一种抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法及应用
阅读：794发布：2023-01-22
专利汇可以提供一种抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 技术领域，具体为一种抑制脲酶活性卵黄 抗体 的制备方法及其应用。本发明采用基因重组技术,克隆幽 门 螺杆菌脲酶（Urease）B亚基DNA 片段 ,进行 碱 基突变后将其构建到克隆到原核表达质粒载体上，通过转化基因工程菌BL21（DE3），采用IPTG诱导重组 抗原 蛋白脲酶B亚基的表达，成功实现可溶形式表达；裂解细胞，分离和纯化脲酶B亚基重组蛋白；将纯化的重组蛋白脲酶B亚基作为抗原与佐剂制备成微球 疫苗 免疫产蛋鸡，用罐组式逆流提取蛋黄中卵黄抗体，用ELISA等技术检测卵黄抗体的滴度和特异性。本发明将该获得的卵黄抗体，加入 牛 奶中直接饮用可 治疗 和 预防 因幽门螺杆菌感染导致的急慢性胃炎、消化性溃疡等胃部 疾病 。，下面是一种抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法及应用专利的具体信息内容。
1.一种抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于：先克隆幽门螺杆菌脲酶B亚基基因片段，进行碱基突变形成特殊脲酶B基因片段，将其亚克隆到原核表达质粒载体上，转化成基因工程菌，然后在25℃～30℃的条件下通过0.1～1.0mM IPTG诱导蛋白表达，最终80-95%的重组脲酶B亚基以可溶性形式蛋白表达；经亲和层析分离纯化脲酶B亚基重组蛋白，将其与佐剂混合，制备成重组幽门螺杆菌脲酶B亚基微球疫苗，通过2-5点肌肉免疫3-4次产蛋鸡；收集鸡蛋，采用罐组式逆流提取蛋黄中卵黄抗体，用ELISA和Western blotting技术检测卵黄抗体的滴度和特异性。
2.根据权利要求1所述的抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的基因工程菌菌株的保藏号为CGMCC NO：11509。
3.根据权利要求1所述的抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的对重组脲酶B亚基蛋白进行纯化，其通过使用Ni-NTA亲和树脂纯化幽门螺杆菌脲酶B亚基可溶性蛋白， SDS-PAGE电泳后灰度扫描表明蛋白纯度达到85 %-98%。
4.根据权利要求1所述的抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的佐剂中含胞壁酰二肽5-50 ug/g、脂多糖5-40 ug/g。
5.根据权利要求1所述的抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的重组脲酶B亚基微球疫苗含有液体石蜡和span 80，将液体石蜡和span 80a按其体积比为
5-9: 1，并400-600 rpm机械搅拌约8-12 min，混合均匀制备油相，将纯化蛋白抗原与胞壁酰二肽和脂多糖溶于20 mg/ml的海藻酸钠溶液中，纯化蛋白抗原、胞壁酰二肽和脂多糖的终浓度分别为150-550 ug/ml、5-50 ug/ml和5-40 ug/ml，混匀，通过直径0.03-0.05 mm的孔径喷雾干燥器喷出，于上述液体石蜡和span 80a的油相中搅拌，乳化3-6 h，既得微球疫苗。
6.根据权利要求1所述的抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的鸡蛋中，其抗脲酶卵黄抗体滴度达到1:10000以上。
7.根据权利要求1所述的抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的卵黄抗体的罐组式逆流提取，于低于30℃的条件多罐逆流提取6-8h,提取率达到90-98%。
8.根据权利要求7所述的抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法，其特征在于：所述的罐组式逆流提取蛋黄中卵黄抗体，第一次，在30℃以下取蛋黄液与UP水按1:2-5体积比混匀,缓慢搅拌1-2 h, 12000rpm离心10-15 min,收集上清液A；第二次，取第一次离心沉淀8-20倍重量的UP水重悬第一次离心沉淀，在30℃以下混匀,搅拌1-2h, 12000 rpm离心10-15 min,收集上清液，将此次的上清液与新鲜的蛋黄液按1:2-5比例在30℃以下混匀，用UP水补足上清液,搅拌1-2h, 12000 rpm离心10-15 min,收集上清液B；第三次取
8-20倍第二次离心获得的沉淀重量的UP水重悬第二次离心获得的沉淀，在30℃以下混匀,搅拌1-2h，12000 rpm离心10-15 min,收集上清液，沉淀另处理，此次获得的上清液与第一次提取离心后的沉淀在30℃以下混匀,搅拌1-2 h, 12000 rpm离心10-15 min,收集上清液；此次获得的上清液与新鲜的蛋黄液按1:2-5体积比在30℃以下混匀，用UP水补足上清液,搅拌1-2 h， 12000 rpm离心10-15 min,收集上清液C；合并上清液A、上清液B和上清液C。
一种抑制脲酶活性卵黄抗体的制备方法及应用
技术领域
背景技术
[0002] 幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)与急慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌及胃MALT淋巴瘤等胃部疾病的发生密切相关。1994年世界卫生组织将其列为一类致癌因子。目前发达国家幽门螺杆菌感染率达到30％，发展中国家人群的Hp的感染率高达50％以上。根除HP后不仅能加速胃溃疡愈合，而且能显著降低胃炎复发率。但目前要彻底根除HP仍然很困难，还没有一种单一的抗生素对HP感染的治疗有效，必须采用多种抗生素联合治疗，如奥美拉唑、甲硝唑、阿莫西林、克拉霉素和铋制剂等联合使用。但联合抗生素越多，副作用越大，抗药性也变得更加复杂、病人治疗费用高、依从性差、副反应多,Hp耐药性显著增强，停药后易复发。Hp疫苗是被认为是预防人群Hp感染的最有前景的方法之一，但由于Hp感染在胃粘膜，常规疫苗免疫产生的体液免疫和细胞免疫难以达到该领域，其保护作用有限，也是迄今为止幽门螺杆菌及亚单位疫苗预防治疗幽门螺杆菌致胃病难的主要原因，到目前为止并未有真正意义上的疫苗上市。Hp疫苗其主要在于预防，然而针对已感染人群或病人的治疗是否有作用，目前没有相关的研究报道。
[0003] 脲酶分布于Hp表面,广泛表达且高度保守,较大的相对分子质量和颗粒状结 构也有利于刺激机体产生免疫反应,可作为Hp疫苗的候选抗原。Hp脲酶由A、B两个亚单位组成,呈六聚体。其中B亚单位相对分子质量约64000,抗原性强,且能使机体产生更有效的保护作用。本专利采用基因突变优化改造了Hp脲酶B亚单位(Urease B subunit,UreB)DNA序列,并构建到原核表达载体,实现其在大肠杆菌中的高效可溶性表达，避免了无活性包涵体的形成。卵黄免疫球蛋白(IgY)由于其来源便宜，产量高，成本低，容易制备，具有热稳定性、耐酸和耐蛋白酶等特点以及动物种系发生学距离的优势，而被作为口服食品，预防和控制肠道、口腔细菌的感染，这些研究与应用为制备抗Hp的特，异性IgY抗体提供了可能，并为预防和治疗Hp感染的胃病开辟了一条新路径。
[0004] 通过现有的文献检索发现，如陈喆等发表题为《幽门螺杆菌临床菌株尿素酶B亚单位原核表达系统的构建及其重组蛋白免疫性的鉴定》(《浙江大学学报:医学版》,2003,第1期(1):4-8)。从文中可知，脲酶原核表达多出现包涵体表达，而包涵体表达常导致蛋白变性失去原有天然结构，且蛋白复性耗时长且技术较复杂，明显增加了蛋白表达纯化成本。刘晓峰等题为《表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的减毒鼠伤寒杆菌口服疫苗的制备》(《中华消化杂志》,2001,09期(9):522-525)，对脲酶B亚单位的原核表达和疫苗研究，但由于Hp感染在胃粘膜，常规疫苗免疫产生的体液免疫和细胞免疫难以达到该领域，其保护作用有限，也是迄今为止幽门螺杆菌及亚单位疫苗预防治疗幽门螺杆菌致胃病难的主要原因，到目前为止并未有真正意义上的疫苗上市。Hp疫苗其主要在于预防，然而针对已感染人群或病人的治疗是否有作用，目前没有相关的研究报道。
[0005] 经对现有的专利技术检索发现，玉义胜等人在《对幽门螺杆菌定居具有抑制活性的糖蛋白》一文中，从牛奶和鸡蛋中筛选出特异地结合幽门螺杆菌脲酶的糖蛋白，抑制菌的定生，但经过分析发现这种糖蛋白在原料中含量低， 制备的糖蛋白产量低、成本高。迈耶等人在《幽门螺杆菌活疫苗》中将幽门螺杆菌脲酶基因插入减毒沙门氏菌细胞，制成疫苗，虽然可以产生免疫反应，但减毒沙门氏菌存在反毒和丢失脲酶基因的风险。根据美国食品与药物管理机构(FDA)的规定，活疫苗中不能存在抗药质粒，在人和动物体内也无法以抗生素来维持重组质粒的稳定性免疫应答反应。聂作明等人用将用超声波粉碎幽门的幽门螺杆菌抗原和HP尿素脲酶的提取物作为混合(Urease)抗原的混合物免疫产蛋母鸡，制备抗Hp的IgY抗体，但该抗原成分复杂，导致其免疫球蛋白的特异性和、针对性和抗体滴度不强高，往往由于菌体表面抗原的丢失或菌体突变，难以达到抑制幽门螺杆菌生长的目的产生的卵黄抗体；此外有人从幽门螺杆菌中分离脲酶，作为免疫原获得抗体，然而该抗体不能抑制幽门螺杆菌的定植。综上所述，需要新型抗体治疗技术的筛选开发，以此实现对幽门螺杆菌的综合防治。
发明内容
[0007] 本发明的另外一个目的是提供以上所述的抑制脲酶活性卵黄抗体的应用。
[0008] 本发明的具体技术方案如下：
[0009] 一种抑制尿素酶脲酶活性卵黄抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：先将幽门螺杆菌脲酶B亚基基因1710bp进行基因突变，再将其亚克隆到原核表达载体，并形成融合表达质粒pET32a-ureB；将质粒pET32a-ureB转化大肠杆菌中并形成基因工程菌(该基因工程菌的菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年10 月15日，保藏编号为CGMCC NO：11509，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli)，将基因工程菌进行分离和纯化，得幽门螺杆菌脲酶B亚基可溶性蛋白；再将幽门螺杆菌脲酶B亚基可溶性蛋白与佐剂混合，制成重组幽门螺杆菌脲酶B亚基微球疫苗，通过2-5点肌肉免疫3-4次产蛋鸡；收集鸡蛋，采用罐组式逆流提取蛋黄中卵黄抗体，用ELISA和Western blotting技术检测卵黄抗体的滴度和特异性。
[0010] 所述的大肠杆菌表达产物中80-95％的重组脲酶B蛋白是幽门螺杆菌脲酶B亚基可溶性蛋白，通过使用Ni-NTA树脂纯化后的重组幽门螺杆菌脲酶B亚基可溶性蛋白，蛋白纯度SDS-PAGE电泳后灰度扫描其纯度在85-98％。
[0011] 所述的佐剂中含胞壁酰二肽5-50ug/g、脂多糖5-40ug/g。
[0012] 幽门螺杆菌B亚基片段微球疫苗的制备：所述的重组脲酶B亚基微球疫苗含有液体石蜡和span 80，将液体石蜡和span 80a按其体积比为5-9:1，并400-600rpm机械搅拌约8-12min，混合均匀制备油相。将纯化蛋白抗原与胞壁酰二肽和脂多糖溶于20mg/ml的海藻酸钠溶液中，纯化蛋白抗原、胞壁酰二肽和脂多糖的终浓度分别为150-550ug/ml、5-50ug/ml和5-40ug/ml，混匀，通过直径0.03-0.05mm的孔径喷雾干燥器喷出，于上述液体石蜡和span 80a的油相中搅拌，乳化3-6h，既得微球疫苗。
[0013] 所述的鸡蛋中，其抗脲酶卵黄抗体滴度达到1:10000以上。
[0014] 所述的卵黄抗体的罐组式逆流提取，于30℃以下条件多罐逆流提取6-8h，提取率达到90-98％。
[0015] 所述的罐组式逆流提取蛋黄中卵黄抗体，第一次，在30℃以下取蛋黄液与UP水按1：2-5体积比混匀，缓慢搅拌1-2h,12000rpm离心10-15min，收集上清液A。第二次，取第一次离心沉淀8-20倍重量的UP水重悬第一次离心沉淀，在30℃ 以下混匀，搅拌1-2h,12000rpm离心10-15min，收集上清液。将此次的上清液与新鲜的蛋黄液按1:2-5比例在30℃以下混匀，用UP水补足上清液，搅拌1-2h,12000rpm离心10-15min，收集上清液B。
第三次取8-20倍第二次离心获得的沉淀重量的UP水重悬第二次离心获得的沉淀，在30℃以下混匀，搅拌1-2h，12000rpm离心10-15min，收集上清液，沉淀另处理，此次获得的上清液与第一次提取离心后的沉淀在30℃以下混匀，搅拌1-2h,12000rpm离心10-15min，收集上清液。此次获得的上清液与新鲜的蛋黄液按1:2-5体积比在30℃以下混匀，用UP水补足上清液，搅拌1-2h，12000rpm离心10-15min，收集上清液C。合并上清液A、上清液B和上清液C。用HCI调节pH至5-5.5，搅拌混匀，加入固体氯化钠达到8-9.5％，4℃静置6-10h，
4 6
12000rpm离心10-15min，收集沉淀，纯度达到80％以上，抗体滴度达1:10-1:10。将沉淀冷冻干燥形成干粉后保存，-20℃保存一年其活力保持在90％左右。
第三次取8-20倍第二次离心获得的沉淀重量的UP水重悬第二次离心获得的沉淀，在30℃以下混匀，搅拌1-2h，12000rpm离心10-15min，收集上清液，沉淀另处理，此次获得的上清液与第一次提取离心后的沉淀在30℃以下混匀，搅拌1-2h,12000rpm离心10-15min，收集上清液。此次获得的上清液与新鲜的蛋黄液按1:2-5体积比在30℃以下混匀，用UP水补足上清液，搅拌1-2h，12000rpm离心10-15min，收集上清液C。合并上清液A、上清液B和上清液C。用HCI调节pH至5-5.5，搅拌混匀，加入固体氯化钠达到8-9.5％，4℃静置6-10h，
4 6
12000rpm离心10-15min，收集沉淀，纯度达到80％以上，抗体滴度达1:10-1:10。将沉淀冷冻干燥形成干粉后保存，-20℃保存一年其活力保持在90％左右。
[0016] 免疫产蛋鸡：将制备的重组脲酶B亚基微球疫苗在胸部以2-5点肌肉注射免疫SPF级产蛋鸡，初免剂量为200-400ug/只；间隔1-2周加强免疫一次，免疫剂量调整为100-200ug/只，第二次加强免疫后一周开始收集鸡蛋；检测抗体滴度，此后当卵黄抗体滴
4
度低于10时可进行强化免疫，免疫剂量为200-600ug/只。通过SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法检测抗体的纯度、特异性及效价滴度后，收集达到要求的鸡蛋。
4
度低于10时可进行强化免疫，免疫剂量为200-600ug/只。通过SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法检测抗体的纯度、特异性及效价滴度后，收集达到要求的鸡蛋。
[0017] 本发明的积极效果体现在：
[0018] (一)在制备疫苗过程中，采用基因工程技术实现了重组脲酶B亚基在体外大量的可溶性表达，克服了常规脲酶B亚基原核表达出现包涵体的状况，保持幽门螺杆菌脲酶B亚基的天然构象，表达水平高，后续纯化简便。采用罐组式逆流提取技术，节能减排，节省了时间，降低了成本。 制备的抗幽门螺杆菌脲酶B亚基的卵黄抗体，在体内对幽门螺杆菌感染的动物模型和病人，体现出很好的保护效果。
[0019] (二)将卵黄抗体与牛奶或酸牛奶混合，对幽门螺杆菌感染小鼠的治愈率达到94％或以上；对明确诊断因幽门螺杆菌感染的胃病病人有效率达到95％或以上。
具体实施方式：
具体实施方式：
[0020] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
[0021] 实施例1：
[0022] 一种抑制尿素酶脲酶活性卵黄抗体的制备方法，该方法包括以下步骤：将幽门螺杆菌脲酶B亚基基因1710bp DNA片段进行基因突变(突变序列见附录)，将其突变后序列亚克隆到原核表达载体，并形成融合表达质粒pET32a-ureB；将质粒pET32a-ureB转化大肠杆菌中并形成基因工程菌(该基因工程菌的菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2015年10月15日，保藏编号为CGMCC NO：11509，分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli)，应用Ni-NTA 0.1～1.0mM IPTG在20℃～30℃诱导蛋白表达，经过将基因工程菌进行分离和纯化，得到可溶形式的重组幽门螺杆菌脲酶B亚基可溶性蛋白；再将幽门螺杆菌脲酶B亚基可溶性蛋白与佐剂混合，制成重组幽门螺杆菌脲酶B亚基微球疫苗，通过2-5点肌肉免疫3-4次产蛋鸡；收集鸡蛋，采用罐组式逆流 提取蛋黄中卵黄抗体，用ELISA和Western blotting技术检测卵黄抗体的滴度和特异性。
[0023] 幽门螺杆菌脲酶B亚基片段的基因克隆及可溶形式重组脲酶B亚基蛋白的纯化：
[0024] 根据人工合成的幽门螺杆菌脲酶B亚基序列，设计一对PCR扩增引物，上游引物：F:5’CCGGAATTCATGAAAAAAATCTCTCGTAAA-3’和下游引物R:5’CCGCTCGAGCTAGAAAAT-GCTAAAGAGTTG-3’，幽门螺杆菌脲酶B亚基基因1710bp片段序列见序列表：
[0025] 以优化的幽门螺杆菌脲酶B亚基全长基因作为模板，退火温度设为57℃进行PCR扩增。回收PCR产物经EcoR I和Xho I酶切回收，与同样经过双酶切处理的pET32a(+)原核表达载体进行连接、转化。按常规方法对重组质粒进行鉴定，重组质粒命名为pET32a-UreB。将鉴定正确的重组质粒pET32a-UreB转化E.coli BL21(DE3)。次日挑取单菌落接种于
3ml含卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基，于37℃，200rpm振荡培养；过夜培养后，以
0.5-5％的接种比例接入,诱导之前发酵条件温度为37℃，搅拌转速800rpm，通气量1vvm，pH 6.0-8.0，诱导之时发酵液OD值0.6-0.8，温度为20℃～30℃，IPTG浓度0.1～1.0mM，搅拌转速800rpm，通气量1vvm，pH 6.0-8.0，诱导8h,离心收集菌体。超声破碎细胞。
4℃12000rpm离心10min，收集上清液。用Invitrogen公司Ni-NTA树脂说明书进行重组蛋白的纯化；并应用Bradford法对纯化的脲酶B蛋白进行定量分析。
3ml含卡那霉素(50ug/ml)的LB液体培养基，于37℃，200rpm振荡培养；过夜培养后，以
0.5-5％的接种比例接入,诱导之前发酵条件温度为37℃，搅拌转速800rpm，通气量1vvm，pH 6.0-8.0，诱导之时发酵液OD值0.6-0.8，温度为20℃～30℃，IPTG浓度0.1～1.0mM，搅拌转速800rpm，通气量1vvm，pH 6.0-8.0，诱导8h,离心收集菌体。超声破碎细胞。
4℃12000rpm离心10min，收集上清液。用Invitrogen公司Ni-NTA树脂说明书进行重组蛋白的纯化；并应用Bradford法对纯化的脲酶B蛋白进行定量分析。
[0026] 幽门螺杆菌脲酶B亚基片段疫苗的制备将液体石蜡和span 80a按其体积比为5-9:1，并400-600rpm机械搅拌约8-12min，混合均匀制备油相。将纯化蛋白抗原与胞壁酰二肽和脂多糖溶于20mg/ml的海藻酸钠溶液中，纯化蛋白抗原与 胞壁酰二肽和脂多糖的终浓度分别为150-550ug/ml、5-50ug/ml和5-40ug/ml，混匀，通过直径0.03-0.05mm的孔径喷雾干燥器喷出，于上述油相中搅拌，乳化3-6h，既得微球疫苗。
[0027] 抗幽门螺杆菌的卵黄抗体的制备
[0028] (1)对产蛋鸡的免疫
[0029] 将制备的疫苗对胸部肌肉4点注射免疫SPF级产蛋鸡，初免剂量为400ug/只；间隔2周加强免疫一次，免疫剂量调整为200ug/只，第三次免疫后一周开始收集鸡蛋；检测4
抗体滴度，此后当卵黄抗体滴度低于10时可进行强化免疫，免疫剂量为200ug/只。通过SDS－PAGE、Western blot和ELISA等方法检测抗体的纯度、特异性及效价滴度后，收集达到要求的鸡蛋。
抗体滴度，此后当卵黄抗体滴度低于10时可进行强化免疫，免疫剂量为200ug/只。通过SDS－PAGE、Western blot和ELISA等方法检测抗体的纯度、特异性及效价滴度后，收集达到要求的鸡蛋。
[0030] (2)抗体分离纯化第一次，在30℃以下取5L蛋黄液与15L UP水混匀,缓慢搅拌1h,12000rpm离心15min,收集上清液(A)。第二次，取第一次离心沉淀10倍重量的UP水重悬，在30℃以下混匀,搅拌1h,12000rpm离心15min,收集上清液。将此次的上清液与新鲜的蛋黄液按1:1比例在30℃以下混匀,搅拌1h,12000rpm离心15min,收集上清液(B)。第三次取10倍重量的UP水重悬第二次离心获得的沉淀，在30℃以下混匀,搅拌1h，12000rpm离心15min,收集上清液，沉淀另处理。此次获得的上清液与第二次提取离心后的沉淀在
30℃以下混匀,搅拌1h,12000rpm离心10min,收集上清液。此次获得的上清液与新鲜的蛋黄液在30℃以下混匀,搅拌1h，12000rpm离心15min,收集上清液(C)。收集A、B、C。用HCI调节pH至5-5.5，搅拌混匀，加入固体氯化钠达到8-9.5％，4℃静置6h，12000rpm离心
4 6
15min,收集沉淀，纯度达到80％以上，抗体滴度达1:10-1:10。将沉淀冷冻干燥形成干粉后保存，-20℃保存一年其活力保持在90％左右。
30℃以下混匀,搅拌1h,12000rpm离心10min,收集上清液。此次获得的上清液与新鲜的蛋黄液在30℃以下混匀,搅拌1h，12000rpm离心15min,收集上清液(C)。收集A、B、C。用HCI调节pH至5-5.5，搅拌混匀，加入固体氯化钠达到8-9.5％，4℃静置6h，12000rpm离心
4 6
15min,收集沉淀，纯度达到80％以上，抗体滴度达1:10-1:10。将沉淀冷冻干燥形成干粉后保存，-20℃保存一年其活力保持在90％左右。
[0031] 抗幽门螺杆菌的卵黄抗体纯度和效价分析
[0032] 将上述收集沉淀，用PBS溶解，并于超滤管进一步纯化和浓缩(截留分子量为100KD),收集卵黄抗体溶液(D)，按Bradford法进行蛋白定量，同时进行无菌检测。
[0033] (1)卵黄抗体纯度分析取上述C、D溶液，分别加入还原剂β-巯基乙醇的SDS-PAGE电泳上样缓冲液(参见2002年分子克隆实验指南第三版，萨姆布鲁斯著，美国)，通过12％分离胶检测实施例1中得到的抗人A组轮状的卵黄抗体的纯度；恒流15mA，凝胶用考马斯亮蓝染色。在凝胶上应用灰度扫描样品的纯度：目的条带在66KD和25KD位置，其他为杂蛋白。
[0034] (2)卵黄抗体浓度测定用Bradford蛋白浓度测定实施例2中得到的抗幽门螺杆菌卵黄抗体的浓度，并按每ml卵黄计算抗体产量。
[0035] (3)活性检测
[0036] A：ELISA间接酶联免疫实验将纯化的脲酶B重组蛋白用包被液稀释至10ug/mL，ELISA板每孔包被100μL，4℃过夜；PBST洗板后加入100μL终浓度为5％的BSA，室温封闭2h；PBST洗板后加入不同稀释倍数的纯化IgY(1∶100～1∶10000)，室温孵育2h；PBST洗板，加入1：5000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的驴抗鸡IgY(100μL孔)，37℃湿盒孵育1h；PBST洗板加TMB(100μL/孔)显色，37℃避光作用10min；加2mol/L H2SO4终止液(50μL/孔)终止反应；酶标自动分析仪450nm波长测定其光吸收值(OD450nm)。实验中试验中设不相关的带His标签蛋白为对照，吸光度OD值2倍以上为阳性标准，测定抗体滴度。
[0037] B：蛋白免疫印迹实验将脲酶B重组蛋白进行12％的SDS-PAGE凝胶电泳，利用蛋白电转移系统将蛋白转至NC膜，5％BSA室温摇床上封闭2h，加上述纯化的IgY抗体作一抗(1∶1000)，室温作用2h或4℃过夜，PBST洗涤3次，每次 10min，加入1∶5000稀释的二抗(HRP标记的羊抗鸡IgY)，室温作用1h，TBST洗涤3次，每次10min，DAB显色。试验中设不相关的带His标签蛋白为对照。结果显示为单一条带，表明制备的卵黄抗体能特异性免疫识别脲酶B抗原蛋白。
[0038] 结果表明，本发明制备的抗幽门螺杆菌的卵黄抗体，抗体滴度可达1:10000以上，且能特异性识别脲酶B蛋白。
[0039] (4)卵黄抗体体内治疗
[0040] 卵黄抗体的体内治疗：将卵黄抗体与牛奶混合，终浓度达到2mg/mL；饲喂幽门螺杆菌感染C57/B6小鼠，建立胃病动物模型；通过每天口服灌胃小鼠含卵黄抗体牛奶100μL，2周后考察病菌量，结果对小鼠病菌量明显降低，胃粘膜修复良好，治愈率达到
94％以上。进一步地，将其口服明确诊断因幽门螺杆菌感染的胃病病人20例，24小时左右病人胃胀等的不适感消失，人群有效率达到95％。
94％以上。进一步地，将其口服明确诊断因幽门螺杆菌感染的胃病病人20例，24小时左右病人胃胀等的不适感消失，人群有效率达到95％。
[0041] 进行基因突变后的幽门螺杆菌脲酶B亚基基因1710bp片段序列如下：
[0042] 1
[0043] ATGAAAAAAATCTCTCGTAAAGAATACGTTTCTATGTACGGTCCGACCACCGGTGACAAA[0044] 61
[0045] GTTCGTCTGGGTGACACCGACCTGATCGCTGAAGTTGAACACGACTACACCATCTACGGT[0046] 121
[0047] GAAGAACTGAAATTCGGTGGTGGTAAAACCCTGCGTGAAGGTATGTCTCAGTCTAACAAC[0048] 181
[0049] CCGTCTAAAGAAGAACTGGACCTGATCATCACCAACGCTCTGATCGTTGACTACACCGGT[0050] 241
[0051] ATCTACAAAGCTGACATCGGTATCAAAGACGGTAAAATCGCTGGTATCGGTAAAGGTGGT[0052] 301
[0053] AACAAAGACATGCAGGACGGTGTTAAAAACAACCTGTCTGTTGGTCCGGCTACCGAAGCT[0054] 361
[0055] CTGGCTGGTGAAGGTCTGATCGTTACCGCTGGTGGTATCGACACCCACATCCACTTCATC[0056] 421
[0057] TCACCCCAACAAATCCCTACAGCTTTTGCAAGCGGTGTAACAACCATGATTGGTGGCGGA[0058] 481
[0059] ACTGGTCCTGCTGATGGCACTAATGCGACTACTATCACTCCAGGCAGAAGAAATTTAAAA[0060] 541
[0061] TGGATGCTCAGAGCGGCTGAAGAATATTCTATGAACTTAGGTTTCTTGGCTAAAGGTAAC[0062] 601
[0063] GCTTCTAACGACGCGAGCTTAGCCGATCAAATTGAAGCTGGTGCGATTGGCTTTAAAATC[0064] 661
[0065] CACGAAGACTGGGGCACCACTCCTTCTGCAATCAATCATGCGTTAGATGTTGCAGACAAA[0066] 721
[0067] TACGATGTGCAAGTCGCTATCCACACAGACACTTTGAATGAAGCCGGTTGCGTGGAAGAC[0068] 781
[0069] ACTATGGCAGCTATTGCCGGACGCACTATGCACACTTTCCACACTGAAGGTGCTGGCGGC[0070] 841
[0071] GGACACGCTCCTGATATTATTAAAGTAGCTGGTGAACACAACATTCTTCCCGCTTCCACT[0072] 901
[0073] AACCCCACTATCCCTTTCACTGTGAATACAGAAGCAGAACACATGGACATGCTTATGGTG[0074] 961
[0075] TGCCACCACTTGGATAAAAGCATTAAAGAAGATGTTCAGTTCGCTGATTCAAGGATCCGC[0076] 1021
[0077] CCTCAAACCATTGCGGCTGAAGACACTTTGCATGACATGGGGATTTTCTCAATCACCAGC[0078] 1081
[0079] TCTGACTCTCAAGCTATGGGTCGTGTGGGTGAAGTTATCACTAGAACTTG GCAAACAGCT[0080] 1141
[0081] GACAAAAACAAAAAAGAATTTGGCCGCTTGAAAGAAGAAAAAGGCGATAACGACAACTTC
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 检测磺胺类药物的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法 | 2020-07-26 | 4 |
| 快速检测大豆Bowman-Brik胰蛋白酶抑制因子的胶体金免疫层析试纸及制备方法 | 2020-08-30 | 3 |
| 基于金属增强发光及纳米粒子标记放大的双增强化学发光免疫分析法 | 2020-10-12 | 2 |
| 苄青霉噻唑酸人工抗原及其抗体的制备方法与应用 | 2021-08-12 | 0 |
| 聚苯乙烯荧光纳米颗粒及其制备和应用 | 2021-02-26 | 2 |
| 食品中麸质过敏原的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法 | 2020-08-06 | 5 |
| HCG周期检测试剂盒及其制备方法 | 2021-03-04 | 5 |
| 克拉霉素衍生物及其制备方法与应用 | 2021-07-09 | 3 |
| 一种抗血小板溶栓素及其制备方法 | 2021-10-20 | 2 |
| GP－胸腺素α1及其制备方法 | 2021-01-14 | 4 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈