专利汇可以提供腺病毒anti-Fi、anti-Pb和anti-Hx的免疫球蛋白制备方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种腺病毒anti-Fi、anti-Pb和anti-Hx的免疫球蛋白的制备方法,首先从腺病毒提取腺病毒的 纤维 蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白作为 抗原 ,其次经组织培养制备的病毒抗原,以不连续梯度 密度 离心纯化抗原,然后用所制备的纯化抗原,建立筛选高效价腺病毒anti-Fi、anti-Pb和anti-Hx的免疫球蛋白的方法,及体外中和病毒试验等。最后用低温 乙醇 方法或离子交换层析法方法或亲和层析法在具有高效价腺病毒anti-Fi、anti-Pb和anti-Hx的免疫球蛋白血源中提取免疫球蛋白。,下面是腺病毒anti-Fi、anti-Pb和anti-Hx的免疫球蛋白制备方法专利的具体信息内容。
1、腺病毒anti-Fi、anti-Pb和anti-Hx的免疫球蛋白制备方法,其特征在于,包括以下步骤: 1)制备含有腺病毒的纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白的抗原 将腺病毒接种于已成长单层的Hep-2细胞或hela细胞或人胚肾细胞或KB细胞或人胚肺二倍体细胞或Vero细胞,在培养箱中培养,每天观察细胞病变情况,当致细胞病变(CPE)出现+++(即细胞病变约占整个单层细胞75%),收集细胞及上清,病毒灭活,在-70℃反复冻融,再经超声打碎、冰冻保存; 2)纯化病毒抗原 用氯化铯或蔗糖或多聚蔗糖作为介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度,通过重力或离心力场的作用使病毒碎片分层、分离,或层析吸附柱方法纯化病毒抗原;将超声打碎的腺病毒培养液高速离心20分钟,弃去沉渣留上清,装入以5%、15%、30%、45%、60%的蔗糖制备的不连续梯度密度离心管,超速离心2小时,根据病毒的分子量确定该病毒所在离心管位置,吸出冰冻保存; 3)建立筛选高效价腺病毒anti-Fi、anti-Pb和anti-Hx的免疫球蛋白方法 用从腺病毒中提取的含有腺病毒的纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白病毒碎片混合作为抗原,以10μg/ml~20μg/ml包被酶板,利用结合在固相载体表面的抗原仍保持其免疫学活性,来自人或动物的血浆、血清和体液中腺病毒的纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白抗体与固相载体表面的腺病毒的纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白起反应,再用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开,再加入酶标记的抗体,也通过反应而结合在固相载体上,此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例,加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析,由于酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度; 4)用上述方法筛选的产物用硫酸铵沉淀法或聚乙二醇沉淀法或低温乙醇方法或/和离子交换层析法方法或/和亲和层析法提取高效价腺病毒anti-Fi、anti-Pb和anti-Hx的免疫球蛋白; 5)提纯后的腺病毒anti-Fi、anti-Pb和anti-Hx的免疫球蛋白经60±1℃,10小时灭活病毒和/或在pH值4.1±0.3,在24±1℃条件下放置21天和/或纳米膜过滤和/或溶剂/表面活性剂(S/D)法和/或干热法(80℃,72小时)去除、灭活病毒,再经除菌过滤,分装成或冻干成腺病毒anti-Fi、anti-Pb和anti-Hx的免疫球蛋白。
2. 如权利1所述的方法,制备含有腺病毒的纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白的抗 原的细胞是H印-2细胞或Vero细胞。
3. 如权利l所述的方法,纯化病毒抗原所用的介质为蔗糖,梯度为15%、 30%、 45%。
4. 如权利l所述的方法,建立筛选高效价腺病毒anti-Fi、 anti-Pb和anti-Hx的免疫 球蛋白方法中,分离纯化的腺病毒的纤维蛋白、五邻体蛋白和六邻体蛋白,是按蛋白含量 1: 1: l等量混合成10ug/ml〜20lig/ml。
5. 如权利l所述的方法,腺病毒anti-Fi、 anti-Pb和anti-Hx的免疫球蛋白的原料 来源为人的血浆和血清。
6. 如权利l所述的方法,用低温乙醇分离法分离腺病毒anti-Fi、 anti-Pb和anti-Hx 的免疫球蛋白的乙醇浓度为15%〜25%; pH为5. 1〜7.2;温度为-3。C〜-7。C。
7. 如权利l所述的的方法,用离子交换层析法提高纯度,使用含DEAE-或S-基团的离 子交换树脂,直接吸附除特异性抗病毒免疫球蛋闩之外的杂质,从而直接从流穿液获得纯化 的免疫球蛋白,其中条件为pH为5. 0〜6. 8;所述的离子交换树脂选自:DEAE-S印harose、 DEAE-S印harose FF、 S-S印harose、 S-Sepharose FF禾口 DEAE-Sephadx A-50。
8. 如权利要求7所述的方法,其特征在于:用离子交换层析法提取高效价腺病毒 anti-h'i、 anti-Pb和anti-Hx的免疫球蛋白时,原料经DEAE-S印harose CL-6B或 DEAE-S印harose FF柱,腺病毒anti-Fi、 anti-Pb和anti-Hx的免疫球蛋白流穿出柱;平 衡条件为pH5. 0〜6. 0,离子强度为0.01〜0.03。
9. 如权利7所述的方法,所述的离子交换层析法流穿出柱的抗病毒免疫球蛋白再通过 Lysine-S印harose 4B,将穿透液与洗涤液合并后,加入SP-Sephadex C50或CM-S印harose FF吸附,使用pHll的甘氨酸解析出特异性抗病毒免疫球蛋白;平衡条件为pH值6. 0〜5. 4; 解析条件为pHll的甘氨酸。
10. 如权利要求1所述的方法,亲和层析的固体载体选自:S印hadex 、PDX、 S印hacryl、 Sepharose、 Scpharose (X、 Sepharose FF、 Superdex、 Superose 、Trisaceyl、 Trisacyl plus、 Ultrogel A、 Ultrogel AcA、高孔隙度的再生纤维素珠;亲和层析配基为Protein A和Protein G两种蛋白的配基。
11. 如权利要求10所述,亲和层析树脂优选为rProtein A S印hrose Fast Flow、 Protein A S印hrose CL_4B、 Protein G S印hrose CL-4B ,平衡条件为缓冲液的盐浓度为0. 004〜 0.04; pH为4.8〜9. 2。
12、 如权利要求l所述的方法,提纯后的腺病毒anti-Fi、 anti-Pb和anti-Hx的免疫 球蛋白经60土rC, 10小时灭活病毒和/或在pH值4. 1±0.3,在24土rC条件下放置21天 和/或纳米膜过滤和/或溶剂/表面活性剂(S/D)法和/或千热法(8(TC, 72小时)去除、灭 活病毒。
13、 如权利要求12所述的方法,去除、灭活病毒的几种方法的组合,优选为60土rc,IO小时、60土rC, IO小时和纳米膜过滤、pH值4. 1±0.3,在24士rC条件下放置21天和 纳米膜过滤、溶剂/表面活性剂(S/D)法和纳米膜过滤、溶剂/表面活性剂(S/D)法和干热 法(8fTC, 72小时)。
14、 如权利要求13所述的方法,纳米膜的孔径为20纳米〜50纳米。
15、 如权利要求13所述的方法,溶剂/表面活性剂(S/D)法是TNBP/Tween 80或 TNBP/Triton X-100,浓度优选为TNBPO. 3%〜2% (w/w) , Tween 80为1% (w/w), Triton X-100 为1%(w/w)。
16、 如权利要求1〜15所述的方法,所涉及的免疫球蛋白是IgG,其所含的Igd为55%〜 65%、 Ig&为30°/i〜40%、 IgG3为2〜5呢、IgGa为0. 8%〜4%。
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