多肿瘤抑制因子基因种系突变及检测该基因癌肿倾向性的方法

与相关申请的关系本发明是专利申请No.08/251,938(1994年6月1日申请)、08/215,087(1994年3月18日申请)和08/215,086(1994年3月18日申请)的部分续展申请，上述专利申请在此引用作为参考。专利申请No.08/251,938又是专利申请No.08/227,369(1994年4月14日申请)的部分续展申请，而专利申请No.08/227,369又是专利申请No.08/214,582(1994年3月18日申请)的部分续展申请，这些专利申请也在此引用作为参考。发明背景本发明涉及人癌肿中多肿瘤抑制因子(Multiple Tumor Sup-pressor，简称MTS)基因的体细胞突变及其在人癌肿的诊断和预后方面的应用。本发明还涉及MTS基因的种系(germline)突变及其在诊断癌肿发生的倾向方面的应用，这些癌肿包括黑素瘤、眼黑素瘤、白血病、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、肌肉瘤、胆管癌、鳞状上皮细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)以及胰腺、乳房、脑、前列腺、膀胱、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸、肾、胃、结肠和直肠的癌肿。本发明还涉及MTS基因突变的人癌肿的治疗，其中包括基因治疗、蛋白质置换治疗和蛋白质模拟物(mimetics)。最后，本发明还涉及筛选用于癌肿治疗的药物。

此处用来说明本发明的背景、尤其用来对实施提供额外的细节出版物和其他材料，在本申请中结合引用作为参考，并且为了方便起见，在下面的文章中指出而且分别归类在所附的文献清单中。

癌肿遗传学非常复杂，涉及多个显性的、转化状态的正调节物(癌基因)以及多个隐性的、负调节物(肿瘤抑制基因)。已经确定了超过100种的癌基因。被鉴定的肿瘤抑制基因还不到12种，但是据估计该数目会增加至超过50种(Knudson，1993)。

牵涉这么多基因强调了在细胞中为了维持正常组织的完整性而发挥作用的生长调控机制的复杂性。这种复杂性还通过另一种方式体现。迄今为止，还没有单个基因参与所有的、或者绝大多数的人癌肿的进程。最常见的癌基因突变是在H-ras基因中，在所有实体瘤的10—15％中有此种突变发现(Anderson et al.，1992)。突变频率最高的肿瘤抑制基因是p53基因，在约50％的所有肿瘤中发生突变。没有一个共同的针对所有转化细胞的靶目标，就不可能寻找到能够摧毁或逆转癌细胞而又不损害正常细胞的“魔弹”。新一代特异性导向式抗肿瘤药物的希望便寄托在能够鉴定出在细胞分裂调控中起普遍作用的肿瘤抑制基因或癌基因。

已经克隆和确定的肿瘤抑制基因影响下列癌肿的易感性：1)成视网膜细胞瘤(RB1)；2)Wilm氏瘤(WT1)；3)Li-Fraumeni(TP53)；4)家族性腺瘤息肉症(APC)；5)I型神经纤维瘤病(NF1)；6)II型神经纤维瘤(NF2)；7)von Hippel-Lindau综合征(VHL)和8)2A型多发性内分泌腺瘤病(MEN2A)。

已经确定遗传图谱但还没有被分离的肿瘤抑制因子的基因座包括下列基因：I型多发性内分泌腺瘤病(MEN1)；II型Lynch癌家族性综合征(LCFS2)；家族性乳房癌(BRCA1)；神经母细胞瘤(NB)；基底细胞痣综合征(BCNS)；Beckwith-Wiedemann综合征(BWS)；肾细胞癌(RCC)；I型结节性硬化(TSC1)和II型结节性硬化(TSC2)。目前已经定性的肿瘤抑制基因编码产物与多种蛋白质类型具有相似性，其中包括DNA结合蛋白(WT1)、辅助性转录调节蛋白(RB1)、GTP酶活化蛋白(又称为GAP)(NF1)、细胞骨架组份(NF2)、膜结合受体激酶(MEN2A)，其他的编码产物与已知的蛋白质没有明显的相似性(APC和VHL)。

在大多数情况下，最初通过遗传研究而鉴别的肿瘤抑制基因已表明在某些偶发的肿瘤中是缺失的或突变的。该结果暗示，染色体异常的区域可以表明在癌肿的遗传倾向和偶发癌肿中所涉及重要的肿瘤抑制基因的位置。

迄今为止确定的数种肿瘤抑制基因的特征之一是它们在某些肿瘤类型中高频率地缺失。缺失常常涉及失去一个等位基因，即所谓的杂合性丢失(loss of heterozygosity，简称LOH)，但是也涉及两个等位基因的纯合缺失(homozygous deletion)。对于LOH，余下的等位基因被认为不起作用，其原因或者是因为已有的遗传突变，或者是因为第二次的偶发突变。

黑素瘤是一种常见的癌肿，每100个美国人中有1人得此病(American Cancer Society，1992)。环境影响如暴露于紫外线对于黑素瘤的发生起重要作用，但是遗传也是决定因素。家族性黑素瘤的一个基因即MLM，已经被定位于染色体9p21(Cannon-Albright etal.，1992；Nancarrow et al.，1993；Gruis et al.，1993；goldsteinet al.，1994)。如果MLM基因座具有一个倾向性的等位基因，则患黑素瘤的可能性增加约50倍。MLM是数目日益增长的肿瘤抑制基因家族中的一员。黑素瘤的倾向性按显性孟德尔性状进行遗传，但是倾向性的MLM突变被认为按最初由Knudson(1971)提出的方式呈现为体细胞的隐性等位基因。在携带一个野生型和一个突变型MLM等位基因的倾向性个体中，分裂的细胞经过了第二次的突变事件，该事件涉及MLM野生型拷贝的丢失或失活，从而暴露出可遗传的突变型MLM等位基因。相反，单一的野生型拷贝基因可以防止发生恶性肿瘤。

在9p21处MLM附近的染色体异常已经广泛地在几种不同的肿瘤类型中被确定，包括神经胶质瘤细胞系、非小细胞肺细胞系和急性成淋巴细胞白血病细胞系(Olopade et al.，1992；Olopade et al.，1993；Lukeis et al.，1990；Diaz et al.，1991；Middleton et al.，1991；Fountain et al.，1992；Cheng et al.，1993；James et al.，1993)。因此，依据在非黑素瘤肿瘤细胞中9p21染色体异常的频率，MLM区域可能含有一个(或多个)参与至少几种不同肿瘤类型进展的基因。这些事件涉及LOH以及高频率的纯合缺失。

组织中的细胞在一生中只有三种重要的选择：生长并分裂，不生长但维持活着，或者细胞程序死亡。不适当的生长和分裂或者细胞在该死亡的时候而不死亡都会导致肿瘤。一种控制肿瘤生长的机制是直接调控细胞周期。例如，那些控制决定引发DNA复制的基因是癌基因或肿瘤抑制基因的有力候选者，其取决于它们在该过程中起刺激还是抑制作用。在细胞周期(G1，S，G2和M期)中，真核细胞的进程被一系列细胞周期蛋白(cyclin)/依赖细胞周期蛋白的激酶(cyclin-dependent kinase，简称Cdk)复合物的依次地形成、激活和随后失活所控制。已表明，细胞周期蛋白D′s/Cdk2，4，5、细胞周期蛋白E/Cdk2、细胞周期蛋白A/Cdk2和细胞周期蛋白B/A/Cdk2涉及该过程。细胞周期蛋白D′s和Cdk2、Cdk4和Cdk5涉及从G1向S的转变，即当细胞生长并决定是否开始DNA复制的时候。最近还发现了其他的细胞周期调控因子。这些因子是Cdk抑制剂(Cdkinhibitors，简称CkI)，其中包括Farl、p21、p40、p20和p16(Marx，1994；Nasmyth & Hunt，1993)。

最近发现，几种癌基因和肿瘤抑制基因直接参与细胞周期。例如，细胞周期蛋白(促进DNA复制的蛋白质)中的一种是作为癌基因参与的(Motokura et al.，1991；Lammie et al.，1991；Witherset al.，1991；Rosenberg et al，1991)，而肿瘤抑制因子Rb与主要的细胞周期蛋白配偶体即Cdk发生作用(Ewen et al.，1993)。鉴别黑素瘤的易感性基因座将打开个体遗传筛选的路径，从而可以评估例如由于暴露于阳光下而导致癌肿的高危险率。MTS还使人倾向于发生大量其他癌肿，这些癌肿包括但并不限于：白血病、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、肌肉瘤、胆管癌、鳞状上皮细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病以及胰腺、乳房、脑、前列腺、膀胱、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸、肾、胃、结肠和直肠的癌肿。此外，因为MTS影响几种不同的肿瘤类型的进展，因此它能用于确定癌肿病人的预后。因此，MTS可以作为发展非常重要的诊断测试的基础，人们可以预测发生癌肿(如黑素瘤、眼黑素瘤、白血病、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、肌肉瘤、胆管癌、鳞状上皮细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病以及胰腺、乳房、脑、前列腺、膀胱、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸、肾、胃、结肠和直肠的癌肿)的倾向，而且人们还能预测癌肿的预后。此外，因为MTS涉及多肿瘤类型的进程，因此MTS可以因其抑制肿瘤生长能力而直接或间接地提供通用的抗癌肿治疗的手段。例如将肿瘤细胞恢复成具有正常的MTS功能，可以将其改变成非恶性。发明概述本发明涉及人癌肿中的多肿瘤抑制因子(Multiple TumorSuppressor，简称MTS)基因的体细胞突变及其在人癌肿的诊断和预后方面的应用。本发明还涉及MTS基因的种系突变及其在诊断许多种癌肿发生的倾向方面的应用，这些癌肿包括黑素瘤、眼黑素瘤、白血病、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、肌肉瘤、胆管癌、鳞状上皮细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病以及胰腺、乳房、脑、前列腺、膀胱、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸、肾、胃、结肠和直肠的癌肿。本发明还涉及MTS基因突变的人癌肿的治疗，其中包括基因治疗、蛋白质置换治疗和蛋白质模拟物。最后，本发明涉及筛选用于癌肿治疗的药物。附图的简述图1A显示亲缘族3137。所有的黑素瘤患者都携带易感单倍型(haplotype)。还标明了携带易感单倍型的个体中的其他癌肿。说明符号如下：实心圆圈或正方形表示黑素瘤；部分实心圆圈或正方形表示其他癌肿；“/”表示已去世；“*”表示不知道该个体是否携带易感单倍型；“**”表示该个体似乎携带易感单倍型和“35”表示若患病情况下检查或诊断时的年龄。

图1B显示亲缘族3161。所有的黑素瘤患者都携带易感单倍型。对其他癌肿没有确定单倍型。说明符号如下：实心圆圈或正方形表示黑素瘤；部分实心圆圈或正方形表示其他癌肿；“/”表示已去世；“＝”表示在亲缘族中的其他地方出现；五边形中的“3”表示有多次婚姻和“35”表示若患病情况下检查或诊断时的年龄。

图1C显示了亲缘族3355。所有的黑素瘤患者都携带易感单倍型。对其他癌肿没有确定单倍型。说明符号如下：实心圆圈或正方形表示黑素瘤；部分实心圆圈或正方形表示其他癌肿；“/”表示已去世和“35”表示若患病情况下检查或诊断时的年龄。

图1D显示了亲缘族1771以及黑素瘤和其他癌肿的发生情况。在该亲缘族中，在MTS上鉴别到一个突变。说明符号如下：“*”表示确认的突变携带者；实心圆圈或正方形表示黑素瘤；部分实心圆圈或正方形表示其他癌肿(在该亲缘族中为结肠癌)；“/”表示已去世和“35”表示若患病情况下检查或诊断时的年龄。

图2为酵母人工染色体(YAC)和P1克隆两侧邻接IFNA-s和D9S171的区域。着丝点在右侧。对于P1克隆，箭头指出了在该载体中T7启动子序列的方向。组合一起的YAC表示，根据在区域中对序列标志位点(STS)的定位，这些克隆是相似的。这些YAC被假定是不完全相同的。YACA5、B11、C6和F9含有IFN-1和IFN-s。YACD1、F5和E3含有D9S126和D9S171。没有显示出含有D9S171的YAC的近端和含有IFNA-s的YAC的远端。距离没有严格地按比例绘制。在图2中标出了位于IFNA-s和D9S171内部的标记。以“c”开始的标记从粘性质粒(cosmid)末端序列衍生而得。没有标出粘性质粒。在c1.b和c5.3之间以及760-L和D9S171之间的距离不详。

图3为在黑素瘤细胞系中观察到的缺失图。根据一系列缺失的标记，缺失被分成12类。十一个细胞系缺失了图中所绘的全部标记，这种类型没有标出。其他12类中每一类的代表数目被列在“#系”栏目中。1-10类的缺失断点位置被描绘在落于与缺失的DNA相邻的标记处，即为延伸至缺失处的一系列标记中的最后的阳性标记。对于第11类和第12类，缺失的位置用实心的三角形标出。

图4A为粘性质粒c5图。用于缺失分析的相关STS和粘性质粒及其P1一起被标出。c1.b标记位于P1-1062的近端并且没有标出。MTS1和MTS2的转录方向用箭头标出。

图4B为粘性质粒c5的限制性图谱和STS图。用粗线标出MTS1和MTS2的编码外显子的位置。“E1”和“E2”分别表示“编码外显子1”和“编码外显子2”。“B”是BamHI，“S”是SalI，“R1”是EcoRI和“R5”是EcoRV。

图5A和5B是含有5′不翻译区域、外显子1和部分内含子1的MTS1基因组序列和已公布p16序列(Serrano et al.，1993)之间的比较。起始密码子(带下划线)位于891位，而拼接位置(箭头)位于1016位。在图5A-B中所示的MTS1序列为SEQ ID NO：3。在图5B中所示的p16序列为SEQ ID NO：24。

图6A和6B是含有部分内含子1、外显子2和部分内含子2的MTS1基因组序列和已公布的p16序列(Serrano et al.，1993)之间的比较。拼接位置(箭头)在192位之前和498位之后。在图6A-B中所示的MTS1序列为SEQ ID NO：4。在图6A中所示的p16序列与SEQ ID NO：4的核苷酸192-498位相同。

图7A和7B是含有部分内含子1、“外显子2”及随后序列的MTS2基因组序列和已公布的p16序列之间的比较。“外显子2”序列与MTS1的外显子2在核苷酸273-580位之间很相似。MTS2和p16中的拼接位置用箭头标出。开始趋异(divergence)的位点用“°”表示。MTS2的终止密码子位于外显子2的532位并用“*”表示。在图7A-B中所示的MTS2序列为SEQ ID NO：5。在图7A中所示的p16序列与SEQ ID NO：4的核苷酸192-498位相同。

图8是MTS1和MTS2之间DNA序列的比较，包括外显子2和部分周围的内含子。对于MTS1，内含子1的3′拼接位置和内含子2的5′拼接位置用三角形标出。靠近编码外显子2的3′端的趋异点用箭头标出。所示的MTS1序列对应于SEQ ID NO：4的核苷酸92-548位。所示的MTS2序列对应于SEQ ID NO：5的核苷酸174-630位。

图9显示了在不同的STS的肿瘤细胞系中的缺失情况。每次PCR实验包括阳性对照和阴性对照，而且仅有一个或二个STS缺失的细胞系(例如第21类)至少重复测试两次。

图10A-C为MTS2 mRNA的表达。图10A显示了在得自不同的人组织RNA(Clonetech)中的MTS2转录物的相对水平：道1-脑；道2-乳房；道3-肾；道4-肺；道5-淋巴细胞；道6-卵巢；道7-胰腺；道8-前列腺；道9-脾；道10-胃；道11-胸腺。具有不同于预期分子量的产物的起因不明(见道1)。图10B显示了在诱导分裂之后的时间函数方面人淋巴细胞中相对的MTS2的转录物水平：道1-0小时；道2-1小时；道3-2小时；道4-4小时；道5-8小时；道6-16小时；道7-24小时；道8-32小时；道9-40小时；道10-48小时；道11-56小时；道12-64小时。在诱导后40-50小时之间，绝大多数的细胞处于S期。图10C显示了以Rb状态作为函数时MTS2的转录物水平。Rb+细胞系是：道1-KIT(Hori et al.，1987)；道2-二倍体人成纤维细胞MRC5，通道28；道3-UMSCC2；道4-Bristol8；道5-ZR75；道6-HaCaT；道7-T24。Rb-细胞系是：道8-MDA MB 468；道9-5637；道10-C33A；道11-SiHa；道12-CaSki；道13-WERI。

图11为包括5′不翻译区域在内的MTS2的cDNA序列(以及编码的多肽)。外显子2的起始位于491位，并且用箭头表示。cDNA序列为SEQ ID NO：15，而氨基酸序列为SEQ ID NO：16。

图12A和12B显示了MTS1E1β的cDNA序列(以及编码的多肽)。拼接位点用箭头表示。外显子2的起始位于335位，外显子3从642位开始。cDNA序列为SEQ ID NO：13，而氨基酸序列示于SEQID NO：14。

图13是p16区域的物理图。外显子1α(E1α)、外显子1β(E1β)、外显子3(E2)和外显子3(E3)用实心盒表示。还标出了Eco RI(RI)、Eco RV(RV)和Sal I(S)的限制性酶切位点。在限制性图谱上方的是基因组克隆粘性质粒c5和P11063。在下方的是细胞系A375和SK-mel93中的缺失。虚线表示缺失的DNA。

图14是小鼠和人的p16β转录物序列的排列情况。大写字母表示相同的核苷酸。p16阅读框中的终止密码子用下划线标出。E1β和E2之间的拼接用脱字号(v)表示。小鼠β序列为SEQ ID NO：25。人β序列与SEQ ID NO：13中的核苷酸193-461位相同。

图1 5是在含有E1β缺失的细胞系中α转录物的表达情况。用从所示样品中分离得的总RNA而衍生得到cDNA。在反应中加入放射性标记的引物以扩增p16转录物。混合等量的α和β扩增产物，产物在5％变性聚丙烯酰胺凝胶中分离：道1-静止的T细胞；道2-细胞系SK-mel93；道3-细胞系A375。

图16A-D为p16转录物的表达。在反应中加入放射性标记的引物以扩增p16转录物，而且产物在5％变性聚丙烯酰胺凝胶中分离。在图16A和16D中，在电泳之前将来自共同样品的α和β反应物混合。图16A显示了来自不同的人组织RNA中的p16转录物的相对水平：道1：脑；道2：乳房；道3：肾；道4：肺；道5：淋巴细胞；道6：卵巢；道7：胰腺；道8：前列腺；道9：脾；道10：胃；道11：胸腺。图16B显示了在诱导分裂之后的时间函数方面人淋巴细胞中β转录物的相对量：道1：0小时；道2：1小时；道3：2小时；道4：4小时；道5：8小时；道6：16小时；道7：24小时；道8：32小时；道9：40小时；道10：48小时；道11：56小时；道12：64小时。图16C显示了在诱导分裂之后的时间函数方面人淋巴细胞中α转录物的相对量，各道与图16B相同，但是缩短了1小时。还分析了其他分子的表达，这些分子或者可能影响细胞周期的进程，或者在细胞周期中的转录水平被调节。与以前的结果一致，一旦诱导T细胞，Cdk4和GoS2(一种功能不明的分子，但是当静止T细胞进入细胞周期时，其转录被诱导。)的水平就增加(Russell and Forsdyke，1991；Matsushime et al，1992；Gengand Weinberg，1993)。相反，在实验过程中p27的RNA水平似乎没有变化(Toyoshima and Hunter，1994；Kato et al.，1994)。图16D显示了以Rb状态作为函数时p16的转录物。Rb-细胞系是：道1：WERI；道2：CaSki；道3：SiHa；道4：C33A；道5：5637；道6：MDAMB468。Rb+细胞系是：道7：T24；道8：HaCaT；道9：Zr75；道10：Bristol8；道11：UMSCC2；道12：二倍体人成纤维细胞MRC5；道13，KIT(Hori et al.，1987)。

图17为包括cDNA的非编码部分在内的MTS1的cDNA序列。三角形表示拼接处。在第二个拼接处的序列中虚线仅仅是强调该拼接处，并不表示缺失碱基。该序列是SEQ ID NO：36。发明详述本发明涉及人癌肿中的多肿瘤抑制因子(MTS)基因的体细胞突变及其在人癌肿的诊断和预后方面的应用。本发明还涉及MTS基因的种系突变及其在诊断各种不同的癌肿发生的倾向方面的应用，这些癌肿包括黑素瘤、眼黑素瘤、白血病、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、肌肉瘤、胆管癌、鳞状上皮细胞瘤、慢性淋巴细胞性白血病以及胰腺、乳房、脑、前列腺、膀胱、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸、肾、胃、结肠和直肠的癌肿。本发明还涉及MTS基因突变的人癌肿的治疗，其中包括基因治疗、蛋白质置换治疗和蛋白质模拟物。最后，本发明涉及筛选用于癌肿治疗的药物。

本发明提供一种分离的多聚核苷酸，它含有全部或部分MTS基因座或突变的MTS基因座，其长度较佳地为至少8个碱基并且不超过约100个千碱基对。该多聚核苷酸可以是反义多聚核苷酸。本发明还提供一种含有这种分离的多聚核苷酸的重组构建物，例如适用于在转化的宿主细胞中表达的重组构建物。

本发明还提供了在分析物中检测含有部分MTS基因座的多聚核苷酸或其表达产物的方法。该方法还可包括扩增部分MTS基因座的步骤，也可以再包括提供一套作为扩增该部分MTS基因座的引物。该方法可以用于诊断患癌肿的倾向或用于癌肿的诊断或预后。

本发明还提供分离的抗体，较佳地为单克隆抗体，它们能特异性地与分离的、含有至少5个由MTS基因座编码的氨基酸残基的多肽结合。

本发明还提供了用于在分析物中检测含有部分MTS基因座的多聚核苷酸的试剂盒，该试剂盒包括包装在适当容器中的与部分MTS基因座互补的多聚核苷酸以及使用说明。

本发明还提供了制备含有聚合核苷酸的多聚核苷酸方法，从而产生含有至少8个连续的MTS基因座的核苷酸序列；还提供了含有聚合氨基酸的多肽的制法，从而产生含有至少5个由MTS基因座编码的氨基酸。

此外，本发明提供了筛选用于癌肿治疗的药物的方法，以便鉴别出合适的、能恢复MTS基因产物功能的药物。

最后，本发明提供了针对癌肿细胞的基因治疗法所需的手段。这些治疗试剂可以利用含有全部或部分MTS基因座的多聚核苷酸，将其置于合适的载体或用更直接的方法将其送递入该靶细胞，从而恢复MTS蛋白质的功能。治疗试剂也可以利用基于部分或全部MTS蛋白质序列的多肽。从而使其在体内在功能上替代MTS的活性。

本发明发现，使个体倾向患黑素瘤和其他癌肿的MTS基因座(在已有技术中称为黑素瘤(MLM)基因座)是编码MTS1的基因，已发现它是Cdk尤其是Cdk4的抑制剂。此处该基因被称为MTS1。本发明还发现，MTS基因座含有被称为MTS2的第二编码序列，它与MTS1在部分序列上非常相似。本发明还发现，MTS1基因有两个启动子-α和β。当使用α启动子时，得到的mRNA由外显子1α、外显子2和外显子3构成。这被称为MTS1。当使用β启动子时，得到的mRNA由外显子1β、外显子2和外显子3构成。这被称为MTS1E1β。本发明发现，在种系中MTS基因座的突变表示存在患黑素瘤和其他癌肿的倾向。最后，本发明发现，MTS基因座的体细胞突变与大多数(如果不是全部的话)肿瘤类型有关，因此是癌肿或癌肿预后的一般性标记。MTS基因座的突变事件涉及编码序列和非编码序列中的缺失、插入和点突变。

MLM基因座最早是用遗传学方法，通过几个犹他州的亲缘族和一个德克萨斯州的亲缘族在遗传标记和黑素瘤倾向之间的显著连锁而定位的(Cannon Albright，1992)。在亲缘族中通过重组子所界定的区域的两侧为D9S736和D9S171。随后，这些及其他的遗传标记被用于基因定位，即通过分析含有缺失的黑素瘤和非黑素瘤细胞系中纯合缺失情况。最小的缺失重叠区域的两侧为IFNA-s和D9S171。筛选YAC文库以鉴别在这些标记周围的基因组克隆。P1克隆由染色体步移(chromosomal walk)的部分而分离，并且除了有两个间隔外，邻接IFNA-s至D9S171。制备特异序列标志位点(specific sequence-tagged site，STS)以构建更详细的分子图谱。使用这些标记和缺失分析，在粘性质粒5(c5)中发现以标记c5.1和c5.3为两侧的中心缺失重叠区域。缺失频率最高的标记是c5.3，它非常靠近MTS。

对c5是否存在“CpG”岛进行分析表明，它含有至少一个MTS的候选基因。确定了c5的EcoRI片段的DNA序列并且与GenBank的序列进行比较。鉴别出两个独特的c5区域，它们与以前鉴别的编码人Cdk4抑制剂的基因即p16(Serrano et al.，1993)的区域相似。这两个候选基因被称为MTS1和MTS2。用来自MTS1外显子2的探针筛选淋巴细胞、胎儿脑及正常乳房的cDNA文库，鉴别出另一候选基因MTS1E1β。

c5基因组序列和p16mRNA序列的详细比较揭示，MTS1含有一307bp片段，该片段与部分p16编码序列相同。MTS1中的该核苷酸片段的两侧为可识别的拼接序列。对MTS1的进一步研究表明，它包括p16的全部编码序列和两个内含子。内含子1位于翻译起始位置下游126bp处；内含子2位于翻译终止位置下游11bp处。这两个内含子将p16的编码序列分成3个区域：126bp的5′区域(编码外显子1)、307bp的中间区域(编码外显子2)和11bp的3′区域(编码外显子3)。

MTS2含有一个与p16几乎相同的DNA序列，它从编码外显子2的5′端向内含子2延伸约200bp。然而，序列的相似性在MTS1的内含子2上游51bp处减弱，此处两种序列完全趋异。这对应于MTS2的最终密码子的位置。MTS1和MTS2的序列比较表明，两种基因之间的序列相似性还从内含子1的3′拼接处的上游延伸近50个核苷酸。因此，非编码DNA比假定的编码DNA的某些区域更保守。为了排除编码DNA中的序列趋异是由于克隆假象的可能性，设计特异性地扩增跨越MTS2的序列趋异点的PCR引物。这些引物从粘性质粒P1和基因组DNA中扩增出预定大小的片段。因此，位于靠近MTS2外显子2的3′端的趋异序列的确是基因组序列。

MTS1E1β含有外显子1，该外显子称为外显子1β或E1β，它具有不同于MTS1和MTS2的外显子1的序列。MTS1E1β还含有与MTS1的外显子2和外显子3相同的外显子2(E2)和外显子3(E3)。外显子1β位于MTS1的外显子1的上游并且不含有任何编码序列。结果，MTS1E1β编码翻译起始位置位于外显子2的第一个ATG处的p10。

利用外显子2，通过分析假定携带MLM倾向性等位基因的个体基因组DNA而来测试MTS1和MTS2与遗传易感性基因座MTS的相关性。8个个体中有一个个体的MTS1外显子2中鉴别出DNA多态性。该突变是单一的核苷酸置换，造成一个氨基酸变化。该多态性和MLM倾向性等位基因一起分离。

MTS1中的损伤(缺失和核苷酸置换)优势表明，MTS1或某个紧密连锁的基因座导致肿瘤表型。受到这些损伤的细胞比没有受到损伤的细胞具有选择优势。另一种解释认为这些损伤是与细胞生长无关的随机事件，该解释是不可能的。原因在于，首先，在肿瘤表型和MTS1突变之间的高相关性暗示在MTS1突变和肿瘤形成之间存在因果关系。其次，MTS1影响黑素瘤的易感性，因此它具有独立地作为肿瘤抑制基因的意义。再者，作为Cdk的强抑制剂p16的生物化学功能与MTS1在体内作为DNA复制起始的通用抑制剂而发挥作用的模式很好地相符。

根据本发明的诊断和预后方法，可以检测野生型MTS基因座的变化。此外，该方法还可以通过检测野生型MTS基因座和证实缺乏倾向性或瘤形成而进行。“野生型基因的改变”包含所有形式的突变，包括在编码区域和非编码区域的缺失、插入和点突变。缺失可以是整个基因或只是部分基因的缺失。点突变可以造成终止密码子、移码突变或氨基酸置换。体细胞突变是仅发生在某些组织如肿瘤组织中的突变，不会在种系中遗传。种系突变可以在任一身体组织中找到而且是遗传的。若仅有一个单一的等位基因呈体细胞突变，那么说明是处于早期瘤形成状态。然而，若两个等位基因都突变，那么说明是处于晚期瘤形成状态。因此，MTS突变的发现可以提供诊断和预后信息。可以对没有缺失的MTS等位基因(即在作为携带MTS缺失染色体的姐妹染色体上的MTS等位基因)进行筛选，以确定是否有其他的突变如插入、小缺失和点突变。据信，在肿瘤组织中发现的许多突变导致MTS基因产物表达下降。但是，导致无功能的基因产物的突变也会产生癌肿。点突变事件可以发生在调控区域如在基因的启动子中，从而导致mRNA表达的消失或下降。点突变还会破坏适当的RNA加工，从而导致MTS基因产物表达的消失或者导致mRNA稳定性或翻译效率的下降。

有用的诊断技术包括，但并不限于：荧光原位杂交(FISH)、直接DNA测序、脉冲电场凝胶电泳(PFGE)分析、Southern印迹分析、单链构象分析(SSCA)、核糖核酸酶(RNase)保护测定、等位基因特异的寡核苷酸(ASO)、点杂交分析和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)，下文将更详细地描述。

患癌肿如黑素瘤和其他此处指出的癌肿的倾向，可以通过测试任何人组织的MTS基因的突变而确定。例如，一个遗传有种系MTS突变的人将易患癌肿。这一点可以通过测试来自该个体的任何身体组织中的DNA而确定。最简单地，可以抽取血液并且从血细胞中抽提出DNA。此外，通过检测胎儿细胞、胎盘细胞或羊水是否有MTS基因的突变可以进行产前诊断。例如由点突变或缺失而造成的野生型MTS等位基因的改变可以用此处所述的任一手段检测出。

为了在组织中检测野生型MTS基因的改变，须将该组织分离出而不含周围正常组织。富集含肿瘤细胞的组织制品的方法是本领域中公知的。例如，可以从石蜡或低温恒温器的切段中分离组织。还可以用流式细胞计量术将癌肿细胞与正常细胞分开。这些技术以及其他将肿瘤细胞和正常细胞分开的技术是本领域中公知的。如果肿瘤组织被正常细胞严重污染，那么突变的检测将变得更困难。

一种检测DNA序列多态性的快速的初步分析法是观察一系列用一个或多个限制性内切酶、更佳地是用大量限制性内切酶消化的DNA的Southern印迹。每张印迹片含有一系列的正常个体和一系列的癌肿病例。显示出杂交片段的Southern印迹(当用靠近或含有MTS基因座的序列作为探针杂交时，在长度上会与对照DNA有差别。)表明可能存在一个突变。如果使用会产生非常大的限制性片段的限制性内切酶时，那么可以使用脉冲电场凝胶电泳(PFGE)。

点突变的检测可以用本领域中公知的技术进行MTS等位基因的分子克隆并对该等位基因测序而实现。或者，可以用已有技术对来自肿瘤组织的基因组DNA制品直接扩增基因序列。然后再确定扩增序列的DNA序列。

有6种已知的、比较完整的但仍不是直接的测试方法可以确定易感性等位基因的存在：1)单链构象分析(SSCA)(Orita et al.，1989)；2)变性梯度凝胶电泳(DGGE)(Wartell et al.，1990)；3)RNase保护测定(Finkelstein et al.，1990；Kinszler et al.，1991)；4)等位基因特异的寡核苷酸(ASO)(Conner el al.，1983)；5)使用识别核苷酸错配的蛋白质如大肠杆菌mutS蛋白质(Modrich，1991)和6)等位基因特异的PCR(Rano&Kidd，1989)。对于等位基因特异的PCR，使用在其3′端会与特定的MTS突变杂交的引物。如果特定的MTS突变不存在，则观察不到扩增产物。还可以使用如在欧洲专利申请No.0332435和Newton等人(1989)的文章中公开的扩增不应突变体系(Amplification Refractory Mutation System，ARMS)。基因的插入和缺失还可以通过克隆、测序和扩增而检测。此外，还可以使用针对该基因或周围标记基因的限制性片段长度多态性(RFLP)探针，以便以多态性片段形式评估等位基因的改变或插入。该方法对于筛选患病个体的亲属是否具有相同的MTS突变特别有用。也可以使用本领域中公知的检测插入和缺失的其他方法。

在前三种方法(即SSCA，DGGE和RNase保护测定)中，出现一条新的电泳条带。SSCA检测迁移有所不同的条带，因为序列变化造成单链分子内碱基配对的差别。RNase保护涉及将突变型多聚核苷酸切成两个或多个更小的片段。DGGE是用变性梯度凝胶，检测与野生型序列不同的突变型序列的迁移率。在等位基因特异的寡核苷酸测定中，设计出可以检测特异性序列的寡核苷酸，然后通过检测杂交信号的存在与否而进行分析。在mutS测定中，蛋白质只与由突变型和野生型序列形成的含有核苷酸错配的异源双链序列结合。

根据本发明，错配物是杂合的核酸，双链之间不是100％互补。缺失、插入、倒位或置换还造成整体同源性的缺失。错配检测可以用于检测基因或其mRNA产物中的点突变。虽然这些技术比测序的灵敏度低，但是对于大量的肿瘤样本而言，其操作更为简便。错配切断技术的一个例子是RNase保护法。在本发明的实践中，该方法涉及使用与人野生型MTS基因编码序列互补的标记核糖核酸探针。该核糖核酸探针和从肿瘤组织中分离出的mRNA或DNA一起退火(杂交)，随后用能够检测双链RNA结构中某些错配的酶核糖核酸酶A(RNase A)消化。如果RNase A检测到错配，它就在错配位置将其切断。因此，退火的RNA产物在电泳凝胶基质中分离，如果错配被RNase A检测到并切断，那么会观察到一个RNA产物，它比全长的、由核糖核酸探针与mRNA或DNA形成的双链RNA更小。核糖核酸探针不必是全长的MTS mRNA或基因，它可以是它们的一个片段。如果核糖核酸探针仅含有MTS mRNA或基因的片段，那么需要用大量的这些探针来筛选整个mRNA序列是否存在错配。

按类似的方式，通过酶法或化学方法的切断，可以使用DNA探针来检测错配。如参见Cotton et al.，1988；Shenk et al.，1975；Novack et al.，1986。或者，通过错配双链相对于正确配对双链的电泳迁移率的改变而检测错配。如参见Cariello，1988。用核糖核酸探针或DNA探针，在杂交之前用PCR(见下文)扩增含有突变的细胞mRNA或DNA，用Southern杂交法检测MTS基因DNA的变化，尤其当变化是大的重排如缺失和插入时。

也可以用等位基因特异的探针筛选用PCR扩增的MTS基因DNA序列。这些探针是核酸寡聚物，每种含有一个携带已知突变的MTS基因序列的区域。例如，一个寡聚物可以长约30核苷酸，并且对应于一部分MTS基因序列。通过使用一组这种等位基因特异的探针，便可以用PCR扩增产物来筛选，从而确定在MTS基因中是否存在已确定的突变类型。例如可以在尼龙滤膜上用扩增的MTS序列和等位基因特异的探针进行杂交。在严紧杂交条件下与特定的探针发生杂交表示在这种肿瘤组织中存在与等位基因特异性探针相同类型的突变。

对于候选基因座中突变的最明确的测试方法是直接比较癌肿病人和对照人群的基因组MTS序列。或者，人们可以用PCR方法扩增后对信使RNA进行测序，从而不必确定候选基因的外显子结构。

癌肿病人在MTS编码区域之外的突变可以通过检测MTS基因附近或内部的非编码区域如内含子和调控序列而检测出。非编码区域的突变是至关重要的早期指明来自Northern印迹实验，该实验揭示出与对照个体相比，在癌肿病人中有分子大小异常或高丰度的信使RNA分子。

MTS mRNA表达的改变可以用本领域中公知的技术进行检测。其中包括Northern印迹分析、PCR扩增和RNase保护法。mRNA表达的减少表明野生型MTS基因发生了改变。还可以通过筛选野生型MTS蛋白质的改变而检测野生型MTS基因的改变。例如，可以使用具有针对MTS的免疫反应性的单克隆抗体来筛选组织。缺乏相应的抗原便表示有MTS突变。也可以使用对突变型等位基因产物特异的抗体来检测突变型MTS基因产物。这些免疫学测定可以以本领域中公知的方便的方式进行。其中包括：Western印迹、免疫组织化学测定和酶联免疫吸附测定(ELISA)。任何检测MTS蛋白质改变的方法都可以用于检测野生型MTS基因的改变。可以使用功能测定，如蛋白质结合确定法。例如，已知MTS蛋白质与Cdk尤其是与Cdk4结合。因此可以测定与野生型MTS蛋白质或Cdk4的结合能力。此外，可以测定MTS的生物化学功能，对Cdk如对Cdk4的抑制功能和对细胞周期的调控作用。寻找到突变型MTS基因产物就表示存在野生型MTS基因的改变。

还可以在其他的人体样品如血清、粪便、尿液和唾液中检测突变型MTS基因或基因产物。可以将上述相同的检测组织中突变型MTS基因或基因产物的技术应用于其他的人体样品。癌肿细胞会从肿瘤上脱落下来从而出现在这些人体样品中。此外，MTS基因产物本身会分泌入细胞外空间，从而在原先没有癌肿细胞的这些人体样品中被找到。通过对这些人体样品进行筛选，可以对许多种癌肿进行早期诊断。另外，可以更早期地通过测试人体样品中是否存在突变型MTS基因或基因产物而监测化疗或放疗的进展。

本发明的诊断方法还适用于任何一种在肿瘤发生中MTS发挥作用的肿瘤。在几乎所有被检测的肿瘤中都观察到在MTS区域的体细胞突变或染色体臂9p的缺失。本发明的诊断方法对于医疗人员很有用，能使他们决定适当的治疗方案。

本发明的引物对可以通过PCR而用于确定某一特定MTS等位基因的核苷酸序列。单链DNA引物对可以与染色体9p上的MTS基因内部或周围的序列进行退火，以便引发MTS基因本身的DNA合成扩增。整套的这些引物可以合成所有的MTS基因编码序列(即外显子)的核苷酸。更佳地，一套引物可以合成内含子和外显子序列。也可以使用等位基因特异的引物。这种引物只与特定的MTS突变型等位基因发生退火，从而只能扩增出以突变型等位基因作为模板的产物。

为了促进随后的扩增序列的克隆，引物可以在其5′端含有限制性酶切位点序列。因此除少数形成限制性酶切位点所需的核苷酸外，所有的引物核苷酸来自MTS序列或靠近MTS的序列。这些酶和酶切位点是本领域中公知的。引物本身可以用本领域中公知的技术合成。一般可以使用市售的寡核苷酸合成仪制备引物。根据SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：36所示的MTS开放阅读框架设计特定的引物是本领域中的技术人员所能胜任的。

本发明提供的核酸探针能用于许多目的。如上所述，它们可以用于与基因组DNA的Southern杂交和用于RNase保护法以检测点突变。这些探针还可以用于检测PCR扩增产物。使用其他技术，它们还可以用于检测MTS基因或mRNA的错配。定义本发明使用下列定义：“多聚核苷酸的扩增”采用诸如聚合酶链反应(PCR)、连接扩增(或称为连接酶链反应，LCR)和基于使用Q-beta复制酶的扩增方法。这些方法是公知的而且在本领域中被广泛使用。例如参见美国专利4,683,195和4,683,202以及Innis et al.，1990(PCR)和Wuet al.，1989a(LCR)。用于进行PCR的试剂和硬件已商品化。用于扩增MTS基因序列的引物最好互补于并且特异性地与MTS区域序列或者界定靶区域的区域序列杂交。用扩增方法产生的MTS序列可以直接测序。或者，扩增的序列可以在序列分析之前被克隆，但该方法稍不可取。对用酶法扩增的基因组片段的直接克隆和测序分析的方法已由Scharf(1986)描述过。

“被分析的多聚核苷酸”和“被分析的链”指单链或双链多聚核苷酸，它被可疑包含一段靶序列而且存在于各种不同类型的样品包括生物样品中。

“抗体”。本发明还提供了能够特异性地与MTS多肽或其片段结合、或者与MTS区域的多聚核苷酸序列特别是MTS基因座或其部分结合的多克隆和/或单克隆抗体及其片段以及其免疫结合等价物。术语“抗体”指均一的分子统一体或由多种不同的分子统一体组成的混合物如血清产物。多肽可以在肽合成仪上合成并偶联于载体分子(如钥孔血蓝蛋白)，然后注入兔子数月。测试兔血清对MTS多肽或片段的免疫反应性。单克隆抗体可以通过将蛋白质多肽、融合蛋白质或其片段注入小鼠而制备。用ELISA筛选单克隆抗体，然后测试其与MTS多肽或其片段的特异免疫反应性。参见Harlow &Lane，1988。这些抗体可以用于分析和作为药物。

一旦获得足够量的所需多肽，就可以将其用于各种用途。典型的用途是用于生产特异性结合的抗体。这些抗体可以为多克隆或单克隆抗体，而且可以用本领域中公知的技术在体外或体内产生。

对于产生多克隆抗体，可以选择合适的靶免疫体系，典型地是小鼠或兔。按由适用于动物的方法以及免疫学家熟知的其他参数所限定的方式，将基本纯化的抗原供给免疫体系。典型的注射位置是爪垫、肌内注射、腹膜内注射或皮下注射。当然，也可以用其他动物替代小鼠或兔。然后用本领域中公知的技术纯化多克隆抗体，再调节所需的特异性。

免疫应答通常用免疫测定进行分析。一般地这些免疫测定涉及对一种抗原源进行某种程度的纯化，这种抗原源由相同的细胞产生并且该抗原源中的抗原相同。各种免疫测定方法是本领域中公知的。如参见Harlow & Lane，1988或Goding，1986。

典型地，用标准程序如Harlow & Lane(1988)或Goding(1986)所述的程序，可以制得亲和力为10-8M-1或更佳地为10-9至10-10M-1或更高的单克隆抗体。简而言之，可以选用合适的动物，然后采用所需的免疫方案。经过适当的时间，取出动物的脾脏，然后在合适的选择条件下，将个体脾细胞与无限增殖化的骨髓瘤细胞融合。随后，通过克隆分离细胞，并且测试各克隆的上清液以确定是否产生适当的针对所需抗原区域的特异性抗体。

其他合适的技术涉及在体外将淋巴细胞暴露于抗原性多肽，或者选择噬菌体或类似载体中的抗体库。参见Huse et al.，1989。本发明的多肽和抗体可加以修饰或不加修饰地使用。多肽和抗体常常可以通过共价或非共价地连接一种提供可检测信号的物质而标记。大量不同的标记物和连接技术是公知的，并且在科学和专利文献中被广泛地报道。合适的标记物包括放射性核素、酶、底物、辅助因子、抑制剂、荧光剂、化学发光剂、磁性颗粒等。有关使用这些标记物的专利包括美国专利3,817,837；3,850,752；3,939,350；3,996,345；4,277,437；4,275,149和4,366,241。同样，还可以产生重组免疫球蛋白(参见美国专利4,816,567)。

“结合配偶体”指一种能够高特异性地与配体分子结合的分子，如抗原和抗原特异性抗体或者酶和其抑制剂。通常地，特异性结合配偶体必须以足够的亲和力进行结合从而在分离条件下固定被分析物拷贝/互补双链(当进行多聚核苷酸杂交时)。特异性的结合配偶体是本领域中熟知的，例如包括生物素和抗生物素蛋白或链球菌抗生物素蛋白(streptavidin)、IgG和蛋白质A、无数已知的受体-配体偶联物和互补的多聚核苷酸链。在互补的多聚核苷酸结合配偶体中，配偶体长度通常地至少约15碱基，而且长度至少可以为40碱基。多聚核苷酸可以由DNA、RNA或合成的核酸类似物构成。

“生物样品”指来自某个体、可疑地含有被分析的多聚核苷酸或多肽的组织或体液样品，包括但并不限于：例如血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤外表、呼吸道、肠道和生殖-泌尿道、眼泪、唾液、血细胞、肿瘤、器官、组织和体外细胞培养成分的样品。

如此处所用，术语“诊断”或“预后”，当用于有关肿瘤形成的上下文时，被用于表示1)对瘤形成损伤进行分类，2)确定瘤形成的严重性或3)在治疗之前、之中或之后监视疾病的进展。

“编码”。如果当某多聚核苷酸在其天然状态或用本领域中熟练技术人员熟知的方法操作时，可以被转录和/或被翻译从而产生mRNA或多肽或其片段，那么则称某多聚核苷酸“编码”多肽。反义链是该核酸的互补物，可以从其推导出编码序列。

“分离的”或“基本纯的”。“分离的”或“基本纯的”核酸(如RNA、DNA或混合聚合物)是基本上与在自然状态下伴随其的天然的人序列或蛋白质的其他细胞组份(如核糖体、聚合酶、许多其他人基因组序列及蛋白质)分离的核苷酸。该术语包括从其自然存在的环境中取出的核酸序列或其蛋白质，并且包括重组的或克隆的DNA分离物和化学合成的类似物或者通过异源体系而生物合成的类似物。

“MTS等位基因”指正常的MTS基因座的等位基因以及携带变异的等位基因，这些变异使得个体倾向在许多部位患癌肿。这些癌肿包括黑素瘤、眼黑素瘤、白血病、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、肌肉瘤、胆管癌、鳞状上皮细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病以及胰腺、乳房、脑、前列腺、膀胱、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸、肾、胃、结肠和直肠的癌肿。这种倾向性等位基因还被称为“MTS易感等位基因”。

“MTS基因座”、“MTS基因”、“MTS核酸”或“MTS多聚核苷酸”都指位于MTS区域的多聚核苷酸，它们会在正常的组织中表达，其中，某些等位基因会使个体倾向患黑素瘤和其他癌肿，例如眼黑素瘤、白血病、星形细胞瘤、成胶质细胞瘤、淋巴瘤、神经胶质瘤、Hodgkin氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、肉瘤、肌肉瘤、胆管癌、鳞状上皮细胞癌、慢性淋巴细胞性白血病以及胰腺、乳房、脑、前列腺、膀胱、甲状腺、卵巢、子宫、睾丸、肾、胃、结肠和直肠的癌肿。在本文中，MTS基因座可以和本领域中的名称MLM基因座互换使用，使用“MTS”是为了包括作为基因座、基因、区域等而使用的“MLM”。MTS基因座的突变涉及到其他肿瘤的引发和/或进展。该基因座部分地由导致个体倾向患癌肿的突变所表示。这些突变位于本文下述的MTS区域中。MTS基因座包括编码序列、中间序列和控制转录和/或翻译的调控序列。MTS基因座包括所有等位基因的DNA序列变异。

当这些术语用于核酸时，是指编码MTS多肽(包括p16)、片段、同系物或变体(例如包括融合蛋白或缺失蛋白)的核酸。本发明的核酸具有或者衍生自或者类似于天然MTS编码基因的序列，或者具有基本上与天然MTS编码基因或其部分同源的序列。MTS多肽(MTS1)的编码序列显示于SEQ ID NO：1，而MTS多肽(MTS1)的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：2。第二种MTS多肽(MTS1E1β)的编码序列显示于SEQ ID NO：13，而相应的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：14。第三种MTS多肽(MTS2)的编码序列显示于SEQ ID NO：15，而相应的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：16。术语p16可以和MTS1及MTS1E1β互换使用，用于意指编码p16的MTS1和编码p10的MTS1E1β。MTS1和MTS1E1β是一个基因的两种形式，这两种形式取决于使用两种启动子中的哪一种进行转录。MTS2是MTS区域中的一个单独部分，它编码p15。

本发明的多聚核苷酸包括RNA、cDNA、基因组DNA、合成形式和混合聚合物，可以是有义或反义链，而且可以是用化学或生化方法修饰过的或者含有非天然的或衍生的核苷酸碱基，这些对本领域中的熟练技术人员而言是显而易见的。例如这些修饰包括，标记、甲基化、用类似物置换一个或多个天然核苷酸、核苷酸之间的修饰如不带电荷的键连接(如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、甲氨酸酯等)、带电荷的键连接(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、侧链部分(如多肽)、嵌入剂(intercalator)(如吖啶、补骨脂内酯等)、螯合剂、烷基化剂和修饰的键连接(如α正位异构化(anomeric)核酸等)。还包括合成的分子，该分子能通过氢键和其他化学相互作用模拟与指定序列结合的多聚核苷酸。这种分子是本领域中熟知的，例如包括那些在分子骨架中用肽键替换磷酸键的分子。

本发明提供包括全部或部分MTS区域的重组核酸。重组构建物能在宿主细胞中自我复制。或者，重组构建物被整合入宿主细胞的染色体DNA中。这种重组的多聚核苷酸包括基因组的、cDNA的半合成的或合成来源的多聚核苷酸，该多聚核苷酸因其来源或操作呈现：1)并不与全部或部分在天然状态下与其相连的多聚核苷酸相连；2)连接于在天然状态下并不与其相连的多聚核苷酸或者3)天然地不存在。

因此，本发明提供了含有非天然存在序列的重组核酸。尽管可以使用野生型序列，但是野生型序列常常被加以改变，如通过缺失、置换或插入。

可以使用不同类型的cDNA或基因组文库作为本发明的天然核酸源进行筛选，也可以通过使用PCR等技术在基因组DNA或其他天然来源中扩增存在的序列而获得这些核酸。选择的cDNA库通常对应于富含所需蛋白质的mRNA的组织源。一般噬菌体文库较佳，但是也可以使用其他文库。文库的克隆被涂布于平板上，转移至基膜上进行筛选，变性及利用探针检测是否存在所需的序列。

用于本发明的DNA序列通常含有至少5个密码子(15个核苷酸)，更通常地至少7—15个密码子，最通常地至少35个密码子。可以存在一个或多个内含子。核苷酸的数目通常是能够与MTS编码序列特异性地杂交的成功探针所需的最小长度左右。

有关核酸操作的技术例如在Sambrook et al.，1989或Ausubelet al.，1992中有广泛的描述。使用这些技术的试剂，如限制性内切酶等是本领域中熟知的，而且可以从供应商如New EnglandBioLabs、Boehringer Mannheim、Amersham、Promega Biotec、U.S.Biochemicals、New England Nuclear和大量其他供应商处购得。用于产生本发明的融合蛋白的重组核酸序列中可以从天然的或人工合成的序列中衍生而得。许多天然的基因序列可以用合适的探针从基因组文库中或者从不同的cDNA中获得。参见GenBank，National Institutes of Health。

“MTS区域”指在P1克隆P1-1062和P1-1063中找到的人染色体9的部分。这些位于大肠杆菌NS3529中的P1克隆已于1994年3月16日被保藏在美国典型培养物保藏中心(Rockville，MarylandUSA)，其保藏号分别为ATCC No.69589和69590。该区域含有MTS基因座，包括MTS1、MTS2和MTS1E1β基因。

如本文所用，术语“MTS基因座”、“MTS等位基因”和“MTS区域”都指含有该基因座、等位基因或区域的双链DNA以及含有该基因座、等位基因或区域的单链DNA。

如本文所用，“部分”MTS基因座或区域或等位基因被定义为具有至少约8个核苷酸，或较佳地约15个核苷酸或更佳地至少约25个核苷酸的最小数目，并且可以是具有至少约40个核苷酸的最小数目。

“MTS蛋白质”或“MTS多肽”指由MTS基因座编码的蛋白质或多肽(包括MTS1多肽、MTS2多肽和MTS1E1β多肽)、其变异蛋白或其片段。术语“多肽”指氨基酸的聚合物或其等价物，并不指具有特定长度的产物；因此，肽、寡肽和蛋白质都被包括在多肽这一定义中。该术语并不排除多肽的修饰作用如糖基化、乙酰基化、磷酰基化等。该定义包括含有一个或多个氨基酸类似物(例如包括非天然氨基酸等)的多肽、具有取代键以及其他本领域中已知的天然或非天然修饰的多肽。一般地，这种多肽至少具有约50％、较佳地大于约90％、更佳地至少约95％与天然MTS序列的同源性。还包括由在高严紧或低严紧条件下与MTS编码核酸杂交的DNA所编码的蛋白质，以及用针对MTS蛋白质的抗血清而获得的密切相关的多肽或蛋白质。

用于比较同源性的多肽序列长度通常至少约16个氨基酸，常常至少约20个残基，更通常地至少约24个残基，典型地至少约28个氨基酸，而且更佳地大于约35个残基。

“可操作相连的”是指这样一种并列关系，其中所述的组份所处的关系使得它们可以按预期的方式发挥功能。例如，如果启动子可以引起一段编码序列转录或表达的话，则该启动子是可操作相连于编码序列的。

“探针”。与导致易患某些癌肿或者大多数癌肿的MTS等位基因关联的多聚核苷酸多态性可以通过与某多聚核苷酸探针的杂交反应进行检测，该探针在严紧至中等严紧杂交和洗涤条件下能够与该靶序列形成稳定的杂合体。如果预期探针完全与靶序列互补，那么可以使用严紧条件。如果预期存在某些错配，例如预期的变异体与探针不是完全互补的时候，那么可以降低杂交的严紧性。选择的条件应消除非特异的/偶然的结合，即应降低背景。因为这种显示可确定中性DNA多态性和突变，所以，还需要进一步分析以表明MTS易感等位基因的缺失。

用于MTS等位基因的探针可以从MTS区域或其cDNA获得。探针可以具有任何合适长度，它可以横跨MTS区域的全部或部分，而且可以特异性地与MTS区域杂交。如果靶序列含有与探针相同的序列，那么探针可以短一些，如约为8—30碱基对，因为在严紧条件下杂合体也是相对稳定的。如果预期与探针之间有某些程度的错配，即如果怀疑探针会与变异区域杂交，那么可以采用较长的、会与靶序列产生必要特异性杂交的探针。

探针包括连于标记物或报道分子的分离多聚核苷酸，而且可以使用标准方法用于分离其他的、具有序列相似性的多聚核苷酸序列。对于探针的制备和标记，请参见Sambrook et al.，1989或Ausubelet al.，1992。其他类似的多聚核苷酸可以通过使用同源的多聚核苷酸加以选择。或者，编码这些多肽或类似多肽的多聚核苷酸可以通过利用丰余的遗传密码子加以合成或选择。可以引入不同的密码子置换，例如沉默变化(从而产生不同的限制性酶切位点)或优化某特定体系的表达。可以引入突变以修饰多肽的性能，也许会改变配体结合的亲和力、链间的亲和力、多肽降解或转换率(turnover rate)。

本发明的探针含有合成寡核苷酸或其他多聚核苷酸，它们可以衍生自天然存在的或重组的单链或双链多聚核苷酸，或者通过化学方式合成。探针可以通过缺口平移、Klenow填入法或其他本领域中已知的方法进行标记。

最好选用编码MTS的多聚核苷酸序列作为探针，该探针具有至少约8个核苷酸，通常地至少约15个核苷酸而且小于约6千碱基对，通常地小于约1.0千碱基对的多聚核苷酸序列部分。探针还可以用于在细胞或组织中确定是否存在编码MTS的mRNA。

对于MTS多肽或其片段，本发明还提供了“蛋白质修饰形式或片段”，它们一级结构序列基本同源，但是包括例如，体内或体外通过化学和生化的修饰形式，以及掺入非常见氨基酸的形式。这些修饰包括乙酰基化、羧基化、磷酰基化、糖基化、遍在蛋白化(ubiquitination)、如用放射性核素进行标记以及各种酶的修饰，这些都是本领域中的熟练技术人员能轻易理解的。大量不同的标记多肽的方法以及大量不同的用于该用途的取代基或标记物是本领域中熟知的，其中包括放射性同位素如32P、可与标记的抗配体(如抗体)结合的配体、荧光团、化学发光剂、酶和作为标记配体特异性结合配对成员的抗配体。标记物的选择取决于所需的灵敏度、与引物偶联的简便性、所要求的稳定性和所能得到的检测设备。标记多肽的方法是本领域中熟知的。例如参见Sambrook et al.，1989或Ausubel et al.，1992。

除了基本上全长的多肽之外，本发明还提供了具有生物学活性的多肽片段。重要的生物学活性包括配体结合活性、免疫学活性和其他MTS多肽的生物学活性。免疫学活性包括靶免疫体系中的免疫原功能，以及具有供结合的免疫表位以作为MTS蛋白质表位的竞争剂或取代抗原。如本文所用，“表位(又称抗原决定簇)”指多肽的抗原决定簇。一个表位可以含有三个表位独有的处于空间构象中的氨基酸。一般地，一个表位由至少5个这样氨基酸、更常见地由至少8—10个这样氨基酸构成。确定这些氨基酸的空间构象的方法是本领域中熟知的。

对于免疫学的用途，可以使用串联重复的多肽片段作为抗原，从而产生高抗原性的蛋白质。或者，这种多肽抗原作为特异性结合的极有效的竞争剂。下文描述特异地针对MTS多肽或其片段的抗体的生产过程。

本发明还提供了含有MTS多肽及其片段的融合多肽。可以在两个或多个MTS多肽序列之间或者在MTS序列和相关蛋白质之间使同源的多肽融合。同样可以构建异源的融合蛋白，它具有衍生蛋白质的复合性能或活性。例如，可以在不同的新融合多肽或片段之间“交换”配体结合域或其他的结构域。这种同源或异源的融合多肽可表现出例如已改变的结合活力和特异性。融合配偶体包括免疫球蛋白、细菌β-半乳糖苷酶、trpE、蛋白质A、β-内酰胺酶、α-淀粉酶、乙醇脱氢酶和酵母α接合因子。例如参见Godowski et al.，1988。

典型地，融合蛋白可以用重组核酸法(如下文所示)或者用化学合成法制得。用于合成多肽的技术在Merrifield，1963中有描述。

“蛋白质纯化”指将MTS多肽从其他生物材料中如从用重组的编码MTS的核酸转化的细胞中分离出的各种不同方法，这些方法是本领域中熟知的。例如，可以用如本发明中提供的抗体，使用免疫亲和色谱法来纯化多肽。各种不同的蛋白质的纯化方法是本领域中熟知的，其中包括在Deutscher，1990和Scopes，1982中所述的方法。

术语“分离的”、“基本纯的”、和“基本同质的”可以互换使用，都用于描述已经与在天然状态下伴随它的组份分离的蛋白质或多肽。当约60—75％的样品具有单一的多肽序列时，该单体蛋白质便是基本纯的。基本纯的蛋白质典型地含有约60—90％W/W、更通常地约95％而且更佳地超过约99％的蛋白质样品。蛋白质的纯度或同质性可以用多种本领域中熟知的方法表示，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或在对凝胶进行染色之后观察蛋白质样品中单一的多肽条带。对于某些情况，可以用高效液相色谱(HPLC)或其他本领域中熟知的手段提供更高的分辨率用于纯化。

当MTS蛋白质已经与在天然状态下伴随它的天然污染物分离时，则该MTS蛋白质就基本上不含与其天然相关的组份了。因此，用化学方法合成的多肽或者在与天然产生该多肽的细胞不同的细胞体系中合成的多肽基本上不含与其天然相关的组份。还可以使用本领域中熟知的蛋白质纯化技术，通过分离使蛋白质基本上不含与其天然相关的组份。

如本文所用，作为分离的和可操作的基因序列表达产物而产生的多肽是“分离的多肽”，即使是在同源的细胞类型中表达。人工合成形式或用异源细胞表达的分子本身就是分离的分子。

“重组核酸”是天然不存在的核酸，或者是将两个本身分开的序列片段通过人工组合形成的核酸。该人工组合通常是通过化学合成手段，或者通过对分离的核酸片段进行人工操作(例如通过遗传工程技术)而实现。典型地，当需要引入或去除一个序列识别位点时，通常是用编码相同的或保守性的氨基酸的丰余密码子来置换某一密码子。或者，可以将具有所需功能的核酸片段合并起来产生所需的功能组合。

“调控序列”指那些通常位于某基因座10Kb编码区域之内的、影响基因表达(包括基因的转录和信使RNA的翻译、拼接、稳定性等)的序列。

“基本同源或类似”。如果与其他核酸(或其互补链)最佳地进行排列(具有适当的核苷酸插入或缺失)时，核苷酸序列的相同程度有至少约60％的核苷酸碱基，通常地至少约70％的核苷酸碱基，更通常地至少约80％，较佳地至少约90％，更佳地至少约95—98％的核苷酸碱基时，那么我们称该核酸或其片段与另一核酸“基本同源”(或“基本类似)。

或者，当核酸或其片段在选择的杂交条件下能够与另一核酸(或其互补链)或与某一链或其互补链杂交，那么就存在基本同源或类似性。当发生比特异性完全缺乏更具选择性的杂交时，存在着杂交的选择性。典型地，当在一段至少约14个核苷酸的区间中有至少约55％的同源性、较佳地至少约65％、更佳地至少约75％、最佳地至少约90％的同源性时，会发生选择性的杂交。参见Kanehisa，1984。如本文所述，同源性的比较长度可以在更长的区段进行。在某些实施例中经常是至少约9个核苷酸长度，通常地至少约20个核苷酸，更通常地至少约24个核苷酸，典型地至少约28个核苷酸，更典型地至少约32个核苷酸，并且更佳地至少约36个核苷酸或更多。

除了受碱基组成、互补链长度和杂交核酸之间核苷酸碱基错配的数目等因素影响之外，核酸杂交还受诸如盐浓度、温度或有机溶剂等因素的影响，这一点是本领域中的熟练技术人员所知晓的。严紧的温度条件通常包括超过30℃的温度，典型地超过37℃，更佳地超过45℃。严紧的盐浓度一般小于1000mM，典型地小于500mM，更佳地小于200mM。然而，这些参数的组合比任何单一参数更为重要。例如参见Wetmur & Davidson，1968。

探针序列还可以在特定的条件下与双链DNA特异性地杂交，从而形成三股或其他更高级的DNA复合物。这些探针的制备和合适的杂交条件是本领域中所熟知的。

当用于多肽时，术语“基本同源”或“基本相同”表示感兴趣的多肽或蛋白质与完整的天然存在的蛋白质或其部分相比，至少约30％相同，通常地至少约70％相同，更佳地至少约95％相同。

“基本相似的功能”指相对于野生型MTS核酸或野生型MTS多肽而言的修饰核酸或修饰蛋白质的功能。修饰多肽基本上与野生型MTS多肽同源而且基本上具有相同的功能，即抑制Cdk尤其是抑制Cdk4。修饰多肽可以具有不同的氨基酸序列和/或含有修饰氨基酸。除了抑制Cdk功能之外，修饰多肽还可以有其他的性能，比如更长的半衰期。修饰多肽的抑制Cdk的活性基本上与野生型的活性相同。或者，修饰多肽的抑制Cdk的活性比野生型的活性更高。修饰多肽用常规技术合成，或者用修饰核酸编码并用常规技术产生。修饰核酸用常规技术制备。基本上类似野生型MTS基因功能的核酸可以产生上述的修饰蛋白质。

典型地，多肽的同源性用序列分析软件确定。例如参见GeneticsComputer Group(University of Wisconsin Biotechnology Center，910 University Avenue，Madison，Wisconsin 53705)的序列分析软件包(Sequence Analysis Software Package)。蛋白质分析软件通过测定各种置换、缺失和其他修饰方面指定的同源性来匹配相似的序列。典型地保守性的置换包括列于下组中的置换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸和苯丙氨酸、酪氨酸。

多肽“片段”、“部分”是指至少约5—7个连续氨基酸、通常地至少约7—9个连续氨基酸、典型地至少约9—13个连续氨基酸、最佳地至少约20-30个或更多连续氨基酸的一段氨基酸残基。

本发明的多肽，如果是可溶的，可以偶联于固相载体，例如硝基纤维素、尼龙、柱填塞材料(如琼脂糖凝胶(Sepharose)珠)、磁性珠、玻璃毛、塑料、金属、聚合物凝胶、细胞或其他的底物。这些载体可以是珠、槽(well)、量尺或膜等形式。

“靶区域”指被扩增和/或被检测的核酸区域。术语“靶序列”所指的序列在所需条件下，将与探针或引物形成稳定的杂合体。

除非另外注明，本发明的实施采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA、遗传学和免疫学的常规技术。例如参见Maniatis et al.，1982；Sambrook et al.，1989；Ausubel et al.，1992；Glover，1985；Anand，1992；Guthrie & Fink，1991。用于人基因图谱包括人染色体9p图谱的技术和材料的一般性讨论，可参见White &Lalouel(1988)的文章。制备重组的或化学合成的核酸；载体、转化、宿主细胞本发明的大量多聚核苷酸可以通过在适当宿主细胞中的复制而产生。编码所需片段的天然或合成的多聚核苷酸片段可以整合入重组多聚核苷酸构建物中，通常为DNA构建物。该构建物可以将其引入原核或真核细胞中并在其中复制。一般地，多聚核苷酸构建物适合在单细胞宿主如酵母或细菌中复制，但是也可以将其引入培养的哺乳动物或植物或其他的真核细胞系中(整合或没有整合入基因组中)。对用本发明方法产生的核酸的纯化，在Sambrook et al.，1989或Ausubel et al.，1992中有描述。

本发明的多聚核苷酸还可以用化学合成的方法产生，例如Beaucage & Caruthers，1981所述的亚磷酰胺法或者Matteucci etal.，1981所述的三酯法，而且可以在商购的、自动寡核苷酸合成仪上进行。从化学合成的单链产物基础上获得双链片段，即通过合成互补链然后在合适的条件下使两条链退火，或者使用DNA聚合酶和合适的引物序列添加互补链。

为了引入原核或真核宿主中而制备的多聚核苷酸构建物可以含有一个能被宿主识别的复制系统，该系统包括编码所需多肽的多聚核苷酸片段，而且最好含有可操作地相连于多肽编码片段的转录和翻译起始调控序列。表达载体含有复制起始点或自我复制序列(autonomously replicating sequence，ARS)和表达控制序列、启动子、增强子和必要的加工信息位点如核糖体结合位点、RNA拼接位点、多聚腺苷酸化位点、转录终止序列和mRNA稳定序列。合适的话，可以含有来自天然MTS蛋白质或者来自其他受体或者来自相同或相关物种的分泌多肽的分泌信号，从而使蛋白质能够通过和/或留在细胞膜，并因此获得其功能性拓扑结构或者从细胞中分泌出去。这些载体可以用本领域中熟知的标准重组技术制备，例如可以参见Sambrook et al.，1989或Ausubel et al.，1992。

应选择合适的启动子和其他必要的载体序列使其能在宿主中发挥作用。合适的话，可以选用与MTS基因天然相关的序列。细胞系和表达载体的可操作的组合在Sambrook et al.，1989或Ausubelet al.，1992中有描述，还可以参见Metzger et al.，1988。许多有用的载体是本领域中熟知的，而且可以从供应商如Stratagene、NewEngland Biolabs、Promega Biotech等处获得。启动子如trp、lac和噬菌体启动子、tRNA启动子和糖酵解酶启动子可以用于原核宿主。有用的酵母启动子包括金属硫蛋白(metallothionein)、3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶如烯醇化酶或甘油醛-3-磷酸脱氢酶、担负利用麦芽糖和半乳糖的酶等的启动子区域。适合用于酵母表达的载体和启动子还在Hitzeman et al.，EP73，675A中有进一步描述。合适的非天然哺乳动物启动子包括来自SV40早期和晚期启动子(Fierset al.，1978)或来自Moloney鼠白血病病毒、鼠肿瘤病毒、鸟肉瘤病毒、腺病毒II、牛乳头状瘤病毒或多瘤的启动子。另外，构建物可以连于可扩增的基因(如二氢叶酸还原酶(DHFR))从而可以产生多拷贝基因。对于合适的增强子和其他的表达控制序列，也可以参见Enhancers and Eukaryotic Gene Expression，Cold Spring HarborPress，Cold Spring Harbor，New York(1983)。

尽管这些表达载体可以自我复制，但是它们也可以通过使用本领域中熟知的方法插入到宿主细胞的基因组中再复制。

表达和克隆载体将可能含有供选择的标记基因，该基因编码的蛋白质是载体转化的宿主细胞的存活或生长所必需的。该基因保证只有表达该插入子的宿主细胞才能生长。典型的选择基因编码下列蛋白质：a)提供对抗生素或其他毒性物质如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤等抗性的蛋白质；b)互补营养缺陷的蛋白质或c)提供复合培养基中没有的重要营养成分的蛋白质，例如杆菌D-丙氨酸消旋酶的基因。选择合适供选择的标记基因取决于所用的宿主细胞，而各种不同宿主的合适标记基因是本领域中所熟知的。

含有感兴趣核酸的载体可以在体外转录，然后用熟知的方法例如通过注射(参见T.Kubo et al.，1988)将得到的RNA引入宿主细胞，或者也可以用本领域中熟知的方法将载体直接引入宿主细胞，这取决于宿主细胞的类型。这些方法包括：电穿孔；采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、二乙氨乙基(DEAE)-葡聚糖或其他物质的转染；微粒轰击(microprojectile bombardment)；脂质转染(lipofection)；感染(当载体是感染物时，例如反转录病毒基因组)和其他方法。一般地参见Sambrook et al.，1989或Ausubel et al.，1992。可以用任何本领域中已知的方法，特别是上述的方法。将多聚核苷酸引入宿主细胞的过程在本文中称为“转化”。已经引入上述核酸的细胞还包括该细胞的后代。

大量本发明的核酸和多肽可以在相容的原核或真核宿主细胞中通过载体或其他表达载体表达而得以制备。最常用的原核宿主是大肠杆菌菌株，尽管有其他的原核生物，如枯草杆菌或假单孢菌(属)。

哺乳动物或其他的真核宿主细胞，如酵母、丝状真菌、植物、昆虫或两栖动物或鸟类的宿主细胞，也可以用于产生本发明的蛋白质。哺乳动物细胞的培养增殖是本领域中每个人都熟知的。参见Jakoby和Pastan(编辑)，1979。常用的哺乳动物宿主细胞系的例子是VERO和Hela细胞中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和W138、BHK和COS细胞系。但是熟练的技术人员知道，其他的细胞系也是合适的，用于提供更高效的表达、所需的糖基化形式或其他特性。

根据载体构建的方式，通过标记基因选择克隆。标记基因位于相同或不同的DNA分子上，较佳地在相同的DNA分子上。在原核宿主中，可以通过对诸如氨苄青霉素、四环素或其他抗生素的抗性而选择转化子。根据温度敏感性产生的特定产物也可以用作合适的标记物。

用本发明的多聚核苷酸转化的原核或真核细胞不仅可以用于产生本发明的核酸和多肽，也可以用于研究MTS多肽的性质。

反义多聚核苷酸序列可用于防止或减弱MTS基因座的表达，这一点是本领域中的熟练技术人员所能理解的。例如，可以将含有全部或部分MTS基因座序列、或者其他来自MTS区域序列(尤其是位于MTS基因座两侧的序列)的多聚核苷酸载体置于反义方向启动子的控制下，并引入细胞。在细胞中，这种反义构建物的表达会干扰MTS转录和/或复制。

细胞周期蛋白(Cycline)和Cdk是真核生物中广泛存在着的细胞周期调控因子。这些蛋白质最初在酵母中发现，并且已经在海洋无脊椎动物、两栖动物和哺乳动物包括鼠、兔和人中发现。通过使用基于一种物种基因序列的探针和/或引物，可以在其他物种中鉴别出同源的细胞周期调控基因。因此，本文所公开的MTS基因序列的探针和引物，可以用于在其他物种中鉴别同源的MTS基因序列和蛋白质。针对分离出这些物质的物种，可用这些MTS基因序列和蛋白质进行本文所述的诊断/预后、治疗和药物筛选。使用方法：核酸诊断和诊断试剂盒为了检测是否存在使个体易患癌肿的MTS等位基因，可以制备生物样品如血液，然后分析是否存在易感性MTS等位基因。为了检测是否存在瘤形成、或者先前损伤的恶性发展、或者诊断的征兆，可以制备损伤的生物样品，然后分析是否存在导致瘤形成的MTS等位基因。这些测试的结果和解释可以供给卫生保健机构，从而告诉受测试的个体。这些诊断可以由诊断实验室进行，或者可以制造诊断试剂盒并售给卫生保健机构或个人以供自我诊断。

起初，筛选方法涉及通过PCR扩增有关的MTS序列，然后进行DNA序列分析。在另一本发明的优选例子中，筛选方法是一种非PCR方案。该筛选方法包括本领域中熟知的两步标记放大技术。PCR和非PCR的筛选方案都能以很高的灵敏度检测靶序列。

目前最常用的方法是靶目标的扩增。使用聚合酶扩增靶核酸序列。一种特别优选的、聚合酶驱动的扩增反应方法是聚合酶链反应(PCR)。处于本发明范围之内的一种优选的PCR方案在实施例1中提供。由于聚合酶驱动扩增循环，因此聚合酶链反应和其他聚合酶驱动的扩增分析方法使拷贝数目增加一百万倍以上。一旦被扩增，得到的核酸可以用于测序或者用作DNA探针的底物。

当使用探针来检测靶序列的存在时(例如在筛选癌肿的易感性时)，可以处理待分析的生物样品(例如血液和血清)以抽提出核酸。样品核酸可以用不同的方法进行制备，从而促进靶序列的检测。例如变性、限制性消化、电泳或点杂交。被分析核酸的靶区域通常必须至少部分呈单链状态，以便与探针的靶序列形成杂合体。如果序列本身是单链，那么不需要变性。但是，如果序列是双链，那么序列可能需要变性。可以用本领域中熟知的各种技术进行变性。

在会促使探针的靶序列和被分析物中假定的靶序列之间形成稳定杂合体的条件下，将被分析核酸和探针进行保温。与被分析物结合的探针区域可以被制成与人染色体9p的靶区域完全互补。因此，为了防止假阳性，需要高严紧条件。只有当探针与基因组中单一的染色体区域互补时方使用高严紧条件。杂交的严紧性由杂交和洗涤过程中的众多因素所决定，其中包括温度、离子强度、碱基组成、探针长度和甲酰胺浓度。这些因素在Maniatis et al.，1982和Sambrook etal.，1989中有总结。在某些情况下，更高级杂合体如三聚体、四聚体等的形成也可以作为检测靶序列的方法。

如果存在杂合体，那么形成的杂合体的检测通常通过使用标记探针实现。或者，探针是未标记的，但是可以与直接或间接标记的配体通过特异性地结合而检测出。合适的标记物以及用于标记探针和配体的方法是本领域中中熟知的，其中包括用已知方法(如缺口平移、随机引物法和磷酸根转移法(kinasing))掺入的放射性标记物、生物素、荧光基团、化学发光基团(如二氧杂环丁烷(dioxetane)，尤其是触发态二氧杂环丁烷)、酶、抗体等。在这一基本技术框架下的改动是本领域中熟知的，其中包括那些促进将待检测的杂合体从外源材料中分离出来和/或放大来自标记部分的信号的改动。众多的改动形式总结于Matthews & Kricka，1988；Landegren et al.，1988；Mittlin，1989；美国专利4,868,105和EPO出版物No.225，807中。

如上所述，本发明合适地提供了非PCR筛选分析方法。在实施例15中提供了代表性的非PCR程序。在该程序中，将核酸探针(或类似物，例如用膦酸甲酯骨架替换普通的磷酸二酯)与低浓度的DNA靶目标杂交。该探针具有与其共价相连的酶，而共价连接不会干扰杂交反应的特异性。接着该酶-探针-偶联物-靶核酸复合物可以与游离的探针-酶偶联物分离，然后加入底物进行酶检测。可以通过显色变化或者灵敏度增高103—106倍的荧光输出量而观察酶活性。对于寡聚脱氧核苷酸-碱性磷酸酶偶联物的制备及其作为杂交探针的用途，可以参见Jablonski et al.，1986。

两步标记放大技术是本领域中中熟知的。这些分析方法基于这样的原理：将小配体(如地高辛配基(digoxigenin)、生物素等)连于能够特异性地与MTS结合的核酸探针上。针对MTS1的代表性探针对应于SEQ ID NO：4中核苷酸448-498的位置。等位基因特异的探针也在该例子的构思范围之中，代表性的等位基因特异的探针包括含有总结于表3的倾向性突变和总结于表5的肿瘤体细胞突变的探针。

在一个例子中，连于核酸探针上的小配体被抗体-酶偶联物特异性识别。在该例子中，将地高辛配基连于核酸探针上。用能够使化学发光底物发生转换的抗体-碱性磷酸酶偶联物检测杂交。用于标记该例子中核酸探针的方法，可以参见Martin et al.，1990。在另一例子中，小配基被能够特异性地与其复合的另一个配基-酶偶联物所识别。这种情况下的一个众所周知的例子是生物素-抗生物素的相互作用。标记核酸探针的方法以及它们基于生物素-抗生物素分析的用途，参见Rigby，et al.，1977和Nguyen，et al.(1992)。

同样在本发明构思范围之中的是本发明的核酸探针分析可以采用能够检测出MTS基因的核酸探针的混合物。因此，在一个从细胞样品中检测MTS1存在的例子中，采用多种与MTS1互补的探针，尤其是这组不同的探针可以为2、3或5种不同的核酸探针序列。在另一例子中，为了在病人中检测是否存在MTS基因序列的突变，可以使用一种以上与MTS1互补的探针，该混合物含有能够与等位基因特异性突变结合的探针，而这些突变是在带有MTS1突变的病人人群中鉴别出的。在该例子中，可以使用任何数目的探针，而且最好包括对应于、使个体倾向于患乳房癌的主要的基因突变的探针。一些本发明范围之内的候选探针包括表3和5中列出的等位基因特异性突变的探针。使用方法：肽诊断和诊断试剂盒损伤的瘤形成状况可以根据野生型MTS多肽发生的改变而加以检测。这种改变可以用常规的技术通过序列分析确定。更佳地，使用抗体(多克隆或单克隆抗体)来检测MTS多肽的差异或MTS多肽的缺乏。在本发明的优选实施例中，抗体将MTS蛋白质从溶液中免疫沉淀出，以及在聚丙烯酰胺凝胶的Western印迹或免疫印迹中与MTS蛋白质反应。在另一优选实施例中，通过使用免疫细胞化学技术，抗体可以从石蜡或冰冻组织切片中检测出MTS蛋白质。用于获得和纯化抗体的技术是本领域中中众所周知的，因而可以选用任一这样的技术来实现本发明的制备。

检测MTS或其突变方法的优选例子包括酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assays，ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫放射测定(IRMA)和免疫酶测定(IEMA)，包括用于单克隆和/或多克隆抗体的夹心测定。夹心测定例子在David等人的美国专利No.4,376,110和4,486,530中有描述(这些文献在此引用作为参考)，并且以实施例18为例。使用方法：药物筛选本发明对于筛选化合物特别有用，即在各种药物筛选技术中通过使用Cdk多肽或其结合片段而筛选化合物。最好使用Cdk4。在测试中使用的Cdk多肽或其片段可以处于溶液中的游离状态，或者被固定于某固相载体，或者位于细胞表面。一种药物筛选方法最好是在竞争结合测定中，采用已经用表达多肽或其片段的重组多聚核苷酸稳定地转化了的原核或真核宿主细胞。这种细胞，或者处于游离状态或者处于固定形式，都可以用于标准结合分析中。例如人们可以测量在Cdk多肽或其片段和被测试的试剂之间是否形成复合物，或者检测在Cdk多肽或其片段和MTS多肽或其片段之间形成的复合物被所测试的试剂干扰的程度。

因此，本发明提供了筛选药物的方法，它包括将某种试剂与Cdk多肽或其片段接触，然后用本领域中熟知的方法测定：1)是否存在由该试剂和Cdk多肽或其片段形成的复合物或2)是否存在由Cdk多肽或其片段和配基形成的复合物。还可以测定Cdk的活性，以确定该试剂是否能够抑制Cdk，即是否能够调节细胞周期。在这种竞争性结合测定中，Cdk多肽或其片段是被标记的。将游离的Cdk多肽或其片段从蛋白质：蛋白质复合物中分离，游离(即未复合的)标记物的量便分别是被测试的试剂结合于Cdk的测量值，或者是其干扰Cdk：MTS多肽结合的测量值。可以按这种方法分析MTS多肽的小肽(肽模拟物)以确定哪些具有Cdk抑制活性。

另一种药物筛选的方法可以为适当的与Cdk多肽有结合亲和力的化合物提供全面的筛选，该方法在Geysen的欧洲专利申请No.84/03664中(1984年9月13日出版)有详细的描述。简而言之，在固相基质如塑料针或其他表面上合成大量不同的小肽测试化合物，然后将肽测试化合物与Cdk多肽反应并洗涤。接着用本领域中熟知的方法检测结合的Cdk多肽。

纯化的Cdk可以直接涂在平板上以便用于上述的药物筛选技术。但是，也可以使用针对多肽的非中和抗体来捕获固定于固相上Cdk多肽的抗体。

本发明还提供了竞争性药物筛选测定法的用途。其中能够特异性地结合Cdk的中和抗体与测试化合物发生竞争，争夺与Cdk多肽或其片段的结合。在这种方法中，可以使用抗体来检测具有一个或多个Cdk多肽抗原决定簇的任何肽。

另一种药物筛选的技术涉及使用具有无功能MTS基因的真核宿主细胞或细胞系(例如上述的)。这些宿主细胞系或细胞在细胞周期调控中的Cdk水平上存在缺陷。在药物化合物存在条件下，这些宿主细胞系或细胞生长。测量宿主细胞的生长速率以确定化合物是否能够调控细胞周期。一种测量生长速率的方法是测定Cdk、最好是Cdk4的生物学活性。使用方法：合理的药物设计合理的药物设计的目的是生产出感兴趣的具有生物学活性多肽的结构类似物，或与其反应的小分子结构类似物(例如促效剂、拮抗剂、抑制剂)，以便设计出的药物是活性更高或更稳定的多肽，或者该药物可以增强或干扰肽在体内的功能。例如参见Hodgson，1991。在一种方法中，人们先要通过X-射线衍射晶体法、通过计算机模型设计或者最典型地通过多种手段的结合而确定感兴趣蛋白质(例如，p16或Cdk4)或Cdk16-p16复合物的三维结构。通过基于同源蛋白质结构的模型设计可以获得有关某肽结构的不常见的有用信息。合理的药物设计的一个例子是人免疫缺陷病毒(HIV)蛋白酶抑制剂的开发(Erickson et al.，1990)。此外，可以用丙氨酸扫描法(Wells，1991)分析肽(如p16或Cdk4)。在该技术中，用Ala置换氨基酸残基，然后确定该置换对肽活性的影响。肽的每一个氨基酸残基都用这种方式进行分析，以确定肽的重要区域。

通过功能测定的选择，还可以分离靶目标特异性抗体，然后解开其晶体结构。从理论上讲，这种方法会得到一个药物核心(pharmacore)，而随后的药物设计都可以以此为基础。通过产生针对有功能的、有药物学活性的抗体的抗个体基因型抗体(anti-id)，就有可能绕过蛋白质晶体分析。作为一个镜像的镜像，可以预计抗个体基因型抗体的结合位点是最初受体的类似物。然后，抗个体基因型抗体可以用于从化学或生物学方法产生的肽文库中鉴别和分离出所需的肽。此时，选出的肽可以作为药物核心。

因此，人们可以设计出MTS活性更高或更稳定的药物，或者可以设计出作为MTS活性抑制剂、促效剂、拮抗剂等的药物。因为已有克隆的MTS序列，所以可以产生出足够量的MTS多肽，以便进行X-射线衍射晶体等分析。另外，此处提供的MTS蛋白质序列的知识对那些采用计算机模型设计取代X-射线衍射晶体的人以及那些使用这两种方法的人起指导作用。使用方法：基因治疗根据本发明，提供了向携带突变型MTS等位基因的细胞提供野生型MTS功能的方法。提供这样一种功能会抑制受体细胞的肿瘤生长。可以将位于载体中的野生型MTS基因或部分基因引入细胞，引入的基因处于染色体外。在这种情况中，基因在细胞中的染色体外进行表达。如果部分基因被引入并在携带突变型MTS等位基因的细胞中表达，则部分基因应能够编码使细胞进行非瘤形成生长所需的部分MTS蛋白质。更优选的是这样一种情况：野生型MTS基因或其部分被引入突变型细胞并且和细胞中存在的内源突变型MTS基因发生重组。这种重组需要发生双重组事件，从而导致MTS基因突变的校正。用于将基因引入从而进行重组或维持在染色体外的载体，是本领域中熟知的，而且可以使用任何合适的载体。将DNA引入细胞的方法，例如电穿孔、磷酸钙共沉淀和病毒转导都是本领域中熟知的，方法的选择是一般技术人员都能做到的。用野生型MTS基因转化的细胞可以用作研究癌肿消退以及研究促进这种消退的药物治疗的模型系统。

如上所述，可以在基因治疗方法中采用MTS基因或其片段(适用时)，以便增加癌肿细胞中该基因表达产物的数量。这种基因治疗特别适用于癌肿细胞和前癌肿(pre-cancerous)细胞，因为与正常细胞相比，这种细胞中MTS多肽的水平下降或缺乏。这种基因治疗还可以用于在另一些肿瘤细胞中增加MTS基因的表达水平，在这些细胞中突变型基因按“正常的”水平进行表达，但是基因产物却完全没有功能。

基因治疗可以用普遍接受的方法进行，例如Friedman在Therapy For Genetic Disease(T.Friedman，ed.，OxfordUniversity Press(1991)，PP.105—121)中所描述的方法。来自病人的肿瘤细胞可以先用上述的诊断方法进行分析，以确定肿瘤细胞中产生MTS多肽。然后制备含有连于表达调控元件并且能够在肿瘤细胞中复制的MTS基因拷贝的病毒或质粒载体。适用的载体是本领域中中熟知的，例如在美国专利5,252,479和PCT出版的申请WO93/07282中所公开的。接着可以将载体注射入病人，或者是局部地在肿瘤位置进行，或者是全身性进行(为了进入可能转移至其他位置的肿瘤细胞)。如果转染的基因没有永久性地整合入各个靶肿瘤细胞的基因组，那么需要定期地进行治疗。由于MTS多肽与细胞周期的调控紧密相关，因此优选地将MTS基因和其自身的调控元件一起引入，从而避免在所有摄入该基因的细胞中MTS多肽的组成型表达。

本领域中已知的基因转移系统都可以用于作为实施本发明的基因治疗方法。包括病毒和非病毒转移方法。大量的病毒已用作基因转移载体，其中包括乳多空病毒(如SV40，Madzak et al.，1992)、腺病毒(Berkner，1992；Berkner et al.，1988；Gorziglia andKapikian，1992；Quantin et al.，1992；Rosenfeld et al.，1992；Wilkinson et al.，1992；Stratford-Perricaudet et al.，1990)、牛痘病毒(Moss，1992)、腺伴随病毒(Muzyczka，1992；Ohi et al.，1990)、包括单纯疱疹病毒(HSV)和EB病毒(EBV)在内的疱疹病毒(Margolskee，1992；Johnson et al.，1992；Fink et al.，1992；Breakfield and Geller，1987；Freese et al.，1990)和来自鸟类(Brandyopadhyay and Temin，1984；Petropoulos et al.，1992)、鼠(Miller，1992；Miller et al.，1985；Sorge et al.，1984；Mann andBaltimore，1985；Miller et al.，1988)和人(Shimada et al.，1991；Helseth et al.，1990；Page et al 1990；Buchschacher andPanganiban，1992)的反转录病毒。大多数的人类基因治疗方案以减毒的鼠反转录病毒为基础。

本领域中已知的非病毒基因转移方法包括化学方法，例如磷酸钙共沉淀(Graham and van der Eb，1973；Pellicer et al.，1980)；机械方法，例如显微注射(Anderson et al.，1980；Gordon et al.，1980；Brinster et al.，1981；Constantini and Lacy，1981)；通过脂质体进行的膜融合介导转移(Felgner et al.，1987；Wang andHuang，1989；Kaneda et al.，1989；Stewart et al.，1992；Nabel etal.，1990；Lim et al.，1992)和直接DNA摄入以及受体介导的DNA转移(Wolff et al.，1990；Wu et al.，1991；Zenke et al.，1990；Wu et a1.，1989b；Wolff et al.，1991；Wagner et al.，1990；Wagner et al.，1991；Cotten et al.，1990；Curiel et al.，1991a；Curiel et al.，1991b)。病毒介导的基因转移可以与脂质体送递直接进行体内基因转移一起使用，使得这种转移指导病毒载体进入肿瘤细胞而不是周围的不分裂细胞。或者，可以将产生反转录病毒载体的细胞系注射入肿瘤(Culver et al.，1992)，这种细胞的注入可以连续地提供载体颗粒来源。该技术已经被批准用于患有不可进行手术的脑肿瘤病人。

结合生物学和物理学基因转移方法，将任何大小的质粒DNA与对腺病毒六邻体蛋白特异的聚赖氨酸偶联抗体混合，形成的复合物被连于腺病毒载体。然后用这种三分子复合物感染细胞。在双链DNA破坏之前，腺病毒载体能够有效地结合、内化(internalization)和降解核内体(endosome)。

已表明，脂质体/DNA复合物能够介导直接的体内基因转移。尽管对于标准的脂质体，基因转移过程是非特异性的，但是已经有报道，在直接的原位施用方法(Nabel 1992)之后，在肿瘤病灶部位有局部体内摄入和表达。使用方法：肽治疗可以将具有MTS活性的肽提供给携带突变型MTS等位基因或缺乏MTS等位基因的细胞。本文公开了MTS蛋白质的序列(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：16)。使用已知的表达载体，通过细菌中的cDNA序列的表达而产生蛋白质。或者，MTS多肽可以从产生MTS的哺乳动物细胞中抽提出。另外，可以使用化学合成技术来合成MTS蛋白质其中任何一种技术都能够提供含有MTS蛋白质的、本发明的制剂。该制剂基本上不含其他种类的人蛋白质。通过在微生物内或体外合成，可以极方便地实现该目的。

可以通过显微注射或使用脂质体将活性MTS分子引入细胞。或者，某些活性分子可以被细胞主动地或通过扩散摄入。在细胞外施用MTS基因产物足以影响肿瘤的生长。提供具有MTS活性分子可以部分在逆转瘤形成状态。也可以使用其他具有MTS活性的分子(例如肽、药物或有机化合物)来实现这种逆转。还可以使用具有基本类似功能的修饰多肽进行肽治疗。使用方法：转化的宿主同样地，携带突变型MTS等位基因的细胞和动物可以用作模型系统，以研究和测试可能成为治疗剂的物质。典型地，这些细胞是培养的上皮细胞。这些细胞可以从具有体细胞或种系MTS突变的个体中分离而得。或者如上所述，可以对细胞系进行工程改造，使之携带MTS等位基因的突变。将测试药物施用于细胞之后，测定细胞的瘤形成转化表型。对瘤形成转化细胞的任何性状都可以进行评估，其中包括不依赖于贴壁的生长(anchorage-independent growth)、在裸鼠中的致瘤性、对细胞的入侵性和对生长因子的依赖性。其中任何一种性状的测定是本领域中熟知的。

在对全体动物进行诱变或对种系细胞或合子进行处理之后，可以选择用于测试治疗剂的动物。这些处理包括插入突变型MTS等位基因(通常来自另一种动物)以及插入破坏的同源基因。或者，可以使用常规技术(Capecchi，1989；Valancius and Smithies，1991；Hasty et al.m 1991；Shinkai et al.，1992；Mombaerts et al.，1992；Philpott et al.，1992；Snouwaert et al.，1992；Donehower et al.，1992)通过插入或缺失突变或者其他的遗传改变而破坏动物的内源MTS基因。在将测试物质施用于动物之后，必须评估肿瘤的生长。如果测试物质防止或抑制肿瘤的生长，那么该测试物质是用于治疗本文所述癌肿的候选治疗剂。

本发明结合下列实施例进行阐述。这些实施例仅用于阐述本发明，并不以任何方式限制本发明。采用的是本领域中中熟知的标准技术或在下文中特别说明的技术。实施例1材料和方法A.MTS谱系图1A-1D分别显示了亲缘族3137、3161、3355和1771。在图中显示了这些亲缘族中的癌肿发生情况。亲缘族3137中所有的黑素瘤都携带易感性单倍型，而且还标出了该亲缘族其他携带易感性单倍型的癌肿。在亲缘族3161和3355中的所有黑素瘤都携带易感性单倍型。在亲缘族1771中的癌肿中鉴别出MTS的突变。

B.肿瘤细胞系从Ludwig Institute for Cancer Research、Memorial Sloan-Kettering Cancer Center得到76个黑素瘤细胞系，从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得8个黑素瘤细胞系和5个非黑素瘤细胞系。

C.肿瘤细胞系DNA的制备和分析从细胞系中分离DNA过程：向3毫升裂解缓冲液(0.1MNaCl；0.1M TrisHCl pH8.O；5mM EDTA；0.5％SDS)中加入约1×107细胞，然后涡旋振动并且在65℃保温30分钟。加入0.5ml8M KOAc，混合反应物，然后在冰上保温30分钟。离心(10,000×g，5分钟)后，用等体积的95％乙醇沉淀上清液，并且再次离心(10,000×g，15分钟)。将DNA重新悬浮于50-200毫升水中。

D.PCR反应将50ng模板和30pmol每种寡核苷酸引物加入20ml反应混合物中，该混合物含有0.1mM dNTP、10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、2mM MgCl2、0.01％明胶和1单位Amplitaq聚合酶(Perkin-Elmer)。样品在Perkin-Elmer9600热循环仪上，按94℃10秒、55℃10秒和72℃10秒的顺序进行35个循环。随后通过1.5％琼脂糖(SeaKem)或3％NuSieve3∶1琼脂糖(FMC BioProducts)电泳，并用溴化乙锭染色观察产物。

E.YAC使用上述PCR条件，用IFNA、D9S171和D9S126筛选CEPHYAC文库，获得含有MTS区域标记的酵母人工染色体(Yeastartificial chromosomes，YAC)。含有YAC的酵母菌株在30℃、AHV培养基(10g/l酪蛋白水解产物-酸；1.7g/l酵母含氮碱基；5g/l硫酸铵；20mg/l半硫酸腺嘌呤；2％葡萄糖；pH＝5.8)中通过剧烈摇动生长3天。按Ausubel et al.，1992所述的方法制备酵母DNA。

F.噬菌体文库的构建含有YAC DNA的酵母基因组DNA用BamHI完全消化，然后用T4 DNA连接酶(Boehringer-Mannheim)将其插入BamHI消化的EMBL3噬菌体臂(Promega)，用GigapackII抽提物(Stratagene)进行体外包装。噬菌体生长在大肠杆菌菌株C600上。通过与32P标记的人C0t-1DNA(GIBCO-BRL)的杂交鉴别出含有人DNA的重组噬菌体。用含有YAC左臂或右臂序列的PCR片段进行筛选，鉴别出含有连于YAC载体的人序列的噬菌体(末端克隆)。杂交和洗涤在标准条件(Middleton et al.，1991)下进行。挑取阳性噬菌斑，通过平板纯化3次。用Qiaex柱(Qiagen)制备噬菌体DNA。

G.粘性质粒文库构建用Sau3A部分消化含有YAC DNA的酵母基因组DNA，然后在线性(10-40％)蔗糖梯度上按大小分开各组份，如Maniatis et al.，1982所述。按制造商的说明制备SuperCos1粘性质粒载体(Stratagene)，然后和插入子DNA按质量比4∶1(插入子∶载体)进行混合，用连接酶处理，并如上所述在体外进行包装。将粘性质粒引入DH5α宿主细胞，然后按每个15厘米培养皿培养2000个克隆的密度进行平板培养。如上所述和如Maniatis et al.，1982所述进行菌落杂交。

H.P1克隆通过用本文所述方法制备的STS进行筛选，从GenomeSystems，Inc.(St.Louis，Missouri)获得横跨MTS区域的P1克隆。用碱裂解法，然后用氯化铯梯度离心技术(Maniatis et al.，1982)从这些克隆中分离出DNA(Birnboim and Doly，1979)，I.STS的产生用与P1载体(pSacBII)、SuperCos1载体或EMBL3载体的克隆位点两侧序列互补的寡核苷酸，对1.0mg P1、粘性质粒或模板DNA测序，得到STS。测序在ABI 373A DNA测序仪上用PRISM快速反应染料脱氧终止剂循环测序试剂盒(PRISM Ready ReactionDyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(ABI))进行。STS被设计成长度尽可能接近20碱基对，而且Tm尽可能接近60℃。

J.黑素瘤倾向性亲缘族中MTS1的种系突变用标准方法从血液中制备携带者个体的基因组DNA。引物被设计在内含子位置中以便从MTS1中扩增编码外显子1或2，或者从MTS2中扩增出编码外显子2(对于各样品使用20ng DNA)。除了加入二甲基亚砜(DMSO)至终浓度为5％外，PCR反应使用标准缓冲液。循环测序反应使用α-P32-dATP，对用位于序列中不同位置的引物扩增而得的产物进行。测序产物在6％变性聚丙烯酰胺凝胶上分析，将所有的(A)反应一起上样，然后是C)反应等等。所有的多态性都可以通过相对链的序列分析而确定。实施例2用遗传连锁标记确定MTS的位置为了分析肿瘤细胞系在9p21区域的纯合缺失，采用一套已知与MTS连锁的标记。这些标记最初用于在10个犹他州的亲缘族和1个德克萨斯州亲缘族(Cannon-Albright et al.，1992)中显示与黑素瘤倾向的显著连锁(LOD值＝12.7)。这些标记包括来自α-干扰素基因簇(IFNA)(Kwiatkowski & Diaz，1992)(它是已测试的最远端标记)的序列、近端标记(D9S104)和另外4个位于其中的标记(D9S171、D9S126、D9S161和D9S169)(Cannon-Albright et al.，1992)。根据遗传研究，这些介于其间的标记的线性顺序是：D9S171、D9S126、D9S161、D9S169。IFNA标记由能够从野生型基因组DNA中扩增出两个片段的寡核苷酸引物对构成，这两个片段是：一个是含有多聚CA区段的、约138-150碱基对的多态性片段(IFNA-1)，另一个是约120碱基对的不变片段(IFNA-s)。IFNA-s相对于IFNA-1的位置不明。

先前报道的含有缺失的5个非黑素瘤肿瘤细胞系用遗传标记进行分析。结果揭示，每个细胞系中至少有一种所测试的标记存在纯合缺失(表1)。使用D9S161、D9S169或D9S104时没有鉴别出纯合缺失。这些缺失中重叠的最小区域被IFNA-1和D9S171所界定。这暗示，这两个标记基因之间的区域含有涉及肿瘤抑制的基因，可能是MTS。因此接着详细研究IFNA-1和D9S171之间的基因组区域，尤其是IFNA-s附近的区域。

表1用与MTS连锁的遗传标记检测肿瘤细胞系中的纯合缺失标记肿瘤    IFNA-1 IFNA-2 D9S171 D9S126 D9S161 D9S169 D9S104细胞系U-138      -     -      -      -      +      +      +U-118      -     -      -      -      +      +      +U-87       -     -      +      +      +      +      +A-172      +     -      +      +      +      +      +H4         -     -      -      -      +      +      +注：所有的细胞系得自ATCC，是神经胶质瘤或神经母细胞瘤。实施例3MTS区域的基因组克隆为了获得IFNA-s周围区域的基因组克隆，对CEPH YAC文库进行筛选(Cohen et al.，1993)。鉴别出11个含有D9S171标记的YAC和5个含有IFNA-s的YAC。没有分离出同时含有D9S171和IFNA-s的YAC(图2)。将3个YAC克隆(C9、C6、F9)亚克隆入噬菌体，将另一个YAC(C6)亚克隆入粘性质粒载体。这些步骤以及其他粘性质粒克隆提供了一种方便的途径来产生位于已知遗传标记内部的STS，并且加快了下述的染色体步移。

为了提供用于构建该区域连续的基因组图所需的基因组DNA的独立来源，以及为了协助产生STS，可以在P1克隆中从IFNA-s开始向D9S171延伸、从D9S171反方向地向IFNA-s延伸、以及从YAC C6端向两个方向延伸而开始染色体步移。作为这种染色体步移的部分，一共分离出27个P1克隆(图2)。这些按次序排列的PI形成了连续的、从IFNA-s延伸至D9S171、并且具有两个缺口的组合体(assembly)。P1克隆以及几个噬菌体和粘性质粒克隆用于产生MTS区域的精细结构图。实施例4MTS区域的精细结构分析为了构建更详细的MTS区域分子图，还需要额外的标记。用来自基因组克隆的DNA序列设计用于STS的PCR引物。这些STS用于协助对P1和YAC克隆进行次序排列。来自IFNA-s和D9S171之间区域的总计54个STS是建立详细的MTS区域物理图的主要基础(图2)。这些STS引物序列被输入Genome Database。

从IFNA-s向D9S171延伸的一套新标记被用于测试84个黑素瘤细胞系，以确定在MTS区域是否有纯合缺失。总计52个细胞系有纯合缺失区域(图3)。几个缺失是大范围的，例如13细胞系缺失的区域包括816.7和760-L。

为了对MTS进行定位，最能提供信息的肿瘤细胞系分成两组(图3)：i)含有单独的c5.1缺失的细胞系(11类)和ii)含有单独的c5.3缺失的细胞系(12类)。总计有5个黑素瘤细胞系属于这两组。在所有检测到缺失的情况中，缺失似乎是简单的缺失即没有迹象表明在IFNA-s和D9S171之间的区域发生多重缺失事件。这些携带缺失的细胞系合起来描述了一个以标记c5.1和c5.3为中心的缺失重叠区域，从而不必对从IFNA-s向D9S171的区域制作完整的物理图。实施例5鉴别粘性质粒c5和P1含有MTS的菌落P1062和P1063A.遗传标记的布局对YAC克隆的分析和对肿瘤细胞系中缺失的分析而得的结果与遗传标记的布局相一致：IFNA、D9S171、D9S126。3个YAC含有D9S171和D9S126，而4个YAC含有IFNA-1和IFNA-s(图2)。没有一个YAC同时含有D9S171和IFNA。这暗示：i)IFNA-1和IFNA-s紧密连锁和ii)D9S126和D9S171连锁。这些结果可以用细胞系的缺失来证实。大多数缺失D9S171的细胞系也缺失D9S126。相反地，细胞系U-87，尽管对D9S171和D9S126呈阳性，但是缺失IFNA-s和IFNA-1(表1)。一个黑素瘤细胞系即SK-MEL-5缺失IFNA-s、D9S171和D9S126，但是没有缺失IFNA-1。因此，IFNA-1必然位于IFNA-s的远端。另一黑素瘤细胞系SK-Mel-Zan缺失IFNA-1、IFNA-s和D9S171，但是不缺失D9S126，因此D9S171位于IFNA-s和D9S126之间。总之，这些发现支持在表1中给出的标记的次序排列。

人α-干扰素基因家族由位于染色体9p上的超过23个基因和假基因构成。这个基因簇已经被克隆并被分成10个连锁组(Henco etal.，1985)。通过对神经胶质瘤细胞系中α-干扰素不同的序列的缺失丢失分析，对这些连锁组进行了部分排序(Olopade et al.，1992)。神经胶质瘤细胞系H14缺失IFNA-1和IFNA-s。它还缺失连锁组IV(例如α13、α6和α20)的序列。神经胶质瘤细胞系A172含有IFNA-1和连锁组IV，但是缺失连锁组I(例如α1和α19)、III(例如α8)和IX(例如α2)以及IFNA-s。该分析结果将IFNA-1置于连锁组I、III和IX以及IFNA-s的远端。A172缺失的远端边界被定在IFNA-s远端的一个P1长度之内。因此，连锁组I、III和IX必然靠近位于离IFNA-s远端小于85kb的某一点处。

B.遗传标记之间的物理距离上述结果还不能对IFNA-s和D9S171之间的距离作出准确的估计，因为不可能分离出含有这两个标记基因的YAC。另外，根据用STS制作的图谱，从IFNA-s向远端延伸的5个YAC中没有一个YAC与从D9S171向近端延伸的11个YAC发生重叠。因CEPHYAC插入子的平均长度在500kb之内，所以IFNA-s和D9S171之间的距离至少应有那么大。

IFNA-s和c5.1之间的区域被P1克隆中的9个步移步段所覆盖。假定每个步段平均为P1插入子的一半长度，那么c5.1和IFNA-s之间的距离约为400kb。因此，在黑素瘤细胞系中经常缺失的、与c5.1紧密连锁的肿瘤抑制基因必然位于IFNA-s近端约400kb内。

C.肿瘤细胞系的缺失在57％测试的黑素瘤肿瘤中发现了9p21区域的纯合缺失。14个肿瘤细胞系含有在近端一侧延伸通过760-L的缺失，16个细胞系含有延伸超过位于远端一侧816.7的缺失。假定缺失是起因，即在该区域基因的缺失造成肿瘤的表型，那么肿瘤抑制基因必然位于760-L和816.7之间。最小的缺失涉及标记c5.1和c5.3。在所有测试的标记中，很多细胞系(51个)中有c5.3的缺失。因此，肿瘤抑制基因最可能的位置非常靠近C5.3，因为C5.3是缺失最频繁的标记。4个细胞系含有单独的C5.3缺失(12类)，一个细胞系单独缺失C5.1(11类)。这两个标记都存在于同一粘性质粒c5上。因此，有可能肿瘤抑制基因包括来自粘性质粒c5的序列。P1克隆P1062和P1063含有在c5中发现并且围绕粘性质粒的序列。因此，如下进一步所述，P1062和P1063含有完整的MTS区域。

上述实施例中的结果与以前对MTS的遗传研究相一致，以前的研究表明，在IFNA-1和D9S126之间的区域是MTS最可能存在的位置(Cannon-Albright et al.，1992)。最近的遗传研究已经利用位于P1-452上IFNA-2和C5.3之间的多态性(CA)重复来限定MTS的位置(图2)。使用该标记进行重组染色体分析，结果将MTS置于P1-453近端。因此，MTS被定位于在黑素瘤细胞系簇中纯合缺失的区域。

这些结果支持这样的观点：在靠近C5.3的某处存在肿瘤抑制因子基因座MTS。所有含有缺失的细胞系都具有共同的缺失DNA区域，除了那些缺失被限定于C5.1或C5.3的细胞系(11和12类)。除了那些位于粘性质粒c5中的非重叠缺失外，没有证据表明在这组细胞系中存在非重叠的缺失。因此，没有理由提出更复杂的机制，例如涉及远离C5.1和C5.3的另一个位于9p21的肿瘤抑制因子基因座的机制。

在多肿瘤类型中存在9p21的纯合缺失这一观察结果暗示，位于那里的肿瘤抑制基因可能在多种不同的组织中表达。因此，在参与多种类型肿瘤的发展进程这一点上，肿瘤抑制基因可能与p53基因是类似的(参见下面进一步的数据)。在具有黑素瘤倾向的家族中已报道过其他类型的癌肿(Nancarrow et al.，1993；Bergman et al.，1990)。用C5.1和C5.3对各种不同的癌肿类型进行彻底的缺失分析(见下文)，阐明了该肿瘤抑制基因在除黑素瘤之外的肿瘤中的重要性。

某些观察到的纯合缺失去除了许多遗传标记。Fountain等人报道，在两个不同的黑素瘤细胞系中染色体9p21的纯合缺失延伸了2-3Mb(Bergman et al.，1990)。在该研究中，至少一个细胞系SK-MEL-5，含有从测试的最远端标记IFNA-1处开始并且通过D9S126的缺失，该区域明显太大以致于不能存在于单个YAC上。大缺失占优势暗示，在MTS周围区域缺乏对细胞存活所必需的基因。实施例6MTS候选基因的分离在上面的实施例中，描述了在MTS附近YAC和P1染色体步移分析的结果。用得自c5序列的STS进行精细结构图谱试验表明，在5个不同的黑素瘤细胞系中存在小的、非重叠的c5序列的缺失。该结果表明，可能肿瘤抑制基因(可能是MTS)至少部分位于c5中。

进一步的表明c5含有至少一个基因的证据来自对c5和附近粘性质粒中(CpG)二核苷酸频率的分析。在哺乳动物中，几乎所有的日常基因和近半数的所有组织特异性基因与(CpG)二核苷酸异常丰富的区域相关(Bird，1989；Larsen et al.，1992)。因此，存在这种“CpG岛”便表明存在基因。用识别含有两个(CpG)配对序列的限制性核酸内切酶EagI、BssHI和SacII消化粘性质粒c5、c12、c57和c59。只有粘性质粒c5和c12含有这些酶的识别位点。粘性质粒c5含有一个EagI位点、至少10个BssHI位点和至少12个SacII位点。在c5和重叠粘性质粒c12中存在CpG岛暗示，事实上c5含有至少一个MTS候选基因。

为了寻找MTS，确定来自粘性质粒c5的EcoRI片段的DNA序列。当将这些序列与GenBank的序列进行比较时，鉴别出两个与众不同的c5区域，它们与以前鉴定的、编码人依赖细胞周期蛋白的激酶4(cyclin-dependent kinase4，Cdk4)抑制剂或p16基因的区域相似(Serrano et al.，1993)。这两个基因是MTS的候选基因，称为MTS1和MTS2。MTS1位于粘性质粒c5最靠近染色体9p端粒的一端附近，而MTS2位于c5着丝点端附近。见图4B。图4A中给出的粘性质粒图显示了MTS1和MTS2以及P1克隆P1062、P1063和P1069的位置。

来自c5的MTS1基因组序列和p16 mRNA序列的仔细比较揭示，MTS1含有一段307bp的、与部分p16编码序列相同的序列。该MTS1核苷酸区段的两侧为可识别的拼接序列。对MTS1的进一步研究表明，它包括完整的p16编码序列和两个内含子(图5A和5B以及图6A和6B)。内含子1位于翻译起始位置下游126bp处；内含子2位于翻译终止位置上游11bp处。这两个内含子将MTS1编码序列分成3个区域：126bp的5′区域(编码外显子1)、307bp的中间区域(编码外显子2)和11bp的3′区域(编码外显子3)。SEQ IDNO：3为MTS1的5′区域、外显子1和部分内含子1的核苷酸序列。SEQ ID NO：4为MTS1的部分内含子1、外显子2和部分内含子2的核苷酸序列。

MTS2含有几乎与p16相同的DNA序列区域，它从编码外显子2的5′端向内含子2延伸约211bp(图7A)。然而，序列相似性在MTS1内含子上游51bp处下降，该处对应于MTS2的最后密码子所在的位置(图8)。MTS1和MTS2的序列比较(图8)表明，两个基因间的序列相似性从含子1的3′拼接点向上游延伸约40个核苷酸。因此，非编码DNA部分比某些假定的编码DNA区域更保守。为了排除编码DNA中的序列趋异是由于克隆假象所造成的这一可能性，设计能够特异性地扩增出跨越MTS2序列趋异点的PCR引物。这些引物从粘性质粒、P1和基因组DNA中扩增出预定大小的片段。因此，靠近MTS2外显子2的3′端的趋异序列确实是基因组序列。SEQ ID NO：5列出了MTS2的部分内含子1、“外显子2”和“内含子2”的核苷酸序列。SEQ ID NO：15列出了MTS2的cDNA序列。

在粘性质粒c5中存在两个紧密相关的基因暗示，在该区域可能存在其他相关基因。为了证实这种可能性，用粘性质粒c5、c12、c59和P1的1063和1060以及人基因组DNA的限制性内切酶消化产物进行Southern印迹。用含有大部分MTS1外显子2(包括与MTS2共有的区域)的片段探测这些印迹。在克隆DNA和基因组DNA中用探针检测到两个EcoRI片段。这个结果与在基因组存在两个p16类基因，即MTS1和MTS2相一致。还与目前已知存在MTS1E1β相一致，MTS1E1β是MTS1的另一种形式，它含有MTS1的外显子2和3但是不含外显子1。实施例7MTS1E1β的分离和结构MTS1E1β的分离用完整的MTS1 cDNA作为探针并且使用常规的cDNA文库筛选技术，通过杂交选择而分离出含有MTS1E1β的克隆。常规的cDNA文库筛选是用得自MTS1外显子2的探针进行的。对来自胎儿脑、正常乳房和淋巴细胞的各个文库，筛选一百万个克隆。从淋巴细胞文库中分离出杂交的cDNA克隆。克隆经测序表明含有含有E1β。它还含有MTS1的外显子2(E2)和外显子3(E3)。通过将得自卵巢组织的cDNA和粘性质粒c5一起培育，分离出用杂交选择法而得的cDNA克隆。该粘性质粒用生物素标记并且制成单链形式。让c5和cDNA之间形成杂合体，然后用包被有链球菌抗生物素蛋白的磁性颗粒捕获生物素标记的粘性质粒。选择的cDNA被从粘性质粒上洗脱下来，用PCR扩增，克隆化以及被测序。该cDNA克隆与用文库筛选法分离而得的克隆相似，因为它们含有E1β、E2和E3。其中没有一个克隆含有以前所述的外显子1(见SEQ ID NO：3)。MTS1E1β cDNA的序列列于SEQ ID NO：13。

MTS1E1β的结构MTS1和MTS1E1β是一个基因的两种形式：这两种形式都使用外显子2和3，但是具有不同的第一外显子。MTS1含有α形式(E1α)，它编码由MTS1编码的p16蛋白质的前43个氨基酸。MTS1E1β含有外显子1的β形式(E1β)。通过将复合cDNA克隆序列比作克隆所来自的基因组区域，确定p16基因的外显子结构(图13)。对含有p16的基因组区域进行基因组Southern印迹、序列分析以及长PCR，以确定p16外显子的位置(图13)。p16基因约跨30kb的基因组DNA。E1β是外显子最靠5′端的部分，次序为E1β、E1α、E2和E3。

E1β在p16阅读框中的翻译(从p16的编码外显子2和3所用的阅读框而推知)揭示，有一个阅读框内的终止密码子位于E1β和E2之间的拼接位置上游仅10个密码子处。该终止密码子的位置被基因组和cDNA序列分析所证实。位于该终止密码子下游的第一个潜在的起始密码子是在p16的阅读框内，紧靠E1/E2拼接位点的3′端。该潜在起始密码子的两侧序列与共有Kozak序列(Kozak，1987)并不十分相似。如果在p16阅读框内翻译，那么p16基因的E1β转录物将编码105个氨基酸的蛋白质。

对βcDNA的其他分析揭示，它具有处于与编码p16框架不同的框架中的大开放阅读框(ORF)。该ORF(称为ORF2)延伸通过E1β并且伸入E2的67个氨基酸处。全长的ORF可编码180个氨基酸的蛋白质。然而，该阅读框在E1β5′端是开放式的，因此可能是不完全的。统计分析暗示，这种大小的ORF不可能由随机序列构成的DNA偶然产生(P＝0.003)。然而，若给出β转录物的碱基组成，则可能性将较大(P＝0.16)。预测的多肽与任何以前描述的蛋白质都不相似。

鉴别出E1β的进化保守性部分，可以提供有关哪些序列对它的功能至关重要的线索。用改良的cDNA末端快速扩增法(RACE)技术，称为杂合体捕获RACE(Hybrid Capture RACE，HCR)(见实施例12)，分离出小鼠p16cDNA，并且与人p16cDNA进行比较。一种类型的小鼠p16cDNA(β型)具有与人E1β等价的外显子和E2等价物。第二种类型(α型)含有连于E2的E1α等价物。E1α和E2鼠外显子与人的对应物具有70％的相同性。鼠和人的E1β外显子核苷酸序列具有51％的相同性(图14)，而且鼠E1β外显子还含有处于编码p16阅读框架中的终止密码子。从终止密码子5′处的核苷酸序列推导出的人和鼠的多肽是完全趋异的。因此，在p16阅读框中的终止密码子不可能是测序假象。

考虑到E1β作用的不确定性，我们分析了在所有三种阅读框中鼠和人β转录物的相似性。在与编码p16的阅读框(ORF1)不同的阅读框中，人和鼠的β转录物都含有大ORF(ORF2)。推导出的、由ORF2编码的多肽具有40％的相同性。但是，如果将ORF2肽的比较限定于E1β所编码的部分的话，它们仅有28％的相同性。相反，鼠和人的p16序列有67％的相同性。另外，根据E2中的ORF2所推导出的多肽与根据E2中的第三阅读框(ORF3)所推导出的多肽相似(42％)。这些结果暗示，ORF2不是选择性地维持的，因而可能不编码蛋白质。还比较了人和鼠βRNA的次级结构，没有发现惊人的相似性。总之，这些结果暗示，β转录物是p16功能所需要的，因为它在鼠和人中都存在；而且如果它被翻译，那么编码的蛋白质可能在外显子2中的第一个甲硫氨酸处起始。实施例8MTS1中的种系突变为了测定MTS1或MTS2是否与遗传易感性基因座MTS相对应，对来自8个假定携带MTS倾向性等位基因的个体的基因组DNA(Cannon-Albright et al.，1992)进行分析。用衍生自MTS1或MTS2特异性内含子序列的寡核苷酸引物(表2)对每种样品进行扩增，扩增出外显子DNA序列。

表2筛选MTS1中外显子的引物引物       SEQ ID NO：    外显子   基因1F            6             1      MTS11108R         7             1      MTS142F           8             2      MTS1551R          9             2      MTS121F           10            2      MTS250R           11            2      MTS289F           12            2      MTS2用引物1F和1108R扩增MTS的外显子1，然后用引物1108R测序。用引物42F和551R扩增MTS的外显子2，然后用引物42F和551R测序。用21F和50R扩增MTS2的外显子2，用引物89F和50R再进行扩增，然后用引物89F和50R进行测序。

这些基因组片段的DNA序列揭示出在8个个体中的2个中存在多态性。多态性不存在于其他的任何样品中，这暗示，它们在人群中不是共同的。为了表明多态性是与MTS染色体而不是与其他的同源染色体连锁，对来自各亲缘族中携带倾向性等位基因的其他个体的基因组DNA进行分析。在每种情况下，多态性都与MTS倾向性等位基因一起分离。在亲缘族3012的个体(12821)中发现了密码子93的突变(gly→trp)。这也在患病的携带者同胞(13183)和未患病的携带者表亲(14917)中发现，但是在未患病的非携带者同胞(13184)中没有发现。在亲缘族1771的个体(15635)中发现密码子118的突变(val→asp)。这也在患病的携带者一级表亲(嫡堂(表)兄妹)(10205)、患病的携带者一级表亲(嫡堂(表)兄妹)(11414)和10205的患病携带者一级表亲(10146)中发现，但是在10205的未患病的非携带者的舅舅(或叔叔)(10120)中没有发现。

多态性是单一的核苷酸置换，它造成氨基酸的变化(表3)。置换涉及用大的、憎水性的残基取代小的、亲水性的残基，或者用带电的氨基酸取代中性氨基酸。

表3倾向性种系MTS突变突变    编码效果    位置*G→T    gly→trp    277T→A    val→asp    353*：突变在SEQ ID NO：1 DNA序列中的位置。

在分析的8个样品中没有发现MTS2外显子2的多态性。这暗示，至少在这些亲缘族中，MTS2不会导致易患黑素瘤。由于MTS2类似于MTS1，因此MTS2可能与其他类型的癌肿有关。也有可能MTS2是无功能的基因。

在易患黑素瘤的个体中，在MTS1中而没有在MTS2中发现种系突变与黑素瘤纯合缺失分析的结果相符合。实施例9肿瘤细胞系中MTS是否存在的分析因为多肿瘤类型中高频率的9p21缺失，所以对来自12种不同类型的细胞系是否存在MTS1进行分析。使用一套在基因中按一定间隔分布的序列标志位点(STS)来测试肿瘤细胞系的基因组DNA是否存在预期的片段(图4A、4B和9)。该研究结果暗示，在高百分比的肿瘤细胞系中存在MTS1的缺失(表4)。纯合缺失存在于所有测试的肿瘤类型中，除了结肠和神经母细胞瘤细胞系。缺失的百分比从低至肺癌和白血病中的25％到高至星形细胞瘤中的94％。总之，在290个测试的细胞系中的135个细胞系中检测到纯合缺失。从该数目可以得到携带缺失的肿瘤细胞系百分比的最低估计值，因为用于该分析的STS并没有覆盖整个基因。因此某些小缺失可能没有被检测出。另外，例如少数核苷酸的插入或缺失等损伤以及核苷酸置换，这种方法也会漏检。

表4不同肿瘤类型中的纯合缺失肿瘤类型    细胞系数目    缺失数目    缺失％黑素瘤        99            57          58白血病        4             1           25肺癌          59            15          25成胶质细胞瘤  10            0           0膀胱癌        15            5           33肾癌          9             5           56星形细胞瘤    17            16          94结肠癌        20            0           0乳房癌        10            6           60卵巢癌        7             2           29神经胶质瘤    35            25          71骨肉瘤        5             3           60总计          290           135         47％为了提高对含有MTS1突变的细胞系总数的估计，对34个没有表现出明显的MTS1序列纯合缺失的细胞系是否存在MTS1损伤进行更仔细的检测。含有近97％MTS1编码序列的序列被扩增并分析多态性。在34个黑素瘤中的14个中观察到MTS1外显子1或外显子2的18种体细胞突变(表5)。这些突变中的3种是移码突变，7种是无义突变，4种是错义突变和4种是沉默突变。含有沉默突变的4个细胞系中的3个还含有其他的突变形式，而且18种突变中的16种位于编码外显子2处。除一个细胞系之外，所有细胞系都专门含有半合或纯合多态性，暗示其他的同源染色体也会有缺失。单一的杂合细胞系含有两个不同的非沉默突变，该发现表明每条染色体都经历了独立的突变事件。根据对MTS1 DNA序列和缺失分析，至少75％的黑素瘤细胞系含有突变型MTS1或者在两条同源染色体上缺失该基因。

表5肿瘤中的体细胞MTS突变细胞系      突变       编码效果      位置*SK-M-ste    G→A         无          240G→A       gly→ser      241SK-M-swi    C→T       arg→终止     148SK-M-ris    G→A       ala→thr      418SK-M-beh   缺失5个碱基移码           266-270SK-M-178    C→T       arg→终止     214SK-M-sta    G→A       trp→终止     306SK-M-uti    C→T       arg→终止     214SK-M-EML131缺失8个碱基  移码         148-155C→A         无          147SK-M-koz    C→T       pro→leu      317(het.**)   C→T         无          213C→T       arg→终止     214SK-M-kra    C→T       pro→leu      317SK-M-kuu    C→T         无          354SK-M-mar    G→A       trp→终止     305SK-M-whi    C→T       gln→终止     124SK-M-adl 缺失2个碱基    移码       104-105(het.)*在SEQ ID NO：1DNA序列中突变的位置**Het.表示“杂合子”，指在样品中存在野生型和突变型序列。MTS1中的损伤优势(缺失和核苷酸置换)表示是MTS1或某个紧密连锁的基因座造成肿瘤表型。受到损伤的细胞比没有受到损伤的细胞具有选择优势。另一种解释认为这些损伤是与细胞生长无关的随机事件，该解释是不可能的。原因在于，首先，肿瘤表型和MTS1突变之间的高相关性暗示在MTS1突变和肿瘤形成之间存在因果关系。其次，MTS1影响黑素瘤的易感性，因此它具有独立地作为肿瘤抑制基因的意义。再者，作为Cdk的强抑制p16剂的生物化学功能与p16在体内作为DNA复制起始的通用抑制剂而发挥作用的模式很好地相符。

有可能MTS1的突变或缺失是在培养时细胞生长的结果。然而，高比例的原代白血病细胞也含有α-干扰素基因簇的纯合缺失，该基因簇与MTS1相距不足500kb(Diaz et al.，1990)。以前的缺失研究表明，α-干扰素基因的缺失总是涉及那些向着丝点延伸超过MTS1的标记(Weaver-Feldhaus et al.，1994)。由于MTS1区域的纯合缺失存在于原代肿瘤细胞和培养细胞系中，因此在肿瘤细胞系中观察到的缺失不可能纯粹是在培养时细胞生长造成的。然而，在肿瘤的发展中MTS1突变何时出现这一问题将由对原始肿瘤样品的分析而给出最佳的回答。MTS1在体内的作用在所有的真核细胞中，细胞分裂需要经过两个至关重要的决定点：从G1向S的转变，此时开始DNA合成，以及从G2向M的转变，此时开始有丝分裂。在哺乳动物中，控制细胞分裂的机制涉及多种组份，其中许多是相关的(参见Sherr，1993)。Cdk可能是控制成分中的核心，因为它们通过使大量关键底物磷酸化而进行调控，这些底物接着引发从G1向S以及从G2向M的转变。从G1向S的转变可能是更为重要的决定点，因为它最先在细胞周期中出现。迄今为止，已经鉴别出4种参与控制从G1至S的Cdk(Cdk2-5)和这些Cdk的一套正调控因子(细胞周期蛋白C、D1-3、E)。最近还鉴别出几个负调控因子，包括p16、p15、p18、p20、p21和p27(Xiong et al.，1993；Serrano et al.，1993；Gu et al.，1993；El-Diery et al.，1993；Harper et al.，1993；Hannon and Beach，1994；Polyak etal.，1994b；Toyoshima and Hunter，1994；Guan et al.，1995)。这些负调控因子似乎是通过抑制Cdk的激酶活性而起作用的。某些细胞周期调控因子涉及人癌肿(可参考Hunter and Pines，1994)。p20抑制Cdk2以及可能其他的Cdk，而p16(也称为MTS1、CdkN2或INK4a)抑制Cdk4但是在体外试验中明显地不抑制Cdk2(Serranoet al.，1993)。基于体外研究和其与p53的相互作用，p21被认为是所有Cdk的通用抑制剂(Xiong et al.，1993)。因此在体外，p16比p21更具特异性。这些抑制剂中的每一种都阻止细胞进入S期。同样，在某些乳房癌中细胞周期蛋白D1或Cdk4过度表达，而在大量细胞系和原代肿瘤中p16基因是突变或缺失的(Buckley et al.，1993；Caldas et al.，1994；Kamb et al.，1994b；Mori et al.，1994；Tam et al.，1994a)。这些结果暗示，某些细胞周期蛋白和Cdk是原癌基因而p16(MTS1)是肿瘤抑制因子基因。p15、p18，p21和p27的生物化学行为表明，它们也是肿瘤抑制因子，但是还没有详细的、有关它们基因在肿瘤或细胞系中突变分析的报道。本文提供的结果给出了MTS1在体内作为细胞分裂抑制剂的证据。

位于人9号染色体9p21段的p16基因(MTS1)尤其令人感兴趣，因为它在高比例的某些类型的癌肿和衍生自肿瘤的细胞系中突变或纯合缺失(Caldas et al.，1994；Kamb et al.，1994b；Mori etal.，1994；Nobori et al.，1994)。另外，在几个已知携带9p21连锁黑素瘤易感性的亲缘族中，MTS1突变与患黑素瘤的倾向性一起分离(Hussussian et al.，1994；Kamb et al.，1994a)。然而，对于MTS1在遗传性和偶发性癌肿中的作用，还有一些未解决的问题。几个对9p21标记具有高LOD值的、易患黑素瘤的亲缘族在MTS1编码序列中没有发现突变。而且，肿瘤或细胞系中MTS1纯合缺失优势对于肿瘤抑制基因失活而言也是不典型的，因而暗示在MTS1附近存在其他参与癌肿形成的基因。

最近的报道暗示，某些促有丝分裂和抗有丝分裂的信号影响细胞周期的进程，这种影响至少部分地是通过调控Cdk抑制剂的活性而进行的(Firpo et al.，1994；Hannon and Beach，1994；Kato etal.，1994；Polyak et al.，1994a；Slingerland et al.，1994)。例如，TGFβ诱导的细胞周期的抑制可以通过激活p15和p27而介导。相反地，在IL-2诱导的静止T淋巴细胞的促有丝分裂过程中，p27被负调控。相对较少知道的是MTS1的调控。最近许多的报道提供的证据表明，MTS1的水平部分地由Rb蛋白质调控(Serrano et al.，1993；Li et al.，1994a；Tam et al.，1994b；Parry et al.，1995)。这些以及其他发现(Serrano et al.，1995)导致建立了一个MTS1作用的模型，其中MTS1抑制Cdk4/6，从而防止Rb的磷酸化。Rb随后参与反馈环，限制MTS1的水平。

这些结果为MTS1在细胞周期的调控中起着杰出作用提供了遗传证据。此外，这些结果暗示，体内MTS1的靶目标是肿瘤形成的主要因素。如果MTS1在体内抑制Cdk4而不是Cdk2，那么Cdk4是癌基因的强有力候选基因。在MTS1中普遍存在突变暗示，Cdk4在大多数(如果不是全部的话)细胞中是细胞分裂的通用激活剂。关于MTS1对不同Cdk影响的进一步生物化学研究有助于弄清在正常细胞和转化细胞中Cdk活性的等级关系。与p16相似，如果p21是Cdk的通用抑制剂，那么其基因也会在高比例的肿瘤中缺失或突变。

如果MTS1是大多数正常细胞中处于活性状态的通用肿瘤抑制因子，那么预计MTS1的种系突变会导致易患除黑素瘤之外的癌肿。例如p53基因的种系突变，就象在Li-Fraumeni综合征中发现的突变一样，会增加患多种癌肿的可能性，其中包括儿童期肉瘤、乳房癌(Malkin et al.，1990)。以前的研究发现，在某些易患黑素瘤的家族中，胰腺癌的发病率异乎寻常地高(Bergman et al.，1990；Nancarrow et al.，1993)。该观察结果与在胰腺肿瘤细胞系中发现存在MTS1的纯合缺失相一致。有可能MTS1倾向性遗传与MTS1体细胞遗传是不同的。例如，由于选择的劣势，MTS1周围区域缺失数千碱基对DNA的大缺失可能不存在于人基因库中。然而，这种缺失在转化的体细胞中可能是有利的，这可能是因为它们去除了多个基因。这种可能性与存在另一个与MTS1极其相似的基因即MTS2相一致。MTS2位于MTS1外显子1的上游约12kb处，MTS2第一个外显子位于MTS2第二个外显子的上游约2.5kb处。MTS2按与MTS1类似的方式发挥其功能。与仅使两个基因中任一个失活的突变相比，将MTS1和MTS2都去除的缺失可以给细胞提供更大的生长优势。或者，这两个基因是在不同的或部分相同的细胞种类中发挥作用。这些可能性需要进一步的研究。实施例10MTS1E1β的突变分析由于在衍生自肿瘤的细胞系中失活p16纯合缺失占优势，以及9p21连锁的、易患黑素瘤的亲缘族没有p16的突变，所以导致其他人士提出在p16附近存在其他的同样涉及癌肿形成的基因(Cairnset al.，1994；Spruck et al.，1994)。如果E1β编码调控细胞生长中所涉及的蛋白质，那么这些序列就可能含有存在于偶发性和/或家族性癌肿中的、在较早期研究中所错过的突变。因此，在从各种不同的肿瘤所衍生而得的细胞系中以及在某些易患黑素瘤的亲缘族中筛选E1β的突变。

已有关于易患黑素瘤家系的遗传特性的报道(Cannon-Albrightet al.，1992)。从易患黑素瘤的亲缘族(Kamb et al.，1994a)以及从细胞系(Liu et al.，1995)中分离基因组DNA的过程已有描述。用正向引物(5′-AGTCTGCAGTTAAGG-3′SEQ ID NO：33)和反向引物(5′-GGCTAGAGGCGAATTATCTGT-3′SEQ ID NO：34)对E1β进行PCR扩增，在下列条件下进行30个循环：97℃3秒、65℃10秒、75℃20秒。将扩增反应产物稀释100倍，然后在同样的反应条件下，使用同样的正向引物和不同的反向引物(5′-CACCAAACAAAACAAGTGCCG-3′SEQ ID NO：35)再次扩增。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，然后用Qiagen珠(Qiagen，Inc)进行抽提。获得的产物用Cyclist测序试剂盒(Stratagene)及上述的正向引物(SEQ ID NO：33)测序。

在一组来自4种肿瘤(表6)、共计24个细胞系中，以及在患病家族成员之间共同携带明显的单倍型、但以前研究(Kamb et al.，1994a)没有发现p16突变的6个黑素瘤亲缘族(Cannon-Albright etal.，1992)中，没有检测到E1β的序列突变体。这些试验暗示，在肿瘤的进程中，E1β突变不是常见的事件，而且它们与这些亲缘族中9p21连锁的黑素瘤易感性无关。

表6筛选E1β突变的细胞系类型        数目肺(癌)        3膀胱(癌)      7神经胶质瘤    9黑素瘤        5总计1         24注：1以前并没有表明这些细胞系在p16区域含有纯合缺失或携带p16编码序列的突变(Liu et al.，1995)。根据以前的结果(Liuet al.，1995)，在膀胱和黑素瘤组中，应有类似数目和类型的细胞系在p16编码序列有4个点突变。实施例11对MTS2进行突变筛选细胞系中的MTS2突变在衍生自肿瘤的细胞系中，去除MTS1的纯合缺失优势暗示，在MTS1附近存在另外的、涉及癌肿形成的基因。如果MTS2基因涉及偶发性癌肿，那么在肿瘤细胞系中可能含有突变。因此，在一组肿瘤细胞系中筛选MTS2编码序列的突变。

按Kamb等人(1994a)所述的方法，通过PCR扩增MTS2的外显子1和2。使用引物对2E1.F1(5′-AGGGAAGAGTGTCGTTAAG-3′SEQ ID NO：19)和2E1.R2(5′-AGACTCCTGTACAAATCTAC-3′SEQ ID NO：20)来获得外显子1。使用引物对89F(SEQ IDNO：12)和50R(SEQ ID NO：11)来获得外显子2。扩增后，DNA产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，然后用Qiagen珠(Qiagen，Inc)进行抽提。获得的产物用Cyclist测序试剂盒(Stratagene)及引物2E1.F1对外显子1测序，用引物89F和50R对外显子2测序。

在一组衍生自膀胱癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、肾癌、肺癌和黑素瘤的细胞系中，筛选MTS2编码序列的突变。所有这些细胞系类型都高频率地含有MTS1和MTS2的纯合缺失(Kamb et al.，1994b)。衍生自黑素瘤、肾癌、肺癌和膀胱癌的细胞系含有MTS1点突变或移码突变(Liu et al.，1995)。然而，神经胶质瘤和星形细胞瘤的细胞系不含有这种类型的MTS2突变。用于这些筛选试验的特殊细胞系是从一组以前表明不携带MTS2和MTS1序列纯合缺失的细胞系中选出(Kambét al.，1994b)。

在筛选的58个细胞系中的任一个中都没有在MTS2编码序列中发现MTS2突变(表7)。根据以前对这些细胞系类型中MTS1的研究，该组细胞系中应含有约8个局限于膀胱癌、黑素瘤、肺癌和肾癌组的MTS1突变(Liu et al.，1995)。因此，从这组肿瘤细胞系中没有获得有关MTS2体细胞突变的证据。

表7细胞系中MTS2突变的筛选多态性1细胞系类型   #筛选数目   #变化的数目   变化类型   编码效果星形细胞瘤      2            0膀胱(癌)        4            1         G→A；C→A    无神经胶质瘤      6            0黑素瘤          17           2         G→A；C→A    无肾(癌)          4            1         G→A；C→A    无肺(癌)          10           1         G→A；C→A    无小细胞肺(癌)    7            2         G→A；C→A    无非小细胞肺(癌)  8            0总计            58           71这些常见的多态性(Kamb et al.，1994a)位于内含子1，靠近核苷酸位置-27(C至A)和-103(G至A)处的3′受体位置。在亲缘族中筛选MTS2突变在无MTS1编码序列突变的9p21连锁的易患黑素瘤亲缘族中，MTS2基因可能是造成黑素瘤易感性的原因，这一可能性吸引人们把它弄清楚。已有关于易患黑素瘤家系的遗传特性的报道(Cannon-Albright et al.，1992)。使用标准程序，利用从全血中分离出的淋巴细胞，分离出来自家族成员的基因组DNA(Kamb et al.，1994a)。如上所述，在具有高LOD值的9p21连锁易患黑素瘤且以前的研究(Kamb et al.，1994a)没有发现MTS1突变的亲缘族中(见表8)，筛选MTS2编码序列的突变。没有检测到MTS2突变。因此，这些试验没有提供MTS2损伤造成遗传性黑素瘤的证据，尽管仅依据这些有限的试验还不能将这种可能性排除。

表8在易患黑素瘤的亲缘族中筛选MTS2种系突变亲缘族   LOD值   病例总数   携带单倍型的数目3346     5.97        21           213137     1.9         17           211764     1.04        4            43006     0.19        6            33161     -0.01       10           83343     -0.53       10           8实施例12MTS1和MTS1E1βRNA的表达两个p16启动子p16mRNA的两种不同形式可能通过两种不同的途径形成。转录可以从不同的启动子起始，或者mRNA可以得自同一个启动子，然后进行不同的拼接产生不同形式的转录物。

因为甚至当上游的E1β序列缺失时，α形式也可以在细胞系中转录，所以说明存在独立的α转录及β转录启动子。细胞系A375和SK-mel含有一种缺失，该缺失在E1α和E1β之间存在一个断点(图13)。这个近端的断点在这两个细胞系中还没有被准确定位，但是位于E1β5′端上游至少85kb处。用α-特异性引物进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，这两种细胞系都表达α转录物(图15)。RT-PCR的程序如下：从T细胞、细胞系或人组织分离的总RNA(Sambrooket al.，1989)合成cDNA(Clontech)。cDNA反应采用9聚物引发DNA的合成并且使用SuperscriptII反转录酶(Betheda ResearchLaboratories)。通过将α32P-dATP(Amersham)掺入合成反应物(0.1Ci/mmol)，然后测定掺入到最终产物中的放射性核苷酸的数量，从而计算出cDNA产率。用PCR方法，使用α或β特异性地来自E2的正向引物和半嵌套反向引物，通过连续两轮扩增分析p16α和p16β转录物水平。在第一次扩增中，用α-特异性引物AS.1(5′-CAACGCACCGAATAGTTACG—3′SEQ ID NO：26)或β-特异性引物BS.1(5′-TACTGAGGAGCCAGCGTCTA-3′SEQ ID NO：27)以及X2.R140′(5′-AGCACCACCAGCGTGTC-3′SEQ ID NO：22)扩增2ng的cDNA模板。反应是在Perkin-Elmer9600热循环仪上，按下列条件进行20个循环：97℃3秒；65℃10秒；75℃20秒。反应产物稀释100倍，然后用引物AS.1或BS.1和X2B(5′-CGTGTCCAGGAAGCCC-3′SEQ ID NO：23)再次进行扩增。X2B寡聚物在其5′端用γ32P-dATP(DuPont)进行标记(Sambrook etal.，1989)。PCR条件如上，但是只进行15个循环。为了消除由于基因组DNA污染造成的问题，PCR产物跨E1α或E1β/E2拼接点。产物通过在5％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分开。抽干的凝胶用X-OMAT(柯达)胶片曝光过夜。

结果暗示，α转录物从独立于E1β5′序列的启动子处开始转录。另一种解释是，缺失导致异位启动子序列与E1α融合。但是，这似乎不可能，因为A375和SK-mel93是各自独立分离的细胞系。α启动子的准确位置还不清楚，但是RNase保护分析表明，它至少位于p16起始密码子上游440bp处。因此，人p16基因是复杂的，它具有两种部分重叠的转录物。这两种转录物具有不同的编码潜力，而且由不同的启动子Pα和Pβ产生。

p16的表达方式有关基因功能的线索来自对基因在不同组织中表达方式的分析。为了确定p16的表达方式，从11个组织中制备一套cDNA样品，然后用α和β特异性引物进行筛选(图16A-D)。在所有检测的组织中都检测到两种形式的p16转录物，尽管存在一些差异。例如，在脾中，α和β形式之间的比率倾向于β。相反，在乳房中该比率倾向于α。这些表达数据与某些研究相符，这些研究发现在来自许多不同组织类型的细胞系中，都存在p16的缺失和点突变(Kamb et al.，1994b；Liu et al.，1995)，这暗示p16在多种组织中具有作用。

考虑到p16的生物化学功能，即在体外表现为Cdk4和Cdk6的抑制剂(Serrano et al.，1993；Li et al.，1994a；Parry et al.，1995)，可以在细胞周期时分析细胞中p16的表达。用植物凝集素(PHA)加上白细胞介素-2(IL-2)刺激人外周血淋巴细胞(PBL)，在刺激后不同时间内收获细胞。这些细胞用流式细胞仪分析以确定细胞所处的周期阶段，用RT-PCR分析以确定p16基因表达的相对水平，以及用Western印迹法分析以确定p16蛋白质的水平。从正常的成年供者抽取血液，然后从中分离出外周血淋巴细胞并且通过在Ficoll-Hypaque梯度(Boyum，1968)中悬浮而部分纯化。再按以前所述的逆流淘析法(Elstad et al.，1988)进一步纯化淋巴细胞。原作者估计，用这种方法制备的细胞群98％是纯的B和T细胞。纯化的细胞在添加10％小牛血清的RPMI(Gibco)中生长，用10μg/mlPHA(Sigma)和10U/ml IL-2(Sigma)诱导静止细胞。用流式细胞仪监视细胞周期的进展。按制造商所述的方法，用RNazol B(CINNA/BIOTECX Laboratories，Inc.)从原代T细胞中分离出RNA。用诱导后分离出的T细胞cDNA制作一系列的稀释物，从而确定PT-PCR的量。确定靶目标不再被扩增时的稀释倍数，从而确定存在于未稀释样品中的靶cDNA的数量。尽管来自不同PCR试验的结果是相符的，但是稀释试验表明，只有当RNA水平差异大于4倍时才能检测出RNA水平的变化。得自Rb+和Rb-细胞系的cDNA样品都用这种方式进行分析。对于各种cDNA样品(无论来自组织、细胞系还是T细胞)，都轻易地检测到人肌动蛋白，并且它们的含量大体相同。

两种形式p16转录物的比率在细胞周期中发生显著的变化(图6B-C)。起初，B形式较少，但是在刺激后30—40小时，其水平开始上升。同时，α形式的表达水平维持相对稳定，也许只有稍许增加。通过使用流式细胞仪发现，比率的变化与离开G0期进入S期的细胞相关。用模板稀释试验检测RT-PCR的量。这些试验表明，RT-PCR可以检测转录水平4倍或更大的变化。估计β诱导至少为10倍。因此，当细胞进入细胞周期时，它们改变两种p16转录物的相对量使得比率的变化倾向于β。

我们还检测了当T细胞通过细胞周期时，p16蛋白质表达的水平。在促有丝分裂诱导后的不同时期分离蛋白质，然后对分离的蛋白质进行Western印迹分析。用针对完整多肽C-末端20个氨基酸的p16抗体测定p16蛋白质的水平。当细胞离开G0期时，p16蛋白质的水平维持相对稳定。因此，在细胞周期中p16编码RNA(α转录物)和p16蛋白质两者都维持相对稳定。有其他学者报道，在S期p16水平会有温和增加(Tam et al.，1994b)。我们没有观察到p16的增加，这可能反映了在不同细胞类型中p16调控的差异，或者是因为在检测蛋白质(或cDNA)水平增加2—3倍时存在问题。

p16在肿瘤细胞系中的表达以前的研究表明，Rb影响p16的表达(Serrano et al.，1993；Liet al.，1994a；Parry et al.，1995)。我们测试了细胞中Rb状态对βmRNA表达的影响(图16D)。从一组细胞系中制备cDNA，其中5个含有野生型的Rb蛋白质，6个含有无功能的Rb蛋白质(Parry etal.，1995)。正如预计的那样，仅在Rb阴性细胞系中检测到α转录物。但是，在Rb阳性和Rb阴性细胞系中都检测到β转录物。因此，与α相反，βRNA的表达与衍生自肿瘤的细胞系中Rb的突变状态无关。

有证据表明，p16是多基因家族的成员(Guan et al.，1995)。与其他多基因家族相似，该家族的成员可能执行着重复的功能、不同的功能或者以不同的暂时性或组织特异性方式执行着功能。因此，考虑到p16蛋白质的低水平和明显没有Rb对p16的调控，有可能p16不在T淋巴细胞中调控细胞周期。然而因为当诱导T细胞时，β转录物显著地被诱导，而且又因为在高比例的T细胞衍生肿瘤中p16是缺失的(Hebert et al.，1994)，因此，似乎p16在人T细胞中起着重要作用。仅在用病毒转化的细胞系或衍生自肿瘤的细胞系中，观察到Rb对p16的明显影响。也许，在野生型组织中p16是按其他方式被调控的。

E1β是p16的保守和调控部分尽管，β转录物的作用不明，但是结果表明它对于p16基因座的功能至关重要，因为：(i)E1β在鼠中是保守的；(ii)β转录物的相对含量按组织特异性和依赖于细胞周期的方式进行调控和(iii)两个细胞系携带的纯合缺失去除E1β，而不是E1α。这些结果暗示，E1β是野生型p16发挥功能所必需的。

分离鼠的βcDNA，并且与人的MTS1E1β比较。用称为杂交体捕获RACE(HCR)的改良杂交体选择程序分离鼠cDNA克隆。从鼠的乳房和胸腺中分离出富含poly-A+的RNA。第一条cDNA链的合成反应(Sambrook et al.，1989)采用随机的12聚物和SuperscriptII反转录酶(Bethesda Research Laboratories)。在第二条链合成之后，通过将特异性的双链寡聚物(双链RP.2)(5′-TGAGTAGAATTCTAACGGCCGTCATTGTTC-3′SEQ ID NO：28)连于其5′端而将cDNA锚住。第二条cDNA链的5′端是在连接反应中唯一被磷酸化的DNA末端。在连接反应后，锚住的cDNA通过在SepharoseCL-4B柱洗脱而纯化。锚住的cDNA用p16特异性反向引物(5′-AGCGTGTCCAGGAAGCCTTC-3′SEQ ID NO：29)和嵌套式RP.2(RP.B)(5′-TGAGTAGAATTCTAACGGCCGTCATTG-3′SEQ ID NO：30)进行扩增，随后用位于第一次扩增所用反向引物上游处的、生物素标记的基因特异性寡核苷酸(5′-ACTGCGAGGACCCCACTACCTTCTCC-3′SEQ ID NO：31)进行捕获。捕获的cDNA被再次扩增，其中使用RP.B和位于捕获寡核苷酸上游处的、基因特异性反向引物(5′—GAACGTTGCCCATCATCATC-3′SEQ ID NO：32)。获得的产物被凝胶纯化、克隆和测序。通过克隆和对鼠基因组克隆(含有在低严紧性下与人E2探针杂交序列)进行测序而确定鼠p16寡核苷酸的序列。

将鼠β转录物与人进行比较，结果暗示，E1β并不编码蛋白质。只有含有E2中p16阅读框的序列是严格保守的。因此，如果β转录物被翻译，那么似乎蛋白质会从E2中起始而且按照与编码p16同样的阅读框进行翻译。推导出的多肽的计算分子量为10kDa，而且保留p16中4个锚蛋白(ankyrin)重复序列中的23/4。然而，p15仅含有31/2锚蛋白重复序列(Hannon and Beach，1994)，而其他蛋白质的折叠和发挥功能只有1或2个重复。p10分子是否存在于体内以及它是否抑制Cdk4/6还需要进一步测试。

βRNA的功能如果β转录物的角色是抑制细胞生长，那么我们能够在衍生自肿瘤的细胞系中发现中断E1β的突变形式。与该观点相符的是两个黑素瘤细胞系，它们的缺失是将E1β去除但是仍然能够继续表达a转录物。在这些细胞系中p16编码序列是野生型的。然而，在一组25个肿瘤细胞系中没有发现E1β中小的遗传损伤(例如碱基置换)。因此，还难于作出结论E1β是纯合缺失的目标。如果E1β外显子不编码蛋白质，那么小的遗传损伤不足以中断其功能。或者，上述缺失的目标可能是其他基因。例如，有可能在这些黑素瘤细胞系中p15基因(MTS2)是缺失的相关目标。在这种观点中，E1β缺失纯粹是因为，与E1α相比，它更靠近P15。然而，因为我们不能在许多细胞系中检测P15的点突变，又因为没有细胞系是含有特异性地去除p15的缺失(Kamb et al.，1994b)，因此这种解释似乎是不可能的。

遗传证据暗示，p16和Rb是生长调控途径中的成员，该路径在肿瘤发生过程中经常被失活。如果β转录物的角色是负调控细胞生长，那么它可能是另一个一定是独立于p16和Rb突变的路径的一部分。这样便可以解释为什么特异性中断E1β的缺失只有在Rb-细胞系中才能观察到。根据E1β的表达方式，E1β似乎在活跃的循环细胞中起作用。关于E1β角色的明确结论有待于分析其在体内的表达。实施例13MTS2 mRNA的表达按制造商所述的方法，用RNazol B(CINNA/BIOTECXLaboratories，Inc.)从细胞系或原代T细胞中分离出RNA。从总RNA(Sambrook et al.，1989)合成cDNA，其中采用随机9聚物引发DNA的合成。通过将α32P-dATP(Amersham)掺入合成反应物(0.1Ci/mmol)，然后测定掺入最终产物中的放射性核苷酸的数量，从而计算出cDNA产率。用PCR方法，使半嵌套(heminested)反向引物，通过连续两轮扩增而分析MTS2的表达。在第一次扩增中，用E1F(5′-TGAGGGTCTGGCCAGC-3′SEQ ID NO：21)和X2.R140′(5′-AGCACCACCAGCGTGTC-3′SEQ ID NO：22)扩增2ng的cDNA模板。反应是在Perkin-Elmer9600热循环仪上，按下列条件进行20个循环：97℃3秒；65℃10秒；75℃20秒。反应产物稀释100倍，然后用引物E1F和X2B(5′-CGTGTCCAGGAAGCCC-3′SEQ ID NO：23)再次进行扩增。X2B寡聚物在其5′端用γ32P-dATP(DuPont)进行标记(Sambrook etal.，1989)。PCR条件如上，但是只进行15个循环。产物通过在5％变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳而分开。抽干的凝胶用X-OMAT(柯达)胶片曝光过夜。

在不同组织中MTS2的表达已发现，MTS2在许多组织类型中表达，包括那些MTS2纯合缺失导致肿瘤的类型(见图10A)。但是，在不同组织中还是存在某些差异。例如，在肺中MTS2转录物能轻易地被检测到，但是在前列腺和脑组织中检测不出。相反，在所有检测的细胞中都可以检测到紧密相关的MTS1基因的表达。目前还不清楚MTS2 RNA水平的这种组织特异性差异是否反映了对MTS2蛋白质的组织特异性需求。

在细胞周期中MTS2的表达如果MTS2调控细胞周期中的重要转变，那么其表达会在细胞周期中变化。例如，在正常分裂细胞中，p21 mRNA的丰度会随细胞周期各阶段的不同而变化(Li et al.，1994b)。为了测试MTS2的转录是否在细胞周期中被调控，用PHA和IL2刺激静止的人T细胞，并在刺激后的不同阶段进行监测(见图10B)。当细胞离开G0期通过细胞周期各阶段时，没有检测到MTS2表达水平的明显变化。相反，调控基因Cdk4的表达按人们的预期发生变化(Matsushime et al.，1992)。因此，关于通过正常分裂细胞的周期时MTS2 mRNA的差异性表达方面的证据，还没有发现。

已提出，MTS1蛋白质参与一个涉及成视网膜细胞瘤蛋白质Rb的生长调控途径(Serrano et al.，1993；Guan et al.，1995；Serranoet al.，1995)。最近的研究提供了强有力和详尽的证据，支持MTS1至少部分地受Rb的调控(Li et al.，1994a；Parry et al.，1995)。MTS1和MTS2之间的生物化学方面的相似性暗示，MTS2也可能受Rb的调控。这种可能性可以通过比较MTS2 mRNA在Rb阳性细胞系和Rb阴性细胞系中的水平(浓度)加以确认。没有检测到Rb状态和MTS2 RNA水平之间的相关性(见图10C)。这暗示，细胞系的Rb状态并不显著地影响MTS2转录物的丰度。因此，与MTS1相反，MTS2的表达是独立于Rb的。实施例14MTS1和MTS2的异位表达通过聚合酶链反应，使用引物MTS1.F(5′-AAA GGA TCCATT GCC ACC ATG GAG CCG GCG GCG GGG AGC AGC ATGGAG CCT TCG GCT-3′)(SEQ ID NO：17)和E3.R(5′-TTTGAA TTC AAT CGG GGA TGT CTG—3′)(SEQ ID NO：18)扩增出MTS1的483bp片段。设计的引物MTS1.F在5′端附近含有限制性内切酶位点以便以后的克隆，并且含有Kozak共有序列(Kozak，1987)。用于该反应的模板DNA来自乳房组织的cDNA。将产生的片段插入已用EcoRI和BamHI消化的表达载体pcDNA3(In Vitrogen)。pcDNA3含有巨细胞病毒(CMV)启动子和编码氨苄青霉素和新霉素抗性的密码子。产生的重组载体pcDNAp16，再通过电穿孔进入细胞系HS294T。HS294T来自黑素瘤并且含有MTS1和MTS2的纯合缺失。HS294T在添加有10％小牛血清、非必需氨基酸、丙酮酸钠和L-谷氨酸盐的Dulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)(Gibco)中生长。细胞在37℃，于5％二氧化碳中生长。HS294T与pSS(Stratagene)按1∶4的比例进行共转化从而将潮霉素抗性赋予转化细胞，与此同时，HS294T与含有插入在CMV启动子下游的MTS1编码序列的pcDNA3(Invitrogen)表达载体，或不含有插入子的pcDNA3载体共转化。

将MTS2的编码序列同样地克隆入pcDNA3，同样地也形成Kozak共有序列，从而产生pcDNAp15，然后将其导入HS294T。其中，使用在实施例13中制备的MTS2 cDNA。

将含有潮霉素抗性选择标记的质粒pSS(Stratagene)与pcDNAp16或pcDNAp15同时共转化，在电穿孔中每样品池含20微克pSS。电穿孔的条件为每样品池800微升细胞(1.5×106细胞/毫升)和500微法(μF)电容，400伏特。用pcDNA3和pSS进行对照试验。将电穿孔后的细胞(约400微升)置于含300微克/毫升潮霉素的培养皿中。14天后对集落进行计数。结果列于表9。

9pcDNAp15         pcDNAp16质粒             集落/平板        集落/平板pcDNA3＋pSS       26.6±4.8      17.2±0.15pcDNAp15＋pSS     3.8±0.8        ——pcDNAp16＋pSS      ——                    1.1 ±0.5当含有融合于CMV启动子的全长MTS2编码序列的构建物被转化入HS294T时，与对照相比，它以七倍的比例抑制集落形成，因此可以与MTS1异位表达相匹配。该结果表明，MTS2的异位表达足以抑制细胞的生长。还不清楚转化的细胞是否是停在G1期(如同MTS1异位表达所造成的那样)，或者其生长是以其他方式被终止的。从表9可以得出结论，在原本缺乏p15或p16表达(此处是因为纯合缺失)的细胞系中，p15或p16过度表达会抑制细胞的生长。精确的机制还不清楚，但可能是由于p15或p16过度表达使细胞分裂停止或杀死细胞。这些实验数据暗示，p15和p16在体内的确是作为肿瘤抑制蛋白，因此p15和p16可能具有治疗用途。

出于多种原因，MTS2是肿瘤抑制基因的有力候选基因。它具有广泛的与MTS1序列相似性，它在体外与Cdk结合并且抑制其活性，而且体内MTS2的异位表达抑制细胞生长。上述结果导致存在这样的可能性：尽管MTS2和MTS1之间存在生物化学方面的相似性，但是两种蛋白质在体内具有很不相同的功能。MTS2的两个特征暗示，情况可能是这样的：i)是MTS2而不是MTS1被TGFβ诱导(Hannon and Beach，1994)和ii)与MTS1不同，MTS2的转录似乎与Rb无关。可能MTS2根本不涉及肿瘤形成。或者，MTS2参与一个与涉及MTS1的途径不同的肿瘤抑制途径。该途径中的各种因子还不清楚，但是可以想象，其中某些因子在体细胞中会以比MTS2高得多的频率发生突变。在这种观点中，缺乏MTS2的体细胞突变并不能排除其在肿瘤抑制中的重要角色。如上所述，MTS2的异位表达抑制细胞生长，这角色与MTS2是肿瘤抑制因子相符。MTS2表达水平在细胞周期中是稳定的，而且它被TGFβ诱导，这些暗示，在G1期的停止中，MTS2发挥作用，而不必一定调控细胞周期中各事件的时机。相反，MTS1的表达受Rb的调控，这表示MTS1在细胞周期转变中起作用。因此有必要测试MTS2作为体内生长调控分子的功能，并且分析MTS2发挥功能的途径。实施例15两步法检测样品中存在的MTS根据Antonarakis等人的方法(1985)处理病人样品，通过1％琼脂糖凝胶而分开，然后转至尼龙膜上供Southern印迹分析。膜在150mJ时，用GS基因接头(GS Gene Linker)(Bio-Rad)进行UV交联。对应于SEQ ID NO：4中核苷酸448-498位置的MTS探针被亚克隆入pTZ18U。将噬菌粒(phagemid)转化入用M13K07辅助噬菌体(Bio-Rad，Richmond，CA)感染的大肠杆菌MV1190。用标准程序(见Sambrook，et al.，1989)分离单链DNA。

印迹在65℃、7％十二烷基磺酸钠(SDS)、0.5M NaPO4中预杂交15-30分钟。该方法与Nguyen等人(1992)所述的方法相同。印迹在65℃、7％SDS、0.5M NaPO4中与25-50ng/ml单链DNA探针杂交过夜。杂交后进行洗涤，其中包括在65℃、5％SDS、40mM NaPO4中洗涤30分钟，共二次，然后在65℃、1％SDS、40mM NaPO4中洗涤30分钟，共二次。

接着，印迹用磷酸盐缓冲液(PBS)(pH6.8)在室温下漂洗5分钟，与含0.2％酪蛋白的PBS于室温下保温30—60分钟，然后在PBS中漂洗5分钟。然后，印迹在摇动水浴中，于45℃，用杂交缓冲液(6M尿素、0.3M NaCl和5X Denhardt′s溶液(见Sambrook，etal.，1989))预培育5—10分钟。移去缓冲液，并代之以50-75微升/cm2新鲜杂交缓冲液加上2.5nM共价相连的寡核苷酸-碱性磷酸酶偶联物，其中核苷酸序列与通用引物位置(UP-AP，Bio-Rad)互补。印迹在45℃杂交20—30分钟，杂交后的洗涤是在6M尿素、1×标准柠檬酸盐水(SSC)、0.1％SDS中于45℃洗涤10分钟，二次；然后在1×SSC，0.1％TritonX-100洗涤10分钟，一次。印迹在室温下用1×SSC漂洗10分钟。

印迹在摇动水浴中，于室温下，在底物缓冲液(0.1M二乙醇胺、1mM MgCl2、0.02％叠氮化钠、pH10.0)中培育10分钟。各印迹和底物缓冲液以及0.2mM AMPPD(3-(2′-螺金刚烷)-4-甲氧基-4-(3′-磷酰基氧基)苯基-1，2-二氧杂环丁烷，二钠盐，Bio-Rad)被一起置于热封闭袋中。在室温下，摇动保温20分钟后，移去多余的AMPPD溶液。印迹用X光底片曝光过夜。阳性条带表示存在MTS。实施例16产生针对MTS的多克隆抗体MTS编码序列的片段在大肠杆菌中作为融合蛋白进行表达。高表达的蛋白质用凝胶洗脱法进行纯化，并按类似于Harlow和Lane(1988)所述的程序免疫兔和小鼠。已表明该程序可以产生针对各种其他蛋白质的抗体(例如参见Kraemer，et al.，1993)。

简言之，将MTS编码序列区段作为质粒PET5A(Novagen，Inc.，Madison，WI)中的融合蛋白进行克隆。MTS整合序列包括对应于SEQ ID NO：4中448-498的氨基酸。用IPTG诱导后，通过SDS/PAGE证实具有预计分子量的融合蛋白的表达。融合蛋白用电洗脱法从凝胶中纯化出。通过在N末端的蛋白质测序鉴别出蛋白质是MTS融合产物。接着，纯化的蛋白质被用作免疫原去免疫兔。免用100微克蛋白质和完全Freund佐剂进行免疫，然后按3周间隔再进行两次，第一次用100微克免疫原和不完全Freund佐剂，第二次用100微克免疫原和PBS。在此之后两周收集含有抗体的血清。

重复该程序，以获得针对MTS基因突变型形式的抗体。这些抗体，以及针对野生型MTS的抗体，被用于在不同的组织和生物体液中检测突变型形式的存在及相对水平。实施例17产生针对MTS的单克隆抗体用下列方案产生单克隆抗体。使用含有完整MTS或MTS肽(野生型或突变型)的免疫原免疫小鼠，该MTS或MTS肽用戊二醛或EDC连于钥孔血蓝蛋白。这些是本领域中熟知的。

将免疫原和佐剂混合。每个小鼠接受4次10—100微克免疫原的注射，在第4次注射之后，从小鼠中采集血液样品以确定血清中是否含有针对免疫原的抗体。用ELISA或RIA确定血清效价。选出血清中表明存在针对免疫原的抗体的小鼠，用于产生杂交瘤。

从免疫小鼠中取出脾脏，制备单细胞悬浮液(见Harlow andLane，1988)。基本上用Kohler和Milstein(1975)所述的方法融合细胞。简言之，按Harlow和Lane(1988)所述的方法，用聚乙二醇将P3.65.3骨髓瘤细胞(美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD)和免疫脾细胞融合在一起。按2×105细胞/孔的密度将细胞置于96孔的组织培养板上。检查各孔是否有细胞的生长，并且对生长的孔中的上清液通过ELISA或RIA，用野生型或突变型MTS靶蛋白进行测试以确定MTS特异性抗体的存在。对阳性孔中的细胞继续进行培养并且亚克隆以获得并证实单克隆系。

具有所需特异性的克隆在小鼠中作为腹水或者在空心纤维系统中继续繁殖和生长，从而产生出足够的抗体供研究和分析之用。实施例18MTS的夹心分析将单克隆抗体连于固相表面，例如板、试管、珠或颗粒。较佳地，抗体被附着于96孔ELISA板的孔表面。将含有MTS肽/蛋白质(野生型或突变型)的100微升样品(例如血清、尿液、组织胞液)加至固相抗体。样品在室温下保温2小时。接着倒去样品液体，用缓冲液洗涤固相以去除非结合的物质。将第二种单克隆抗体(针对MTS肽/蛋白质的不同的抗原决定簇)加至固相。该抗体是用检测分子(例如I125、酶、荧光基团、生色基团)标记的。固相和第二种抗体在室温下保温2小时。倒去第二种抗体，用缓冲液洗涤固相以去除非结合的物质。

定量地测定结合标记物的数量，它与样品中MTS肽/蛋白质的数量成正比例。再使用对野生型MTS特异的单克隆抗体以及对各种MTS突变特异的单克隆抗体进行分析。

很明显地，本发明的方法和内容可以用于各种不同的实施例中，其中只有一小部分公开于此。本领域中的熟练技术人员知晓，还存在其他的体现形式(或实施例)，这些都是属于本发明范围之内。因此，上述的实施例只用于阐述目的，并不用于限制目的。参考文献清单American Cancer Society (1992). In Cancer Facts and Figures-1992.Anand，R.(1992).Techniques for the Analysis of Complex Genomes，(Academic Press).Anderson，et al.(1980).Proc. Natl. Acad.Sci.USA77：5399-5403.Anderson，J.A.，et al.(1992).J.Otolaryngology21：321.Antonarakis，S.E.，et al.(1985).NewEngl.J.Med.313：842-848.Ausubel，F.M.，et al.(1992).Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley and Sons，NewYork. New York).Beaucage & Carruthers(1981). Tetra.Letts.22：1859-1862.Bergman，W.，et al.(1990).Br.J.Cancer61，932-936.Berkner(1992).Curr.Top.Microbiol.Immunol.158：39-61，Berkner，et al.(1988). Bio Techniques6：616-629.Bird，A.P.(1989).Nucleic Acids Res.17：9485.Bimboim，H.C.& Doly，J.(1979).Nuc.AcidsRes.7：1513-1523.Boyum.A.(1968)..Scand.J.Clin.Lab.Invest.21(suppl.97)：77-89.Brandyopadhyay and Temin(1984)，Mol.Cell.Biol.4：749-754.Bre3kfield and Geller(1987).Mol.Neurobiol.1：337-371.Brinster，et al.(1981).Cell27：223-231.Buchschacher and Panganiban(1992).J.Virol.66：2731-2739.Buckley，M.F.，Sweeney，K.J.，Hamilton，J.A.，Sini，R.L.，Manning，D.L.，Nicholson，R.I.，deFazio，A.，Watts，C.K.，Musgrove，E.A.and Sutherland，R.L.(1993).Oncogene8：2127-2133.Caims，P.，Mao，L..Merlo，A.，Lee，D.J.，Schwab，D.，Eby，Y.，Tokino，K.，van der Riet，P.，Blaugrund，J.E.and Sidransky，D.(1994).Science265：415-416.Caldas，C.，Hahn，S.A.，da Costa，L.，Redston，M.S.，Schutte，M.，Seymour，A.B.，Weinstein，C.L.，Hruban，R.H.，Yeo.C.J.and Kem，S.E.(1994).Nature Genetics8：27-32.Cannon-Albright，L.A.，Goldgar，D.E.，Meyer，L.J.，Lewis，C.M.，Anderson，D.E.，Fountain，J.W.，Hegi，M.E.，Wiseman，R.W.，Petty，E.M.，Bale，A.E.，Olopade，O.I.，Diaz，M.O.，Kwiatkowski，D.J.，Piepkorn，M.W.，Zone，J.J.and Skolaick，M.H.(1992).Science258：1148-1152.Capecchi，M.R.(1989).Science244：1288.Cariello(1988).Human Genetics42：726.Cheng，J.Q.，et al.(1993).Cancer Res.53：4761.Cohen，D.，et al.(1993).Nature366，698-701.Conner，B.J.，et al.(1983).Proc.Nat.Acad.Sci.USA.80：278-282.Constantini and Lacy(1981).Nature294：92-94.Cotten，et al.(1990).Proc.Natl.Acad.Sci.US487：4033-4037.Cotton，et al.(1988).Proc.Nat.Acad.Sci.USA85：4397.Culver，et al.(1992).Science256：1550-1552.Curiel.et al.(1991a).Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：8850-8854.Curiel.et al.(1991b).Hum. Gene Ther.3：147-154.Deutscher.M.(1990).Meth. Enzymology182：83-89(Academic Press，San Diego).Diaz.M.O.，et al.(1988).Proc.Natl.Acad Sci.USA85：5259-5263.Diaz.M.O.，et al.(1990).New Engl.J.Med.322：77.Donehower.L.A.，et al.(1992).Nature356：215.EI-Diery.W.S.，Tokino，T.，Velculescu V.E.，Levy，D.B.，Parsons，R.，Trent.J.M.，Lin，D.，Mercer，W.E.，Kinszler，K.W.and Vogelstein，B.(1993).Cell75：817-825.Elstad，M.R.et al.(1988).J.Immunol.140：1618-1624.Enhancers and Eukaryotic Gene Expression，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1983).Erickson，J.et al.(1990).Science249：527-533.Ewen，M.E.，et al.(1993).Cell73：47.Felgner，et al.(1987).Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：7413-7417.Fiers，et al.(1978).Nature 273：113.Fink，et al.(1992).Hum.Gene Ther.3：11-19.Finkelstein，J.，et al.(1990).Genomics7：167-172.Firpo，E.J.，Koff，A.，Solomon，M.J.and Roberts，J.M.(1994).Mol.Cell.Biol.14：4889-4901.Fountain，J.W.，et al.(1992).Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10557-10561.Freese，et al.(1990).Biochem.Pharmacol.40：2189-2199.Friedman.T.(1991).In Therapy for Genetic Diseases，T.Friedman，ed.，Oxford University Press，pp.105-121.Geng，Y.and Weinberg，R.A.(1993).Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：10315-10319.Glover.D.(1985).DNA Cloning，I and II(Oxford Press).Goding(1986).Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，2d ed.(Academic Press，NewYork).Godowski.et al.(1988).Science241：812-816.Goldstein.A.M.，et al.(1994).Am.J. Hum.Genet.54：489.Gordon.et al.(1980).Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：7380-7384.Gorziglia and Kapikian(1992).J.Virol.66：4407-4412.Graham and van der Eb(1973).Virology52：456-467.Gruis，N.A..et al.(1993).Melanoma Res.3：271.Gu，Y.，et al.(1993).Nature366：707.Guan.K.-L.，Jenkins.C.W.，Li，Y.，Nichols，M.A.，Wu，X.，O’Keefe，C.L.，Matera，A.G.andXong.Y.(1995).Genes Dev.8，6078-6082.Guthrie，G.& Fink，G.R.(1991).Guide to Yeast Genetics and Molecular.Biology，(AcademicPress).Hannon.G.J.and Beach，D.(1994).Nature371：257-261.Harlow & Lane(1988).Antibodies：ALaboratory.Manual，(Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，New York).Harper，J.W.，Adami，G.R.，Wei，N.，Keyomarsi，K.and Elledge，S.J.(1993).Cell75：805-816.Hasty，P.，K.，et al.(1991).Nature350：243.Hebert，J.，Cayuela，J.M.，Berkeley，J.and Sigaux，F.(1994).Blood84：4038-4044.Helseth.et al.(1990).J.Virol.64：2416-2420.Henco，K.，et al.(1985).J.Mol.Biol.185：227-260.Hodgson，J.(1991).Bio/Technology9：19-21.Hori，et al.(1987).Blood70：1069-1071.Hunter，T.and Pines，J.(1994).Cell79：573-582.Huse.et al.(1989).Science246：1275-1281.Hussussian.C.J.，Struewing.J.P.，Goldstein，A.M.，Higgins，P.A.T.，Ally，D.S.，Sheahan，M.D.，Clark.W.H.Jr.，Tucker，M.A.and Dracopoli，N.C.(1994).Nature Genetics8：15-21.Innis et al.(1990).PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，(Academic Press.SanDiego).Jablonski.E..et al.(1986).Nucl.Acids Res.14：6115-6128.Jakoby.W.B.and Pastan.I.H.(eds.)(1979).Cell Culture.Method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专利和专利申请清单美国专利No.3,817,837美国专利No.3,850,572美国专利No.3,939,350美国专利No.3,996,345美国专利No.4,275,149美国专利No.4,277,437美国专利No.4,366,241美国专利No.4,376,110美国专利No.4,486,530美国专利No.4,683,195美国专利No.4,683,202美国专利No.4,81 6,567美国专利No.4,868,105美国专利No.5,252,479EPO出版物No.225,807欧洲专利申请出版物No.0332435Geusen，欧洲专利申请No.84/03664，1984年9月13日出版Hitzeman et al.，EP73,675APCT申请出版物WO93/07282

序列表(1)一般信息：(i)申请人：Skolnick，Mark H.

Cannon-Albright，Lisa A.

Kamb，Alexander(ii)发明名称：多肿瘤抑制因子基因种系突变及检测该基因癌肿倾向性的方法(iii)序列数目：36(iv)通讯地址：(A)地址：Venable，Baetjer，Howard & Civiletti，LLP(B)街：1201 New York Avenue，Suite 1000(C)城市：Washington(D)州：DC(E)国家：美国(F)邮政编码：20005(v)计算机可读形式：(A)记录介质类型：软盘(B)计算机：IBM PC兼容型(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30(vi)本申请资料：(A)申请号：US

(B)申请日：(C)分类：(vii)在先申请资料：(A)申请号：US08/251,938(B)申请日：01—06月—1994(vii)在先申请资料：(A)申请号：US08/215,088(B)申请日：18—03月—1994(vii)在先申请资料：(A)申请号：US08/214,581(B)申请日：18—03月—1994(vii)在先申请资料：(A)申请号：US08/227,369(B)申请日：14—04月—1994(vii)在先申请资料：(A)申请号：US08/214,582(B)申请日：18—03月—1994(viii)律师/代理人信息：(A)姓名：Saxe，Stephen A.

(B)登记号：38,609(C)参考/文档号：24884—109348—PCT—2(ix)通讯信息：(A)电话：202—962—4848(B)传真：202—962—8300(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：(A)长度：447碱基对(B)类型：核酸(C)股性：双链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：否(iv)反义：否(vi)最初来源：(A)有机体：人(ix)特征：(A)名称/检索符号：CDS(B)位置：1..447(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：ATG GAG CCT TCG GCT GAC TGG CTG GCC ACG GCC GCG GCC CGG GGT CGG     48Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu Ala Thr Ala Ala Ala Arg Gly Arg1               5                   10                  15GTA GAG GAG GTG CGG GCG CTG CTG GAG GCG GTG GCG CTG CCC AAC GCA     96Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu Glu Ala Val Ala Leu Pro Asn Ala20                  25                  30CCG AAT AGT TAC GGT CGG AGG CCG ATC CAG GTC ATG ATG ATG GGC AGC     144Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser

35                  40                  45GCC CGA GTG GCG GAG CTG CTG CTG CTC CAC GGC GCG GAG CCC AAC TGC      192Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys50                  55                  60GCC GAC CCC GCC ACT CTC ACC CGA CCC GTG CAC GAC GCT GCC CGG GAG      240Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu65                  70                  75                  80GGC TTC CTG GAC ACG CTG GTG GTG CTG CAC CGG GCC GGG GCG CGG CTG      288Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu85                  90                  95GAC GTG CGC GAT GCC TGG GGC CGT CTG CCC GTG GAC CTG GCT GAG GAG      336Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu100                 105                 110CTG GGC CAT CGC GAT GTC GCA CGG TAC CTG CGC GCG GCT GCG GGG GGC      384Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly115                 120                 125ACC AGA GGC AGT AAC CAT GCC CGC ATA GAT GCC GCG GAA GGT CCC TCA      432Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg Ile Asp Ala Ala Glu Gly Pro Ser130                 135                 140GAC ATC CCC GAT TGA                                                  447Asp Ile Pro Asp *145(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：(A)长度：149氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Met Glu Pro Ser Ala Asp Trp Leu Ala Thr Ala Ala Ala Arg Gly Arg1               5                   10                  15Val Glu Glu Val Arg Ala Leu Leu Glu Ala Val Ala Leu Pro Asn Ala20                  25                  30Pro Asn Ser Tyr Gly Arg Arg Pro Ile Gln Val Met Met Met Gly Ser35                  40                  45Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys50                  55                  60Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu65                  70                  75                  80Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu85                  90                  95Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu100                 105                 110Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly115                 120                 125Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg Ile Asp Ala Ala Glu Gly Pro Ser130                 135                 140Asp Ile Pro Asp *145(2)SEQ ID NO：3的信息：(i)序列特征：(A)长度：1149碱基对(B)类型：核酸(C)股性：双链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：否(iv)反义：否(vi)最初来源：(A)有机体：人(ix)特征：(A)名称/检索符号：内含子(B)位置：1..890(ix)特征：(A)名称/检索符号：外显子(B)位置：891..1016(ix)特征：(A)名称/检索符号：内含子(B)位置：1017..1149(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：TCCCCCGCCC GTWTTAAWTA AACCTCATCT TTCCAGAGTC TGTTCTTATA CCAGGAAATG           60TACACGTCTG AGAAACCCTT GCCCCAGACA GTCGTTTTAC ACGCAGGAGG GGAAGGGGAG          120GGGAAGGAGA GAGCAGTCCT TTTCTCCAAA AGGAATCCTT NGAACTAGGG TTTCTGACTT          180AGTGAACCCC GCGYTCCTGA AAATCAWGGG TTGAGGGGGT AGGGGGACAC TTYCCTAGTC          240GYACAGSTKA TTTCGMTYCT CGGTGGGGCT CTCACAMCTA GGAAAGAATW GTTTTGCTTT          300TTCTTATGAT TAAAAGAAGA AGCCATACTT TTCCCTATGA CACCAAACAC CCCGATTCAA          360TTTGGCAGTT AGGAAGGTTG TATCGCGGAG GAAGGAAACG GGGCGGGGGC GGATTTCTTT          420TTTAACAGAG TGAACGCACT CAAACACGCC TTTGCTGGCA GGCGGGGGGA GCGCGGCTGG          480GAGCAGGGGA GGCCGGAGGG CGGTGTGGGG GGCAGGTGGG GAGGAGCCCA GTCCTCCTTC          540CTTGCCAACG CTGGCTCTGG CGAGGGCTGC TTYCGGCTGG TGCCCCCGGG GGAGACCCAA          600CCTGGGGCGA CTTCAGGGGT GCCACATTCG CTAAGTGCTC GGAGTTAATA GCACCTCCTC          660CGAGCACTCG CTCACAGCGT CCCCTTGCCT GGAAAGATAC CGCGGTCCCT CCAGAGGATT          720TGAGGGACAG GGTCGGAGGG GGCTCTTCCG CCAGCACCGG AGGAAGAAAG AGGAGGGGCT          780GGCTGGTCAC CAGAGGGTGG GGCGGACCGC GTGCGCTCGG CGGCTGCGGA GAGGGGGAGA          840GCAGGCAGCG GGCGGCGGGG AGCAGCATGG AGCCGGCGGC GGGGAGCAGC ATGGAGCCTT          900CGGCTGACTG GCTGGCCACG GCCGCGGCCC GGGGTCGGGT AGAGGAGGTG CGGGCGCTGC          960TGGAGGCGGT GGCGCTGCCC AACGCACCGA ATAGTTACGG TCGGAGGCCG ATCCAGGTGG         1020GTAGAGGGTC TGCAGCGGGA GCAGGGGATG GCGGGCGACT CTGGAGGACG AAGTTTGCAG         1080GGGAATTGGA ATCAGGTAGC GCTTCGATTC TCCGGAAAAA GGGGAGGCTT CCTGGGGAGT         1140TTTCAGAAC                                                                 1149(2)SEQ ID NO：4的信息：(i)序列特征：(A)长度：1187碱基对(B)类型：核酸(C)股性：双链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：否(iv)反义：否(vi)最初来源：(A)有机体：人(ix)特征：(A)名称/检索符号：内含子(B)位置：1..191(ix)特征：(A)名称/检索符号：外显子(B)位置：192..498(ix)特征：(A)名称/检索符号：内含子(B)位置：499..1187(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：GAATTCATTG TGTACTGAAG AATGGATAGA GAACTCAAGA AGGAAATTGG AAACTGGAAG           60CAAATGTAGG GGTAATTAGA CACCTGGGGC TTGTGTGGGG GTCTGCTTGG CGGTGAGGGG          120GCTCTACACA AGCTTCCTTT CCGTCATGCC GGCCCCCACC CTGGCTCTGA CCATTCTGTT          180CTCTCTGGCA GGTCATGATG ATGGGCAGCG CCCGAGTGGC GGAGCTGCTG CTGCTCCACG          240GCGCGGAGCC CAACTGCGCC GACCCCGCCA CTCTCACCCG ACCCGTGCAC GACGCTGCCC          300GGGAGGGCTT CCTGGACACG CTGGTGGTGC TGCACCGGGC CGGGGCGCGG CTGGACGTGC          360GCGATGCCTG GGGCCGTCTG CCCGTGGACC TGGCTGAGGA GCTGGGCCAT CGCGATGTCG          420CACGGTACCT GCGCGCGGCT GCGGGGGGCA CCAGAGGCAG TAACCATGCC CGCATAGATG          480CCGCGGAAGG TCCCTCAG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(A)名称/检索符号：内含子(B)位置：1..273(ix)特征：(A)名称/检索符号：misc—RNA(B)位置：274..529(D)其他信息：/注意点＝″对应于SEQ ID NO：4的外显子″(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：GATCATCACT TTACCATCAA CTTTCTTGTC TCTGAACGTT TAGAGAATAA AATGGCATTT            60AATTGGTVCT GAGTWTAACC TGAAGGTGGG GTGGGAAAGT GGWTTGCATC AGCAADTGAA           120GAAACACCAG ACATCAGAGA CCTGAACACC TCTGCACTGG GTGAAAACTT GGCAATTAGG           180TGTTTCTTTA AATGGCTCCA CCTGCCTTGC CCCGGCCGGC ATCTCCCATA CCTGCCCCCA           240CCCTGGCTCT GACCACTCTG CTCTCTCTGG CAGGTCATGA TGATGGGCAG CGCCCGCGTG           300GCGGAGCTGC TGCTGCTCCA CGGCGCGGAG CCCAACTGCG CAGACCCTGC CACTCTCACC           360CGACCGGTGC ATGATGCTGC CCGGGAGGGC TTCCTGGACA CGCTGGTGGT GCTGCACCGG           420GCCGGGGCGC GGCTGGACGT GCGCGATGCC TGGGGTCGTC TGCCCGTGGA CTTGGCCGAG           480GAGCGGGGCC ACCGCGACGT TGCAGGGTAC CTGCGCACAG CCACGGGGGA CTGACGCCAG           540GTTCCCCAGC CGCCCACAAC GACTTTATTT TCTTACCCAA TTTCCCACCC CCACCCACCT           600AATTCGATGA AGGCTGCCAA CGGGGAGCGG CGGAAAGCCT GTAAGCCTGC AAGCCTGTCT           660GAGACTCACA GGAAGGAGGA GCCGACCGGG AATAACCTTC CATACATTTT TTTCTTTGTC           720TTATCTGGCC CTCGACACTC ACCATGAAGC GAAACACAGA GAAGCGGATT TCCAGGGATA           780TTTAGGAGTG TGTGACATTC CAGGGGTCGT TTGNTTTTCA GGGTTTTCTG AGGGAAAGTG           840CATATGAAAT CCTTGACTGG ACCTGGTGGC TACGAATCTT CCCGATGGAT GAATCTCCCA           900CTCCAGCGCT GAGTGGGAGA AGGCAGTGAT TAGCACTTGG GTGACGGCAG TCGATGCGTT           960CACTCCAATG TCTGCTGAGG AGTTATGGTG AACCCACAAC TTAGGCCCTA GCGGCAGAAA          1020GGAAAACCTG AAGACTGAGG ACAAAGTGGA GGAGGGCCGA GGTGGGCTTC AGTATGTCCC          1080CNNCGGCGCT TTAGTTTGAG CGCATGGCAA GTCACATGCG TAAACGACAC TCTCTGGAAG          1140CCCTGGAGAC CCTCGCCCAA CTCCACCAGA TAGCAGAGGG GTAAGAGAGG ATGTGCAAGC          1200GACGACAGAT GCTAAAATCC CTGGATCACG ACGCTGCAGA GCAC                           1244(2)SEQ ID NO：6的信息：(i)序列特征：(A)长度：19碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：否(iv)反义：否(vi)最初来源：(A)有机体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：CAGCACCGGA GGAAGAAAG                             19(2)SEQ ID NO：7的信息：(i)序列特征：(A)长度：20碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：否(iv)反义：是(vi)最初来源：(A)有机体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：GCGCTACCTG ATTCCAATTC                           20(2)SEQ ID NO：8的信息：(i)序列特征：(A)长度：20碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：否(iv)反义：否(vi)最初来源：(A)有机体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：GGAAATTGGA AACTGGAAGC                                20(2)SEQ ID NO：9的信息：(i)序列特征：(A)长度：19碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：否(iv)反义：是(vi)最初来源：(A)有机体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：TCTGAGCTTT GGAAGCTCT                               19(2)SEQ ID NO：10的信息：(i)序列特征：(A)长度：21碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：否(iv)反义：否(vi)最初来源：(A)有机体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：ATCATCACT TTACCATCAA C                               21(2)SEQ ID NO：11的信息：(i)序列特征：(A)长度：19碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：否(iv)反义：是(vi)最初来源：(A)有机体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：GGGTGGGAAA TTGGGTAAG                           19(2)SEQ ID NO：12的信息：(i)序列特征：(A)长度：20碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：否(iv)反义：否(vi)最初来源：(A)有机体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：TGAGTTTAAC CTGAAGGTGG                          20(2)SEQ ID NO：13的信息：(i)序列特征：(A)长度：1131碱基对(B)类型：核酸(C)股性：双链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：否(iv)反义：否(vi)最初来源：

(A)有机体：人(ix)特征：(A)名称/检索符号：CDS(B)位置：338..655(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：CGCGCCTGCG GGGCGGAGAT GGGCAGGGGG CGGTGCGTGG GTCCCAGTCT GCAGTTAAGG        60GGGCAGGAGT GGCGCTGCTC ACCTCTGGTG CCAAAGGGCG GCGCAGCGGC TGCCGAGCTC       120GGCCCTGGAG GCGGCGAGAA CATGGTGCGC AGGTTCATGG TGACCCTCCG GATTCGGCGC       180GCGTGCGGAC CGCCGCGAGT GAGGGTTTTC GTGGTTCACA TCCCGCGGCT CACGGGGGAG       240TGGGCAGCAC CAGGGGCGCC CGCCGCTGTG GCCCTCGTGC TGATGCTACT GAGGAGCCAG       300CGTCTAGGGC AGCAGCCGCT TCCTAGAAGA CCAGGTC ATG ATG ATG GGC AGC GCC        355Met Met Met Gly Ser Ala150                 155CGA GTG GCG GAG CTG CTG CTG CTC CAC GGC GCG GAG CCC AAC TGC GCC         403Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly Ala Glu Pro Asn Cys Ala160                 165                 170GAC CCC GCC ACT CTC ACC CGA CCC GTG CAC GAC GCT GCC CGG GAG GGC         451Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His Asp Ala Ala Arg Glu Gly175                 180                 185TTC CTG GAC ACG CTG GTG GTG CTG CAC CGG GCC GGG GCG CGG CTG GAC         499Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg Ala Gly Ala Arg Leu Asp190                 195                 200GTG CGC GAT GCC TGG GGC CGT CTG CCC GTG GAC CTG GCT GAG GAG CTG         547Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val Asp Leu Ala Glu Glu Leu205                 210                 215GGC CAT CGC GAT GTC GCA CGG TAC CTG CGC GCG GCT GCG GGG GGC ACC         595Gly His Arg Asp Val Ala Arg Tyr Leu Arg Ala Ala Ala Gly Gly Thr220                 225                 230                 235AGA GGC AGT AAC CAT GCC CGC ATA GAT GCC GCG GAA GGT CCC TCA GAC         643Arg Gly Ser Asn His Ala Arg Ile Asp Ala Ala Glu Gly Pro Ser Asp240                 245                 250ATC CCC GAT TGA AAGAACCAGA GAGGCTCTGA GAAACCTCGG GAAACTTAGA             695Ile Pro Asp  *255TCATCAGTCA CCGAAGGTCC TACAGGGCCA CAACTGCCCC CGCCACAACC CACCCCGCTT       755TCGTAGTTTT CATTTAGAAA ATAGAGCTTT TAAAAATGTC CTGCCTTTTA ACGTAGATAT       815AAGCCTTCCC CCACTACCGT AAATGTCCAT TTATATCATT TTTTATATAT TCTTATAAAA       875ATGTAAAAAA GAAAAACACC GCTTCTGCCT TTTCACTGTG TTGGAGTTTT CTGGAGTGAG       935CACTCACGCC CTAAGCGCAC ATTCATGTGG GCATTTCTTG CGAGCCTCGC AGCCTCCGGA       995AGCTGTCGAC TTCATGACAA GCATTTTGTG AACTAGGGAA GCTCAGGGGG GTTACTGGCT      1055TCTCTTGAGT CACACTGCTA GCAAATGGCA GAACCAAAGC TCAAATAAAA ATAAAATTAT      1115TTTCATTCAT TCACTC                                                                                                                                                                          1131(2)SEQ ID NO：14的信息：(i)序列特征：(A)长度：l06氨基酸(B)类型：氨基酸(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：Met Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly1               5                  10                  15Ala Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His20                  25                  30Asp Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg35                  40                  45Ala Gly Ala Arg Leu Asp Val Arg Asp Ala Trp Gly Arg Leu Pro Val50                  55                  60Asp Leu Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Asp Val Ala Arg Tyr Leu Arg65                  70                  75                  80Ala Ala Ala Gly Gly Thr Arg Gly Ser Asn His Ala Arg Ile Asp Ala85                  90                  95Ala Glu Gly Pro Ser Asp Ile Pro Asp  *100                 105(2)SEQ ID NO：15的信息：(i)序列特征：(A)长度：751碱基对(B)类型：核酸(C)股性：双链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：否(iv)反义：否(vi)最初来源：(A)有机体：人(ix)特征：(A)名称/检索符号：CDS(B)位置：335..751(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：CGGGCAGTGA GGACTCCGCG ACGCGTCCGC ACCCTGCGGC CAGAGCGGCT TTGAGCTCGG        60CTGCGTCCGC GCTAGGCGCT TTTTCCCAGA AGCAATCCAG GCGCGCCCGC TGGTTCTTGA       120GCGCCAGGAA AAGCCCGGAG CTAACGACCG GCCGCTCGGC CACTGCACGG GGCCCCAAGC       180CGCAGAAGGA CGACGGGAGG GTAATGAAGC TGAGCCCAGG TCTCCTAGGA AGGAGAGAGT       240GCGCCGGAGC AGCGTGGGAA AGAAGGGAAG AGTGTCGTTA AGTTTACGGC CAACGGTGGA       300TTATCCGGGC CGCTGCGCGT CTGGGGGCTG CGGA ATG CGC GAG GAG AAC AAG           352Met Arg Glu Glu Asn Lys110GGC ATG CCC AGT GGG GGC GGC AGC GAT GAG GGT CTG GCC AGC GCC GCG         400Gly Met Pro Ser Gly Gly Gly Ser Asp Glu Gly Leu Ala Ser Ala Ala115             120                 125GCG CGG GGA CTA GTG GAG AAG GTG CGA CAG CTC CTG GAA GCC GGC GCG         448Ala Arg Gly Leu Val Glu Lys Val Arg Gln Leu Leu Glu Ala Gly Ala130                 135                 140GAT CCC AAC GGA GTC AAC CGT TTC GGG AGG CGC GCG ATC CAG GTC ATG         496Asp Pro Asn Gly Val Asn Arg Phe Gly Arg Arg Ala Ile Gln Val Met145                 150                 155                 160ATG ATG GGC AGC GCC CGC GTG GCG GAG CTG CTG CTG CTC CAC GGC GCG         544Met Met Gly Ser Ala Arg Val Ala Glu Leu Leu Leu Leu His Gly Ala165                 170                 175GAG CCC AAC TGC GCA GAC CCT GCC ACT CTC ACC CGA CCG GTG CAT GAT         592Glu Pro Asn Cys Ala Asp Pro Ala Thr Leu Thr Arg Pro Val His Asp180                 185                 190GCT GCC CGG GAG GGC TTC CTG GAC ACG CTG GTG GTG CTG CAC CGG GCC         640Ala Ala Arg Glu Gly Phe Leu Asp Thr Leu Val Val Leu His Arg Ala195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(xi)序列描述：SEQ ID NO：21：TGAGGGTCTG GCCAGC                                                           16(2)SEQ ID NO：22的信息：(i)序列特征：(A)长度：17碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：否(iv)反义：是(vi)最初来源：(A)有机体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：AGCACCACCA GCGTGTC                                                          17(2)SEQ ID NO：23的信息：(i)序列特征：(A)长度：16碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：DNA(基因组)(iii)假设：否(iv)反义：是(vi)最初来源：

(A)有机体：人(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：CGTGTCCAGG AAGCCC    16(2)SEQ ID NO：24的信息：(i)序列特征：(A)长度：144碱基对(B)类型：核酸(C)股性：双链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：否(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：AATTCGGCAC GAGGCAGCAT GGAGCCTTCG GCTGACTGGC TGGCCACGGC CGCGGCCCGG           60GGTCGGGTAG AGGAGGTGCG GGCGCTGCTG GAGGCGGTGG CGCTGCCCAA CGCACCGAAT          120AGTTACGGTC GGAGGCCGAT CCAG                                                 144(2)SEQ ID NO：25的信息：(i)序列特征：(A)长度：395碱基对(B)类型：核酸(C)股性：双链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：否(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：AAGAGAGGGT TTTCTTGGTA AAGTTCGTGC GATCCCGGAG ACCCAGGACA GCGTAGCTGC           60GCTCTGGCTT TCGTGAACAT GTTGTTGAGG CTAGAGAGGA TCTTGAGAAG AGGGCCGCAC          120CGGAATCCTG GACCAGGTGA TGATGATGGG CAACGTTCAC GTAGCAGCTC TTCTGCTCAA          180CTACGGTGCA GATTCGAACT GCGAGGACCC CACTACCTTC TCCCGCCCGG TGCACGACGC          240AGCGCGCGAA GGCTTCCTGG ACACGCTGGT GGTGCTGCAC GGGTCAGGGG CTCGGCTGGA          300TGTCCGCGAT GCCTGGGGTC GCCTCCCGCT CGACTTCGCC CAAGAGCGGG GACATCAAGA          360CATCGTGCGA TATTTGCGTT CCGCTGGGTG CTCTT                                     395(2)SEQ ID NO：26的信息：(i)序列特征：(A)长度：20碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：CAACGCACCG AATAGTTACG    20(2)SEQ ID NO：27的信息：(i)序列特征：(A)长度：20碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：TACTGAGGAG CCAGCGTCTA               20(2)SEQ ID NO：28的信息：(i)序列特征：(A)长度：30碱基对(B)类型：核酸(C)股性：双链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：TGAGTAGAAT TCTAACGGCC GTCATTGTTC    30(2)SEQ ID NO：29的信息：(i)序列特征：(A)长度：20碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：AGCGTGTCCA GGAAGCCTTC              20(2)SEQ ID NO：30的信息：(i)序列特征：(A)长度：27碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：其他核酸(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：TGAGTAGAAT TCTAACGGCC GTCATTG         27(2)SEQ ID NO：31的信息：(i)序列特征：(A)长度：26碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：ACTGCGAGGA CCCCACTACC TTCTCC          26(2)SEQ ID NO：32的信息：(i)序列特征：(A)长度：20碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：GAACGTTGCC CATCATCATC                                                       20(2)SEQ ID NO：33的信息：(i)序列特征：(A)长度：15碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：否(iv)反义：否(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：AGTCTGCAGT TAAGG                                                            15(2)SEQ ID NO：34的信息：(i)序列特征：(A)长度：21碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：否(iv)反义：是(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：GGCTAGAGGC GAATTATCTG T                                                     21(2)SEQ ID NO：35的信息：(i)序列特征：(A)长度：21碱基对(B)类型：核酸(C)股性：单链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：否(iv)反义：是(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：CACCAAACAA AACAAGTGCC G             21(2)SEQ ID NO：36的信息：(i)序列特征：(A)长度：947碱基对(B)类型：核酸(C)股性：双链(D)拓扑结构：线性(ii)分子类型：cDNA(iii)假设：否(iv)反义：否(vi)最初来源：(A)有机体：人(ix)特征：(A)名称/检索符号：混合特征(B)位置：151(D)其他信息：/注意点＝″拼接位点受体。″(ix)特征：(A)名称/检索符号：混合特征(B)位置：458(D)其他信息：/注意点＝″拼接位点受体。″(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：ATGGAGCCGG CGGCGGGGAG CAGCATGGAG CCTTCGGCTG ACTGGCTGGC CACGGCCGCG           60GCCCGGGGTC GGGTAGAGGA GGTGCGGGCG CTGCTGGAGG CGGTGGCGCT GCCCAACGCA          120CCGAATAGTT ACGGTCGGAG GCCGATCCAG GTCATGATGA TGGGCAGCGC CCGAGTGGCG          180GAGCTGCTGC TGCTCCACGG CGCGGAGCCC AACTGCGCCG ACCCCGCCAC TCTCACCCGA          240CCCGTGCACG ACGCTGCCCG GGAGGGCTTC CTGGACACGC TGGTGGTGCT GCACCGGGCC          300GGGGCGCGGC TGGACGTGCG CGATGCCTGG GGCCGTCTGC CCGTGGACCT GGCTGAGGAG          360CTGGGCCATC GCGATGTCGC ACGGTACCTG CGCGCGGCTG CGGGGGGCAC CAGAGGCAGT          420AACCATGCCC GCATAGATGC CGCGGAAGGT CCCTCAGACA TCCCCGATTG AAAGAACCAG          480AGAGGCTCTG AGAAACCTCG GGAAACTTAG ATCATCAGTC ACCGAAGGTC CTACAGGGCC          540ACAACTGCCC CCGCCACAAC CCACCCCGCT TTCGTAGTTT TCATTTAGAA AATAGAGCTT          600TTAAAAATGT CCTGCCTTTT AACGTAGATA TAAGCCTTCC CCCACTACCG TAAATGTCCA          660TTTATATCAT TTTTTATATA TTCTTATAAA AATGTAAAAA AGAAAAACAC CGCTTCTGCC          720TTTTCACTGT GTTGGAGTTT TCTGGAGTGA GCACTCACGC CCTAAGCGCA CATTCATGTG          780GGCATTTCTT GCGAGCCTCG CAGCCTCCGG AAGCTGTCGA CTTCATGACA AGCATTTTGT          840GAACTAGGGA AGCTCAGGGG GGTTACTGGC TTCTCTTGAG TCACACTGCT AGCAAATGGC          900AGAACCAAAG CTCAAATAAA AATAAAATTA TTTTCATTCA TTCACTC                        947