一种多肽疫苗的筛选评估方法
专利汇可以提供一种多肽疫苗的筛选评估方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及多肽 疫苗 技术领域，具体涉及一种多肽疫苗的筛选评估方法，包括如下步骤：选择病原体中和 抗原 表位多肽序列作为多肽疫苗的序列；将 选定 的中和抗原表位采用化学方法进行多肽合成，封闭活性基团；将多肽与偶联载体进行偶联，洗脱未偶联的多肽，封闭未偶联的偶联载体，清洗待用；将偶联多肽后的偶联载体装填至 蛋白质 纯化柱，加入 抗体 样本，洗脱并收集中和抗体；通过体外微量中和试验的方法，分析捕获的中和抗体的中和滴度。本发明涉及一种前期已在动物试验中证实具有中和效果的抗原表位肽，评估其是否适合用于人体的多肽疫苗的筛选评估方法。本发明的筛选评估方法将大大提高多肽疫苗的研发效率，降低研发成本。，下面是一种多肽疫苗的筛选评估方法专利的具体信息内容。
1.一种用于非治疗目的的多肽疫苗的筛选评估方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）多肽序列的选择：选择病原体中和抗原表位多肽序列作为多肽疫苗的序列；
（2）中和抗原表位多肽的合成：将选定的中和抗原表位进行多肽合成，封闭活性基团；
（3）多肽与偶联载体偶联：将多肽与偶联载体进行偶联，洗脱未偶联的多肽，封闭未偶联的偶联载体，清洗待用；
（4）亲和层析：将偶联多肽后的偶联载体装填至蛋白质纯化柱，加入抗体样本，洗脱并收集中和抗体；
（5）中和抗体分析：通过体外微量中和试验的方法，分析捕获的中和抗体的中和滴度。
2.根据权利要求1所述的一种用于非治疗目的的多肽疫苗的筛选评估方法，其特征在于：所述步骤（1）具体为：选择EV71病毒C4流行株中和抗原表位SP55、SP70和VP2-28多肽序列作为多肽疫苗的序列。
3.根据权利要求2所述的一种用于非治疗目的的多肽疫苗的筛选评估方法，其特征在于：所述步骤（1）中，EV71病毒C4流行株中和抗原表位SP55、SP70和VP2-28多肽序列分别为：
SP55：PDSRESLAWQTATNP
SP70：YPTFGEHKQEKDLEY
VP2-28：AGGTGTEDTHPPYKQ。
4.根据权利要求1所述的一种用于非治疗目的的多肽疫苗的筛选评估方法，其特征在于：所述步骤（3）包括如下步骤：
（3.1）偶联载体预处理：选择琼脂糖珠作为偶联载体，加入双蒸水进行膨胀，再加入双蒸水进行洗涤；
（3.2）偶联配基：
（3.2.1）配基溶解：将多肽用质量分数为25%、pH为9.0的二甲基甲酰胺溶解；
（3.2.2）偶联：将预处理后的琼脂糖珠和溶解后的多肽按体积比0.8-1.2:1的比例混合，在20-40℃温度下孵育14-18h；
（3.2.3）洗脱：用质量分数为25%、pH为9.0的二甲基甲酰胺洗脱未偶联的多肽；
（3.2.4）封闭：在20-40℃温度下，将洗脱后的琼脂糖珠静置于0.8-1.2mol/L的乙醇胺中3-5h，封闭未偶联的偶联载体；
（3.2.5）清洗：用摩尔浓度为0.1mol/L、pH为4.0的醋酸盐缓冲液加0.4-0.6mol/L的NaCl溶液和pH为8.0的tris-HCl缓冲液加摩尔浓度为0.4-0.6mol/L的NaCl溶液循环清洗琼脂糖珠。
5.根据权利要求1所述的一种用于非治疗目的的多肽疫苗的筛选评估方法，其特征在于：所述步骤（4）包括如下步骤：
（4.1）结合：将偶联多肽后的偶联载体装填至蛋白质纯化柱，以丙种球蛋白作为抗体样本，加入纯化柱中，加入pH为7.4的磷酸盐缓冲液洗涤；
（4.2）洗脱：用摩尔浓度为0.1mol/L、pH为4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体，于收集管中加入0.4-0.6gTris固体试剂；
（4.3）收集：重复步骤（4.1）和步骤（4.2），直至收集足够量的抗体；
（4.4）平衡：用10K的蛋白超滤管加入13-17mLPBS平衡，在4500-5500rpm转速下离心25-
35min，弃掉废液；
（4.5）浓缩去盐：将步骤（4.3）收集的抗体加入蛋白超滤管中，在4500-5500rpm转速下离心25-35min，收集超滤膜上方液体为浓缩去盐抗体；重复该步骤，直至全部抗体浓缩去盐。
6.根据权利要求5所述的一种用于非治疗目的的多肽疫苗的筛选评估方法，其特征在于：所述步骤（4.5）之后还包括步骤（4.6）保存：短时间内用不完的抗体加入无菌甘油至质量分数为45%-55%，于-15～-25℃温度下保存。
7.根据权利要求1所述的一种用于非治疗目的的多肽疫苗的筛选评估方法，其特征在于：所述步骤（5）包括如下步骤：
（5.1）病毒TCID50的计算：将Vero细胞接种至96孔板，然后接种EV71病毒，接种7天后观察细胞病变情况，计算EV71病毒的TCID50；
（5.2）体外微量中和实验通过体外微量中和试验的方法，分析捕获的中和抗体的中和滴度。
8.根据权利要求1所述的一种用于非治疗目的的多肽疫苗的筛选评估方法，其特征在于：所述步骤（5.1）包括如下步骤：
（5.1.1）接种细胞：将含有FBS的DMEM培养基的Vero细胞，用PBS洗三遍，再用2-4mL质量分数为0.2%-0.3%的胰酶消化1.5-2.5min，加入2-4mL含有FBS的DMEM培养基，吹打制成单细胞悬液，800-1200rpm转速下离心4-6min，弃掉上清，加入含有FBS的DMEM培养基，吹打制成单细胞悬液，并用细胞计数板计数；
用含有FBS的DMEM培养基将细胞稀释成1.5×104-2.5×104个细胞/100μL，并接种至96孔板，过夜培养；
（5.1.2）接种病毒：将培养的EV71病毒经过0.20-0.25μm滤膜过滤，用含有FBS的DMEM培养基将EV71病毒按照10-1 10-15梯度稀释；
~
将EV71病毒接种至步骤（5.1.1）中的96孔板，每孔接种100μL，每个梯度接种10个孔；
（5.1.3）计算：病毒接种7天后观察细胞病变情况，计算EV71病毒TCID50；
所述含有FBS的DMEM培养基中，FBS的质量分数为1.5%-2.5%。
9.根据权利要求1所述的一种用于非治疗目的的多肽疫苗的筛选评估方法，其特征在于：所述步骤（5.2）包括如下步骤：
（5.2.1）将Vero细胞按每孔1.5×104-2.5×104个细胞/100μL接种到96孔板，生长过夜；
（5.2.2）用含有FBS的DMEM培养基稀释病毒至TCID50为100，取新96孔板，每孔加入EV71病毒50μL；
（5.2.3）用含有FBS的DMEM培养基按倍比稀释浓缩去盐抗体，将不同稀释比例的抗体按
50μL/孔加入步骤（5.2.2）的96孔板中，轻摇混匀，36-37℃温度下孵育0.5-1.5h；
（5.2.4）将步骤（5.2.2）的96孔板中的液体加入步骤（5.2.1）的96孔板中，每个样本设平行孔3个，在CO2浓度为4%-6%、36-37℃温度下培养2-4d，完全抑制致细胞病变效应出现的最高血清稀释度作为血清的中和滴度；
（5.2.5）分析单个中和抗原表位多肽结合抗体的中和滴度，并作为评价该中和抗原表位多肽在人体免疫反应中的效果；
所述含有FBS的DMEM培养基中，FBS的质量分数为1.5%-2.5%。
10.根据权利要求1所述的一种用于非治疗目的的多肽疫苗的筛选评估方法，其特征在于：所述步骤（5）之后还包括步骤（6）组合分析：将捕获的中和抗体两两组合以及三个组合，通过体外微量中和试验的方法，分析不同组合的中和抗体的中和滴度。
一种多肽疫苗的筛选评估方法
技术领域
背景技术
发明内容
（2）中和抗原表位多肽的合成：将选定的中和抗原表位进行多肽合成，封闭活性基团；
（3）多肽与偶联载体偶联：将多肽与偶联载体进行偶联，洗脱未偶联的多肽，封闭未偶联的偶联载体，清洗待用；
（4）亲和层析：将偶联多肽后的偶联载体装填至蛋白质纯化柱，加入抗体样本，洗脱并收集中和抗体；
（5）中和抗体分析：通过体外微量中和试验的方法，分析捕获的中和抗体的中和滴度。
VP2-28：AGGTGTEDSHPPYKQ。
SP55：PDSRESLAWQTATNP
SP70：YPTFGEHKQEKDLEY
VP2-28：AGGTGTEDTHPPYKQ。
（3.2）偶联配基：
（3.2.1）配基溶解：将多肽用质量分数为25%、pH为9.0的二甲基甲酰胺溶解；
（3.2.2）偶联：将预处理后的琼脂糖珠和溶解后的多肽按体积比0.8-1.2:1的比例混合，在20-40℃温度下孵育14-18h；
（3.2.3）洗脱：用质量分数为25%、pH为9.0的二甲基甲酰胺洗脱未偶联的多肽；
（3.2.4）封闭：在20-40℃温度下，将洗脱后的琼脂糖珠静置于0.8-1.2mol/L的乙醇胺中3-5h，封闭未偶联的偶联载体；
（3.2.5）清洗：用摩尔浓度为0.1mol/L、pH为4.0的醋酸盐缓冲液加0.4-0.6mol/L的NaCl溶液和pH为8.0的tris-HCl缓冲液加摩尔浓度为0.4-0.6mol/L的NaCl溶液循环清洗琼脂糖珠。
（4.2）洗脱：用摩尔浓度为0.1mol/L、pH为4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体，于收集管中加入0.4-0.6gTris固体试剂；
（4.3）收集：重复步骤（4.1）和步骤（4.2），直至收集足够量的抗体；
（4.4）平衡：用10K的蛋白超滤管加入13-17mLPBS平衡，在4500-5500rpm转速下离心25-
35min，弃掉废液；
（4.5）浓缩去盐：将步骤（4.3）收集的抗体加入蛋白超滤管中，在4500-5500rpm转速下离心25-35min，收集超滤膜上方液体为浓缩去盐抗体；重复该步骤，直至全部抗体浓缩去盐。
（5.2）体外微量中和实验通过体外微量中和试验的方法，分析捕获的中和抗体的中和滴度。
用含有FBS的DMEM培养基将细胞稀释成1.5×104-2.5×104个细胞/100μL，并接种至96孔板，过夜培养；
（5.1.2）接种病毒：将培养的EV71病毒经过0.20-0.25μm滤膜过滤，用含有FBS的DMEM培-1 -15
养基将EV71病毒按照10 10 梯度稀释；
~
将EV71病毒接种至步骤（5.1.1）中的96孔板，每孔接种100μL，每个梯度接种10个孔；
（5.1.3）计算：病毒接种7天后观察细胞病变情况，计算EV71病毒TCID50；
所述含有FBS的DMEM培养基中，FBS的质量分数为1.5%-2.5%。
（5.2.2）用含有FBS的DMEM培养基稀释病毒至TCID50为100，取新96孔板，每孔加入EV71病毒50μL；
（5.2.3）用含有FBS的DMEM培养基按倍比稀释浓缩去盐抗体，将不同稀释比例的抗体按
50μL/孔加入步骤（5.2.2）的96孔板中，轻摇混匀，36-37℃温度下孵育0.5-1.5h；
（5.2.4）将步骤（5.2.2）的96孔板中的液体加入步骤（5.2.1）的96孔板中，每个样本设平行孔3个，在CO2浓度为4%-6%、36-37℃温度下培养2-4d，完全抑制致细胞病变效应出现的最高血清稀释度作为血清的中和滴度；
（5.2.5）分析单个中和抗原表位多肽结合抗体的中和滴度，并作为评价该中和抗原表位多肽在人体免疫反应中的效果；
所述含有FBS的DMEM培养基中，FBS的质量分数为1.5%-2.5%。
具体实施方式
（1）多肽序列的选择：选择病原体中和抗原表位多肽序列作为多肽疫苗的序列；
（2）中和抗原表位多肽的合成：将选定的中和抗原表位采用化学方法进行多肽合成，封闭巯基等活性基团；
（3）多肽与偶联载体偶联：将多肽与偶联载体进行偶联，洗脱未偶联的多肽，封闭未偶联的偶联载体，清洗待用；
（4）亲和层析：将偶联多肽后的偶联载体装填至蛋白质纯化柱，加入抗体样本，洗脱并收集中和抗体；
（5）中和抗体分析：通过体外微量中和试验的方法，分析捕获的中和抗体的中和滴度。
SP70：YPTFGEHKQEKDLEY
VP2-28：AGGTGTEDTHPPYKQ。
（3.2）偶联配基：
（3.2.1）配基溶解：将多肽用质量分数为25%、pH为9.0的二甲基甲酰胺溶解；
（3.2.2）偶联：将预处理后的琼脂糖珠和溶解后的多肽按体积比0.8:1的比例混合，在
20℃温度下孵育18h；
（3.2.3）洗脱：用质量分数为25%、pH为9.0的二甲基甲酰胺洗脱未偶联的多肽；
（3.2.4）封闭：在20℃温度下，将洗脱后的琼脂糖珠静置于0.8mol/L的乙醇胺中3h，封闭未偶联的偶联载体；
（3.2.5）清洗：用摩尔浓度为0.1mol/L、pH为4.0的醋酸盐缓冲液加0.4mol/L的NaCl溶液和pH为8.0的tris-HCl缓冲液加摩尔浓度为0.4mol/L的NaCl溶液循环清洗琼脂糖珠。
（4.2）洗脱：用摩尔浓度为0.1mol/L、pH为4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体，于收集管中加入0.4gTris固体试剂；
（4.3）收集：重复步骤（4.1）和步骤（4.2），直至收集足够量的抗体；
（4.4）平衡：用10K的蛋白超滤管加入13mLPBS平衡，在4500rpm转速下离心35min，弃掉废液；
（4.5）浓缩去盐：将步骤（4.3）收集的抗体加入蛋白超滤管中，在4500rpm转速下离心
35min，收集超滤膜上方液体为浓缩去盐抗体；重复该步骤，直至全部抗体浓缩去盐。
（5.2）体外微量中和实验通过体外微量中和试验的方法，分析捕获的中和抗体的中和滴度。
用含有FBS的DMEM培养基将细胞稀释成1.5×104个细胞/100μL，并接种至96孔板，过夜培养；
（5.1.2）接种病毒：将培养的EV71病毒经过0.20μm滤膜过滤，用含有FBS的DMEM培养基将EV71病毒按照10-1 10-15梯度稀释；
~
将EV71病毒接种至步骤（5.1.1）中的96孔板，每孔接种100μL，每个梯度接种10个孔；
（5.1.3）计算：病毒接种7天后观察细胞病变情况，计算EV71病毒TCID50；
所述含有FBS的DMEM培养基中，FBS的质量分数为1.5%。
（5.2.2）用含有FBS的DMEM培养基稀释病毒至TCID50为100，取新96孔板，每孔加入EV71病毒50μL；
（5.2.3）用含有FBS的DMEM培养基按倍比稀释浓缩去盐抗体，将不同稀释比例的抗体按
50μL/孔加入步骤（5.2.2）的96孔板中，轻摇混匀，36℃温度下孵育1.5h；
（5.2.4）将步骤（5.2.2）的96孔板中的液体加入步骤（5.2.1）的96孔板中，每个样本设平行孔3个，在CO2浓度为4%、36℃温度下培养4d，完全抑制致细胞病变效应出现的最高血清稀释度作为血清的中和滴度；
（5.2.5）分析单个中和抗原表位多肽结合抗体的中和滴度，并作为评价该中和抗原表位多肽在人体免疫反应中的效果；
所述含有FBS的DMEM培养基中，FBS的质量分数为1.5%。
所述步骤（3）包括如下步骤：
（3.1）偶联载体预处理：选择琼脂糖珠作为偶联载体，加入双蒸水进行膨胀，再加入双蒸水进行洗涤；
（3.2）偶联配基：
（3.2.1）配基溶解：将多肽用质量分数为25%、pH为9.0的二甲基甲酰胺溶解；
（3.2.2）偶联：将预处理后的琼脂糖珠和溶解后的多肽按体积比1:1的比例混合，在30℃温度下孵育16h；
（3.2.3）洗脱：用质量分数为25%、pH为9.0的二甲基甲酰胺洗脱未偶联的多肽；
（3.2.4）封闭：在30℃温度下，将洗脱后的琼脂糖珠静置于1mol/L的乙醇胺中4h，封闭未偶联的偶联载体；
（3.2.5）清洗：用摩尔浓度为0.1mol/L、pH为4.0的醋酸盐缓冲液加0.5mol/L的NaCl溶液和pH为8.0的tris-HCl缓冲液加摩尔浓度为0.5mol/L的NaCl溶液循环清洗琼脂糖珠。
（4.2）洗脱：用摩尔浓度为0.1mol/L、pH为4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体，于收集管中加入0.5gTris固体试剂；
（4.3）收集：重复步骤（4.1）和步骤（4.2），直至收集足够量的抗体；
（4.4）平衡：用10K的蛋白超滤管加入15mLPBS平衡，在5000rpm转速下离心30min，弃掉废液；
（4.5）浓缩去盐：将步骤（4.3）收集的抗体加入蛋白超滤管中，在5000rpm转速下离心
30min，收集超滤膜上方液体为浓缩去盐抗体；重复该步骤，直至全部抗体浓缩去盐。
用含有FBS的DMEM培养基将细胞稀释成2×104个细胞/100μL，并接种至96孔板，过夜培养；
（5.1.2）接种病毒：将培养的EV71病毒经过0.22μm滤膜过滤，用含有FBS的DMEM培养基将EV71病毒按照10-1 10-15梯度稀释；
~
将EV71病毒接种至步骤（5.1.1）中的96孔板，每孔接种100μL，每个梯度接种10个孔；
（5.1.3）计算：病毒接种7天后观察细胞病变情况，计算EV71病毒TCID50；
所述含有FBS的DMEM培养基中，FBS的质量分数为2%。
（5.2.2）用含有FBS的DMEM培养基稀释病毒至TCID50为100，取新96孔板，每孔加入EV71病毒50μL；
（5.2.3）用含有FBS的DMEM培养基按倍比稀释浓缩去盐抗体，将不同稀释比例的抗体按
50μL/孔加入步骤（5.2.2）的96孔板中，轻摇混匀，37℃温度下孵育1h；
（5.2.4）将步骤（5.2.2）的96孔板中的液体加入步骤（5.2.1）的96孔板中，每个样本设平行孔3个，在CO2浓度为5%、37℃温度下培养3d，完全抑制致细胞病变效应出现的最高血清稀释度作为血清的中和滴度；
（5.2.5）分析单个中和抗原表位多肽结合抗体的中和滴度，并作为评价该中和抗原表位多肽在人体免疫反应中的效果；
所述含有FBS的DMEM培养基中，FBS的质量分数为2%。
所述步骤（3）包括如下步骤：
（3.1）偶联载体预处理：选择琼脂糖珠作为偶联载体，加入双蒸水进行膨胀，再加入双蒸水进行洗涤；
（3.2）偶联配基：
（3.2.1）配基溶解：将多肽用质量分数为25%、pH为9.0的二甲基甲酰胺溶解；
（3.2.2）偶联：将预处理后的琼脂糖珠和溶解后的多肽按体积比1.2:1的比例混合，在
40℃温度下孵育14h；
（3.2.3）洗脱：用质量分数为25%、pH为9.0的二甲基甲酰胺洗脱未偶联的多肽；
（3.2.4）封闭：在40℃温度下，将洗脱后的琼脂糖珠静置于1.2mol/L的乙醇胺中5h，封闭未偶联的偶联载体；
（3.2.5）清洗：用摩尔浓度为0.1mol/L、pH为4.0的醋酸盐缓冲液加0.6mol/L的NaCl溶液和pH为8.0的tris-HCl缓冲液加摩尔浓度为0.6mol/L的NaCl溶液循环清洗琼脂糖珠。
（4.2）洗脱：用摩尔浓度为0.1mol/L、pH为4.0的柠檬酸缓冲液洗脱抗体，于收集管中加入0.6gTris固体试剂；
（4.3）收集：重复步骤（4.1）和步骤（4.2），直至收集足够量的抗体；
（4.4）平衡：用10K的蛋白超滤管加入17mLPBS平衡，在5500rpm转速下离心25min，弃掉废液；
（4.5）浓缩去盐：将步骤（4.3）收集的抗体加入蛋白超滤管中，在5500rpm转速下离心
25min，收集超滤膜上方液体为浓缩去盐抗体；重复该步骤，直至全部抗体浓缩去盐。
1200rpm转速下离心4min，弃掉上清，加入含有FBS的DMEM培养基，吹打制成单细胞悬液，并用细胞计数板计数；
用含有FBS的DMEM培养基将细胞稀释成2.5×104个细胞/100μL，并接种至96孔板，过夜培养；
（5.1.2）接种病毒：将培养的EV71病毒经过0.25μm滤膜过滤，用含有FBS的DMEM培养基将EV71病毒按照10-1 10-15梯度稀释；
~
将EV71病毒接种至步骤（5.1.1）中的96孔板，每孔接种100μL，每个梯度接种10个孔；
（5.1.3）计算：病毒接种7天后观察细胞病变情况，计算EV71病毒TCID50；
所述含有FBS的DMEM培养基中，FBS的质量分数为2.5%。
（5.2.1）将Vero细胞按每孔2.5×10个细胞/100μL接种到96孔板，生长过夜；
（5.2.2）用含有FBS的DMEM培养基稀释病毒至TCID50为100，取新96孔板，每孔加入EV71病毒50μL；
（5.2.3）用含有FBS的DMEM培养基按倍比稀释浓缩去盐抗体，将不同稀释比例的抗体按
50μL/孔加入步骤（5.2.2）的96孔板中，轻摇混匀，37℃温度下孵育0.5h；
（5.2.4）将步骤（5.2.2）的96孔板中的液体加入步骤（5.2.1）的96孔板中，每个样本设平行孔3个，在CO2浓度为6%、37℃温度下培养2d，完全抑制致细胞病变效应出现的最高血清稀释度作为血清的中和滴度；
（5.2.5）分析单个中和抗原表位多肽结合抗体的中和滴度，并作为评价该中和抗原表位多肽在人体免疫反应中的效果；
所述含有FBS的DMEM培养基中，FBS的质量分数为2.5%。
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