形式存在。之后利用Western-blot分析表达产物与阳性血清的反应性(如图4所示)。
[0014] (6)制备检测禽腺病毒抗体的抗原:将BL21表达的融合表达产物GST-F2上清经GST标签亲和层析柱纯化后得到纤突蛋白基因F2的表达蛋白。图5为SDS-PAGE分析纯化的F2蛋白表达产物。
[0015] (7)检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒：该试剂盒成分包括包被有纤突蛋白基因F2表达产物的ELISA酶标板，阳性阴性对照(阳性对照为抗血清4型禽腺病毒的鸡血清，阴性对照为SPF鸡血清)，HRP标记的兔抗鸡二抗(购买所得)，样品稀释液(含0.05％Tween-20的PBST)，显色液(TMB显色液以)及洗涤液(含0.05％Tween-20的PBST)。
[0016] 该试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：将阳性血清1：100稀释后，加入A1、A2孔，将阴性血清1：100稀释后加入A3、A4孔，剩下的的孔用于检测待检样品(1：400稀释)，37度反应1小时；PBST洗涤3遍后，加入工作浓度的HRP标记的兔抗鸡抗体，37度反应1小时；PBST洗涤3遍后，进行显色10分钟，之后加入终止液终止显色。读取OD450吸光值,OD450大于0.2的孔判为阳性。
[0017] 本发明的有益效果体现在：本发明建立的FAdV-4抗体的间接ELISA试剂盒能特异性的检测出FAdV-4抗体，而与抗流感病毒血清(AIV)、抗
马立克病毒血清(MDV)、抗新城疫病毒血清(NDV)、抗禽网状内皮组织增生症病毒血清(REV)以及SPF鸡血清不反应(图6)。因此，该试剂盒具有良好FAdV-4的特异性，能用于FAdV-4感染及免疫状况流行病学调查。
附图说明
[0018] 图1是本发明PCR扩增线性化pGEX-6p-1载体示意图(泳道1：线性化的pGEX-6p-1载体；泳道M：1Kb DNA Ladder)。
[0019] 图2是本发明PCR扩增F2目的片段示意图(泳道1：禽腺病毒F2基因；泳道M：100bpDNA Ladder)。
[0020] 图3是本发明SDS-PAGE分析GST-F2的表达示意图(泳道1：蛋白Marker；泳道2：GST上清；泳道3：GST沉淀；泳道4：GST-F2表达产物破碎上清；泳道5：GST-F2表达产物破碎沉淀)。图4是本发明Western-blot分析表达产物的反应性示意图(泳道1：GST-F2表达产物破碎上清；泳道2：GST-F2表达产物破碎沉淀；泳道3：阴性对照GST上清；泳道4：阴性对照GST沉淀；泳道5：蛋白Marker)。
[0021] 图5是本发明SDS-PAGE分析纯化的GST-F2的表达产物示意图(泳道1:纯化的GST-F2表达产物；泳道2：蛋白Marker；泳道3：阴性对照GST上清；泳道4：阴性对照GST沉淀；泳道5：未纯化GST-F2的表达产物破碎上清；泳道6：未纯化GST-F2的表达产物破碎沉淀)。图6是本发明检测FAdV-4抗体的间接ELISA试剂盒特异性检测示意图。
具体实施方式
[0022] 下面将通过附图和具体实施方例对本发明做进一步的具体描述，但不能理解为是对本发明保护范围的限定。
[0024] 本发明所述基于F2蛋白的检测血清4型禽腺病毒抗体的间接ELISA试剂盒，可以通过下述步骤得到：
[0025] (1)FAdV-4禽腺病毒分离:
[0026] 取疑似禽腺病毒感染的病死鸡的肝脏，研碎后用按1:5的比例加入PBST制成悬液；5000r/min离心15min，取上清；加入青霉素和
链霉素各1000IU/ml，37℃反应30min；经
0.45um微孔滤器过滤后，以0.2ml/胚的剂量，经尿囊腔接种8日龄SPF鸡胚，接种后96-120小时后收取尿囊液；尿囊液经鉴定为FAdV-4禽腺病毒后，－20℃保存。
[0027] (2)禽腺病毒基因组的制备：
[0028] 取FAdV-4分离毒株病毒(血清4型禽腺病毒)上清400uL于1.5mL指形管内，加入400uL细胞裂解液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.0，20mmol/L EDTA pH 8.0，2％SDS和蛋白酶K)，充分混匀后放置56℃水浴锅作用4小时；加入400uLTris平衡酚，充分混匀后10000r/min离心10分钟，取上清于另一1.5mL指形管；加入400uL酚：氯仿：异戊醇，充分混匀后10000r/min离心5分钟，取上清于另一1.5mL指形管；加入800uL无水乙醇，颠倒混匀后放入-20℃孵育30分钟，12000r/min离心15分钟，弃尽上清；室温自然干燥后向沉淀加入30uL灭菌超纯水和2uLRNA酶，充分溶解后，即得FAdV-4病毒基因组(禽腺病毒基因组)，置-20℃备用。
[0029] (3)PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体以及FAdV-4病毒F2蛋白基因片段：
[0030] 设计扩增出含pGEX-6p-1线性化载体与FAdV-4禽腺病毒F2蛋白基因片段的引物：具体引物序列见表1，由苏州金唯智生物科技有限公司合成。
[0031] 表1.PCR扩增线性化pGEX-6p-1及禽腺病毒F2基因引物
[0032]
[0033] 分别以pGEX-6p-1载体质粒(Invitrogen公司)以及步骤(2)制备的禽腺病毒基因组为模板，表1所述相应引物为引物分别进行PCR扩增出线性化的pGEX-6p-1载体以及禽腺病毒F2基因序列。PCR扩增反应体系为：模板1uL，5×Buffer10uL，10mM dNTP Mix 1uL，上游引物为10μmol 2uL，下游引物为10μmol 2uL，高保真酶1uL，加入灭菌超纯水至50uL。PCR扩增反应循环参数为：95℃预变性4分钟，随后进行30个循环(95℃变性30秒，55℃
退火30秒，72℃延伸3分钟)，72℃延伸10分钟。PCR结束后，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行
电泳分析(如图1，图2所示)。
[0034] (4)p-FAdV-F2重组表达载体构建：
[0035] 将以上纯化的线性化载体pGEX-6p-1以及禽腺病毒F2基因片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTMⅡ的作用下进行重组克隆。重组克隆经序列验证后，命名为p-FAdV-F2。具体重组反应体系如下：纯化的禽腺病毒F2基因片段PCR产物50-100ng，纯化的pGEX-6p-1线性化载体50ng，2μL商品化的ExnaseTMⅡ酶，4uL 5倍的缓冲液，其它补加水至20μL。反应物于37℃作用30分钟后，置
冰上5分钟。随后将20μL反应物转化到常规感受态细菌，涂LB平板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备，并进行PCR鉴定。鉴定的阳性克隆转化到BL21细胞中进行诱导表达。
[0036] (5)F2原核表达质粒的表达及其产物的免疫反应性鉴定：
[0037] 扩增阳性克隆的BL21细胞，并以1：100接种于加AMP的LB培养基中，250rpm摇3h以后加入IPTG进行诱导表达，5h后收集细菌，用PBST重悬后40Hz，间隔8s进行破碎，破碎完成后离心分上清和沉淀，图3为本发明SDS-PAGE分析GST-F2的表达示意图，SDS-PAGE分析破碎后的上清和沉淀，可见表达产物主要表达在沉淀中以包涵体的形式存在，之后利用Western-blot分析表达产物与阳性血清的反应性(图4)。用抗禽腺病毒阳性血清进行的Western-blot分析证明，只有本发明表达的F2蛋白片段能与禽腺病毒阳性血清进行良好的免疫反应。
[0038] (6)制备检测FAdV-4抗体的抗原：
[0039] 利用BL21表达的产物上清进行蛋白纯化，经谷胱甘肽琼脂糖
树脂亲和层析纯化。图5为SDS-PAGE分析纯化的F2蛋白表达产物。
[0040] (7)检测FAdV-4抗体的间接ELISA试剂盒组装及特性：
[0041] 该试剂盒成分包括包被有F2蛋白表达产物的ELISA酶标板，阳性阴性对照(阳性对照为抗血清4型禽腺病毒的鸡血清，阴性对照为SPF鸡血清)，HRP标记的兔抗鸡二抗(购买所得)，样品稀释液(含0.05％Tween-20的PBST)，显色液TMB以及洗涤液(含0.05％Tween-20的PBST)。该试剂盒检测血清4型禽腺病毒抗体的步骤及阳性判定标准如下：将阳性血清1：400稀释后，加入A1、A2孔，将阴性血清1：400稀释后加入A3、A4孔，剩下的孔用于检测待检样品，37度反应1小时；PBST洗涤3遍后，加入1：50000稀释的HRP标记的兔抗鸡抗体，37度反应1小时；PBST洗涤3遍后，进行显色10分钟，之后加入终止液终止显色。读取OD450吸光值。以大于阴性OD值为0.2的孔判为阳性。试剂盒特异性试验发现，该试剂盒仅与抗FAdV-4的阳性血清反应(FAdV1，FAdV2)，而抗流感病毒血清(AIV)、抗马立克病毒血清(MDV)、抗新城疫病毒血清(NDV)、抗禽网状内皮组织增生症病毒血清(REV)、SPF鸡血清均不反应(图6)。
[0042] 实施例2
[0043] 临床样品检测效果
[0044] 对临床上来自FAdV-4免疫鸡群的16份血清进行了检测。如表2所示，免疫7天后的4份血清ELISA检测均为阴性，而免疫后14天以及21天的的相应4份血清样品均为ELISA阳性。而且发现ELISA读值随着鸡免疫后天数增加而增大。这与鸡群免疫后抗体产生规律相一致，同时提示本发明构建的ELISA具有良好的特异性。另外，为进一步验证ELISA检测的可靠性，以感染FAdV-4的禽腺病毒的鸡
肝细胞为抗原，进行了间接免疫
荧光分析。比对结果发现，在所检测的样品中，间接免疫荧光检测FAdV-4抗体的结果与ELISA检测结果完全符合。以上检测结果证明，本发明基于纤突蛋白F2的检测血清4型禽腺病毒抗体的ELISA试剂盒具有良好的特异性及应用前景。
[0045] 表2.ELISA试剂盒对免疫鸡群血清检测效果
[0046]
