技术领域
[0001] 本
发明涉及一种猪肺炎支原体活菌滴度测定方法，尤其涉及猪肺炎支原体双
抗体夹心ELISA活菌滴度测定方法，属于
生物工程技术领域。
背景技术
[0002] 猪支原体肺炎(Mycoplasmal pneumonia of swine，MPS)，俗称猪喘气病，又称猪地方流行性肺炎(Swine enzootic pneumonia)，是一种由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneμmoniae，Mhp)引起的慢性
接触性
呼吸道传染病，广泛发生于世界各地，在
畜牧业高度发达的美国、澳大利亚等国家也普遍存在，临床症状主要为咳嗽和气喘，一般患猪死亡率不高，但严重降低
饲料转化率，长期生长发育不良，造成巨大的经济损失。
[0003] 免疫接种猪肺炎支原体
疫苗是防控MPS的重要措施之一，疫苗接种可有效减少肺部损伤、提高饲料转化率、缩短出栏时间。在对Mhp的规模化生产和疫苗制备中，常常需要测定培养物中的活菌滴度，目前常用于培养物的活菌滴度测定的方法主要包括三种，
颜色变化单位(CCU)计数法、菌落变化单位(CFU)计数法、紫外检测法。
[0004] 其中CCU计数方法比较直观，应用广泛，但其操作要求较高，影响因素多，且耗时长，对生产周期影响较大；CFU计数原理与CCU计数相同，计数更加精确，但操作更为复杂，极容易污染，且同样具有耗时长的缺点；紫外检测法具有简单、快速的特点，但由于Mhp培养基中核酸成分的限制，并不适用于Mhp培养物中活菌滴度的测定。尚需建立一种快速准确的新型猪肺炎支原体活菌滴度检测方法，以缩短生产周期，提高生产效率。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服
现有技术之
缺陷，提供一种猪肺炎支原体双抗体夹心ELISA活菌滴度测定方法，以解决猪肺炎支原体传统定量检测方法费时长的弊端。
[0006] 本发明所述技术问题是由以下技术方案实现的。
[0007] 一种猪肺炎支原体活菌滴度测定方法，其特征在于包括以下步骤：
[0008] a.包被：用包被液将抗P46蛋白单克隆抗体稀释，包被至96孔酶标板，4℃过夜；所述包被液为
碳酸盐缓冲液；
[0009] b.封闭：弃去包被液，用PBST洗涤，加入含
脱脂奶粉的PBS作为封闭液，100-250μl/孔，37℃作用0.5-2h；所述PBST溶液为含0.05％Tween-20的PBS溶液；
[0010] c.加样：弃去封闭液，用PBST洗涤后分别加入阴性和阳性对照样品、标准品、待检样品，80-150μl/孔，37℃孵育0.5-2h；
[0011] 阴性对照样品为A26液体培养基，阳性对照样品为猪肺炎支原体菌液，标准品为标记为S1至S6的不同活菌滴度的猪肺炎支原体菌液；
[0012] d.加酶标抗体：弃去阴性和阳性对照样品、标准品、待检样品，用PBST洗涤后加入稀释的酶标抗体，80-150μl/孔，37℃孵育0.5-2h；
[0013] e.显色：弃去酶标抗体，用PBST洗涤后加入TMB底物显色液，80-150μl/孔，室温避光反应5-30分钟；
[0014] f.终止：用2M H2SO4终止反应，20-100μl/孔，450nm处读取吸光值；
[0015] g.结果判定：如果阳性对照OD450nm值1.0～1.5，阴性对照OD450nm值≦0.20，则试验成立，接下来，以S6作为参比标准品记为1个横坐标单位，S1～S5分别记为50、25、10、5、2.5个横坐标单位，以标准品OD450nm值减去阴性对照样品OD450nm值所得到的值为纵坐标绘制标准曲线图，通过标准曲线计算，以待检样品OD450nm值-阴性对照样品OD450nm值来得到待检样品中的猪肺炎支原体活菌滴度。
[0016] 优选地，在本发明所述的猪肺炎支原体活菌滴度测定方法的步骤a中，抗P46蛋白单克隆抗体的制备包括以下步骤：引物设计、PCR扩增、基因克隆、原核表达、亲和层析制备纯化的P46蛋白，之后免疫BALB/c小白鼠，筛选阳性杂交瘤细胞，经亚克隆得到抗P46蛋白单克隆抗体。优选地，本发明中PCR扩增的上游引物F、下游引物R序列分别为：F：SEQ ID NO.1；R：SEQ ID NO.2。进一步优选抗P46蛋白单克隆抗体IgG1。
[0017] 另外，优选地，步骤c中阳性对照猪肺炎支原体菌液活菌滴度为1.0×109CCU/ml；标准品猪肺炎支原体菌液活菌滴度分别为：S1：5.0×109CCU/ml，S2：2.5×109CCU/ml，S3：
1.0×109CCU/ml，S4：5.0×108CCU/ml，S5：2.5×108CCU/ml，S6：1.0×108CCU/ml。进一步优选所述阴阳性对照样品、标准品、待检样品均采用超声处理后用于检测。
[0018] 另外，优选地，步骤d中的酶标抗体由辣根过
氧化物酶HRP对抗P46蛋白单克隆抗体进行标记制备而得，酶标抗体效价不低于1:2000。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0020] (1)本发明应用双抗体夹心ELISA方法实现了对猪肺炎支原体活菌滴度的测定，检测周期仅需1天，与常用的CCU计数法相比，大大缩短了生产周期，提高了生产效率。
[0021] (2)特异性强，与絮状支原体、猪鼻支原体、猪滑液支原体进行ELISA检测无交叉反应。
[0022] (3)重复性好，批内变异系数和批间变异系数均小于5％，说明同一样品在同批和不同批试验中变异程度很小，表明该方法具有较高的重复性。
附图说明
[0023] 图1为双抗体夹心ELISA法定量检测猪肺炎支原体活菌滴度标准曲线图。图中横坐标为猪肺炎支原体标准品活菌滴度，S6记为1个横坐标单位，S1～S5分别记为50、25、10、5、2.5个横坐标单位；纵坐标为标准品与阴性对照样品的OD450nm吸光度差值。
具体实施方式
[0024] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0025] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0026] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法。
[0027] 本发明中，名词术语既包括单数形式，也包括复数形式，除非上下文另行明确指出。本发明中所述的“至少之一”或“至少一种”不仅仅指包含“一个”或“一种”的情况，更重要的还包含“多个”或“多种”的情况。
[0028] 在示例性实施方案中，本发明的步骤a包被：用包被液将抗P46蛋白单克隆抗体稀释，包被至96孔酶标板，4℃过夜；所述包被液为碳酸盐缓冲液。其中，优选地，将抗P46蛋白单克隆抗体稀释至2-8μg/ml，优选3-7μg/ml，更优选4-6μg/ml，例如，4μg/ml或5μg/ml等。优选地，所述包被液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液。优选地，包被液pH 9.6。
[0029] 在示例性实施方案中，步骤b.封闭：弃去包被液，用PBST洗涤后加入含0.5％脱脂奶粉的PBS作为封闭液。每孔中封闭液的添加体积并不特别限定，优选100-250μl，例如150μl。加入封闭液后的作用条件也不特别限定，优选37℃作用1小时。
[0030] 在示例性实施方案中，步骤c.加样：弃去封闭液，用PBST洗涤后分别加入阴性和阳性对照样品、标准品、待检样品，80-150μl/孔，37℃孵育0.5-2h。优选地，每孔中加入的样品的体积为100μl。优选的孵育时间为0.5h。
[0031] 在示例性实施方案中，阴性对照样品为A26液体培养基。优选地，阳性对照样品为猪肺炎支原体菌液。优选地，标准品为标记为S1至S6的不同活菌滴度的猪肺炎支原体菌液。优选地，阳性对照猪肺炎支原体菌液的活菌滴度为1.0×108-5.0×109CCU/ml，优选地，1.0×109CCU/ml；标准品猪肺炎支原体菌液活菌滴度优选地分别为：S1：5.0×109CCU/ml，S2：
2.5×109CCU/ml，S3：1.0×109CCU/ml，S4：5.0×108CCU/ml，S5：2.5×108CCU/ml，S6：1.0×
108CCU/ml。在优选的实施方案中，阴阳性对照样品、标准品、待检样品均采用超声处理后用于检测，本发明中采用超声处理有利于灵敏性和准确性的提高，本
发明人发现超声处理不仅有利于细胞的破裂，更重要的是，在本发明的特定条件下，超声处理有利于
抗原与抗体的结合。
[0032] 在示例性实施方案中，步骤d.加酶标抗体：弃去阴性和阳性对照样品、标准品、待检样品，用PBST洗涤后加入稀释的酶标抗体，80-150μl/孔，37℃孵育0.5-2h。优选地，每孔的体积为100μl。孵育时间优选为1h。
[0033] 在示例性实施方案中，步骤e.显色：弃去酶标抗体，用PBST洗涤后加入TMB底物显色液，80-150μl/孔，室温避光反应5至30分钟。优选地，每孔的体积为100μl，反应时间优选为10分钟。
[0034] 在示例性实施方案中，步骤f.终止：用2M H2SO4终止反应，20-100μl/孔，450nm处读取吸光值。优选地，每孔的体积为50μl。
[0035] 在示例性实施方案中，步骤g.结果判定的方法为，如果阳性对照OD450nm值1.0～1.5，且阴性对照OD450nm值≦0.20时，则试验成立。在试验成立的前提下，接下来，以S6作为参比标准品记为1个横坐标单位，S1～S5分别记为50、25、10、5、2.5个横坐标单位，以标准品OD450nm值减去阴性对照样品OD450nm值所得到的值为纵坐标绘制标准曲线图，通过标准曲线计算，以待检样品OD450nm值-阴性对照样品OD450nm值来得到待检样品中的猪肺炎支原体活菌滴度。
[0036] 在示例性实施方案中，步骤a中抗P46蛋白单克隆抗体由生物工程制备。通过采用以生物工程制备的抗原制备的单克隆抗体具有纯度高，成分单一的优点。具体制备步骤包括：引物设计、PCR扩增、基因克隆、原核表达、亲和层析制备的纯化P46蛋白，免疫BALB/c小白鼠，筛选阳性杂交瘤细胞，经亚克隆得到抗P46蛋白单克隆抗体。本发明中，优选地，在制备作为抗原的P46蛋白时，如下所述的引物来进行PCR反应：F：SEQ ID NO.1；R：SEQ ID NO.2。通过上述特定引物得到的P46蛋白
片段具有抗原性强，产生的抗体特异性高等优点。本发明中优选的抗体类型为IgG1。
[0037] 在示例性实施方案中，步骤d中的酶标抗体由辣根过氧化物酶HRP对抗P46蛋白单克隆抗体进行标记制备而得，酶标抗体效价不低于1:2000。优选地酶标抗体小量分装。通常情况下，在-70℃以下低温保存备用。
[0039] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0040] 实施例中所用的
试剂及来源：大肠杆菌DH5a购自Takara公司；弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂、IPTG、BCA蛋白浓度测定
试剂盒、HRP、Tween20均购自美国Sigma-Aldrich公司；骨髓瘤细胞Sp2/0株由浙江大学赠送，市场有售；96孔可拆卸酶标板购自Solarbio公司；TMB单组份显色液购自Solarbio公司；其他所用化学试剂均为分析纯。
[0041] 实施例1制备猪肺炎支原体P46蛋白、单克隆抗体和酶标抗体。
[0042] 1)猪肺炎支原体P46蛋白的制备
[0043] 根据Gen Bank上发表的猪肺炎支原体P46蛋白的基因序列，设计一对引物，分别如下P1：5’GGATCCTGCACACAATAACTG3’(SEQ ID NO:1)，P2：5’AAGCTTGAGAACTTCAACAGC3’(SEQ ID NO:1)，扩增片段长约810bp，以Mhp J株基因组作为模板，采用PCR扩增目的基因，目的基因经酶切、测序鉴定正确后转化大肠杆菌DH5a感受态，进行目的基因的克隆。定点突变正确的菌株接种LB培养基经IPTG诱导后进行原核表达，蛋白复性后采用琼脂糖亲和层析柱纯化，得到纯化的P46蛋白，Bradford法测定浓度为450μg/ml，-70℃以下低温保存备用。
[0044] 2)抗P46蛋白单克隆抗体的制备
[0045] 将纯化的P46蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合乳化后，免疫6周龄雌性BALB/c小白鼠，第三次免疫后5天取血清抗体效价最高的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0进行细胞融合，运用ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，采用有限稀释法进行3次亚克隆，得到两株抗猪肺炎支原体P46蛋白的杂交瘤细胞株，制备腹
水得到抗P46蛋白单克隆抗体，经鼠单克隆抗体Ig类/亚类鉴定分别为IgG1、IgG2，抗体效价分别为1:12 800、1:3200，BCA法测定蛋白浓度分别为4.53mg/ml、3.02mg/ml。优选抗P46蛋白单克隆抗体IgG1。
[0046] 3)酶标抗体的制备
[0047] 用辣根过氧化物酶HRP对单克隆抗体IgG1进行标记，
收获后测定酶标抗体效价为1:8000，小量分装，-70℃以下低温保存备用。
[0048] 实施例2双抗体夹心ELISA定量检测方法应用
[0049] 待检样品为瑞普(保定)生物药业有限公司生产的猪肺炎支原体菌液，批号：8
151203，应用标准的颜色变化单位(CCU)计数法进行测定，活菌滴度为5.0×10CCU/ml，检测周期21天。
[0050] a.包被：用包被液将抗P46蛋白单克隆抗体稀释至4μg/ml，100μl/孔，包被至96孔酶标板，4℃过夜；所述的抗原包被液为0.05mol/L碳酸盐缓冲液，其pH 9.6；
[0051] b.封闭：弃去包被液，用PBST洗涤3次，加入含0.5％脱脂奶粉的PBS作为封闭液，150μl/孔，37℃作用1h；所述PBST溶液为含0.05％Tween-20的PBS溶液；
[0052] c.加样：弃去封闭液，用PBST洗涤3次后分别加入阴阳性对照样品、标准品、待检样品，100μl/孔，各2孔，37℃孵育30min；
[0053] 阴性对照为A26液体培养基；阳性对照为猪肺炎支原体菌液，活菌滴度为1.0×109CCU/ml；标准品(S1～S6)为不同活菌滴度的猪肺炎支原体菌液，其中S1：5.0×109CCU/
9 9 8 8
ml，S2：2.5×10 CCU/ml，S3：1.0×10CCU/ml，S4：5.0×10CCU/ml，S5：2.5×10CCU/ml，S6：
1.0×108CCU/ml，5ml/支定量分装，-70℃以下保存。其中S2标准品由S1标准品2倍稀释而得，S4、S5标准品由S3标准品2倍、4倍稀释而得，S1、S3、S6标准品活菌滴度为直接测定。
[0054] 阴阳性对照样品、标准品、待检样品均采用超声处理后用于检测。取样品5ml，超声处理60s(脉冲，40％功率循环)，并使用
冰水环境进行冷却，低温3 000rpm离心10min，取上清5倍稀释后即可用于检测。
[0055] d.加酶标抗体：弃去阴阳性对照样品、标准品、待检样品，用PBST洗涤3次后加入1:8000倍稀释的酶标抗体，100μl/孔，37℃孵育1h；
[0056] e.显色：弃去酶标抗体，用PBST洗涤3次后加入TMB底物显色液，100μl/孔，室温避光反应10min；
[0057] f.终止：用2M H2SO4终止反应，50μl/孔，450nm处读取吸光值；
[0058] g.结果判定：阳性对照样品OD450nm值1.345，阴性对照样品OD450nm值为0.081，试验成立。以S6作为参比标准品记为1个横坐标单位，S1～S5分别记为50、25、10、5、2.5个横坐标单位，以(标准品OD450nm值-阴性对照样品OD450nm值)为纵坐标绘制标准曲线图(见图1)，得到y＝0.50529ln(x)+0.12644，相关系数R2＝0.96593。待检样品OD450nm值为0.873，根据标准曲线计算得x＝4.380，即待检样品中的猪肺炎支原体活菌滴度为4.380×108CCU/ml。
[0059] 实施例3双抗体夹心ELISA定量检测方法评价
[0060] 运用建立好的双抗体夹心ELISA定量检测方法，检测10批次猪肺炎支原体菌液样品，同时使用CCU计数方法进行测定，对比测定结果进行分析，结果见表1。
[0061] 表1多批次菌液活菌滴度测定结果
[0062] 单位：CCU/ml[0063]
[0064] 本发明应用双抗体夹心ELISA方法实现了对猪肺炎支原体活菌滴度的定量测定，与标准的CCU计数方法结果大体一致，且精确度更高，检测周期仅需1天，大大缩短了生产周期，提高了生产效率。
[0065] 运用建立好的双抗体夹心ELISA定量检测方法，检测絮状支原体(1.0×108CCU/ml)、猪鼻支原体(5.0×109CCU/ml)、猪滑液支原体(1.0×109CCU/ml)样品各1份，ELISA检测结果显示3份待检样品检测结果均和阴性对照样品相一致，表明无交叉反应，特异性强。
[0066] 运用建立好的双抗体夹心ELISA定量检测方法，选择1.0×108CCU/ml、5.0×8 9
10CCU/ml、1.0×10CCU/ml三个抗原含量点，每个点测定5个重复，计算批内变异系数；连续测定5次，计算批间变异系数。该方法批内变异系数为1.24％-4.53％，批间变异系数为
2.24％-4.25％，均小于5％，说明同一样品在同批和不同批试验中变异程度很小，表明该方法重复性好。
[0067] 参考本
申请的优选技术方案详细描述了本申请的
生物材料去细胞洗脱装置，然而，需要说明的是，在不脱离本申请的精神的情况下，本领域技术人员可在上述公开内容的
基础上做出任何改造、修饰以及变动。本申请包括上述具体实施方案及其任何等同形式。
