口蹄疫(foot-and-mouth disease，以下简称FMD)是由口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus，以下简称FMDV)感染引起的多种偶蹄动物共 患的一种急性、烈性、高度接触性、发热性传染病，以流行广、传播快、发病 率高而著称。该病的发生和流行严重危害畜牧业的健康持续发展，造成巨大的 经济损失，同时口蹄疫也是人畜共患病，因此世界各国相当重视对该病的研究 和防制。
2003年10月9日在中国申请的申请号为200310100114.5的专利《一种口 蹄疫病毒非结构蛋白基因3ABC及其制备方法与应用》公开了口蹄疫病毒 3ABC的基因及利用该基因建立可鉴别口蹄疫免疫动物与野毒感染动物的诊 断试剂盒。此发明专利中的检测抗原仅是初步提纯的包涵体，除重组3ABC抗 原外，还含有大量杂质蛋白，在动物血清中发现大肠杆菌抗体是一个常见现象， 包涵体中含有的大肠杆菌菌体蛋白会与被检血清中的大肠杆菌抗体反应，因而 大肠杆菌系统表达的蛋白由于纯化问题会导致一定的假阳性检出率；又由于灭 活疫苗中制备过程中可能会残留痕量3ABC抗原特别是3A抗原，可诱导机体 产生抗非结构蛋白抗体，重复注射疫苗后尤为明显。在野外检测重复注射疫苗 动物血清时，偶尔也能检测到非结构蛋白抗体阳性或可疑抗体。Bergman等还 发现，年龄大的、重复注射疫苗的动物偶尔在EITB(酶联免疫吸附电转移测 试)中出现1条或1条以上3ABC蛋白阳性反应带，因而用全长的3ABC基 因转化的抗原作为包被抗原也存在混淆感染抗体和免疫抗体的可能。

本发明是为了解决现有的口蹄疫鉴别抗原会出现非特异性反应，造成检出 假阳性的问题，而提供鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列。
本发明第一种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列长度为72bp，基因 序列如SEQ ID NO.1所示。
将本发明第一种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列命名为BF基因。
本发明第二种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列长度为177bp，基因 序列如SEQ ID NO.2所示。本发明第二种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因 序列是以本发明SEQ ID NO.1所示基因序列为基本单元，并以编码连接肽 GGTGGTGGTGGATCC在各基本单元之间进行串联，本发明第二种鉴别诊断 口蹄疫的表位抗原的基因序列由2个基本单元和1个编码连接肽串联而成。
将本发明第二种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列命名为2BF基因。
本发明第三种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列长度为351bp，基因 序列如SEQ ID NO.3所示。本发明第三种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因 序列是以本发明SEQ ID NO.1所示基因序列为基本单元，并以编码连接肽 GGTGGTGGTGGATCC在各基本单元之间进行串联，本发明第三种鉴别诊断 口蹄疫的表位抗原的基因序列由4个基本单元和3个编码连接肽串联而成。
将本发明第三种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列命名为4BF基因。
本发明第四种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列长度为525bp，基因 序列如SEQ ID NO.4所示。本发明第四种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因 序列是以本发明SEQ ID NO.1所示基因序列为基本单元，并以编码连接肽 GGTGGTGGTGGATCC在各基本单元之间进行串联，本发明第四种鉴别诊断 口蹄疫的表位抗原的基因序列由6个基本单元和5个编码连接肽串联而成。
将本发明第四种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列命名为6BF基因。
本发明第五种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列长度为699bp，基因 序列如SEQ ID NO.5所示。本发明第五种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因 序列是以本发明SEQ ID NO.1所示基因序列为基本单元，并以编码连接肽 GGTGGTGGTGGATCC在各基本单元之间进行串联，本发明第五种鉴别诊断 口蹄疫的表位抗原的基因序列由8个基本单元和7个编码连接肽串联而成。
将本发明第五种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列命名为8BF基因。
本发明的鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列表达的蛋白具有以下优 点：
1、表达的蛋白(nBF蛋白，nBF蛋白包括BF基因表达的蛋白、2BF基 因表达的蛋白、4BF基因表达的蛋白、6BF基因表达的蛋白和8BF基因表达 的蛋白)可检测所有易感动物的所有亚型的FMDV
nBF蛋白抗原表位在各型FMDV都高度保守，用NCBI的Blast进行相似 性搜索发现，组成nBF蛋白的多肽与口蹄疫南非2型(SAT2-FMDV)相似性 最差，但相似度也在93％～96％，因此nBF蛋白可检测所有亚型的FMDV感染 抗体。
2、表达nBF蛋白的生产工艺简单且成本低
本发明的基因序列可以通过IPTG诱导重组大肠杆菌在体外大量的表达 nBF蛋白，大规模工业生产还可使用乳糖代替IPTG进一步降低成本；大肠杆 菌的工业发酵工艺已相当成熟，相对于基于口蹄疫全病毒制备抗原来说，所需 生产设备要少、生产工艺简单，并且生产成本较低。
3、表达的蛋白可通过检测动物血清来区分灭活疫苗免疫动物与野毒感染 动物
含有BF表位的非结构蛋白在口蹄疫病毒复制时大量产生，因此口蹄疫 感染动物可在体内产生高水平的抗BF抗体，而灭活疫苗中非结构蛋白被去除， 动物免疫后将不产生抗BF抗体。因此用优选出的纯化8BF蛋白建立ELISA， 可通过检测动物血清来区分灭活疫苗免疫动物与野毒感染动物。
4、本发明基因所表达的nBF蛋白的基本单元序列仅编码24个氨基酸， 所以克服了大分子量重组蛋白(如专利200310100114.5的重组3ABC约870 个氨基酸)因存在众多可以同其他小核糖核酸病毒抗体产生交叉反应的表位， 可能出现许多非特异性反应的缺陷，因此本发明基因不产生假阳性的问题。
5、本发明的基因表达的nBF蛋白都是可溶性的，而不是包涵体。
6、用Western blot方法分析筛选已表达的nBF蛋白，证明口蹄疫标准阳 性血清(O型和Asia I型)都可与之发生特异性反应，而与疫苗免疫血清则不发 生反应。选用表达量大且抗原性好的8BF蛋白，亲合层析纯化后建立可鉴别 口蹄疫免疫动物与野毒感染动物的间接ELISA(酶联免疫吸附试验)。
附图说明
图1为具体实施方式五的蛋白可溶性分析图；图2为具体实施方式六的蛋 白鉴定口蹄疫的效果图。

具体实施方式一：本实施方式的鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列 为：GGTCCTTATGCTGGTCCAATGGAACGTCAGAAACCTCTCAAAGTGAA AGCCAAAGCGCCGGTGGTGAAAGAA。
本实施方式的基因序列交由基因工程公司合成。
本实施方式的基因序列也可以采用SOE-PCR方法人工合成(人工合成操 作由东北农业大学动物医学院微生物考研室独立完成)。
具体实施方式二：本实施方式的鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列 为：GGTCCTTATGCTGGTCCAATGGAACGTCAGAAACCTCTCAAAGTGAA AGCCAAAGCGCCGGTGGTGAAAGAAGGTGGTGGTGGATCTGGTCCTTAT GCTGGTCCAATGGAACGTCAGAAACCTCTCAAAGTGAAAGCCAAAGCG CCGGTGGTGAAAGAAGGTGGTGGTGGATCCTAA。
本实施方式的基因序列交由基因工程公司合成。
本实施方式的基因序列也可以由具体实施方式一的鉴别诊断口蹄疫的表 位抗原的基因序列和编码连接肽采用酶切连接的方法构建。
本实施方式的鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列是以具体实施方式 一所示基因序列为基本单元，并以编码连接肽GGTGGTGGTGGATCC在各基 本单元之间进行串联，本实施方式的鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列由 2个基本单元和1个编码连接肽串联而成。
具体实施方式三：本实施方式的鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列 为：GGTCCTTATGCTGGTCCAATGGAACGTCAGAAACCTCTCAAAGTGAA AGCCAAAGCGCCGGTGGTGAAAGAAGGTGGTGGTGGATCTGGTCCTTAT GCTGGTCCAATGGAACGTCAGAAACCTCTCAAAGTGAAAGCCAAAGCG CCGGTGGTGAAAGAAGGTGGTGGTGGATCTGGTCCTTATGCTGGTCCAA TGGAACGTCAGAAACCTCTCAAAGTGAAAGCCAAAGCGCCGGTGGTGA AAGAAGGTGGTGGTGGATCTGGTCCTTATGCTGGTCCAATGGAACGTCA GAAACCTCTCAAAGTGAAAGCCAAAGCGCCGGTGGTGAAAGAAGGTGG TGGTGGATCCTAA。
本实施方式的基因序列交由基因工程公司合成。
本实施方式的基因序列也可以由具体实施方式一的鉴别诊断口蹄疫的表 位抗原的基因序列和编码连接肽采用酶切连接的方法构建。
本实施方式的鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列是以具体实施方式 一所示基因序列为基本单元，并以编码连接肽GGTGGTGGTGGATCC在各基 本单元之间进行串联，本实施方式的鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列由 4个基本单元和3个编码连接肽串联而成。
具体实施方式四：本实施方式的鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列 为：GGTCCTTATGCTGGTCCAATGGAACGTCAGAAACCTCTCAAAGTGAA AGCCAAAGCGCCGGTGGTGAAAGAAGGTGGTGGTGGATCTGGTCCTTAT GCTGGTCCAATGGAACGTCAGAAACCTCTCAAAGTGAAAGCCAAAGCG CCGGTGGTGAAAGAAGGTGGTGGTGGATCTGGTCCTTATGCTGGTCCAA TGGAACGTCAGAAACCTCTCAAAGTGAAAGCCAAAGCGCCGGTGGTGA AAGAAGGTGGTGGTGGATCTGGTCCTTATGCTGGTCCAATGGAACGTCA GAAACCTCTCAAAGTGAAAGCCAAAGCGCCGGTGGTGAAAGAAGGTGG TGGTGGATCTGGTCCTTATGCTGGTCCAATGGAACGTCAGAAACCTCTCA AAGTGAAAGCCAAAGCGCCGGTGGTGAAAGAAGGTGGTGGTGGATCTG GTCCTTATGCTGGTCCAATGGAACGTCAGAAACCTCTCAAAGTGAAAGC CAAAGCGCCGGTGGTGAAAGAAGGTGGTGGT GGATCCTAA。
本实施方式的基因序列交由基因工程公司合成。
本实施方式的基因序列也可以由具体实施方式一的鉴别诊断口蹄疫的表 位抗原的基因序列和编码连接肽采用酶切连接的方法构建。
本实施方式的鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列是以具体实施方式 一所示基因序列为基本单元，并以编码连接肽GGTGGTGGTGGATCC在各基 本单元之间进行串联，本实施方式的鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列由 6个基本单元和5个编码连接肽串联而成。
具体实施方式五：本实施方式的鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列 为：GGTCCTTATGCTGGTCCAATGGAACGTCAGAAACCTCTCAAAGTGAA AGCCAAAGCGCCGGTGGTGAAAGAAGGTGGTGGTGGATCTGGTCCTTAT GCTGGTCCAATGGAACGTCAGAAACCTCTCAAAGTGAAAGCCAAAGCG CCGGTGGTGAAAGAAGGTGGTGGTGGATCTGG TCCTTATGCTGGTCCAA TGGAACGTCAGAAACCTCTCAAAGTGAAAGCCAAAGCGCCGGTGGTGA AAGAAGGTGGTGGTGGATCTGGTCCTTATGCTGGTCCAATGGAACGTCA GAAACCTCTCAAAGTGAAAGCCAAAGCGCCGGTGGTGAAAGAAGGTGG TGGTGGATCTGGTCCTTATGCTGGTCCAATGGAACGTCAGAAACCTCTCA AAGTGAAAGCCAAAGCGCCGGTGGTGAAAGAAGGTGGTGGTGGATCTG GTCCTTATGCTGGTCCAATGGAACGTCAGAAACCTCTCAAAGTGAAAGC CAAAGCGCCGGTGGTGAAAGAAGGTGGTGGTGGATCTGGTCCTTATGCT GGTCCAATGGAACGTCAGAAACCTCTCAAAGTGAAAGCCAAAGCGCCG GTGGTGAAAGAAGGTGGTGGTGGATCTGGTCCTTATGCTGGTCCAATGG AACGTCAGAAACCTCTCAAAGTGAAAGCCAAAGCGCCGGTGGTGAAAG AAGGTGGTGGTGGATCCTAA。
本实施方式的基因序列交由基因工程公司合成。
本实施方式的基因序列也可以由具体实施方式一的鉴别诊断口蹄疫的表 位抗原的基因序列和编码连接肽采用酶切连接的方法构建。
本实施方式的鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列是以具体实施方式 一所示基因序列为基本单元，并以编码连接肽GGTGGTGGTGGATCC在各基 本单元之间进行串联，本实施方式的鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列由 8个基本单元和7个编码连接肽串联而成。
将本实施方式的鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列连接至原核表达 载体pET-30a(+)的BamH I和Xho I位点，构建pET-30a(n+)BF表达载体，转 入表达宿主菌BL21(DE3)plys后经IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)诱导 表达蛋白，具体步骤及操作参见《分子克隆实验指南》(第三版p217-p232)。
本实施方式的载体、宿主、酶、试剂均购于大连宝生物公司。
将本实施方式的鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列表达的蛋白进行 可溶性分析，分析结果如图1所示，图1中第1道的从上到下的蛋白质分子质 量标准分别为116.0ku、66.2ku、45.0ku、35.0ku、25.0ku、18.0ku和14.0ku； 第2道为空载体菌诱导后对照；第3道为8BF/BL21重组菌诱导后对照；第4 道为细菌裂解液上清；第5道为细菌裂解液沉淀。
从图1中可以看出本实施方式的基因表达的蛋白几乎全都在表达在上清 部分，而沉淀部分几乎没有，即8BF蛋白几乎全部为可溶性表达而不是包涵体 表达。
具体实施方式六：将具体实施方式二至具体实施方式五的鉴别诊断口蹄疫 的表位抗原的基因序列分别连接至原核表达载体pET-30a(+)的BamH I和 Xho I位点，构建pET-30a(n+)BF表达载体，转入表达宿主菌BL21(DE3)plys 后经IPTG(异丙基β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达了4种蛋白，具体步骤及操 作参见《分子克隆实验指南》(第三版p217-p232)。
本实施方式的载体、宿主、酶、试剂均购于大连宝生物公司。
将表达的这4种蛋白通过western blot的方法进行抗原性分析：
以4种蛋白(具体实施方式二至具体实施方式五4个基因序列各自所表达 的蛋白)为被检抗原，原核表达的带有组氨酸标签的FMDV-VP2蛋白(重组口 蹄疫vp2蛋白)做为阳性参照蛋白，原核表达的带有组氨酸标签的禽流M蛋白 作为阴性参照蛋白；以牛Asia型口蹄疫病毒阳性血清为一抗；兔抗牛IgG-HRP (Sigma公司产品，辣根过氧化物酶标记的免抗牛IgG)为二抗参照《免疫学 常用实验方法》进行Western blot操作。
结果如图2所示，图2中第1道为原核表达的带有组氨酸标签的禽流M 蛋白，可见其与FMDV阳性血清无反应；第2道为2BF蛋白与口蹄疫阳性血 在预期位置出现特异性条带；第3道为4BF蛋白与口蹄疫阳性血在预期位置 出现特异性条带；第4道为6BF蛋白与口蹄疫阳性血在预期位置出现特异性 条带；第5道为8BF蛋白与口蹄疫阳性血在预期位置出现特异性条带；第6 道为原核表达的带有组氨酸标签的FMDV-VP2蛋白，可见其与FMDV阳性血清 反应的特异性条带，证明此western blot系统有效。
由图2可见4种蛋白中8BF与口蹄疫阳性血清的反应性最强。
序列表
<110>东北农业大学
<120>鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列
<160>5
<210>1
<211>72
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>本发明第一种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列。
<400>1
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<210>2
<211>177
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>本发明第二种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列。
<400>2
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<210>3
<211>351
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>本发明第三种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列。
<400>3
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<210>4
<211>525
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>本发明第四种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列。
<400>4
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<223>本发明第五种鉴别诊断口蹄疫的表位抗原的基因序列。
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