抗原生物标志物
阅读：434发布：2020-05-13
专利汇可以提供抗原生物标志物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了可用于筛选 血浆 中用作抗癌 治疗 剂之 抗体 的肽 抗原 。还提供了包含所述肽抗原的 试剂 盒 及其使用方法。，下面是抗原生物标志物专利的具体信息内容。
1.确定生物样品是否包含具有抗癌活性的靶抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
i)提供生物样品；
ii)提供根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6中任一个的至少一种肽抗原或其功能性变体；
iii)使所述生物样品与所述至少一种肽抗原接触；
iv)确定存在于所述生物样品中的与所述肽抗原特异性结合的靶抗体的浓度；以及v)将所确定之存在于所述生物样品中的靶抗体的浓度与参考浓度进行比较，其中与所述参考浓度相比，所述生物样品中靶抗体的浓度的显著增加表明所述生物样品包含显著浓度的一种或更多种具有抗癌活性的靶抗体。
2.权利要求1所述的方法，其中所述或每种肽抗原锚定至基底。
3.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述生物样品是全血样品或血液级分例如血浆或血清的样品。
4.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括提供根据至少SEQ ID NO：3的肽抗原或其功能性变体。
5.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法包括向已与所述肽抗原特异性结合的靶抗体施加标记的步骤。
6.权利要求5所述的方法，其中所述标记与第二抗体缀合。
7.权利要求6所述的方法，其中所述方法包括添加抗体酶缀合物的步骤，所述抗体酶缀合物被配置为结合已与所述肽抗原结合的任何抗体。
8.权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述方法包括在施加标记之后洗涤以除去未施加于或结合于靶抗体的标记的步骤。
9.对应于SEQ ID NO：1至6的肽抗原或其功能性变体。
10.权利要求9所述的肽抗原产生用于治疗癌症的抗体或适配体的用途。
11.试剂盒套件，其包含根据SEQ ID NO：1至6的一种或更多种肽抗原或其功能性变体。
12.根据权利要求11所述的试剂盒套件，其包含根据至少SEQ ID NO：3的肽抗原或其功能性变体。
13.权利要求11或权利要求12所述的试剂盒套件，其中所述一种或更多种肽抗原结合于基底的表面。
14.根据权利要求13所述的试剂盒套件，其中所述一种或更多种肽抗原直接结合于所述基底的表面。
15.根据权利要求13所述的试剂盒套件，其中所述一种或更多种肽抗原通过接头间接结合于所述基底的表面。
16.组合物，其包含与根据SEQ ID NO：1至6中任一个的肽抗原或其功能性变体结合的至少一种抗体。
17.权利要求16所述的组合物，其包含与根据SEQ ID NO：3的肽抗原或其功能性变体结合的至少一种抗体。
18.治疗有效量的根据权利要求16或权利要求17所述的组合物用于治疗癌症的用途。
19.包含治疗有效量的根据权利要求16或权利要求17所述的组合物的人血浆用于纯化抗癌γ-球蛋白的用途。
20.治疗有效量的根据权利要求19纯化的抗癌γ-球蛋白用于治疗癌症的用途。
抗原生物标志物
技术领域
背景技术
[0002] 癌症是对人群具有越来越大影响的一种突出的疾病。基于最新的全球癌症统计数据，2012年全世界范围内发生了1410万新病例和820万死亡(Torre等，CA Cancer J Clin 65：87-108，2015)。由于人口的增长和老龄化，癌症的发生率正在增加。
[0003] 虽然至少一些类型的癌症的存活率正在增加，但这些改善至少部分地是由于早期诊断病例的数量增加，其中癌症未生长或扩散至危险程度，因此可以通过药物和/或手术更成功地治疗。
[0004] 许多可用的癌症治疗是细胞毒性治疗，其中临床医师试图用例如药物或辐射靶向并且杀死患者体内的癌细胞。然而，这样的细胞毒性剂通常对天然健康细胞以及对癌细胞均具有细胞毒性，并且可能对患者产生显著的副作用。此外，可以给予患者的细胞毒性试剂的最大剂量通常低于杀死靶癌细胞的可能最佳剂量，因为更高剂量的细胞毒性试剂的作用对患者的健康细胞具有太大影响而不可接受。
[0005] 肿瘤细胞具有产生一些生长因子(例如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR))的能力，这些生长因子可以与细胞表面上的其相应受体结合，产生多种生物效应，从而促进肿瘤进展(Scartozzi M，等：PLOS One 7：e38192，2012)。已经显示，已知Hsp90、EGFR、VEGF和蛋白激酶B(AKT)在辐射抗性中具有作用(Sheridan MT，等：Radiat Oncol Investig 5：180-186，1997；Tanno S，等：Cancer Res 64∶3486-3490，2004.)，并且辐射暴露可导致EGFR的激活，这可继而激活磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸酯3-激酶(PI3K)/AKT和信号转导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator oftranscription 3，STAT3)通路，并上调VEGF产生(Bowers G，等：Oncogene 20：1388-1397，2001.)。
[0006] 天然抗体为人所知已有近半个世纪。尽管知道多反应性天然IgM在病原体消除中具有作用，但天然抗体也在维持体内平衡、炎性疾病、自身免疫和抗肿瘤细胞毒性中起作用(Boehm等，Gerontology 56：303-309，2010；Schwartz-Albiez等，Autoimmun Rev 7：491-495，2008)。循环中的IgG抗体被认为是自身免疫疾病的血清学标志，但越来越多的研究也揭示了自身抗体与许多非自身免疫病症例如癌症和神经疾病之间的联系(Eric等，PLOS ONE 8：e60726，2013)。
[0007] 包含来源于人抗体的γ-球蛋白的组合物已用于许多疾病的治疗。然而，仍然需要有效鉴定可处理为用于癌症的γ-球蛋白治疗中的治疗有效抗体的人来源。
[0008] 因此，本发明的一个目的是提供用于鉴定可能对癌症是治疗有效的抗体的有用来源的方法和靶标，以及包含所述抗体的组合物。
发明内容
[0009] 根据本发明的第一方面，提供了确定生物样品是否包含具有抗癌活性的靶抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
[0010] i)提供生物样品；
[0011] ii)提供根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6中任一个的至少一种肽抗原或其功能性变体；
[0012] iii)使生物样品与至少一种肽抗原接触；以及
[0013] iv)确定存在于生物样品中的与肽抗原特异性结合的靶抗体的浓度；以及[0014] v)将所确定之存在于生物样品中的靶抗体的浓度与参考浓度进行比较，[0015] 其中与参考浓度相比，生物样品中靶抗体的浓度的显著增加表明生物样品包含显著浓度的具有抗癌活性的一种或更多种靶抗体。
[0016] 表1：根据本发明的肽抗原
[0017]
[0018] 所述或每种肽抗原或其功能性变体可对应于为靶抗体靶标的蛋白质的肽序列。因此，蛋白质可以是靶蛋白。肽序列可不直接对应于靶蛋白的序列，而是可对应于或模拟形成靶抗体结合位点的折叠靶蛋白的肽的排列。
[0019] 所述或每种肽抗原或其功能性变体可适合于选择性结合与细胞膜蛋白结合的抗体。因此，细胞膜蛋白可以是靶蛋白。肽抗原或其功能性变体可来源于在常见癌细胞中高度表达的细胞膜蛋白。肽抗原或其功能性变体可适合于选择性结合与在常见癌细胞中高度表达的细胞膜蛋白结合的抗体。例如，肽抗原或其功能性变体可适合于选择性结合与在以下中高度表达的细胞膜蛋白结合的抗体：肝癌细胞、肺癌细胞、胃癌细胞、胰腺癌细胞或食管癌细胞。细胞膜蛋白可在两种或更多种类型的癌细胞中高度表达。细胞膜蛋白可在大多数类型的癌细胞中高度表达。
[0020] 例如，表2示出了在其表面上高度表达肽抗原之靶蛋白的癌组织的一些实例。
[0021] 表2：高度表达表1中列出的靶蛋白的癌细胞
[0022]靶蛋白 癌组织 备注
VEGFR1a 脑、肾、肝、白血病和淋巴瘤 超过一种同工型
VEGFR1b 脑、肾、肝、白血病和淋巴瘤 超过一种同工型
FGFR2 肾、肝、肉瘤和结肠 超过一种同工型
ERBB3 膀胱、乳腺卵巢、结肠和黑素瘤 超过一种同工型
ABCC3 乳腺、食管、头/颈、肾、肺、淋巴瘤和脑
ABCC5 乳腺、结肠、头/颈、肝、肺、宫颈和淋巴瘤
VEGFR1a 脑、肾、肝、白血病和淋巴瘤 超过一种同工型
VEGFR1b 脑、肾、肝、白血病和淋巴瘤 超过一种同工型
FGFR2 肾、肝、肉瘤和结肠 超过一种同工型
ERBB3 膀胱、乳腺卵巢、结肠和黑素瘤 超过一种同工型
ABCC3 乳腺、食管、头/颈、肾、肺、淋巴瘤和脑
ABCC5 乳腺、结肠、头/颈、肝、肺、宫颈和淋巴瘤
[0023] 通常，靶抗体不与健康细胞的细胞膜蛋白结合。
[0024] 根据SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6中任一个的肽抗原可锚定至基底(substrate)。基底可适用于免疫测定。基底可以是平面基底，例如玻璃或塑料载玻片或类似物，并且肽抗原可结合于平面基底的一个或两个平面表面。基底可以是反应容器或反应容器的壁。基底可以是孔。基底可以是孔板，并且肽抗原可结合于孔板的一个或更多个孔的表面。基底可以是颗粒。因此，肽抗原可结合于颗粒的表面。颗粒可以是珠或类似物。颗粒可以是团聚体或结晶材料。
[0025] 在本发明的一些实施方案中，肽抗原优选地以可用于与抗体特异性结合的方式锚定至基底的表面。例如，肽抗原可在肽抗原的N-或C-末端结合于表面。
[0026] 或者，肽抗原可通过接头结合于表面。接头可以是饱和的或不饱和的烃链、醚、聚合物、聚乙二醇(polyethylglycol，PEG)、聚二醇(poly glycol)、聚醚或类似物。接头可以是肽。在其中接头是肽的实施方案中，肽长度可以是1至10个氨基酸、1至20个氨基酸、或1至30个氨基酸。
[0027] 接头可从肽抗原的N-末端延伸。接头可从肽抗原的C-末端延伸。
[0029] 不包含肽抗原的基底的表面可包含阻断剂以防止或减少可能存在于生物样品中的物质与基底表面的非特异性结合。例如，表面可包含阻断蛋白，其吸附至基底并阻断基底与可能存在于生物样品中的其他蛋白质。在另一个实例中，表面可包含自组装单层(self-assembled monolayer，SAM)。SAM可包含具有结合头基和抑制或阻止非特异性结合的尾基的分子。例如，在其中基底是玻璃基底的实施方案中，SAM可包含与基底的二氧化硅结合的有机硅烷并且有机尾部延伸远离表面。
[0030] 所述方法可以是免疫测定。免疫测定可使用标记来检测生物样品中的靶抗体。因此，所述方法可包括将标记施加于已与肽抗原特异性结合的靶抗体的步骤。例如，标记可与靶抗体特异性结合。标记可以是本领域已知的任何合适的可检测标记。例如，标记可以是酶、放射性同位素、DNA报道分子、荧光报道分子或电致发光标签。
[0031] 免疫测定可以是竞争性测定系统。免疫测定可以是非竞争性测定系统。例如，免疫测定可使用诸如免疫细胞化学、免疫组织化学、放射免疫测定、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、“夹心"免疫测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体结合测定、免疫放射测定、荧光免疫测定等技术。
[0032] 在其中使用标记检测靶抗体的实施方案中，标记可与第二抗体缀合。第二抗体可被配置为结合已与肽抗原特异性结合的靶(“第一")抗体的表位。因此，所述方法可包括使标记的缀合物与靶抗体接触从而标记靶抗体的步骤。作为结果，所述标记可允许由存在的标记的浓度来确定靶抗体的浓度。
[0033] 所述方法可包括添加抗体-酶缀合物的步骤，所述抗体-酶缀合物被配置为结合已与肽抗原结合的任何抗体。在其中生物样品来源于人对象的实施方案中，所述方法可包括添加抗人免疫球蛋白(Ig)的步骤。抗人Ig可与酶缀合。缀合物可与已结合肽抗原的靶抗体接触。所述方法可还包括添加用于缀合酶的酶底物的步骤。优选地，酶对酶底物的作用诱导可检测的酶底物的变化。酶可以裂解底物以诱导底物中可检测的变化。酶可以氧化底物以诱导底物中可检测的变化。例如，缀合酶可以是过氧化物酶，并且当酶底物被过氧化物酶氧化时，酶底物可以产生颜色变化。过氧化物酶可以是辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)。底物可以是3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)。可以使用其他实例并且其是本领域技术人员公知的。
[0034] 因此，所述方法可以是酶联免疫吸附测定(ELISA)。
[0035] 在一些实施方案中，可添加第三抗体以结合第二抗体。第三抗体可包含与第二抗体相互作用的部分，从而允许检测第二抗体，并且由此检测靶抗体。
[0036] 所述方法可包括在施加标记之后洗涤基底以除去未施加于或结合于靶抗体的标记的步骤。
[0038] 所述方法可包括在使生物样品与肽抗原接触的步骤之后从肽抗原洗涤生物样品的步骤。因此，可以除去至少大部分未与肽抗原特异性结合的物质。
[0039] 因此，本发明的方法可确定生物样品是否包含显著浓度的可能潜在地用作抗癌治疗剂的靶抗体。
[0041] 通常来说，在本发明的方法之前，从人对象采集生物样品。
[0042] 可处理使用本发明的方法鉴定的生物样品以纯化、提取或扩增其中的靶抗体。例如，可处理生物样品以产生γ-球蛋白治疗剂。
[0043] 术语“抗体"以最广泛的含义使用，并且特别地涵盖单克隆抗体(包括具有免疫球蛋白Fc区的全长抗体)、具有多表位特异性的抗体组合物、双特异性抗体、双抗体和单链分子、以及抗体片段(例如，Fab、F(ab’)2和Fv)。
[0044] 基础4-链抗体单元是由两个相同的轻(L)链和两个相同的重(H)链构成的异四聚体糖蛋白。IgM抗体由5个基础异四聚体单元和被称为J链的额外多肽组成，并且包含10个抗原结合位点，而IgA抗体包含2至5个基础4-链单元，其可以与J链一起聚合以形成多价的团聚体。在IgG的情况下，4-链单元通常为约150,000道尔顿。每个L链通过一个共价二硫键与H链连接，而两个H链取决于H链同种型通过一个或更多个二硫键相互连接。每个H和L链还具有规律间隔的链内二硫桥。每个H链具有在N-末端的可变结构域(VH)，随后对于α和γ链中每一个是三个恒定结构域(CH)，而对于μ和ε同种型是四个CH结构域。每个L链具有在N-末端的可变结构域(VL)，随后是在其另一端的恒定结构域。VL与VH对齐，并且CL与重链的第一恒定结构域(CH1)对齐。认为特定的氨基酸残基在轻链和重链可变结构域之间形成界面。VH和VL的配对一起形成单个抗原结合位点。对于不同类别的抗体的结构和特性，参见例如Basic and Clinical Immunology，第8版，Daniel P.Sties，Abba I.Terr and Tristram G.Parsolw(编辑)，Appleton&Lange，Norwalk，Conn.，1994，第71页和第6章。
[0045] 来自任何脊椎动物物种的L链可基于其恒定结构域的氨基酸序列分入两种明显不同的类型(称为κ和λ)之一。依据其重链的恒定结构域(CH)的氨基酸序列，免疫球蛋白可分为不同的类别或同种型。有五种类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其具有分别称为α、δ、ε、γ和μ的重链。基于CH序列和功能的相对较小差异，γ和μ类别进一步分为亚类，例如，人表达以下亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
[0046] 术语“可变"是指可变结构域的某些区段在抗体之间序列差异很大的事实。V结构域介导抗原结合并且限定特定抗体对其特定抗原的特异性。但是，可变性不是均匀地分布于可变结构域的整个跨度。相反，V区由约15至30个氨基酸残基的称为框架区(framework region，FR)的相对不变的段组成，所述相对不变的段被每个长度为约9至12个氨基酸残基的称为“高变区"或有时称为“互补决定区"(complementarity determining region，CDR)的极度可变的较短区域分隔。天然重链和轻链的可变结构域各自包含通过三个高变区连接的四个FR，四个FR主要采用β-片层构型，三个高变区形成连接β-片层结构的环，并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每个链中的高变区通过FR紧密地保持在一起，并且与来自其他链的高变区一起促进抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。恒定结构域不直接参抗体与抗原的结合，但表现出多种效应物功能，例如参与抗体依赖性细胞毒性(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)。
[0047] 本文中使用的肽(例如在本发明的方法中使用的抗原)的“功能性变体"包括当肽被一个或更多个氨基酸修饰或在一个或更多个氨基酸处被修饰并且保留特定肽的功能至相同的程度、或至足以成功地进行本发明的方法的程度时产生的序列。
[0048] 本文中使用的“功能性”是指肽以与上文列出的特定肽相同或类似的亲和力与靶抗体结合的能力。SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6的每种肽与靶抗体特异性结合。例如，肽抗原与靶抗体的解离常数KD可小于1×10-7、小于1×10-8、小于1×10-9或小于1×10-10。因此，用于本发明方法的给定肽抗原的功能性变体具有是该肽抗原的平衡常数的至少10％或1％的平衡解离常数。可用于确定抗原是否选择性地与特定抗体结合的方法是本领域已知的。
[0049] 当然可以容忍变体的给定特性中的一些性能下降，但是变体应保留适合于它们所预期的相关应用的特性。SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6的变体的筛选可用于鉴定它们是否保留了适当的特性。
[0050] 本文中使用的肽(例如本发明的肽抗原)的“变体"包括当肽被一个或更多个氨基酸(例如1、2、5或甚至多至10个氨基酸，如果替换是如下定义的保守替换的话)修饰或所述在一个或更多个氨基酸处被修饰时产生的序列。
[0051] 变体可具有“保守"替换，其中被替换的氨基酸具有与替代它的氨基酸类似的结构或化学特性，例如用异亮氨酸替代亮氨酸。变体可具有“非保守"变化，例如用色氨酸替代甘氨酸。变体还可包含具有氨基酸缺失或插入或二者的序列。可使用本领域公知的计算机程序找到确定哪些氨基酸残基可被替换、插入或缺失而不消除蛋白质活性的指导。
[0052] 在一个实例中，肽中包含一个保守替换，例如SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6中的保守替换。在另一个实例中，肽中包含10个或更少的保守替换，例如5个或更少。因此，本发明的肽可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个保守替换。通过使用例如标准方法(例如定点诱变或PCR)操纵编码肽的核苷酸序列，可以产生包含一个或更多个保守替换的该肽。或者，可以通过使用例如本领域已知的肽合成方法产生肽以包含一个或更多个保守取替换。
[0053] 可替换蛋白质中的原始氨基酸并且被认为是保守替换的氨基酸的一些实例包括：对于Ala的Ser；对于Arg的Lys；对于Asn的Gln或His；对于Asp的Glu；对于Gln的Asn；对于Glu的Asp；对于Gly的Pro；对于His的Asn或Gln；对于Ile的Leu或Val；对于Leu的Ile或Val；对于Lys的Arg或Gln；对于Met的Leu或Ile；对于Phe的Met、Leu或Tyr；对于Ser的Thr；对于Thr的Ser；对于Trp的Tyr；对于Tyr的Trp或Phe；以及对于Val的Ile或Leu。
[0054] 在一个实施方案中，替换在Ala、Val、Leu和Ile之间；在Ser和Thr之间；在Asp和Glu之间；在Asn和Gln之间；在Lys和Arg之间；和/或在Phe和Tyr之间。
[0055] 关于保守替换的进一步的信息可以在Ben-Bassat等(J.Bacteriol.169：751-7，1987)、O’Regan等(Gene 77：237-51，1989)、Sahin-Toth等(Protein Sci.3：240-7，1994)、Hochuli等(Bio/Technology 6：1321-5，1988)、WO 00/67796(Curd等)以及遗传学和分子生物学的标准教科书等地方找到。
[0056] 变体包括“经修饰的肽"或“突变肽"，其涵盖具有至少一个氨基酸的替换、插入和/或缺失的肽。经修饰的肽或突变肽可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个氨基酸修饰(选自替换、插入、缺失及其组合)。
[0057] 因此，保留与靶抗体选择性结合的功能的SEQ ID NO：1至6中任一个的肽抗原的片段包含在本发明的范围内。例如，肽抗原片段可包含SEQ ID NO：1至6中任一个的肽抗原的至少10个氨基酸。肽抗原片段可包含SEQ ID NO：1至6中任一个的肽抗原的至少15个氨基酸。肽抗原片段可包含SEQ ID NO：1至6中任一个的肽抗原的至少20个氨基酸。
[0058] 术语“显著增加"是指与不包含显著水平或浓度的所述或每种靶抗体的对象中存在的相同靶抗体的平均浓度相比，靶抗体浓度增加至少50％、至少100％、至少150％或至少200％。可通过阈值确定显著水平，高于该阈值，靶抗体的浓度被确定为高于所使用的测定的噪声水平，并且因此被确定为阳性结果。可将阈值确定为不具有显著浓度的所述或每种靶抗体的生物样品中所述或每种靶抗体之测量浓度的标准偏差的函数。阈值可以是这样的浓度，高于该浓度，所述或每种靶抗体可被提取和/或纯化。
[0059] 靶抗体的参考浓度可以是来自不表达显著浓度的所述或每种靶抗体的对象的生物样品中的靶抗体的浓度。靶抗体的参考浓度可以是预定阈值，即截止值。截止值可以是来自生物样品的确定浓度的百分位数。例如，截止值可以是第70、第80、第90、第95、第97.5百分位数，高于其，浓度被确定为显著浓度。
[0060] 本发明在第二方面延伸至对应于SEQ ID NO：1至6的肽抗原或其功能性变体。
[0061] 肽抗原可用于检测生物样品中的目标抗体。生物样品可以是体液。通常来说，生物样品是血液样品，例如全血样品或血液级分例如血浆或血清的样品。或者，生物样品可以是淋巴液、腹膜液、脑脊髓液或胸膜液。
[0062] 肽抗原可用于第一方面的方法中。
[0063] 肽抗原可包含接头或间隔区部分，其允许肽抗原锚定至表面，同时保留与靶抗体结合的能力。
[0064] 肽抗原可用于产生抗体。肽抗原可用于产生抗体片段。抗体可以是单克隆抗体。所产生的抗体可用于在患者中治疗癌症。通常来说，抗体是IgG抗体。例如，抗体可以是人IgG抗体。
[0065] 肽抗原可用于产生抗体样蛋白。例如，肽抗原可用于产生适配体等。
[0066] 针对肽抗原所产生的抗体或适配体可具有针对异常细胞(例如癌细胞)的活性。例如，抗体或适配体可与异常细胞的细胞膜中的表面蛋白结合。与异常细胞的细胞膜结合的抗体或适配体可抑制异常细胞的增殖。因此，抗体或适配体可用于抑制异常细胞的增殖。
[0067] 根据本发明的第三方面，提供了针对SEQ ID NO：1至6的肽抗原或其功能性变体所产生的抗体或适配体。抗体可以是单克隆抗体。所产生的抗体可用于在患者中治疗癌症。通常来说，抗体是IgG抗体。例如，抗体可以是人IgG抗体。
[0068] 抗体可以是完整抗体。抗体可以是抗体片段。通常来说，抗体至少包含与SEQ ID NO：1至6的特定肽抗原或其功能性变体结合的特定可变结构域片段。
[0069] 产生根据本方面的合适的抗体或适配体并确定它们是否与本发明的肽抗原特异性结合的合适方法是本领域公知的，并且包括例如使用噬菌体展示方法，例如McCafferty，J.；Griffiths，A.；Winter，G.；Chiswell，D.(1990).“Phage antibodies：filamentous phage displaying antibody variable domains”.Nature.348(6301)：552-554中描述的那些的方法。
[0070] 抗体或适配体可具有针对异常细胞(例如癌细胞)的活性。例如，抗体或适配体可与异常细胞的细胞膜中的表面蛋白结合。与异常细胞的细胞膜结合的抗体或适配体可抑制异常细胞的增殖。因此，抗体或适配体可用于抑制异常细胞的增殖。
[0071] 根据本发明的第四方面，提供了包含根据SEQ ID NO：1至6的一种或更多种肽抗原或其功能性变体的试剂盒套件(kit ofparts)。
[0072] 试剂盒套件可包含根据SEQ ID NO：1至6的两种或更多种抗原或其功能性变体。试剂盒套件可包含根据SEQ ID No：1至6的三种或更多种抗原或其功能性变体。试剂盒套件可包含根据SEQ ID NO：1至6中每一种的肽抗原或其功能性变体。
[0073] 例如，试剂盒套件可包含根据至少SEQ ID NO：3的肽抗原或其功能性变体。
[0074] 在另一个实例中，试剂盒套件可包含根据至少SEQ ID NO：3的肽抗原或其功能性变体和根据SEQ ID NO：1至2和4至6中至少一种的肽抗原或其功能性变体。
[0075] 设想了根据本发明第二方面的肽抗原的其他组合，并且其包含在本发明的范围内。
[0076] 试剂盒套件可包含结合或锚定至基底的根据SEQ ID NO：1至6的一种或更多种肽抗原。基底可适用于免疫测定。基底可以是平面基底，例如玻璃或塑料载玻片或类似物，并且肽抗原可结合于平面基底的一个或两个平面表面。基底可以是反应容器或反应容器的壁。基底可以是孔。基底可以是孔板，并且肽抗原可结合于孔板的一个或更多个孔的表面。基底可以是颗粒。因此，肽抗原可结合于颗粒的表面。颗粒可以是珠或类似物。颗粒可以是团聚体或结晶材料。
[0077] 一种或更多种肽抗原可直接结合于基底的表面。肽抗原的N-末端可直接结合于基底的表面。肽抗原的C-末端可直接结合于基底的表面。
[0078] 一种或更多种肽抗原可通过接头间接地结合于基底。接头可将一种或更多种肽抗原与基底的表面间隔开，以增加一种或更多种肽抗原用于与靶抗体特异性结合的可用性。
[0079] 基底可适用于免疫测定。本发明第一方面的合适的免疫测定是本发明本方面的合适的免疫测定。例如，基底可适用于酶联免疫吸附测定(ELISA)。因此，所述试剂盒套件可用于确定来自对象的生物样品是否包含所述或每种肽抗原特异性结合的抗体。抗体的存在可表明生物样品来自其中的对象具有特定疾病或医学病症。因此，试剂盒套件可用于测定中以确定从中采集生物样品的对象是否具有该特定疾病或医学病症。
[0080] 靶抗体可以是与通常存在于至少一种类型癌细胞的细胞膜中的蛋白质特异性结合的抗体。包含靶抗体的生物样品可阻碍或抑制其特异性结合的蛋白质的活性。在其中靶抗体与存在于至少一种类型癌细胞的细胞膜中的蛋白质结合的实施方案中，包含靶抗体的生物样品可阻碍或抑制至少一种类型癌细胞的生长。
[0081] 试剂盒套件可包含缓冲溶液，肽抗原可悬浮于其中。试剂盒套件可包含洗涤缓冲溶液，其可用于洗涤肽抗原已结合或锚定的基底。试剂盒套件可包含标志物或标记，其可用于在使用所述试剂盒套件进行免疫测定期间标识或标记与肽抗原结合的抗体。
[0082] 因此，试剂盒可允许鉴定可适合于用作至少一种类型癌症的治疗剂的生物样品。可处理由此鉴定的生物样品以生产药物或药物组合物，所述药物或药物组合物可被给予以治疗至少一种类型的癌症。例如，可处理生物样品以产生用于癌症治疗的γ球蛋白。
[0083] 阳性鉴定的生物样品的处理可包括生物样品内靶抗体的提取、浓缩或扩增。
[0084] 本发明在第五方面延伸至包含与根据本发明第二方面的肽抗原结合的至少一种抗体或其片段的组合物。
[0085] 通常来说，至少一种抗体或其片段是IgG抗体。
[0086] 至少一种抗体或其片段可选自：抗VEGFR1a IgG、抗VEGFR1b IgG、抗FGFR2 IgG、抗ERBB3 IgG、抗ABCC3 IgG或抗ABCC5 IgG。
[0087] 至少一种抗体或其片段可选自：抗ERBB3 IgG、抗ABCC3 IgG、抗ABCC5 IgG或抗FGFR2 IgG。
[0088] 至少一种抗体或其片段可选自：抗ERBB3 IgG、抗ABCC3 IgG或抗FBGF2 IgG。
[0089] 组合物可以是经处理的生物样品。组合物可以是血浆组合物。组合物可以是经纯化的血浆组合物。例如，组合物可以是已被筛除血小板、病毒颗粒或类似物的血浆。
[0090] 或者，组合物可由包含至少一种抗体或其片段的替代水溶液产生。例如，至少一种抗体或其片段可从生物样品中纯化和分离并重悬于合适的水性介质中。合适的水性介质可以是缓冲水溶液。
[0091] 因此，本方面的组合物可以是非天然存在的合成组合物。
[0092] 根据本发明的第六方面，提供了根据第五方面的组合物用于治疗癌症的用途。
[0093] 优选地，组合物包含治疗有效量的与根据第二方面的所述或每种肽抗原结合的至少一种抗体或其片段。
[0094] 向对象施用组合物可允许抗体与靶细胞膜蛋白结合从而抑制该蛋白的活性，由此减缓或阻止宿主细胞的生长。组合物可直接施用于待治疗的特定部位。组合物可一般地施用于对象。例如，在组合物是血浆组合物的情况下，该组合物可以以输注或注射至对象中使用以治疗癌症。
[0095] 第一至第六方面的优选和任选特征是第一至第六方面的优选和任选特征。换言之，针对每个方面所公开的特征可被视为是针对任何其他方面的特征。
[0096] 发明详述
[0097] 虽然下面详细讨论了本发明的多种实施方案的制备和使用，但是应理解，本发明提供了许多可以在广泛多种的特定背景下实施的可应用的发明概念。本文中讨论的具体实施方案仅举例说明制备和使用本发明的具体方式，并不限定本发明的范围。
[0098] 为了便于理解本发明，下面定义了许多术语。本文中定义的术语具有本发明相关领域的普通技术人员通常理解的含义。没有数量词修饰的术语不旨在仅指单个实体，而是包括可使用其具体实例进行举例说明的一般类别。本文中的术语用于描述本发明的一些具体实施方案，但是除了在权利要求中所列出的之外，它们的使用不限定本发明。
[0099] 用于癌症治疗的ELISA试剂盒
[0100] 本发明的线性肽抗原通过固相化学合成，具有95％的纯度，并且然后用于开发内部(in-house)ELISA以检测人血浆中的抗癌IgG抗体。然后使用富含抗各肽抗原的抗癌IgG抗体的血浆培养来源于多种癌症的细胞系。我们最终选择了可与抗癌IgG结合的线性肽抗原，以开发具有本发明肽抗原的混合物的ELISA抗体检测试剂盒。
[0101] 板包被
[0102] 如下制备用作根据本发明的基底的96孔板，以用于ELISA型测定：
[0103] a.材料
[0105] ·1M磷酸盐缓冲液(p3619，Sigma-Aldrich)。
[0106] ·结合缓冲液：100mL：0.1M磷酸盐缓冲液，含有0.15M NaCl和10mM EDTA，pH 7.2：(使用10mL 1M磷酸盐缓冲液+0.85g NaCl+292mg EDTA+90mL去离子水制备)
[0107] ·洗涤缓冲液：200mL：0.1M磷酸盐缓冲液，含有0.15M NaCl和0.05％吐温20，pH 7.2：(使用20mL 1M磷酸盐缓冲液+1.7g NaCl+0.1mL吐温20+180mL去离子水制备)。
[0108] ·半胱氨酸-HCl(C1276-10G，Sigma-Aldrich)：10μg/mL。
[0109] ·合成肽抗原：5mg/mL 67％乙酸。
[0110] b.包被过程
[0111] ·在使用之前将微板用200μL洗涤缓冲液洗涤三次。
[0112] ·在结合缓冲液中制备20μg/mL的抗原。
[0113] ·将100μL抗原工作溶液添加至每个孔并在4℃下孵育过夜。
[0114] ·将板使用200μL洗涤缓冲液洗涤三次。
[0115] ·临使用之前，在结合缓冲液中制备10μg/mL的半胱氨酸溶液。将200μL添加至每个孔并在室温下孵育1小时以使过量的马来酰亚胺基团失活。
[0116] ·将板使用200μL洗涤缓冲液洗涤两次，然后在40℃下干燥。
[0117] ·用箔膜密封干燥的板，并将其在2℃至8℃下保持多至6个月。
[0118] 用于检测抗癌IgG抗体的ELISA方案
[0119] 下面提供了适用于本发明的肽抗原的典型ELISA方案。
[0120] 人血浆样品购自Biosciences(Cambridge，UK)，其收集自健康的血液捐献者。将20个随机选择的血浆样品的混合血浆用作参考样品(reference sample，RS)以在每个96孔板上检测富含或缺少抗癌IgG抗体的血浆。简单来说，基于制造商的说明书包被马来酰亚胺活化的板(Cat.15150，Thermo Scientific，Edinburgh，UK)。将抗原包被的板用200μL洗涤缓冲液洗涤两次，所述洗涤缓冲液为含有0.05％吐温20的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(P4417，Sigma-Aldrich，Ayrshire，UK)；然后向每个样品孔添加50μL在测定缓冲液中1∶200稀释的血浆样品，所述测定缓冲液是含有0.5％牛血清白蛋白(BSA)的PBS；向每个阴性对照(NC)孔添加50μL测定缓冲液，并向每个RS孔添加50μL RS样品。在室温下孵育1.5小时之后，将板用200μL洗涤缓冲液洗涤三次，并向每个孔添加50μL在测定缓冲液中1∶30000稀释的过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG抗体(ab98567，Abcam，Cambridge，UK)。在室温下孵育1小时之后，通过添加50μL稳定的色原(SB02，Life Technologies，Warrington，UK)开始显色，并在20分钟之后通过添加25μL终止溶液(SS04，Life Technologies)终止显色。在10分钟之内在450nm下在微板读数仪上完成光学密度(OD)的测量，参考波长为620nm。
[0121] SBR的计算
[0122] 所有样品一式两份地进行测试，并且特异性结合率(specific binding ratio，SBR)可用于表示血浆IgG抗体的相对水平。SBR如下计算：
[0123]
[0124] 其中OD样品定义为对于富含抗癌IgG抗体的血浆测量的OD，ODNC定义为对于阴性对照测量的OD，OD对照定义为对于混合的参考样品测量的OD。
[0125] 具有高SBR的样品被鉴定为包含显著水平的抗癌IgG抗体的样品。
[0126] 因此，可以使用上述测定鉴定包含显著水平或浓度的与本发明肽抗原结合的靶抗体的血浆样品。作为结果，所鉴定的样品可用于生产用于治疗癌症的潜在治疗剂。所鉴定的血浆样品的效力可通过测试血浆样品对癌细胞系增殖的影响来研究。表3给出了针对表1中列出的肽抗原的抗癌IgG的相对水平。
[0127] 表3：人血浆中抗癌IgG抗体的相对水平
[0128]
[0129] 细胞增殖测定
[0130] 来源于肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)和胰腺癌(pancreatic adenocarcinoma，PA)的四种细胞系购自European Collection of Authenticated Cell Cultures(ECACC)，Porton Down，UK。在这四种癌细胞系中，两种来源于人HCC，包括Hep B3和Huh-7D12，AsPC-1来自人胰腺癌腹水转移并且BxPC-3来自人原发性胰腺癌。将这些癌细胞系在含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI 1640培养基(Gibco，USA)中接种于96孔板中，100μ4
L/孔，密度为2.5×10细胞/ml，并在具有5％CO2的潮湿气氛中在37℃下培养24小时；在与上述相同的条件下，将这些癌细胞与含有20％人血浆的RPMI 1640一起培养48小时，所述人血浆对于每种抗癌IgG抗体分别为阳性或阴性。通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8，Sigma-Aldrich)评估细胞生存力。简单来说，将10μL CCK-8溶液添加至每个孔；在37℃下孵育2小时之后，在450nm波长下在微板读数仪上测量每个孔的OD。使用完全培养基作为空白。细胞生存力用于提供数据并如下计算：
L/孔，密度为2.5×10细胞/ml，并在具有5％CO2的潮湿气氛中在37℃下培养24小时；在与上述相同的条件下，将这些癌细胞与含有20％人血浆的RPMI 1640一起培养48小时，所述人血浆对于每种抗癌IgG抗体分别为阳性或阴性。通过细胞计数试剂盒-8(CCK-8，Sigma-Aldrich)评估细胞生存力。简单来说，将10μL CCK-8溶液添加至每个孔；在37℃下孵育2小时之后，在450nm波长下在微板读数仪上测量每个孔的OD。使用完全培养基作为空白。细胞生存力用于提供数据并如下计算：
[0131]
[0132] 其中OD阳性定义为在用抗癌IgG阳性的血浆培养的癌细胞中测量的OD，OD阴性定义为在用抗癌IgG阴性的血浆培养的癌细胞中测量的OD。用1-细胞生存力计算抑制率。细胞生存力数据表示为平均值±标准差(SD)，并使用Student’s t-检验或Mann-Whitney U检验来检查用抗癌IgG阳性血浆处理的细胞和用抗癌IgG阴性血浆处理的那些之间细胞生存力的差异。P值＜0.05被认为具有统计学意义。
[0133] 初步结果
[0134] 血浆抗癌IgG的抑制作用在不同的癌细胞之间变化。细胞生存力＜0.9且P值＜0.05被定义为有效抑制，其对于癌症治疗可能具有治疗价值。抑制率也用于表示数据，其定义为(1-细胞生存力)×100％。
[0135] 如表4中所示，抗ERBB3 IgG对Hep B3细胞的增殖具有29％的抑制率(P＝0.003)，并且对Huh-7D12细胞的抑制率为17％(P＜0.001)。
[0136] 表4：血浆抗ERBB3 IgG对癌细胞增殖的抑制作用
[0137]
[0138] 如表5中所示，抗ABCC3 IgG对Hep B3细胞的增殖具有24％的抑制率(P＝0.005)，并且对Huh-7D12细胞的抑制率为13％(P＝0.001)。
[0139] 表5：抗ABCC3 IgG对癌细胞增殖的抑制作用
[0140]
[0141] 如表6中所示，抗ABCC5 IgG对AsPCI细胞的增殖具有20％的抑制率(P＝0.047)，并且对Hep B3细胞增殖的抑制率为24％(P＝0.011，来自Mann-Whitney U检验)。
[0142] 表6：抗ABCC5 IgG对癌细胞增殖的抑制作用
[0143]
[0144] 如表7中所示，抗FGFR2 IgG对Huh-7D12细胞的增殖具有32％的抑制率(P＜0.001)，并且对AsPC1细胞的抑制率为23％(P＝0.004)。
[0145] 表7：抗FGFR2 IgG对癌细胞增殖的抑制作用
[0146]
[0147] 如表8中所示，抗VEGFR1a IgG对Hep B3细胞的增殖具有29％的抑制率(P＜0.001)，并且对Huh-7D12细胞的抑制率为19％(P＝0.016)。
[0148] 表8：抗VEGFR1a IgG对癌细胞增殖的抑制作用
[0149]
[0150] 如表9中所示，抗VEGFR1b IgG对Hep B3细胞的增殖具有25％的抑制率(P＜0.001)，并且对BxPC3细胞的抑制率为21％(P＝0.009)。
[0151] 表9：抗VEGFR1b IgG对癌细胞增殖的抑制作用
[0152]
[0153] 总之，使用本发明的肽抗原检测的所有六种抗体在上述实验中对于至少一种癌细胞类型都证明了对癌细胞增殖的抑制。在所测试的6种不同抗体中，抗FGFR2 IgG对癌细胞生长显示出最强的抑制作用；针对其他5种抗原的IgG抗体也可以不同程度地抑制癌细胞的生长。
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