技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物检测领域，具体地说，涉及一种猪伪狂犬病毒gG的ELISA检测试剂盒。
背景技术
[0002] 伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的一种以发热、奇痒(猪除外)和脑脊髓炎为主要症状的急性传染病，常感染猪、
牛、羊、鼠等，猪是该病毒的最主要宿主，其主要引起母猪繁殖障碍，表现为流产、死胎、木乃伊胎等；新生仔猪发生感染时死亡率可达100％。该病是极难防疫的自然疫源性
疾病，因其传播速度快、死亡率高、流行范围广、传播途径多、病原体在动物体内持续感染，国际动物卫生组织(OIE)将其列为二类传染病。我国现有31个省市发生过该病，给
畜牧业造成了严重的经济损失。
[0003] 猪伪狂犬基因缺失标记
疫苗及配套
鉴别诊断试剂盒的应用是
净化根除该病的有效途径。目前，我国使用基因缺失疫苗主要为缺失gE基因的Bartha-k61株活疫苗。此外，国内自主研发的gG缺失株疫苗也已逐渐扩大市场份额，该疫苗尚无配套的
鉴别诊断试剂盒，疫苗免疫后无法用市售的检测试剂盒区分野毒感染还是疫苗免疫的猪群，因此亟需能够区分疫苗免疫和野毒感染的鉴别诊断试剂盒。
发明内容
[0004] 为了解决
现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种猪伪狂犬病毒gG的ELISA检测试剂盒。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0006] 一种猪伪狂犬病毒gG的ELISA检测试剂盒，所述试剂盒包含包被有猪伪狂犬病毒gG蛋白重组
抗原的酶标板；
[0007] 所述gG蛋白重组抗原的制备方法如下：以gG蛋白编码基因为模板，利用引物对扩增得到gG蛋白基因
片段，构建重组表达载体，通过原核系统表达gG蛋白重组抗原；
[0008] 所述引物对包括：
[0009] 上游引物：ATGAATTCAGAGAGGCCCCTCGGGA；
[0010] 下游引物：TAAAGCTTGGCCGCGGGCGAGCCCAC。
[0011] 进一步地，将所述重组表达载体转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，加IPTG进行诱导表达；将表达产物通过His-Tag镍柱亲和层析法纯化后，获得纯化的gG蛋白重组抗原。
[0012] 作为优选，所述gG蛋白重组抗原的包被量为0.1-1ug/孔。
[0013] 更进一步地，所述包被有猪伪狂犬病毒gG蛋白重组抗原的酶标板的制备方法包括如下步骤：
[0014] 1)将gG蛋白重组抗原用0.05M pH9.6的
碳酸钠缓冲液稀释gG蛋白重组抗原，加入酶标板孔中，包被量为0.1-1ug/孔；
[0015] 2)将酶标板用封板膜
覆盖，置于37℃下30分钟，然后转至4℃孵育不低于12h；
[0016] 3)弃去酶标板孔内液体，向板孔中加入孔洗涤液，静置3分钟，重复3～5次；每次洗涤时弃去孔内液体，最后一次洗涤弃去洗涤液后，将残留液体在吸
水纸上拍干；
[0017] 4)用含0.5-4％BSA、2％-8％新牛血清的0.01M pH7.4的
磷酸盐缓冲液封闭酶标板；
[0018] 5)将酶标板置于37℃下1h，孵育后将孔内液体弃去，在吸水纸上拍干；
[0019] 6)向酶标板板孔加入含5％-20％
蔗糖的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液室温孵育3-5h，弃去孔内液体，自然晾干后，用加入干燥剂的
包装袋抽
真空密封保存。
[0020] 进一步地，所述试剂盒包含酶标
抗体，所述酶标抗体为辣根过
氧化物酶标记的山羊抗猪IgG。所述酶标抗体用样品稀释液作1∶25000倍稀释，分装为25ml/瓶。
[0021] 进一步地，所述试剂盒还包括：样品稀释液、洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液A、B和终止液。
[0022] 更进一步地，所述阳性对照血清为gG蛋白重组抗原免疫猪后，采集含有gG抗体的猪血清。
[0023] 进一步地，所述样品稀释液和洗涤液中含有ProClin300作为
防腐剂。
[0024] 所述阴性对照血清为未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪血清。
[0025] 具体地，所述样品稀释液、洗涤液、底物显色液A、B和终止液的成分及含量如下：
[0026] 样品稀释液：称取NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，BSA 1.0g，ProClin300 1.0ml加蒸馏水900ml溶解，加蒸馏水定容至1000ml，分装为40ml/瓶。
[0027] 10倍浓缩洗涤液(0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液)：称取NaCl 80g，KCl 2.0g，Na2HPO4·12H2O 29g，ProClin300 1.0ml加蒸馏水900ml溶解，再加入Tween-20 5ml，加蒸馏水定容至1000ml，分装为60ml/瓶。使用时，用蒸馏水10倍稀释后即可使用。
[0028] 底物显色A液：
醋酸钠13.6g，
柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3ml，蒸馏水加至500ml，分装为15ml/瓶。
[0029] 底物显色B液：
乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，取0.15g TMB溶于3mlDMSO中，蒸馏水加至500ml，分装为15ml/瓶。
[0030] 终止液：在891.3ml蒸馏水中逐滴加入浓
硫酸(98％)108.7ml，即得2mol/L的H2SO4的水溶液，混匀后分装为15ml/瓶，室温保存。
[0031] 本发明还进一步提供了所述试剂盒在检测猪血清中gG抗体方面的应用。
[0032] 所述应用具体为：
[0033] 1)从试剂盒中取出酶标板(已包被gG蛋白重组抗原的96孔酶标板)，用样品稀释液将待检血清样本40倍稀释(例如：5ul的样品加入195ul样本稀释液)。用移液器吸取100ul
混合液至酶标板中，同时设置阳性对照血清及阴性对照血清各两孔，每孔100ul；
[0034] 2)在37℃条件下孵育60分钟；
[0035] 3)弃去孔内液体，向孔板中加入大约300ul/孔洗涤液(10倍浓缩液用蒸馏水稀释为1倍工作液)，静置3分钟，重复3-5次。每次洗涤时都应弃去孔内液体，最后一次洗涤弃去洗涤液后，将残留液体在吸水纸上拍干；
[0036] 4)每孔加入100ul酶标抗体；
[0037] 5)在37℃条件下孵育30分钟；
[0038] 6)重复步骤3)；
[0039] 7)每孔加入底物显色液A和底物显色液B各50ul，轻微震荡混匀，避免孔内液体溢出；
[0040] 8)在37℃条件下孵育15分钟；
[0041] 9)每孔加入50ul终止液，使反应终止；
[0042] 10)测量并记录被检样品和对照的OD值(450nm)。
[0043] 本发明试剂盒判定标准：阴性对照的平均值OD450nm小于0.25，阳性对照的平均值大于1.0试验方能有效。S＝样品OD450nm值，P＝阳性对照的OD450nm平均值，[0044] 如果S/P值大于0.5，样品应判定为猪伪狂犬病毒gG抗体阳性。如果S/P值小于或等于0.5，但大于0.4，样品应重测。如试验结果不变，应间隔一定时间后重新
采样检测。如果S/P值小于0.5，样品应判定为猪伪狂犬病毒gG抗体阴性。如果试验无效，试验操作可能有误，试验应重做。
[0045] 本发明的有益效果在于：
[0046] 本发明应用原核系统表达猪伪狂犬病毒gG蛋白重组抗原，包被酶标板制备ELISA检测试剂盒，可区分gG基因缺失疫苗株免疫与野毒感染的抗体检测，可为gG缺失疫苗株提供鉴别诊断技术。该方法具有敏感性高、特异性强的特点，且方法操作简单、检测时间短，2小时内即可出判定结果，为净化根除伪狂犬病提供有
力保障。
具体实施方式
[0047] 以下
实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0048] 实施例1 gG蛋白重组抗原的制备
[0049] 1)提取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组，根据GenBank上发表的猪伪狂犬病毒中国流行株基因序列，针对gG蛋白编码基因的主要抗原位点区域设计扩增引物：
[0050] 上游引物：ATGAATTCAGAGAGGCCCCTCGGGA；
[0051] 下游引物：TAAAGCTTGGCCGCGGGCGAGCCCAC。
[0052] 2)以PRV基因组为模板，根据上述引物扩增gG蛋白基因片段，将gG基因片段克隆到T载体上，然后再将基因插入克隆载体pET-32a，构建重组表达载体，命名为pET32a-gG。
[0053] 3)将构建的pET32a-gG重组表达载体转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，加IPTG进行诱导表达。
[0054] 4)将表达产物通过His-Tag镍柱亲和层析法纯化后，获得纯化的gG蛋白重组抗原。
[0055] 实施例2 包被gG蛋白重组抗原的酶标板的制备
[0056] 1)将实施例1得到的纯化后的gG蛋白重组抗原，用0.05M pH9.6碳酸钠缓冲液稀释重组抗原，稀释终浓度为5.6ug/ml，吸取稀释后的重组抗原加入酶标板孔中，每孔100ul，即包被量为0.56ug/孔。
[0057] 2)包被条件：将酶标板用封板膜覆盖，置于37℃30分钟，然后转至4℃过夜孵育(不低于12h)。
[0058] 3)弃去酶标板孔内液体，然后向板孔中加入大约300ul/孔洗涤液(10倍浓缩液用蒸馏水10倍稀释为工作液)，静置3分钟，重复3-5次。每次洗涤时都应弃去孔内液体，最后一次洗涤弃去洗涤液后，将残留液体在吸水纸上拍干。
[0059] 4)封闭：用含2％BSA(
质量浓度)、5％新牛血清(体积浓度)的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液封闭酶标板，每孔100ul。
[0060] 5)封闭条件：将上述加入封闭液的酶标板置于37℃ 1h，孵育后将孔内液体弃去，在吸水纸上拍干。
[0061] 6)将酶标板孔加入含5％蔗糖(质量浓度)的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液室温孵育3h，弃去孔内液体，自然晾干后，酶标板用加入干燥剂的包装袋抽真空密封保存。
[0062] 实施例3 猪伪狂犬病毒gG的ELISA检测试剂盒的制备
[0063] 1、材料：
[0064] 除实施例2制备的包被gG蛋白重组抗原的酶标板外，试剂盒还包括样品稀释液、10倍浓缩洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显色液A、B、酶标抗体，终止液。
[0065] 2、制备方法
[0066] 1)样品稀释液制备：称取NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O2.9g，BSA 1.0g，ProClin300 1.0ml加蒸馏水900ml溶解，加蒸馏水定容至1000ml，分装为40ml/瓶。
[0067] 2)10倍浓缩洗涤液(0.1M pH7.4磷酸盐缓冲液)：称取NaCl 80g，KCl 2.0g，Na2HPO4·12H2O 29g，ProClin300 1ml加蒸馏水900ml溶解，再加入Tween-20 5ml，加蒸馏水定容至1000ml，分装为60ml/瓶。
[0068] 3)阴性对照血清制备：采集未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪血清，以上述样品稀释液作20倍稀释，分装1ml/瓶。
[0069] 4)阳性对照血清制备：以gG蛋白重组抗原免疫猪后，采集含有gG抗体的猪血清，以上述样品稀释液作20倍稀释制备猪阳性对照血清，分装1ml/瓶。
[0070] 5)底物显色液制备：
[0071] 底物显色A液：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，30％双氧水0.3ml，蒸馏水加至500ml，分装为15ml/瓶。
[0072] 底物显色B液：乙二胺四乙酸二钠0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，取0.15g TMB溶于3mlDMSO中，蒸馏水加至500ml，分装为15ml/瓶。
[0073] 6)酶标抗体制备：商品化辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG，用样品稀释液作1∶25000倍稀释，分装为25ml/瓶。
[0074] 7)终止液制备：
[0075] 在891.3ml蒸馏水中逐滴加入浓硫酸(98％)108.7ml，即得2mol/L的H2SO4的水溶液，混匀后分装为15ml/瓶，室温保存。
[0076] 8)试剂盒组装：
[0077] 根据上述制备方法制备各组分，按每个试剂盒配置包被密封的酶标板2
块，样品稀释液、10倍浓缩洗涤液、阴性对照血清、阳性对照血清、底物显示液A，底物显色液B、酶标抗体、终止液各1瓶，及操作
说明书1份进行装盒。
[0078] 实施例4 猪伪狂犬病毒gG-ELISA检测试剂盒的应用
[0079] 1)从试剂盒中取出酶标板，用样品稀释液将待检血清样本40倍稀释(例如：5ul的样品加入195ul样本稀释液)。用移液器吸取100ul混合液至酶标板中，同时设置阳性对照血清及阴性对照血清各两孔，每孔100ul。
[0080] 2)在37℃条件下孵育60分钟。
[0081] 3)弃去孔内液体，向孔板中加入大约300ul/孔洗涤液(10倍浓缩液用蒸馏水作10倍稀释为1倍工作液)，静置3分钟，重复3-5次。每次洗涤时都应弃去孔内液体，最后一次洗涤弃去洗涤液后，将残留液体在吸水纸上拍干。
[0082] 4)每孔加入100ul酶标抗体。
[0083] 5)在37℃条件下孵育30分钟。
[0084] 6)重复步骤3。
[0085] 7)每孔加入底物显色液A和底物显色液B各50ul，轻微震荡混匀，避免孔内液体溢出。
[0086] 8)在37℃条件下孵育15分钟。
[0087] 9)每孔加入50ul终止液，使反应终止。
[0088] 10)测量并记录被检样品和对照的OD值(450nm)。
[0089] 本发明试剂盒判定标准：阴性对照的平均值OD450nm小于0.25，阳性对照的平均值大于1.0试验方能有效。S＝样品OD450nm值，P＝阳性对照的OD450nm平均值，[0090] 如果S/P值大于0.5，样品应判定为猪伪狂犬病毒gG抗体阳性。如果S/P值小于或等于0.5，但大于0.4，样品应重测。如试验结果不变，应间隔一定时间后从新采样，检测。如果S/P值小于0.4，样品应判定为猪伪狂犬病毒gG抗体阴性。
[0091] 实施例5 猪伪狂犬病毒gG-ELISA检测试剂盒特异性检测
[0092] 应用猪伪狂犬病、猪乙型脑炎、
猪瘟、猪呼吸与繁殖障碍综合征、猪细小病毒，猪
口蹄疫(O型)的标准阳性血清及猪伪狂犬病阴性血清，以猪伪狂犬病毒gG-ELISA检测试剂盒进行检测。检测结果如下表，结果显示：猪伪狂犬病标准阳性血清S/P值为1.0>阳性判定临界值0.5，其余S/P值均显著低于阴性临界值0.4。表明该试剂盒检测特异性良好。
[0093] 表1 猪伪狂犬病毒gG-ELISA检测试剂盒血清特异性检测结果
[0094]血清名称 PRV JEV CSFV PRRSV PPV FMD PRV阴性血清
S/P 1.16 0.18 0.19 0.14 0.20 0.14 0.15
OD450nm 1.45 0.22 0.24 0.18 0.25 0.17 0.19
[0095] 对比例1不同gG蛋白重组抗原酶标板检测效果比较
[0096] 一、gG2，gG3蛋白重组抗原制备
[0097] 1)与实施例1同理：提取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组，根据GenBank上发表的猪伪狂犬病毒中国流行株基因序列，针对gG蛋白编码基因的主要抗原位点区域设计了两对扩增引物：
[0098] gG2上游引物：ATGAATTCAAGTGGGCAACGTGGATCCT
[0099] gG2下游引物：TAAAGCTTGTCGTAGTAGTCGGCGTAGTCG
[0100] gG3上游引物：ATGAATTCGCCACCCTCCCGCCCATC
[0101] gG3下游引物：TAAAGCTTTCAGGCGGAGGCCACGT
[0102] 2)以PRV基因组为模板，根据上述引物扩增gG蛋白基因片段，将gG基因片段克隆到T载体上，然后再将基因插入克隆载体pET-32a，构建重组表达载体，分别命名为pET32a-gG2，pET32a-gG3。
[0103] 3)将构建的pET32a-gG2，pET32a-gG3重组表达载体转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中，加IPTG进行诱导表达。
[0104] 4)将表达产物通过His-Tag镍柱亲和层析法纯化后，获得纯化的gG2，gG3蛋白重组抗原。
[0105] 二、包被gG2，gG3蛋白重组抗原的酶标板的制备(与实施例2同理)[0106] 1)将实施例1得到的纯化后的gG2，gG3蛋白重组抗原，用0.05MpH9.6碳酸钠缓冲液稀释重组抗原，稀释终浓度为5.6ug/ml，吸取稀释后的重组抗原加入酶标板孔中，每孔100ul，即包被量为0.56ug/孔。
[0107] 2)包被条件：将酶标板用封板膜覆盖，置于37℃30分钟，然后转至4℃过夜孵育(不低于12h)。
[0108] 3)弃去酶标板孔内液体，然后向板孔中加入大约300ul/孔洗涤液(10倍浓缩液用蒸馏水10倍稀释为工作液)，静置3分钟，重复3-5次。每次洗涤时都应弃去孔内液体，最后一次洗涤弃去洗涤液后，将残留液体在吸水纸上拍干。
[0109] 4)封闭：用含2％BSA(质量浓度)、5％新牛血清(体积浓度)的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液封闭酶标板，每孔100ul。
[0110] 5)封闭条件：将上述加入封闭液的酶标板置于37℃ 1h，孵育后将孔内液体弃去，在吸水纸上拍干。
[0111] 6)将酶标板孔加入含5％蔗糖(质量浓度)的0.01M pH7.4的磷酸盐缓冲液室温孵育3h，弃去孔内液体，自然晾干后，酶标板用加入干燥剂的包装袋抽真空密封保存备用。
[0112] 三、三种gG蛋白重组抗原包被酶标板用于临床样本敏感性及特异性检测比较[0113] 应用确诊为PRV抗体阳性血清56份及猪伪狂犬病阴性血清38份，均以猪伪狂犬病毒gG-ELISA检测试剂盒进行检测，比较三种不同抗原检测效果。检测结果如下表2-4，结果显示：本发明所述gG重组蛋白酶标板检测敏感性及特异性均优于gG2，gG3重组蛋白抗原酶标板。
[0114] 表2
[0115]
[0116] 表3
[0117]
[0118] 表4
[0119]
[0120] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明
基础上，可以对之作一些
修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
