细胞培养基的营养添加剂
阅读：5发布：2020-08-21
专利汇可以提供细胞培养基的营养添加剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 是关于一种制造细胞培养基的营养添加剂的方法，包含将 哺乳动物 的血液离心后取出上清液；添加血小板活化剂至该上清液中以得出上清活化液；及灭菌该上清活化液。本发明还关于一种使用上述方法制造的细胞培养基的营养添加剂；一种包含该营养添加剂的细胞培养基；以及一种将该细胞培养基用于在组织工程或再生医疗上培养或处理细胞的用途。，下面是细胞培养基的营养添加剂专利的具体信息内容。
1.一种制造细胞培养基的营养添加剂的方法，其包含
a.将哺乳动物的血液离心后取出上清液；
b.添加血小板活化剂至该上清液中以得出上清活化液；及
c.灭菌该上清活化液；
其中，所述的血小板活化剂包含胶原蛋白、凝血酶及氯化钙，所述胶原蛋白、凝血酶及氯化钙的浓度范围为：
胶原蛋白1000μg/ml至5000μg/ml、凝血酶5U/ml至50U/ml、氯化钙0.1％至4.0％；
胶原蛋白1000μg/ml至5000μg/ml、凝血酶0.1U/ml至2.0U/ml、氯化钙0.1％至
4.0％；或
胶原蛋白10μg/ml至800μg/ml、凝血酶5U/ml至50U/ml、氯化钙0.1％至4.0％。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤a的离心方式为100g至5000g离心三次。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述步骤a的离心方式为第一次100g至500g离心5至10分钟、第二次100g至500g离心5至10分钟、第三次1000g至5000g离心5至10分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤a的上清液中血小板浓度范围为每毫升
500000至1000000个血小板。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细胞培养基是干细胞培养基。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述哺乳动物是猪。
7.一种以权利要求1所述的方法制造的细胞培养基的营养添加剂。
8.根据权利要求7所述的营养添加剂，其具有促进细胞增生及存活的效用。
9.根据权利要求7所述的营养添加剂，其中，所含的内毒素少于0.03EU/mL。
10.根据权利要求7所述的营养添加剂，其具有胰蛋白酶抑制活性。
11.一种包含权利要求7所述的营养添加剂的细胞培养基。
细胞培养基的营养添加剂
技术领域
[0001] 本发明关于一种新式细胞培养基添加剂。
背景技术
[0002] 干细胞于近几年来成为组织工程的首要研究之一，其可分化为多种组织细胞以应用于再生医疗，如：骨细胞、神经细胞、心肌细胞及胰岛细胞等，但临床及组织应用最大的瓶颈是无法在体外快速培养至治疗所需的数量，以致难以普遍实际应用于医疗上。
[0003] 目前许多研究胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)普遍被应用作为细胞培养基添加剂。胎牛血清是一种源自未出生胎牛血液通过离心程序去除红血球后所得的血清，一般添加5～20％的胎牛血清于培养基中以促进细胞的增生。使用胎牛血清作为培养基补充剂，一直是受到争议的问题，其生产与使用始终伴随着伦理及科学的争议。通常胎牛血清的收集部分是一导管插入脐带收集血液，另一方法则是利用12到16针规(gauge)的针头直接插入胎牛的心脏并抽取血液，两种方式皆可能造成胎牛的痛苦。目前全球每年胎牛血清的生产量约为50万升，而每头胎牛仅能取得约0.5升的血清，推算可得知每年约有百万头胎牛因此而牺牲，而此胎牛血清的制造一直被动物保护人士所诟病。而在科学上，血清含丰富的蛋白质、生长因子、激素、营养素与代谢物、脂质、矿物质与抑制物，其组成复杂且具有存在污染物的可能性，常对研究质量造成影响。
[0004] 在台湾，一头达上市体重的肉猪约可取得2.5升的血液，则台湾一年应可收集约2200万升的猪血液(农委会网站http://www.coa.gov.tw/show_index.php，2009畜牧统计)。目前台湾境内收集猪血液后的利用主要加工成为食品或经喷雾干燥后制成饲料用血粉，同时猪的生理组成及构造与人类相似，可将其血液作为利用。而血液制剂(blood product，BP)则是一种经处理的血小板浓缩血浆，其较全血高出约8倍的血小板浓度，其中每个血小板约含有50～80个α颗粒(α-granules)，血小板在正常生理凝血反应下，会聚集于受伤组织并刺激α颗粒释放生长因子使伤口愈合，其α颗粒经活化后可释放多种生长因子，如：胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、角质化细胞生长因子(keratinocyte growth factor，KGF)、血小板来源生长因子(platelet-derived growth，PDGF)及转化生长因子-β(transforming growth factor，TGF-β)等。
发明内容
[0005] 本发明自猪血液开发一种合适于细胞培养用的新式营养添加剂，自猪血液以不同离心方式浓缩制成猪血液制剂(porcine blood product，P-BP)，加入不同活化剂组合配方活化血小板以释放生长因子。经定量分析后以Design-Expert软件设计最佳的活化剂配方，并检测重金属及纤维连接素含量。配制成培养基与胎牛血清及市售无血清培养基，以比较对人类干细胞粘附率、增生率及存活率的影响。本发明中设计Co(+)T(+)Ca(-)、Co(+)T(-)Ca(-)及Co(-)T(+)Ca(-)等三组为最佳活化配方。含量分析结果显示P-BP不含有害的重金属，而纤维连接素含量较市售血清少，在细胞培养的结果同时显示细胞的粘附较缓慢。细胞培养结果显示三种P-BP可促进细胞增生率及存活率。由此可知，本发明的细胞培养基的营养添加剂可更有效地促进细胞的增生速度，并达市售培养基2倍以上的效果。本发明的细胞培养基的营养添加剂可使细胞于较短时间内大量增生，可快速培养细胞将其应用于组织工程，或应用于再生医疗上使用。相较于市售培养基，本发明的细胞培养基的营养添加剂可显著地降低细胞的破裂及形态上伤害，并提供细胞最适生长环境。本发明的细胞培养基的营养添加剂还可与生物材料(biomaterial)结合，放置于生物体内达伤口快速修复及愈合的效果，以帮助再生医疗领域的发展。
[0006] 本文中所使用的术语意义除非另有特别界定，否则均与熟习此所述技艺者的普遍认知相同。本申请案中使用的术语其意义如下所列：
[0007] “血小板活化剂”意指任何可刺激血小板释放生长因子的物质，该生长因子通常可促进细胞快速增生。生长因子包括但不限于IGF、KGF、PDGF或TGF-β。
[0008] 因此，本发明提供一种制造细胞培养基的营养添加剂的方法，包含：a.将哺乳动物的血液离心后取出上清液；b.添加血小板活化剂至该上清液中以得出上清活化液；及c.灭菌该上清活化液。在较佳实施例中，步骤a的离心方式是100g至5000g离心三次；在更佳实施例中，步骤a的离心方式是第一次100g至500g离心5至10分钟、第二次100g至500g离心5至10分钟、第三次1000g至5000g离心5至10分钟。在较佳实施例中，步骤a的上清液中血小板浓度范围为每毫升500000至1000000个血小板。
[0009] 在较佳实施例中，该血小板活化剂包含选自胶原蛋白、凝血酶及氯化钙所组成群组的活化剂。在更佳实施例中，该血小板活化剂包含胶原蛋白、凝血酶及氯化钙，其中胶原蛋白、凝血酶及氯化钙的浓度范围较佳为胶原蛋白1000μg/ml至5000μg/ml、凝血酶5U/ml至50U/ml、氯化钙0.1％至4.0％；胶原蛋白1000μg/ml至5000μg/ml、凝血酶0.1U/ml至2.0U/ml、氯化钙0.1％至4.0％；或胶原蛋白10μg/ml至800μg/ml、凝血酶5U/ml至50U/ml、氯化钙0.1％至4.0％。
[0010] 在较佳实施例中，该细胞培养基是干细胞培养基。
[0011] 在较佳实施例中，该哺乳动物是猪。
[0012] 本发明还提供一种以上述方法制造的细胞培养基的营养添加剂。在较佳实施例中，该细胞培养基的营养添加剂具有促进细胞增生及存活的效用。在另一较佳实施例中，该营养添加剂所含的内毒素少于0.03EU/mL。在另一较佳实施例中，该营养添加剂具有胰蛋白酶抑制活性。
[0014] 图1是TGF-β的RSM图；
[0015] 图2是PDGF的RSM图；
[0016] 图3是IGF的RSM图；
[0017] 图4是KGF的RSM图；
[0018] 图5是TGF-β的Cube图；
[0019] 图6是PDGF的Cube图；
[0020] 图7是IGF的Cube图；
[0021] 图8是KGF的Cube图；
[0022] 图9是毛细管电泳结果图；
[0023] 图10显示细胞粘附率试验结果；
[0024] 图11显示细胞增生率试验结果；
[0025] 图12显示细胞存活率试验结果；
[0026] 图13显示内毒素试验结果；
[0027] 图14显示三种不同成份的P-BP与FBS比较酶抑制的能力结果。
具体实施方式
[0028] 本发明可能以不同的形式来实施，并不仅限于下列文中所提及的实例。下列实施例仅作为本发明不同面向及特点中的代表。
[0029] 实施例1
[0030] 猪血液血液制剂的制备：
[0032] 2.将采集的血液于室温经5-10分钟三次100～5000g离心后取出上清液(第一次100-500g离心5-10分钟、第二次100-500g离心5-10分钟、第三次1000-5000g离心5-10分钟方式浓缩)。
[0033] 3.加入不同浓度的胶原蛋白、凝血酶及氯化钙配方组合，Co (+)添加胶原蛋白的浓度为1000～5000μg/ml，Co(-)为胶原蛋白10～800μg/ml，T(+)为添加凝血酶5～50U/ml，T(-)为凝血酶0.1～2.0U/ml，Ca(+)则为氯化钙5～30％，Ca(-)为氯化钙0.1～
4.0％(表1)，再于15至45℃水浴下50-100rpm震荡活化10～60分钟，活化完毕后再以
500-15,000g离心萃取上清活化液。
4.0％(表1)，再于15至45℃水浴下50-100rpm震荡活化10～60分钟，活化完毕后再以
500-15,000g离心萃取上清活化液。
[0034] 4.以0.10～0.50μm滤膜过滤，便取得猪血液血液制剂。
[0035] 表1活化剂配方的添加方法
[0036]
[0037] 实施例2
[0038] 生长因子含量检测：
[0040] 2.利用CUSABIO CSE-E06800p生长因子ELISA分析试剂盒分析P-BP生长因子含量，依照标准曲线计算出P-BP的KGF含量。
[0041] 3.利用R&D系统DHD00B生长因子ELISA分析试剂盒分析P-BP生长因子含量，依照标准曲线计算出P-BP的PDGF含量。
[0042] 4.利用R&D系统MB100B生长因子ELISA分析试剂盒分析P-BP生长因子含量，依照标准曲线计算出P-BP的TGF-β含量。
[0043] 5.结果显示于表2，P-BP经活化后所有生长因子分泌量皆显著提高(p＜0.05)，TGF-β、PDGF、KGF的分泌量高于FBS，特别是TGF-β达显著的差异(p＜0.05)，并参照下方表格。生长因子可促进细胞增生，降低细胞增生的所需时间，P-BP生长因子含量较市售胎牛血清及无血清培养基高，其在培养时可较快速增生细胞，使细胞达一定数量于医疗或试验上利用。
[0044] 表2经ELISA测定生长因子含量的结果
[0045]
[0046] 实施例3
[0047] 最佳活化配方设计：
[0048] 以Design-Expert软件分析生长因子含量的结果，计算出各活化剂对各生长因子释放的影响，并以方差分析(ANOVA)数值表示(表3)，A为胶原蛋白、B为凝血酶、C为氯化钙，ANOVA指数显示活化剂对生长因子释放的影响，数值大则表示活化剂能使血小板释放更多含量的生长因子。其中经胶原蛋白、氯化钙活化会增加TGF-β及PDGF的释放，氯化钙则增加KGF的分泌，结果参考RSM(响应面方法(response surface methodology))及立方体(Cube)效益图(图1至图8)，最后得Co-T+Ca-、Co+T-Ca-及Co+T+Ca-为可能的最佳配方。
[0049] 表3经Design-Expert软件分析，各活化剂对生长因子释放的指数[0050]
[0051]
[0052] 实施例4
[0053] 重金属分析：
[0054] 1.样品添加等量硝酸及双氧水(2∶1)溶液后，以400℃高温加热进行降解程序。降解完的产物回溶至0.2M硝酸中，再以电感耦合等离子体质谱分析仪(ICP-MS，SCIEX ELAN 5000，Perkin Elmer，USA)检测离子含量。结果显示(表4)钴、镉、汞及铅的金属离子含量无显著差异，并不含有对动物体有害的重金属含量。同时三种P-BP在硒的含量皆高于FBS，硒为必要微量元素，可有助于细胞的抗氧化能力。
[0055] 表4P-BP与市售血清做原电感耦合等离子体质谱取得的离子含量结果[0056]
[0057] 实施例5
[0058] 以毛细管电泳测定纤维连接素(fibronectin)：
[0059] 1.以0.1N NaOH活化毛细管。
[0060] 2.以DDH2O将NaOH洗脱。
[0061] 3.将缓冲液注入毛细管中。
[0062] 4.将样本注入毛细管。
[0064] 6.分离结束后，以DDH2O将毛细管内清洗。
[0065] 7.毛细管电泳操作过程的条件如表5所示。
[0066] 8.缓冲液系统：三(羟甲基)甲基甘氨酸(两性离子缓冲剂(Tricine))缓冲液，在1000mL DDH2O溶液中含有0.33％三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1.44％氨基乙酸(glycine)、0.1％SDS(pH＝8.3)。
[0067] 9.纤维连接素会在2-5分钟的间出现波锋，检测结果为图9，图中显示三种P-BP纤维连接蛋白含量皆低于市售胎牛血清，而纤维连接蛋白为细胞粘附因子，其含量可能影响细胞于一定时间内的粘附率。
[0068] 表5毛细管电泳操作过程的条件
[0069]时间[分] 事件 值 期间
1 冲洗压 30.0psi 3.00分
2 冲洗压 35.0psi 2.00分
3 冲洗压 30.0psi 2.00分
4 注射压 1.5psi 20秒
5 0.00 独立电压 25.0KV 15.0分
6 0.50 归零
7 15.00 终止数据
8 15.00 冲洗压 40psi 2.00分
9 18.00 结束
1 冲洗压 30.0psi 3.00分
2 冲洗压 35.0psi 2.00分
3 冲洗压 30.0psi 2.00分
4 注射压 1.5psi 20秒
5 0.00 独立电压 25.0KV 15.0分
6 0.50 归零
7 15.00 终止数据
8 15.00 冲洗压 40psi 2.00分
9 18.00 结束
[0070] 实施例6
[0071] 干细胞的分离：
[0072] 1.检体取得皆符合中国文化大学及台北荣民总医院的伦理规范。
[0073] 2.由荣总取得脂肪检体，先添加含5％抗生素的PBS，以离心方式清洗检体并分离多余杂质。
[0074] 3.再加入0.075％胶原酶(collagenase)于37℃进行降解作用30分钟。
[0075] 4.加入10％胎牛血清培养基终止反应，再以离心方式分离沉淀的干细胞。
[0076] 5.以20-100μm滤膜过滤，于烧瓶内培养。
[0077] 实施例7
[0078] 人类干细胞培养基制备：
[0079] 1.将粉状DMEM培养基以无菌水配置，添加抗生素1％的比例，再添加市售FBS(海克隆，美国(Hyclone，USA))、无血清培养基(serum-free medium，SFM；StemPro，USA)、SFM(CEF，USA)、Co(-)T(+)Ca(-)、Co(+)T(-)Ca(-)及Co(+)T(+)Ca(-)血液制剂10％的含量至培养基中，以0.10～0.50μm滤膜过滤，以完成人类干细胞培养基。
[0080] 实施例8
[0081] 人类干细胞培养试验：
[0082] 1.使用猪血液制剂培养基与胎牛血清(Hyclone，USA)及市售两种SFM(英杰，美国，加利福尼亚(Invitrogen，USA，California)；细胞工程技术公司，美国爱荷华州(Cellular Engineering Technologies Inc.，CET，USA，Iowa))比较对人类干细胞培养的影响，细胞皆种入1×104cell/cm2，以75T烧瓶(Orange Scientific)并于5％CO2、37℃环境下培养。
[0083] 实施例9
[0084] 细胞粘附率试验：
[0085] 1.添加猪血液制剂培养基、胎牛血清培养基及市售无血清培养基至干细胞培养上。
[0086] 2.培养24小时后以锥虫蓝(trypan Blue)染色，并以细胞计数仪(invitrogen，USA)计数已粘附及未粘附的细胞数。
[0087] 3. 计 算 出 细 胞 粘 附 率，结 果 为 图 10。 粘 附 率 计 算 公 式：
[0088] 4.其中胎牛血清粘附率为最佳的85％，因胎牛血清在纤维连接素测定的结果显示其纤维连接素含量较高，而纤维连接素为可助于细胞粘附的因子，可证明两试验的结果相符。
[0089] 实施例10
[0090] 细胞增生率试验：
[0091] 1.添加猪血液制剂培养基、胎牛血清培养基及市售无血清培养基至干细胞培养上。
[0092] 2.培养人类干细胞24、48、72及96小时后以锥虫蓝染色，以细胞计数仪(invitrogen，USA)计数粘附的细胞取得增生率，其结果表示于图11。
[0093] 3.其结果显示三种血液制剂对人类干细胞皆有较佳的增生率：
[0094] Co(+)T(+)Ca(-)：221％
[0095] Co(+)T(-)Ca(-)：253％
[0096] Co(-)T(+)Ca(-)：164％
[0097] 4.本发明与市售培养基相比，能花费较短时间使细胞生长至一定细胞数量，如此能快速增生大量细胞，并于其它试验或医疗上使用。
[0098] 实施例11
[0099] 细胞存活率试验：
[0100] 1.添加猪血液制剂培养基、胎牛血清培养基及市售无血清培养基至干细胞培养上。
[0101] 2.培养24、48及96小时后添加MTT试剂，再于37℃培养3-5小时。
[0102] 3.添加二甲基亚砜(DMSO)将晶体溶出，经分光光度计测定吸光值后计算出存活率，其结果为图12。
[0103] 4.结果显示三种血液制剂对人类干细胞皆高于市售胎牛血清有较佳的存活率：
[0104] Co(+)T(+)Ca(-)：160％
[0105] Co(+)T(-)Ca(-)：176％
[0106] Co(-)T(+)Ca(-)：174％
[0107] 表示P-BP较市售培养基更可减少细胞死亡的发生率，可保有细胞原有形态及结构，并可提供人类干细胞一最适生长的环境。
[0108] 实施例12
[0109] 内毒素检测：
[0110] 以LAL试剂盒(CAPE COD，US)进行样品内毒素检测，将0.2mL P-BP样品各添加至正对照组试验管及试验管中，若试验管中液体凝胶则表示其样品内毒素超过0.03EU/mL。
[0111] 三种P-BP(Co(-)T(+)Ca(-)、Co(+)T(-)Ca(-)及Co(+)T(+)Ca(-))内毒素试验皆于试验管及正对照试验管中进行，其试验管检测若样品内毒素含量高于0.03EU/mL，则会呈现胶状，其结果显示三种P-BP样品未凝胶(图13)，表示所含内毒素含量未达0.03EU/mL。若培养基含有大量内毒素，其会影响细胞生长甚至产生细胞凋亡的现象。
[0112] 实施例13
[0113] 胰蛋白酶抑制反应试验：
[0114] 一般FBS会于使用胰蛋白酶使细胞悬浮时添加以抑制酶继续作用，此试验欲评估P-BP是否也具有抑制胰蛋白酶活性及其取代FBS的可行性。
[0115] a.将1000μg/ml胶原蛋白溶液置于试管中，加入胰蛋白酶与胶原蛋白作用后再各加入含FBS及P-BP培养基(media)于37℃对胰蛋白酶进行抑制反应。
[0116] b.添加20％三氯醋酸(TCA)溶液使未作用蛋白质(protein)沉淀。
[0117] c.以5号滤纸过滤，检测滤液中4-Hyp浓度以推算胶原蛋白降解情形。
[0118] 酶抑制结果(图14)显示P-BP与FBS对于胰蛋白酶活性抑制并无显著差异(p＜0.05)，其表示P-BP可于细胞培养时，使用胰蛋白酶细胞悬浮时添加，可有效抑制胰蛋白酶活性，可避免酶继续作用对细胞造成的伤害。
[0119] 一个熟知此领域技艺者能很快体会到本发明可很容易达成目标，并获得所提到的结果及优点，以及那些存在于其中的东西。本发明中的培养基及其制造程序与方法乃较佳实施例的代表，其为示范性且不仅局限于本发明领域。熟知此技艺者将会想到其中可修改之处及其它用途。这些修改都蕴含在本发明的精神中，并在权利要求范围中界定。
[0120] 本发明的内容叙述与实施例均揭示详细，得使任何熟习此技艺者能够制造及使用本发明，即使其中有各种不同的改变、修饰、及进步之处，仍应视为不脱离本发明的精神及范围。
[0122] 在此所适当地举例说明的发明，可能得以在缺乏任何要件，或许多要件、限制条件或并非特定为本文中所揭示的限制情况下实施。所使用的名词及表达是作为说明书的描述而非限制，同时并无意图使用这类排除任何等同于所示及说明的特点或其部份的名词及表达，但需认清的是，在本发明的专利申请范围内有可能出现各种不同的改变。因此，应了解到虽然已根据较佳实施例及任意的特点来具体揭示本发明，但是熟知此技艺者仍会修改和改变其中所揭示的内容，诸如此类的修改和变化仍在本发明的权利要求范围内。
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