用于淋巴靶向的方法和装置
阅读：992发布：2020-08-05
专利汇可以提供用于淋巴靶向的方法和装置专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及包括 生物 相容和可 生物降解 基质的可植入装置，所述基质浸渍有适合选择性地靶向淋巴系统的生物活性复合物，其中所述生物活性复合物包括一种或多种颗粒形成材料和一种或多种生物活性剂。本发明还涉及所述可植入装置的使用方法和制备方法。，下面是用于淋巴靶向的方法和装置专利的具体信息内容。
1.一种可植入装置，包括：
生物相容并且可生物降解的基质，其浸渍有适合选择性地靶向淋巴系统的生物活性复合物，
其中所述生物活性复合物包括一种或多种颗粒形成材料和一种或多种生物活性剂，所述颗粒形成材料和所述生物活性剂形成适合选择性地靶向淋巴系统的颗粒，其中所述颗粒具有足够的尺寸以选择性地靶向淋巴系统，并且所述足够的尺寸是指所述颗粒能够经过淋巴管迁移或被保留在淋巴结内的尺寸。
2.权利要求1的可植入装置，其中所述颗粒的尺寸为0.3μm至11.2μm。
3.权利要求1的可植入装置，其中所述颗粒的尺寸为0.7μm至2μm。
4.权利要求1的可植入装置，其中所述一种或多种生物活性剂是治疗药物。
5.权利要求1的可植入装置，其中所述一种或多种生物活性剂选自放射性同位素、光敏剂、放射致敏剂、辐射防护剂、光动力剂、中子俘获剂、抗原、疫苗、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽、生物反应调节剂、抗微生物药和抗增殖药。
6.权利要求1的可植入装置，其中所述一种或多种生物活性剂选自抗增殖药、抗肿瘤药和抗肿瘤转移药。
7.权利要求6的可植入装置，其中所述抗增殖药、抗肿瘤药和抗肿瘤转移药选自微管稳定药、烷化剂、抗代谢药、替尼泊苷、抗肿瘤酶、拓朴异构酶抑制剂、丙卡巴肼、米托蒽酯、铂配合物、生物反应调节剂和生长抑制剂以及造血生长因子。
8.权利要求6的可植入装置，其中所述抗肿瘤药选自蒽环霉素类药物、长春花属药物、丝裂霉素类药物、博来霉素类药物、细胞毒性核苷类、紫杉烷类、大环内酯类、盘皮海绵内酯、蝶啶类药物、二炔烯类和鬼臼毒素类。
9.权利要求6的可植入装置，其中所述生物活性剂选自多柔比星、洋红霉素、柔红霉素、氨蝶呤、甲氨蝶呤、甲喋呤、二氯-甲氨蝶呤、丝裂霉素C、泊非霉素、曲妥单抗(Herceptin.TM.)、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、吉西他滨、阿糖胞苷、鬼臼毒素、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、美法仑、长春碱、长春新碱、异长春碱、长春地辛、环氧长春碱、紫杉醇、雌莫司汀、顺铂、卡铂、环磷酰胺、博来霉素、吉西他滨、异环磷酰胺、美法仑、六甲蜜胺、塞替派、阿糖胞苷、依达曲沙、三甲曲沙、达卡巴嗪、L-天冬酰胺酶、喜树碱、CPT-11、托泊替康、吡啶并苯并引哚衍生物、干扰素和白介素。
10.权利要求9的可植入装置，其中所述生物活性剂选自紫杉醇和多柔比星。
11.权利要求1的可植入装置，其中所述生物活性剂选自氮芥类、烷基磺酸酯、亚硝基脲、三氮烯、抗代谢药、替尼泊苷、抗生素、取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质激素抑制剂、肾上腺皮质类固醇、孕酮、雌激素、抗雌激素和雄激素。
12.权利要求1的可植入装置，其中所述生物活性剂选自激素和拮抗剂。
13.权利要求1的可植入装置，其中所述生物活性剂选自酶、氮芥、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链佐星、达卡巴嗪、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、长春花属生物碱、长春碱、长春新碱、长春地辛、依托泊苷、替尼泊苷、放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、L-天冬酰胺酶、羟基脲、丙卡巴肼、米托坦、氨鲁米特、肾上腺皮质类固醇、泼尼松、己酸羟孕酮、醋酸甲氧孕酮、醋酸甲地孕酮、己烯雌酚、炔雌醇、他莫昔芬、丙酸睾酮和氟甲睾酮。
14.权利要求1的可植入装置，其中所述生物活性剂选自淋巴管发生抑制剂、血管发生抑制剂、细胞生长抑制剂、抗氧化剂、细胞因子、趋化因子、反义寡核苷酸、导向淋巴管的LyP-1肽包裹的量子点、激素和激素拮抗剂。
15.权利要求14的可植入装置，其中所述生物活性剂选自血管内皮生长因子C、
D(VEGF-C、D)抗体、VEGF-C、D受体的抗体、和表皮生长因子受体(EGFR)抗体。
16.权利要求1的可植入装置，其中所述颗粒形成材料选自生物相容的聚合物、脂质、脂质体、金属颗粒、磁性颗粒、生物素、抗生物素蛋白和多糖。
17.权利要求16的可植入装置，其中所述颗粒形成材料选自聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乳酸-共-己内酯、聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚苯乙烯、聚乳酸-嵌段-聚乙二醇、聚乙醇酸-嵌段-聚乙二醇、聚丙交酯-共-聚乙交酯-嵌段-聚乙二醇、聚乙二醇-嵌段-脂质、聚乙烯醇(PVA)、聚酯、聚(膦嗪)、多糖、多糖衍生物、聚透明质酸、聚藻酸、多肽、聚赖氨酸、聚谷氨酸、聚酸酐、蛋白质、聚丙烯酰胺(PAA)、及其衍生物和混合物。
18.如权利要求17的可植入装置，其中所述聚酯是聚(原酸酯)、聚(磷酸酯)、聚己内酯、或聚羟基烷酸酯。
19.如权利要求17的可植入装置，其中所述多糖是壳多糖、壳聚糖、纤维素、或糖胺聚糖。
20.如权利要求19的可植入装置，其中所述纤维素是羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、或羧甲基纤维素。
21.如权利要求17的可植入装置，其中所述多糖衍生物是壳聚糖衍生物。
22.如权利要求18的可植入装置，其中所述聚羟基烷酸酯是聚羟基戊酸酯、或聚羟基丁酸酯。
23.如权利要求17的可植入装置，其中所述蛋白质是白蛋白、明胶或胶原。
24.权利要求17的可植入装置，其中所述颗粒形成材料为PLGA。
25.权利要求1的可植入装置，其中所述生物活性复合物包括添加剂。
26.权利要求25的可植入装置，其中所述添加剂选自佐剂、衣料、色素、粘合剂、缓冲剂、润滑剂、崩解剂、增塑剂和稳定剂。
27.权利要求1的可植入装置，其中所述生物活性剂包括PLGA和紫杉醇或脂质和多柔比星的微粒。
28.权利要求1的可植入装置，其中所述生物相容并且可生物降解的基质在一段时间内降解以在一段时间内释放所述生物活性复合物。
29.权利要求28的可植入装置，其中所述生物相容并且可生物降解的基质在几小时至
1年的时间内降解。
30.权利要求29的可植入装置，其中所述生物相容并且可生物降解的基质在几天至几周的时间内降解。
31.权利要求1的可植入装置，其中所述生物相容并且可生物降解的基质是可成形的。
32.权利要求1的可植入装置，其中所述生物相容并且可生物降解的基质为选自海绵、薄片、薄膜、丝网、拭子、棉塞和衬垫的形式。
33.权利要求1的可植入装置，其中所述生物相容并且可生物降解的基质是水凝胶薄膜。
34.权利要求1的可植入装置，其中所述生物相容并且可生物降解的基质选自明胶、胶原、明胶-藻酸盐。
35.权利要求1的可植入装置，其中所述生物相容并且可生物降解的基质包含添加剂。
36.权利要求35的可植入装置，其中所述添加剂是可通过X-射线检测的不透射线的材料。
37.权利要求1的可植入装置，其中将所述一种或多种游离生物活性剂加入所述生物相容和可生物降解的基质中。
38.权利要求1的可植入装置，其中所述基质是交联的。
39.权利要求1的可植入装置，其中全身递送的生物活性剂浓度小于递送至淋巴系统的生物活性剂浓度。
40.权利要求1至39中任一项的可植入装置在制备用于治疗选自瘤形成和微生物感染的疾病或病症的药物中的应用，其中所述可植入的装置包括有效量的生物活性剂以治疗所述疾病。
41.权利要求40的应用，其中所述微生物感染是细菌感染或病毒感染。
42.权利要求40或41的应用，其中所述可植入装置被设计成植入胸膜腔、腹膜腔、皮下组织间隙、阴道或直肠以及淋巴结或淋巴组织因手术治疗需要被清扫或摘除后残留的组织间隙。
43.权利要求40的应用，其中所述疾病或病症是瘤形成。
44.权利要求40的应用，其中所述疾病或病症选自肺癌、卵巢癌、食道癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃肠癌、肝癌、胰腺癌、头颈部癌、皮肤癌、淋巴瘤、肉瘤、胸腺瘤、间皮瘤、淋巴转移、前列腺癌、丝虫病、布鲁杆菌病、肺结核和HIV感染。
45.权利要求40的应用，其中所述疾病或病症选自肺癌和肺癌的淋巴转移。
46.权利要求1至39中任一项的可植入装置在制备用于将生物活性剂输送到对象的淋巴系统的药物中的应用，其中所述可植入装置包括有效量的生物活性剂。
47.权利要求46的应用，其中所述可植入装置被设计成植入胸腹腔、腹膜腔、皮下组织间隙、阴道或直肠以及淋巴结或淋巴组织因手术治疗需要被清扫或摘除后残留的组织间隙。
48.权利要求46或47的应用，其中所述生物活性剂用于治疗或预防瘤形成。
49.权利要求48的应用，其中所述瘤形成是癌症。
50.权利要求49的应用，其中所述癌症选自肺癌、卵巢癌、食道癌、乳腺癌、结肠直肠癌、胃肠癌、肝癌、胰腺癌、头颈部癌、皮肤癌、淋巴瘤、肉瘤、胸腺瘤、间皮瘤和前列腺癌。
51.权利要求46或47的应用，其中所述生物活性剂用于治疗或预防淋巴系统转移。
52.一种使用γ闪烁造影法、正电子发射断层成像(PET)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、磁共振成像(MRI)、X-射线、计算机辅助的X-射线断层成像(CT)、近红外光谱或超声使淋巴系统成像或可视化的方法，所述方法包括将权利要求1的可植入装置给予对象，并进行γ闪烁造影法、正电子发射断层成像(PET)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、磁共振成像(MRI)、X-射线、计算机辅助的X-射线断层成像(CT)、近红外光谱或超声，以使淋巴系统成像或可视化，其中所述可植入装置包括作为合适的造影剂或显像剂的生物活性剂。
53.权利要求52的方法，其中所述造影剂或显像剂选自铁磁材料、全氟化学品、染料、发射γ的放射性标记物和发射正电子的放射性标记物。
54.权利要求52或53的方法，其中使前哨淋巴结可视化或成像。
55.权利要求1的可植入装置在使用γ闪烁造影法、正电子发射断层成像(PET)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、磁共振成像(MRI)、X-射线、计算机辅助的X-射线断层成像(CT)、近红外光谱或超声光谱使淋巴系统可视化或成像中的应用，其中所述可植入装置包括作为合适的造影剂或显像剂的生物活性剂。
56.权利要求55的应用，其中所述造影剂或显像剂选自铁磁材料、全氟化学品、染料、发射γ的放射性标记物和发射正电子的放射性标记物。
57.权利要求55或56的应用，其中使前哨淋巴结可视化或成像。
58.一种制备权利要求1至39中任一项的可植入装置的方法，该方法包括：
a)在合适的溶剂内混合生物活性剂和颗粒形成材料，以形成溶液或悬浮液；
b)将所述溶液或悬浮液喷雾干燥以形成所述生物活性复合物的颗粒；
c)在合适的溶剂内将b)中形成的所述颗粒与适合形成生物相容性基质的生物相容性聚合物混合；
d)除去c)的溶剂以形成所述可植入装置。
用于淋巴靶向的方法和装置
技术领域
[0001] 本发明涉及能够将治疗药物递送并保留在经常受到癌症和其它疾病侵扰的解剖结构——淋巴系统——内的新型靶向药物传递系统。尤其是，本发明涉及将与微粒和/或纳米颗粒载体联合配制的治疗药物靶向递送至淋巴管(lymphatics)和淋巴结，还涉及包含所述颗粒载体的可植入装置。本发明还涉及这些可植入装置作为例如癌症的治疗手段的治疗方法和应用。
背景技术
[0002] 淋巴系统是由丰富的薄壁脉管和淋巴结组成一个广大的网络，几乎渗透体内的每个解剖学位置。淋巴系统的主要作用是将血浆蛋白、颗粒物质和细胞从组织液转运回血流。此外，淋巴系统还主动清除细胞碎片、微生物、和肿瘤细胞。许多疾病会影响到淋巴系统，如果能够将药物更有效地递送到淋巴系统，其中相当一部分疾病可能会得到有效控制。 [0003] 肿瘤细胞一旦侵入淋巴系统，就有机会被带到局部淋巴结，进而在那里生长形成次发性肿瘤(转移)。由于淋巴系统和静脉系统之间有着极为广泛的交互联络，所以淋巴系统内的肿瘤通常会有机会通过血道扩散到其它器官。
[0004] 对于绝大多数癌症，转移性疾病往往最早累及区域淋巴结，这是肿瘤发展的共同标志。在评估癌症患者的治疗方案选择时，淋巴结转移被认为是估测预后最重要的因素之一。肿瘤细胞一旦累及淋巴系统，淋巴结就可能成为癌细胞生根并播种这些细胞到身体其i它区域的一个贮库 。即使是那些已经接受了所谓根治手术的患者仍然具有极大的复发和继而死亡的可能性，这可能应部分地归咎于淋巴系统内的微转移。
[0005] 大约百分之二十的美国人死于罹患癌症，其中一半是由肺癌、结肠直肠癌和乳腺癌所致。肺癌是导致男性和女性癌症死亡的首要原因。尽管近期在肺癌的治疗上取得了一些进展，但5-年生存率仍低于15％。其分期、 预后和治疗方案的选择都与淋巴系统受癌影响的程度密切相关。淋巴转移一旦发生，肺癌治愈的机会就显著下降。对于非小细胞肺癌(NSCLC)，如果肺内淋巴结发生了癌转移，术后存活率基本减半，如果癌累及紧邻肺外(纵隔)的淋巴结，术后存活率又会再度减半。即使患有早期疾病的患者已经接受了有效的根ii治手术，却仍然具有肿瘤复发和继而死亡的极大可能 。大约30％患有早期NSCLC的患者iii，iv
会在手术后癌症复发 。这一现象提示在病人接受手术时，那些不能用现有肿瘤分期技术和常规组织病理学方法检测到的隐蔽的微转移肿瘤细胞很可能已经传播到了区域淋巴结或远处的器官。
会在手术后癌症复发 。这一现象提示在病人接受手术时，那些不能用现有肿瘤分期技术和常规组织病理学方法检测到的隐蔽的微转移肿瘤细胞很可能已经传播到了区域淋巴结或远处的器官。
[0006] 结肠直肠癌有着显著的发病率和死亡率。对于淋巴结转移的精确评价关乎到该病v的预后和治疗的重要性 。外科手术仍然是治疗局部结肠直肠癌的主要手段。但若不接受额外的辅助治疗，50％的手术治疗患者会死于复发和转移。对于III期疾病，用基于氟尿嘧啶的方案进行全身辅助化疗只能获得相当有限的5-年存活率的改善。
[0007] 同样，淋巴结转移是评价乳腺癌患者预后最重要的因素之一。它与无病存活和总vi体存活的相关性优于其它任何预后因素 。多至三分之一患有浸润性乳腺癌的女性在诊断时已被发现有淋巴结转移。五年存活率从无淋巴结转移患者的80％下降至具有淋巴结转移患者的45至50％。
[0008] 淋巴瘤是淋巴系统的原发性肿瘤，可能涉及全身各部位的淋巴结。用全身化疗可以有效地治疗许多淋巴瘤。然而，一些恶性程度高的淋巴瘤会在初始治疗有良好反应的基础上变得耐受标准化疗，进而导致复发。
[0009] 控制淋巴转移可以改善许多癌症的治疗效果。目前，局部-区域性(local-regional)疗法，例如手术和放射疗法是治疗区域淋巴疾病的最有效方式，但通常不能完全清除所有的淋巴转移性疾病。全身化疗受到全身副作用的限制，并且可能鉴于“血液-淋巴屏障”的缘故，药物通常不能有效地渗入淋巴系统。当接受广泛的癌症手术后，因局部血管和淋巴管受到阻断，淋巴系统获取药物的能力受到进一步的影响。目前，缺少特异性的针对淋巴转移的有效靶向治疗。因此，显然需要那些基于更好地理解淋巴系统的病理生理特性的有效措施来改善淋巴系统肿瘤的治疗。
[0010] 由于淋巴系统具有清除外来颗粒物质的独特生理功能，这一特性引发了我们使用微粒作为药物载体将治疗药物靶向区域淋巴结的兴趣。胶粒体不仅在探究表征淋巴系统的属性时具有重要作用而且可用来递送药物。与 此一致的是，发现经组织间隙给予的胶粒主要由淋巴系统吸收并在区域淋巴结内有不同程度地累积。Strand等已经综述了胶粒作为放vii射诊断剂的应用 。其中检查了许多的材料，包括固体颗粒、乳液和囊泡(脂质体)。它们的分布主要取决于微粒的大小，有报道提示用于淋巴系闪烁造影术的胶粒体约为40-60nm的中值粒径。例如，在皮下注射微胶粒后摄入区域淋巴结的量较少，在2-5小时后通常为viii ix，x，xi
1-10％ 。这种独特的选择性生物分布导致研制了胶体材料如脂质体 、活性炭颗粒xii，xiii xiv，xv xvi xvii，xviii
、乳液 、脂质 和聚合颗粒 作为药物载体。
1-10％ 。这种独特的选择性生物分布导致研制了胶体材料如脂质体 、活性炭颗粒xii，xiii xiv，xv xvi xvii，xviii
、乳液 、脂质 和聚合颗粒 作为药物载体。
[0011] 腹膜和胸膜是分别覆盖腹膜腔和胸膜腔内表面以及它们所含的许多器官和组织表面的薄膜。腹膜和胸膜两者都富含淋巴管。在胸膜腔中，肺和胸膜的淋巴引流(lymph drainage)之间有许多连接，尤其是在纵隔。同样，在腹膜和内脏淋巴引流之间也发现了广泛的交通。淋巴引流方向趋于朝向经常发生淋巴转移的那些区域淋巴结。这些互联的淋巴管道为开发淋巴靶向策略提供了坚实的生理学基础。
[0012] 壁层胸膜富集毛细淋巴管。许多淋巴管开口直接通向胸膜腔(pleuralspace)，使xix得颗粒物质易于进入淋巴管中。Shinohara H. 使用扫描电镜检查了金黄地鼠的胸膜局部解剖结构。在每个胸膜腔中查找到了约1,000个淋巴孔。壁层胸膜淋巴管通过多重途径将淋巴回流至胸部区域淋巴结。通过肺切除术从而消除脏胸膜淋巴管的作用，本发明人提示xx
胸膜腔微粒的吸收主要是通过壁胸膜进行的 。颗粒如何在淋巴管内转运的确切机理尚不清楚。一种解释是颗粒被单核细胞、尤其是巨噬细胞吞噬并运载到区域淋巴结。 [0013] 在治疗卵巢癌、食道癌、和乳腺癌时，有人已经试图将抗癌药递送到区域淋巴结。
在这些研究中，碳颗粒或硅石颗粒被用作为药物载体，经皮下(s.c.)或肿瘤内注射。实验研究和早期临床试验均揭示这样的给药途径可致可观的药物量在淋巴结内积聚，同时减少xxi
了血浆内的细胞毒性药物水平 。通常情况下，静脉内(i.v.)给予的微胶粒不大可能被淋巴系统吸收，因为胶粒体的大小阻止其通透过毛细血管壁。在i.v.给药后，这些颗粒主要被肝脏和脾的巨噬细胞吸收。由此可见，经血道给予，药物载体的命运基本上难以改变，除非选择不同的给药途径。
胸膜腔微粒的吸收主要是通过壁胸膜进行的 。颗粒如何在淋巴管内转运的确切机理尚不清楚。一种解释是颗粒被单核细胞、尤其是巨噬细胞吞噬并运载到区域淋巴结。 [0013] 在治疗卵巢癌、食道癌、和乳腺癌时，有人已经试图将抗癌药递送到区域淋巴结。
在这些研究中，碳颗粒或硅石颗粒被用作为药物载体，经皮下(s.c.)或肿瘤内注射。实验研究和早期临床试验均揭示这样的给药途径可致可观的药物量在淋巴结内积聚，同时减少xxi
了血浆内的细胞毒性药物水平 。通常情况下，静脉内(i.v.)给予的微胶粒不大可能被淋巴系统吸收，因为胶粒体的大小阻止其通透过毛细血管壁。在i.v.给药后，这些颗粒主要被肝脏和脾的巨噬细胞吸收。由此可见，经血道给予，药物载体的命运基本上难以改变，除非选择不同的给药途径。
[0014] 脂质体、乳液和各种非脂质颗粒系统已经试图被使用于靶向淋巴结递送药物。脂质体是具有多功能、无毒和生物相容的脂质囊泡，是最受关注 的能承载各种药物的载体。对于脂质体系统来说，，据记载淋巴结最佳吸收程度是48小时达到1-2％。通过结合抗体可将其吸收提高至大约5％。
[0015] 至今关于使用聚合物作为淋巴靶向的药物传递系统的信息极其有限。虽然聚丙交xxii酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)及其共聚物(PLGA)已经被开发应用于局部递送化疗药 ，但它xxiii
们的根本设计目的是用于治疗癌性腹膜炎而不是靶向淋巴转移 。聚合物微球能被淋巴xxiv xxv
系统吸收是实验过程中的一个偶然发现 。一种特别经皮下(s.c.)注射用于淋巴靶向xxvi
的PLGA纳米球药物传递系统已研制成功 。其粒径小于100nm。所述PLGA颗粒的表面设计附有PLA:PEG(聚乙二醇)以利于提高颗粒从注射部位引流到区域淋巴结。
们的根本设计目的是用于治疗癌性腹膜炎而不是靶向淋巴转移 。聚合物微球能被淋巴xxiv xxv
系统吸收是实验过程中的一个偶然发现 。一种特别经皮下(s.c.)注射用于淋巴靶向xxvi
的PLGA纳米球药物传递系统已研制成功 。其粒径小于100nm。所述PLGA颗粒的表面设计附有PLA:PEG(聚乙二醇)以利于提高颗粒从注射部位引流到区域淋巴结。
[0016] 新近研制的含有多柔比星的聚合物-脂质混杂纳米颗粒复合物(PLN-Dox)已经显示可提高对野生型和多药耐药(MDR)型人乳腺肿瘤细胞系的体外细胞毒性。PLN-Dox显示xxvii xxviii出具有对P-糖蛋白(P-gp)过度表达细胞系更高的体外细胞毒性 。
[0017] 由于胸膜的独特解剖结构和生理特性，颗粒放置到胸膜腔后的生物分布还没有得到充分研究。文献报道在使用滑石浆胸膜固定术控制胸腔积液的常规治疗后，偶然发现滑xxix xxx石粉颗粒被区域淋巴结所吸收 。人体研究和动物实验都揭示置于胸膜腔内的滑石粉xxxi
颗粒可能通过胸膜淋巴管迁移到纵隔淋巴结 。最近，有研究试图通过胸膜腔内给予将脂xxxii 111 99
质体靶向到纵隔淋巴结 。使用闪烁造影成像测定了 铟-抗生物素蛋白和 mTc-生物
111
素-脂质体的药代动力学和纵隔淋巴结吸收。 铟-抗生物素蛋白在给药44小时后的生物分布结果显示，通过胸膜注射的纵隔淋巴结吸收为注射剂量的3.3％。
颗粒可能通过胸膜淋巴管迁移到纵隔淋巴结 。最近，有研究试图通过胸膜腔内给予将脂xxxii 111 99
质体靶向到纵隔淋巴结 。使用闪烁造影成像测定了 铟-抗生物素蛋白和 mTc-生物
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素-脂质体的药代动力学和纵隔淋巴结吸收。 铟-抗生物素蛋白在给药44小时后的生物分布结果显示，通过胸膜注射的纵隔淋巴结吸收为注射剂量的3.3％。
[0018] 由于淋巴微转移可导致局部肿瘤复发和潜在的全身肿瘤扩散，所以急需开发药物靶向策略来消除淋巴微转移。该策略要得以成功，原则就是应该将抗癌药从给药的部位递送到能发挥作用的部位。常规的全身化疗不可能将抗癌药物有效地递送到淋巴结而不引发严重的副作用。
发明内容
[0019] 本发明涉及用于将治疗药物靶向递送并保留在淋巴系统中的颗粒和包含所述颗粒的可植入装置。
[0020] 在一个实施方案中，本发明提供了包括生物相容和可生物降解基质的可植入装置，所述基质浸渍有适合选择性地靶向淋巴系统的生物活性复合物，其中所述生物活性复合物包括一种或多种颗粒形成材料和一种或多种生物活性剂。在具体实施方案中，所述可植入的装置包括适合选择性地靶向淋巴系统的颗粒。在另一个实施方案中，所述颗粒是微粒或纳米颗粒，或微粒与纳米颗粒的组合。
[0021] 在本发明的另一个实施方案中，包括治疗疾病或病症的方法，所述方法包括将本发明的可植入装置给予有需要的对象，所述可植入的装置包括有效量的生物活性剂以治疗所述疾病。在另一个实施方案中，所述疾病或病症选自瘤形成、淋巴转移、细菌感染、微生物感染和病毒感染，尤其是瘤形成(例如癌症)和淋巴转移。
[0022] 在本发明的另一个实施方案中，包括将生物活性剂给予对象的淋巴系统的方法，所述方法包括在所述对象体内植入本发明的可植入装置，其中所述可植入装置包括有效量的生物活性剂。在本发明的实施方案中，在胸膜腔、腹膜腔、皮下组织、阴道或直肠中植入所述可植入的装置。
[0023] 本发明还包括将本发明的可植入装置作为药物的应用。在本发明的实施方案中，还包括本发明的可植入装置在治疗或预防选自瘤形成、细菌感染、微生物感染和病毒感染的疾病或病症中的应用，以及本发明的可植入装置在制备用于治疗或预防选自瘤形成、细菌感染、微生物感染和病毒感染的疾病或病症的药物中的应用。
[0024] 本发明还包括本发明的可植入装置在治疗或预防肿瘤转移至淋巴系统中的应用，和本发明的可植入装置在制备用于治疗或预防肿瘤转移至淋巴系统的药物中的应用。 [0025] 在本发明的另一个实施方案中，包括使用γ闪烁造影法、正电子发射断层成像(PET)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、磁共振成像(MRI)、X-射线、计算机辅助的X-射线断层成像(CT)、近红外光谱或超声使淋巴系统成像或可视化的方法，所述方法包括将本发明的可植入装置给予对象，并进行γ闪烁造影法、正电子发射断层成像(PET)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、磁共振成像(MRI)、X-射线、计算机辅助的X-射线断层成像(CT)、近红外光谱或超声以使淋巴系统成像或可视化，其中所述可植入的装置包括作为合适的造影剂或显像剂的生物活性剂。在本发明的实施方案 中，所述造影剂或显像剂选自铁磁材料、全氟化学品、染料、发射γ的放射性标记物和发射正电子的放射性标记物。在本发明的实施方案中，使前哨淋巴结可视化或成像。
[0026] 本发明还包括本发明的可植入装置在使用γ闪烁造影法、正电子发射断层成像(PET)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、磁共振成像(MRI)、X-射线、计算机辅助的X-射线断层成像(CT)、近红外光谱或超声光谱可视化或成像淋巴系统中的应用，其中所述可植入的装置包括作为合适的造影剂或显像剂的生物活性剂。
[0027] 在另一个实施方案中，本发明提供了制备本发明的可植入装置的方法，该方法包括：
[0028] a)在合适的溶剂内混合生物活性剂和颗粒形成材料，以形成溶液或悬浮液； [0029] b)将所述溶液或悬浮液喷雾干燥以形成所述生物活性复合物的颗粒； [0030] c)在合适的溶剂内将b)中形成的所述颗粒与适合形成生物相容性基质的生物相容性聚合物混合；
[0031] d)除去c)的溶剂以形成所述可植入的装置。
[0032] 在另一个实施方案中，本发明提供了具有足够的尺寸以进入淋巴系统或淋巴结的颗粒。在另一个实施方案中，本发明提供了本发明的颗粒在治疗疾病如癌症中的应用。在另一个实施方案中，本发明提供了所述颗粒在治疗淋巴转移中的应用。
[0033] 本发明的其它特征和优点将通过下列详述而得显见。然而应该理解，在说明本发明的优选实施方案时仅是以举例说明的方式提供了所述详述和具体实施例，因为从所述详细的说明中，处于本发明精神和范围内的各种变化和修改对本领域技术人员将是明显的。 附图说明
[0034] 图1显示在胸膜内给予24h后，具有不同尺寸的111铟-氨基聚苯乙烯在大鼠体内*的生物分布(n＝4)；p＜0.01(学生t检验)。
[0035] 图2显示在胸膜腔内给予后，粒度为～2μm的111铟-氨基聚苯乙烯在大鼠体内*随时间的生物分布(n＝4)；p＜0.01(学生t检验)。
[0036] 图3显示PLGA-PTX微球的体外药物释放曲线。从第1天到第21天每 天测量累积药物释放，然后扩展到每5天测量，直到第51天。在37℃的温度下，在磷酸盐缓冲液(PBS)中将载有紫杉醇的PLGA微球的体外释放测量三次。将载有15mg紫杉醇的微球悬浮在包含0.1％(v/v)Tween 80的10ml PBS中。在37℃调温烘箱中以30rpm上下翻转试管，在给定的时间间隔将样品以10,000rpm离心10分钟，保存顶部8ml上清液供分析。将所沉淀的微球再悬浮于重新加替的释放介质中。通过将紫杉醇萃取到3ml二氯甲烷(DCM)中以确定紫杉醇的量。在干燥后，将样品复溶到2ml 50∶50乙腈∶水(v/v)中并通过高压液相(HPLC)检测。
[0037] 图4显示具有不同的尺寸、几何形状和含量的各种明胶和明胶-藻酸盐海绵样品。 [0038] 图5显示紫杉醇从PLGA-PTX微球、包含PLGA-PTX的明胶海绵和PTX中的体外累积释放曲线。在包含钙、镁和0.5％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸盐缓冲溶液中，在500ng/ml的细菌胶原酶(IV型)浓度下将紫杉醇测量四次。在37℃温育样品，在振荡培-1
养箱中以100min 下水平振荡。在给定的时间间隔，以5000rpm将试管离心15分钟。使
200μl上清液通过具有PVDF膜的0.22μm针筒驱动过滤器。将100μl等份滤液与相等体积的乙腈(acitonitrile)混合。将混合物在10000rpm离心5分钟。取上清液供HPLC检测。由校正曲线计算PTX的量。Spon：海绵；CL：交联。
养箱中以100min 下水平振荡。在给定的时间间隔，以5000rpm将试管离心15分钟。使
200μl上清液通过具有PVDF膜的0.22μm针筒驱动过滤器。将100μl等份滤液与相等体积的乙腈(acitonitrile)混合。将混合物在10000rpm离心5分钟。取上清液供HPLC检测。由校正曲线计算PTX的量。Spon：海绵；CL：交联。
[0039] 图6显示H460肺癌细胞的体外克隆发生测定(clonogenic assay)结果。以适当的密度将H460细胞播种到6-cm细胞培育板上过夜，然后开始处理。用游离紫杉醇、PLGA安慰剂或PLGA-紫杉醇处理H460细胞，以评价细胞毒性。将紫杉醇、PLGA-紫杉醇复合物和PLGA载体分别溶于二甲基亚砜(DMSO)，用RPMI-1640培养基(DMSO＜0.1％)进一步稀释。用含该浓度DMSO的培养基对细胞进行假处理。A：在0.1-1000nM的浓度范围内，游离PTX相对于从PLGA-PTX中提取的PTX的体外细胞毒性；B：PLGA处理和假处理对照之间的比较；C：在药物半数抑制量IC50(5nM)浓度时，紫杉醇暴露时间对细胞毒性的影响。 具体实施方式
[0040] 本发明人开发了能够将生物活性剂如抗肿瘤药递送到淋巴系统，包括区域淋巴管和淋巴结的新型颗粒药物传递系统，还开发了相应的可植入的 装置，所述装置浸渍有用于靶向递送至淋巴系统的新型颗粒药物传递系统。在具体实施方案中，通过手术干预，经胸膜腔、腹膜腔或皮下施用以靶向淋巴系统。
[0041] 因此，本发明包括含有生物相容和可生物降解基质的可植入装置，所述基质浸渍有适合选择性地靶向淋巴系统的生物活性复合物，其中所述生物活性复合物包括一种或多种颗粒形成材料和一种或多种生物活性剂。
[0042] 在用于本文时，“淋巴系统”指初级(primary)淋巴系统，包括毛细淋巴管、淋巴管和淋巴结，以及富集淋巴管的次级(secondary)淋巴样组织，例如与肠道相关的淋巴样组织、肠系膜、派尔集合淋巴结、网膜和副淋巴组织(accessory lymph tissue)如各种身体位置处的节旁组织(paranodaltissue)。
[0043] 在用于本文时，术语“颗粒”指纳米颗粒、微粒、或纳米颗粒和微粒两者。 [0044] 术语“微粒”是本领域已知的，包括微球和微囊，以及可能不易归入上述两类中的任一类的结构，全都具有小于1000微米的平均尺寸。术语“微球”是本领域已知的，包括基本球形的胶体结构，例如由生物相容的聚合物如所述组合物形成，尺寸范围为约1微米或高至约1000微米。通常，“微囊”也是本领域已知的术语，其可以区别于微球，因为微囊通常由一定类型的物质例如聚合物组合物覆盖。如果所述结构直径小于约1微米，则可以利用本领域已知的相应术语“纳米球”、“纳米囊”、和“纳米颗粒”。在某些实施方案中，所述纳米球、纳米囊和纳米颗粒的平均直径为约500、200、100、50或10nm。
[0045] 在用于本文时，术语“生物活性复合物”指包括一种或多种颗粒形成材料和一种或多种生物活性剂的复合物。
[0046] 在用于本文时，术语“颗粒形成材料”指适合给予对象的材料，所述材料可以与生物活性剂联合并形成适合将所述生物活性剂递送到淋巴系统的颗粒。
[0047] 在一个实施方案中，所述生物活性复合物包括所述颗粒形成材料和所述生物活性剂的微粒或纳米颗粒或微粒与纳米颗粒的组合，所述复合物具有足够的尺寸以进入淋巴系统。在用于本文时，术语“足够的尺寸”将被本领域技术人员容易地理解为是指如下尺寸，其中所述颗粒能够经过淋巴 管迁移或被保留在淋巴结内。在具体实施方案中，所述颗粒的尺寸范围为约50nm至约100nm。在另一个实施方案中，所述颗粒的尺寸范围为约140nm至约1500nm。在另一个实施方案中，所述颗粒的尺寸范围为约0.3μm至约11.2μm。在另一个实施方案中，所述颗粒的尺寸范围为约0.7μm至约2μm。
[0048] 在另一个实施方案中，可以改变粒度以靶向淋巴系统的不同部分。例如，较小尺寸的颗粒可以用于靶向淋巴管，而较大尺寸的颗粒可以用于靶向淋巴结。在本发明的另一个实施方案中，可以改变粒度以改善被淋巴系统例如处于身体不同部分的淋巴管或淋巴结的吸收。例如，对于用于如乳腺癌和黑素瘤而言，低于100nm的颗粒是合适的，而对于胸膜内或腹膜内施用而言，约1μm至约5μm的颗粒是合适的。
[0049] 在本发明的实施方案中，由一种或多种药物学可接受的颗粒形成材料形成所述颗粒。可以使用各种颗粒形成材料，包括药物学可接受或生物相容的聚合物、脂质、脂质体、金属颗粒、磁性颗粒、生物素、抗生物素蛋白和多糖如胶原、透明质酸、白蛋白和明胶、及其衍生物和其组合。
[0050] 术语“药物学可接受的”或“生物相容的”是本领域已知的。在某些实施方案中，该术语包括在适当的医学判断范围内适合用于与人类和动物的组织接触而没有过度的毒性、刺激性、过敏反应、或其它问题或并发症，具有合理的效益/风险比的组合物、聚合物和其它材料和/或剂型。
[0051] 术语“聚合物”指由两个或多个重复单元即单体的化学联合形成的分子。因此，术语“聚合物”可以包括例如二聚物、三聚物和低聚物。所述聚合物可以是合成的、天然存在的或半合成的。在合适的形式中，术语“聚合物”指分子量(MW)通常大于约3000、适合大于约10,000且小于约1千万、适合小于约1百万、更适合小于约200,000的分子。
[0052] 药物学可接受或生物相容性聚合物的实例包括但不限于：聚乳酸、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚乳酸(PLA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乳酸-共-己内酯、聚乙二醇(PEG)、聚环氧乙烷(PEO)、聚苯乙烯、聚乳酸-嵌段-聚乙二醇、聚乙醇酸-嵌段-聚乙二醇、聚丙交酯-共-聚乙交酯-嵌段-聚乙二醇、聚乙二醇-嵌段-脂质、聚乙烯醇(PVA)、聚酯、聚(原酸酯)、聚(膦嗪)、聚(磷酸酯)、聚己内酯(polycaprolactaones)、明胶、胶原、糖胺聚糖、聚原酸酯、多糖、多糖衍生物、聚透明质酸、聚藻酸、壳多糖、壳 聚糖、壳聚糖衍生物、纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羧甲基纤维素、多肽、聚赖氨酸、聚谷氨酸、白蛋白、聚酸酐、聚羟基烷酸酯(polyhydroxy alkonoates)、聚羟基戊酸酯、聚羟基丁酸酯、蛋白质、聚磷酸酯、聚丙烯酰胺(PAA)、及其衍生物和混合物。
[0053] 在用于本文时，术语“脂质”指非聚合的合成或天然存在的小有机化合物，它们通常是两性的和生物相容的。所述脂质通常包括亲水成分和疏水成分。示例性脂质包括例如：脂肪酸、脂肪酸酯、中性脂肪、磷脂、糖脂、脂族醇、蜡、萜、甾体和表面活性剂。术语“脂质”还意味着包括脂质的衍生物。更具体地，术语“脂质”包括但不限于：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、鞘磷脂以及合成的磷脂如二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰甘油、二肉豆蔻酰磷脂酰丝氨酸、二硬脂酰磷脂酰丝氨酸和二棕榈酰磷脂酰丝氨酸。
[0054] 在本发明的实施方案中，所述颗粒形成材料的衍生物是经表面改性的衍生物，其中所述表面改性改变了亲水性、疏水性或改变了所述材料的性质从而使它适于或靶向体内的特定区域。
[0055] 本发明的合适实施方案包括由可降解聚合物如聚丙交酯(PLA)、聚乙交酯(PGA)及其共聚物(PLGA)制成的颗粒。这些可降解聚合物的一个优点是它们能够降解成生物学可接受的分子如乳酸或乙醇酸和水，这些降解产物可以通过正常代谢途径代谢和排出体外。例如，PLA/PLGA在水中通过大量水解而降解。所述聚合物的降解速率通常控制着所包封的治疗药物的释放。因此，根据特定药物需要的治疗，通过选择具有适当的理化性质如分子量和共聚物组成的PLA或PLGA，可以控制该药物从其聚合物基质内释放的动力学。 [0056] 还可以由聚苯乙烯颗粒制备颗粒，所述聚苯乙烯颗粒已经经过表面改性，通过例如接枝亲水性聚合物如N-异丙基丙烯酰胺(NIPAm)和/或甲基丙烯酸(MAA)改变了它们的亲水性。
[0057] 由于身体不同隔室之间的淋巴系统的解剖特征和生理学特征不同，所以存在通过改变所述聚合物的理化性质来进一步改善靶向效率的潜能。影响所述淋巴颗粒分布的最重111
要的因素之一是粒度。本发明人利用三种不同尺寸(～300nm、～2μm、和～11μm)的铟(In)标记的氨基聚苯乙烯珠粒研究了粒度对经胸膜腔给予的淋巴颗粒分布的影响。研究揭示，与另两种尺寸相比，～2μm的颗粒具有明显更高的淋巴吸收。所述颗粒在区域淋巴结中还具有合理的停留时间。有关报道显示极其小的粒度(＜100nm)被用于经皮下组织s.c.的淋巴递送。对于皮下给予，最佳尺寸为10nm至50nm。近期研究显示，直径大于几百纳米的颗粒往往停留在注射位置，因为它们太大而不能通透过组织间隙按正常方式汇入xxxiii
淋巴流 。只有当腹膜腔或胸膜腔给予颗粒时，处于纳米范围内的尺寸变化才不致对颗粒吸收造成重大影响，因为那些颗粒只需单纯地从腔室直接进入表面淋巴管，因而不必通xxxiv xxxv
过组织间隙扩散 。淋巴管壁上的开口是腹膜腔淋巴吸收的唯一尺寸限制屏障 。本发明人证实，与另两种较小尺寸的颗粒相比，经胸膜腔给予的尺寸范围为700至1500nm的碳胶体提供了更好的淋巴结分布。似乎大约2μm的颗粒是胸膜内淋巴靶向区域淋巴结的适当尺寸。对于小颗粒在淋巴结内的低吸收的一种可能的解释是，尽管这些颗粒可能易于到达胸膜淋巴管，但却不能在区域淋巴结内保留。
要的因素之一是粒度。本发明人利用三种不同尺寸(～300nm、～2μm、和～11μm)的铟(In)标记的氨基聚苯乙烯珠粒研究了粒度对经胸膜腔给予的淋巴颗粒分布的影响。研究揭示，与另两种尺寸相比，～2μm的颗粒具有明显更高的淋巴吸收。所述颗粒在区域淋巴结中还具有合理的停留时间。有关报道显示极其小的粒度(＜100nm)被用于经皮下组织s.c.的淋巴递送。对于皮下给予，最佳尺寸为10nm至50nm。近期研究显示，直径大于几百纳米的颗粒往往停留在注射位置，因为它们太大而不能通透过组织间隙按正常方式汇入xxxiii
淋巴流 。只有当腹膜腔或胸膜腔给予颗粒时，处于纳米范围内的尺寸变化才不致对颗粒吸收造成重大影响，因为那些颗粒只需单纯地从腔室直接进入表面淋巴管，因而不必通xxxiv xxxv
过组织间隙扩散 。淋巴管壁上的开口是腹膜腔淋巴吸收的唯一尺寸限制屏障 。本发明人证实，与另两种较小尺寸的颗粒相比，经胸膜腔给予的尺寸范围为700至1500nm的碳胶体提供了更好的淋巴结分布。似乎大约2μm的颗粒是胸膜内淋巴靶向区域淋巴结的适当尺寸。对于小颗粒在淋巴结内的低吸收的一种可能的解释是，尽管这些颗粒可能易于到达胸膜淋巴管，但却不能在区域淋巴结内保留。
[0059] 本发明的颗粒用于将生物活性剂靶向淋巴系统，包括淋巴结。因此，在另一个实施方案中，本发明的颗粒包含需要到达淋巴管和/或淋巴结的生物活性剂。
[0060] 在用于本文时，术语“生物活性剂”指被递送到活体的身体管道以产生期望的效果，通常为有益效果的任何治疗或诊断物质。
[0061] 在合适的实施方案中，所述生物活性剂是抗肿瘤药。在一个实施方案中，所述生物活性剂是抗增殖药或抗肿瘤转移药。在合适的实施方案中，所述抗增殖药或抗肿瘤转移药通常包括微管稳定药(例如紫杉醇、多西他赛或其衍生物或类似物)；烷化剂；抗代谢药；替尼泊苷(epidophyllotoxin)；抗肿瘤酶；拓朴异构酶抑制剂；丙卡巴肼；米托蒽酯；铂配合物；生物反应调节剂和生长抑制剂；以及造血生长因子。示例性抗肿瘤药类别包括例如蒽环霉素类药物、长春花属药物、丝裂霉素类、博来霉素类、细胞毒性核苷类、紫杉烷类、大环内酯类、盘皮海绵内酯(discodermolide)、蝶啶类药物、二炔烯类(diynenes)和鬼臼毒素类。那些类别的成员包括例如：多柔比星、洋红霉素、柔红霉素、氨蝶呤、甲氨蝶呤、甲喋呤、二氯-甲氨蝶 呤、丝裂霉素C、泊非霉素、曲妥单抗(Herceptin.TM.)、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、吉西他滨、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、鬼臼毒素或鬼臼毒素衍生物如依托泊苷、磷酸依托泊苷或替尼泊苷、美法仑、长春碱、长春新碱、异长春碱、长春地辛、环氧长春碱、紫杉醇等。其它有用的抗肿瘤药包括：雌莫司汀、顺铂、卡铂、环磷酰胺、博来霉素、吉西他滨、异环磷酰胺、美法仑、六甲蜜胺、塞替派、阿糖胞苷(cytarabin)、依达曲沙(idatrexate)、三甲曲沙、达卡巴嗪、L-天冬酰胺酶、喜树碱、CPT-11、托泊替康、吡啶并苯并吲哚衍生物、干扰素和白介素。
[0062] 其它代表性抗增殖药或抗肿瘤转移药包括：烷化剂如氮芥类，例如氮芥、环磷酰胺、美法仑和苯丁酸氮芥，alkyl sulptronates如白消安(busulphan)、亚硝基脲如卡莫司汀、洛莫司汀(lomusine)、司莫司汀和链佐星，三氮烯类如达卡巴嗪，抗代谢药如叶酸类似物如甲氨蝶呤，嘧啶类似物如氟尿嘧啶和阿糖胞苷，嘌呤类似物如巯基嘌呤和硫鸟嘌呤，天然产物如长春花属生物碱，例如长春碱、长春新碱和长春地辛，鬼臼毒素如依托泊苷和替尼泊苷，抗生素如放线菌素D、柔红霉素、多柔比星、博来霉素、普卡霉素和丝裂霉素，酶如L-天冬酰胺酶，取代的脲如羟基脲，甲基肼衍生物如丙卡巴肼，肾上腺皮质激素抑制剂如米托坦和氨鲁米特，激素和拮抗剂如肾上腺皮质类固醇如泼尼松，孕酮如己酸羟孕酮、醋酸甲氧孕酮和醋酸甲地孕酮，雌激素如己烯雌酚和炔雌醇，抗雌激素如他莫昔芬，和雄激素如丙酸睾酮和氟甲睾酮。
[0063] 其它实施方案包括抑制淋巴管发生的部分如血管内皮生长因子C、D(VEGF-C、D)抗体或其受体VEGFR-3的抗体，或抑制血管发生的部分，例如抗表皮生长因子受体(EGFR)药、作用于各种抗癌信号途径的各种小分子如整联蛋白偶联性激酶(ILK)抑制剂、基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂、大分子、抗氧化剂、细胞因子、趋化因子、反义寡核苷酸、导向(home to)淋巴管的LyP-1肽包裹的量子点(qdots)、激素和激素拮抗剂。
[0064] 在本发明的合适实施方案中，所述生物活性剂是紫杉醇或紫杉醇衍生物或多柔比星。
[0065] 在本发明的另一个实施方案中，可以将多于一种生物活性剂加入所述微粒中。可以联合使用多种生物活性剂以提供协同作用或提供多种类型的治疗。例如，可以合并两种或多种互补的治疗药物以提供互补形式的治疗， 或者可以将组织敏化剂与治疗药物联用以提供协同作用，或者可以将治疗药物与放射敏化剂(radiation sensitizer)联用以期用化疗和放疗的组合治疗恶性病。本领域技术人员将知道生物活性剂的合适组合。 [0066] 在本发明的另一个实施方案中，可以将独立于所述生物活性复合物的一种或多种生物活性剂加入所述生物相容和可生物降解的基质中。通过将游离生物活性剂与包括所述生物活性剂的生物活性复合物联合，可以获得所述生物活性剂的最佳药代动力学曲线。所述游离生物活性剂的释放将提供最初的高药物浓度，而所述复合物内的颗粒将缓慢释放药物以保持药物水平。这将允许在更长时间内将药物浓度保持在治疗窗内。因此，可以提高半数致死剂量(LD50)和最大耐受剂量(MTD)，增强了所述生物活性剂的安全特性，同时减少了血浆有效浓度EC50，从而提高了所述生物活性剂的有效性。在该实施方案中，所述游离生物活性剂还可以不同于所述复合物内的生物活性剂，从而提供替代手段以不同的释放速率递送协同或组合疗法。
[0067] 可以使用本领域已知的任何程序将所述生物活性剂加入颗粒形成材料中并制备纳米颗粒或微粒。可以使用各种制剂方法，包括喷雾干燥、双乳化法、溶剂蒸发等。例如在喷雾干燥中，可以在合适的溶剂中混合所述生物活性剂和所述颗粒形成材料。然后将所得溶液或悬浮液喷雾干燥以形成微粒或纳米颗粒。入口温度、出口温度、喷雾流速控制、进料喷雾速率、吸气器水平、和雾化压力都可以作相应的调整，以制备具有特定物理性质如尺寸和形状的颗粒。
[0068] 本发明包括用于将生物活性剂靶向至淋巴系统或淋巴结的可植入装置。在一个实施方案中，所述可植入的装置浸渍有本发明的颗粒。在另一个实施方案中，所述可植入的装置是生物相容的基质。在另一个实施方案中，所述可植入的装置是可生物降解的基质。在另一个实施方案中，所述可植入的装置是生物相容、可生物降解的基质，所述基质浸渍有含有治疗药物的颗粒。
[0069] 可以使用任何合适的材料形成所述生物相容的基质。在本发明的实施方案中，用于形成所述生物相容性基质的材料包括不同类型的聚合物如均聚物或共聚物(包括交替、无规和嵌段共聚物)，它们可以是环形、线性或分枝的均聚物或共聚物(包括交替、无规和嵌段共聚物)，它们可以是环形、线性或分枝的(例如具有星状、梳状或枝状结构的聚合物)，它们可以是天然或 合成的，它们可以是热塑性的或热固性的，并且它们可以是疏水的、亲水的或两性的。
[0070] 用于所述生物相容性基质的聚合物可以选自下列材料例如：聚羧酸聚合物和共聚物，包括聚丙烯酸；乙缩醛聚合物和共聚物；丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯聚合物和共聚物(例如甲基丙烯酸正丁酯)；纤维素聚合物和共聚物，包括醋酸纤维素、硝酸纤维素、丙酸纤维素、醋酸-丁酸纤维素、玻璃纸、人造丝、三醋酸人造丝、和纤维素醚如羧甲基纤维素和羟基烷基纤维素；聚氧化亚甲基聚合物和共聚物；聚酰亚胺聚合物和共聚物，如聚醚嵌段酰亚胺、聚酰胺酰亚胺、聚酯酰亚胺、和聚醚酰亚胺；聚砜聚合物和共聚物，包括聚芳基砜和聚醚砜；聚酰胺聚合物和共聚物，包括尼龙66、尼龙12、聚己内酰胺和聚丙烯酰胺；树脂，包括醇酸树脂、酚树脂、脲树脂、三聚氰胺树脂、环氧树脂、烯丙基树脂和环氧树脂；聚碳酸酯；聚丙烯腈；聚乙烯吡咯烷酮(交联或未交联)；乙烯基单体的聚合物和共聚物，包括聚乙烯醇、聚卤乙烯如聚氯乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物(EVA)、聚偏二氯乙烯、聚乙烯醚如聚乙烯基甲基醚、聚苯乙烯、苯乙烯-马来酸酐共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物、苯乙烯-乙烯-丁烯共聚物(例如聚苯乙烯-聚乙烯/丁烯-聚苯乙烯(SEBS)共聚物，作为 G系列聚合物销售)、苯乙烯-异戊二烯共聚物(例如聚苯乙烯-聚异戊丙烯-聚苯乙烯)、丙烯腈-苯乙烯共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、苯乙烯-丁二烯共聚物和苯乙烯-异丁烯共聚物(例如聚异丁烯-聚苯乙烯嵌段共聚物如SIBS)、聚乙烯酮、聚乙烯咔唑、和聚乙烯酯如聚乙酸乙烯酯；聚苯并咪唑；聚烷基氧聚合物和共聚物，包括聚环氧乙烷(PEO)；聚酯，包括聚对苯二甲酸乙二酯和脂族聚酯如丙交酯(包括乳酸以及d-，1-和内消旋丙交酯)的聚合物和共聚物、ε-己内酯、乙交酯(包括乙醇酸)、羟基丁酸酯、羟基戊酸酯、对二氧杂环己酮、碳酸亚丙酯(及其烷基衍生物)、1，4-二氧杂环庚烷-2-酮、1，5-二氧杂环庚烷-2-酮、和6，6-二甲基-1，4-二噁烷-2-酮(一种具体实例为聚乳酸和聚己内酯的共聚物)；聚醚聚合物和共聚物，包括聚芳基醚如聚亚苯基醚、聚醚酮、聚醚醚酮；聚苯硫醚；聚烯烃聚合物和共聚物，包括聚亚烷基如聚丙烯、聚乙烯(低密度和高密度，低分子量和高分子量)、聚丁烯(例如聚1-丁烯和聚异丁烯)、EPDM共聚物(例如santoprene)、乙烯-丙烯二烯单体(EPDM)橡胶、聚-4-甲基-戊-1-烯、乙烯-α-烯烃共聚物、乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物和乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；氟化 聚合物和共聚物，包括聚四氟乙烯(PTFE)、聚(四氟乙烯-共-六氟丙烯)(FEP)、改性的乙烯-四氟乙烯共聚物(ETFE)、和聚偏二氟乙烯(PVDF)；硅氧烷聚合物和共聚物；聚氨酯；对亚二甲苯聚合物；聚亚氨基碳酸酯；共聚(醚-酯)，例如聚环氧乙烯-聚乳酸共聚物；聚膦嗪；聚亚烷基草酸酯；聚草酰胺(polyoxaamides)和聚氧杂酯(polyoxaesters)(包括含有胺和/或酰氨基的那些)；聚原酸酯；生物高分子，例如多肽、蛋白质、多糖和脂肪酸(及其酯)，包括纤维蛋白、纤维蛋白原、胶原、弹性蛋白、壳聚糖、明胶、淀粉、糖胺聚糖如透明质酸；以及上述材料的共混物和共聚物。
[0071] 弹性聚合物在一些实施方案中特别有益。弹性聚合物包括：(a)聚烯烃聚合物，例如包含丁基的聚合物如聚异丁烯；(b)聚烯烃共聚物，例如聚烯烃-聚乙烯基芳族共聚物，例如聚异丁烯-聚苯乙烯共聚物、聚(丁二烯/丁烯)-聚苯乙烯共聚物、聚(乙烯/丁烯)-聚苯乙烯共聚物、和聚丁二烯-聚苯乙烯共聚物；和(c)硅氧烷聚合物和共聚物；及其共混物。聚烯烃-聚乙烯基芳族共聚物的具体实例包括聚烯烃-聚乙烯基芳族二嵌段共聚物和聚乙烯基芳族-聚烯烃-聚乙烯基芳族三嵌段共聚物，例如作为 销
售的聚苯乙烯-聚(乙烯/丁烯)-聚苯乙烯(SEBS)三嵌段共聚物，和记载于例如美国专利No.5,741,331、美国专利No.4,946,899和美国专利No.6,545,097中的聚苯乙烯-聚异丁烯-聚苯乙烯(SIBS)三嵌段共聚物，各文献于此全文纳入本文作为参考。另外的聚烯烃-聚乙烯基芳族共聚物列于前面的段落。
售的聚苯乙烯-聚(乙烯/丁烯)-聚苯乙烯(SEBS)三嵌段共聚物，和记载于例如美国专利No.5,741,331、美国专利No.4,946,899和美国专利No.6,545,097中的聚苯乙烯-聚异丁烯-聚苯乙烯(SIBS)三嵌段共聚物，各文献于此全文纳入本文作为参考。另外的聚烯烃-聚乙烯基芳族共聚物列于前面的段落。
[0072] 在本发明的一些实施方案中，所述生物相容的基质包含疏水性聚合物、亲水性聚合物、或疏水性聚合物和亲水性聚合物两者。
[0073] 本发明所用聚合物可以从中选择的疏水性聚合物的实例包括：烯烃聚合物和共聚物，例如聚乙烯、聚丙烯、聚(1-丁烯)、聚(2-丁烯)、聚(1-戊烯)、聚(2-戊烯)、聚(3-甲基-1-戊烯)、聚(4-甲基-1-戊烯)、聚(异戊二烯)、聚(4-甲基-1-戊烯)、乙烯-丙烯共聚物、乙烯-丙烯-己二烯共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物；苯乙烯聚合物和共聚物例如聚(苯乙烯)、聚(2-甲基苯乙烯)、包含小于约20摩尔％丙烯腈的苯乙烯-丙烯腈共聚物、苯乙烯-2，2，3，3，-四氟丙基甲基丙烯酸酯共聚物和烯烃-苯乙烯共聚物；卤代烃聚合物和共聚物，例如聚(氯代三氟乙烯)、氯代三氟乙烯-四氟乙烯共聚物、聚(六氟丙烯)、聚(四氟乙烯)、四氟乙烯、四氟乙烯-乙烯共聚物、聚(三氟乙烯)、聚(氟乙烯)、聚(氯乙烯)和聚(偏二氟乙烯)；乙烯基聚合物和共聚物，例如聚(丁酸乙烯 酯)、聚(癸酸乙烯酯)、聚(十二烷酸乙烯酯)、聚(十六烷酸乙烯酯)、聚(己酸乙烯酯)、聚(丙酸乙烯酯)、聚(辛酸乙烯酯)、聚(七氟异丙氧基乙烯)、聚(七氟异丙氧基丙烯)和聚(甲基丙烯腈)；丙烯酸酯的聚合物和共聚物，例如聚(丙烯酸正丁酯)、聚(丙烯酸乙酯)、聚(1-氯二氟甲基)四氟乙基丙烯酸酯、聚二(氯氟甲基)氟代甲基丙烯酸酯、聚(1，1-二氢七氟丁基丙烯酸酯)、聚(1，1-二氢五氟异丙基丙烯酸酯)、聚(1，1-二氢十五氟辛基丙烯酸酯)、聚(七氟异丙基丙烯酸酯)、聚5-(七氟异丙氧基)戊基丙烯酸酯、聚11-(七氟异丙氧基)十一烷基丙烯酸酯、聚2-(七氟丙氧基)乙基丙烯酸酯和聚(九氟异丁基丙烯酸酯)；甲基丙烯酸酯的聚合物和共聚物，例如聚(甲基丙烯酸苄酯)、聚(甲基丙烯酸甲酯)、聚(甲基丙烯酸正丁酯)、聚(甲基丙烯酸异丁酯)、聚(甲基丙烯酸叔丁酯)、聚(甲基丙烯酸叔丁基氨基乙酯)、聚(甲基丙烯酸十二酯)、聚(甲基丙烯酸乙酯)、聚(甲基丙烯酸2-乙基己酯)、聚(甲基丙烯酸正己酯)、聚(甲基丙烯酸苯酯)、聚(甲基丙烯酸正丙酯)、聚(甲基丙烯酸十八酯)、聚(1，1-二氢十五氟辛基甲基丙烯酸酯)、聚(七氟异丙基甲基丙烯酸酯)、聚(十七氟辛基甲基丙烯酸酯)、聚(1-氢四氟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(1，1-二氢四氟丙基甲基丙烯酸酯)、聚(1-氢六氟异丙基甲基丙烯酸酯)、和聚(甲基丙烯酸九氟叔丁酯)；聚碳酸酯；聚酰亚胺；聚醚醚酮；聚酰胺；聚乙酸乙烯酯；聚砜；聚醚砜；聚酯，例如聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(对苯二甲酸丁二酯)；聚氨酯和硅氧烷-氨酯共聚物；和聚有机硅氧烷(硅酮)。
[0074] 本发明所用聚合物可以从中选择的亲水性聚合物的实例包括：丙烯酸和甲基丙烯酸的聚合物和共聚物，及其碱金属盐和铵盐；甲基丙烯酰胺的聚合物和共聚物；甲基丙烯腈的聚合物和共聚物；不饱和二元酸如马来酸和富马酸的聚合物和共聚物，和这些不饱和二元酸的半酯，以及这些二元酸或半酯的碱金属盐或铵盐；不饱和磺酸如2-丙烯酰氨基-2-甲基丙磺酸和2-(甲基)丙烯酰基乙磺酸的聚合物和共聚物，及其碱金属盐和铵盐；具有亲水性基团的甲基丙烯酸酯的聚合物和共聚物如甲基丙烯酸2-羟基乙酯和甲基丙烯酸2-羟基丙酯，聚乙烯醇的聚合物和共聚物，其中可以包含多个亲水性基团如羟基、酰氨基、羧基、氨基、铵和磺酰基(-SO3)基团；聚亚烷基二醇和聚环氧烷的聚合物和共聚物如聚乙二醇、聚丙二醇、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷；具有极性侧基的乙烯基化合物的聚合物和共聚物如N-乙烯吡咯烷酮、N-乙烯基丁内酰胺、N-乙烯基己丙酰胺；源自丙烯酰胺的聚合物 和共聚物；亲水性聚氨酯；羟基丙烯酸酯的聚合物和共聚物；乙烯吡咯烷酮的聚合物和共聚物，包括乙酸乙烯酯/乙烯吡咯烷酮共聚物，淀粉、多糖，包括树胶和纤维素聚合物如琼脂、黄原胶和其它树胶、葡聚糖、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素、胶原、明胶、藻酸盐、和透明质酸。
[0075] 应该注意上列所有聚合物也都可以用作颗粒形成材料。
[0076] 在合适的实施方案中，所述生物相容性、可生物降解的基质是水凝胶。在另一个实施方案中，所述生物相容性、可生物降解的基质包含明胶或明胶-藻酸盐。在另一个实施方案中，所述生物相容性、可生物降解的基质包含胶原。在本发明的另一个实施方案中，所述生物相容性、可生物降解的基质包括羧甲基纤维素。在本发明的另一个实施方案中，所述生物相容性、可生物降解的基质包括果胶。
[0077] 在本发明的具体实施方案中，所述生物相容的基质可以是海绵、薄片、薄膜、丝网、拭子、棉塞或衬垫的形式。在合适的具体实施方案中，所述生物相容的基质是海绵的形式。 [0078] 在本发明的另一个实施方案中，所述生物相容的基质可以是交联的。对恰当的交联方法的选择应当考虑交联效果、维持颗粒-药物复合物的完整性、和交联剂对对象的潜在毒性。本领域已知各种方法均可以用于交联各种聚合材料，所述方法包括物理方法如紫外线、剧烈脱水、辐射、冷冻和融化循环以及使用各种交联剂的化学方法。用于交联本发明基质的示例性方法包括：(1)使明胶浆与1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基碳二亚胺)(EDC)在足够的条件下接触一段时间以形成交联的基质；(2)将冻干的基质在足够的条件下加热一段时间以形成交联的基质；(3)使冻干的基质在足够的条件下在电子束下暴露一段时间，以形成交联的基质；(4)使冻干的基质在足够的条件下在γ灭菌下暴露一段时间，以形成交联的基质；和(5)使冻干的装置暴露于甲醛气体以形成交联。聚合物基质的物理特征可以通过聚合物的交联程度而发生显著变化。在具体实施方案中，以如下方式交联基质，该方式允许颗粒在约几天到约几周的时间内从所述可降解的基质中释放出来。
[0079] 无论组成如何，本发明的生物相容性基质通常都将满足所述可植入装置的所有机械、化学和生物学要求。
[0080] 术语“可生物降解的”是本领域已知的，包括将在应用过程中降解的聚合物、组合物和制剂，如本文所述的那些。可生物降解的聚合物与不可 生物降解的聚合物之间的不同之处通常在于前者可以在使用过程中降解。在某些实施方案中，所述应用包括体内应用，例如体内治疗，在其它某些实施方案中，所述应用涉及体外应用。通常，可生物降解性所致的降解涉及将可生物降解的聚合物降解成其组成亚单元，或者例如通过生化过程将所述聚合物消化成更小的非聚合亚单元。在某些实施方案中，通常可以识别两种不同类型的生物降解。例如，一类生物降解可能涉及聚合物骨架内的键(无论是共价键还是其它键)的断裂。在这样的生物降解中，通常生成单体和低聚物，这样的生物降解甚至更通常通过连接着聚合物的一个或多个亚单元的键的断裂而发生。相比之下，另一类生物降解可能涉及侧链内部的键或将侧链连接到聚合物骨架的键(无论是共价键还是其它键)的断裂。例如，通过生物降解可能释放作为侧链连接到聚合物骨架的抗肿瘤药紫杉烷或其它化学部分。在某些实施方案中，一种或另一种或两种常见类型的生物降解都可能在聚合物的应用过程中发生。在用于本文时，术语“生物降解”包括这两种常见类型的生物降解。
[0081] 可生物降解聚合物的降解速率通常部分取决于各种因素，所述因素包括引起任何降解的联接基的化学特性、所述聚合物的分子量、结晶度、生物稳定性、和交联程度、所述植入物的物理特征、形状和尺寸、以及给药的方式和位置。例如，分子量越大，结晶度越高，和/或生物稳定性越大，则任何可生物降解聚合物的生物降解通常越慢。术语“可生物降解的”将涵盖也称为“可生物溶蚀的”材料和方法。
[0082] 在某些实施方案中，本发明的聚合物制剂在期望应用中可接受的时间内生物降解。在某些实施方案中，例如在体内治疗中，当暴露于pH 6至8且温度为25至37℃的生理溶液时，所述降解通常在小于约五年、小于约一年、小于约六个月、小于约三个月、小于约一个月、小于约十五天、小于约五天、小于约三天、或甚至小于约一天的时间内发生。在其它实施方案中，根据期望的应用，所述聚合物在约一小时至几个月的时间内降解。 [0083] 在本发明的实施方案中，所述生物相容的基质将在一段时间内降解，以在一段时间内释放所述生物活性复合物。在另一个实施方案中，所述生物相容的基质将在约几小时至约1年的时间内降解。在合适的实施方案中，所述基质将在约几天至约几周的时间内降解。
[0084] 在本发明的其它实施方案中，所述生物相容的基质是可成形的。在用于本文时，术语“可成形的”意味着所述基质材料可以被成形或被塑造为特定形状。术语“可成形的”应该被认为与“可适应的”、“可操纵的”和“可塑造的”是同义的。在本发明的实施方案中，所述生物相容的基质可以在植入所述装置前成形，或者可以在植入时成形以适应具体器官或生物表面的轮廓。
[0085] 本发明包括含有药物学可接受的添加剂、载体和/或赋形剂的实施方案。所述添加剂、载体或赋形剂可以包括佐剂、衣料、色素、缓冲剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、稳定剂等。 [0086] 术语“药物学可接受的载体”是本领域已知的，包括例如参与将任何所述组合物从一个器官或身体部分携带或运输到另一个器官或身体部分的药物学可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。每种载体在与所述组合物的其它成分的相容性方面必须是“可接受的”并且对患者无害。在某些实施方案中，药物学可接受的载体是无热源的。可以作为药物学可接受载体的材料的一些实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；(4)粉末化的黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂和蜡；(9)油，例如花生油、棉籽油、向日葵油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇类，例如丙三醇、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)藻酸；(16)无热源的水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)用于药物制剂的其它无毒相容的物质。 [0087] 其它物质也可以添加到所述生物相容的基质中。增塑剂如丙二醇或丙三醇可以以高至基质重量的约30％包括到基质中。添加增塑剂将提高最终产物的柔韧性和强度。 [0088] 在将所述装置植入对象体内前，可以将它灭菌。可以通过例如热或E-束灭菌实现灭菌。通常将把生物相容的润湿剂掺入或涂布到所述基质组合物上，然后进行灭菌程序。交联明胶组合物的E-束灭菌记载于2001年3月12日提交的美国临时专利申请No.60/275,391，题为“Methods for Sterilizing Cross-Linked Gelatin Compositions”，该申请全文纳入本文作为参考。交联明胶组合物的热灭菌记载于美国专利No.2,465,357。 [0089] 所述装置在植入前还可以沉积不透射线的包衣或构造离子束表面纹理。不透射线的材料阻止X-射线，使得经处理的装置在X-射线或荧光成像时可见。可以将各种不透射线的材料沉积为具有各种图案如标记带和窄条的稠密、充分粘附的薄膜包衣。涂覆不透射线的包衣和构造离子束表面纹理两者都可以应用至聚合物。构造离子束纹理在聚合物表面产生特殊的形态，可以产生各种均匀或随机间隔的结构类型。构造了离子束纹理的表面是耐用且不会分层的，因为它们是其下表面的固有部分。
[0090] 在本发明的实施方案中，将本发明的可植入装置植入有此需要的对象体内。可以使用微创程序如腹腔镜检查或纵隔镜检查植入所述装置。在另一个实施方案中，可以在诊断程序的过程中，例如在活组织检查或更具体地在淋巴结活组织检查的过程中植入所述可植入的装置。在这种情况下，可以立即开始治疗以改善对象的预后。在另一个实施方案中，可以在手术过程中植入所述可植入的装置。在具体实施方案中，可以在手术切除肿瘤的过程中植入所述可植入的装置。
[0091] 在本发明的实施方案中，本发明的可植入装置提供了控释所述生物活性剂的益处。本发明的装置为控制所述生物活性剂的释放速率提供了多个机会。首先，可以选择所述生物相容且可生物降解的基质，从而使基质的降解在期望的时间段内提供微粒的释放。通过选择具体的聚合物或共聚物、交联的程度以及可能提高或降低降解速率的添加剂，可以控制该降解速率。其次，可以这样制备本发明的微粒或纳米颗粒，从而在预定的时间段内释放所述活性剂。通过选择颗粒形成材料和通过添加添加剂可以控制颗粒的降解速率。在另一个实施方案中，所述可生物降解的基质可以包含所述颗粒形式的生物活性剂以及在基质降解时直接释放游离生物活性剂。这个实施方案可以在基质降解时提供一个单次剂量的(a bolus of)生物活性剂，然后提供一段时间的微粒药物缓释。
[0092] 在本发明的另一个实施方案中，所述可植入的装置可以用于改善生物活性剂的药代动力学特性。在具体实施方案中，本发明的可植入装置可以用于提高半数致死剂量(LD50)和最大耐受剂量(MTD)，从而改善所述生物活性剂的安全特性。在另一个实施方案中，本发明的可植入装置可以用于降 低生物活性剂的有效剂量(ED50)，从而提高所述生物活性剂的治疗指数(LD50/ED50)并改进有效性。例如，本发明的装置可以制备成包括具有适当尺寸以选择性地靶向淋巴系统的颗粒。可以选择基质和颗粒形成材料以提供优选的控释性质。可以将所述装置植入期望治疗的位置或其附近，基质将在那里降解以释放选择性地靶向所述期望位置的颗粒。然后到达所述期望位置的颗粒可以以受控方式释放所述生物活性剂，从而在一段时间内提供所述生物活性剂的持续浓度。通过这种方式，可以在更长的时间内将生物活性复合物的浓度保持在治疗窗内，并且可以将所述生物活性复合物导向所需的位置，从而避免全身给药的潜在毒性作用。
[0093] 本发明的可植入药物传递装置将对许多应用有益，包括：
[0094] (1)淋巴系统的成像和可视化形式，例如γ闪烁造影法、正电子发射断层成像(PET)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、磁共振成像(MRI)、X-射线、计算机辅助的X-射线断层成像(CT)、近红外光谱、和超声。这些技术提供了关于涉及肿瘤，尤其是患有恶性病的对象体内无法达到的淋巴结的检测信息，并且还可以用于其它感染和炎性病症。这对了解淋巴结大小和淋巴结充盈(filling of nodes)也具有指导意义。在诊断应用中被如此导向淋巴结的颗粒将包含合适的造影剂或显像剂如铁磁材料如氧化铁、全氟化学品如全氟辛基溴、染料、或发射γ的放射性标记物如锝-99m、铟-111、镓-67、铊-201、碘-123、125、或131、发射正电子的放射性标记物如氟-18。其它显像剂包括荧光发射剂、光活化的染料。
[0095] (2)放射治疗。在放疗中被这样导入淋巴结的颗粒包括放射核标记的胶体如金-198和钇-90。它包括具有放射致敏剂、辐射防护剂、或光动力剂的胶体。参见例如Coleman，Int J Radiation Onc，42(4)：781783，1998，该文献全文纳入本文作为参考。它们还可以包括中子俘获剂如硼-10。这些物质在用中子照射后被激活。参见Barth等，Cancer Res 50：1061 1071，1990，该文献全文纳入本文作为参考。
[0096] (3)将治疗药物递送到淋巴结。参见例如Kohno等，J Infect Chemother，4：159173，1998；Lasic 等，Vesicles，Rosoff(ed)，Marcel Dekker，NewYork，477489，1996；
Bookman，Curr Opin Oncol 7(5)：478484，1995；Alving，J ImmunoMethods，140：113，
1991；Daemen，Medical Applications of Liposomes，Lasicand Papahadjopoulos(eds)，Elsevier Science B.V.，117143，1998；Gregoriadis 等，Medical Applications of Liposomes，Lasic and Papahadjopoulos(eds)，Elsevier Science B.V.，6173，1998；和Woodle 等，Medical Applications ofLiposomes，Lasic and Papahadjopoulos(eds)，Elsevier Science B.V.，429449，1998，所有文献均全文纳入本文作为参考。 [0097] 在一个实施方案中，本发明涉及治疗疾病或病症的方法，所述方法包括将本发明的可植入装置给予有此需要的对象，所述可植入的装置包括有效量的生物活性剂以治疗所述疾病。本发明还包括本发明的可植入装置在治疗疾病或病症中的应用，以及本发明的可植入装置在制备用于治疗疾病或病症的药物中的应用。在本发明的实施方案中，通过植入将本发明的可植入装置给予有此需要的对象。可以使用微创方法如腹腔镜检查或纵隔镜检查植入所述装置。在另一个实施方案中，可以在诊断程序过程中，例如在活组织检查或更具体地在淋巴结活组织检查的过程中植入所述可植入的装置。在这种情况下，可以立即开始治疗以改善对象的预后。在另一个实施方案中，可以在手术过程中植入所述可植入的装置。
手术的一些实施方案包括微创手术法如腹腔镜检查和纵隔镜检查、或手术活组织检查或肿瘤切除。在另一个实施方案中，通过植入胸膜腔或腹膜腔或皮下隔室给予或阴道或直肠给予所述可植入的装置。
Bookman，Curr Opin Oncol 7(5)：478484，1995；Alving，J ImmunoMethods，140：113，
1991；Daemen，Medical Applications of Liposomes，Lasicand Papahadjopoulos(eds)，Elsevier Science B.V.，117143，1998；Gregoriadis 等，Medical Applications of Liposomes，Lasic and Papahadjopoulos(eds)，Elsevier Science B.V.，6173，1998；和Woodle 等，Medical Applications ofLiposomes，Lasic and Papahadjopoulos(eds)，Elsevier Science B.V.，429449，1998，所有文献均全文纳入本文作为参考。 [0097] 在一个实施方案中，本发明涉及治疗疾病或病症的方法，所述方法包括将本发明的可植入装置给予有此需要的对象，所述可植入的装置包括有效量的生物活性剂以治疗所述疾病。本发明还包括本发明的可植入装置在治疗疾病或病症中的应用，以及本发明的可植入装置在制备用于治疗疾病或病症的药物中的应用。在本发明的实施方案中，通过植入将本发明的可植入装置给予有此需要的对象。可以使用微创方法如腹腔镜检查或纵隔镜检查植入所述装置。在另一个实施方案中，可以在诊断程序过程中，例如在活组织检查或更具体地在淋巴结活组织检查的过程中植入所述可植入的装置。在这种情况下，可以立即开始治疗以改善对象的预后。在另一个实施方案中，可以在手术过程中植入所述可植入的装置。
手术的一些实施方案包括微创手术法如腹腔镜检查和纵隔镜检查、或手术活组织检查或肿瘤切除。在另一个实施方案中，通过植入胸膜腔或腹膜腔或皮下隔室给予或阴道或直肠给予所述可植入的装置。
[0098] 在本发明的实施方案中，所述疾病或病症选自：瘤形成、细菌感染、微生物感染和病毒感染。所述疾病或病症的具体实例包括但不限于：肺癌、卵巢癌、食道癌、乳腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、胃肠癌、肝癌、胰腺癌、头颈癌、皮肤癌、淋巴瘤、肉瘤、胸腺瘤、间皮瘤、淋巴转移、丝虫病、布鲁杆菌病、肺结核和HIV感染。在本发明的合适实施方案中，所述疾病或病症是肺癌或肺癌的淋巴转移。
[0099] 在其另一个实施方案中，本发明包括将生物活性剂给予对象的淋巴系统的方法，所述方法包括将本发明的可植入装置植入所述对象，其中所述可植入的装置包括有效量的生物活性剂。
[0100] 此外，提供了制备用于预防或治疗对象体内的疾病或病症的药物的方法，所述方法包括：获得本发明的生物活性复合物，所述生物活性复合物包含用于治疗所述疾病或病症的有效量生物活性剂如治疗药物和任选的药物学可接受的载体；和用所述复合物浸渍生物相容且可生物降解的基质。
[0101] 在本发明的另一个实施方案中，提供了制备本发明的可植入装置的方 法，所述方法包括：在合适的溶剂内混合生物活性剂和颗粒形成材料，以形成溶液或悬浮液，然后将所述溶液或悬浮液喷雾干燥以形成生物活性复合物的颗粒。然后在合适的溶剂中将所述生物活性复合物的颗粒与生物相容的基质混合。然后除去溶剂，形成本发明的可植入装置。 [0102] 在本发明的实施方案中，将所述植入装置植入哺乳动物的淋巴系统附近，以治疗疾病或病症如癌症。
[0103] 用于本文时，术语“瘤形成”指组织或器官的异常、无组织生长，通常形成明显的团块。这样的生长称为瘤。瘤形成被理解为包括如癌症、肿瘤和生长的术语，并且可以是良性或恶性的。
[0104] 在用于本文时，术语药物的“有效量”或“足够量”指该量足以实现有益或期望的结果，包括临床结果，因此，“有效量”取决于它所应用的语境。例如，在施用癌症治疗药物的语境中，药物的有效量指例如与未施用所述药物时获得的响应相比足以获得这种治疗的量。施用有效量的生物活性剂定义为实现期望的结果所需的在剂量和作用时间方面都有效的量。例如，物质的有效量可以根据下列因素变化，例如疾病状态、个体的年龄、性别和体重、和抗体在个体体内产生期望的响应的能力。可以调整剂量方案以提供最佳治疗响应。 [0105] 在用于本文时，并且如本领域熟知的，“治疗”是获得有益或期望的结果，包括临床结果的方法。有益或期望的临床结果可以包括但不限于：缓和或改善一种或多种症状或病症，降低疾病的程度，稳定(即不恶化)疾病的状态，防止疾病的扩散，延迟或减缓疾病发展，改善或减轻疾病的状态，和无论是可检测还是不可检测的好转(无论是部分还是总体)。“治疗”也可以意味着与未接受治疗时预期的存活时间相比延长存活时间。 [0106] “减轻”疾病或障碍意味着与未治疗障碍相比，减少了所述障碍或疾病状态的程度和/或不良的临床表现，和/或减缓或延长了发展的时程。
[0107] 在另一个实施方案中，本发明涉及使用γ闪烁造影法、正电子发射断层成像(PET)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、磁共振成像(MRI)、X-射线、计算机辅助的X-射线断层成像(CT)、近红外光谱、或超声使淋巴系统成像或可视化的方法，所述方法包括将本发明的可植入装置给予对象，并进行γ闪烁造影法、正电子发射断层成像(PET)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、磁共振成像(MRI)、X-射线、计算机辅助的X-射线断层成像 (CT)、近红外光谱、或超声以使淋巴系统成像或可视化。在具体实施方案中，在诊断应用中被如此导向淋巴系统的颗粒将包含生物活性剂，所述生物活性剂是合适的造影剂或显像剂如铁磁材料如氧化铁、全氟化学品如全氟辛基溴、染料、或发射γ的放射性标记物如锝-99m、铟-111、镓-67、铊-201、碘-123、125、或131、发射正电子的放射性标记物如氟-18。
[0108] 本发明还包括本发明的可植入装置在使用γ闪烁造影法、正电子发射断层成像(PET)、单光子发射计算机断层成像(SPECT)、磁共振成像(MRI)、X-射线、计算机辅助的X-射线断层成像(CT)、近红外光谱、或超声光谱使淋巴系统成像或可视化中的应用，其中所述可植入的装置包括作为合适的造影剂或显像剂的生物活性剂。
[0109] 在本发明的具体实施方案中，本发明的可植入装置可用于可视化或成像肿瘤疾病内的前哨淋巴结。所述前哨淋巴结是转移中的肿瘤细胞在进入淋巴系统后遇到的首个淋巴结。前哨淋巴结的重要性在于如下事实，即转移中的肿瘤细胞会被免疫系统识别并终止在那里。通常，这些肿瘤细胞被位于前哨淋巴结内的免疫细胞破坏。然而，肿瘤细胞可能会存活，从而在前哨淋巴结内产生转移性疾病的病灶。如果肿瘤细胞已经转移到体内的其它位置，则有99％的可能将在前哨淋巴结内发现恶性肿瘤细胞。另一方面，如果在严格的病理学检查后没有在前哨淋巴结内发现肿瘤细胞，则在原发性肿瘤被除去后癌症将不易复发。因此定位前哨淋巴结并且必要时将治疗特异性地靶向这些淋巴结极为重要。本发明提供了将生物活性剂，如放射标记的胶体、或其它可检测的胶体递送到前哨淋巴结的新途经。可以在手术前通过微创方式将本发明的可植入装置引入特定位置或部位。然后可以在手术过程中识别前哨淋巴结并做仔细的病理检查，以确定需要施行淋巴结清扫的程度。
[0110] 本文所述的PLGA-PTX新型制剂避免了使用目前可注射紫杉醇制剂中所含的Cremophor EL。Cremophor EL可能引起严重的过敏反应。因此，这成为本发明的可植入装置的另一大益处，因为它避免使用在i.v.制剂中所必需但却有不良效果的添加剂。 [0111] 在另一个实施方案中，本发明涉及放射治疗的方法。在该实施方案中，所述生物活性剂是放射核标记的胶体如金-198和钇-90。如上所述，它包括 具有放射致敏剂、辐射防护剂、或光动力剂的胶体，并且还可以包括在用中子照射后被激活的中子俘获剂如硼-10。 [0112] 在用于本文时，冠词“a”和“an”指一个或多于一个(即至少一个)所述冠词的文法对象。
[0113] 在用于本文时，术语“包括”以包含端值的(inclusive)、开放的意义使用，意味着可以包括另外的元素。
[0114] 下列非限制性实施例用于举例说明本发明。
[0115] 实施例
[0116] 缩略语
[0117] DCM二氯甲烷
[0118] DMSO二甲亚砜
[0119] DOX多柔比星
[0120] EDC 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺
[0121] FBS胎牛血清
[0122] GFP绿荧光蛋白
[0123] HPESO环氧化大豆油的水解聚合物
[0124] HPLC高效液相色谱法
[0125] NHS N-羟基琥珀酰亚胺
[0126] PBS磷酸盐缓冲盐水
[0127] PLGA聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)
[0128] PLM聚合物-脂质微粒
[0129] PLN聚合物-脂质纳米颗粒
[0130] PTX紫杉醇
[0131] PVDF聚偏二氟乙烯
[0132] PVP聚乙烯吡咯烷酮
[0133] RPMI罗斯韦尔公园纪念研究所(Roswell Park Memorial Institute)
[0134] SDS十二烷基硫酸钠
[0135] SEM扫描电镜
[0136] TEM透射电镜
[0137] 化学品
[0138] 聚(DL-丙交酯-共-乙交酯)(PLGA，75：25，MW 90000-126000)、明胶(A型，275Bloom)、藻酸钠、紫杉醇(泰素或PTX)、胶原酶、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、罗丹明、十二烷基硫酸钠(SDS)、叠氮化钠、聚乙烯吡咯烷酮(PVP，K29-32级，平均MW58,000)、多柔比星(作为盐酸盐)、硬脂酸购自Sigma Chemical Co.，Canada。活性炭(USP级)购自Xenex，USA。HPESO(环氧化大豆油的水解聚合物)阴离子聚合物由Dr.Z.Liu和S.Erhan(食品医药管理局，USA)提供，PluronicF68(非离子型嵌段共聚物)是BASF Corp.(Florham Park，NJ，U.S.A)的赠品。掺有异硫氰酸荧光素(PSF)的氨基聚苯乙烯颗粒(0.29μm、2.18μm、11.2μm)和聚苯乙烯乳胶(2.5％固体颗粒，平均直径90nm)获自Polysciences(Wilmington，PA)。有机溶剂二氯甲烷(DCM)是HPLC溶剂。在高效液相色谱法(HPLC)中用作流动相的乙腈是HPLC级。硬脂酸在95％乙醇中重结晶纯化。含有钙和镁的磷酸盐缓冲盐水也购自Sigma Chemical Co.，并被用作体外释放测定的缓冲溶液。全程使用由Millipore(Millipore Corporation，MX，USA)生产的蒸馏水。LYVE-1兔多克隆抗体(ab14917)获自abcam，以1∶500稀释倍数在Dako抗体稀释液中稀释。
[0139] 细胞系和动物
[0140] NCI-H460人大细胞肺癌细胞获自美国典型培养物保藏中心(Americantype Culture Collection，ATCC)(Rockville，MD)。细胞在95％空气/5％CO2环境中，温度保持37℃，细胞在盛有10％胎牛血清且不含抗生素的RPMI 1640细胞培养液的T80培养皿内生长。当细胞达到约80％汇合时进行传代培养。
[0141] 用肝生长因子受体Met转染、表达绿荧光蛋白(GFP)的DLD-1人结肠癌细胞系由Dr.MS Tsao(Ontario Cancer Institute，Toronto，Canada)提供。细胞在补充有10％胎牛血清(FBS)(Gibco-BRL，Grand Island，NY)的Dulbecco’s改良Eagle培养液(DMEM)中常规培养。
[0142] 体重为200-250g的四周龄Rowett雄性裸鼠(CR：NIH-RNU)和雌性Sprague Dawley大鼠获自Charles River Laboratories Inc。在到达后，将动物独立的群体保持在微型隔离笼的特定无病原环境，处于受控的光线、温度和湿度。使动物适应1-2周，然后根据研究方案开展实验。雌性重症联合免 疫缺陷(SCID)小鼠于Ontario Cancer Institute(Ontario，Canada)内部生养。在6-8周龄时将动物用于实验研究。所有动物均喂以经消毒处理的食物并可自由饮水。所有操作均在层流罩中的无菌条件下进行。定期评价动物的健康状况。当动物显示晚期恶病质或濒临死亡的迹象时，通过CO2窒息对其实施人性化的安乐死。在动物实验前，从University Health Network/OntarioCancer Institute，University of Toronto获得院校实验动物管理许可(instituti onal animal care approval)。
[0143] 实施例1：不同种类的颗粒在胸膜腔淋巴道内的分布
[0144] 不同种类的颗粒在胸膜腔淋巴道内的分布已经在大鼠模型中进行了研究(Liu J等Lung Cancer 2006；51(3)：377-86)。模型系统由健康大鼠、接受肺切除术的大鼠、和携带同位移植肺癌的大鼠组成，以模拟与临床相似的境况。颗粒悬浮液给到胸膜腔内进行颗粒在淋巴道分布的研究。首先使用微细活性炭(木炭)颗粒作为示踪剂，以显示胸腔内给药后的颗粒在淋巴道的分布。根据肉眼检查、光学显微镜和透射电镜(TEM)的结果显示，区域淋巴管和淋巴结吸收了具有较广尺寸范围的炭颗粒。为了确定肺对这些颗粒的淋巴吸收的作用，在完成大鼠左肺切除后立即在胸膜腔内给予炭颗粒。结果显示与非手术动物有类似的淋巴颗粒分布形式，其中炭颗粒广泛沉积在区域淋巴管和淋巴结内。TEM影像照揭示，在淋巴结内所见的大部分颗粒的尺寸为1-2μm。进一步的研究显示，与其它更宽尺寸范围的颗粒相比，处于这个尺寸范围内的颗粒具有更好的淋巴道分布，因为它们很容易在对侧纵隔和腹膜腔淋巴结内被识别出来。而且，TEM揭示，更微小尺寸的一些炭颗粒则被巨噬细胞吞噬并在毛细淋巴管内传输。随后，使用健康和同位移植(orthotopic)肺癌模型研究了各种颗粒在淋巴道的分布，包括用或未用聚(N-异丙基丙烯酰胺-共-甲基丙烯酸)表面改性的不可生物降解的荧光标记聚苯乙烯纳米颗粒，和罗丹明标记的可生物降解的PLGA微粒。无论构成颗粒的材料和颗粒的表面疏水性之间的差别如何，在区域淋巴管和淋巴结中都发现了类似的颗粒分布模式。在同位移植肺癌模型中，颗粒在胸膜腔内给药后被区域癌性淋巴结大量吸收。然而，颗粒在肺内的分布主要局限于脏层胸膜上的肺外周淋巴管。各种颗粒能在肺癌和肺切除动物模型中被淋巴系统选择性吸收这一结果本身提示，这种靶向策略在肺癌中的潜在 应用可被用作肺癌切除后的辅助手段。同样在对侧纵隔淋巴结中有颗粒分布吸收，所见观察提示了应用微粒靶向远离给药位置的淋巴引流区域的可能性。 [0145] 实施例2：胸膜腔内给予颗粒的大小尺寸对其在淋巴道分布的影响
[0146] 淋巴颗粒分布的主要因素是粒度xxxvi。将氨基聚苯乙烯颗粒进行放射标记，以评价颗粒尺寸对胸淋巴系统内的颗粒吸收的影响。将具有三种尺寸，即0.29μm(小)、111
2.18μm(中)、和11.2μm(大)的氨基聚苯乙烯颗粒直接用 铟(In)进行放射标记。对于小、中和大颗粒，标记效率分别为68.9±2.1％、81.9±3.2％、61.2±4.3％。在盐水和获
111 111
自大鼠的血浆中确定了 In-氨基聚苯乙烯的稳定性。结果显示 In-氨基聚苯乙烯放射标记在至少72小时内稳定。
2.18μm(中)、和11.2μm(大)的氨基聚苯乙烯颗粒直接用 铟(In)进行放射标记。对于小、中和大颗粒，标记效率分别为68.9±2.1％、81.9±3.2％、61.2±4.3％。在盐水和获
111 111
自大鼠的血浆中确定了 In-氨基聚苯乙烯的稳定性。结果显示 In-氨基聚苯乙烯放射标记在至少72小时内稳定。
[0147] 通过左侧胸膜内给药，在大鼠中进行111In-氨基聚苯乙烯的体内生物分布研究。使用四组大鼠(每组四只)，检查颗粒尺寸对其在淋巴道吸收的影响。分别用0.29μm、
111
2.18μm、和11.2μm的 In-氨基聚苯乙烯处理三组动物(4mg，200μci/每只)，用游离
111
In(200μci/每只)处理一组动物作为对照。在给药24小时后，收集组织样品，包括左侧纵隔淋巴结(LLN)、右侧纵隔淋巴结(RLN)、血液、肺、和胸膜洗液，称重，随后测量放射活性。通过与注射样品的标准等份相比，计算每个器官所含的注射剂量百分比(％ID)。组织生物分布结果示于图1。在胸膜内给药24小时后，与其它组相比，2.18μm聚苯乙烯颗粒对于LLN和RLN两者都具有明显更高的淋巴吸收。对于LLN，小、中、大尺寸组和对照组的％ID分别为5.81±2.93％、16.64±4.58％、3.47±1.83％、和1.14±1.32％。对于RLN，小、中、大尺寸组和对照组的％ID分别为2.55±2.28％、10.98±3.59％、3.41±1.19％、
0.499±0.468％。(平均值±SD，n＝4，P＜0.01，不成对学生t检验)。
111
2.18μm、和11.2μm的 In-氨基聚苯乙烯处理三组动物(4mg，200μci/每只)，用游离
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In(200μci/每只)处理一组动物作为对照。在给药24小时后，收集组织样品，包括左侧纵隔淋巴结(LLN)、右侧纵隔淋巴结(RLN)、血液、肺、和胸膜洗液，称重，随后测量放射活性。通过与注射样品的标准等份相比，计算每个器官所含的注射剂量百分比(％ID)。组织生物分布结果示于图1。在胸膜内给药24小时后，与其它组相比，2.18μm聚苯乙烯颗粒对于LLN和RLN两者都具有明显更高的淋巴吸收。对于LLN，小、中、大尺寸组和对照组的％ID分别为5.81±2.93％、16.64±4.58％、3.47±1.83％、和1.14±1.32％。对于RLN，小、中、大尺寸组和对照组的％ID分别为2.55±2.28％、10.98±3.59％、3.41±1.19％、
0.499±0.468％。(平均值±SD，n＝4，P＜0.01，不成对学生t检验)。
[0148] 为了进一步检查颗粒在区域淋巴组织内的保留时间，胸膜内给予中等尺寸111
(2.18μm)的 In-氨基聚苯乙烯颗粒，并在胸膜内给药6小时、24小时、48小时、和72小时后检查体内生物分布。峰淋巴吸收大约发生在注射24小时后。LLN和RLN的24小时吸收分别为14.46±1.5％和11.24±4.35％。在72小时后，分别有3.20±3.24％和
2.13±1.84％ID保留在LLN和RLN内。全身吸收进入血液、肺的量分别为0.121±0.029％、
1.229±0.678％，明显低 于分布到淋巴组织内的水平(p＜0.01，图2)。闪烁造影显像显
111
示在纵隔淋巴结区域存在大量累积的 铟放射活性。这与在尸体检查时发现的淋巴组织内的颗粒累积具有良好的相关性。
(2.18μm)的 In-氨基聚苯乙烯颗粒，并在胸膜内给药6小时、24小时、48小时、和72小时后检查体内生物分布。峰淋巴吸收大约发生在注射24小时后。LLN和RLN的24小时吸收分别为14.46±1.5％和11.24±4.35％。在72小时后，分别有3.20±3.24％和
2.13±1.84％ID保留在LLN和RLN内。全身吸收进入血液、肺的量分别为0.121±0.029％、
1.229±0.678％，明显低 于分布到淋巴组织内的水平(p＜0.01，图2)。闪烁造影显像显
111
示在纵隔淋巴结区域存在大量累积的 铟放射活性。这与在尸体检查时发现的淋巴组织内的颗粒累积具有良好的相关性。
[0149] 结果暗示，粒度对于淋巴系统内的颗粒分布有明显影响。在大鼠模型中，大约2μm似乎是合适的颗粒尺寸用来通过胸膜腔给药靶向胸淋巴。
[0150] 实施例3：PLGA、PLGA-PTX微球的合成和表征
[0151] PLGA和载有紫杉醇的PLGA微粒的制备
[0152] 根据Mu L等，使用喷雾干燥技术制备PLGA微球xxxvii，方法上同时进行了一些改TM TM良。简言之，通过使用具有标准喷嘴(0.7mm直径)的Buchi 微型喷雾干燥器B-191(Buchi Laboratory-Techniques，Switzerland)，进行实验室规模的喷雾干燥，以制备载有紫杉醇的PLGA微球。操作条件设置如下：入口空气温度54℃，出口温度43℃，喷雾流速控制(700NL/h)，泵设置在进料喷雾速率4.0-4.5ml/min，雾化压力6bar(90PSI)，吸气器设置水平(100％)。将PLGA、PTX溶于适当体积的二氯甲烷(DCM)，(材料基质和药物在有机溶液中的总浓度为～2％；2.0g PLGA/100ml DCM；PLGA∶PTX＝1∶0.08w/w)，然后在室温下用磁力搅拌器搅拌，直到成分均匀溶解为止。然后将溶液喷雾干燥，直到再不能喷出产品为止。对于PLGA-罗丹明颗粒的制备，将罗丹明粉末和PLGA聚合物一起溶于DCM中(20mg罗丹明，4.0g PLGA溶于200ml DCM)。收集经干燥的产物。将所得微球贮存在室温真空干燥器中。根据相同的方法，制备其中不含PTX和罗丹明的安慰剂微球。
[0153] 载有紫杉醇的PLGA微粒的表征
[0154] 粒度和形态
[0155] 使用Coulter LS230激光衍射粒度分析仪(Beckman Coulter，Inc.)确定粒度分布。在粒度分析前，将微球悬浮在包含0.1％Tween 80的水中以防止聚集。对于每份样品，计算三次测定的平均直径。所报告的值是平均值±三批不同颗粒的标准差。
[0156] 使用扫描电镜(SEM)(JEOL JSM-5900LV)确定PLGA-PTX微粒、及原料PTX粉末的表面形态。
[0157] PLGA颗粒中含药量的确定
[0158] 使用HPLC(HP1090液相色谱仪)重复三次测定微球中的PTX含量。精密称量0.5mg载有紫杉醇的微球并溶于0.5ml DCM。在室温下轻柔地引入氮气流以挥发DCM。然后添加1.0ml乙腈-水(50∶50v/v)并混合直到获得澄清的溶液。将溶液放入小瓶中供HPLC检测。对于每种制剂，由三次重复测量计算PTX总含量的平均值。使用孔径大小5μm的反相Inertsil ODS-218碳柱(C18)。流动相由乙腈-水(50∶50，v/v)的混合物组成，用泵以
1.0ml/min的流速供应。用自动进样器进样50μl等份的样品。用UV检测器在227nm检测柱流出物。将载药量计算为载入微球内的药物重量与PLGA-PTX颗粒复合物重量的重量比。
1.0ml/min的流速供应。用自动进样器进样50μl等份的样品。用UV检测器在227nm检测柱流出物。将载药量计算为载入微球内的药物重量与PLGA-PTX颗粒复合物重量的重量比。
[0159] 实验进一步确定了PLGA-PTX微球中可能存在的游离PTX量。收集微球并用蒸馏水洗涤三次以除去可能的游离PTX。通过用孔径大小0.45μm的硝酸纤维素膜(Cat.TMNo.200-4045，Nalgene Labware)过滤收集微球，并在室温下减压干燥。使用HPLC进一步确定洗出液中的PTX量和保留在PLGA微球上的PTX量。在进一步分析前，将所得微球在室温下保存在干燥器中。PLGA-PTX微球的体外药物释放
[0160] 在37℃的温度下，在PBS溶液中测定载有紫杉醇的PLGA微球的体外药物释放，实验重复三次。在螺帽试管中，将15mg载有紫杉醇的PLGA微球悬浮在包含0.1％(v/v)TMTween 80的10ml PBS液中。在37℃的调温烘箱中，以30rpm上下翻转试管，在预定的时间间隔，将样品以10,000rpm离心10分钟后，取8ml顶部上清液供分析。然后将8ml新鲜PBS补充加入试管。将所沉淀的微球样品再悬浮于10ml PBS缓冲液中并放回烘箱。如下确定8ml上清液中的紫杉醇量：将紫杉醇萃取到3ml DCM中，然后在45℃和N2流下挥发至干，复溶到2ml 50∶50乙腈∶水(v/v)中，并如上所述通过HPLC分析。得到累积药物释放曲线。
[0161] 结果
[0162] 微球制备和包封率
[0163] 使用喷雾干燥技术成功制备了载有PTX的PLGA微球、PLGA-罗丹明微球和安慰剂PLGA。PLGA在有机溶剂中的浓度为2％(w/v)。喷雾干燥产 品的产率为12.3％。根据不同的产物批次，颗粒的载药量为6.6％-7.2％(w/w)，包含82.5％-90％预期量的初始PTX载量(8％)。从PLGA-PTX微球中洗脱的游离PTX部分占总载药量的0.69％，此量甚小，故予忽略。因此，对用于其余研究的PLGA-PTX微球没有进行洗涤。
[0164] 喷雾干燥技术被广泛用于制药和生化领域。尽管产率相对较低，这一技术有几个优点。喷雾干燥是一个一次性连续流程，通常产出均匀尺寸的颗粒。它易于按比例增加生产规模，比用于制备微球的其它常规方法更简单，更快捷。文献也记载了用于配制PLGA-PTXxxxviii xxxix xl xli微粒或纳米颗粒的几种其它技术 ，其中最广泛使用的是溶剂蒸发。
[0165] PTX是高度亲脂性的物质并且相对耐热，其熔点为213-220℃。这些特征使它非常适应本研究中所选用的制备参数和溶剂。通过调控喷雾干燥参数或引入化学添加剂譬如胆xlii固醇，喷雾干燥技术可发挥更大的潜能提高包封率和载药量 。
[0166] 微球的形态特征
[0167] SEM显微照片显示，所有三种类型的微粒均具有相似的球体形状，具有完整和相对光滑的表面。原料药PTX颗粒具有无规的晶体结构，粒度偏差非常大。SEM检查没有发现PTX晶体嵌入微球表面的证据。
[0168] 粒度和粒度分布
[0169] 所有三类PLGA微球大小均在1-8μm的相对狭窄的尺寸范围。一共制备了三批PLGA-PTX颗粒。微球的平均尺寸为3.5±2.1μm。SEM检查也进一步明确了粒度范围。粒xliii度在确定淋巴颗粒分布时是非常重要的因素 。淋巴递送的最佳粒度随着不同的身体xliv
部位而有一定的变化 。当腹膜腔内或胸膜腔内给予颗粒时，淋巴管壁上的开口是颗粒xlv
吸收的唯一尺寸限制屏障 ，因为颗粒只需单纯地从体腔进到表面淋巴管内，而无需通过组织间隙扩散。有关资料提示，通过腹膜腔或胸膜腔给药靶向区域淋巴结的合适粒度约为xlvi xlvii xlviii
1-5μm ，而靶向其它部位淋巴管的颗粒可能需要纳米尺寸 。我们制备的颗粒粒度似乎适合通过腹膜腔和胸膜腔给药靶向淋巴。在本项研究中，我们无意制备多种尺寸的xlix l li lii
PLGA颗粒。然而，使用不同的制 剂方法可以制备具有不同尺寸范围的PLGA颗粒 。
liii
在制剂中应用适当的乳化剂或添加剂可以调控粒度和粒度分布 。
部位而有一定的变化 。当腹膜腔内或胸膜腔内给予颗粒时，淋巴管壁上的开口是颗粒xlv
吸收的唯一尺寸限制屏障 ，因为颗粒只需单纯地从体腔进到表面淋巴管内，而无需通过组织间隙扩散。有关资料提示，通过腹膜腔或胸膜腔给药靶向区域淋巴结的合适粒度约为xlvi xlvii xlviii
1-5μm ，而靶向其它部位淋巴管的颗粒可能需要纳米尺寸 。我们制备的颗粒粒度似乎适合通过腹膜腔和胸膜腔给药靶向淋巴。在本项研究中，我们无意制备多种尺寸的xlix l li lii
PLGA颗粒。然而，使用不同的制 剂方法可以制备具有不同尺寸范围的PLGA颗粒 。
liii
在制剂中应用适当的乳化剂或添加剂可以调控粒度和粒度分布 。
[0170] 紫杉醇从PLGA微粒中的体外释放
[0171] PLGA-PTX微球的紫杉醇体外释放曲线示于图3。在研究开始24小时以后，在每次测量过程中更换新鲜释放介质以保持漏槽条件。在最初21天，每天都测量累积药物释放，在剩下的研究中，由于药物释放缓慢而改为每5天测量一次。在整个释放研究过程中微球释放约37％的总包封的紫杉醇，相当于2.4mg紫杉醇或100mg载药微球。在最初24小时内观察到了初始阶段的突释(burst release)，在此过程中释放了6.8％的载药量。然后是在第二至第十四天观察到的接近零级释放动力学的较慢的阶段。在第14至第51天，释放速率逐渐降低。
[0172] 实施例4：包含微粒的明胶海绵的合成和表征
[0173] 包含PTX和PLGA-PTX颗粒的明胶海绵的制备
[0174] 将明胶粉末(A型，275 Bloom)在50℃蒸馏水中溶解2小时，以制备2％(w/w)明TM胶溶液。将5.0mg PLGA-PTX、或其等价量的游离PTX(330μg)加入到0.1％(w/v)Tween
80dH2O中。然后将预制颗粒悬浮液与相等体积的2％凝胶溶液混合，以制备1％(w/w)混合的明胶悬液(gel solution)。通过温和抽吸(pipetting)充分混合颗粒明胶悬液，然后将
2ml溶液放入24-孔细胞培养板(Corning)的塑料孔中。将样品在-30℃冷冻2小时并使用盘式冻干机(Dura-stop μP FTS System)冻干。冷冻干燥条件设置如下：一期干燥-30℃，冻干室真空200mT，持续72小时。二期干燥20℃，冻干室真空±20mT，持续4小时。 [0175] 包含各种微球的明胶-藻酸盐海绵的制备
80dH2O中。然后将预制颗粒悬浮液与相等体积的2％凝胶溶液混合，以制备1％(w/w)混合的明胶悬液(gel solution)。通过温和抽吸(pipetting)充分混合颗粒明胶悬液，然后将
2ml溶液放入24-孔细胞培养板(Corning)的塑料孔中。将样品在-30℃冷冻2小时并使用盘式冻干机(Dura-stop μP FTS System)冻干。冷冻干燥条件设置如下：一期干燥-30℃，冻干室真空200mT，持续72小时。二期干燥20℃，冻干室真空±20mT，持续4小时。 [0175] 包含各种微球的明胶-藻酸盐海绵的制备
[0176] 将明胶和藻酸钠的粉末在50℃双蒸馏水中溶解2小时，以制备1％(w/w)和2wt％(w/w)溶液。以明胶与藻酸钠的重量比为7∶3和5∶5混合两种溶液，并在室温下搅拌30分钟。然后将5mg PLGA、PLGA-罗丹明微球或炭胶体(具有三种不同的尺寸范围：700至
1500nm、400至600nm和140至240nm)分散到包含0.1％Tween 80(v/v)的20ml凝胶溶液中。然后将凝胶溶液注入24-孔聚苯乙烯细胞培养板(Corning)或小模具(353097 Cell culture Insert，Becton Dickinson)中，在-70℃冷冻过夜并在-50℃冷冻干燥72小时。 [0177] 包含微粒的明胶海绵的形态
1500nm、400至600nm和140至240nm)分散到包含0.1％Tween 80(v/v)的20ml凝胶溶液中。然后将凝胶溶液注入24-孔聚苯乙烯细胞培养板(Corning)或小模具(353097 Cell culture Insert，Becton Dickinson)中，在-70℃冷冻过夜并在-50℃冷冻干燥72小时。 [0177] 包含微粒的明胶海绵的形态
[0178] 相应地使用光学显微镜、荧光显微镜和SEM检查浸渍有PLGA、PLGA-PTX、PLGA-罗丹明、和炭胶体的明胶海绵的形态结构。包含PLGA-PTX微球的交联明胶海绵的制备 [0179] 用EDC/NHS系统交联
[0180] 对适当交联方法的选择应该考虑交联效果、保持PLGA-PTX微球的完整性、和交联liv剂对人体组织的潜在毒性。在本研究中，通过使用(EDC/NHS)系统进行明胶海绵的交联 ，lv
同时做一些改良。选择EDC/NHS系统是因为它与其它方法相比显示出更好的生物相容性 。
lvi lvii
其交联是通过谷氨酸或天冬氨酸残基与胺基团之间反应形成酰胺键而发生 。交联反应产生水溶性脲衍生物是唯一的副产物，它可以很容易地从人体中排除。因此，减少了因其它化学交联剂相关的毒性残余物释放而引起的担心。
同时做一些改良。选择EDC/NHS系统是因为它与其它方法相比显示出更好的生物相容性 。
lvi lvii
其交联是通过谷氨酸或天冬氨酸残基与胺基团之间反应形成酰胺键而发生 。交联反应产生水溶性脲衍生物是唯一的副产物，它可以很容易地从人体中排除。因此，减少了因其它化学交联剂相关的毒性残余物释放而引起的担心。
[0181] 以两种不同的EDC∶COOH摩尔比(1.75∶1和7∶1)将EDC/NHS直接引入明胶凝胶溶液，以获得具有不同交联程度的海绵，同时将NHS与EDC的摩尔比保持在0.4。在添加交联剂后，将样品在4℃保持30分钟，然后开始冷冻干燥。
[0182] 用甲醛气体交联
[0183] 在合成海绵后，还尝试了使用甲醛气体进行交联的方法。与将交联剂直接添加到凝胶溶液中或将海绵浸入交联介质的方法相比，气体交联法有助于保持海绵的形状和质地。在室温密闭容器中，将未交联的海绵悬至到1cm深的37％甲醛水溶液层上进行交联。甲醛气体的暴露时间从15分钟至24小时不等。在交联后，让海绵通风，并在连续真空的干燥器中放置2小时以尽量减少海绵中的残余甲醛。
[0184] 体外药物释放评价
[0185] 在含有生理浓度(500ng/ml)来自溶组织梭状芽胞杆菌(EC 3.4.24.3Sigma Chemical Company，St Louis，MO)的细菌胶原酶(IV型)及包含钙、镁 和0.5％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸盐缓冲溶液(1×PBS pH 7.4)中，测量PTX从PLGA-PTX微球，浸渍有游离PTX和含PLGA-PTX微球的明胶海绵在体外的释放，实验重复四次。将包含相当于330μgPTX量的微球或明胶海绵样品浸入50-mL锥形螺帽试管内的50mL培养基中，0.05％(w/v)叠氮化钠防腐处理培养基以防止微生物生长。在37℃温育样品，并在振荡培养箱TM -1
(Multitron II)中以100min 水平振荡。在给定的时间间隔，将试管以5000rpm离心15分钟。然后将200μl上清液滤过带有PVDF膜( -GV，Millipore，Carrigtwohill，Co.Cork，Ireland)的0.22μm针筒驱动过滤器。将100μl等份滤液与相等体积的乙腈在TM
1.5ml Appendorf 管中混合。在简短涡旋混合后，将混合物以10000rpm离心5分钟。如上所述将上清液提取后取样供HPLC检测。由校正曲线计算PTX的量。计算中通过校正因取样而丢失的溶液体积获得累积药物释放曲线。在药物释放研究结束时进一步确定紫杉醇的质量平衡。(表1)说明选择进行体外药物释放研究的样品。
(Multitron II)中以100min 水平振荡。在给定的时间间隔，将试管以5000rpm离心15分钟。然后将200μl上清液滤过带有PVDF膜( -GV，Millipore，Carrigtwohill，Co.Cork，Ireland)的0.22μm针筒驱动过滤器。将100μl等份滤液与相等体积的乙腈在TM
1.5ml Appendorf 管中混合。在简短涡旋混合后，将混合物以10000rpm离心5分钟。如上所述将上清液提取后取样供HPLC检测。由校正曲线计算PTX的量。计算中通过校正因取样而丢失的溶液体积获得累积药物释放曲线。在药物释放研究结束时进一步确定紫杉醇的质量平衡。(表1)说明选择进行体外药物释放研究的样品。
[0186] 明胶海绵的体外降解
[0187] 在包含胶原酶(500ng/ml)的水性介质中检查包含PLGA安慰剂微球的未交联和交联明胶海绵(EDC/NHS)的降解行为，所述水性介质类似于未添加SDS的药物释放介质。试验使用具有相似尺寸和重量(40-45mg)的海绵样品进行研究。将未交联、低度交联(EDC∶COOH＝1.75∶1)和高度交联(EDC∶COOH＝7.1)的样品(各种类型取三个样品-1n＝3)分别浸入40ml降解介质中。在37℃温育样品，并以100min 水平振荡。记录海绵完成降解所需的时间。研究持续3周，期间还观察了PLGA微球从海绵体的释放。 [0188] 使用改良酶降解测定法评价了用甲醛气体交联的明胶海绵的降解能力。将重量为
40-45mg的海绵片浸泡在37℃PBS溶液中，该溶液包含CaCl2 和浓度为200μg/ml(200mg/g海绵)的胶原酶(IV型，来自Sigma ChemicalCo.)。记录海绵完全降解所需的时间。 [0189] 明胶海绵的膨胀
40-45mg的海绵片浸泡在37℃PBS溶液中，该溶液包含CaCl2 和浓度为200μg/ml(200mg/g海绵)的胶原酶(IV型，来自Sigma ChemicalCo.)。记录海绵完全降解所需的时间。 [0189] 明胶海绵的膨胀
[0190] 为了测量海绵的膨胀能力，将预先称重的干燥海绵样品在蒸馏水中浸泡20秒。将湿海绵在Petri-盘上放置1分钟以除去未吸收的(bulk)水份， 然后测量湿样品的重量。用6个不同的海绵片重复该程序。然后，根据下列方程确定海绵膨胀能力：
[0191] ％膨胀＝[(Ww-Wd)×100/Wd]
[0192] 其中Ww和Wd分别表示湿样品和干样品的重量。
[0193] 结果
[0194] 浸渍有PLGA微球的明胶海绵的形态
[0195] 明胶和明胶藻酸盐海绵装置可以被制备成具有不同的尺寸、不同的几何形态和包含有不同的成分。各种类型的具代表性的海绵样品示于图4。PLGA-PTX微球的形态与包含于明胶海绵内的微球形态相似，这提示明胶海绵的合成过程对于颗粒形态没有明显影响。所制备的所有海绵均显示相似的网格结构。在高倍显微镜下，海绵结构内的微球清晰可见，其中微粒均匀分散在海绵网络内。在一些区域，微球联结成葡萄串状与海绵基质交互混合。
还进一步检查了包含有PLGA-PTX微球的交联明胶海绵的形态。当用EDC/NHS处理明胶凝胶后，所成海绵的孔径比未交联的明胶海绵的孔径大。然而，交联海绵的孔隙率低于未交联海绵的孔隙率。从所获得的包含有PLGA-罗丹明微球的明胶海绵的荧光显微照片显示大量PLGA-罗丹明微球存在于海绵基质当中。
还进一步检查了包含有PLGA-PTX微球的交联明胶海绵的形态。当用EDC/NHS处理明胶凝胶后，所成海绵的孔径比未交联的明胶海绵的孔径大。然而，交联海绵的孔隙率低于未交联海绵的孔隙率。从所获得的包含有PLGA-罗丹明微球的明胶海绵的荧光显微照片显示大量PLGA-罗丹明微球存在于海绵基质当中。
[0196] 明胶海绵的交联、膨胀和体外降解
[0197] 经用EDC/NHS处理明胶溶液后形成海绵的交联。研究对两种不同的EDC∶COOH摩尔比(1.75∶1和7∶1)所达到的交联程度进行了比较。对海绵机械性能的评价并非本研究的目的，因为交联海绵显得更有粘性。结果显示，明胶的交联程度随着EDC与COOH的摩尔比上升而增加。这导致海绵更耐受在含胶原酶的PBS溶液中的降解。在包含胶原酶(500ng/ml)的水性介质中，用1％凝胶溶液制成的40mg明胶海绵需45-60分钟完全降解。浸渍在海绵中的PLGA微球随着海绵崩解而迅速释放。在温育3周后，具有EDC∶COOH＝
7∶1摩尔比的高度交联明胶海绵在相同的介质中保持完整或不溶。实验没有发现PLGA微球明显从海绵基质中释放出来。在温育10天后，具有EDC∶COOH＝1.75∶1摩尔比的相对低度交联的海绵完全崩解。同时观察到PLGA微球释放到了介质中。用甲醛气体交联的明胶海绵的酶降 解能力示于表2。结果显示，在相同的甲醛气体暴露时间下，明胶海绵的体外生物降解能力与凝胶溶液的浓度成反比。将亲水性聚合物藻酸盐引入凝胶基质将提高海绵的生物降解能力。保留PLGA颗粒倾向不从明胶基质中泄漏取决于诸多因素：降解时间、交联效果、释放介质及其组成。因此，一定程度地反应交联效果的体外生物降解能力的测定应该根据实验条件作相应的解释。
7∶1摩尔比的高度交联明胶海绵在相同的介质中保持完整或不溶。实验没有发现PLGA微球明显从海绵基质中释放出来。在温育10天后，具有EDC∶COOH＝1.75∶1摩尔比的相对低度交联的海绵完全崩解。同时观察到PLGA微球释放到了介质中。用甲醛气体交联的明胶海绵的酶降 解能力示于表2。结果显示，在相同的甲醛气体暴露时间下，明胶海绵的体外生物降解能力与凝胶溶液的浓度成反比。将亲水性聚合物藻酸盐引入凝胶基质将提高海绵的生物降解能力。保留PLGA颗粒倾向不从明胶基质中泄漏取决于诸多因素：降解时间、交联效果、释放介质及其组成。因此，一定程度地反应交联效果的体外生物降解能力的测定应该根据实验条件作相应的解释。
[0198] 明胶海绵的膨胀与交联程度成反比。对于未交联、低度交联和高度交联海绵(EDC/NHS)，膨胀百分比分别为746±41％、522±24％、和425±39％。这种倾向可能是由于添加交联剂而降低了海绵的孔隙率。结果是，高度交联的海绵无法将更多的水分保留在其网络结构内。
[0199] 大多数医用明胶海绵是交联的，以延长它们在人体内的降解时间。尽管已有报道通过几种交联剂如甲醛和戊二醛进行化学交联，但这些化学品在生物系统内的毒性成为令人担心的问题。EDC/NHS是具有生物安全性的明胶海绵交联系统。通过调整EDC/COOH摩尔比可以改变交联效果。根据文献，大多数交联过程是在合成明胶海绵后进行的。在这种情况下，将海绵暴露于包含EDC/NHS的水性介质或包含EDC的有机溶剂如90％(v/v)丙酮/水混合物以减少用于交联的EDC量。然而，这些方法不适合本研究，因为这样做可能会触发药物释放或者容易破坏PLGA-PTX微球的完整性。其它物理交联方法如加热和紫外线照射也不适合本研究，因为它们或可能破坏PLGA微球的完整性，或者可能降解PTX。包含PLGA-PTX微球的高度交联的明胶海绵样品被选为进行体外药物释放研究。
[0200] 明胶海绵的紫杉醇体外释放
[0201] 体外PTX释放曲线示于图5。当将包含原料药PTX晶粒的未交联明胶海绵放入药物释放介质时，它们膨胀，然后在一小时(45-60分钟)内完全溶解。在短暂暴露于释放介质(1小时)后，药物迅速并接近完全释放(＞90％)，并在整个研究过程中保持相似的水平，这暗示PTX本身没有控释性质。由于未交联的明胶海绵在释放介质内迅速崩解，所以水溶性明胶海绵对于PTX释放到介质中没有限制作用。总体上说，PTX从包含PLGA-PTX微球的所有明胶海绵体释放的速率是缓慢的。在19天的实验过程中，PLGA-PTX微球和包含PLGA-PTX微球的明胶海绵的药物释放曲线极为相似。结果显 示，在这段时间内释放了7.4-8.5％的总载药量。在第一个小时有小的突释(占所载的总PTX的约2％)，然后是更缓慢和连续的释放。在研究结束时(第19天)，在PLGA和明胶-PLGA复合物(未交联)的PTX释放量之间没有发现显著差异(P＞0.05，双尾t-检验)。然而，在药物释放研究的最初三天，包含PLGA-PTX微球的交联明胶海绵放慢了药物释放速率。这种初始药物释放的迟滞阶段明显不同于其它样品(图5)。在更慢但稳定地释放药物约4天后，PTX的释放似乎在另外3天达到了一个平台。然后是持续药物释放。到第19天为止，总共释放了7.1％的所载的总PTX。
[0202] 在完成体外释放研究后，尝试计算PTX的质量平衡。对于PLGA-PTX、包含PLGA-PTX的未交联明胶海绵和包含PLGA-PTX的交联明胶海绵，计算包括体外释放累积量加上从微球中回收的量。这三种样品PTX总回收率分别占初始载药量的57.7％、66.9％和63.3％。PTX累积释放百分比是基于考虑最终质量平衡计算得出的。总体结果显示，PLGA-PTX和海绵与PLGA-PTX的复合物两者均具有控释性质。然而，PTX的控释主要受制于PLGA聚合物微球的降解。交联的明胶海绵通过将PLGA-PTX微球保留在其膨胀基质内以减少聚合物暴露于水性介质，从而可以对PTX的释放发挥额外的限制作用。从本研究中获得的PTX总累积释lviii lixlx
放低于文献报道值 ，主要是因为使用了独特的药物释放系统和独特的取样方法。使用本方法，只需取出很小体积的释放介质供HPLC分析，这不同于用新鲜释放介质更替取样介质的其它方法，那种方式可能会改变药物释放环境。此外，使样品滤过孔径大小0.22μm的针筒过滤器(具有低PTX吸附的PVDF膜)，可以消除微球污染而造成的对PTX检测的影响。
放低于文献报道值 ，主要是因为使用了独特的药物释放系统和独特的取样方法。使用本方法，只需取出很小体积的释放介质供HPLC分析，这不同于用新鲜释放介质更替取样介质的其它方法，那种方式可能会改变药物释放环境。此外，使样品滤过孔径大小0.22μm的针筒过滤器(具有低PTX吸附的PVDF膜)，可以消除微球污染而造成的对PTX检测的影响。
[0203] PTX的控释对于治疗癌症具有很强的临床指导意义，因为它提供了在长时间内保持治疗药物有效浓度的可能性。PTX通过稳定细胞内的微管以促进微管集合而起作用，这阻lxi断了细胞周期的G2/M期 。这种细胞周期特异性作用可能导致细胞毒性受时间依赖性作用的影响。尤其是，更长的PTX暴露持续时间可以使更大比例的细胞进入G2/M期，这可以错误！未定义书签。
在PTX浓度超过0.05μM时提高细胞毒性 ，因为在此浓度以上细胞毒性更依赖
lxii
于提高暴露持续时间而不是提高PTX浓度 。此外，在体外通过延长药物暴露时间能够克lxiii
服癌细胞对PTX的耐药性 。
在PTX浓度超过0.05μM时提高细胞毒性 ，因为在此浓度以上细胞毒性更依赖
lxii
于提高暴露持续时间而不是提高PTX浓度 。此外，在体外通过延长药物暴露时间能够克lxiii
服癌细胞对PTX的耐药性 。
[0204] 本研究开发的明胶和PLGA-PTX微球复合物提供了进一步优化PTX控释的机会。由初期结果可知，通过进一步控制交联效果，或者通过以适当的组成将PLGA-PTX微球与游离PTX掺合到一起，以期获得理想的适用于淋巴靶向的PTX控释。
[0205] 实施例5：通过植入包含微粒和纳米颗粒的明胶海绵靶向区域淋巴系统体内淋巴靶向能力
[0206] 通过将所述海绵装置经腹膜腔和胸膜腔植入健康大鼠和携带同位移植肺癌的裸鼠体内，进一步研究淋巴靶向能力和生物相容性。应用包含PLGA-罗丹明微球和炭胶体的未交联明胶海绵。通过手术将海绵引入大鼠的腹膜腔和胸膜腔。对于腹膜腔植入的方法，通过吸入3％异氟烷将动物麻醉。在无菌条件下，在上腹部区域作一1.0cm的切口。将约40mg包含PLGA-罗丹明微球的明胶海绵放入腹膜腔富集淋巴样组织的胃小弯区。然后用外科伤口夹闭合腹部切口。
[0207] 对于胸膜腔植入的方法，通过吸入含～5％异氟烷将动物在诱导室先麻醉，然后通过口腔插入16号血管导管(Becton Dickinson，Infusion therapysystems Inc.Sandy，Utah 84070)。将动物置于右侧卧姿，固定四肢。将导管连接到循环容积的啮齿动物呼吸机，以80-100呼吸/分钟的速率递送10ml/kg潮气量，并维持3％异氟烷。将左侧胸壁清洁，剃毛，并用碘伏(betadine)灭菌。在第五肋间隙作一1.5cm前外侧皮肤切口并分离组织延及到胸膜腔。用无菌自动牵开器撑开肋骨。将包含PLGA-罗丹明或炭胶体的预制明胶海绵引入胸膜腔中间侧。在放入海绵后，用4-0丝线缝合肋骨，用外科伤口夹闭合皮肤切口。在已lxiv建立好的H460同位移植肺癌模型中进行相似的经胸膜腔植入海绵装置 。在支气管内植入H460肺癌细胞21天后，通过左侧开胸术将包含5mg PLGA-罗丹明的海绵植入胸膜腔。 [0208] 在植入第3天或第7天后对动物实施安乐死(每组n＝3)。获取所关注的组织，尤其是区域(纵隔、腹腔)淋巴结、其它淋巴样组织、网膜、肠系膜进行显微镜检查。将组织样本放入装有LAMB鸟氨酸氨基甲酰转移酶(OCT)包埋剂的组织孔内，迅速在干冰上冷冻。
制备3μm连续低温切片用于荧光显微镜检查和光学显微镜检查。在识别出荧光标记的颗粒后，将对应的组 织载玻片进行H&E染色，以通过光学显微镜确认其组织学结构。同时检查手术区域海绵的完整程度和残余碎片的证据。
制备3μm连续低温切片用于荧光显微镜检查和光学显微镜检查。在识别出荧光标记的颗粒后，将对应的组 织载玻片进行H&E染色，以通过光学显微镜确认其组织学结构。同时检查手术区域海绵的完整程度和残余碎片的证据。
[0209] 结果
[0211] 在动物体内植入海绵没有引起并发症。在植入三天后，所有海绵均部分地崩解。在植入七天后，海绵几乎完全崩解。荧光显微镜检查显示，区域淋巴结自发地吸收了通过腹膜腔和胸膜腔植入的PLGA-罗丹明微球。腹膜腔内植入明胶-PLGA海绵还导致肠系膜和腹膜后淋巴样组织的淋巴颗粒吸收，这些部位都是癌症扩散经常涉及的地方。通过胸膜腔内植入还将PLGA-罗丹明颗粒成功地递送到了癌性纵隔淋巴结。胸膜腔内植入炭明胶海绵勾勒出了炭胶体在胸区域淋巴组织内的分布。所述淋巴组织包括同侧和对侧纵隔淋巴结、肺门淋巴结、隆凸下淋巴结、乳内动脉淋巴结和后纵隔淋巴样组织。通过这种方法还回收到了含炭颗粒的腹腔淋巴结。SEM检查显示，处于较小尺寸范围(140-240nm或更小)的炭颗粒将由淋巴管吸收。尽管未交联的明胶海绵在体外迅速崩解(1小时内)，但在体内观察到了相对较慢的生物降解过程。这些饶有兴趣的初步体内研究结果是令人鼓舞的，因为它证明了这样一个原理，即通过植入我们新开发的淋巴药物传递装置，可生物降解和不可生物降解的颗粒药物载体都能被有效地递送到靶标淋巴管和淋巴结(局部、区域和远处)。 [0212] 实施例6：PLGA-紫杉醇的体外有效性
[0213] 以适当的密度将H460肺癌细胞铺种在盛有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基的6-cm细胞培养皿中，并使其粘附过夜。用游离紫杉醇、PLGA安慰剂或PLGA-紫杉醇中的一种并不同浓度处理H460细胞，以评价细胞毒性。将紫杉醇、及含相当量紫杉醇的PLGA-紫杉醇复合物和PLGA载体溶于DMSO(二甲亚砜，Sigma)，进一步用RPMI-1640培养基稀释。用
0.1-1000nM浓度的药物处理所培养的细胞。药物培养基内的最终DMSO浓度＜0.1％。用该浓度的DMSO对H460进行假处理作为实验对照。在添加药物后，将细胞在37℃温育48小时。然后吸掉药物培养基，用PBS将细胞漂洗一次。然后添加5ml体积的无药培养基。在包含95％空气和5％CO2混 合物的加湿培养箱中，将细胞保持在37℃培养基中温育14天，使得存活细胞生长成肉眼可见的集落。然后除去培养基，用0.5％亚甲蓝的70％乙醇溶液将癌细胞集落固定并染色。通过使用立体显微镜(Leica MZ FLIII)分析这些癌集落。使用图像分析软件Image pro-plus(6.0版)分析计数癌集落，基于铺种在6-cm培养皿中的细胞数目，从中计算平板效率。数出每个板上的集落，将结果表达为相对于在未暴露于紫杉醇的对照板上形成的集落的百分比。将紫杉醇处理的细胞杀灭值百分比作为所用药物浓度的函数制图。通过将经药物处理的细胞的平板效率除以未暴露于药物的细胞(即对照)的平板效率，确定存活分数。
0.1-1000nM浓度的药物处理所培养的细胞。药物培养基内的最终DMSO浓度＜0.1％。用该浓度的DMSO对H460进行假处理作为实验对照。在添加药物后，将细胞在37℃温育48小时。然后吸掉药物培养基，用PBS将细胞漂洗一次。然后添加5ml体积的无药培养基。在包含95％空气和5％CO2混 合物的加湿培养箱中，将细胞保持在37℃培养基中温育14天，使得存活细胞生长成肉眼可见的集落。然后除去培养基，用0.5％亚甲蓝的70％乙醇溶液将癌细胞集落固定并染色。通过使用立体显微镜(Leica MZ FLIII)分析这些癌集落。使用图像分析软件Image pro-plus(6.0版)分析计数癌集落，基于铺种在6-cm培养皿中的细胞数目，从中计算平板效率。数出每个板上的集落，将结果表达为相对于在未暴露于紫杉醇的对照板上形成的集落的百分比。将紫杉醇处理的细胞杀灭值百分比作为所用药物浓度的函数制图。通过将经药物处理的细胞的平板效率除以未暴露于药物的细胞(即对照)的平板效率，确定存活分数。
[0214] 结果
[0215] 在体外H460肺癌细胞显示出对紫杉醇治疗的敏感性。H460细胞生长对紫杉醇和PLGA-紫杉醇的响应是浓度依赖性的。在1.0-1000nM的浓度范围内，紫杉醇和PLGA-紫杉醇对H460细胞的集落形成具有相似的细胞毒性作用(图6A)。与假对照相比，PLGA对集落形成没有额外的作用(图6B)。药物的暴露持续时间明显影响紫杉醇的体外效力。当用lxvIC50(5nM)浓度的紫杉醇处理H460细胞时 ，细胞毒性更依赖于提高暴露于药物的持续时间(图C)。
[0216] Ringel等以前已经证实紫杉醇在细胞培养基内是稳定的lxvi。因此紫杉醇溶液的效力不至会在细胞温育过程中降低。
[0217] 从PLGA-PTX复合物中提取的紫杉醇与原始紫杉醇一样有效，这提示PLGA-PTX制剂过程对紫杉醇的有效性没有负面影响。提高紫杉醇的暴露持续时间可使给定样品中更多的细胞进入对紫杉醇具有活性的各细胞周期。药物暴露时间持续越短，越大比例的细胞可能在治疗期间完全处于紫杉醇敏感的G2和M期之外。此外，还发现当将紫杉醇与放疗依次或同时联用时，它是有效的放射致敏剂，因为它能同步G2/M期内的肿瘤细胞，G2/M期是细胞lxvii周期中最具放射敏感性的部分。临床前和临床研究都证明了紫杉醇的放射致敏作用 。
因此，将紫杉醇靶向递送至区域淋巴系统可以改善对淋巴转移的化疗和放疗效果。 [0218] 实施例7：合成含包封有多柔比星(Dox)的聚合物-脂质混杂微粒(PLM)或纳米颗粒(PLN)的明胶海绵
因此，将紫杉醇靶向递送至区域淋巴系统可以改善对淋巴转移的化疗和放疗效果。 [0218] 实施例7：合成含包封有多柔比星(Dox)的聚合物-脂质混杂微粒(PLM)或纳米颗粒(PLN)的明胶海绵
[0219] PLM-Dox和PLN-Dox系统的制备
[0220] 根据Wong等采用的研究方法，以相同的成分制备具有两种不同尺寸(微米尺寸lxviiiPLM；纳米尺寸PLN)的脂质颗粒 。将100mg硬脂酸和0.9ml水溶液的混合物温热到
72-75℃，所述水溶液包含4.2mg多柔比星和Pluronic-F68(2.5％w/v)，然后添加2.1mg HPESO聚合物，这是一种阴离子型聚合物，以前证明它能提高多柔比星在脂质相内的分布
1xix
。PLN制备如下：将混合物经过五次超声降解处理，其中每次持续2分钟，并将所得亚微米级乳液分散到4℃的水中(1份乳液对4份水)。而制备PLM时则通过用磁力棒机械搅拌代替超声处理。根据以往报道，取部份颗粒样品，通过可见/UV-分光光度法测定Dox载药量，通lxx TM
过光子关联光谱确定粒度 。通过能有效结合多柔比星的阳离子型离子交换剂Sephadex lxxi
C-25除去颗粒悬浮液内游离、未载药的多柔比星 ，然后将颗粒用于植入制剂。 [0221] 将预制颗粒悬浮液与相等体积的2％凝胶溶液混合，得到1％(w/w)混合凝胶溶液。通过轻柔抽吸充分混合凝胶溶液，然后将1ml溶液放入24-孔细胞培养板(Coming)的塑料孔中。将凝胶样品在-70℃冷冻过夜并在-50℃冷冻干燥72小时。
72-75℃，所述水溶液包含4.2mg多柔比星和Pluronic-F68(2.5％w/v)，然后添加2.1mg HPESO聚合物，这是一种阴离子型聚合物，以前证明它能提高多柔比星在脂质相内的分布
1xix
。PLN制备如下：将混合物经过五次超声降解处理，其中每次持续2分钟，并将所得亚微米级乳液分散到4℃的水中(1份乳液对4份水)。而制备PLM时则通过用磁力棒机械搅拌代替超声处理。根据以往报道，取部份颗粒样品，通过可见/UV-分光光度法测定Dox载药量，通lxx TM
过光子关联光谱确定粒度 。通过能有效结合多柔比星的阳离子型离子交换剂Sephadex lxxi
C-25除去颗粒悬浮液内游离、未载药的多柔比星 ，然后将颗粒用于植入制剂。 [0221] 将预制颗粒悬浮液与相等体积的2％凝胶溶液混合，得到1％(w/w)混合凝胶溶液。通过轻柔抽吸充分混合凝胶溶液，然后将1ml溶液放入24-孔细胞培养板(Coming)的塑料孔中。将凝胶样品在-70℃冷冻过夜并在-50℃冷冻干燥72小时。
[0222] 通过共焦荧光显微镜和SEM进一步检查包含PLM-Dox或PLN-Dox的明胶海绵。 [0223] 结果
[0224] PLM和PLN的多柔比星载药量分别为3.0±0.5％和3.2±0.4％(n＝3)。通过光子关联光谱法测量颗粒的粒度分布。PLM和PLN的平均粒度分别为1750±45nm和68±12nm。用于植入制剂的颗粒悬浮液包含2％(w/v)脂质含量。将两类颗粒的多柔比星浓度调节为
0.6mg/mL用于植入制剂。
0.6mg/mL用于植入制剂。
[0225] 还获得了包含PLM-Dox的海绵的SEM显微照片。根据共焦荧光显微镜检查，PLM-Dox和PLN-Dox被整合到了明胶基质内。单独的PLN-Dox系统显示具有延长的药物释lxxii放的特性，与以往的研究所报告结果相同 。大约50％所载有的Dox在4小时内释放，另有20-30％在另外72小时内释放。药物在大尺寸的颗粒中可能释放得更缓慢，因为大颗粒具有更小的有 效表面积。由于多柔比星本身是一荧光物质，所以整个可植入系统可用以研究在各种环境下的体内淋巴靶向能力。
[0226] 实施例8：在同位移植肺癌辅助(adjuvant)性治疗模型中证实PLGA-PTX明胶海绵在控制淋巴肿瘤方面的治疗效果
[0227] 同位肺癌模型和左肺切除
[0228] 应用同位移植肺癌模型检查浸渍有PLGA-PTX微球的明胶海绵的治疗效果。所述lxxiii模型在最初手术切除原发性肺肿瘤后，在区域淋巴结内具有明显的肿瘤复发 。因此，不难想像在切除原发性肿瘤后，可能会看到不同的转移模式，就像在其它实验性肿瘤系统中lxxiv
观察到的那样 。这样的模型还提供了一个相关的系统可以用来研究微转移和辅助性抗癌治疗的疗效。
观察到的那样 。这样的模型还提供了一个相关的系统可以用来研究微转移和辅助性抗癌治疗的疗效。
[0229] 对H460同位移植肺癌模型以前曾有过详细描述，它具有极大的转移潜能，可模拟lxxv 6人非小细胞肺癌 。简言之，通过小的气管造口，将H460细胞(1×10)经支气管内植入接受过预照射(5Gy)的裸鼠的肺内。在细胞植入三周后，从肿瘤块周围收获新鲜肿瘤组织，并在无菌条件下机械切割成直径0.5mm的片。然后使用相同的技术，将部分50mg肿瘤碎片植入裸鼠的左侧支气管。发现动物全部发生区域淋巴结转移和广泛的全身转移。 [0230] 支气管内肿瘤接种14天后对动物进行左肺切除术以完全除去原发性肿瘤，以模拟早期肺癌患者的手术治疗，因为此时区域淋巴结转移尚未形成。麻醉和开胸术方法与前述相同。在成功的开胸术后，识别出左肺门并用4-0丝线结扎。结扎线内包括供应左肺的左主支气管和主要血管。在结扎线远端切除左肺。用电烙将切口边缘灼烧以进一步灭杀可能的肿瘤细胞。再将动物随机分成两组(每组n＝8)。组I：不再做进一步治疗；组II：胸膜腔内植入包含PLGA-PTX(100mg/kg)的明胶海绵。在治疗后，用4-0丝线缝合复合肋骨，用外科伤口夹闭合皮肤切口。通过相同的胸膜腔内植入方法，用空白明胶海绵处理携带肺癌的动物组(n＝3)作为假对照，以确定明胶基质对癌症复发的影响。动物随诊至肿瘤植入后40天(肺肿瘤切除后26天)，以检查肿瘤复发率，尤其是淋巴系统内的肿瘤复发率。 [0231] 肿瘤复发的评价
[0232] 在动物死亡后进行仔细的尸检。在不同位置，包括淋巴结、对侧肺、骨、肾、脑、软组织(牙龈)等处对肿瘤的发生做大体的评价。取出内部器官，包括肺、肾、脑、胸壁、骨、以及淋巴结，固定在10％福尔马林缓冲液中，然后组织包埋在石蜡中。将所有组织依次切片并用苏木精和伊红(H&E)染色，以便进行显微镜检查。除了原发性肿瘤外，发现的任何肉眼可见或显微镜下可见的肿瘤都被认为是转移灶。将器官或组织分为有转移发生(阳性)或无转移发生(阴性)。主要评价目标是淋巴结转移的发生，以及如果存在任何复发，复发癌性淋2
巴结的肿瘤负担(重量和体积)。通过公式0.52×长度×宽度 计算肿瘤体积。次要评价目标是全身转移的发生率。
巴结的肿瘤负担(重量和体积)。通过公式0.52×长度×宽度 计算肿瘤体积。次要评价目标是全身转移的发生率。
[0233] 统计分析
[0234] 使用方差分析(ANOVA)或不成对学生t-检验处理淋巴结重量和体积。使用Fisher’s精确检验比较治疗组和未治疗对照组之间的转移发生率。
[0235] 结果
[0236] 术中植入包含PLGA-PTX的明胶海绵显著减少了淋巴道肿瘤转移。治疗组的淋巴转移发生率25％(2/8)显著低于对照100％(8/8)(p＜0.01)。治疗组的其中一个复发淋巴结转移只能用显微镜识别。然而，治疗组和对照组在控制全身转移方面没有差异。与未治疗的对照相比，在治疗组中，由淋巴结重量和体积所代表的复发淋巴结的肿瘤负荷明显更低。在从植入海绵的动物体内回收的淋巴组织中，显微镜下可以识别出大量PLGA-PTX微球。在假治疗对照(用空白明胶海绵治疗)与未治疗的对照之间，肿瘤复发模式没有差异。 [0237] 所用给药装置能对侵袭性同位移植肺癌模型中的淋巴道肿瘤转移产生特异性抑制的结果提示，这项正在开发的淋巴靶向策略获得了重要成功。配备有作为二级药物转运载体的明胶基质，PLGA-PTX微球可以被有效和特异地递送到区域淋巴系统。
[0238] 实施例9：在结肠癌中显示控制淋巴肿瘤转移的治疗效果和靶向能力DLD1同位结肠癌模型的构建
[0239] 首先建立皮下异种移植物，通过在2-3只动物双肋腹注射1×106 DLD1(Met)肿瘤细胞产生供体肿瘤用来建立同位移植结肠肿瘤。在同位植入前，获取皮下肿瘤并用包含抗3
生素的培养基洗涤。在除去样本中的坏死组织和非癌性组织后，将肿瘤切割成平均1cm 的尺寸供同位植入。选用肿瘤浅表区的具活性的肿瘤组织进行移植。通过使用包含～5％异氟烷的异氟烷诱导室麻醉SCID小鼠，然后通过鼻罩保持1.5至3.0％的异氟烷维持麻醉。
绑住麻醉的小鼠的四肢，将小鼠固定在小的动物手术台上，背向手术台。根据Pocard及同lxxvi
事所述的方法经做一些改良后进行肿瘤移植 。简言之，通过小型中线剖腹术取出盲肠，用单个6/0plorene缝合线将一片肿瘤组织缝到盲肠表面，使肿瘤组织包埋在由两侧盲肠壁所组成的“荷包袋”内。在肿瘤种植完成后，用不锈钢伤口夹闭合腹壁。该模型系统具有突出的淋巴道肿瘤转移潜能。在肿瘤植入五周后，可见广泛的淋巴转移，包括肝门或门脉旁淋巴结、腹腔淋巴结、肠系膜淋巴结、以及通过向头部方向扩散到达纵隔淋巴结。平均起来，动物在植入肿瘤70-80天后死于疾病。通过腹腔内植入包含PLM-Dox的明胶海绵治疗同位移植结肠癌模型中的
生素的培养基洗涤。在除去样本中的坏死组织和非癌性组织后，将肿瘤切割成平均1cm 的尺寸供同位植入。选用肿瘤浅表区的具活性的肿瘤组织进行移植。通过使用包含～5％异氟烷的异氟烷诱导室麻醉SCID小鼠，然后通过鼻罩保持1.5至3.0％的异氟烷维持麻醉。
绑住麻醉的小鼠的四肢，将小鼠固定在小的动物手术台上，背向手术台。根据Pocard及同lxxvi
事所述的方法经做一些改良后进行肿瘤移植 。简言之，通过小型中线剖腹术取出盲肠，用单个6/0plorene缝合线将一片肿瘤组织缝到盲肠表面，使肿瘤组织包埋在由两侧盲肠壁所组成的“荷包袋”内。在肿瘤种植完成后，用不锈钢伤口夹闭合腹壁。该模型系统具有突出的淋巴道肿瘤转移潜能。在肿瘤植入五周后，可见广泛的淋巴转移，包括肝门或门脉旁淋巴结、腹腔淋巴结、肠系膜淋巴结、以及通过向头部方向扩散到达纵隔淋巴结。平均起来，动物在植入肿瘤70-80天后死于疾病。通过腹腔内植入包含PLM-Dox的明胶海绵治疗同位移植结肠癌模型中的
[0240] 淋巴转移
[0241] 在盲肠肿瘤接种七天后，将20只动物随机分成两组，即治疗组和非治疗对照组(每组n＝10)。治疗组通过腹膜腔内植入包含PLM-Dox的明胶海绵(0.3mg/动物或海绵)作为进一步干预，而对照组不接受进一步的治疗。海绵植入的方法是通过原先切口进行剖腹术后，将海绵破碎成几个小片，放置在肿瘤移植部位、隔下和肝门区域。
[0242] 体内显像
[0243] 在处死动物后，立即使用MaestroTM体内显像系统(CRi Inc.PixelMEDIA，Inc.)检查GFP和多柔比星的荧光信号。在肿瘤植入35天后，少量的动物(各组n＝2)处死后做这一检查，以评价淋巴靶向能力。该系统配有独特的多谱显像技术，能够区分多柔比星、GFP和其它来源的荧光信号。
[0244] 肉眼检查和显微镜检查
[0245] 在肿瘤植入47天后(在海绵植入40天后)处死实验动物，以评价淋巴靶向递送的效率。记录体重。进行尸检，肉眼评价原发性肿瘤、淋巴结转移或远处转移。将肉眼检查2
所见的肿瘤称重并取样供组织学检查。通过公式0.52×长度×宽度 计算淋巴结体积。
对于荧光检查，将组织样品埋入鸟氨酸氨基甲酰转移酶(OCT)化合物(Miles，Elkhart，IN)中，在干冰上冷冻并在-70℃贮存。然后制备3μm连续低温切片供荧光显微镜检查(Leica TCSSP2-X1共焦光谱和多光子显微镜)。多柔比星和GFP检查的发射波长分别为540-650nm和460-500nm。在识别荧光标记的颗粒后，对平行切片的组织载玻片进行H&E染色，以通过光学显微镜证实其组织学结构。为了了解颗粒递送与淋巴管分布的关系，用特异性淋巴标记物LYVE-1抗体也就是淋巴管内皮细胞表达的透明质酸受体，对区域淋巴结和肠系膜组lxxvii
织进行免疫染色 (Prevo R等，J.Biol.Chem.2001；276：19420-19430)。将冷冻组织载玻片在2％甲醛/PBS中固定20分钟，并阻断内源性过氧化物酶(0.3％H2O2)和生物素(Vector lab生物素阻断试剂盒)活性。所有后续反应均在室温下进行，并用PBS缓冲液洗涤。将载玻片在LYVE-1一级抗体(Abcamab14917兔多克隆，以1∶500稀释倍数在Dako抗体稀释液中稀释)中温育1小时。然后用抗兔IgG-生物素共轭的联合试剂(Vector Lab)和链霉素HRP标记试剂(Idetect Ultra HRP检测系统，ID Labs inc)处理，NovaRed(Vector Lab)作为底物。在Gill改性苏木精(Harleco)中将载玻片复染并置于Permount(Fisher Scientific)中。
所见的肿瘤称重并取样供组织学检查。通过公式0.52×长度×宽度 计算淋巴结体积。
对于荧光检查，将组织样品埋入鸟氨酸氨基甲酰转移酶(OCT)化合物(Miles，Elkhart，IN)中，在干冰上冷冻并在-70℃贮存。然后制备3μm连续低温切片供荧光显微镜检查(Leica TCSSP2-X1共焦光谱和多光子显微镜)。多柔比星和GFP检查的发射波长分别为540-650nm和460-500nm。在识别荧光标记的颗粒后，对平行切片的组织载玻片进行H&E染色，以通过光学显微镜证实其组织学结构。为了了解颗粒递送与淋巴管分布的关系，用特异性淋巴标记物LYVE-1抗体也就是淋巴管内皮细胞表达的透明质酸受体，对区域淋巴结和肠系膜组lxxvii
织进行免疫染色 (Prevo R等，J.Biol.Chem.2001；276：19420-19430)。将冷冻组织载玻片在2％甲醛/PBS中固定20分钟，并阻断内源性过氧化物酶(0.3％H2O2)和生物素(Vector lab生物素阻断试剂盒)活性。所有后续反应均在室温下进行，并用PBS缓冲液洗涤。将载玻片在LYVE-1一级抗体(Abcamab14917兔多克隆，以1∶500稀释倍数在Dako抗体稀释液中稀释)中温育1小时。然后用抗兔IgG-生物素共轭的联合试剂(Vector Lab)和链霉素HRP标记试剂(Idetect Ultra HRP检测系统，ID Labs inc)处理，NovaRed(Vector Lab)作为底物。在Gill改性苏木精(Harleco)中将载玻片复染并置于Permount(Fisher Scientific)中。
[0246] 统计分析
[0247] 使用ANOVA或不成对学生t-检验进行淋巴结重量、体积和原发性肿瘤重量分析。使用Fisher精确检验比较淋巴结转移的发生率。
[0248] 结果
[0249] 在SCID小鼠的盲肠壁上同位植入DLD1(Met)肿瘤碎片导致100％肿瘤发生(tumor take)。所有对照动物(10/10)都发生了淋巴道转移，在尸检过程中，每只动物体内平均有3个可识别的转移淋巴结(从1-4个不等)。来自肠系膜、肝门、隔下和纵隔的淋巴结经常发现有肿瘤转移。然而，在治疗组 中，淋巴转移显著减少，其中10只动物中有2只(20％)发生了淋巴转移(P＜0.01)。在这两只动物中，总共识别出3个转移性淋巴结。而且，与对照组相比，在治疗组中，以肿瘤体积为代表的转移性淋巴结的肿瘤负荷显著小于非治疗组(P＜0.01)。通过腹膜腔内植入所述浸渍有PLM-Dox的海绵装置，还一定程度地抑制了局部原发性肿瘤生长(P＝0.062)。显微镜检查显示，在治疗动物的区域和远处淋巴管以及淋巴结内能识别到许多多柔比星荧光信号明显不同于在阴性对照中所见。体内荧光显像在发现转移性淋巴结的后纵隔和前纵隔部位见有大量多柔比星荧光信号。荧光显微镜检查揭示，许多PLM-Dox荧光信号出现在带有GFP表达的癌性淋巴结内。在区域淋巴结的门区域发现形态大、对LYVE-1抗体有反应、形态不规则、薄壁的淋巴管，而PLM-Dox主要出现在淋巴结的皮层和髓质部分。用LYVE-1抗体将肠系膜免疫染色，显示许多阳性染色淋巴管被肠系膜淋巴结包围。在肠系膜淋巴结和淋巴管的附近发现了多柔比星的荧光信号。 [0250] 实施例10：在淋巴瘤中证实淋巴靶向递送
[0251] 像大多数癌症化疗一样，治疗淋巴瘤的化疗药也主要通过静脉内给药进入全身循环。然而，治疗效果受到化疗药的剂量限制性毒性的极大限制。本发明开发了一个替代途径来将抗癌药递送到淋巴瘤。
[0252] 研究已经显示可以通过局部给药将脂质微粒或纳米颗粒递送到局部区域性淋巴lxxviii结 。脂质包封的药物制剂还提供了常规药物传递所不及的优点。例如，一些基于脂质的制剂提供了更长的体内半衰期，更好的组织靶向，和低毒性。文献中描述了基于脂质制备药物传递载体的许多方法(参见例如美国专利No.5,741,516，该文献纳入本文作为参考)。
本研究，将微粒或纳米颗粒药物载体掺入可植入的明胶海绵中，提供了一个可以局部控制淋巴瘤的新方向或方法。
本研究，将微粒或纳米颗粒药物载体掺入可植入的明胶海绵中，提供了一个可以局部控制淋巴瘤的新方向或方法。
[0253] 淋巴瘤是许多小鼠类型和种族中最常见的肿瘤。用于本研究的动物模型是具有PTEN突变的B6小鼠。年老B6小鼠是在动物中具有淋巴瘤高发生率的种类之一(10-50％)。大多数肿瘤是滤泡型B-细胞淋巴瘤，出现在脾脏、肠系膜淋巴结和/或派尔集合淋巴结。肿瘤还经常涉及纵隔，颈，腹股沟区和浅表淋巴结。
[0254] 选择表现为颈部肿大淋巴结的患有淋巴瘤的B6小鼠进行体内研究，以评估植入PLM-Dox明胶海绵的淋巴靶向能力。将海绵引入腹膜腔以检查PLM-Dox的淋巴递送。对照动物使用相同方法接受空白明胶海绵。
[0255] 为各组选择两只携带淋巴瘤的B6小鼠。麻醉和剖腹术程序与前面所述相同。将重量40mg的包含PLM-Dox(0.3mg/海绵或动物)的明胶海绵植入腹膜腔。用不锈钢伤口夹闭合伤口。对动物随诊7天，然后处死以评估淋巴颗粒分布。
[0256] 在处死动物时，获取肿大的颈部、腹腔和纵隔淋巴结。将组织样本放入装有LAMB鸟氨酸氨基甲酰转移酶(OCT)包埋剂的组织培养孔中，在干冰上迅速冷冻，然后在-70℃贮存。制备3μm连续低温切片用于荧光显微检查和光学显微(H&E染色)检查。
[0257] 结果
[0258] 腹膜腔内植入PLM-Dox海绵导致PLM-Dox微球被自发地吸收到有淋巴瘤累及的腹腔区域淋巴结和纵隔淋巴结内。在淋巴瘤累及的淋巴结内发现了大量的PLM-Dox荧光信号。
[0259] 实施例11：靶向乳腺的淋巴引流
[0260] 研究已显示包含多柔比星的新开发的聚合物-脂质混杂纳米颗粒(PLN-Dox)可增强对野生型和MDR表达的人乳腺肿瘤细胞系的体外细胞毒性。PLN-Dox对P-gp过度表达细lxxixlxxx胞系显示出更强的体外细胞毒性 。将PLN-Dox系统整合到可生物降解的可植入基质如明胶海绵内，可以极大地提高把PLN-Dox特异有效地递送至受乳腺癌累及的淋巴管和淋巴结的潜能。
[0261] 动物和手术方法
[0262] 通过皮下植入包含PLN-Dox的明胶海绵，在健康雌性Sprague Dawley大鼠中检查将PLN-Dox递送到区域淋巴系统的效率。对照动物采用相同的方法植入空白明胶海绵。通TM过Maestro 体内显像系统和荧光显微镜进一步检查颗粒在淋巴道的分布。
[0263] 通过使用包含～5％异氟烷的异氟烷诱导室麻醉大鼠，然后将通过鼻罩递送1.5至3.0％的异氟烷以维持麻醉。在胸骨稍左的胸壁上作一1.5-cm切口， 通过轻柔的钝性分离将皮肤与胸壁分离。产生一皮下袋。将重量40mg、包含PLN-Dox(0.3mg/海绵或动物)的明胶海绵(颗粒尺寸：50-100nm)植入皮下袋，并与乳腺脂肪垫直接接触。用间断的丝线缝合伤口。海绵装置植入完成后，立即通过Maestro体内显像系统获得多柔比星的基线荧光分布。在24小时和3天后分别再次作检查，以了解脂质-dox在腋窝区域的淋巴吸收。在处死动物时，从腋窝区域获取淋巴结。将组织样本放入装有LAMB鸟氨酸氨基甲酰转移酶(OCT)包埋剂的组织培养孔中，立即在干冰上冷冻，然后在-70℃贮存。制备3μm连续低温切片进行荧光显微镜检查。在识别荧光标记的颗粒后，对相应组织载玻片进行H&E染色，通过光学显微镜检查证实其组织学结构。
[0264] 结果
[0265] 植入海绵没有导致副作用。海绵被植入皮下乳腺脂肪垫3天后就几乎崩解。最初体内显像只在植入位置发现可辨别的多柔比星荧光信号。然而，相同动物的24小时和第3天体内显像揭示，在两个腋窝都识别到了多柔比星的荧光信号，其中左侧密度相对较高。荧光显微镜检查发现，从治疗动物体内获得的腋窝淋巴结包含大量PLN-Dox信号。而在对照动物的淋巴结内没有检查到可分辨的荧光信号。
[0266] 结果提示，含有PLN-Dox的可植入明胶海绵用于通过手术干预进行淋巴靶向是一种实际可接受的治疗方法。这种装置能够用于乳腺癌的辅助和新辅助治疗。使用乳腺癌动物模型做进一步的研究显得十分必要。
[0268] 所有公开、专利和专利申请被全文纳入本文作为参考，其程度如同具体和单独地指明每个单独的公开、专利或专利申请被全文纳入本文作为参考。
[0269] 表1
[0270]
[0271] 表2
[0272]
[0273] FV＝甲醛
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