一种造影剂及其制备方法和应用
阅读：532发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种造影剂及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种 造影剂 及其制备方法和应用，所述造影剂以Mn3[Co(CN)6]2 纳米粒子 为 内核 ，以 二 氧 化 硅 包覆层为 外壳 ，其弛豫率高、毒性低和 荧光 量子产率高，可应用于T1-T2双模式 磁共振成像 、磁共振血管成像、多波段 生物 荧光成像和双 光子 生物荧光成像。，下面是一种造影剂及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种造影剂，其特征在于，所述造影剂以Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子为内核，以二氧化硅包覆层为外壳，其中，所述内核具有立方块状结构。
2.根据权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述造影剂的粒径为160～200nm，比
2
表面积为500～700m/g，平均孔径为2～5nm。
3.根据权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述内核的粒径为150～180nm，比表
2
面积为150～250m/g，平均孔径为3～10nm，所述外壳的壳层厚度为10～20nm。
4.一种造影剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将锰盐和聚乙烯吡咯烷酮溶于水和乙醇的混合体系中，获得溶液A；
2)将钴氰酸盐溶于水中，获得溶液B；
3)将步骤2)中得到的溶液B加入步骤1)中得到的溶液A中，搅拌、离心，获得Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子；
4)将步骤3)中得到的Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子分散到乙醇溶液中，加入氨水后再加入正硅酸四乙酯，搅拌、离心，即获得以Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子为内核，以二氧化硅包覆层为外壳的造影剂。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的锰盐选自乙酸锰、氯化锰和硫酸锰中的一种，所述步骤2)中的钴氰酸盐选自钴氰酸钾、钴氰酸钠中的一种。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中水和乙醇的体积比为(0-3):(0-1)。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中锰盐和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:(15-30)。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述锰盐和钴氰酸盐的摩尔比为(1-5):(1-4)。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子的质量和正硅酸四乙酯的体积的比为(5-20):(20-50)，其中Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子的质量的单位为mg，正硅酸四乙酯的体积的单位为μL。
一种造影剂及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 据自然生物技术（Nature Biotechnology2007年，第25卷，217页）报道，生物医学成像技术在肿瘤的早期发现中起着非常重要的作用，其中磁共振成像和荧光成像是目前使用的最广泛也是最有效的成像技术。常用的磁共振造影剂有顺磁性配合物和超顺磁性纳米粒子两种。其中顺磁性配合物造影剂作为T1造影剂，尤其以钆喷酸葡胺（马根维显）在临床中应用最为广泛，然而已经有报导显示大剂量的使用马根维显易于引起肾源系统性纤维化，对人体有害。而超顺磁性纳米粒子作为目前常用的T2造影剂，主要代表为超顺磁性四氧化三铁纳米粒子，虽然具有很高的成像灵敏度，但是因为T2成像的低信号容易被出血干扰，也影响了它的实际应用。虽然现在已经有报道通过合成复合粒子来实现T1-T2双模式成像，但其复杂的合成步骤以及两种成像模式之间的干扰，使得其成像效果并不理想（[1]Biomaterials2011年，第32卷，4584页；[2]Advanced Materials2011年，第23卷，5392页）。
[0003] 因为磁共振成像可以提供高分辨率的三维结构信息，而荧光成像是在细胞尺度上进行的可视化观测，因此，二者的结合与独立成像比较，可以很大程度上增加诊断的准确性。目前常见的制备荧光和磁共振成像的双模式造影材料的方法是通过将顺磁性离子和量子点结合或者通过包覆的方法将磁性核和荧光团复合而实现的（[1]Angew Chem Int Edit2010年，第49卷，3976页；[2]J Am Chem Soc2007年，第129卷，8698页）。但是这些方法受到量子点毒性以及荧光集团稳定性的影响，限制了其在生物方面的应用。因此，发展一种可以同时实现T1-T2双模式磁共振成像和荧光成像的造影剂以用于疾病诊断已成为本领域亟需解决的技术难题。
发明内容
[0004] 有鉴于此，本发明提供了一种弛豫率高、毒性低和荧光量子产率高的造影剂，及其制备方法和应用。
[0006] 优选地，所述造影剂的粒径为160～200nm，比表面积为500～700m2/g，平均孔径为2～5nm。
[0007] 优选地，所述内核的粒径为150～180nm，比表面积为150～250m2/g，平均孔径为3～10nm，所述外壳的壳层厚度为10～20nm。
[0008] 本发明提供的造影剂为核壳型二氧化硅包覆的Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子，具有良好的弛豫率，可用于磁共振血管成像及T1-T2双模式磁共振成像，还能提供多波段生物荧光成像，同时可提供高分辨率的双光子生物荧光成像，实现了磁共振和荧光成像的多功能，可用于医学成像诊断。
[0009] 该造影剂的内核Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子为钴氰酸根配合物纳米立方，其具有面心立方的金属有机框架结构，不但比表面积大，内部孔洞多，可以很好地和水分子结合以达到理想的磁共振成像效果，而且也能保留锰离子的光学性能。通过单一材料取代复合粒子的思路，内核在二氧化硅的包覆下形成有较好生物相容性的核壳结构纳米立方，可有效避免不同类型造影剂合成为复合造影剂的不良效果。
[0010] 本发明还提供了一种造影剂的制备方法，其包括如下步骤：
[0012] 2）将钴氰酸盐溶于水中，获得溶液B；
[0013] 3）将步骤2）中得到的溶液B加入步骤1）中得到的溶液A中，搅拌、离心，获得Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子；
[0014] 4）将步骤3）中得到的Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子分散到乙醇溶液中，加入氨水后再加入正硅酸四乙酯，搅拌、离心，即获得以Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子为内核，以二氧化硅包覆层为外壳的造影剂。
[0016] 在本发明的造影剂的制备方法中，步骤1）中水和乙醇的比例可以影响到Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子的形貌和大小，优选地，所述步骤1）中水和乙醇的体积比为(0-3):(0-1)，更优选地，所述步骤1）中水和乙醇的体积比为3:1。此外，所述步骤1）中锰盐和聚乙烯吡咯烷酮的质量比为1:(15-30)。
[0017] 在本发明方法的一个优选实施方案中，为了使锰盐和钴氰酸盐充分反应，所述锰盐和钴氰酸盐的摩尔比为(1-5):(1-4)，并且还可在溶液A和溶液B混合后对混合溶液进行加热，使得搅拌反应在一固定温度下进行，此反应对搅拌速度和搅拌时间没有严格限制，优选地，搅拌时间为0.5～2h。此外，搅拌后还可静置一定时间后再离心，以使合成的纳米立方具有更好的结晶性能并且易于分离。
[0018] 在本发明方法的一个优选实施方案中，Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子的质量和正硅酸四乙酯的体积的比为(5-20):(20-50)，Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子的质量的单位为mg，正硅酸四乙酯的体积的单位为μL。为了获得更厚的二氧化硅包覆层，步骤4）可重复多次。
[0019] 在步骤4）中加入氨水是为了使体系呈碱性，氨水的加入量并无严格限定，可根据实际需求灵活选择。此外，为了使Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子和正硅酸四乙酯反应更加充分，步骤4）中的搅拌可在20℃～40℃下进行，其搅拌速度和搅拌时间无严格限定，优选地，搅拌时间为2h～4h。
[0020] 本发明的造影剂具有如下特点：
[0021] 1）弛豫率高，可实现T1-T2双模式磁共振成像；
[0022] 2）毒性低；
[0023] 3）荧光量子产率高，可实现多波段生物荧光成像和双光子生物荧光成像。
[0024] 使用本发的造影剂的制备方法，具有如下效果：
[0025] 1）本发明的方法操作简单，重复性好，易于实现工业化生产；
[0027] 图1为S1和Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子的X射线衍射图谱；
[0028] 图2为实施例1中Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子（a）、S1的扫描电镜照片（b）和S1的高分辨透射电镜照片（c）；
[0030] 图4为实施例1中Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子（a）和S1（b）的T1-T2双模式磁共振成像图片以及Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子（c）和S1（d）的T1和T2弛豫效率曲线；
[0031] 图5为S1分散在磷酸盐缓冲溶液中后，通过尾静脉注入构建了脑部肿瘤模型的小鼠体内后的T1和T2成像图；
[0032] 图6为S1分散在磷酸盐缓冲溶液中注入小鼠脑部的T2灌注成像图，其中（a）图为脑部肿瘤模型的T2灌注磁共振成像图片，（b）图为磁共振信号强度和时间的关系曲线；
[0033] 图7为S1分散在磷酸盐缓冲溶液中后，通过尾静脉注射入正常小鼠体内后在肾脏部位（a）和血管部位（b）的T1成像图；
[0034] 图8为Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子（a）和S1（b）被细胞吞噬后在分别明场、激发波长在488nm和403nm的共聚焦激光显微镜以及激发波长在720nm的双光子荧光显微镜的荧光成像图。
具体实施方式
[0035] 为使发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。
[0036] 在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
[0037] 本发明的实施例中所用的原料如下：
[0038] 乙酸锰，分析纯，国药集团化学试剂有限公司
[0039] 聚乙烯吡咯烷酮（PVP），分析纯，国药集团化学试剂有限公司
[0040] 乙醇，体积分数≥99.7%，国药集团化学试剂有限公司
[0041] 钴氰酸钾，分析纯，Acros organics公司
[0042] 氨水，浓度25%至28%，国药集团化学试剂有限公司
[0043] 正硅酸四乙酯，分析纯，国药集团化学试剂有限公司
[0044] 本发明在实施例中采用上海巨纳科技有限公司生产的HJ-2A数显双头磁力搅拌器进行搅拌，采用北京京立离心机有限公司生产的LG10-2.4A台式高速离心机进行离心，采用日本JEOL公司生产的JSM-6700M场发射扫描电子显微镜对粒子的形貌和尺寸进行检测，采用日本Hitachi公司生产的H-800透射电子显微镜对粒子的形貌和尺寸进行检测，采用日本Rigaku公司生产的D/MAX-cA X射线衍射仪对造影剂的物相进行检测，采用Micromeritics公司生产的ASAP2020氮气吸附脱附仪对粒子的比表面积进行测试，采用VGESCALAB公司生产的MKII X射线光电子能谱仪对造影剂表面元素进行价态检测，采用Zeiss公司生产的L SM710共聚焦影响显微镜对造影剂的荧光成像性能进行检测，采用通用公司（GE）生产的Sigma HDX3.0T磁共振成像仪对造影剂的磁共振成像性能进行检测。
[0045] 本发明实施例中有关数据的测试方法如下：
[0046] 体外磁共振成像（In vitro MRI）在25℃下操作执行，其中T1加权成像采用饱和回复的自旋回声序列，选取参数为TE=10ms,TR=4000,2000,1000,500,200,100ms，T2*加权成像采用梯度回波序列，选取参数为TR=120,TE=2.328,6.112,9.896,13.68,17.46,21.24m2
s，翻转角为30°，带宽为31.25Hz，观测区域尺寸为180×180mm，层宽为3mm。
s，翻转角为30°，带宽为31.25Hz，观测区域尺寸为180×180mm，层宽为3mm。
[0047] 体内磁共振成像（In vivo MRI）检测在25℃下操作执行，其中T1加权成像采用快速自选回波序列，选取参数为TR/TE为780/19.6ms,激发数（NEX）为2，回波轨道长度为2，2
观测区域尺寸为0.188×0.188mm，层数10层，层间距为2mm。
观测区域尺寸为0.188×0.188mm，层数10层，层间距为2mm。
[0048] 荧光成像分析主要是检测内吞了造影剂的Hela细胞中的荧光信号，具体过程为把Hela细胞接种到玻璃底的活细胞培养皿中，与造影剂孵育24小时后，用PBS溶液润洗Hela细胞三次，然后换成含有10%胎牛血清的CO2非依赖型培养基，Hela细胞维持在37度，图像获取由激光扫描显微镜完成，使用的镜头是40倍的油浸式复消色差物镜，绿色荧光通道的激发光是488纳米激光，蓝色荧光通道的激发光是403纳米激光，双光子激光的波长为720纳米，扫描分辨率为1024×1024。
[0049] 实施例1
[0050] 造影剂的制备
[0051] 1）将0.075mmol的乙酸锰和0.3g的聚乙烯吡咯烷酮溶于15mL乙醇和5mL水中的混合体系中，获得溶液A；
[0052] 2）将0.04mmol的钴氰酸钾溶于10mL水中，获得溶液B；
[0053] 3）用针筒注射器将溶液B缓慢滴加到在磁力搅拌条件下的溶液A中，搅拌1h，再将所得的浑浊液体静置24小时，之后离心、洗涤、烘干，获得Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子；
[0054] 4）取18mg Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子分散到18mL乙醇中，加入氨水后搅拌10分钟，再加入68μL的正硅酸四乙酯，搅拌2小时，之后离心、洗涤、烘干，即获得以Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子为内核，以二氧化硅包覆层为外壳的造影剂S1。
[0055] 如图1所示，S1由Mn3[Co(CN)6]2和二氧化硅组成，图谱中20°处的微小突起表明了二氧化硅包覆层的存在；
[0056] 如图2所示，Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子呈现立方状，如图中箭头位置所示，在通过二氧化硅包覆后，S1的表面明显粗糙化，结合透射电镜可以确定二氧化硅包覆层的存在；
[0057] 如图3所示，通过S1的吸附-脱附曲线（c）和孔径分布曲线（d）可以看出S1具有较大的比表面积和孔径。
[0058] 实施例2
[0059] S1的T1-T2双模式磁共振成像效果
[0060] 如图4所示，T1成像模式下从低浓度到高浓度图像由暗变亮，T2成像模式下刚好相反，表示出了S1的双模式成像造影效果；
[0061] 如图5所示，S1可以持续的在小鼠脑部肿瘤位置提供T1和T2造影成像效果；
[0062] 如图6所示，通过（b）图中磁共振信号随时间下降的曲线说明了打入S1之后脑部T2信号的降低，并且通过对比肿瘤组织（（a）中1所指处）和正常组织（（a）中2所指处），可以看出由于S1在肿瘤部位的富集，其T2信号明显低于正常组织；
[0063] 如图7所示，S1可以通过体内循环而累积在肾脏部位从而提供持续的肾脏部位的造影，并且可以在血管中提供出色的T1成像效果，清晰的显示出该纳米立方作为造影剂在血管中的流动路径。
[0064] 实施例3
[0065] S1的荧光成像效果
[0066] 如图8所示，吞噬了Mn3[Co(CN)6]2纳米粒子（a）和S1（b）之后的肿瘤细胞在多波段下呈现出了荧光信号。其中，在激发波长在403nm下荧光信号呈现微弱的蓝光，在激发波长在488nm下荧光信号成像呈现强烈的绿光，而在双光子激发时，其激发波长为720nm下，荧光信号呈现强烈的蓝光，这说明了S1可以在多个波段以及双光子荧光成像中提供可用的荧光信号。
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