利用溶血磷脂酰胆碱支架的组合物和方法
阅读：27发布：2021-09-16
专利汇可以提供利用溶血磷脂酰胆碱支架的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及利用溶血磷脂酰胆 碱 支架 的组合物和方法。所述组合物和方法可用于LPC介导的 脂肪酸 和其它分子递送；用于筛选和 鉴别 用于肠胃外营养的脂肪酸制剂；以及尤其用于活体动物器官成像。本发明还提供利用人Mfsd2a中的突变和多态性作为神经缺损的标记物的组合物和方法。，下面是利用溶血磷脂酰胆碱支架的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种筛选一种或多种化合物以确定经由Mfsd2a蛋白转运的方法，所述方法包括：
(a)使包含所述一种或多种化合物的生物混合物接触经基因修饰的小鼠和野生型小鼠，所述经基因修饰的小鼠的基因组中包含所述Mfsd2a基因的纯合破坏(KO小鼠)；
(b)测定所述KO小鼠和所述野生型小鼠的组织或流体中所述一种或多种化合物的量；
以及
(c)比较所述KO小鼠和所述野生型小鼠的所述组织或流体中所述一种或多种化合物的量，其中与所述KO小鼠相比，所述野生型小鼠中所述一种或多种化合物的量较高是经由Mfsd2a蛋白转运所述化合物的指示。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述KO小鼠不表达功能Mfsd2a蛋白。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物混合物来源于乳、鱼油提取物或LPC制剂。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述组织或流体是脑、眼、肝脏、心脏或母乳。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述接触方法是经口或经静脉内施用。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种化合物是营养补充剂。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述营养补充剂是LPC制剂。
8.一种筛选一种或多种化合物以确定经由Mfsd2a蛋白转运的方法，所述方法包括：
(a)使包含所述一种或多种化合物的生物混合物接触包含人野生型Mfsd2a cDNA或突变型人Mfsd2a cDNA的细胞系或mock转染的细胞；
(b)测定包含所述人野生型Mfsd2a cDNA的细胞和包含突变型人Mfsd2a cDNA的细胞或mock转染的细胞中所述一种或多种化合物的量；以及
(c)比较所述包含野生型Mfsd2a cDNA的细胞和包含突变型人Mfsd2a cDNA的细胞或mock转染的细胞中所述一种或多种化合物的量，其中与包含突变型人Mfsd2a cDNA的细胞或mock转染的细胞相比，所述包含野生型Mfsd2a cDNA的细胞中所述一种或多种化合物的量较高是经由Mfsd2a蛋白转运所述化合物的指示。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述细胞是HEK 293。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述突变型人Mfsd2a cDNA包含所述人Mfsd2a蛋白序列中D93或D97对应的位置处的突变。
11.一种包含一种或多种LPC组分的营养补充剂，所述LPC组分选自由以下组成的组：
LPC-16:0、LPC-18:0、LPC-18:1、LPC-18:2n-6、LPC-20:4n-6、LPC-22:6n-3、LPC-20:5n-3。
12.一种营养补充剂，所述营养补充剂包含浓度分别为37mM、14mM、10mM、20mM、4mM、
25mM和0.5mM的LPC-16:0、LPC-18:0、LPC-18:1、LPC-18:2n-6、LPC-20:4n-6、LPC-22:6n-3、LPC-20:5n-3。
13.根据权利要求11或12所述的营养组合物，还包含人白蛋白。
14.根据权利要求11或12或13所述的营养组合物，还包含选自由以下组成的另外脂质配方：IntralipidTM、SMOFKabivenTM、OmegavenTM、LipofundinTM、ClinOleicTM和LiposynTM。
15.一种包含一种或多种PC组分的营养补充剂，所述PC组分选自由以下组成的组：PC-
16:0、PC-18:0、PC-18:1、PC-18:2n-6、PC-20:4n-6、PC-22:6n-3、PC-20:5n-3。
16.一种营养补充剂，所述营养补充剂包含浓度分别为37mM、14mM、10mM、20mM、4mM、
25mM和0.5mM的PC-16:0、PC-18:0、PC-18:1、PC-18:2n-6、PC-20:4n-6、PC-22:6n-3、PC-20:
5n-3。
17.根据权利要求15或16所述的营养组合物，还包含人白蛋白。
18.根据权利要求15或16或17所述的营养组合物，还包含选自由以下组成的组的另外脂质配方：IntralipidTM、SMOFKabivenTM、OmegavenTM、LipofundinTM、ClinOleicTM和LiposynTM。
19.一种筛选调节通过Mfsd2a蛋白的转运的化合物的方法，所述方法包括：
(a)使包含人野生型Mfsd2a cDNA或突变型人Mfsd2a cDNA的细胞系或mock转染的细胞接触LPC-棕榈酸、LPC-油酸、LPC-硬脂酸、LPC-亚油酸、LPC-亚麻酸、LPC-花生四烯酸、LPC-二十二碳六烯酸或衍生物；
(b)测定在包含所述人野生型Mfsd2a cDNA的所述细胞和所述包含突变型人Mfsd2a cDNA的细胞或mock转染的细胞中在存在和不存在测试化合物的情况下，所述LPC-棕榈酸、LPC-油酸、LPC-硬脂酸、LPC-亚油酸、LPC-亚麻酸、LPC-花生四烯酸、LPC-二十二碳六烯酸或衍生物的摄入量；
其中与不存在所述测试化合物的情况相比，在存在所述测试化合物的情况下，包含所述人野生型Mfsd2a cDNA的细胞摄入LPC-棕榈酸、LPC-油酸、LPC-硬脂酸、LPC-亚油酸、LPC-亚麻酸、LPC-花生四烯酸、LPC-二十二碳六烯酸或衍生物的水平增加或减少，可将所述化合物鉴别为通过所述Mfsd2a蛋白的转运的调节物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞是HEK 293。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述突变型人Mfsd2a cDNA包含所述人Mfsd2a蛋白序列中D93或D97对应的位置处的突变。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述测试化合物通过所述Mfsd2a蛋白直接转运。
23.一种器官成像的方法，所述方法包括将标记支架或缀合物施用于受试者，以及测定所关注的器官中所述标记支架或缀合物的摄入量或与Mfsd2a蛋白的相互作用。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述支架是LPC。
25.根据权利要求23所述的方法，其中所述标记是荧光的。
26.根据权利要求23所述的方法，其中所述标记是经氟化的。
27.根据权利要求23所述的方法，其中所述器官是脑或眼。
28.根据权利要求23所述的方法，其中所述标记支架是Top-Fluor-LPC或NBD-LPC。
29.一种通过Mfsd2a蛋白转运化合物的方法，所述方法包括在足以允许支架或缀合物摄入的条件下将所述支架或缀合物提供给受试者。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述支架是LPC。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述化合物经由LPC的ω碳缀合至LPC。
32.根据权利要求29所述的方法，其中所述支架或缀合物跨过BBB或累积于BBB中。
33.根据权利要求29所述的方法，其中所述支架或缀合物累积于所述脑或眼部。
34.一种组合物，所述组合物包含缀合至化合物的支架。
35.根据权利要求34所述的组合物，其中所述支架是LPC。
36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述化合物经由LPC的ω碳缀合至LPC。
37.根据权利要求34所述的组合物，其中所述化合物是药剂。
38.根据权利要求34所述的组合物，其中所述化合物是成像剂。
39.一种评估受试者中神经缺损易感性增加的方法，所述方法包括：
(a)提供来自所述受试者的生物样品，其中所述样品包含Mfsd2a基因的全部或一部分；
以及
(b)检测所述样品中的所述Mfsd2a基因或其部分中突变或多态性的存在；以及(c)基于所述Mfsd2a基因或其部分中存在所述突变或多态性评估所述受试者的神经缺损易感性增加。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述突变是Thr159Met或Ser166Leu。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述多态性是表4、表6或表7中列出的单核苷酸多态性中的一种或多种。
42.根据权利要求39所述的方法，其中所述突变导致功能丧失。
43.根据权利要求39所述的方法，其中所述突变是Mfsd2a的亚效等位基因。
44.根据权利要求39所述的方法，其中所述神经缺损是记忆和学习的缺损或焦虑。
45.根据权利要求39所述的方法，其中所述受试者是怀孕前或妊娠期间的妇女。
46.根据权利要求45所述的方法，还包括如果所述Mfsd2a基因或其部分中存在所述突变或多态性，则施用高DHA饮食或用LPC经静脉或肠道进行治疗。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述LPC包括LPC-DHA。
48.根据权利要求39所述的方法，其中所述受试者是诊断为认知功能障碍的儿童或成人。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述认知功能是学习障碍或焦虑。
50.根据权利要求48所述的方法，还包括如果所述Mfsd2a基因或其部分中存在所述突变或多态性，则施用高DHA饮食或用LPC经静脉或肠道进行治疗。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述LPC包括LPC-DHA。
52.根据权利要求39所述的方法，其中所述检测包括使所述样品接触优先地与所述Mfsd2a基因或其部分杂交的寡核苷酸探针。
53.根据权利要求39所述的方法，其中所述检测包括通过PCR扩增所述Mfsd2a基因或其部分。
54.根据权利要求39所述的方法，其中所述检测包括对所述Mfsd2a基因、其部分或对应的Mfsd2a cDNA或其部分测序。
55.一种评估受试者的Mfsd2a蛋白的转运功能的方法，所述方法包括：
(a)在第一细胞中表达测试Mfsd2a cDNA，且在第二细胞中表达野生型Mfsd2a cDNA；
(b)使表达所述测试Mfsd2a cDNA的所述第一细胞和表达所述野生型Mfsd2a cDNA的所述第二细胞接触LPC-DHA或LPC-ω3脂肪酸；以及
(c)测定表达所述测试Mfsd2a cDNA的所述第一细胞和表达所述野生型Mfsd2a cDNA的所述第二细胞的LPC-DHA或LPC-ω3脂肪酸摄入，
其中与表达所述野生型Mfsd2a cDNA的所述第二细胞相比，表达所述测试Mfsd2a cDNA的所述第一细胞的LPC-DHA或LPC-ω3脂肪酸摄入水平减少表明所述测试Mfsd2a cDNA编码的蛋白缺失转运功能。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述测试Mfsd2a cDNA编码Thr159Met或Ser166Leu突变。
57.根据权利要求55所述的方法，其中所述测试Mfsd2a cDNA编码表4、表6或表7中列出的多态性中的一种或多种。
利用溶血磷脂酰胆碱支架的组合物和方法
[0001] 领域
[0002] 本发明涉及利用支架例如溶血磷脂酰胆碱支架的组合物和方法。该组合物和方法可用于LPC介导的脂肪酸和其它分子递送；用于筛选和鉴别用于肠胃外营养的脂肪酸制剂；以及用于活体动物器官成像。本发明还涉及利用人Mfsd2a中的突变和多态性作为神经缺损的标记物的组合物和方法。
[0003] 背景
[0004] 血流中包含多种脂质物类，它们以脂蛋白、白蛋白和其它脂质结合蛋白循环。血液中的多种脂质均为复合物，大部分物类属于磷脂、脂肪酸和鞘脂类。这些种类的多个成员具有结构作用(例如磷脂酰胆碱)和信号转导作用(例如鞘氨醇-1-磷酸)。一种对其在血液中的功能认知相对较少的脂质物类是溶血磷脂酰胆碱(LPC)。LPC在结构上由三种主要脂质组分构成：甘油、磷酸胆碱以及酯化为sn-1或sn-2羟基甘油的脂肪酸。在细胞膜内，大部分LPC通过经由磷脂酶A2合成sn-2位磷脂酰胆碱脂质中的脂肪酸部分来合成。新生成的LPC是通过经由溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)的酰化反应重新合成磷脂酰胆碱的前体，该反应构成了磷脂重塑的兰氏循环(Lands Cycle)。有人提出，兰氏循环对于调节膜性质，例如保持核膜中的磷脂中饱和脂肪酸的高水平是重要的。此外，兰氏循环也可起到保持细胞膜内LPC(对细胞是有毒的)的极低水平的作用。有趣的是，血液中LPC的水平非常高，人和啮齿动物中达到约100μM(Croset,M.,Brossard,N.,Polette,A.&Lagarde,M.Characterization of plasma unsaturated lysophosphatidylcholines in human and rat.The Biochemical Journal 345Pt 1,61-67(2000)；Quehenberger,O.等Lipidomics reveals a remarkable diversity of lipids in human plasma.Journal of lipid research 51,
3299-3305,doi:10.1194/jlr.M009449(2010))。少量的总血LPC通过卵磷脂-胆固醇酰基转移酶对高密度脂蛋白的作用以及通过脂蛋白相关的磷脂酶A2对低密度脂蛋白的作用以循环中的脂蛋白生成。人和啮齿动物血液中的大量LPC通过肝脏中磷脂酶A2的作用合成，它们在肝脏中以白蛋白分泌。人和啮齿动物中丰度最高的血液LPC是LPC-棕搁酸、硬脂酸和油酸。其它种类的非膜定位溶血脂质，例如溶血PE、溶血PI和溶血PS在血液中的水平极低，并且主要以脂蛋白循环。血液LPC的生理功能仍不清楚，但一些报道暗示在炎症、血管新生、细胞增殖和迁移中具有重要的信号转导作用。本文提供了LPC在包括营养在内的各种领域的新用途。
3299-3305,doi:10.1194/jlr.M009449(2010))。少量的总血LPC通过卵磷脂-胆固醇酰基转移酶对高密度脂蛋白的作用以及通过脂蛋白相关的磷脂酶A2对低密度脂蛋白的作用以循环中的脂蛋白生成。人和啮齿动物血液中的大量LPC通过肝脏中磷脂酶A2的作用合成，它们在肝脏中以白蛋白分泌。人和啮齿动物中丰度最高的血液LPC是LPC-棕搁酸、硬脂酸和油酸。其它种类的非膜定位溶血脂质，例如溶血PE、溶血PI和溶血PS在血液中的水平极低，并且主要以脂蛋白循环。血液LPC的生理功能仍不清楚，但一些报道暗示在炎症、血管新生、细胞增殖和迁移中具有重要的信号转导作用。本文提供了LPC在包括营养在内的各种领域的新用途。
[0005] 就营养而言，大部分低出生体重和极低出生体重的早产新生儿继续留在新生儿重症监护室(NICU)相当于妊娠的第三个三月期的时间。在此期间，不能经由胃肠道获得足够营养的早产婴儿需要肠胃外营养(PN)支持。据显示，早产婴儿营养不良在以后的生命中会对身体和智力发育造成很多不良后果，并且增加了心血管疾病和代谢紊乱的风险(Isaacs EB等(2008)The effect of early human diet on caudate volumes and IQ.Pediatric research 63(3):308-314；Lapillonne A&Griffin IJ(2013)Feeding preterm infants today for later metabolic and cardiovascular outcomes.The Journal of pediatrics 162(增刊3):S7-16.)。
[0006] 虽然儿科PN国际准则最近进行了修改并成为全世界的护理标准(Nutritional needs of the preterm infant:scientific basis and practical guidelines.Cincinnati:Digital Educational Publishing Inc.,OH.；Koletzko B,Goulet O,Hunt J,Krohn K,&Shamir R(2005)1.Guidelines on Paediatric Parenteral Nutrition of the European Society of Paediatric Gastroenterology,Hepatology and Nutrition(ESPGHAN)and the European Society for Clinical Nutrition and Metabolism(ESPEN),Supported by the European Society of Paediatric Research(ESPR).Journal of pediatric gastroenterology and nutrition 41增刊2:S1-87)，但在NICU中使用PN仍不足以满足早产婴儿的营养摄入是公知的(Martin CR等(2009)
Nutritional practices and growth velocity in the first month of life in extremely premature infants.Pediatrics 124(2):649-657；Olsen IE,Richardson DK,Schmid CH,Ausman LM,&Dwyer JT(2002)Intersite differences in weight growth velocity of extremely premature infants.Pediatrics 110(6):1125-1132)。重要的是，PN中营养物质的最佳组分仍不清楚(Beardsall K等(2008)Early insulin therapy in very-low-birth-weight infants.The New England journal of medicine 359(18):
1873-1884；Clark RH,Chace DH,&Spitzer AR(2007)Effects of two different doses of amino acid supplementation on growth and blood amino acid levels in premature neonates admitted to the neonatal intensive care unit:a randomized,controlled trial.Pediatrics 120(6):1286-1296)。护理标准是氨基酸、葡萄糖和脂质的制剂。脂质通常来源于大豆油(最多至20％)，并且在一些更新的制剂中，包含ω-3油(如，得自F的SUMFLipid)。大豆油提供能量脂肪酸，并且ω-3和ω-6脂肪酸前体合成为二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(ARA)，它们是脑发育必需的。前体脂肪酸转化为DHA和ARA依靠新生儿肝脏，通常肝脏功能缺乏且不能提供足够量的这些必需脂肪酸。本文提供了这些和其它营养问题的解决方案。
Nutritional practices and growth velocity in the first month of life in extremely premature infants.Pediatrics 124(2):649-657；Olsen IE,Richardson DK,Schmid CH,Ausman LM,&Dwyer JT(2002)Intersite differences in weight growth velocity of extremely premature infants.Pediatrics 110(6):1125-1132)。重要的是，PN中营养物质的最佳组分仍不清楚(Beardsall K等(2008)Early insulin therapy in very-low-birth-weight infants.The New England journal of medicine 359(18):
1873-1884；Clark RH,Chace DH,&Spitzer AR(2007)Effects of two different doses of amino acid supplementation on growth and blood amino acid levels in premature neonates admitted to the neonatal intensive care unit:a randomized,controlled trial.Pediatrics 120(6):1286-1296)。护理标准是氨基酸、葡萄糖和脂质的制剂。脂质通常来源于大豆油(最多至20％)，并且在一些更新的制剂中，包含ω-3油(如，得自F的SUMFLipid)。大豆油提供能量脂肪酸，并且ω-3和ω-6脂肪酸前体合成为二十二碳六烯酸(DHA)和花生四烯酸(ARA)，它们是脑发育必需的。前体脂肪酸转化为DHA和ARA依靠新生儿肝脏，通常肝脏功能缺乏且不能提供足够量的这些必需脂肪酸。本文提供了这些和其它营养问题的解决方案。
[0007] 此外，还阐明了Mfsd2a蛋白中的突变作为神经疾病和功能缺损的基础的作用。本文还公开了这些医学挑战的解决方案。
[0008] 概述
[0009] 本文公开了利用支架，例如溶血磷脂酰胆碱支架，进行通过Mfsd2a蛋白的转运的组合物和方法。该组合物和方法可用于LPC介导的脂肪酸和其它分子递送；筛选和鉴别用于肠胃外营养的脂肪酸制剂；以及尤其用于活体动物器官成像。本文还公开了利用人Mfsd2a中的突变和多态性作为神经缺损的标记物的组合物和方法。
[0010] 在第一方面，本文提供了筛选一种或多种化合物，以确定经由Mfsd2a蛋白转运的方法，该方法包括：(a)使待测试的生物混合物接触经基因修饰的小鼠和野生型小鼠，该经基因修饰的小鼠的基因组中包含Mfsd2a基因的纯合破坏(KO小鼠)；(b)测定KO小鼠和野生型小鼠的组织或流体中一种或多种化合物的量；以及(c)比较KO小鼠和野生型小鼠的组织或流体中该一种或多种化合物的量，其中与KO小鼠相比，野生型小鼠中该一种或多种化合物的量较高是经由Mfsd2a蛋白转运该化合物的指示。
[0011] 在一些实施方案中，KO小鼠不表达功能Mfsd2a蛋白。在一些实施方案中，生物混合物来源于乳、鱼油提取物或LPC制剂。在一些实施方案中，组织或流体是脑、肝脏、心脏或母乳。在一些实施方案中，接触方法是经口或经静脉内施用。
[0012] 在第二方面，本文提供了筛选一种或多种化合物，以确定经由Mfsd2a蛋白转运的方法，该方法包括：(a)使待测试的生物混合物接触包含人野生型Mfsd2a cDNA或突变型人Mfsd2a cDNA的细胞系或mock转染的细胞；(b)测定包含人野生型Mfsd2a cDNA的细胞和包含突变型人Mfsd2a cDNA的细胞或mock转染的细胞中该一种或多种化合物的量；以及(c)比较包含野生型Mfsd2a cDNA的细胞和包含突变型人Mfsd2a cDNA的细胞或mock转染的细胞中该一种或多种化合物的量，其中与包含突变型人Mfsd2a cDNA的细胞或mock转染的细胞相比，包含野生型Mfsd2a cDNA的细胞中该一种或多种化合物的量较高是经由Mfsd2a蛋白转运该化合物的指示。
[0013] 在一些实施方案中，细胞是HEK 293。在一些实施方案中，突变型人Mfsd2a cDNA包含人Mfsd2a蛋白序列中D93或D97对应的位置处的突变。
[0014] 在第三方面，本文提供了包含一种或多种LPC组分的营养补充剂，该LPC组分选自由以下组成的组：LPC-16:0、LPC-18:0、LPC-18:1、LPC-18:2n-6、LPC-20:4n-6、LPC-22:6n-3、LPC-20:5n-3。
[0015] 在第四方面，本文提供了包含浓度分别为37mM、14mM、10mM、20mM、4mM、25mM和0.5mM的LPC-16:0、LPC-18:0、LPC-18:1、LPC-18:2n-6、LPC-20:4n-6、LPC-22:6n-3、LPC-20:
5n-3的营养补充剂。
5n-3的营养补充剂。
[0016] 在第五方面，本文提供了包含一种或多种PC组分的营养补充剂，该PC组分选自由以下组成的组：PC-16:0、PC-18:0、PC-18:1、PC-18:2n-6、PC-20:4n-6、PC-22:6n-3、PC-20:5n-3。
[0017] 在第六方面，本文提供了包含浓度分别为37mM、14mM、10mM、20mM、4mM、25mM和0.5mM的PC-16:0、PC-18:0、PC-18:1、PC-18:2n-6、PC-20:4n-6、PC-22:6n-3、PC-20:5n-3的营养补充剂。
[0018] 在一些实施方案中，营养补充剂还包含人白蛋白。在一些实施方案中，营养补充剂还包含选自由以下组成的组的另外脂质配方:IntralipidTM、SMOFKabivenTM、OmegavenTM、LipofundinTM、ClinOleicTM和LiposynTM。
[0019] 在第七方面，本文提供了筛选调节通过Mfsd2a蛋白的转运的化合物的方法，该方法包括：(a)使包含人野生型Mfsd2a cDNA或突变型人Mfsd2a cDNA的细胞系或mock转染的细胞接触LPC-棕搁酸、LPC-油酸、LPC-硬脂酸、LPC-亚油酸、LPC-亚麻酸、LPC-花生四烯酸、LPC-二十二碳六烯酸或衍生物；(b)测定在包含人野生型Mfsd2a cDNA的细胞和包含突变型人Mfsd2a cDNA的细胞或mock转染的细胞中在存在和不存在测试化合物的情况下，LPC-棕搁酸、LPC-油酸、LPC-硬脂酸、LPC-亚油酸、LPC-亚麻酸、LPC-花生四烯酸、LPC-二十二碳六烯酸或衍生物的摄入量；其中与不存在测试化合物的情况相比，在存在测试化合物的情况下，包含人野生型Mfsd2a cDNA的细胞摄入LPC-棕搁酸、LPC-油酸、LPC-硬脂酸、LPC-亚油酸、LPC-亚麻酸、LPC-花生四烯酸、LPC-二十二碳六烯酸或衍生物的水平增加或减少，可将该化合物鉴别为通过Mfsd2a蛋白的转运的调节物。
[0020] 在一些实施方案中，细胞是HEK 293。在一些实施方案中，突变型人Mfsd2a cDNA包含人Mfsd2a蛋白序列中D93或D97对应的位置处的突变。在一些实施方案中，测试化合物通过Mfsd2a蛋白直接转运。
[0021] 在第八方面，本文提供了器官成像的方法，该方法包括将标记支架或缀合物施用于受试者，以及测定所关注的器官中该标记支架或缀合物的摄入量或与Mfsd2a蛋白的相互作用。
[0022] 在一些实施方案中，支架是LPC。在一些实施方案中，标记是荧光的。在一些实施方案中，标记是经氟化的。在一些实施方案中，器官是脑或眼。在一些实施方案中，标记支架是Top-Fluor-LPC或NBD-LPC。
[0023] 在第九方面，本文提供了通过Mfsd2a蛋白转运化合物的方法，该方法包括在足以允许支架或缀合物摄入的条件下将支架或缀合物提供给受试者。
[0024] 在一些实施方案中，支架是LPC。在一些实施方案中，化合物经由LPC的ω碳缀合至LPC。在一些实施方案中，支架或缀合物跨过BBB或累积于BBB中。在一些实施方案中，支架或缀合物累积于脑或眼部。
[0025] 在第十方面，本文提供了包含缀合至化合物的支架的组合物。
[0026] 在一些实施方案中，支架是LPC。在一些实施方案中，化合物经由LPC的ω碳缀合至LPC。在一些实施方案中，化合物是药剂。在一些实施方案中，化合物是成像剂。
[0027] 在第十一方面，本文提供了评估受试者中神经缺损易感性增加的方法，该方法包括：(a)提供来自受试者的生物样品，其中该样品包含Mfsd2a基因的全部或一部分；以及(b)检测样品中的Mfsd2a基因或其部分中突变或多态性的存在；以及(c)基于Mfsd2a基因或其部分中存在突变或多态性评估受试者的神经缺损易感性增加。
[0028] 在一些实施方案中，突变是Thr159Met或Ser166Leu。在一些实施方案中，多态性是表4、表6或表7中列出的单核苷酸多态性中的一种或多种。在一些实施方案中，突变导致功能丧失。在一些实施方案中，突变是Mfsd2a的亚效等位基因。
[0029] 在一些实施方案中，神经缺损是记忆和学习的缺损或焦虑。
[0030] 在一些实施方案中，受试者是怀孕前或妊娠期间的妇女。
[0031] 在一些实施方案中，方法还包括如果Mfsd2a基因或其部分中存在突变或多态性，则施用高DHA饮食或用LPC经静脉或肠道进行治疗。在一些实施方案中，LPC包括LPC-DHA。
[0032] 在一些实施方案中，受试者是诊断为认知功能障碍的儿童或成人。在一些实施方案中，认知功能是学习障碍或焦虑。
[0033] 在一些实施方案中，检测包括使样品接触优先地与Mfsd2a基因或其部分杂交的寡核苷酸探针。在一些实施方案中，检测包括通过PCR扩增Mfsd2a基因或其部分。在一些实施方案中，检测包括对Mfsd2a基因、其部分或对应的Mfsd2a cDNA或其部分测序。
[0034] 在第十二方面，本文提供了评估受试者的Mfsd2a蛋白的转运功能的方法，该方法包括：(a)在第一细胞中表达测试Mfsd2a cDNA，且在第二细胞中表达野生型Mfsd2a cDNA；(b)使表达测试Mfsd2a cDNA的第一细胞和表达野生型Mfsd2a cDNA的第二细胞接触LPC-DHA或LPC-ω3脂肪酸；以及(c)测定表达测试Mfsd2a cDNA的第一细胞和表达野生型Mfsd2a cDNA的第二细胞的LPC-DHA或LPC-ω3脂肪酸摄入，其中与表达野生型Mfsd2a cDNA的第二细胞相比，表达测试Mfsd2a cDNA的第一细胞的LPC-DHA或LPC-ω3脂肪酸摄入水平减少表明测试Mfsd2a cDNA编码的蛋白缺失转运功能。
[0035] 在一些实施方案中，测试Mfsd2a cDNA编码Thr159Met或Ser166Leu突变。在一些实施方案中，测试Mfsd2a cDNA编码表4、表6或表7中列出的多态性中的一种或多种。
[0037] 图1.Mfsd2a定位于KO小鼠的血脑屏障和神经缺损部位。a,Mfsd2a(红色)高度富集于脑微脉管，此处示出存在于CA1区域，其中成熟神经元被NeuN染色(绿色)。b,c,Mfsd2a在紧密接触星形细胞终足的血脑屏障的内皮细胞中表达，如GFAP染色所示。d,小白蛋白(Pvalb)染色检测到KO小鼠小脑中的浦肯野细胞丧失。e,WT和KO小鼠的小脑中浦肯野细胞的定量。***P<0.001。f,8周龄WT和KO小鼠的矢状脑切片的海马区NeuN染色表明，KO小鼠的特定海马区中的成熟神经元减少。g,上述(f)检查的小鼠的CA1、CA3和齿状回(DG)区域中神经元的定量。***P<0.001。数据以平均值±SEM表示。
[0038] 图2.Mfsd2a KO小鼠的脑缺失DHA。MFSD2a敲除(KO)和野生型(WT)成体小鼠的脑、肝脏和心脏磷脂的全面脂质组分析。a,以热图表示所测定的脑、肝脏和心脏中单个磷脂物类的百分比。含DHA的物质和含AA的物类分别以红色和蓝色突出显示。LysoPC：溶血磷脂酰胆碱、PC：磷脂酰胆碱、LysoPE：溶血磷脂酰乙醇胺、PE：磷脂酰乙醇胺、LysoPI：溶血磷脂酰肌醇、PI：磷脂酰肌醇、PS：磷脂酰丝氨酸、p：缩醛磷脂、e：酯。b,d,f,脑、肝脏和心脏磷脂中的总DHA水平(WT,n＝5；KO,n＝4)。c,e,f,脑、肝脏和心脏中的总AA水平***P<0.0001，**P<0.01，*P<0.05。DHA和AA水平以总磷脂水平的百分比的平均值±SEM表示。参见表2。
[0039] 图3.放射性标记LPC的基于细胞的转运测定。a,b,c,在30分钟后，LPC-[14C]DHA、LPC-[14C]油酸、LPC-[3H]棕榈酸的浓度依赖性转运。测试指定浓度下小鼠Mfsd2a(WT)和突变型构建体D92A、D96A的放射性标记LPC的摄入量。d,LPC-[14C]DHA、LPC-[14C]油酸、LPC-[3H]棕榈酸的转运偏好比较。e,放射性标记LPC-[14C]DHA的生物掺入。f,如e所示的TLC板的PC条带的定量。g,LPC-[14C]油酸生物掺入到磷脂酰胆碱。h,f,如g所示的TLC板的PC条带的定量。i,小鼠Mfsd2a的转运活性是钠依赖性的(Ch+表示胆碱)。k,通过Mfsd2a转运50μM LPC-[14C]油酸的钠浓度依赖性的剂量响应曲线。对于a-d,f,h,i,k，三组数据以平均值±SEM表示。***P<0.0001。
[0040] 图4.在KO小鼠中，脑的放射性标记LPC摄入量减少。a,给6-7周龄雄性小鼠静脉注射相同剂量的LPC-[14C]DHA和b,LPC-[14C]油酸。在注射2小时后收集脑、肝脏和心脏进行脂质提取，并使用闪烁计数进行DPM定量。摄入量以平均值±SEM表示。(WT,n＝5；KO,n＝5)。***P<0.0001，*P<0.05。c,荧光NBD-LPC的结构。d,与mock(空质粒)、D92A和D96A突变体相比，表达野生型Mfsd2a的HEK293细胞显示出NBD-LPC的摄入活性显著增加。e,TLC分析显示，NBD-LPC生物掺入到PC。NBD-LPC的转运被10倍摩尔过量的LPC-18:0(冷)抑制。突变体D92A、D96A具有与mock转染的细胞相似的NBD-LPC转运活性。f,如e所示的TLC板的PC条带的定量。g,在KO小鼠中，脑的NBD-LPC摄入量减少。给6周龄雄性小鼠(WT,n＝3；KO,n＝3)静脉注射300μg NBD-LPC/BSA复合物。h,对WT和KO小鼠的十五个脑切片的荧光定量，并以荧光强度/像素表示。数据以平均值±SEM表示。**P<0.001。
[0041] 图5.Mfsd2a在脑中的微脉管的内皮中大量表达。a,Mfsd2a的表达与葡萄糖转运蛋白Slc2a1(Glut1)一起共定位于内皮中。三角示出了血脑血管中的内皮细胞。比例尺：5μm。b,Mfsd2a在脑中的微脉管中大量表达，此处示出了齿状回区域中的切片。比例尺：50μm。c,Mfsd2a和周细胞标记物Pdgfr-b共定位于脑微脉管中，但如面板d所示，Mfsd2a未在周细胞中表达。面板d中的黄色和红色三角分别表示内皮细胞和周细胞。(c中的比例尺：20μm；d中的比例尺：5μm)。
[0042] 图6.Mfsd2a的相似表达模式存在于猴子脑中的微脉管的内皮中。a,Mfsd2a在微脉管中大量表达，并且与葡萄糖转运蛋白Slc2a1(Glut1)一起共定位于脑中，此处示出了P4猴子小脑中的切片。比例尺；200μm。b,c,Mfsd2a在脑微脉管的内皮中表达。图中示出了海马区。GFAP是星形细胞标记物。
[0043] 图7.Mfsd2a在e15.5胚胎BBB中的定位和脂质分析。a,Mfsd2a(红色)在微脉管中大量表达，并且与葡萄糖转运蛋白Slc2a1(Glut1，绿色)一起共定位于胚胎脑中。比例尺：100μm。b,WT(n＝6)和KO(n＝5)的e18.5胚胎脑中磷脂的质谱测定显示，KO胚胎脑的DHA水平显著减少，而AA水平增加。***P<0.001。参见源文件的完整数据集。
[0044] 图8.示出了a,胎盘和胚胎重量。收集与KO雄鼠杂交的两只HET妊娠小鼠(E18.5)的胎盘和胚胎并称重。HET(n＝7)和KO(n＝11)之间的胎盘和胚胎重量无显著差异。b,使用悬尾实验测试10周龄WT和KO小鼠中钩爪表型的存在。
[0045] 图9.示出了a,两只8周龄WT和KO同窝仔鼠的脑的代表性图像。b,KO(n＝4)小鼠的脑重量显著小于WT(n＝4)同窝仔鼠。***P<0.001。数据以平均值±SEM表示。c,脑的总体形态和矢状脑切片。8周龄WT和KO小鼠的矢状脑切片用NeuN染色以观察神经元细胞，用Mfsd2a多克隆抗体杂交以观察Mfsd2a的表达。图中显示，Mfsd2a在脑中广泛表达。比例尺：1mm。d,8周龄WT和KO小鼠的海马区的H&E染色表明，KO小鼠的海马区较小。比例尺：500μm。
[0046] 图10.Mfsd2a KO小鼠表现出学习、记忆的缺损和严重焦虑。a,b,Y-迷宫测验和c,d,新物体认知测试分别用于评估WT和KO小鼠的空间学习、短期记忆(STM)和长期记忆(LTM)。KO小鼠在空间工作记忆的Y迷宫测验中表现出进臂总次数显著减少。KO小鼠在新物体认知测试中显示出对新物体的偏好显著减少，分别表明短期记忆和长期记忆出现了缺陷。“训练”表示训练期。e-h,零迷宫测验、i-m,明/暗箱测试分别用于评估WT和KO小鼠的焦虑。KO小鼠在焦虑行为的零迷宫测验期间显示出穿梭进入开放臂和低头进入开放臂减少。KO小鼠在焦虑的明/暗箱测试期间显示出进入明箱减少以及延迟进入明箱增加。m-o,活动行为的旷场试验。KO小鼠在自发活动行为的旷场试验中显示出行进距离减少。在旷场试验期间，与WT小鼠相比，KO小鼠无垂直活动，表明活动机能障碍，并且在中心停留的时间减少，表明探索减少。在旷场角落停留的时间增加暗示KO小鼠比WT小鼠更焦虑，这与零迷宫测验和明/暗箱测试的结果一致。WT小鼠(n＝11-13)和KO小鼠(n＝8-10)。***P<0.001，**P<
0.01，*P<0.05。数据以平均值±SEM表示。
0.01，*P<0.05。数据以平均值±SEM表示。
[0047] 图11a至图11e.通过质谱分析单个磷脂物类。Mfsd2a敲除(KO，n＝4，阴影条)和野生型(WT，n＝5，空心条)同窝仔鼠的脑、肝脏和心脏磷脂的全面脂质组分析。LysoPC：溶血磷脂酰胆碱、PC：磷脂酰胆碱、LysoPE：溶血磷脂酰乙醇胺、PE：磷脂酰乙醇胺、LysoPI：溶血磷脂酰肌醇、PI：磷脂酰肌醇、PS：磷脂酰丝氨酸、p：缩醛磷脂、e：酯。脂肪酸水平以对应器官中的总磷脂的百分比计算，并以平均值±SEM表示。叠置图用于表示WT与KO小鼠的相同脂肪酸物类的差异。
[0048] 图12.Mfsd2a不转运未酯化的脂肪酸。a,在用100μM[14C]-DHA过夜温育后，转染有小鼠Mfsd2a和人Mfsd2a的HEK293细胞的磷脂和中性脂质的薄层色谱(TLC)分析。标准品：游14 14
离的[ C]-DHA。b.在用100μM[ C]-油酸过夜温育后，转染有小鼠Mfsd2a和突变体的HEK293细胞的磷脂和中性脂质的TLC分析。所用的TLC方案在方法中描述。PC：磷脂酰胆碱、PE：磷脂酰乙醇胺、TAG：甘油三酯、CE：胆固醇酯。
离的[ C]-DHA。b.在用100μM[ C]-油酸过夜温育后，转染有小鼠Mfsd2a和突变体的HEK293细胞的磷脂和中性脂质的TLC分析。所用的TLC方案在方法中描述。PC：磷脂酰胆碱、PE：磷脂酰乙醇胺、TAG：甘油三酯、CE：胆固醇酯。
[0049] 图13.在转染24小时后，小鼠Mfsd2a和突变体在HEK293细胞中的表达和定位。a,Mfsd2a、D92A和D96A在质膜的定位(红色)。b,在转染24小时后，Mfsd2a、D92A和D96A在HEK293细胞中的表达的Western印迹分析。
[0050] 图14.人Mfsd2a的LPC转运活性。a,放射性标记LPC-[14C]DHA和c,LPC-[14C]油酸生物掺入到磷脂酰胆碱(PC)。表达人Mfsd2a的细胞用LPC-[14C]DHA或50μM LPC-[14C]油酸温育。在用LPC-[14C]DHA温育30分钟以及用LPC-[14C]油酸温育120分钟后，从细胞提取脂质，并使用TLC法分析磷脂酰胆碱(PC)和溶血磷脂酰胆碱(LPC)。通过表达人Mfsd2a(hMfsd2a)14 3
和空质粒(mock)的HEK293进行b,LPC-[ C]DHA和d,LPC-[ H]油酸的剂量依赖性转运。
和空质粒(mock)的HEK293进行b,LPC-[ C]DHA和d,LPC-[ H]油酸的剂量依赖性转运。
[0051] 图15.LPC的时间依赖性和大量转运。a,50μM LPC-[14C]油酸的时间依赖性转运。b,表达Mfsd2a的细胞中LPC配体的净摄入量增加。在用100μM未标记的LPC-油酸温育1小时后，转染有小鼠Mfsd2a和突变体的HEK293细胞的磷脂的薄层色谱(TLC)分析。所示数字为PC水平相对于mock的倍数变化。标准PC：磷脂酰胆碱，LPC：溶血磷脂酰胆碱。
[0052] 图16.Mfsd2a的转运活性不是质子依赖性的和锂依赖性的。a,在指定pH下，表达小鼠Mfsd2a(WT)、D92A、D96A和mock的细胞的转运活性无显著差异。b,Mfsd2a的活性是钠依赖性的，但不是锂依赖性的。数据以相同条件处理的表达Mfsd2a的细胞相对于对应的mock细胞的倍数变化表示。c,Mfsd2a的转运活性不是BSA依赖性的，因为溶解于乙醇或胶束形式的LPC-棕榈酸通过Mfsd2a转运，尽管水平低于BSA。
[0053] 图17.确定Mfsd2a的配体结构的竞争分析。所有竞争分析使用25μM LPC-[3H]棕榈酸作为配体，在存在或不存在10倍摩尔过量(250μM)的指定竞争剂的条件下进行。a,b和c所用的脂质竞争剂的结构。b,指定酰基链LPC的竞争分析。c,指定头部基团的竞争分析。分析在30分钟温育后停止。竞争活性以对照(不存在无竞争剂情况下的Mfsd2a的活性)的百分比表示。LPC：溶血磷脂酰胆碱、LPE：溶血磷脂酰乙醇胺、LPS：溶血磷脂酰丝氨酸、LPA：溶血磷脂酸、6:0：己酸、8:0：癸酸、10:0：辛酸、12:0：月桂酸、14:0：肉豆蔻酸、16:0：棕榈酸、18:0：硬脂酸、18:1：油酸。GPC：α-甘油磷酸胆碱。d,e和f所用的生物活性脂质竞争剂的代表性结构。e,溶血磷脂形式的缩醛磷脂和血小板活化因子(PAF)的竞争分析。该实验与b一起进行，从而如b所示的对照和mock可作为基准。f,PAF和溶血鞘磷脂(溶血SM)还显示出强竞争，而鞘氨醇1-磷酸(S1P)不竞争LPC-[3H]16:0的摄入。竞争活性以对照(不存在无竞争剂情况下的Mfsd2a的活性)的百分比表示。g,具有16个碳原子烷基链的非生物溶血磷脂类似物foscholine-16(米替福新，Miltefosine)的代表性结构。h,指定foscholine与LPC-[3H]棕榈酸结合的竞争分析。分析在15分钟温育后停止。竞争活性以对照(不存在无竞争剂情况下的Mfsd2a的活性)的百分比表示。烷基链长度为8(Fos-8)、10(Fos-10)和12(Fos-12)个碳原子的foscholine不竞争，而烷基链长度为16个碳原子的foscholine(Miltefosine)显示出
3
强竞争LPC-[ H]16:0。数据以平均值±SEM表示；***P<0.001。
3
强竞争LPC-[ H]16:0。数据以平均值±SEM表示；***P<0.001。
[0054] 图18.在用25μM TopFluor-LPE温育30分钟后，转染有小鼠Mfsd2a和突变体的HEK293细胞的磷脂的薄层色谱(TLC)分析。a,磷脂的TLC分析。b,TLC板的PC条带的强度定量。PE：磷脂酰乙醇胺、LPE：溶血磷脂酰乙醇胺。
[0055] 图19.在Mfsd2a缺失小鼠中，脑的未酯化的[14C]DHA摄入量未减少。给7周龄雄性小鼠静脉注射1mmol[14C]DHA/BSA复合物。在注射2小时后收集脑、肝脏和心脏进行脂质提取，并使用闪烁计数进行DPM定量。a-c,WT和KO脑、心脏和肝脏的未酯化的[14C]DHA摄入，以DPM/g表示。d-f,将“a-c”中的DHA摄入水平转换为nmol/g。g-i,WT小鼠的脑、心脏和肝脏的LPC-DHA(图4的数据转换为2小时内的nmol/g)和未酯化的DHA(数据取自上述d-f)形式的DHA绝对摄入量之间的比较。给小鼠注射相同量的LPC-DHA和DHA。野生型脑的LPC-DHA摄入量远大于未酯化的DHA摄入量。数据以平均值±SEM表示。(WT,n＝5；KO,n＝5)。***P<0.0001，*P<0.05。
[0056] 图20.在Mfsd2a缺失小鼠中，脑的未酯化的TopFluor-LPC摄入量减少。该实验如图4中NBD-LPC的描述进行。a,TopFluor-LPC的结构。b,与mock(空质粒)、D92A和D96A突变体相比，表达野生型Mfsd2a的HEK293细胞显示出TopFluor-LPC摄入活性显著增加。c,TLC分析显示，TopFluor-LPC生物掺入到PC。d,如c所示的TLC板的PC条带的定量。e,在KO小鼠中，脑的TopFluor-LPC摄入量减少。给7周龄雄性小鼠(WT,n＝3；KO,n＝3)静脉注射300μg TopFluor-LPC/BSA复合物。f,对WT和KO小鼠的10个脑切片的荧光进行定量，并以荧光强度/像素表示。数据以平均值±SEM表示。**P<0.001。
[0057] 图21.膳食DHA补充剂不能挽救Mfsd2a敲除表型。在与KO雄性小鼠交配怀孕前，给杂合雌性小鼠每2天管饲100ul DHA油(包含26％DHA甘油三酯和6％EPA，总ω-3为35％)达2周。杂合小鼠未表现出可检测的表型，具有与WT小鼠(未示出)相似的脑DHA，因此表型与WT相似。在该挽救研究中使用HET和KO杂交的理论基础是增加KO小鼠的产率。在孕育期间，继续给妊娠小鼠每2天管饲DHA。在哺乳期间继续管饲母鼠，幼鼠在3周龄时断奶，给予正常饮食，每2天管饲DHA达8周。a,在膳食DHA油处理后，8周龄WT(n＝4)和KO(n＝4)成体小鼠的脑重量。KO小鼠脑仍显著较小。b-e,如使用明/暗箱测试所确定，DHA处理的KO小鼠的强焦虑表型未减少。为研究为什么膳食DHA不能挽救KO表型，我们验证了如下假设：源自母方的DHA(在这种情况下为经由管饲递送至母鼠的DHA)的摄入在脑发育期间不能进入KO小鼠的脑。为验证该可能性，给与KO父鼠杂交的e17.5-e19.5妊娠het母鼠管饲[14C]DHA，并测定胚胎脑的摄入量。f所示的数据表明，在相同的母鼠内，相对于het小鼠，KO小鼠的脑表现出[14C]DHA摄入量减少80％(n＝4WT,n＝6KO)。因此，在胚胎发育期间表达的Mfsd2a对于DHA转运到脑是重要的。数据以平均值±SEM表示。*P<0.05。***P<0.001。
[0058] 图22.Mfsd2a纯合突变的人类表现出严重的小头畸形。a,Thr159Met突变的埃及人血缘家庭的系谱。系谱中的黑色对象表示受影响的儿童。系谱右边的图片是系谱上#2所示的受影响的女孩。b,使用MRI扫描的脑结构图像，其示出了受影响的儿童中的严重的小头畸形和脑积水。注意到皮层较小且缺少脑褶。这些数据来自Zaki M S等Brain 2012；135:2416-2427，其中可找到其它临床数据。c,具有纯合Ser166Leu突变的利比亚人家庭的非血缘儿童的脑MRI图像。注意到这两个非血缘患者之间表型的相似性。
[0059] 图23.MFSD2A突变导致严重的小头畸形和脑室扩张。(A)血缘家庭1422和1825的每代以数字标明。圆形：女性，方形：男性，斜线：死亡，星号：取样。(B)上图：轴向MRI，下图：旁矢状MRI。图像显示，在所有受影响的儿童中，侧脑室(星号)极度扩张，并且胼胝体和脑干(三角)以及小脑(箭头)发育不良。(C)MFSD2A基因的外显子结构和患病突变的位置(D)人、小鼠、鱼和细菌的MFSD2A的直系同源体的氨基酸序列比对，其示出了残基T159和S166的保守性。(E)突变相对于预测蛋白质的位置。TM：跨膜域，橙色：主要协同转运蛋白超家族域、通用底物转运蛋白域。
[0060] 图24.MFSD2A p.T159M和p.S166L突变显示出LPC转运被破坏。(A)在HEK293细胞中表达的MFSD2A(WT)、突变型p.T159M和p.S166L蛋白的Western印迹。突变型蛋白显示出翻译后修饰和稳定性与野生型无差别。(B)突变型蛋白显示出在转染的HEK293细胞中的膜定位与野生型无差别。(C)使用MelB的原子分辨率结构作为模板，从穿线模型产生的人MFSD2A的内部腔体视图。跨膜域II包含保守的钠结合残基D93和D97。跨膜域IV包含T159和S166残基。在30分钟后，LPC-[14C]DHA(D)LPC-[14C]油酸(E)和LPC[14C]棕榈酸(F)的浓度依赖性转运。
突变型构建体p.T159M和p.S166L显示出在一系列浓度范围内存在转运缺陷。(G)与WT相比，突变体和mock显示出，放射性标记LPC-[14C]油酸生物掺入到磷脂酰胆碱(PC)的减少。从表达mock、p.T159M和p.S166L的细胞中观察到大量LPC，反映出LPC摄入存在缺陷。(G)所示的TLC板的放射性标记PC(H)和LPC(I)条带的定量。实验分三组进行两次。数据以平均值±SEM表示。***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。
突变型构建体p.T159M和p.S166L显示出在一系列浓度范围内存在转运缺陷。(G)与WT相比，突变体和mock显示出，放射性标记LPC-[14C]油酸生物掺入到磷脂酰胆碱(PC)的减少。从表达mock、p.T159M和p.S166L的细胞中观察到大量LPC，反映出LPC摄入存在缺陷。(G)所示的TLC板的放射性标记PC(H)和LPC(I)条带的定量。实验分三组进行两次。数据以平均值±SEM表示。***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05。
[0061] 图25.总血浆LPC和单个LPC物类的脂质组质谱分析。WT(n＝5)和Mfsd2a KO(n＝5)小鼠的总血浆LPC(A)和常见C16-22链长LPC物类(B)的浓度，技术重复3次。(C)相对于WT(n＝3)同窝仔鼠，Mfsd2a KO小鼠(n＝4)的血浆中，注射的LPC[14C]油酸随时间推移的定量。对照、来自家庭1422和1825的未受影响的亲代和受影响的个体的总血浆LPC(D)和常见LPC物类(E)浓度。对不同的日子收集的两个独立的血浆样品进行一次分析，技术重复3次。*P<0.05，**P<0.01，***P<0,001。
[0062] 图26.受影响的个体的纯合性图谱。纯合性图谱显示，来自家庭1422和1825的具有纯合MFSD2A突变的受影响的个体以纯合块(红色)表示。灰色：所有受影响的个体中包括MFSD2A重叠的纯合块。箭头：MFSD2A的位置。
[0063] 图27.父亲(杂合)、受影响的(纯合)和未受影响的同胞或非血缘对照(正常纯合基准)的Sanger测序色谱图，其示出了突变(箭头)。
[0064] 图28.MFSD2A在人胎儿脑中的微脉管的内皮细胞中表达。MFSD2A(红色)在内皮中大量表达，并且与葡萄糖转运蛋白GLUT1(绿色)一起共定位于人胎儿脑中。箭头示出了血脑血管中的内皮细胞。比例尺20μm。
[0065] 图29.MFSD2A在人组织中的表达。整个成人组织的RT-PCR显示在除骨骼肌和心脏之外的所有测试组织中均有表达。GAPDH用作上样对照。
[0066] 详述
[0067] 前言
[0068] 二十二碳六烯酸(DHA)是正常脑生长和认知功能必需的ω-3脂肪酸(Kidd,P.M.Omega-3DHA and EPA for cognition,behavior,and mood:clinical findings and structural-functional synergies with cell membrane phospholipids.Alternative medicine review:a journal of clinical therapeutic 12,207-227(2007)；Horrocks,L.A.&Yeo,Y.K.Health benefits of docosahexaenoic acid(DHA).Pharmacological research:the official journal of the Italian Pharmacological Society 40,211-
225,doi:10.1006/phrs.1999.0495(1999)；Mozaffarian,D.&Wu,J.H.Omega-3fatty acids and cardiovascular disease:effects on risk factors,molecular pathways,and clinical events.Journal of the American College of Cardiology 58,2047-2067,doi:10.1016/j.jacc.2011.06.063(2011)；Connor,W.E.Importance of n-3fatty acids in health and disease.The American journal of clinical nutrition 71,171S-175S(2000))。脑磷脂中高度富含DHA，这与其在脑中的重要性一致(Breckenridge,W.C.,Gombos,G.&Morgan,I.G.The lipid composition of adult rat brain synaptosomal plasma membranes.Biochim Biophys Acta 266,695-707(1972)；Innis,S.M.Dietary(n-
3)fatty acids and brain development.The Journal of nutrition 137,855-859(2007)；Salem,N.,Jr.,Litman,B.,Kim,H.Y.&Gawrisch,K.Mechanisms of action of docosahexaenoic acid in the nervous system.Lipids 36,945-959(2001))。尽管在脑磷脂中DHA是高丰度的脂肪酸，但不能在脑中从头合成，必须跨过血脑屏障输入，但DHA摄入脑的机制仍不清楚。在本文中，我们将主要协同转运蛋白超家族成员Mfsd2a(此前的孤儿转运蛋白，我们已示出它只在微脉管的血脑屏障的内皮中表达)鉴别为DHA摄入脑的主要转运蛋白。脂质组分析表明，Mfsd2a缺失小鼠(KO)的脑中DHA的水平显著减少，并且兼有海马区和小脑中的神经细胞丧失，以及神经和严重行为障碍，更重要的是脑尺寸减小。出乎意料的是，基于细胞的研究表明，Mfsd2a以溶血磷脂酰胆碱(LPC)的形式转运DHA，而不是以钠依赖性方式转运未酯化的脂肪酸。值得注意的是，Mfsd2a转运携带长链脂肪酸的常见血浆LPC，例如LPC-油酸和LPC-棕榈酸，而不是具有小于14个碳原子的酰基链的LPC。此外，我们确定磷光体-LPC的两性离子头部基团对于转运是关键的。重要的是，从KO小鼠的血浆进入脑的标记LPC-DHA和其它LPC的摄入量显著减少，表明Mfsd2a对于脑摄入DHA是必须的。我们的发现揭示，血浆衍生的LPC在脑生长和功能中具有出乎意料的重要生理作用。
225,doi:10.1006/phrs.1999.0495(1999)；Mozaffarian,D.&Wu,J.H.Omega-3fatty acids and cardiovascular disease:effects on risk factors,molecular pathways,and clinical events.Journal of the American College of Cardiology 58,2047-2067,doi:10.1016/j.jacc.2011.06.063(2011)；Connor,W.E.Importance of n-3fatty acids in health and disease.The American journal of clinical nutrition 71,171S-175S(2000))。脑磷脂中高度富含DHA，这与其在脑中的重要性一致(Breckenridge,W.C.,Gombos,G.&Morgan,I.G.The lipid composition of adult rat brain synaptosomal plasma membranes.Biochim Biophys Acta 266,695-707(1972)；Innis,S.M.Dietary(n-
3)fatty acids and brain development.The Journal of nutrition 137,855-859(2007)；Salem,N.,Jr.,Litman,B.,Kim,H.Y.&Gawrisch,K.Mechanisms of action of docosahexaenoic acid in the nervous system.Lipids 36,945-959(2001))。尽管在脑磷脂中DHA是高丰度的脂肪酸，但不能在脑中从头合成，必须跨过血脑屏障输入，但DHA摄入脑的机制仍不清楚。在本文中，我们将主要协同转运蛋白超家族成员Mfsd2a(此前的孤儿转运蛋白，我们已示出它只在微脉管的血脑屏障的内皮中表达)鉴别为DHA摄入脑的主要转运蛋白。脂质组分析表明，Mfsd2a缺失小鼠(KO)的脑中DHA的水平显著减少，并且兼有海马区和小脑中的神经细胞丧失，以及神经和严重行为障碍，更重要的是脑尺寸减小。出乎意料的是，基于细胞的研究表明，Mfsd2a以溶血磷脂酰胆碱(LPC)的形式转运DHA，而不是以钠依赖性方式转运未酯化的脂肪酸。值得注意的是，Mfsd2a转运携带长链脂肪酸的常见血浆LPC，例如LPC-油酸和LPC-棕榈酸，而不是具有小于14个碳原子的酰基链的LPC。此外，我们确定磷光体-LPC的两性离子头部基团对于转运是关键的。重要的是，从KO小鼠的血浆进入脑的标记LPC-DHA和其它LPC的摄入量显著减少，表明Mfsd2a对于脑摄入DHA是必须的。我们的发现揭示，血浆衍生的LPC在脑生长和功能中具有出乎意料的重要生理作用。
[0069] 基于本文所公开的发现，提供了用于LPC介导的跨过血脑、血眼和胎盘内皮屏障递送DHA和ω-3脂肪酸的组合物和方法；用于肠胃外营养的LPC-DHA、LPC和ω-3脂肪酸制剂；筛选LPC-营养缀合物和其它缀合物的最优化的制剂的系统；以及使用LPC-缀合物和其它缀合物进行活体动物的脑和眼部成像，进行鉴别显示神经缺损的倾向的方法。
[0070] 所用术语
[0071] 应当理解，本发明不限于毫无疑问可变化的特定的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统。还应当理解，本文所用的术语只是为了描述特定的方面，并非旨在进行限制。如在说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”包括多个指代物，除非内容另有明确指出。
[0072] 如本文所用，当涉及可计量值例如数量、持续时间等等时，术语“大约”旨在涵盖偏离指定值±20％或±10％、更优选地±5％、甚至更优选地±1％以及更优选地±0.1％的变化，因为此类变化适用于执行本发明所公开的方法。
[0073] 除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。虽然可采用与本文所述那些相似或等效的任何方法和材料来进行检验本发明的实践，但本文描述的是优选的方法和材料。
[0074] 的“脊椎动物”、“哺乳动物”、“受试者”、“哺乳动物受试者”或“患者”可互换使用，是指哺乳动物，例如人类患者和非人类灵长类，以及实验动物例如兔子、大鼠和小鼠以及其它动物。动物包括所有脊椎动物，如哺乳动物和非哺乳动物，例如小鼠、绵羊、狗、奶牛、禽类、鸭、鹅、猪、鸡、两栖动物和爬行动物。
[0075] 主要协同转运蛋白超家族(MFS)
[0076] 主要协同转运蛋白超家族(MFS)是原核生物和真核生物二者中最大的次级转运蛋白家族。大部分表征的MFS蛋白转运亲水性化合物，迄今未鉴别出转运生物脂质，特别是磷脂的蛋白(Law,C.J.,Maloney,P.C.&Wang,D.N.Ins and outs of major facilitator superfamily antiporters.Annu Rev Microbiol 62,289-305,doi:10.1146/annurev.micro.61.080706.093329(2008))，转运生物脂质是由ATP结合盒转运家族蛋白指派的功能。Mfsd2a是孤儿转运蛋白，属于MFS 3的成员(Law,C.J.,Maloney,P.C.&Wang,D.N.Ins and outs of major facilitator superfamily antiporters.Annu Rev Microbiol 62,289-305,doi:10.1146/annurev.micro.61.080706.093329(2008))。在细菌中，Mfsd2a与钠/二糖同向转运蛋白melB(细菌二糖蜜二糖的转运蛋白)具有远同源性。全面序列分析表明，从鱼至人Mfsd2a具有较强的系统发生保守性(Berger,J.H.,Charron,M.J.&Silver,D.L.Major facilitator superfamily domain-containing protein 2a(MFSD2A)has roles in body growth,motor function,and lipid metabolism.PLoS One 7,e50629,doi:10.1371/journal.pone.0050629(2012))。鱼Mfsd2a在脑中表达
(www.fishbase.org)。在细胞培养模型中使用无偏筛选，将人Mfsd2a鉴别为合胞体滋养层融合因子合胞素-2的受体(存在于灵长类基因组中的逆转录病毒衍生的蛋白)，而小鼠Mfsd2a不结合合胞素或介导细胞融合。因此，有人提出，人Mfsd2a的融合功能很可能是“次要”功能，其主要功能在转运中(Esnault,C.等A placenta-specific receptor for the fusogenic,endogenous retrovirus-derived,human syncytin-2.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105,17532-17537,doi:10.1073/pnas.0807413105(2008))。在单独的研究中，Mfsd2a被描述为小鼠肝脏中的禁食诱导基因，但在脑中则大量组成型表达(Angers,M.,Uldry,M.,Kong,D.,Gimble,J.M.&Jetten,A.M.Mfsd2a encodes a novel major facilitator superfamily domain-containing protein highly induced in brown adipose tissue during fasting and adaptive thermogenesis.The Biochemical Journal 416,347-355,doi:10.1042/BJ20080165(2008))。我们发现，小鼠肝脏中Mfsd2a的本底水平非常低，并且Mfsd2a在肝脏中的禁食诱导表达由脂肪酸代谢的主要调节因子PPARα调控(Angers,M.,Uldry,M.,Kong,D.,Gimble,J.M.&Jetten,A.M.Mfsd2a encodes a novel major facilitator
superfamily domain-containing protein highly induced in brown adipose tissue during fasting and adaptive thermogenesis.The Biochemical Journal 416,347-
355,doi:10.1042/BJ20080165(2008))，暗示Mfsd2a可能参与脂肪酸转运。
(www.fishbase.org)。在细胞培养模型中使用无偏筛选，将人Mfsd2a鉴别为合胞体滋养层融合因子合胞素-2的受体(存在于灵长类基因组中的逆转录病毒衍生的蛋白)，而小鼠Mfsd2a不结合合胞素或介导细胞融合。因此，有人提出，人Mfsd2a的融合功能很可能是“次要”功能，其主要功能在转运中(Esnault,C.等A placenta-specific receptor for the fusogenic,endogenous retrovirus-derived,human syncytin-2.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 105,17532-17537,doi:10.1073/pnas.0807413105(2008))。在单独的研究中，Mfsd2a被描述为小鼠肝脏中的禁食诱导基因，但在脑中则大量组成型表达(Angers,M.,Uldry,M.,Kong,D.,Gimble,J.M.&Jetten,A.M.Mfsd2a encodes a novel major facilitator superfamily domain-containing protein highly induced in brown adipose tissue during fasting and adaptive thermogenesis.The Biochemical Journal 416,347-355,doi:10.1042/BJ20080165(2008))。我们发现，小鼠肝脏中Mfsd2a的本底水平非常低，并且Mfsd2a在肝脏中的禁食诱导表达由脂肪酸代谢的主要调节因子PPARα调控(Angers,M.,Uldry,M.,Kong,D.,Gimble,J.M.&Jetten,A.M.Mfsd2a encodes a novel major facilitator
superfamily domain-containing protein highly induced in brown adipose tissue during fasting and adaptive thermogenesis.The Biochemical Journal 416,347-
355,doi:10.1042/BJ20080165(2008))，暗示Mfsd2a可能参与脂肪酸转运。
[0077] MFS家族蛋白非常广泛，成员存在于大肠杆菌(E.coli)至人类中。目前已知，大部分表征的MFS成员转运亲水性分子。据显示，尽管MFS家族中总体结构相似性非常高，但MFS蛋白通过相对较少的氨基酸残基变化即可实现配体特异性(Law,C.J.,Maloney,P.C.&Wang,D.N.Ins and outs of major facilitator superfamily antiporters.Annu Rev Microbiol 62,289-305,doi:10.1146/annurev.micro.61.080706.093329(2008))。MFS家族的一般转运机制首先从大肠杆菌甘油-3-磷酸转运蛋白GlpT的X-射线结构推断，然后通过其它MFS家族成员的结构证实(Huang,Y.,Lemieux,M.J.,Song,J.,Auer,M.&Wang,D.N.Structure and mechanism of the glycerol-3-phosphate transporter from Escherichia coli.Science 301,616-620,doi:10.1126/science.1087619(2003)；Shi,Y.Common folds and transport mechanisms of secondary active transporters.Annual Review of Biophysics 42,51-72,doi:10.1146/annurev-
biophys-083012-130429(2013))。该模型被描述为“摇杆-开关”模型，其中胞外开放构象结合配体，导致构象切换为胞内开放构象(Shi,Y.Common folds and transport mechanisms of secondary active transporters.Annual Review of Biophysics 42,51-72,doi:
10.1146/annurev-biophys-083012-130429(2013))。驱动该构象变化的能量由阳离子(例如钠)的结合提供，该能量沿浓度梯度由大变小。就Mfsd2a而言，其利用钠驱动LPC的转运。
实际上，Mfsd2a包含保守的钠结合位点，我们已示出，该位点对于LPC的钠依赖性转运是必需的。Mfsd2a转运必须的溶血脂质的最小配体结构是基于磷酸的两性离子头部基团和最少具有14个碳原子的烷基侧链。作为重要的配体结构特征的LPC的两性离子头部基团的使用与大多数MFS家族成员的亲水性配体的使用一致。Mfsd2a的烷基侧链耐受性是MFS蛋白的新属性。在活体内，Mfsd2a转运结合白蛋白的LPC配体，但我们的研究显示，Mfsd2a也可转运溶解于乙醇或胶束形式的LPC配体。因此，LPC结合白蛋白不是转运必须的。我们提出以下LPC的Mfsd2a转运的简单模型：1)LPC首先吸收到质膜的外叶，然后进行侧向扩散并且2)结合到Mfsd2a。3)磷酸胆碱头部基团与钠一起通过转运蛋白共转运，而烷基侧链遮挡转运蛋白进入膜周围的疏水环境。该构型最终可允许烷基侧链和整个LPC分子跨膜移动到内叶。
biophys-083012-130429(2013))。该模型被描述为“摇杆-开关”模型，其中胞外开放构象结合配体，导致构象切换为胞内开放构象(Shi,Y.Common folds and transport mechanisms of secondary active transporters.Annual Review of Biophysics 42,51-72,doi:
10.1146/annurev-biophys-083012-130429(2013))。驱动该构象变化的能量由阳离子(例如钠)的结合提供，该能量沿浓度梯度由大变小。就Mfsd2a而言，其利用钠驱动LPC的转运。
实际上，Mfsd2a包含保守的钠结合位点，我们已示出，该位点对于LPC的钠依赖性转运是必需的。Mfsd2a转运必须的溶血脂质的最小配体结构是基于磷酸的两性离子头部基团和最少具有14个碳原子的烷基侧链。作为重要的配体结构特征的LPC的两性离子头部基团的使用与大多数MFS家族成员的亲水性配体的使用一致。Mfsd2a的烷基侧链耐受性是MFS蛋白的新属性。在活体内，Mfsd2a转运结合白蛋白的LPC配体，但我们的研究显示，Mfsd2a也可转运溶解于乙醇或胶束形式的LPC配体。因此，LPC结合白蛋白不是转运必须的。我们提出以下LPC的Mfsd2a转运的简单模型：1)LPC首先吸收到质膜的外叶，然后进行侧向扩散并且2)结合到Mfsd2a。3)磷酸胆碱头部基团与钠一起通过转运蛋白共转运，而烷基侧链遮挡转运蛋白进入膜周围的疏水环境。该构型最终可允许烷基侧链和整个LPC分子跨膜移动到内叶。
[0078] 编码人Mfsd2a蛋白的代表性cDNA序列如下所示：
[0079] ATGGCCAAAGGAGAAGGCGCCGAGAGCGGCTCCGCGGCGGGGCTGCTACCCACC
[0080] AGCATCCTCCAAAGCACTGAACGCCCGGCCCAGGTGAAGAAAGAACCGAAAAA
[0081] GAAGAAACAACAGTTGTCTGTTTGCAACAAGCTTTGCTATGCACTTGGGGGAGCC
[0082] CCCTACCAGGTGACGGGCTGTGCCCTGGGTTTCTTCCTTCAGATCTACCTATTGGA
[0083] TGTGGCTCAGGTGGGCCCTTTCTCTGCCTCCATCATCCTGTTTGTGGGCCGAGCCT
[0084] GGGATGCCATCACAGACCCCCTGGTGGGCCTCTGCATCAGCAAATCCCCCTGGAC
[0085] CTGCCTGGGTCGCCTTATGCCCTGGATCATCTTCTCCACGCCCCTGGCCGTCATTG
[0086] CCTACTTCCTCATCTGGTTCGTGCCCGACTTCCCACACGGCCAGACCTATTGGTAC
[0087] CTGCTTTTCTATTGCCTCTTTGAAACAATGGTCACGTGTTTCCATGTTCCCTACTC
[0088] GGCTCTCACCATGTTCATCAGCACCGAGCAGACTGAGCGGGATTCTGCCACCGCC
[0089] TATCGGATGACTGTGGAAGTGCTGGGCACAGTGCTGGGCACGGCGATCCAGGGA
[0090] CAAATCGTGGGCCAAGCAGACACGCCTTGTTTCCAGGACCTCAATAGCTCTACAG
[0091] TAGCTTCACAAAGTGCCAACCATACACATGGCACCACCTCACACAGGGAAACGC
[0092] AAAAGGCATACCTGCTGGCAGCGGGGGTCATTGTCTGTATCTATATAATCTGTGC
[0093] TGTCATCCTGATCCTGGGCGTGCGGGAGCAGAGAGAACCCTATGAAGCCCAGCA
[0094] GTCTGAGCCAATCGCCTACTTCCGGGGCCTACGGCTGGTCATGAGCCACGGCCCA
[0095] TACATCAAACTTATTACTGGCTTCCTCTTCACCTCCTTGGCTTTCATGCTGGTGGA
[0096] GGGGAACTTTGTCTTGTTTTGCACCTACACCTTGGGCTTCCGCAATGAATTCCAG
[0097] AATCTACTCCTGGCCATCATGCTCTCGGCCACTTTAACCATTCCCATCTGGCAGTG
[0098] GTTCTTGACCCGGTTTGGCAAGAAGACAGCTGTATATGTTGGGATCTCATCAGCA
[0099] GTGCCATTTCTCATCTTGGTGGCCCTCATGGAGAGTAACCTCATCATTACATATGC
[0100] GGTAGCTGTGGCAGCTGGCATCAGTGTGGCAGCTGCCTTCTTACTACCCTGGTCC
[0101] ATGCTGCCTGATGTCATTGACGACTTCCATCTGAAGCAGCCCCACTTCCATGGAA
[0102] CCGAGCCCATCTTCTTCTCCTTCTATGTCTTCTTCACCAAGTTTGCCTCTGGAGTG
[0103] TCACTGGGCATTTCTACCCTCAGTCTGGACTTTGCAGGGTACCAGACCCGTGGCT
[0104] GCTCGCAGCCGGAACGTGTCAAGTTTACACTGAACATGCTCGTGACCATGGCTCC
[0105] CATAGTTCTCATCCTGCTGGGCCTGCTGCTCTTCAAAATGTACCCCATTGATGAG
[0106] GAGAGGCGGCGGCAGAATAAGAAGGCCCTGCAGGCACTGAGGGACGAGGCCAG
[0107] CAGCTCTGGCTGCTCAGAAACAGACTCCACAGAGCTGGCTAGCATCCTCTAG
[0108] 代表性人Mfsd2a蛋白序列如下所示：
[0109] MAKGEGAESGSAAGLLPTSILQSTERPAQVKKEPKKKKQQLSVCNKLCYALGGAPY
[0110] QVTGCALGFFLQIYLLDVAQVGPFSASIILFVGRAWDAITDPLVGLCISKSPWTCLGR
[0111] LMPWIIFSTPLAVIAYFLIWFVPDFPHGQTYWYLLFYCLFETMVTCFHVPYSALTMFI
[0112] STEQTERDSATAYRMTVEVLGTVLGTAIQGQIVGQADTPCFQDLNSSTVASQSANHT
[0113] HGTTSHRETQKAYLLAAGVIVCIYIICAVILILGVREQREPYEAQQSEPIAYFRGLRLV
[0114] MSHGPYIKLITGFLFTSLAFMLVEGNFVLFCTYTLGFRNEFQNLLLAIMLSATLTIPIW
[0115] QWFLTRFGKKTAVYVGISSAVPFLILVALMESNLIITYAVAVAAGISVAAAFLLPWSM
[0116] LPDVIDDFHLKQPHFHGTEPIFFSFYVFFTKFASGVSLGISTLSLDFAGYQTRGCSQPE
[0117] RVKFTLNMLVTMAPIVLILLGLLLFKMYPIDEERRRQNKKALQALRDEASSSGCSET
[0118] DSTELASIL
[0119] 在一些实施方案中，上述序列的变体可用于实践本发明，包括与上述核酸和氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
[0120] 功能活性变体包括天然存在的功能活性变体(例如等位变体和物种变体)，以及可通过例如诱变技术或通过直接合成生成的非天然存在的功能活性变体。
[0121] 功能活性变体与如上所示的序列相差约例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸残基，但是仍保持生物活性。在该比较需要比对的情况下，序列以最大同源性比对。关于如何制备表型沉默氨基酸置换的指导提供于Bowie等,Science,247:1306-1310(1990)，据该文献教导，研究氨基酸序列的变化耐受性有两个主要策略。第一个策略通过进化过程期间的自然选择开发氨基酸置换耐受性。通过比较不同物种的氨基酸序列，可鉴别在物种之间保守的氨基酸位置。这些保守的氨基酸很可能对于蛋白质功能是重要的。相比之下，其中置换为自然选择所允许的氨基酸位置，表明该位置不是蛋白质功能关键的。因此，在保持经修饰的肽的特定免疫原性的同时，可修饰耐受氨基酸置换的位置。
[0122] 第二个策略使用基因工程在克隆基因的特定位置引入氨基酸变化，以鉴别蛋白质功能关键的区域。例如，可使用定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham等,Science,244:1081-1085(1989))。然后可测试所得的变体肽的特定生物活性。
[0123] 根据Bowie等，这两个策略揭示，蛋白质出乎意料地具有氨基酸置换耐受性。作者还指出了蛋白质中的某些氨基酸位置可能允许的氨基酸变化。例如，最内埋或内部的(在蛋白质的三级结构内)氨基酸残基需要非极性侧链，而表面或外部侧链的少数特征结构通常是保守的。
[0124] 将突变引入蛋白质的氨基酸的方法是本领域技术人员熟知的。参见例如Ausubel(编),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley and Sons,Inc.(1994)；T.Maniatis,E.F.Fritsch and J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor laboratory,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。
[0125] 也可使用市售的试剂盒例如“QuikChange定点诱变试剂盒”(Stratagene)或直接通过肽合成引入突变。通过置换氨基酸生成肽的功能活性变体可由本领域技术人员完成，该置换不会显著影响该肽的功能。
[0126] 可根据本发明对一条肽作出的氨基酸置换类型是保守氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基被化学性质相似(如，电荷或疏水性)的具有侧链R基的另一个氨基酸残基置换的情形。通常，保守氨基酸置换基本上不会改变蛋白的功能性质。在其中两个或更多个氨基酸序列因保守置换而彼此不同的情况下，可向上调整序列同一性百分比或相似性程度以纠正置换的保守性质。作出该调整的方法是本领域技术人员熟知的。参见例如Pearson,Methods Mol.Biol.243:307-31(1994)。
[0127] 侧链具有相似的化学性质的氨基酸组的实例包括1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)含酰胺侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；以及7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸置换组为：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0128] 或者，保守置换是在Gonnet等,Science 256:1443-45(1992)公开的PAM250对数-可能性矩阵中具有正值的任何变化。“中度保守”置换是在PAM250对数-可能性矩阵中具有非负值的任何变化。
[0129] 此外，可由本领域技术人员运行NCBI BLAST搜索，以鉴别与上述序列具有80％或更高序列同一性的蛋白质。
[0130] 一旦制备所需蛋白质的编码序列，即可将它们克隆到任何合适的载体或复制子。许多克隆载体是本领域技术人员已知的，选择适当的克隆载体与选择有关。用于克隆的重组DNA载体及其可转化的宿主细胞的实例包括噬菌体λ(大肠杆菌)、pBR322(大肠杆菌)、pACYC177(大肠杆菌)、pKT230(革兰氏阴性菌)、pGV1106(革兰氏阴性菌)、pLAFRl(革兰氏阴性菌)、pME290(非大肠杆菌革兰氏阴性菌)、pHV14(大肠杆菌和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))、pBD9(芽孢杆菌属(Bacillus))、pIJ61(链霉菌属(Streptomyces))、pUC6(链霉菌属Streptomyces)、YIp5(酵母属(Saccharomyces))、YCp19(酵母属)和牛乳头状瘤病毒(哺乳动物细胞)。参见Sambrook等，出处同上；DNA Cloning，出处同上；B.Perbal，出处同上。基因可设置在启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)以及任选地操纵子(本文中总称为“控制”元件)的控制下，以使得编码所需蛋白质的DNA序列在宿主细胞内被转录为RNA，该宿主细胞转化有包含该表达构建体的载体。编码序列可包含或可不包含信号肽或前导序列。前导序列可在翻译后加工中被宿主移除。参见例如美国专利号4,431,739、4,425,437、
4,338,397。
4,338,397。
[0131] 其它调控序列也可为所期望的，该调控序列允许调节蛋白质序列相对于宿主细胞生长的表达。调控序列是本领域技术人员已知的，实例包括引起基因表达响应于化学或物理刺激(包括存在调控化合物)而开启或关闭的那些调控序列。其它类型的调控元件也可存在于载体中，例如增强子序列。
[0132] 控制序列和其它调控序列可在插入载体(例如上述克隆载体)前连接到编码序列。或者，编码序列可直接克隆到表达载体，该表达载体已包含控制序列和适当的限制性位点。
[0133] 在一些情况下，修饰编码序列可为必要的，以使其可以适当的取向连接到控制序列；即，保持正确的阅读框。生成蛋白质的突变体或类似物也可为所期望的。突变体或类似物可通过缺失编码蛋白质的序列的一部分，通过插入序列，和/或通过置换序列内的一个或多个核苷酸来制备。修饰核苷酸序列的技术，例如定点诱变，在如Sambrook等，出处同上；DNA Cloning，出处同上；Nucleic Acid Hybridization，出处同上的文献中有所描述。
[0134] 然后使用表达载体转化适当的宿主细胞。许多哺乳动物细胞系是本领域已知的，包括得自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)的无限增殖化细胞系，例如但不限于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞(如，Hep G2)、Madin-Darby牛肾(“MDBK”)细胞、人胚肾(HEK293)细胞以及其它细胞。
[0135] 表达载体可通过本领域已知的任何方式引入合适的宿主细胞，诸如例如磷酸钙转染、电穿孔、脂质体转染、通过逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或其它病毒载体系统等转导。
[0136] 脂质分析
[0137] 在一些实施方案中，进行个体的脂质组合物分析。如本文所用，术语“脂质”的含义广泛，涵盖各种范围的相对水不溶性的或非极性的生物来源化合物分子，包括蜡、甘油三酯、游离的脂肪酸、二酰基甘油、脂肪酸来源磷脂、鞘磷脂、糖脂和萜类例如类视色素、胆固醇、胆固醇酯和类固醇。一些脂质是直链脂族分子，而另一些具有环状结构。一些脂质是芳族的，而另一些不是芳族的。
[0138] 如本文所用，术语脂质“类”是指一组具有共同的结构和/或生物化学性质的脂质分子。合适的脂质类包括极性和非极性脂质类。示例性非极性脂质类包括但不限于游离的脂肪酸、单酰基甘油、二酰基甘油、三酰基甘油、甾醇和/或胆固醇酯。示例性极性脂质类包括但不限于磷脂类，例如磷脂酸、溶血磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、心磷脂和/或溶血心磷脂。
[0139] 如本文所用，术语“脂质组”是指生物样品中脂质代谢物的评估。脂质表达谱通常涉及一种或多种脂质类的脂质代谢物评估(如，脂肪酸、甘油三酯、甘油二酯、胆固醇酯以及磷脂类包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰胆碱、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺和心磷脂)。
[0140] 如本文所用，术语“脂质表达谱”是指生物样品中一种或多种脂质代谢物的评估。在特定实施方案中，评估两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八种或更多种、九种或更多种、十种或更多种、十二种或更多种、十五种或更多种、二十种或更多种、五十种或更多种、100种或更多种或甚至更多的脂质代谢物。在其中评估两种或更多种脂质代谢物的实施方案中，两种或更多种脂质可属于相同的种类或可属于两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种或更多不同的脂质种类。
[0141] 脂质表达谱可以是定量的、半定量的和/或定性的。例如，脂质表达谱可评估脂质的存在或不存在，可评估脂质存在的量大于或小于特定阈值，和/或可评估脂质的相对或绝对量。在特定实施方案中，测定两种、三种、四种或更多种脂质之间的比率。脂质比率的变化或波动对于指明代谢障碍存在(或此类障碍释放)的位置，或疾病、处理响应、副作用发展等等相关的代谢途径的其它变化可为有利的。评估脂质前体和产物的比率，以评估酶活性和流经代谢途径的方法是本领域已知的(参见例如Attie等,(2002)J.Lipid Res.43:1899-1907和Pan等,(1995)J.Clin.Invest.96:2802-2808)。
[0142] 脂质表达谱可使用任何合适的生物样品测定。生物样品可采自受试者(如，患者)，并且可以是中枢和/或周围来源的生物样品，包括但不限于体液、组织、细胞、亚细胞和/或细胞外生物样品。示例性组织和细胞包括但不限于骨骼肌组织和细胞、皮肤组织和细胞、神经组织和细胞，包括脑组织和细胞、脊髓组织和细胞、眼组织和细胞(如，视网膜细胞)、心肌组织和细胞、肺组织和细胞、胰组织和细胞、肝脏组织和细胞、胃肠系统的组织和细胞、脂肪组织和细胞等等。亚细胞样品包括一个或多个组分和/或上述细胞类型的细胞器，包括但不限于细胞质、细胞核、线粒体、高尔基体、内质网、核糖体、溶酶体、质膜、核内体组分等等。体液的实例包括但不限于血液、血浆、血清、唾液、尿液、淋巴液、精液、泪液、母乳和脑脊液。
[0143] 生物样品的脂质表达谱可使用任何合适的方法测定。不同种类的脂质及其检测和任选地定量方法是本领域熟知的(如，薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法、质谱法和NMR波谱法以及它们的任何组合(如，GC/MS)等等)。一种合适的检测和任选地定量生物样品中的脂质的方法利用稳定的同位素示踪剂标记脂质。从生物样品获得脂质表达谱的方法已有所描述，参见例如美国专利公布号2004/0143461A1(S.M.Watkins)和Watkins等(2002)J.Lipid Res.43(11):1809-17。
[0144] 本发明的脂质组分析可生成高密度数据集，该数据集可使用信息学方法评估。高数据密度信息学分析方法是已知的，并且软件是本领域人员可获取的，如聚类分析(Pirouette,Informetrix)、分类预测(SIMCA-P,Umetrics)、计算模型数据集的主要组分分析(SIMCA-P,Umetrics)、2D聚类分析(GeneLinker Platinum,Improved Outcomes Software)和代谢途径分析(biotech.icmb.utexas.edu)。软件包的选择为所关注的问题提供了特定工具(Kennedy等,Solving Data Mining Problems Through Pattern Recognition.Indianapolis:Prentice Hall PTR,1997；Golub等,(2999)Science 286:
531-7；Eriksson等,Multi and Megavariate Analysis Principles and Applications:
Umetrics,Umea,2001)。一般来讲，任何合适的数学分析均可用于评估脂质表达谱中的一种、两种或更多种脂质代谢物。例如，诸如多变量方差分析、多元回归和/或多重回归的方法可用于确定因变量(如，临床测量值)和自变量(如，脂质代谢物的水平)之间的关系。聚类包括分层和非分层法，以及非度量维度标度可用于确定变量之间和这些变量的变化之间的关联。
531-7；Eriksson等,Multi and Megavariate Analysis Principles and Applications:
Umetrics,Umea,2001)。一般来讲，任何合适的数学分析均可用于评估脂质表达谱中的一种、两种或更多种脂质代谢物。例如，诸如多变量方差分析、多元回归和/或多重回归的方法可用于确定因变量(如，临床测量值)和自变量(如，脂质代谢物的水平)之间的关系。聚类包括分层和非分层法，以及非度量维度标度可用于确定变量之间和这些变量的变化之间的关联。
[0145] 此外，主要组分分析是减少研究维度的常见方法，并且可用于解释数据集的方差-协方差结构。主要组分可用于例如多重回归和聚类分析的应用。因子分析用于通过从观察变量构建“隐”变量来描述协方差。因子分析可视为主要组分分析的延伸，而主要组分分析与最大似然法一起用于参数估计。此外，简单假设例如两个平均值的向量相等可使用霍特林T方统计检验。
[0146] 突变的测序
[0147] 在一些实施方案中，对患者样品的核酸进行测序以确定Mfsd2a基因中的突变。可使用本领域技术人员已知的任何核酸测序技术。DNA测序技术包括经典的双脱氧测序反应(Sanger法)，该方法使用标记终止子或引物以及板或毛细管电泳的凝胶分离。在一个实施方案中，新一代(NextGen)测序平台有利地用于实践本发明。NextGen测序是指任何多种后经典Sanger型测序法，该方法能够进行高通量序列测定。NextGen测序平台可包括：通过使用可逆终止标记核苷酸来合成测序、焦磷酸测序、454测序、与标记寡核苷酸探针文库的等位基因特异性杂交、通过使用与标记克隆文库的等位基因特异性杂交然后连接、在聚合步骤期间实时监测标记核苷酸的结合来合成测序、聚合酶克隆测序、单分子实时测序和SOLiD测序。特定测序平台的实例包括：454测序(Roche)(Margulies,M等2005,Nature,437,376-380)；焦磷酸测序，其使用核苷酸添加时释放的焦磷酸(PPi)。PPi在存在腺苷5'磷酰硫酸的情况下通过ATP硫酸化酶转化为ATP。荧光素酶使用ATP将荧光素转化为氧化荧光素，该反应生成可被检测和分析的光。可使用的DNA测序技术的另一个实例是SOLiD技术(Applied Biosystems)。SOLEXA(Illumina)测序是基于使用折返PCR和锚定引物在固体表面上进行DNA扩增。可使用的测序技术的另一个实例包括Pacific Biosciences的单分子实时(SMRTTM)技术。可使用的测序技术的另一个实例是纳米孔测序(Soni G V and Meller A.(2007)Clin Chem 53:1996-2001)。可使用的测序技术的另一个实例涉及使用化学敏感场效应晶体管(chemFET)阵列对DNA进行测序(例如，如美国专利申请公布号20090026082所述)。
[0148] 支架和缀合物
[0149] 在一些实施方案中，本发明提供用于经由Mfsd2a蛋白递送化合物或部分的支架。如本文所用，“支架”是指与Mfsd2a蛋白相互作用或允许经由Mfsd2a蛋白转运进行的任何分子。相互作用包括转运、结合、阻断、活化或抑制Mfsd2a蛋白。在一些实施方案中，支架是溶血磷脂酰胆碱(LPC)支架。此类支架可用于LPC介导的脂肪酸和其它分子的递送。在一些实施方案中，支架最少包括两性离子头部头部基团和酰基或烷基链。在一些实施方案中，支架最少包括磷酸胆碱头部基团、磷酸基团以及长度为至少14个碳原子的酰基或烷基链。
[0150] 在一些实施方案中，支架可以是天然存在的分子或其改性形式。在一些实施方案中，支架可以是通常不天然存在的合成实体，只要其与Mfsd2a蛋白相互作用或经由Mfsd2a蛋白转运即可。
[0151] 在一些实施方案中，化合物或部分可连接到支架，以形成经由Mfsd2a蛋白转运的“缀合物”。在一个实施方案中，可对LPC的酰基链的ω-碳进行改性，以连接用于转运的化合物或部分。然而，任何位置均可用于连接，前提条件是该连接不与经由Mfsd2a蛋白转运相互作用。此外，本领域已知的用于共价或非共价缀合任何方法均可用于将所关注的化合物或部分连接到支架。
[0152] 可连接以用于转运的化合物或部分的实例可包括但不限于脂肪酸、非脂肪酸、药物和标记等等。
[0153] 在一个实施方案中，待转运的化合物或部分可包括下文所讨论的成像剂。在此类实施方案中，标记可在支架上或在连接到支架用于转运的化合物或部分上。
[0154] 成像剂
[0155] 在一些实施方案中，本发明提供用于活体动物成像的LPC-缀合物。用于此类应用的合适的标记的实例包括但不限于下文所公开的那些。
[0156] 标记可以是荧光分子，例如：呫吨类诸如罗丹明、对甲氨基酚和荧光素及其衍生物；双满类(bimanes)；香豆素类及其衍生物诸如伞形酮和氨基甲基香豆素；芳族胺类诸如丹磺酰；方酸染料类；苯并呋喃类；荧光花菁类；咔唑类；二氰亚甲基吡喃类、聚甲炔、氧杂苯并蒽、呫吨、吡喃鎓、喹诺酮(carbostyl)、苝、吖啶酮、喹吖啶酮、红荧烯、蒽、晕苯、菲、嵌二萘、丁二烯、二苯乙烯、镧系金属螯合物、稀土金属螯合物以及此类染料的衍生物。荧光染料在例如美国专利号4,452,720、美国专利号5,227,487和美国专利号5,543,295中有所讨论。
[0157] 就荧光素染料而言，典型的荧光素染料包括但不限于5-羧基荧光、荧光素-5-异硫氰酸酯和6-羧基荧光素；其它荧光素染料的实例可见于例如美国专利号6,008,379、美国专利号5,750,409、美国专利号5,066,580和美国专利号4,439,356。罗丹明染料的另外实例包括四甲基罗丹明-6-异硫氰酸酯、5-羧基四甲基罗丹明、5-羧基对甲氨基酚衍生物、四甲基和四乙基罗丹明、二苯基二甲基和二苯基二乙基罗丹明、二萘基罗丹明、罗丹明101磺酰氯(以商品名TEXAS REDTM销售)以及其它罗丹明染料。其它罗丹明染料可见于例如美国专利号6,080,852、美国专利号6,025,505、美国专利号5,936,087、美国专利号5,750,409。此外，也可使用花菁染料，诸如例如Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy 7。
[0158] 在一些实施方案中，标记是用于正电子发射断层显像(PET)的发射正电子的同位素(如，18F)、用于单光子发射计算机断层显像(SPECT)的γ-射线同位素(如，99mTc)、用于磁3+
共振成像(MRI)的顺磁性分子或纳米粒子(如，Gd 螯合物或被涂覆的磁铁矿纳米粒子)、用于近红外(近-IR)成像的近红外荧光团、用于生物发光成像的荧光素酶(萤火虫、细菌或腔肠动物)或其它发光分子。
共振成像(MRI)的顺磁性分子或纳米粒子(如，Gd 螯合物或被涂覆的磁铁矿纳米粒子)、用于近红外(近-IR)成像的近红外荧光团、用于生物发光成像的荧光素酶(萤火虫、细菌或腔肠动物)或其它发光分子。
[0159] 在一些实施方案中，标记是放射性部分，例如放射性同位素诸如211At、131I、125I、90Y、186Re、188Re、153Sm、212Bi、32P、18F、Lu的放射性同位素等等。
[0160] 除荧光之外，上述化合物或其衍生物中的一些还生成磷光，或仅发磷光。一些磷光化合物包括卟啉、酞菁、聚芳族化合物诸如嵌二萘、蒽和苊等等。标记还可包括荧光淬灭剂，诸如例如(4-二甲基氨基-苯偶氮)苯甲酸(DABCYL)基团。
[0161] 其它标记的实例包括：吲哚羰花菁染料、IRDYE 800CW、ALEXA647、MRI造影剂以及[4,7,10-三(羧基甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基的Gd络合物。
[0162] 营养组合物
[0163] 本发明的营养组合物可通过常规配制技术和食品生产技术制备。
[0164] 营养组合物可用作用于增加能耗的药物、食品或饮料等等。
[0165] 对于表现出不能口服摄取的患者，营养组合物可使用给药管直接施用于患者的肠和胃，或当能够进行口服摄取时，可以食品或饮料给药。
[0166] 营养组合物可配制为液体制剂，例如酏剂、悬浮剂、浆剂、乳剂、安瓿剂；或固体制剂，例如凝胶、树胶、滴剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、片剂(包括糖衣片剂、膜衣片剂)、胶囊剂、包封剂、粉剂等等。
[0167] 当营养组合物可以食品和饮料提供时，此类产品可包括液体产品例如饮料、乳产品例如乳、乳饮料、酸奶、胶冻产品例如胶冻饮料、胶冻软糖、树胶产品、粉剂产品、颗粒剂产品、薄片产品、胶囊剂产品、片剂产品、固体产品例如干棒小吃、饼干等等。
[0168] 可用于形成用作食品或饮料的营养组合物的材料的实例包括甜味剂、着色剂、防腐剂、增稠稳定剂、抗氧化剂、成色剂、杀真菌剂、树胶基质、苦味剂、酶、光泽剂、酸化剂、调味剂、乳化剂、增效剂、用于制备的试剂、风味剂、香料等等。
[0169] 当营养组合物以食品和饮料提供时，可包装为单份。当预先确定每餐摄取的食品和饮料的量时，可使用单份包装。在饮料、树胶、胶冻软糖、酸奶、饼干等等的情况下，其实例包括单份包装，例如包、袋、瓶、盒。在颗粒剂、粉剂、浆液等等形式的食品的情况下，单份包装可以是包、袋等等。特别地，当食品或饮料被指定用于健康、营养、特殊用途或无效用途时，组合物可包装为单份包装单位量，例如当组合物悬浮或溶解于瓶中，得到用于单次食用等等的饮料等时。
[0170] 每天摄取的营养组合物的量可根据年龄、性别、体重、膳食条件等等单独确定，成人每天的量可为约50kcal-2000kcal。该量可在一天内分为约1至3个部分摄取。当营养组合物以一个摄取量单位的包装形式配制为单份食品或饮料时，上述确定的一次摄取的量可单独包装。
[0171] 以下用于实施本发明的具体方面的实施例仅为了进行示意性的说明，并且不旨在以任何方式限制本发明的范围。实施例
[0172] 方法和材料
[0173] 化学品
[0174] 非放射性标记溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨酸和其它溶血磷脂购自Avanti Polar Lipids。放射性标记1-棕榈酰基2-溶血磷酸胆碱(LPC-[3H]棕榈酸)、1-油酰基2-溶血磷酸胆碱(LPC-[14C]油酸)、1-二十二碳六烯酰基2-溶血磷酸胆碱(LPC-[14C]DHA)和[1-14C]二十二碳六烯酸([14C]DHA)购自Americans Radiochemicals。将溶于氯仿(未标记)或乙醇/甲苯(放射性标记)的溶血磷脂在氮气下完全干燥，并溶解于12％无脂肪酸BSA(Sigma)中，该无脂肪酸BSA溶解于150mM NaCl中。为制备LPC-[14C]-油酸/LPC-油酸混合物，使25μCi LPC-[14C]-油酸(比活性55mCi/mmol)干燥，并溶解于3ml 20mM未标记的LPC-18:0/BSA中。LPC-[3H]-棕榈酸)/LPC-棕榈酸通过将25μCi LPC-[3H]-棕榈酸(比活性60Ci/mmol)溶解于4ml 10mM LPC-棕榈酸中来制备。1-二十二碳六烯酰基LPC通过以下步骤制备：使用溶于包含5mM CaCl2的硼砂缓冲液(pH8.5)的蜜蜂毒液PLA2(Sigma)合成1,
2-二二十二碳六烯酰基PC并通过TLC法纯化。为制备LPC-[14C]-DHA/LPC-DHA混合物，将10μCi LPC-[14C]-DHA与未标记的LPC-DHA/BSA混合得到10mM的终浓度。为制备[14C]-DHA/DHA混合物，将50μCi[14C]-DHA与未标记的DHA/BSA混合得到12.2mM的终浓度。
2-二二十二碳六烯酰基PC并通过TLC法纯化。为制备LPC-[14C]-DHA/LPC-DHA混合物，将10μCi LPC-[14C]-DHA与未标记的LPC-DHA/BSA混合得到10mM的终浓度。为制备[14C]-DHA/DHA混合物，将50μCi[14C]-DHA与未标记的DHA/BSA混合得到12.2mM的终浓度。
[0175] 动物
[0176] Mfsd2a敲除小鼠如上所述制备(Berger,J.H.,Charron,M.J.&Silver,D.L.Major facilitator superfamily domain-containing protein 2a(MFSD2A)has roles in body growth,motor function,and lipid metabolism.PLoS One 7,e50629,doi:10.1371/journal.pone.0050629(2012))。小鼠以包含总共11％脂肪的高能量饮食5LJ5(PicoLab)维持。幼鼠在3周龄时断奶并以高能量饮食维持。实验方案经SingHealth机构动物保护和利用委员会(SingHealth Institutional Animal Care and Use Committee)批准。
[0177] 脂质组分析
[0178] 对于组织脂质分析，收集HET母鼠生下的7-8周龄WT和KO雌性小鼠的脑、肝脏和心脏以及e18.5胚胎的脑，立即用液氮冷冻直到提取。脂质提取遵循氯仿/甲醇法进行。对于基于细胞的游离脂肪酸的转运，在用100μM溶于BSA的二十二碳六烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、α-亚麻酸、亚油酸、油酸、棕榈酸复合物过夜处理后，使用HIP缓冲液(己烷:异丙醇3:2，每体积)提取来自表达小鼠Mfsd2a和mock的HEK293细胞的脂质，并在N2气下干燥。高效液相色谱(HPLC)1100系统(Agilent)-三重四极/离子阱质谱(4000Qtrap,Applied
Biosystem)联用测定磷脂物类。如上所述分析单个磷脂物类的水平，并使用包括PC-14:0/
14:0、PE-14:0/14:0、PS-14:0/14:0(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL,USA)和二辛酰基PI(Echelon Biosciences,Inc.,Salt Lake City,UT,USA)的加标内标物定量。
Biosystem)联用测定磷脂物类。如上所述分析单个磷脂物类的水平，并使用包括PC-14:0/
14:0、PE-14:0/14:0、PS-14:0/14:0(Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL,USA)和二辛酰基PI(Echelon Biosciences,Inc.,Salt Lake City,UT,USA)的加标内标物定量。
[0179] 放射性标记和荧光LPC的体外转运
[0180] 将放射性标记LPC棕榈酸(LPC-[3H]棕榈酸)、油酸(LPC-[14C]油酸)和二十二碳六烯酸(LPC-[14C]DHA)或TopFluor-LPC、TopFluor-LPE和NBD-LPC溶解于12％BSA，该BSA用150mM NaCl稀释。放射性标记LPC或荧光LPC的摄入量使用过表达Mfsd2a和突变体构建体的HEK293细胞分析。简而言之，使用lipofectamine 2000(Invitrogen)将pcDNA3.1Mfsd2a(WT)、pcDNA3.1Mfsd2aD92A(D92A)、pcDNA3.1Mfsd2aD96A(D96A)或pcDNA3.1(mock)质粒转染到90-95％汇合度的HEK293细胞。在转染24小时后进行摄入量分析。在配体温育前，用无血清DMEM洗涤HEK293转染细胞，然后进行分析。对于浓度和时间依赖性分析，放射性标记LPC用预热的DMEM培养基稀释。对于钠依赖性分析，放射性标记LPC用含150mM NaCl或150mM氯化胆碱的转运缓冲液(5mM KCl,10mM Hepes,pH7.4)稀释。对于钠浓度依赖性分析，NaCl浓度的任何减少均被氯化胆碱替代，以保持150mM的恒定阳离子摩尔浓度。所有分析均在12孔板中37℃下分三组进行。
[0181] 无白蛋白配体转运分析
[0182] 为制备溶解于乙醇的LPC-棕榈酸，0.75μCi LPC-[3H]棕榈酸用溶于氯仿的LPC-棕榈酸稀释。干燥混合物并溶解于50μl乙醇中，然后如上所述加入6ml含150mM钠的转运缓冲液，得到50μM LPC-棕榈酸。为制备LPC-棕榈酸胶束，0.75μCi LPC-[3H]棕榈酸用溶于氯仿的LPC-棕榈酸稀释。干燥混合物并溶解于6ml含150mM钠的转运缓冲液中，得到100μM LPC-棕榈酸，并在冰上超声5分钟。加入活性炭并离心移除LPC-棕榈酸单体。转运分析类似地使用过表达pcDNA3.1Mfsd2a或pcDNA3.1质粒(对照)的HEK293细胞在37℃下进行30分钟。
[0183] 竞争转运分析
[0184] 简而言之，在用pcDNA3.1Mfsd2a(WT)、pcDNA3.1Mfsd2aD92A(D92A)、pcDNA3.1Mfsd2aD96A或pcDNA3.1(mock)质粒转染HEK293细胞24小时后，用无血清DMEM培养基洗涤一次，然后加入25μM放射性标记LPC-棕榈酸和250μM冷竞争剂的混合物，该混合物溶解于12％BSA中。保持含或不含冷竞争剂的样品中总BSA浓度恒定。分析在37℃下进行30分钟。其它LPC类似物例如foscholine洗涤剂和PAF的竞争分析在相同的条件下进行，不同的是进行15分钟。减少反应时间是必要的，以限制洗涤剂和生物活性脂质对细胞存活的潜在负效应。所有分析均在12孔板中37℃下分三组进行。
[0185] 放射性标记、荧光LPC和未酯化的DHA的体内转运
[0186] 给6-8周龄雄性和雌性小鼠静脉注射75μl 20mM放射性标记LPC-[14H]油酸、溶于总14 14
体积150μl的磷酸盐缓冲盐水的100μl 10mM LPC-[ C]DHA/BSA复合物或82μl 12.2mM[ C]DHA/BSA复合物。在注射后2小时，麻醉小鼠并用包含0.5％BSA的PBS灌注5分钟，以移除血液和结合到脑脉管的脂质示踪剂。收集组织进行脂质提取。对于脂质提取，对组织称重，将相似量的组织在氯仿/甲醇中匀浆。将来自有机相的脂质与闪烁体混合并进行闪烁计数。还通过给每只小鼠注射300μg NBD-LPC/BSA或300μg TopFluor-LPC/BSA复合物进行类似的实验。在该实验中，小鼠用PBS灌注5分钟，然后用4％多聚甲醛(PFA)灌注15分钟，以进行组织固定。制备WT和KO的40μm厚脑切片，并使用Typhoon FLA 9000扫描仪(Agilent)的绿色荧光模式扫描。NBD-LPC累积以每个切片单位面积的荧光表示。还使用[14C]DHA/BSA复合物测定从母鼠转运到胚胎的膳食DHA。给e18.5妊娠雌鼠管饲[14C]DHA/BSA复合物丸剂(200μl 10mM[14C]DHA/BSA/小鼠)。在管饲20小时后收集胚胎的脑并称重。如上所述进行脂质提取和放射性测定。
体积150μl的磷酸盐缓冲盐水的100μl 10mM LPC-[ C]DHA/BSA复合物或82μl 12.2mM[ C]DHA/BSA复合物。在注射后2小时，麻醉小鼠并用包含0.5％BSA的PBS灌注5分钟，以移除血液和结合到脑脉管的脂质示踪剂。收集组织进行脂质提取。对于脂质提取，对组织称重，将相似量的组织在氯仿/甲醇中匀浆。将来自有机相的脂质与闪烁体混合并进行闪烁计数。还通过给每只小鼠注射300μg NBD-LPC/BSA或300μg TopFluor-LPC/BSA复合物进行类似的实验。在该实验中，小鼠用PBS灌注5分钟，然后用4％多聚甲醛(PFA)灌注15分钟，以进行组织固定。制备WT和KO的40μm厚脑切片，并使用Typhoon FLA 9000扫描仪(Agilent)的绿色荧光模式扫描。NBD-LPC累积以每个切片单位面积的荧光表示。还使用[14C]DHA/BSA复合物测定从母鼠转运到胚胎的膳食DHA。给e18.5妊娠雌鼠管饲[14C]DHA/BSA复合物丸剂(200μl 10mM[14C]DHA/BSA/小鼠)。在管饲20小时后收集胚胎的脑并称重。如上所述进行脂质提取和放射性测定。
[0187] 磷脂的TLC分析
[0188] 用无血清DMEM培养基洗涤过表达pcDNA3.1Mfsd2a(WT)、pcDNA3.1Mfsd2aD92A(D92A)、pcDNA3.1Mfsd2aD96A或pcDNA3.1(mock)质粒或人Mfsd2a(Sport6质粒中)的HEK29314 14
细胞一次，然后用50μM放射性标记LPC[ C]油酸、LPC[ C]DHA或用50μM TopFluor-LPC和NBD-LPC温育。用HIP缓冲液提取脂质30分钟两次。用氮气流干燥脂质，在氯仿中重构并滴入TLC板(Milipore)。磷脂分离的溶剂为氯仿/甲醇/氨溶液(25％)(50:25:6，每体积)。将放射性标记磷脂的TLC板干燥30分钟，暴露在荧光屏下过夜并用Typhoon FLA 9000扫描仪(Agilent)扫描。荧光磷脂的TLC板用Typhoon FLA 9000扫描仪扫描，并使用Imagequant软件定量。
细胞一次，然后用50μM放射性标记LPC[ C]油酸、LPC[ C]DHA或用50μM TopFluor-LPC和NBD-LPC温育。用HIP缓冲液提取脂质30分钟两次。用氮气流干燥脂质，在氯仿中重构并滴入TLC板(Milipore)。磷脂分离的溶剂为氯仿/甲醇/氨溶液(25％)(50:25:6，每体积)。将放射性标记磷脂的TLC板干燥30分钟，暴露在荧光屏下过夜并用Typhoon FLA 9000扫描仪(Agilent)扫描。荧光磷脂的TLC板用Typhoon FLA 9000扫描仪扫描，并使用Imagequant软件定量。
[0189] 组织学研究
[0190] 将HET亲代生下的7.5-8周龄WT和KO雄性成体小鼠深度麻醉，并用50ml盐水穿心灌注，然后用100ml溶于0.1M PB(pH7.4)的4％PFA灌注30分钟。对于胚胎，脑首先用4％PFA固定过夜，然后用30％蔗糖固定过夜。在低温恒温器中切成40μm厚矢状切片，将连续切片转移到24孔组织培养皿的不同孔中，以进行免疫染色。将胚胎的切片装入玻片。脑切片使用抗NeuN(1:1000,Chemicon,CA,USA)、Mfsd2a(1:500)、GFAP(1:1000,Chemicon,CA,USA)、小清蛋白(1:500,Swant,Switzerland)、Glut1(1:500,Abcam)、PDGFR-β(1:150eBioscience)抗体进行免疫细胞化学工序，并在4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI,1:5000)中温育5分钟，然后进行洗涤和装片。在Zeiss LSM 710倒置荧光共聚焦显微镜(Carl Zeiss,Pte.Ltd.,Singapore)上获取图像。对食蟹猴(Cynomolgus Macaque)的海马区切片进行相同的定位工序。对海马区中NeuN免疫染色的神经元表达谱和小脑中小清蛋白染色的浦肯野细胞计数，并以密度(免疫阳性神经元的个数/平方毫米(No./mm2)和免疫阳性细胞的个数/毫米(No./mm))的平均值±SEM表示。使用学生t-检验评估统计学显著性。
[0191] 行为研究
[0192] Y迷宫自发变换测验：将小鼠置于具有彼此呈120°角的三个臂的Y-型迷宫的中心。允许动物自由探索所有三个臂。如果小鼠的空间工作记忆未受到损伤，则进入最近访问的臂的倾向将减少。Topscan程序(Cleversys Inc.,Reston,VA)用于对进臂次数评分，并确定变换的次数。小鼠的四肢在臂中时，视为进臂。
[0193] 新物体认知测试：新物体认知测试如上所述进行。简而言之，小鼠用相同的“熟悉”物体训练5分钟，然后评估短期记忆(STM)和长期记忆(LTM)，它们分别需要训练后20分钟和24小时。使用Annostar程序(Cleversys Inc.,Reston,VA)对每个物体的探索次数评分。偏好分数用以下公式计算：(新物体停留的时间-熟悉物体停留的时间)/(两个物体停留的总时间)。熟悉物体和新物体的偏好确定为负分和近似于零的分数，表明对任一物体均无偏好。
[0194] 焦虑测试：用表面消毒剂和70％乙醇清洗每个动物的所有行为装置。在零迷宫中，小鼠置于闭合臂中，并允许探索10分钟。使用Annostar行为评分程序(Cleversys Inc.,Reston,VA)对行为，例如在开放臂停留的时间、进入开放臂的次数、在开放臂之间穿梭和延迟进入开放臂的次数进行评分。此外，记录探索行为，例如低头和伸展。在明/暗箱测试开始时，小鼠置于尺寸为20×40×16cm的暗箱中10分钟，并允许在暗箱和明箱之间自由移动。使用Versamax程序(AccuScan Instruments Inc.,Columbus,OH)记录行为指标，例如在明箱中的停留的时间和水平活动、延迟进入明箱以及在两箱之间穿梭的次数。
[0195] 旷场活动：小鼠置于箱内60分钟，并使用Versamax程序(AccuScan Instruments,Columbus,OH)记录总行进距离、垂直运动的次数以及在角落和中心停留的时间。
[0196] 统计分析
[0197] 使用未配对学生t-检验计算DHA和AA水平和基因型之间的组织学分析的统计差异。LPC-[14C]DHA、LPC-[3H]棕榈酸、LPC-[14C]油酸信号(以mock与WT和突变体之间的DPM表示)的统计分析使用两因素方差分析计算；p<0.05被视为具有显著性。
[0198] 对于行为测试，基因型是被试间因素。单因子方差分析用于分析零迷宫、明/暗箱、旷场和Y迷宫。二因子方差分析用于分析新物体测试，测试日为被试间因素。Bonferroni校正配对比较用作事后比较检验。数据以平均值±SEM表示，p<0.05被视为具有统计学显著性。
[0199] 实施例1：Mfsd2a的免疫定位
[0200] Mfsd2a的免疫定位表明其高度富集于脑微脉管，在其中只存在于构成BBB的内皮中(图1a、图1b、图1c和图5a、图5b)，但未在围绕内皮的周细胞中表达(Armulik,A.等.Pericytes regulate the blood-brain barrier.Nature 468,557-561,doi:10.1038/nature09522(2010)；Bell,R.D.等.Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging.Neuron 68,409-427,doi:10.1016/j.neuron.2010.09.043(2010))(图5c、d)，这确认了先前的报道，该报道指出Mfsd2a的mRNA是BBB中存在的最高富集转录物之一(Daneman,R.等.The mouse blood-brain barrier transcriptome:a new resource for understanding the development and function of brain endothelial cells.PloS One 5,e13741,doi:
10.1371/journal.pone.0013741(2010))。该BBB定位模式还存在于猴的小脑和海马区中(图6)。在e15.5时，Mfsd2a可见于在BBB中表达(图7a)。Mfsd2a定位于BBB的内皮暗示了在BBB中的转运功能。
10.1371/journal.pone.0013741(2010))。该BBB定位模式还存在于猴的小脑和海马区中(图6)。在e15.5时，Mfsd2a可见于在BBB中表达(图7a)。Mfsd2a定位于BBB的内皮暗示了在BBB中的转运功能。
[0201] 实施例2：Mfsd2a敲除小鼠中的表型差异
[0202] 雄性和雌性Mfsd2a基因缺失(KO)小鼠以孟德尔比率出生，但在生命早期产后死亡率显著增加(Berger,J.H.,Charron,M.J.&Silver,D.L.Major facilitator superfamily domain-containing protein 2a(MFSD2A)has roles in body growth,motor function,and lipid metabolism.PLoS One 7,e50629,doi:10.1371/journal.pone.0050629(2012))。据报道，组织和全身健康的生理和生化测定指标在独立制备的Mfsd2a KO小鼠模型中不显著(Tang,T.等.A mouse knockout library for secreted and transmembrane proteins.Nature Biotechnology 28,749-755,doi:10.1038/nbt.1644(2010))。始终不变的是，在E18.5时，KO小鼠的胚胎和胎盘重量与WT同窝仔鼠相似(图8a)。此外，在断奶后KO小鼠表现出活动机能障碍(Berger,J.H.,Charron,M.J.&Silver,D.L.Major facilitator superfamily domain-containing protein 2a(MFSD2A)has roles in body growth,motor function,and lipid metabolism.PLoS One 7,e50629,doi:10.1371/journal.pone.0050629(2012))，在悬尾实验中表现出前爪钩爪(图8b)。KO小鼠的脑尺寸和重量显著小于WT同窝仔鼠(图9a、图9b)。然而，WT和KO脑的大体解剖无明显差异(图9c、图
9d)。有趣的是，KO小鼠的小脑表现出浦肯野细胞显著丧失(图1d、图1e)。此外，在海马区中，特别是CA1和CA3区域中，神经细胞密度显著降低，但在KO小鼠的海马齿状回(DG)中，细胞密度正常(图1f、图1g)。这些数据暗示，KO小鼠可能具有学习和记忆功能缺损。实际上，行为测试表明，KO小鼠具有严重的学习、短期和长期记忆功能缺损以及严重焦虑(图10)。
9d)。有趣的是，KO小鼠的小脑表现出浦肯野细胞显著丧失(图1d、图1e)。此外，在海马区中，特别是CA1和CA3区域中，神经细胞密度显著降低，但在KO小鼠的海马齿状回(DG)中，细胞密度正常(图1f、图1g)。这些数据暗示，KO小鼠可能具有学习和记忆功能缺损。实际上，行为测试表明，KO小鼠具有严重的学习、短期和长期记忆功能缺损以及严重焦虑(图10)。
[0203] 实施例3：野生型和Mfsd2a敲除小鼠的脂质组分析
[0204] 在啮齿动物模型中，ω-3脂肪酸缺乏与认知功能障碍和焦虑相关(Lafourcade,M.等.Nutritional Omega-3deficiency abolishes endocannabinoid-mediated neuronal functions.Nature Neuroscience 14,345-350,doi:10.1038/nn.2736(2011)；Carrie,I.,Clement,M.,de Javel,D.,Frances,H.&Bourre,J.M.Phospholipid supplementation reverses behavioral and biochemical alterations induced by n-3polyunsaturated fatty acid deficiency in mice.Journal of Lipid Research 41,473-480(2000))。这些KO表型暗示，Mfsd2a KO小鼠脑的ω-3脂肪酸水平可能减少，并且其它脂质物类可能发生变化。我们通过质谱对WT和KO小鼠进行了脑、肝脏和心脏的全面脂质组分析。惊人的是，我们发现，与WT小鼠相比，在KO小鼠脑的主要磷脂物类PE、PC、PI和PS中，DHA而非其它ω-3脂肪酸物类显著减少(图2a，且在图11中详述)。在PE、PC、PI和PS中，DHA主要以磷脂物类38:6和40:6存在(Kim,H.Y.Novel metabolism of docosahexaenoic acid in neural cells.The Journal of Biological Chemistry 282,18661-18665,doi:10.1074/
jbc.R700015200(2007))(图2a和图11)。与WT小鼠相比，KO小鼠的肝脏和心脏中含DHA物类的总水平无显著差异(图2d、图2f和图11)。然而，在KO小鼠脑中DHA的总水平减少大约
58.8％，其它脂肪酸物类的变化较小(图2b和图11)。KO小鼠的脑磷脂中的花生四烯酸增加
33.8％(图2c和图11)，在DHA缺乏的啮齿动物模型中，花生四烯酸通常增加(Simopoulos,A.P.The importance of the Omega-6/Omega-3fatty acid ratio in cardiovascular disease and other chronic diseases.Exp Biol Med(Maywood)233,674-688,doi:
10.3181/0711-MR-311(2008))。值得注意的是，KO小鼠以DHA充足的饮食生长，该饮食突出了Mfsd2a在保持脑DHA水平中的生理作用。尽管KO胚胎脑的发育中无解剖学变化，但在e18.5时脑磷脂出现明显的生物化学变化，磷脂中的DHA水平显著减少(图7c)，表明Mfsd2a在胚胎发生期间对于保持DHA水平具有重要作用。
jbc.R700015200(2007))(图2a和图11)。与WT小鼠相比，KO小鼠的肝脏和心脏中含DHA物类的总水平无显著差异(图2d、图2f和图11)。然而，在KO小鼠脑中DHA的总水平减少大约
58.8％，其它脂肪酸物类的变化较小(图2b和图11)。KO小鼠的脑磷脂中的花生四烯酸增加
33.8％(图2c和图11)，在DHA缺乏的啮齿动物模型中，花生四烯酸通常增加(Simopoulos,A.P.The importance of the Omega-6/Omega-3fatty acid ratio in cardiovascular disease and other chronic diseases.Exp Biol Med(Maywood)233,674-688,doi:
10.3181/0711-MR-311(2008))。值得注意的是，KO小鼠以DHA充足的饮食生长，该饮食突出了Mfsd2a在保持脑DHA水平中的生理作用。尽管KO胚胎脑的发育中无解剖学变化，但在e18.5时脑磷脂出现明显的生物化学变化，磷脂中的DHA水平显著减少(图7c)，表明Mfsd2a在胚胎发生期间对于保持DHA水平具有重要作用。
[0205] 实施例4：通过Mfsd2a转运LPC
[0206] 脑选择性累积大量血浆来源DHA。在血浆中，血浆DHA的可交换库可以未酯化的脂17
肪酸或以LPC 存在于白蛋白中。使用基于细胞的分析，我们发现Mfsd2a不转运未酯化的DHA或其它未酯化的脂肪酸(图12，表1)，因此把Mfsd2a排除在脂肪酸转运蛋白外。然后我们测试了Mfsd2a是否可转运LPC形式的DHA。值得注意的是，相对于对照细胞，表达Mfsd2a的细胞表现出LPC-[14C]DHA的浓度依赖性摄入量增加(图3a)，表明Mfsd2a确实是LPC-DHA转运蛋白。钠结合MFS蛋白关键的系统发生保守的残基天冬氨酸92(D92A)和96(D96A)的丙氨酸诱变(Granell,M.,Leon,X.,Leblanc,G.,Padros,E.&Lorenz-Fonfria,V.A.Structural insights into the activation mechanism of melibiose permease by sodium binding.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107,22078-22083,doi:10.1073/pnas.1008649107(2010))分别导致了转运的减少和丧失(图3a)。D92A和D96A突变体具有与野生型相似的表达(图13)。然后我们检查了Mfsd2a对于血浆中最常见的LPC：LPC-油酸和LPC-棕榈酸的转运特异性。表达野生型Mfsd2a的细胞显示出LPC-[14C]油酸和LPC-[3H]棕榈酸的浓度依赖性摄入(图3b、图3c)。人Mfsd2a还以类似方式转运LPC(图14)。Mfsd2a介导的LPC-油酸、LPC-棕榈酸和LPC-DHA摄入的比较表明，Mfsd2a的LPC-DHA转运能力最高，然后是LPC-油酸和LPC-棕榈酸(图3d)。此外，表达野生型和部分活性D92A突变体的细胞表现出饱和动力学曲线随时间推移而变化(图15a)。重要的是，LPC-[14C]DHA和LPC-[14C]油酸的Mfsd2a依赖性转运导致转运的LPC迅速转化为PC(图3e、图3f、图3g、图3h)。此外，Mfsd2a的表达导致PC的质量增加，表明Mfsd2a转运活性导致LPC净摄入细胞(图15b)。
肪酸或以LPC 存在于白蛋白中。使用基于细胞的分析，我们发现Mfsd2a不转运未酯化的DHA或其它未酯化的脂肪酸(图12，表1)，因此把Mfsd2a排除在脂肪酸转运蛋白外。然后我们测试了Mfsd2a是否可转运LPC形式的DHA。值得注意的是，相对于对照细胞，表达Mfsd2a的细胞表现出LPC-[14C]DHA的浓度依赖性摄入量增加(图3a)，表明Mfsd2a确实是LPC-DHA转运蛋白。钠结合MFS蛋白关键的系统发生保守的残基天冬氨酸92(D92A)和96(D96A)的丙氨酸诱变(Granell,M.,Leon,X.,Leblanc,G.,Padros,E.&Lorenz-Fonfria,V.A.Structural insights into the activation mechanism of melibiose permease by sodium binding.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107,22078-22083,doi:10.1073/pnas.1008649107(2010))分别导致了转运的减少和丧失(图3a)。D92A和D96A突变体具有与野生型相似的表达(图13)。然后我们检查了Mfsd2a对于血浆中最常见的LPC：LPC-油酸和LPC-棕榈酸的转运特异性。表达野生型Mfsd2a的细胞显示出LPC-[14C]油酸和LPC-[3H]棕榈酸的浓度依赖性摄入(图3b、图3c)。人Mfsd2a还以类似方式转运LPC(图14)。Mfsd2a介导的LPC-油酸、LPC-棕榈酸和LPC-DHA摄入的比较表明，Mfsd2a的LPC-DHA转运能力最高，然后是LPC-油酸和LPC-棕榈酸(图3d)。此外，表达野生型和部分活性D92A突变体的细胞表现出饱和动力学曲线随时间推移而变化(图15a)。重要的是，LPC-[14C]DHA和LPC-[14C]油酸的Mfsd2a依赖性转运导致转运的LPC迅速转化为PC(图3e、图3f、图3g、图3h)。此外，Mfsd2a的表达导致PC的质量增加，表明Mfsd2a转运活性导致LPC净摄入细胞(图15b)。
[0207] MFS家族成员是协同转运蛋白，它们利用阳离子例如Na+、H+和Li+沿其浓度梯度向下的共转运来驱动溶质转运。鉴于如上所述LPC的转运需要系统发生保守的阳离子结合位点残基D96，我们测试了Mfsd2a转运是否依赖于钠。在不存在钠的情况下，表达野生型Mfsd2a的细胞的LPC转运类似于对照转染的细胞，表明LPC转运是钠依赖性的(图3i)。转运是低钠浓度高度敏感的，表明对钠具有高亲和力，这与其它钠依赖性MFS同向转运蛋白的特性一致(图3k)(Paroder-Belenitsky,M.等.Mechanism of anion selectivity and stoichiometry of the Na+/I-symporter(NIS).Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108,17933-17938,doi:10.1073/pnas.1108278108(2011))。LPC转运不是pH或锂依赖性的(图16a、图16b)。此外，溶解于乙醇或胶束形式的LPC-[3H]16:0通过Mfsd2a转运，尽管与BSA结合形式相比能力更小，表明白蛋白不是转运必需的(图16c)。我们的发现揭示，Mfsd2a是第一个被鉴别为转运磷脂的协同转运蛋白。
[0208] 实施例5：配体特异性和Mfsd2a转运的要求
[0209] 然后我们寻求确定配体特异性，以及Mfsd2a转运所需的LPC配体的化学特征。为实现该目标，我们使用表达Mfsd2a的细胞或mock细胞设定竞争分析，在存在或不存在10倍过量未标记的竞争剂的情况下用25μM LPC-[3H]棕榈酸处理这些细胞。我们发现，最小酰基链长度为14个碳原子的LPC可有效竞争摄入(图17a、图17b、图17c)。溶血磷脂LPE和LPS显示出3
弱竞争，而LPA不竞争LPC-[ H]棕榈酸的转运(图17c)。我们确认，Mfsd2a可使用荧光LPE直接转运LPE(图18)。这些结果表明，磷脂酰胆碱头部基团的两性离子电荷对于配体转运是关键的。此外，单独的短链脂肪酸和甘油磷脂酰胆碱不是竞争剂(图17b、图17c)，这支持以下结论：LPC的长酰基链是配体转运必须的。溶血缩醛磷脂、溶血血小板活化因子和血小板活化因子是强竞争剂，表明LPC的酰基链的羰基不是转运必须的(图17d、图17e、图17f)。溶血鞘磷脂还竞争LPC-[3H]棕榈酸转运，表明甘油主链不是配体功能必须的(图17f)。鞘氨醇-
1-磷酸与LPA类似，不是竞争剂(图17f)，还支持以下结论：磷酸胆碱头部基团的胆碱部分是配体转运必需的。我们使用溶血脂质样洗涤剂确认，最小长度为14个碳原子的酰基侧链和磷酸胆碱头部基团是LPC配体的重要化学特征，而甘油主链和羰基则不是(图17g、图17h)。
弱竞争，而LPA不竞争LPC-[ H]棕榈酸的转运(图17c)。我们确认，Mfsd2a可使用荧光LPE直接转运LPE(图18)。这些结果表明，磷脂酰胆碱头部基团的两性离子电荷对于配体转运是关键的。此外，单独的短链脂肪酸和甘油磷脂酰胆碱不是竞争剂(图17b、图17c)，这支持以下结论：LPC的长酰基链是配体转运必须的。溶血缩醛磷脂、溶血血小板活化因子和血小板活化因子是强竞争剂，表明LPC的酰基链的羰基不是转运必须的(图17d、图17e、图17f)。溶血鞘磷脂还竞争LPC-[3H]棕榈酸转运，表明甘油主链不是配体功能必须的(图17f)。鞘氨醇-
1-磷酸与LPA类似，不是竞争剂(图17f)，还支持以下结论：磷酸胆碱头部基团的胆碱部分是配体转运必需的。我们使用溶血脂质样洗涤剂确认，最小长度为14个碳原子的酰基侧链和磷酸胆碱头部基团是LPC配体的重要化学特征，而甘油主链和羰基则不是(图17g、图17h)。
[0210] 实施例6：LPC-DHA转运到脑需要Mfsd2a
[0211] 然后我们寻求确定Mfsd2a是否为LPC-DHA转运到脑必须的。给Mfsd2a KO和野生型同窝仔鼠小鼠静脉注射LPC-[14C]DHA。值得注意的是，与野生型对照相比，Mfsd2a KO小鼠脑的LPC-[14C]DHA摄入量减少超过90％(图4a)。相比之下，与野生型对照相比，KO小鼠周围组织的LPC-[14C]DHA摄入量未减少(图4a、图4b)。由于未酯化的DHA可经由扩散被脑吸收(Rapoport,S.I.,Chang,M.C.&Spector,A.A.Delivery and turnover of plasma-derived essential PUFAs in mammalian brain.J Lipid Res 42,678-685(2001))，我们测试了Mfsd2a KO小鼠中DHA摄入的扩散途径是否改变。相对于LPC-[14C]DHA的摄入量，脑的未酯化的[14C]DHA的摄入量显著减少，但相对于野生型小鼠，KO中未减少(图19)。这些发现共同阐述了Mfsd2a KO小鼠中脑DHA水平较低的因果关系，并支持以下结论：Mfsd2a是LPC-DHA摄入脑的生理转运蛋白。
[0212] KO小鼠中脑的LPC-[14C]油酸摄入量显著减少，这与细胞培养研究的结果一致，该研究表明Mfsd2a也可转运常见血浆LPC(图4b)。在测试通过Mfsd2a体内转运LPC的单独方法中，我们检查了荧光LPC类似物NBD-LPC的转运(图4c)。我们首先在细胞中验证了NBD-LPC通过Mfsd2a转运。与天然LPC类似，NBD-LPC通过Mfsd2a转运，但D92和D96突变体分别使转运减少和丧失(图4d)。重要的是，NBD-LPC生物掺入到膜磷脂(图4e、图4f)。此外，过量的天然LPC竞争NBD-LPC摄入(图4e、图4f)。然后我们测试了体内转运。给Mfsd2a KO和野生型小鼠静脉注射相同剂量的NBD-LPC，并检查脑切片的荧光累积。与野生型对照相比，KO脑切片的荧光显著减少，这与天然配体的转运一致(图4g、图4h)，表明脑的NBD-LPC摄入取决于Mfsd2a。我们使用结构不同于NBD-LPC的荧光团TopFluor-LPC在细胞培养和体内获得了类似的发现(图20)。
[0213] 实施例7：通过膳食DHA处理挽救Mfsd2a敲除小鼠的研究
[0214] 我们测试了KO小鼠是否可由膳食DHA处理挽救。从妊娠前至哺乳期间用膳食DHA处理Mfsd2a杂合小鼠，继续用DHA处理断奶的幼鼠，直到8周龄不能挽救KO表型，例如脑尺寸和焦虑(图21a至图21e)。重要的是，在e18.5时，与野生型胚胎相比，KO胚胎的脑的膳食DHA摄入量显著减少(图21)，这与KO胚胎中脑DHA水平减少一致(图7b)，表明不能挽救很可能是胚胎发生期间Mfsd2a对于DHA转运到脑的重要作用导致的。
[0215] 目前的研究共同将孤儿转运蛋白Mfsd2a鉴别为钠/LPC同向转运蛋白，展示了DHA进入脑的主要机制，并首次指出血浆来源LPC对于正常的脑生长和功能具有重要的生理作用。根据这些发现，我们提出将Mfsd2a重命名为钠/LPC同向转运蛋白1(NLS1)。
[0216] 实施例8：LPC肠胃外营养制剂
[0217] 本文所公开的发现表明，脑吸收ω-3脂肪酸的主要途径是通过它们天然缀合到LPC并通过Mfsd2a转运到脑。含ω-3脂肪酸和非缀合脂肪酸的甘油三酯不通过该主要途径转运，因此主要被肝脏和其它器官吸收。此外，Mfsd2a缺失小鼠表现出脑较小和神经缺损，并且脑DHA缺乏。我们可得出如下结论：脑摄入LPC-脂肪酸，例如LPC-DHA和其它常见LPC-脂肪酸是正常脑生长和功能必需的。重要的是，儿科PN的护理标准未提供正常脑生长和功能必须的LPC-脂肪酸和LPC-DHA。
[0218] 因此，可制备和测试LPC，以观察LPC作为补充剂加入PN是否能改善NICU中新生儿的结局。正常人血清中的LPC水平为大约100-200μM(7-9μmol/kg)，以白蛋白循环(Barber MN等(2012)Plasma lysophosphatidylcholine levels are reduced in obesity and type 2diabetes.PLoS One 7(7):e41456；Croset M,Brossard N,Polette A,&Lagarde M(2000)Characterization of plasma unsaturated lysophosphatidylcholines in human and rat.Biochem J 345Pt 1:61-67)。人血浆中丰度最高的LPC是LPC-棕榈酸、LPC-硬脂酸和LPC-油酸。我们的方法是从包含上述列出的LPC加上具有ω-3和ω-6脂肪酸(DHA、EPA、ARA)的LPC的材料纯化LPC混合物。这些后面的多不饱和脂肪酸在人体中与脑发育和功能有关(Kidd PM(2007)Omega-3DHA and EPA for cognition,behavior,and mood:clinical findings and structural-functional synergies with cell membrane phospholipids.Alternative medicine review:a journal of clinical therapeutic
12(3):207-227；Horrocks LA&Yeo YK(1999)Health benefits of docosahexaenoic acid(DHA).Pharmacological research:the official journal of the Italian
Pharmacological Society 40(3):211-225；Mozaffarian D&Wu JH(2011)Omega-3fatty acids and cardiovascular disease:effects on risk factors,molecular pathways,and clinical events.Journal of the American College of Cardiology 58(20):
2047-2067；Connor WE(2000)Importance of n-3fatty acids in health and
disease.The American journal of clinical nutrition 71(增刊1):171S-175S))。这些LPC的一个可能来源是目前可从市场获得的富含ω-3和6脂肪酸的鸡蛋。因此，可纯化LPC混合物，然后将该混合物用于肠胃外营养(PN)，以测试临床试验的结局。可测定新生儿在前9个月生命中的大多数结局。这些结局包括在NICU中以及从NICU出院后身体生长和头围改善，并监测正常发育标志。
12(3):207-227；Horrocks LA&Yeo YK(1999)Health benefits of docosahexaenoic acid(DHA).Pharmacological research:the official journal of the Italian
Pharmacological Society 40(3):211-225；Mozaffarian D&Wu JH(2011)Omega-3fatty acids and cardiovascular disease:effects on risk factors,molecular pathways,and clinical events.Journal of the American College of Cardiology 58(20):
2047-2067；Connor WE(2000)Importance of n-3fatty acids in health and
disease.The American journal of clinical nutrition 71(增刊1):171S-175S))。这些LPC的一个可能来源是目前可从市场获得的富含ω-3和6脂肪酸的鸡蛋。因此，可纯化LPC混合物，然后将该混合物用于肠胃外营养(PN)，以测试临床试验的结局。可测定新生儿在前9个月生命中的大多数结局。这些结局包括在NICU中以及从NICU出院后身体生长和头围改善，并监测正常发育标志。
[0219] 基于本文的公开内容，可配制PN补充剂，例如下文所示的那些。
[0220] LPC肠胃外营养制剂的示例性组合物。
[0221]
[0222] 上表示出了可用作PN补充剂的七个(7)LPC组分中的每个的可能浓度范围0.5μM至200μM(基于人类细胞中表达的Mfsd2a转运的动力学分析，如上图4所示)。此类制剂可溶解于人白蛋白(来源于重组表达或任何商业来源)中，作为制备营养组合物的媒介物。此外，LPC混合物或补充剂可单独以及与目前的PN脂质配方例如IntralipidTM、SMOFKabivenTM、OmegavenTM(Fresenius)、Lipofundin(B.Braun)、ClinOleicTM(Baxter)LiposynTM(Hospira Inc)组合提供。
[0223] LPC可以混合物、以LPC或以PC从蛋黄分离，通过反相色谱法纯化，并以白蛋白溶解。LPC可使用特定的磷脂酶(如本文所述)从PC起始物制备，并且可根据需要调整。可通过加入纯化的单个LPC修改每个LPC组分的比率，且范围调整如上文所述。
[0224] 在另一个实施方案中，还提供了肠道营养的补充剂，该补充剂包含PC形式的上述和其它LPC。在该实施方案中，PC以口服形式提供。在服用时，PC可在肝脏中转化为LPC，然后如上所述经由Mfsd2a蛋白跨过BBB。
[0225] 实施例9：人类中的功能Mfsd2a突变
[0226] 如本文所讨论，DHA是正常脑生长和认知功能必需的ω-3脂肪酸(Kidd,P.M.(2007).Omega-3DHA and EPA for cognition,behavior,and mood:clinical findings and structural-functional synergies with cell membrane phospholipids.Alternative medicine review:a journal of clinical therapeutic
12,207-227；Horrocks,L.A.,and Yeo,Y.K.(1999).Health benefits of
docosahexaenoic acid(DHA).Pharmacological research:the official journal of the Italian Pharmacological Society 40,211-225.；Mozaffarian,D.,and Wu,J.H.(2011).Omega-3fatty acids and cardiovascular disease:effects on risk factors,molecular pathways,and clinical events.Journal of the American College of Cardiology 58,2047-2067；Connor,W.E.(2000).Importance of n-3fatty acids in health and disease.Am J Clin Nutr 71,171S-175S))。脑磷脂中高度富含DHA，这与其在脑中的重要性一致(Breckenridge,W.C.,Gombos,G.,and Morgan,I.G.(1972).The lipid composition of adult rat brain synaptosomal plasma membranes.Biochim Biophys Acta 266,695-707；,Innis,S.M.(2007).Dietary(n-3)fatty acids and brain
development.The Journal of Nutrition 137,855-859))。尽管在脑磷脂中DHA是高丰度的脂肪酸，但不能在脑中从头合成，必须跨过血脑屏障(BBB)输入，但DHA摄入脑的机制仍不清楚。如本文所示，我们将主要协同转运蛋白超家族成员Mfsd2a(此前的孤儿转运蛋白，我们已示出它在微脉管的血脑屏障的内皮中表达)鉴别为DHA摄入胚胎和成体脑的主要转运蛋白(Nguyen等.Nature 2014；509:503-6)。脂质组分析表明，Mfsd2a缺失小鼠(KO)的脑中DHA的水平显著减少，并且兼有海马区和小脑中的神经细胞丧失，以及神经和严重行为障碍，更重要的是脑尺寸减小。出乎意料的是，基于细胞的研究表明，Mfsd2a以溶血磷脂酰胆碱(LPC)的形式转运DHA，而不是以钠依赖性方式转运未酯化的脂肪酸。值得注意的是，Mfsd2a转运携带长链脂肪酸的常见血浆LPC，例如LPC-油酸和LPC-棕榈酸。重要的是，从KO小鼠的血浆进入脑的LPC-DHA和其它LPC的摄入量显著减少，表明Mfsd2a对于脑摄入DHA是必须的。此外，我们的发现揭示，血浆衍生的LPC在脑生长和功能中具有出乎意料的重要生理作用。
12,207-227；Horrocks,L.A.,and Yeo,Y.K.(1999).Health benefits of
docosahexaenoic acid(DHA).Pharmacological research:the official journal of the Italian Pharmacological Society 40,211-225.；Mozaffarian,D.,and Wu,J.H.(2011).Omega-3fatty acids and cardiovascular disease:effects on risk factors,molecular pathways,and clinical events.Journal of the American College of Cardiology 58,2047-2067；Connor,W.E.(2000).Importance of n-3fatty acids in health and disease.Am J Clin Nutr 71,171S-175S))。脑磷脂中高度富含DHA，这与其在脑中的重要性一致(Breckenridge,W.C.,Gombos,G.,and Morgan,I.G.(1972).The lipid composition of adult rat brain synaptosomal plasma membranes.Biochim Biophys Acta 266,695-707；,Innis,S.M.(2007).Dietary(n-3)fatty acids and brain
development.The Journal of Nutrition 137,855-859))。尽管在脑磷脂中DHA是高丰度的脂肪酸，但不能在脑中从头合成，必须跨过血脑屏障(BBB)输入，但DHA摄入脑的机制仍不清楚。如本文所示，我们将主要协同转运蛋白超家族成员Mfsd2a(此前的孤儿转运蛋白，我们已示出它在微脉管的血脑屏障的内皮中表达)鉴别为DHA摄入胚胎和成体脑的主要转运蛋白(Nguyen等.Nature 2014；509:503-6)。脂质组分析表明，Mfsd2a缺失小鼠(KO)的脑中DHA的水平显著减少，并且兼有海马区和小脑中的神经细胞丧失，以及神经和严重行为障碍，更重要的是脑尺寸减小。出乎意料的是，基于细胞的研究表明，Mfsd2a以溶血磷脂酰胆碱(LPC)的形式转运DHA，而不是以钠依赖性方式转运未酯化的脂肪酸。值得注意的是，Mfsd2a转运携带长链脂肪酸的常见血浆LPC，例如LPC-油酸和LPC-棕榈酸。重要的是，从KO小鼠的血浆进入脑的LPC-DHA和其它LPC的摄入量显著减少，表明Mfsd2a对于脑摄入DHA是必须的。此外，我们的发现揭示，血浆衍生的LPC在脑生长和功能中具有出乎意料的重要生理作用。
[0227] 与这些小鼠中的发现一致的是，Mfsd2a中具有罕见的失活突变的儿童(Zaki,M.S.,Saleem,S.N.,Dobyns,W.B.,Barkovich,A.J.,Bartsch,H.,Dale,A.M.,Ashtari,M.,Akizu,N.,Gleeson,J.G.,and Grijalvo-Perez,A.M.(2012).Diencephalic-mesencephalic junction dysplasia:a novel recessive brain malformation.Brain:a journal of neurology 135,2416-2427)(图22)表现出严重的小头畸形、脑积水、下身麻痹和失语，这清晰地表明在人体中Mfsd2a是正常脑生长和功能必需的。重要的是，Thr159Met和Ser166Leu突变二者可表现出导致转运失活，这将受影响的儿童的表型与Mfsd2a的失活联系在一起。
[0228] 这些发现提高了Mfsd2a的亚效等位基因导致神经缺损(例如记忆和学习功能缺损)和行为障碍(例如焦虑)的可能性。人Mfsd2a的密码子中的单核苷酸多态性在NHLBI外显子组测序计划(NHLBI Exome Sequencing Project)(表4)中鉴别。超过12,000名欧裔美国人和非裔美国人的组合进行了基因型鉴别。表4中所示的突变可能是导致Mfsd2a的转运活性失活的功能突变，并且可用于在这些群体中进行遗传筛选。
[0229] 表4：人Mfsd2a的密码子中的单核苷酸多态性
[0230]
[0231]
[0232]
[0233] 实施例10：MFSD2A的失活突变导致致死性小头畸形综合征
[0234] 在该实施例中，我们扩展了实施例9所述的结果。我们对3396名患者的群体进行了外显子测序，它们大部分患有隐性神经发育疾病。评估患者和敲除小鼠血清中的溶血磷脂酰胆碱(LPC)-脂质。细胞转染有编码野生型或突变型MFSD2A的cDNA构建体，并监测脂质摄入。
[0235] 我们鉴别了记录为近亲的两个家庭，他们表现出在高度保守的残基中具有非同义纯合突变。患者表现出小头畸形的致死形式，以及大量脑积水、顽固性癫痫和脑性麻痹。患者的血清显示出LPC脂质水平升高，暗示细胞摄入存在缺陷。在转染细胞中，突变型MFSD2A缺乏体外LPC脂质摄入。
[0236] 因此，MFSD2A突变产生特征性的致死性小头畸形综合征，这与必需LPC脂质的摄入量不足有关。
[0237] 方法
[0238] 研究监督
[0239] 研究遵照赫尔辛基宣言(Declaration of Helsinki)的条款进行。加利福尼亚大学圣迭戈分校(University of California San Diego)的伦理审查委员会、埃及国家研究中心的伦理委员会(Ethics Committees of National Research Center,Egypt)以及的黎波里儿童医院(Tripoli Children’s Hospital)批准了研究方案。招募志愿者是3396个家庭组成的大规模神经发育疾病研究的一部分，对他们进行外显子测序以鉴别疾病的遗传学基础。书面知情同意书得自所有研究参与者或指派者。
[0240] 研究参与者
[0242]
[0243]
[0244] 表5：家庭1422和1825的受影响的成员的临床特征。
[0246] 评估每个存活的受影响的成员，包括一般和神经学评估、拟人测定和脑成像观察研究。在调查时，每个家庭中有一个成员存活，一个成员死亡。采集血液样品，分成等分试样用于DNA提取，并冷冻用于随后的脂质组评估。用血液进行已知的溶酶体、过氧化物酶体和线粒体疾病的完整代谢筛选，结果为阴性。所有受影响的成员在生命的前几年死于神经疾病的并发症，死因为发育不良和心肺衰竭，与致死性条件一致。
[0247] 基因分型和基因作图
[0248] 将六名(6)个体的DNA样品用于遗传学研究，包括每个家庭中的两组亲代和一个受影响的成员。这些样品是涉及3396名患者的大规模工作的一部分，这些患者经历了遗传调查，包括1349名埃及人患者和93名利比亚人患者，他们被用作序列分析比较的种族匹配个体。每个家庭的一名个体经历比较基因组杂交(CGH)分析和核型分析，该核型分析不检测染色体结构异常。
[0249] 靶向序列捕获和测序
[0250] 我们对每个家庭的受影响的成员进行了全外显子测序(WES)。在家庭1825中，我们另外进行了两个亲代的WES，以增加结果的特异性。基因组DNA经过Agilent Human All Exon 50Mb试剂盒进行文库制备，然后在Illumina HiSeq 2000仪器上进行双端测序(2×150bp)。对于每个患者样品，>90％的外显子的覆盖度>30×。使用GATK进行变体鉴别(DePristo MA,Banks E,Poplin R等.A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data.Nat Genet 2011；43:491-
8)。我们使用XHMM测试了分离的罕见结构变体(Fromer M,Moran JL,Chambert K等.Discovery and statistical genotyping of copy-number variation from whole-exome sequencing depth.American Journal of Human Genetics 2012；91:597-607)。然后我们使用自定义Python脚本过滤出纯合变体，以移除纯合间隔中未出现的，或无可能破坏蛋白质功能的高分的群体中频率超过0.1％的等位基因。鉴别家庭1422和1825中MFSD2A基因的新突变。群体的其它成员未显示出推定的有害变体。
8)。我们使用XHMM测试了分离的罕见结构变体(Fromer M,Moran JL,Chambert K等.Discovery and statistical genotyping of copy-number variation from whole-exome sequencing depth.American Journal of Human Genetics 2012；91:597-607)。然后我们使用自定义Python脚本过滤出纯合变体，以移除纯合间隔中未出现的，或无可能破坏蛋白质功能的高分的群体中频率超过0.1％的等位基因。鉴别家庭1422和1825中MFSD2A基因的新突变。群体的其它成员未显示出推定的有害变体。
[0251] mfsd2a的功能分析
[0252] 我们检查了MFSD2A突变在转运分析中的效果(Nguyen LN,Ma D,Shui G等.Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3fatty acid docosahexaenoic acid.Nature 2014；509:503-6)../Documents/tmp/％01-_ENREF_5，以及引入野生型(WT)人MFSD2A的突变在挽救MO表型中的效果。患者的血清经过脂质组分析(Shui G,Stebbins JW,Lam BD等.Comparative plasma lipidome between human and cynomolgus monkey:
are plasma polar lipids good biomarkers for diabetic monkeys？PloS One 2011；6:
e19731)。功能分析的详细方法如下文提供。
are plasma polar lipids good biomarkers for diabetic monkeys？PloS One 2011；6:
e19731)。功能分析的详细方法如下文提供。
[0253] 人受试者。患者根据加利福尼亚大学(University of California)批准的人类受试者方案中的标准本地惯例登记。
[0254] 全外显子测序。对于每个样品，通过盐萃取从外周血白细胞提取DNA。使用Agilent SureSelect Human All Exome 50Mb试剂盒进行外显子捕获，并使用Illumina HiSeq2000仪器进行双端测序，在>10×覆盖度下得到约94％的回收率。使用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)将序列与人类基因组(hg19)比对，并使用Genome Analysis Toolkit(GATK)软件和SAMTools算法绘制变体的SNP和插入/缺失多态性。随后用以下标准过滤变体：出现在编码区和/或剪接位点中、非同义、在对照群体(我们的具有5000名个体的内部外显子数据集，dbSNP和外显子组变体服务器)中存在的频率小于0.1％、血缘家庭中的纯合子、在纯合性连锁间隔或区块内。其余的变体以突变的类型(无义/剪接/插入缺失>错义)、物类之间的氨基酸保守性以及损伤预测程序(PolyPhen和Grantham分数)排序。使用自动化优先级排序工作流程分析变体，该工作流程考虑家族遗传模式和变体的严重性(无义/剪接/插入缺失>错义)。对通过阈值(可能的无效等位基因、GERP分数>4或Phastcon分数>0.8)的所有可能有害变体列表进行分离测试，该测试通过全家的Sanger测序进行，以排除外显子测序错误或未通过分离分析的变体(即：根据隐性遗传模型)。只有其中单个有害变体分离的那些才被标记为可能致使性变体。使用HomozygosityMapper从外显子序列构建同接合性图谱(Seelow D,Schuelke M,Hildebrandt F,Nurnberg P.HomozygosityMapper--an interactive approach to homozygosity mapping.Nucleic Acids Research 2009；37:
W593-9)。
W593-9)。
[0255] Sanger测序。使用Primer3程序设计引物，并使用NIH BLAST软件测试特异性。PCR产物用外切核酸酶I(Fermentas)和Shrimp碱性磷酸酶(USB Corporation)处理，并使用Big Dye终止子循环测序试剂盒v.3.1(Big Dye terminator cycle sequencing Kit v.3.1)在ABI 3100DNA分析仪(Applied Biosystems)上测序。序列数据通过Sequencher 4.9(Gene Codes)分析。
[0256] 人MFSD2A的诱变。使用引物hMfsd2aBamHI和hMfsd2aXbaI(表8)对来自Sport6(OpenBiosystems)的人MFSD2A进行PCR，并克隆到pcDNA3.1的BamHI和XbaI位点之间。对于MFSD2A的诱变，使用特异性引物通过PCR扩增p.T159M和p.S166L(表6)。随后将p.T159M and p.S166L的突变PCR产物克隆到pcDNA3.1并测序。
[0257] 表6.本研究中所用的引物
[0258] 引物
[0259]
[0260] PNGase F处理。如上所述用PNGaseF处理在HEK293细胞中表达的MFSD2A、p.T159M、p.S166L，不同的是温育时间为3h(Daneman R,Zhou L,Agalliu D,Cahoy JD,Kaushal A,Barres BA.The mouse blood-brain barrier transcriptome:a new resource for understanding the development and function of brain endothelial cells.PloS One 2010；5:e13741)。
[0261] MFSD2A的建模。MFSD2A的3D结构使用i-Tasser程序建模。MFSD2A的最佳拟合模型是细菌蜜二糖通透酶(MelB)，其原子结构最近得以解析(Ethayathulla AS,Yousef MS,Amin A,Leblanc G,Kaback HR,Guan L.Structure-based mechanism for Na(+)/melibiose symport by MelB.Nat Commun 2014；5:3009)。随后使用PyMol查看MFSD2A建模的跨膜域和残基。
[0262] 转运分析。如上所述使用HEK293细胞进行转运分析(Nguyen LN,Ma D,Shui G等.Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3fatty acid docosahexaenoic acid.Nature 2014；509:503-6)。简而言之，将WT MFSD2A、p.T159M和p.S166L质粒转染到HEK293细胞。在转染一系列LPC[14C]-油酸24h后进行摄入量分析。实验在12孔板中进行，分三组重复两次。摄入活性以DPM/孔表示。放射性标记1-油酰基2-溶血磷酸胆碱(LPC[14C]-油酸购自ARC，非放射性标记LPC-油酸得自Avanti Polar Lipids,Inc。
[0263] 磷脂的TLC分析。用无血清DMEM培养基洗涤过表达pcDNA3.1hMfsd2a(WT)、pcDNA3.1Mfsd2aT159M(p.T159M)、pcDNA3.1Mfsd2aS166L(p.S166L)或pcDNA3.1(mock)质粒14
的HEK293细胞一次，然后用100μM放射性标记LPC[ C]油酸温育30分钟。用含0.5％BSA的DMEM洗涤孔三次。用HIP(己烷/异丙醇，比率3:2)缓冲液提取脂质30分钟两次，用氮气流干燥，在氯仿中重构并滴入TLC板(Milipore)上。磷脂分离的溶剂为氯仿/甲醇/氨溶液(25％)(50:25:6，每体积)。将放射性标记磷脂的TLC板干燥30分钟，暴露在荧光屏下过夜并用Typhoon FLA 9000扫描仪(Agilent)扫描。使用Imagequant软件对磷脂带定量并以mock的倍数变化表示。
的HEK293细胞一次，然后用100μM放射性标记LPC[ C]油酸温育30分钟。用含0.5％BSA的DMEM洗涤孔三次。用HIP(己烷/异丙醇，比率3:2)缓冲液提取脂质30分钟两次，用氮气流干燥，在氯仿中重构并滴入TLC板(Milipore)上。磷脂分离的溶剂为氯仿/甲醇/氨溶液(25％)(50:25:6，每体积)。将放射性标记磷脂的TLC板干燥30分钟，暴露在荧光屏下过夜并用Typhoon FLA 9000扫描仪(Agilent)扫描。使用Imagequant软件对磷脂带定量并以mock的倍数变化表示。
[0264] 血浆样品的脂质组分析。对于人类血浆样品，使用家庭1825的父亲、母亲和受影响的成员的血浆单样和家庭1422的父亲、母亲和受影响的成员的血浆复样进行LPC分析。使用前述基于甲醇的方案提取溶血磷脂(Zhao Z,Xu Y.An extremely simple method for extraction of lysophospholipids and phospholipids from blood samples.J Lipid Res 2010；51:652-9)。简而言之，将血浆样品(2μL)重悬于200μL含100pmol/mL LPC 20:0内标物(Avanti Polar Lipids,USA)的甲醇中，然后涡旋30s并在冰上超声30分钟。样品在4℃下14,000rpm离心10分钟，以除去碎片。上清液用甲醇(总体积25μL)稀释5×，然后注入LC-MS/MS。对于小鼠血浆样品，使用活性炭提取溶血磷脂。简而言之，首先用650μL PBS然后用800μL活性炭溶液(1g/50ml PBS)稀释5只WT和5只KO 3.5月龄同窝仔鼠的血浆(150μL)。样品在25℃下旋转1小时，然后10,000rpm离心5分钟，收集活性炭沉淀。沉淀用PBS洗涤三次，然后重悬于500μL PBS中。向样品加入等量的氯仿/甲醇(2:1)，在25℃下剧烈涡旋30分钟。
通过离心分离有机相，用氯仿/甲醇(2:1)进行脂质提取两次，并在N2气下干燥。在脂质组分析前，将干燥的脂质提取物重悬于150μL氯仿/甲醇1/1中，并用200μL含0.91nmol/mL LPC
20:0内标物的甲醇进一步稀释。将这些溶液注入LC/MSMS。
通过离心分离有机相，用氯仿/甲醇(2:1)进行脂质提取两次，并在N2气下干燥。在脂质组分析前，将干燥的脂质提取物重悬于150μL氯仿/甲醇1/1中，并用200μL含0.91nmol/mL LPC
20:0内标物的甲醇进一步稀释。将这些溶液注入LC/MSMS。
[0265] 质谱分析。样品随机注入LC/MSMS。每个样品的分析技术重复三次。每个样品分析之后进行空白注射以避免残留效应。通过常规注射QC样品监测整个分析中的信号稳定性。使用Kinetex HILIC固定相(150×2.1mm，2.6μm， Phenomenex,USA)在1290液相色谱系统(Agilent Technologies,USA)上进行色谱分析。对于梯度洗脱，所用的溶剂为A：95％乙腈/5％10mM甲酸铵/0.1％甲酸和B：50％乙腈/50％10mM甲酸铵/0.1％甲酸。梯度在6分钟内从0.1％至75％B，在1分钟内达到90％B，在0.1分钟内达到0.1％B，保持0.1％B达3分钟(总运行时间10.1分钟)。在这些条件下，LPC物类在约4.9分钟内洗脱。流速为0.5mL/分钟。
使用多反应监测(MRM)在6460三重四极质谱仪(Agilent Technologies,USA)上定量LPC物类。源条件如下：气体温度300℃，气流5L/分钟，鞘气流11L/分钟以及毛细管电压3500V。MRM从前体离子跃迁到胆碱头段(m/z 184)，碰撞能为29V。在20ms的驻留时间内同时监测到36次跃迁。使用MassHunter Quantitative Analysis(QQQ)软件(Agilent Technologies,USA)提取定量数据。手工组织数据以确保峰值积分正确。将每次MRM跃迁的提取离子色谱峰的曲线下面积(AUC)摘录到Excel中。脂质物类的AUC归一化为内标物的AUC。计算人和小鼠样品的全部和单个LPC物类并以μM表示。
使用多反应监测(MRM)在6460三重四极质谱仪(Agilent Technologies,USA)上定量LPC物类。源条件如下：气体温度300℃，气流5L/分钟，鞘气流11L/分钟以及毛细管电压3500V。MRM从前体离子跃迁到胆碱头段(m/z 184)，碰撞能为29V。在20ms的驻留时间内同时监测到36次跃迁。使用MassHunter Quantitative Analysis(QQQ)软件(Agilent Technologies,USA)提取定量数据。手工组织数据以确保峰值积分正确。将每次MRM跃迁的提取离子色谱峰的曲线下面积(AUC)摘录到Excel中。脂质物类的AUC归一化为内标物的AUC。计算人和小鼠样品的全部和单个LPC物类并以μM表示。
[0266] 血液LPC[14C]-油酸分析。给Mfsd2a KO和WT小鼠静脉注射100μM放射性标记LPC[14C]-油酸。2分钟后收集10μl血液样品(初始剂量)，2小时后从尾静脉采血，通过闪烁计数对放射性进行定量。KO小鼠中血浆LPC[14C]-油酸的量以每个时间点与WT的比率表示。
[0267] 统计分析
[0268] 所有体外实验分四组进行。数据以平均值和标准误差表示。我们使用学生t-检验进行组间比较(双边)。对于多个比较，我们使用GraphPad Prism软件结合方差分析进行土其检验。在MO注射后，使用Kaplan–Meier曲线计算受精后1、2和3天的存活率，该存活率与注射的mRNA无关，包括未注射。使用GraphPad Prism软件运用对数秩(Mantel-Cox)检验比较存活率曲线。p值<0.05被视为表现出统计学显著性。所有p值进行双边检验。
[0269] 结果
[0270] 研究群体
[0271] 研究招募的3396名患者代表多种单独地罕见形式的神经发育疾病，大多数可根据静止性与进展性神经进程分辨，存在癫痫、孤独症或智力障碍、总体畸形特征，或诊断研究例如脑MRI、EEG或血液化学分析的结果显著。虽然回想起来两个家庭显示出很多类似的特征，包括小头畸形、低张力型/痉挛型混合四肢麻痹、无头部控制能力、癫痫发作和脑室极度扩张，但鉴于在常规测试时不存在例外或特殊病证的结果，很难通过临床症状与群体的其余个体分辨。
[0272] 由于在生命的前3个月内不存在发育标志，对两个家庭(一个是利比亚人，另一个是埃及人)实行医疗看护。两个家庭的第一代堂表兄弟姐妹近亲通婚，每个家庭有两个受影响的成员，符合隐性遗传模式(图23A)，不存在发育迟滞的环境风险因素(Engle PL,Black MM,Behrman JR等Strategies to avoid the loss of developmental potential in more than 200million children in the developing world.Lancet 2007；369:229-42)。在出生时，受影响的成员的临床特征显示出除小头畸形之外的正常外观和生长参数，但在前几个月内出现组成型生长迟缓、癫痫和头部生长停滞。存在低张力型/痉挛型混合四肢麻痹、难以维持头部控制、胃食管反流病和吸入性肺炎。在7天和2岁之间出现癫痫，包括由疾病引发、持续3-10分钟的阵挛性或强直性痉挛。常规血液化学检验完全正常，包括全化学检验、全血细胞计数、红细胞沉降率、标准脂质表达谱、乳酸/丙酮酸、精细核型分析以及代谢中间体的临床串联质谱分析。脑成像研究显示出总体脑积水，以及侧脑室极度扩张、皮层表面衰退、小脑和脑干发育不良/萎缩(图23B)。根据专利Aqueduct of Sylvius(西尔维乌斯导水管)和推定诊断排除梗阻性脑积水，该诊断认为该病症代表迄今未知的深部白质疾病形式。
[0273] 全外显子测序
[0274] 通过移除常见变体(在我们的具有5000名个体的内部外显子数据库或具有4000名个体的NHLBI数据库中等位基因频率>0.1％)和亲代的非杂合变体从受影响的成员的WES过滤数据(Tennessen JA,Bigham AW,O'Connor TD等.Evolution and functional impact of rare coding variation from deep sequencing of human exomes.Science 2012；337:64-9)。我们鉴别了每个家庭成员中的罕见蛋白质改变变体。在这些变体中，家庭1825中仅4个变体符合遗传模式(表7)，而这些变体中仅1个通过分离分析，即MFSD2A基因中的chr1:40431005C>T变体，该变体导致c.476C>T核苷酸和p.T159M蛋白质变化。在此鉴别后，我们搜索数据库发现，家庭1422的相同基因中具有chr1:40431162C>T变体，该变体导致c.497C>T核苷酸和p.S166L蛋白质变化(图23C)。两个家庭的表型比较显示它们精确匹配。
两个变体显示出可使用标准程序(表7、表8)进行高损伤预测，该变体存在于纯合性区块中(图26)，且存在于整个脊椎动物进化中完全保守的氨基酸残基中，位于蛋白质的第4个跨膜域(图23D、图23E)。两个突变位于组成型剪接的外显子中，并且根据严格隐性遗传模式，它们在各自的家庭中是分离的(图27)。这些变体不存在于我们的具有大约10,000条染色体的内部数据集或可公开访问的数据库中。
两个变体显示出可使用标准程序(表7、表8)进行高损伤预测，该变体存在于纯合性区块中(图26)，且存在于整个脊椎动物进化中完全保守的氨基酸残基中，位于蛋白质的第4个跨膜域(图23D、图23E)。两个突变位于组成型剪接的外显子中，并且根据严格隐性遗传模式，它们在各自的家庭中是分离的(图27)。这些变体不存在于我们的具有大约10,000条染色体的内部数据集或可公开访问的数据库中。
[0275] 表7.从外显子测序获得的家庭1825的遗传性变体
[0276]
[0277] 表8.从外显子测序获得的家庭1422的遗传性变体
[0278]
[0279] 突变对mfsd2a功能的影响
[0280] 如本文所讨论，MFSD2A编码12次跨膜蛋白质，最近发现该蛋白质涉及BBB的形成和功能，并且是小鼠中DHA转运必须的(Nguyen LN,Ma D,Shui G等.Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3fatty acid docosahexaenoic acid.Nature
2014；509:503-6；Ben-Zvi A,Lacoste B,Kur E等.Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.Nature 2014；509:507-11)。由于残基N217和N227的糖基化，HEK293细胞中的MFSD2A表达在SDS-PAGE上解析为两个同种型约55kDa和约70kDa(Berger JH,Charron MJ,Silver DL.Major facilitator superfamily domain-containing protein 2a(MFSD2A)has roles in body growth,motor function,and lipid metabolism.PloS One 2012；7:e50629)。将p.T159M和p.S166L突变引入人MFSD2A蛋白质，在HEK293细胞中表达，并通过Western印迹和免疫荧光检查。两个突变的表达水平类似并显示出与WT相同的翻译后修饰，在糖基水解酶PNGase F处理后解析为低分子量实体(图24A)。此外，两个突变蛋白稳定表达，且以类似于WT的方式局部定位于质膜(图
24B)。为提供失活突变的分子基础，我们利用MFS家族的大肠杆菌钠-蜜二糖转运蛋白MelB部分的结构信息，MelB与Mfsd2a具有高度序列相似性。p.T159和p.S166二者均驻留在跨膜域4上，它们分别在钠和配体结合中起到通讯作用(Ethayathulla AS,Yousef MS,Amin A,Leblanc G,Kaback HR,Guan L.Structure-based mechanism for Na(+)/melibiose symport by MelB.Nat Commun 2014；5:3009；Cordat E,Leblanc G,Mus-Veteau I.Evidence for a role of helix IV in connecting cation-and sugar-binding sites of Escherichia coli melibiose permease.Biochemistry 2000；39:4493-9)。人残基p.T159与MelB的残基p.T221具有保守性，预测p.T159M突变会破坏钠结合相互作用，而p.S166在MelB中不是保守的(p.W228)，预测p.S166L突变会干扰LPC结合(图24C)。
2014；509:503-6；Ben-Zvi A,Lacoste B,Kur E等.Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier.Nature 2014；509:507-11)。由于残基N217和N227的糖基化，HEK293细胞中的MFSD2A表达在SDS-PAGE上解析为两个同种型约55kDa和约70kDa(Berger JH,Charron MJ,Silver DL.Major facilitator superfamily domain-containing protein 2a(MFSD2A)has roles in body growth,motor function,and lipid metabolism.PloS One 2012；7:e50629)。将p.T159M和p.S166L突变引入人MFSD2A蛋白质，在HEK293细胞中表达，并通过Western印迹和免疫荧光检查。两个突变的表达水平类似并显示出与WT相同的翻译后修饰，在糖基水解酶PNGase F处理后解析为低分子量实体(图24A)。此外，两个突变蛋白稳定表达，且以类似于WT的方式局部定位于质膜(图
24B)。为提供失活突变的分子基础，我们利用MFS家族的大肠杆菌钠-蜜二糖转运蛋白MelB部分的结构信息，MelB与Mfsd2a具有高度序列相似性。p.T159和p.S166二者均驻留在跨膜域4上，它们分别在钠和配体结合中起到通讯作用(Ethayathulla AS,Yousef MS,Amin A,Leblanc G,Kaback HR,Guan L.Structure-based mechanism for Na(+)/melibiose symport by MelB.Nat Commun 2014；5:3009；Cordat E,Leblanc G,Mus-Veteau I.Evidence for a role of helix IV in connecting cation-and sugar-binding sites of Escherichia coli melibiose permease.Biochemistry 2000；39:4493-9)。人残基p.T159与MelB的残基p.T221具有保守性，预测p.T159M突变会破坏钠结合相互作用，而p.S166在MelB中不是保守的(p.W228)，预测p.S166L突变会干扰LPC结合(图24C)。
[0281] 为测试功能破坏，在转染到HEK293细胞后，我们使用一系列浓度的LPC-[14C]DHA、LPC-[14C]油酸和LPC-[14C]棕榈酸(图24D-F)进行基于细胞的测定。p.T159M和p.S166L突变体二者基本上失活，对于所有测试的LPC-脂质，表现出与对照转染的细胞背景相似的转运活性，表明突变破坏了MFSD2A作为LPC转运蛋白的功能。HEK293细胞吸收的LPC通过细胞溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)酯化为磷脂酰胆碱(PC)，并提供了细胞摄入的另外生物化学证据。因此，评估MFSD2A和突变体构建体的LPC至PC转化率(图24G至图24I)。与表达p.T159M和p.S166L突变体的细胞相比，表达WT MFSD2A的细胞显示出外源LPC至膜PC转化率显著较高，这与突变体中转运功能丧失一致(图24F、G)。
[0282] mfsd2a突变对血浆lpc水平的影响
[0283] 我们假设，在BBB的MFSD2A摄入血浆脂质影响了血浆LPC水平，因此MSFD2A缺失应导致血浆LPC水平增加。实际上，我们发现，与对照相比，Msfd2a KO小鼠显示出总血浆LPC水平增加40％(图25A)。与对照相比，Msfd2a KO小鼠的单个LPC的水平也增加(图25B)。其它丰度较低的血浆LPC物类(例如LPC-DHA)也显示出在Msfd2a KO小鼠中的水平增加的趋势(图25B)。静脉注射LPC-[14C]油酸的示踪研究显示，在注射后2小时Msfd2a KO小鼠中的血浆LPC-[14C]油酸水平增加，这与Msfd2a KO小鼠中的血浆LPC稳态水平增加，以及Msfd2a KO小鼠中，脑的LPC摄入取决于LPC物类减少至85-90％之间的发现../Documents/tmp/％01-_ENREF_5一致。(图25C)。鉴于这些结果，我们测试了患者的血浆LPC水平是否相对于杂合亲代以及健康的年龄匹配对照有所增加。脂质组分析表明，先证者中的总血浆LPC相对于其杂合亲代和对照有所增加(图25D)。与Msfd2a KO小鼠中的发现类似，包含16:0、18:0、18:1和
18:2长度脂肪酸的常见血浆LPC物类在MSFD2A突变患者的血清中有所增加，暗示LPC摄入存在缺陷(图25E)。
18:2长度脂肪酸的常见血浆LPC物类在MSFD2A突变患者的血清中有所增加，暗示LPC摄入存在缺陷(图25E)。
[0284] 实施例11：人MFSD2A突变的建模
[0285] 我们利用MelB的详细结构信息得到失活突变p.T159M和p.S166L的分子基础。MFS家族转运的总体机制首先从大肠杆菌甘油-3-磷酸转运蛋白GlpT的X-射线结构推断，并通过其它MFS家族成员(最近发现的成员包括MFSD2A的近直系同源体MelB)的结构确认(Ethayathulla AS,Yousef MS,Amin A,Leblanc G,Kaback HR,Guan L.Structure-based mechanism for Na(+)/melibiose symport by MelB.Nat Commun 2014；5:3009；Huang Y,Lemieux MJ,Song J,Auer M,Wang DN.Structure and mechanism of the glycerol-3-phosphate transporter from Escherichia coli.Science 2003；301:616-20；Shi Y.Common folds and transport mechanisms of secondary active transporters.Annu Rev Biophys 2013；42:51-72)。该模型被描述为“摇杆-开关，交替访问”模型，其中胞外开放构象结合配体，导致构象切换为胞内开放构象(Shi Y.Common folds and transport mechanisms of secondary active transporters.Annu Rev Biophys 2013；42:51-72)。驱动该构象变化的能量由阳离子的结合提供，该能量沿浓度梯度由大变小。就MFSD2A而言，其利用钠驱动LPC的转运。实际上，MFSD2A包含保守的钠结合位点，据显示该位点对于LPC的钠依赖性转运是必需的(Nguyen LN,Ma D,Shui G等.Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3fatty acid docosahexaenoic acid.Nature 2014；509:503-6)。
[0286] 在受影响的儿童中p.T159M的功能丧失的分子解释可从MelB的原子分辨率结构推断。人MFSD2A和MelB的序列比对表明，T159与MelB中的T121具有保守性。MelB中的T121面向钠结合位点，且与钠结合残基D59形成氢键，D59相当于人MFSD2A中的D97(图24C)。T121和D59二者均为MelB转运必须的(Ethayathulla AS,Yousef MS,Amin A,Leblanc G，Kaback HR,Guan L.Structure-based mechanism for Na(+)/melibiose symport by MelB.Nat Commun 2014；5:3009)。人MFSD2A序列在MelB模型上的穿线匹配揭示，人中的T159也近似于钠结合残基D97，相当于小鼠MFSD2A中的D96，并且对于功能是重要的(Nguyen LN,Ma D,Shui G等.Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3fatty acid docosahexaenoic acid.Nature 2014；509:503-6)。与p.T159M类似，MelB中的p.T121A不具备功能。因此，预测p.T159M突变会破坏钠结合并抑制配体转运。p.S166L突变也不具备功能，并且受影响的儿童是具有p.T159M突变的儿童的临床表型模拟。有趣的是，p.T159M和p.S166L二者均驻留在跨膜域4(TMD4)上，已提出它们在配体和钠结合中起到通讯作用(Ethayathulla AS,Yousef MS,Amin A,Leblanc G,Kaback HR,Guan L.Structure-based mechanism for Na(+)/melibiose symport by MelB.Nat Commun 2014；5:3009；Cordat E,Leblanc G，Mus-Veteau I.Evidence for a role of helix IV in connecting cation-and sugar-binding sites of Escherichia coli melibiose
permease.Biochemistry 2000；39:4493-9)。S166残基在所有已测序的脊椎动物中是保守的，但在MelB中则不是保守的。此外，S166残基面向转运腔体(图24C)，暗示在配体结合中发挥作用。实际上，S166在MelB中的对应残基W128是蜜二糖转运关键的(Ethayathulla AS,Yousef MS,Amin A,Leblanc G,Kaback HR,Guan L.Structure-based mechanism for Na(+)/melibiose symport by MelB.Nat Commun 2014；5:3009；Cordat E,Leblanc G,Mus-Veteau I.Evidence for a role of helix IV in connecting cation-and sugar-binding sites of Escherichia coli melibiose permease.Biochemistry 2000；39:
4493-9)。因此，预测S166残基可能通过与LPC的磷酸胆碱头部基团形成氢键而在底物结合中发挥作用。
permease.Biochemistry 2000；39:4493-9)。S166残基在所有已测序的脊椎动物中是保守的，但在MelB中则不是保守的。此外，S166残基面向转运腔体(图24C)，暗示在配体结合中发挥作用。实际上，S166在MelB中的对应残基W128是蜜二糖转运关键的(Ethayathulla AS,Yousef MS,Amin A,Leblanc G,Kaback HR,Guan L.Structure-based mechanism for Na(+)/melibiose symport by MelB.Nat Commun 2014；5:3009；Cordat E,Leblanc G,Mus-Veteau I.Evidence for a role of helix IV in connecting cation-and sugar-binding sites of Escherichia coli melibiose permease.Biochemistry 2000；39:
4493-9)。因此，预测S166残基可能通过与LPC的磷酸胆碱头部基团形成氢键而在底物结合中发挥作用。
[0287] 实施例9、10和11所公开的研究建立了ω-3脂肪酸转运和人类脑生长之间的关系。我们鉴别的两个血缘家庭具有MFSD2A失活突变，他们在生命的前三个(3)月表现出致死性小头畸形综合征，以及大量脑积水、痉挛型四肢麻痹和癫痫。脂质分析表明血清LPC水平升高，很可能是由于MFSD2A活性缺失导致细胞摄入功能丧失。患者总体表型的严重性比从存活的敲除小鼠预测的更严重，表现出小头畸形、共济失调、记忆和学习功能缺损和焦虑(Nguyen LN,Ma D,Shui G等.Mfsd2a is a transporter for the essential omega-
3fatty acid docosahexaenoic acid.Nature 2014；509:503-6)。
3fatty acid docosahexaenoic acid.Nature 2014；509:503-6)。
[0288] 虽然本发明的具体方面进行了描述和说明，但如根据所附权利要求书所解释，这些方面应仅视为展示本发明，而非限制本发明。
[0289] 本说明书引用的所有出版物和专利申请为了所有目的均全文以引用的方式并入本文，如同具体且单独地说明单个出版物或专利申请为了所有目的以引用的方式并入。
[0290] 尽管为了清晰理解已经通过举例说明和实施例的方式相当详细地描述了上述本发明，但对于本领域的普通技术人员将显而易见的是按照本发明的教导内容在不脱离所附权利要求书的精神或范围的情况下可进行各种变化和修改。
[0291] 表1.HEK239细胞摄入的游离脂肪酸的质谱分析。表达Mfsd2a的HEK293细胞用100uM指定的脂肪酸/BSA复合物温育过夜。如方法部分所述提取脂质并通过MS进行磷脂分析。每种脂质物类的量归一化为内标物并以所分析的总磷脂中的摩尔百分比表示。
[0292]
[0293]
[0294]
[0295]
[0296]
[0297]
[0298]
[0299]
[0300]
[0301]
[0302]
[0303]
[0304]
[0305]
[0306]
[0307]
[0308]
[0309]
[0310]
[0311]
[0312]
[0313]
[0314]
[0315]
[0316]
[0317]
[0318]
[0319]
[0320] 表2.脂质组分析。图2的完整数据集。如方法部分所述提取脂质并通过MS进行磷脂分析。每种脂质物类的量归一化为内标物并以所分析的总磷脂中的摩尔百分比表示。红色和蓝色突出显示分别表示含DHA的物质和含AA的物类。
[0321]
[0322]
[0323]
[0324]
[0325]
[0326]
[0327]
[0328] 表3.脂质组分析。扩展数据2d的完整数据集。如方法部分所述提取脂质并通过MS进行磷脂分析。每种脂质物类的量归一化为内标物并以所分析的总磷脂中的摩尔百分比表示。红色和蓝色突出显示分别表示含DHA的物质和含AA的物类。
[0329]
[0330]
[0331]
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 适于采用诊断适当性标准来确定用于识别病变的诊断试验的最佳顺序的医疗鉴别诊断装置 | 2020-05-15 | 367 |
| 猪繁殖与呼吸综合征血清学鉴别诊断试剂盒 | 2020-05-13 | 59 |
| 鉴别诊断不同类型痴呆的方法 | 2020-05-11 | 887 |
| 一种心肌肥厚基因鉴别诊断试剂盒 | 2020-05-12 | 630 |
| 心力衰竭恶化的自动鉴别诊断 | 2020-05-13 | 988 |
| 心电多相信息鉴别诊断仪 | 2020-05-13 | 76 |
| 用于自身免疫疾病的鉴别诊断的方法 | 2020-05-12 | 246 |
| 用于鉴别诊断不同牛泰勒虫的试剂盒及方法 | 2020-05-14 | 91 |
| 改良细菌鉴别诊断剂 | 2020-05-11 | 80 |
| 组合式定位鉴别诊断培养盒 | 2020-05-14 | 994 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈