一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法
专利汇可以提供一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种基于Mmc LppA 蛋白的间接ELISA 试剂 盒 及使用方法。基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒原料及配方为：包被Mmc LppA 蛋白的酶标板、Mmc标准阳性和标准阴性血清、酶标二抗、50×PBST缓冲液、封闭缓冲液、底物液A、底物液B和终止液。本发明能检测羊血清Mmc感染 抗体 和 疫苗 免疫抗体，将为Mmc引起的山羊和 绵羊 支原体型 肺 炎的早期监测、疫苗免疫效果评价及相关研究工作提供关键技术，对本病原所致疫病的早发现早防控具有重要意义。，下面是一种基于MmcLppA蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法专利的具体信息内容。
1.一种基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：间接ELISA试剂盒的原料配方为：包被酶标板1~5个，Mmc标准阳性血清0.5~1.5mL、Mmc标准阴性血清0.5~1.5mL、酶标二抗300-500μL、50×PBST缓冲液20-25mL、底物液A10mL-15mL、底物液B10mL-15mL和终止液
10mL-15mL。
2.根据权利要求1所述一种基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：包被酶标板为重组蛋白包被，重组蛋白为Mmc LppA基因通过大肠杆菌Rosseta（DE3）表达系统获得LppA重组蛋白，并通过镍柱亲和层析法获得纯化蛋白，使用包被缓冲液稀释为1.0μg/100 μL ~3.0μg /100μL，室温包被酶标板12h，3g/100mL的BSA溶液，37℃封闭ELISA反应板1.5h后即为包被酶标板。
3.根据权利要求1所述一种基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：Mmc标准阳性血清应用丝状支原体山羊亚种GZ-LD株免疫山羊获得的高免血清，按1:100稀释。
4.根据权利要求1所述一种基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：Mmc标准阴性血清为采集自丝状支原体山羊亚种血清抗体阴性的山羊血清，按1:100稀释。
5.根据权利要求1所述一种基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述酶标二抗为兔抗羊IgG-HRP，按1:2000稀释使用。
6.根据权利要求1所述一种基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述
50×PBST缓冲液为：NaCl 400.0 g、KCl 10.0 g、KH2PO4 10.0 g、Na2HPO4·12H2O 145 g、Tween-20 25 mL溶于400~500 mL蒸馏水，调整pH为7.2～7.6，定容至1000 mL。
7.根据权利要求1所述一种基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述底物液A为Na2HPO4 14.60 g、柠檬酸 9.33 g、过氧化氢脲 0.52 g，溶于三蒸水，并定容至
1000 mL，调至 p H 5.0～5.4。
8.根据权利要求1所述一种基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述底物液B为TMB 20mg、无水乙醇8~10 mL，加双蒸水至1 000 mL，过滤除菌，无菌分装。
9.根据权利要求1所述一种基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒，其特征在于：所述终止液为0.2 %～0.3% HF溶液。
10.如权利要求1所述的一种基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒的使用方法，其特征在于：包含以下步骤：
第一，取包被酶标板，应用PBST洗涤ELISA反应板5次；
第二，将阴、阳性对照血清及待检血清做1∶100倍稀释，按100μL加入酶标板反应孔中，
37℃孵育1h后，应用PBS洗涤ELISA酶标板各反应孔5次；
第三，将兔抗羊IgG-HRP用PBST做1:2000倍稀释，按100μL加入酶标板反应孔，37℃作用
1h后，应用PBST洗涤酶标板反应孔5次；
第四，将底物液A和B各50μL加入ELISA反应板，避光室温显色10~15min，加入50μL终止液，立即在酶标仪630nm波长下读取OD值；
第五，试验成立条件为阳性血清OD630平均值≥3.069，阴性血清OD630平均值＜1.741；
试验结果判定标准为待检样本OD630值≥2.738为阳性，待检样本OD630值＜2.738为阴性。
一种基于Mmc LppA蛋白的间接ELISA试剂盒及使用方法
技术领域
背景技术
发明内容
第二，将阴、阳性对照血清及待检血清做1∶100倍稀释，按100μL加入酶标板反应孔中，
37℃孵育1h后，应用PBS洗涤ELISA酶标板各反应孔5次；
第三，将兔抗羊IgG-HRP用PBST做1:2000倍稀释，按100μL加入酶标板反应孔，37℃作用
1h后，应用PBST洗涤酶标板反应孔5次；
第四，将底物液A和B各50μL加入ELISA反应板，避光室温显色10~15min，加入50μL终止液，立即在酶标仪630nm波长下读取OD值；
第五，试验成立条件为阳性血清OD630平均值≥3.069，阴性血清OD630平均值＜1.741；
试验结果判定标准为待检样本OD630值≥2.738为阳性，待检样本OD630值＜2.738为阴性。
具体实施方式
酶标板；Mmc标准阳性和标准阴性血清；重组蛋白为Mmc LppA基因通过大肠杆菌Rosseta（DE3）表达系统获得LppA蛋白，并通过镍柱法蛋白纯化试剂盒进行重组蛋白纯化，纯化目的蛋白经包被缓冲液稀释为1.5μg /100μL；包被缓冲液：Na2CO3 1.59g、NaHCO3
2.93g溶于去离子水中，定容至1000mL，调至 p H 9.5～9.8；酶标二抗：兔抗羊IgG-HRP；1×PBST缓冲液： NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH2PO4 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.9g、Tween-20 0.5mL溶于800mL蒸馏水，调整pH为7.2～7.6，定容至1000mL；封闭缓冲液：1g~5gBSA溶于10mL PBST缓冲液；底物液A：Na2HPO4 14.60g、柠檬酸 9.33 g、过氧化氢脲 0.52 g，溶于三蒸水，并定容至1 000 mL，调至 p H 5.0～5.4；底物液B：TMB 20mg、无水乙醇10 mL，加双蒸水至1 000 mL，过滤除菌，无菌分装；终止液：0.2 %～0.3% HF溶液；
如图1所示意，本发明的间接ELISA试剂盒的制备方法为：
第一，原核表达系统表达融合蛋白pColdⅠ-LppA，并经镍柱亲和层析纯化得到蛋白浓度为0.158 mg/mL。应用SDS-PAGE分析其纯化效果；
第二，步骤一的纯化融合蛋白LppA作为包被抗原，并优化间接ELISA反应条件，间接ELISA方法最佳反应条件为：抗原包被液浓度1.5μg/100μL；抗原包被条件室温12h；封闭液
3%BSA，封闭时间1h；阳性、阴性和待检血清血清稀释度1:100；酶标二抗稀释浓度1:2000；显色反应时间15min。
取包被酶标板，应用PBST洗涤ELISA反应板5次； 将阳性血清、阴性血清和待检血清用PBST做1∶100倍稀释，按100μL加入ELISA反应板，37℃作用1h后，用PBS洗涤ELISA反应板5次； 将兔抗羊IgG-HRP用PBST做1:2000倍稀释，以100μL加入ELISA反应板，37℃作用1h后，应用PBST洗涤ELISA反应板5次； 将底物液A和B各50μL加入ELISA反应板，避光室温显色15min，加入50μL终止液，立即在酶标仪630nm波长下读取OD值。 试验结果判定标准为样本OD630值≥2.738为阳性，OD630值＜2.738为阴性。
第六，应用步骤二~四建立的间接ELISA方法，批内及批间重复性试验变异系数为均≤
15.0%，确定该间接ELISA批内重复性及批间重复性良好；
第七，应用步骤二~四建立的间接ELISA方法，检测184份临床羊血清样本，阳性率为
52.72%（97/184），确定其临床适用性良好。
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