本发明的多肽和多核苷酸被认为是针对肿瘤的专一性预防性或治 疗性免疫接种的重要免疫原，因为与在正常细胞中的表达相比，它们 在肿瘤中特异性表达或高度过量表达，因此可以通过抗原特异性免疫 机制靶向它们，导致破坏肿瘤细胞。它们还可以用于诊断肿瘤细胞的 存在。此外，它们在某些情况下不适当的表达可以引起诱导自身免疫、 即不适当的免疫应答，通过用所述多肽或多核苷酸适当地接种疫苗可 能矫正所述不适当的免疫应答。在这方面，对我们的目的而言，最重 要的生物活性是本发明多肽的抗原活性和免疫原性活性。本发明的一 种多肽还可能表现出一种CASB7439多肽的至少一种其它生物活性， 它可能被看作是不同于与所述免疫应答相关的治疗性或预防性干涉的 治疗性或预防性干涉的靶。

第一方面，本发明涉及CASB7439多肽。这种肽包括分离的多肽， 所述多肽包含的一段氨基酸序列在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的全长上分别与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、 SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的氨 基酸序列具有至少70％同一性、优选至少80％同一性、更优选至少90％ 同一性、再更优选至少95％同一性、最优选至少97-99％同一性，前提 是所述分离的多肽不是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14。这种多肽包括含SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10 和SEQ ID NO：11的氨基酸的多肽。
本发明的其它肽包括分离的多肽，其中所述氨基酸序列在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、 SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的全长上分别与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12 或SEQ ID NO：14的氨基酸序列具有至少70％同一性、优选至少80％ 同一性、更优选至少90％同一性、再更优选至少95％同一性、最优选 至少97-99％同一性，前提是所述分离的多肽不是SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14。这种多肽包括SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的多肽。
优选上述多肽通过重组产生。最优选按照本发明的多肽是经纯化 的，并且基本上不含任何其它蛋白或污染性宿主来源的材料。
本发明的其它肽包括由包含在SEQ ID NO：1中所含序列的多核苷 酸编码的分离的多肽。
本发明也提供CASB7439多肽的免疫原性片段，即CASB7439多 肽的一个连续部分，所述免疫原性片段具有与包含下述氨基酸序列的 多肽相同或相似的免疫原性特性：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14。也就是说，所述片段(如有必要，与载体偶联或作为较大融合 蛋白的一部分)能够产生识别所述CASB7439多肽的免疫应答。这样的 免疫原性片段可以包括例如缺乏N-末端前导序列、跨膜结构域或C- 末端锚着结构域的CASB7439多肽。在一个优选的方面，按照本发明 的CASB7439免疫原性片段包含多肽的基本上全部的胞外结构域，所 述多肽在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、 SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的全长上分别与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、 SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的氨基酸序列具有至少70％同一性、 优选至少80％同一性、更优选至少90％同一性、再更优选至少95％同 一性、最优选至少97-99％同一性。按照本发明的免疫原性片段最好包 含至少一个表位。
掺入CASB7439表位的肽片段通常包含得自SEQ ID NO：2的至少 7个、优选9个或10个连续氨基酸。优选的表位示于SEQ ID NO：16 至SEQ ID NO：33中。
掺入这些表位的肽构成本发明的一个优选方面。与这些表位的特 征相同的模拟表位(mimotope)和包含这些模拟表位、产生与在 CASB7439分子环境中的表位有交叉反应的免疫应答的免疫原，也构 成本发明的一部分。
因此，本发明包括包含这些表位本身及其任何模拟表位的分离的 肽。模拟表位的含义被定义为与天然CASB7439表位足够相似、以致 能够被识别所述天然分子的抗体识别的实体；(Gheysen，H.M.等，1986， Synthetic peptides as antigens.Wiley，Chichester，Ciba foundation symposium 119，第130-149页；Gheysen，H.M.，1986，Molecular Immunology，23，7，709-715)；或者当与合适载体偶联时能够产生抗体的 实体，其中所述抗体与所述天然分子有交叉反应。
以上所鉴定的表位的肽模拟表位可以通过添加、缺失或取代选定 氨基酸，设计为供特定目的使用。因而，可以对本发明的肽进行修饰， 以便易于与蛋白质载体缀合。例如，对于某些化学缀合方法，可能理 想的是所述表位包括一个末端半胱氨酸。另外，对于与蛋白质载体缀 合的肽，可能理想的是包括一个远离所述肽的缀合末端的疏水性末 端，以便所述肽的游离未缀合的末端保留与所述载体蛋白质的表面缔 合。这降低了所述肽的构象自由度，因而增加了以与在所述完整分子 的情况下存在的肽构象最为类似的构象呈递所述肽的机率。例如，所 述肽可以被改变成具有一个N-端半胱氨酸和一个C-端疏水性酰胺化 尾。另一方面，可以进行一个或多个所述氨基酸的D-立体异构体形式 的添加或取代，以产生有益的衍生物，例如增强所述肽的稳定性。本 领域技术人员会认识到，这种经修饰的肽或模拟表位可以是全部或部 分非肽模拟表位，其中所述组成残基不一定限于20种天然存在的氨基 酸。另外，可以通过本领域已知的技术将其环化，以将所述肽限制在 密切类似所述肽序列在完整分子环境中的形状的构象。将肽环化的一 个优选方法包括添加一对半胱氨酸残基，以允许形成一个二硫桥。
此外，本领域技术人员会认识到，本发明的模拟表位或免疫原可 以比上述鉴定的表位大，因此可以包含本文公开的序列。因此，本发 明的模拟表位可以包括在一个末端或两个末端添加许多其它天然残基 的N和/C端延伸。所述肽模拟表位也可以是天然序列的反序列(retro sequence)，因为所述序列方向是相反的；或者所述序列可以全部或至 少部分由D-立体异构体氨基酸(倒位序列(inverso sequence))构成。另 外，所述肽序列可以在特征上是反-倒位的(retro-inverso)，因为所述序 列方向是相反的，并且所述氨基酸为D-立体异构体形式。这样的反- 倒位肽的优点是非自身的，因此可以克服免疫系统中的自体耐受的问 题。
另一方面，采用诸如噬菌体展示技术(EP 0 552 267 B1)的多种技 术，使用其自身能够与本发明的表位结合的抗体可以鉴定肽模拟表 位。该技术产生大量的模拟天然肽结构的肽序列，因此能够与抗天然 肽抗体结合，但不一定自身与所述天然肽共享显著的序列同源性。该 方法可能是非常有利的，因为使得有可能鉴定免疫原性特性增强的 肽，或者可以克服任何潜在的可能与应用所述天然肽序列相关的自身 抗原耐受问题，另外，鉴于其在所识别肽模拟表位序列中有共享的化 学特性，该技术使得能够鉴定各种天然肽的识别模式。
可以用本领域众所周知的方法使所述肽与免疫原性载体进行共价 偶联。因此，例如，对于直接共价偶联，有可能利用碳二亚胺、戊二 醛或(N-[γ-马来酰亚胺基丁酰氧基]琥珀酰亚胺酯，利用普通市售的杂 双官能接头例如CDAP和SPDP(采用生产商的说明))。在偶联反应后， 所述免疫原可以容易地通过透析法、凝胶过滤法、分级分离法等进行 分离和纯化。
本发明免疫原中所用的载体类型是本领域技术人员容易知道的。 所述载体的功能是提供细胞因子辅助，以便帮助诱导针对所述肽的免 疫应答。可用于本发明的载体的非竭尽性一览表包括：匙孔血蓝蛋 白(KLH)、血清白蛋白例如牛血清白蛋白(BSA)、灭活细菌毒素(例如破 伤风毒素或白喉毒素(TT和DT))或其重组片段(例如，TT的片段C的 结构域1或DT的易位结构域)或结核菌素的纯化蛋白衍生物(PPD)。另 一方面，所述模拟表位或表位可以直接与脂质体载体缀合，所述脂质 体载体另外包含能够提供T-细胞辅助的免疫原。模拟表位与载体之比 最好约为1∶1至20∶1，每个载体最好应该携带3-15个肽。
在本发明的一个实施方案中，一种优选的载体是流感嗜血菌 (Haemophilus influenzae)的D蛋白(EP 0 594 610 B1)。D蛋白是一种得 自流感嗜血菌的IgD结合蛋白，并且Forsgren(WO 91/18926，授权公 告号(granted)EP 0 594 610 B1)已获得专利权。在某些情况下，例如在 重组免疫原表达系统中，可能最好利用D蛋白的片段，例如D蛋白的 三分之一(包含D蛋白N-末端100-110个氨基酸(GB 9717953.5))。
呈递本发明肽的另一优选的方法是在重组融合分子的环境中呈 递。例如，EP 0 421 635 B描述了应用嵌合嗜肝DNA病毒核心抗原颗 粒呈递病毒样颗粒中的外源肽序列。因此，本发明的免疫原可以包含 在由乙型肝炎核心抗原构成的嵌合颗粒中呈递的肽。另外，所述重组 融合蛋白可以包含本发明的模拟表位和一种载体蛋白，例如流感病毒 的NS1。对于构成本发明部分的任何重组表达的蛋白，编码所述免疫 原的核酸也构成本发明的一个方面。
本发明中所用的肽可以通过本领域众所周知的固相方法容易地合 成。适宜的合成可以通过利用“T-boc”或“F-moc”方法来进行。环肽可 以利用众所周知的“F-moc”方法和全自动装置中的聚酰胺树脂通过固 相方法来合成。或者，本领域技术人员会知道人工进行所述方法必需 的实验室方法。固相合成的技术和方法描述于E.Atherton和R.C. Sheppard的“Solid Phase Peptide Synthesis：A Practieal Approach”，Oxford University Press的IRL出版(1989)。或者，所述肽可以通过重组方法 产生，包括在细菌或哺乳动物细胞系中表达编码所述模拟表位的核酸 分子，然后纯化所表达的模拟表位。肽和蛋白的重组表达技术是本领 域已知的，并且描述于Maniatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook等， Molecular cloning，a laboratory manual，第二版；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(1989)。
在本发明的再一实施方案中提供本文所述多肽的制备方法。本发 明的方法可以通过常规重组技术来进行，所述常规重组技术例如描述 于Maniatis等，Molecular Cloning-A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor(1982-1989)中。因此，提供制备按照本发明多肽的方法，所述 方法包括在足以产生所述多肽的条件下培养宿主细胞，从所述培养基 中回收所述多肽。具体地说，本发明的方法可能最好包括下列步骤：
i)制备能够在宿主细胞中表达DNA聚合物的复制型或整合型 表达载体，所述DNA聚合物包含编码所述蛋白或其免疫原 性衍生物的核苷酸序列；
ii)用所述载体转化宿主细胞；
iii)在允许表达所述DNA聚合物的条件下培养所述转化的宿主 细胞，以产生所述蛋白；和
iv)回收所述蛋白。
本发明的多肽或免疫原性片段可以是“成熟”蛋白形式，或者可 以是更大的蛋白如前体蛋白或融合蛋白的一部分。包括包含以下序列 的额外氨基酸序列通常是有利的：分泌序列或前导序列、原序列(pro- sequences)、有助于纯化的序列如多组氨酸残基、或在重组生产过程中 有利于稳定性的其它序列。此外，也考虑添加外源多肽或脂质尾或多 核苷酸序列，以增加最终分子的免疫原性潜能。
一方面，本发明涉及遗传工程可溶性融合蛋白，所述融合蛋白包 含本发明的多肽或其片段，以及不同亚类的免疫球蛋白(IgG、IgM、 IgA、IgE)重链或轻链的恒定区的不同部分。作为免疫球蛋白，优选的 是人类IgG(特别是IgG1)的重链的恒定部分，其中在绞链区发生融 合。在一个特定实施方案中，可以通过加入可用凝血因子Xa切除的 切割序列就可除去Fc部分。此外，本发明涉及通过遗传工程制备这些 融合蛋白的方法，以及这些融合蛋白在药物筛选、诊断和治疗中的应 用。本发明的一个特别优选的方面涉及应用多肽或多核苷酸生产免疫 治疗性治疗患有或易患癌症、尤其是结肠癌或其它结肠相关性肿瘤或 疾病的患者的疫苗。本发明的再一方面还涉及编码这样的融合蛋白的 多核苷酸。在国际专利申请号WO94/29458和WO94/22914中可以找 到融合蛋白技术的实例。
所述蛋白可以化学缀合或作为重组融合蛋白表达，以使得与未融 合的蛋白相比，在表达系统中产生的水平提高。所述融合配偶体可以 协助提供T辅助细胞表位(免疫融合配偶体)、最好是被人类识别的T 辅助细胞表位，或者所述融合配偶体有助于以比天然重组蛋白更高产 量表达所述蛋白(表达增强子)。最好所述融合配偶体既是免疫融合配 偶体，又是表达增强配偶体。
融合配偶体包括流感嗜血菌B的D蛋白以及流感病毒的非结构蛋 白NS1(血凝素)。另一种免疫融合配偶体是称为LYTA的蛋白。最好 使用所述分子的C-末端部分。Lyta得自肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，它合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶-酰胺酶LYTA(由lytA 基因编码{Gene，43(1986)第265-272页})，即特异性降解肽聚糖骨架中 某些键的自溶素。LYTA蛋白的C-末端结构域负责对胆碱或一些胆碱 类似物如DEAE的亲和性。已经利用该特性开发可用于表达融合蛋白 的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。已经描述了在其氨基端包含C-LYTA 片段的杂种蛋白的纯化{Biotechnology：10，(1992)第795-798页}。可利 用存在于Lyta分子C-末端的起始于残基178的重复序列部分，例如残 基188-305。
本发明也包括前述多肽的异种形式(也称为直向同源物形式)，所 述异种形式是指与人类抗原(也称为自身抗原)具有大致序列同一性的 抗原，所述抗原用作来源于不同的非人类物种的参比抗原。在该方面， 所述大致同一性是指当序列在本领域已知的众多序列比对蛋白中的任 一种中以最佳序列比对排列时一个氨基酸序列与另一个氨基酸序列或 者一个多核苷酸序列与另一个多核苷酸序列的一致性。所谓的大致同 一性是指比较序列之间的序列同一性至少为70-95％、优选至少85- 95％、最优选至少90-95％。因此，按照本发明，异种CASB7439多肽 将是对于人CASB7439为异种的CASB7439多肽，换句话说，异种 CASB7439多肽从非人类的物种中分离出来。在一个优选的实施方案 中，所述多肽从小鼠、大鼠、猪或恒河猴中分离，最优选分离自小鼠 或大鼠。因此，本发明也提供在人体内诱导针对人CASB7439的免疫 应答的方法，所述方法包括给予所述受治疗者有效剂量的包含如本文 中所述的所述人CASB7439的异种形式的组合物，所述人CASB7439 的氨基酸序列如序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11中的任一序列所示。一个优选的实施方案 是使用从小鼠、大鼠、猪或恒河猴中分离的异种CASB7439诱导针对 人CASB7439的免疫应答的方法。按照本发明诱导免疫应答的另一种 优选方法是使用包括表达所述异种抗原的活病毒表达系统的抗原组合 物。优选的异种CASB7439多肽的序列示于SEQ ID NO：12(小鼠)或 SEQ ID NO：14(大鼠)中。
分离的异种CASB7439多肽通常共享大致序列相似性，包括包含 在SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的全长上与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的氨基酸序列具有至少70％同一性、优选至少80％同一性、 更优选至少90％同一性、再更优选至少95％同一性、最优选至少97- 99％同一性的氨基酸序列的分离多肽。因此，所述异种多肽包含SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的多肽的免疫原性片段，其中所述免疫原性片 段的免疫原性活性基本上与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的多肽相 同。另外，所述异种CASB7439多肽可以是这样的片段：选自SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14中所示的氨基酸序列的至少约20个连续氨基 酸、优选约30个、更优选约50个、再更优选约100个、最优选约150 个连续氨基酸。更具体地说，异种CASB7439片段会保留SEQ ID NO：12 或SEQ ID NO：14中所示的较大分子的某些功能特性、最好是免疫活 性，并且可用于本文所述的方法中(例如可用于药用组合物或疫苗组合 物、诊断学中等)。具体地说，所述片段能够引起针对人类对应物的免 疫应答，例如产生与任一SEQ ID NO：2所示的自身人类CASB7439形 式反应的交叉反应性抗体。在一个具体的实施方案中，本发明的异种 多肽可以是较大融合物的一部分，所述融合物包含异种CASB7439多 肽或其片段以及如上所述的用作融合配偶体的异源蛋白或蛋白部分。
本发明还包括前述多肽的变异体，即通过保守氨基酸取代、从而 一个残基被另一个具有相似特性的残基取代而与参比物不同的多肽。 通常这样的取代发生在Ala、Val、Leu和Ile之间；Ser和Thr之间； 酸性残基Asp和Glu之间；Asn和Gln之间；以及碱性残基Lys和Arg 之间；或芳香族残基Phe和Tyr之间。特别优选其中若干个、5-10个、 1-5个、1-3个、1-2个或1个氨基酸以任何组合发生取代、缺失或添 加的变异体。
可以以任何合适的方式制备本发明的多肽。这样的多肽包括分离 的天然存在的多肽、重组产生的多肽、合成产生的多肽或通过这些方 法的组合产生的多肽。用于制备这样的多肽的方法是本领域众所周知 的。
另一方面，本发明涉及CASB7439多核苷酸。这样的多核苷酸包 括含编码多肽的核苷酸序列的分离的多核苷酸，所述多肽在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11 的全长上分别与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的氨基酸序列具有至少70％同一性、优选至少 80％同一性、更优选至少90％同一性、再更优选至少95％同一性。在 这一方面，高度优选具有至少97％同一性的所编码多肽，而更高度优 选具有至少98-99％同一性的所编码多肽，最高度优选具有至少99％同 一性的所编码多肽。
本发明的其它多核苷酸包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含 的一段核苷酸序列在完整编码区上与编码SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11的多肽的核苷 酸序列具有至少70％同一性、优选至少80％同一性、更优选至少90％ 同一性、再更优选至少95％同一性。在这一方面，高度优选具有至少 97％同一性的多核苷酸，而更高度优选具有至少98-99％同一性的多核 苷酸，最高度优选具有至少99％同一性的多核苷酸。
本发明的其它多核苷酸包括分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含 的一段核苷酸序列在所述序列的全长上与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9 或者在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、 SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9的所述编码序列的全长上与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或 SEQ ID NO：9的编码序列具有至少70％同一性、优选至少80％同一性、 更优选至少90％同一性、再更优选至少95％同一性。在这一方面，高 度优选具有至少97％同一性的多核苷酸，而更高度优选具有至少98- 99％同一性的多核苷酸，最高度优选具有至少99％同一性的多核苷 酸。这样的多核苷酸包括含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9多核苷酸的多核 苷酸以及SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、 SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9的多核苷酸或者SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：9 的编码区。
本发明还提供编码本发明的前述异种蛋白的核酸及其在医药领域 的应用。在一个优选的实施方案中，用于药用组合物的异种CASB7439 多核苷酸的序列示于SEQ ID NO：13(小鼠)或SEQ ID NO：15(大鼠)。按 照本发明的分离的异种CASB7439多核苷酸可以是单链(编码链或反 义链)或双链的，并且可以是DNA分子(基因组分子、cDNA分子或合 成分子)或RNA分子。其它的编码序列或非编码序列可以但不一定存 在于本发明的多核苷酸中。在其它相关实施方案中，本发明提供多核 苷酸变异体，所述多核苷酸变异体与SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15 中本文公开的序列有大致同一性，例如采用本文所述的方法(例如使用 标准参数的BLAST分析)与本发明的多核苷酸序列相比包含至少70％ 序列同一性、优选至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％或99％或更高序列同一性的多核苷酸变异体。在一个相关实施方 案中，本发明的分离的异种多核苷酸包含编码在SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的全长上与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14的氨基酸序列 具有至少90％、最好是95％和95％以上同一性的多肽的核苷酸序列或 者与所述分离的多核苷酸互补的核苷酸序列。
本发明还提供与所有上述多核苷酸互补的多核苷酸。
可以将所述多核苷酸插入到合适的质粒、重组微生物载体或活的 重组微生物中，并且可以供免疫接种使用(参见例如Wolff等，Science 247：1465-1468(1990)；Corr等，J.Exp.Med.184：1555-1560(1996)；Doe 等，Proc.Natl.Acad.Sci.93：8578-8583(1996))。因此，本发明提供了包 含如上定义的所述多核苷酸的表达载体或活的重组微生物。
本发明还提供CASB7439多核苷酸的片段，其中当给予受治疗者 时所述片段的免疫原性特性与以下的多核苷酸的免疫原性特性相同： SEQ ID NO：1、SBQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15。
本发明还提供编码如前面定义的CASB7439多肽的免疫性片段的 多核苷酸。
所述片段的免疫原性活性水平为SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、 SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14中所示的多肽序列或者由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13 或SEQ ID NO：15中所示的多核苷酸序列编码的多肽序列的免疫原性 活性水平的至少约50％、优选至少约70％、更优选至少约90％。
按照本发明的多肽片段最好包含至少约5个、10个、15个、20 个、25个、50个或100个连续氨基酸或者100个以上的连续氨基酸， 包括所有居中长度的本文所示的多肽组合物，例如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12 或SEQ ID NO：14中所示的多肽组合物，或者由SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、 SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的序列中所示的多核苷酸序列编码的 多肽组合物。
SEQ ID NO：1的核苷酸序列是包含编码193个氨基酸的多肽即 SEQ ID NO：2的多肽的多肽编码序列(核苷酸545-1126)的cDNA序 列。编码SEQ ID NO：2的多肽的核苷酸序列可以与在SEQ ID NO：1中 所含的多肽编码序列相同，或者它可以是不同于在SEQ ID NO：1中所 含的多肽编码序列的序列，由于遗传密码的丰余性(简并性)，所述核 苷酸序列也编码SEQ ID NO：2的多肽。SEQ ID NO：2的多肽在结构上 与achaete scute家族的其它蛋白相关，并且也命名为“人Achaete Scute 同源物2”(HASH2)(登记号NP_005161和AAB86993)。
人Achaete Scute同源物2(HASH2)基因—正式命名为人ASCL2 (Achaete Scute复合物样2)是果蝇属(Drosophila)Achaete和Scute基因 的同源物。人ASCL2仅在发育中的胎盘的滋养层外绒毛(extravillus trophoblast)中表达，并且作图至染色体11p15上靠近IGF2和H19。小 鼠achaete-scute同系物-2基因(MASH2)编码在滋养层的发育中起作用 的转录因子。Mash2基因在小鼠中是父性遗传的，并且在非恶性水泡 状(单雌生殖(andorgenetic))胎块中缺乏人ASCL2的表达，表明人Ascl2 也在人类中遗传。
Ascl2基因是转录因子的碱性螺旋-环-螺旋(BHLH)家族的成员。它 们通过与E框(5’-CANNTG-3’)结合而激活转录。与其它BHLH蛋白二 聚体化是有效DNA结合所需的。它们在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)以及可能在哺乳动物中参与决定周围神经系统和中枢神 经系统中的神经元前体。
SEQ ID NO：1核苷酸序列的互补链是SEQ ID NO：6的多核苷酸序 列。该链也包含两种其它多肽编码序列。第一种多肽编码序列(SEQ ID NO：1的核苷酸1184-399，SEQ ID NO：6的核苷酸608-1393)编码一种 262个氨基酸的多肽，即SEQ ID NO：3的多肽。第二种多肽编码序列 (SEQ ID NO：1的核苷酸840-262，SEQ ID NO：6的核苷酸952-1530)编 码一种193个氨基酸的多肽，即SEQ ID NO：11的多肽。编码SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：11的多肽的核苷酸序列可以与在SEQ ID NO：6 中所含的多肽编码序列相同，或者它可以是不同于在SEQ ID NO：6中 所含的多肽编码序列的序列，由于遗传密码的丰余性(简并性)，所述 核苷酸序列也编码SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：11的多肽。SEQ ID NO：3的多肽在结构上与剪接辅激活蛋白家族的其它蛋白相关，与人 (Homo sapiens)剪接辅激活蛋白亚基srm300(Genbank登记号 AAF21439)具有同源性和/或结构相似性。SEQ ID NO：11的多肽与任何 已知的蛋白不相关。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：11中所示的多肽序 列以及SEQ ID NO：6中所示的多核苷酸序列是新的序列，并且也构成 本发明的一部分。
预期本发明的优选多肽和多核苷酸除了别的以外，与其同源多肽 和多核苷酸的生物功能/特性相似。此外，本发明优选的多肽、免疫性 片段和多核苷酸具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3或 SEQ ID NO：11的适当的至少一种活性。
本发明还涉及部分或其它不完全的多核苷酸序列和多肽序列，所 述序列是在测定SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：11的相应全长序列之前首先鉴定的。
因此，再一方面，本发明提供分离的多核苷酸，所述多核苷酸：
(a)包含在SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的全长上与SEQ ID NO：4 和SEQ ID NO：5具有至少70％同一性、优选至少80％同一性、更优选 至少90％同一性、再更优选至少95％同一性、甚至更优选至少97-99％ 同一性的核苷酸序列；
(b)具有在SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的全长上分别与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6具有至少70％同一性、优选至少80％同一性、 更优选至少90％同一性、再更优选至少95％同一性、甚至更优选至少 97-99％同一性的核苷酸序列；
(c)SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的多核苷酸；或
(d)编码多肽的核苷酸序列以及SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5的 多核苷酸，所述多肽在SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7的全长上分别与 SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％同一性、优 选至少80％同一性、更优选至少90％同一性、再更优选至少95％同一 性、甚至更优选至少97-99％同一性。
本发明还提供这样的多肽，所述多肽：
(a)包含在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7的全长上与SEQ ID NO：2 和SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％同一性、优选至少80％同 一性、更优选至少90％同一性、再更优选至少95％同一性、最优选至 少97-99％同一性的氨基酸序列；
(b)具有在SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7的全长上与SEQ ID NO：2 或SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％同一性、优选至少80％同 一性、更优选至少90％同一性、再更优选至少95％同一性、最优选至 少97-99％同一性的氨基酸序列；
(c)包含SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：7的氨基酸；和
(d)是SEQ ID NO：7的多肽；
以及本发明还提供由包含在SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5中所含 的序列的多核苷酸编码的多肽。
可以采用标准克隆和筛选技术，从人结肠癌细胞中的mRNA衍生 的cDNA文库中获得本发明的多核苷酸，(例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))。本发明的多核苷酸也可以得自 诸如基因组DNA文库的天然来源，或者可以采用众所周知的在商业上 可获得的技术进行合成。
当用本发明的多核苷酸重组生产本发明的多肽时，所述多核苷酸 可以包括成熟多肽的编码序列本身；或在读框中还有其它编码序列的 成熟多肽的编码序列，所述其它编码序列例如编码前导序列或分泌序 列、前蛋白(pre-protein)序列或原蛋白(pro-protein)序列、或前原蛋白 (prepro-protein)序列或其它融合肽部分的序列。例如，可以编码有利于 纯化所融合的多肽的标记序列。在本发明该方面的某些优选的实施方 案中，所述标记序列为在pQE载体(Qiagen，Inc.)中提供并在Gentz等， Proc Natl Acad Sci USA(1989)86：821-824中描述的六组氨酸肽，或者 是HA标记。所述多核苷酸也可以含有5’和3’非编码序列，例如转录 但不翻译的序列、剪接信号和聚腺苷酸化信号、核糖体结合位点和稳 定mRNA的序列。
本发明的其它实施方案包括编码多肽变异体的多核苷酸，所述多 肽变异体包含SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的氨基酸序列，其中若干个、 例如5-10个、1-5个、1-3个、1-2个或1个氨基酸以任何组合发生取 代、缺失或添加。
与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6中所含的核苷酸序列相同或足够 相同的多核苷酸可以用作cDNA和基因组DNA的杂交探针或者用作 核酸扩增(PCR)的引物，以分离编码本发明多肽的全长cDNA和基 因组克隆，以及分离与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6具有高度序列相 似性的其它基因(包括编码来源于人的共生同源物和来源于除人类以 外的物种的直向同源物和共生同源物的基因)的cDNA和基因组克 隆。通常，这些核苷酸序列与参比物的序列有70％相同、优选80％相 同、更优选90％相同、最优选95％相同。所述探针或引物总的来讲包 含至少15个核苷酸、最好是至少30个核苷酸，并且可以具有至少50 个核苷酸。特别优选的探针具有30-50个核苷酸。特别优选的引物具 有20-25个核苷酸。具体地说，从同种动物来源序列获得的多肽或多 核苷酸可以用作免疫原，以获得与人基因有交叉反应的免疫应答。
编码本发明多肽包括来自除人以外的物种的同系物在内的多核苷 酸，可以通过这样的方法获得：所述方法包括在严格杂交条件下，用 具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6的序列或其片段的标记探针，筛选 合适的文库；并且分离含有所述多核苷酸序列的全长cDNA和基因组 克隆的步骤。这样的杂交技术是本领域技术人员众所周知的。优选的 严格杂交条件包括在包含以下组分的溶液中于42℃保温过夜：50％甲 酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5x Denhardt氏溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20微克/ml变性剪切的 鲑精DNA；然后在0.1x SSC中在约65℃下洗涤滤膜。因此，本发明 也包括在严格杂交条件下，用具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：6的序 列或其片段的标记探针，通过筛选合适的文库可获得的多核苷酸。
技术人员知道，在许多情况下，分离的cDNA序列是不完全的， 因为所述多肽的编码区在所述cDNA的5’端较短。
对于本领域技术人员而言，有数种获得全长cDNA或延伸短cDNA 的方法可利用并且是众所周知的，例如基于cDNA末端快速扩增 (RACE)方法的那些方法(参见例如Frohman等，PNAS USA 85，8998- 9002，1988)。例如以MarathonTM技术(Clontech Laboratories Inc.)为例的 最新改进的该技术已大大简化了对较长cDNA的搜索。在MarathonTM 技术中，用从选定组织中提取的mRNA制备cDNA，并将“接头”序列 连接到每个末端。然后使用基因特异性寡核苷酸引物和接头特异性寡 核苷酸引物的组合，进行核酸扩增(PCR)，以扩增所述cDNA“缺失的” 5’端。然后使用“嵌套”引物重复所述PCR反应，“嵌套”引物即是 设计在所扩增的产物内退火的引物(通过是在接头序列中更远的3’退 火的接头特异性引物和在已知的基因序列中更远的5’退火的基因特异 性引物)。然后可以通过DNA测序分析该反应的产物，随后通过使所 述产物直接连接到现有cDNA而产生完整的序列，或者使用新的序列 信息设计5’引物来进行一个独立的全长PCR，构建全长cDNA。
通过本领域众所周知的方法，可以用包含表达系统的遗传工程改 造的宿主细胞制备本发明的重组多肽。因此，再一方面，本发明涉及 包含本发明多核苷酸的表达系统，涉及用这样的表达系统遗传工程改 造的宿主细胞，还涉及通过重组技术产生本发明的多肽。也可以采用 衍生自本发明的DNA构建体的RNA，使用无细胞翻译系统生产这样 的蛋白质。
为了重组生产，可以遗传工程改造宿主细胞以掺入本发明多核苷 酸的表达系统或其部分。可以采用许多标准实验室手册中介绍的方 法，实现将多核苷酸导入宿主细胞，所述实验室手册例如Davis等， Basic Methods in Molecular Biology(1986)和Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。优选的这类方法包括例如磷酸 钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、转位、微注射、阳离子脂质介导 的转染、电穿孔、转导、擦伤加样(scrape loading)、基因枪引入(ballistic introduction)或感染。
本发明的蛋白最好与反式硫氧还蛋白(TIT)共表达。优选反式与顺 式硫氧还蛋白共表达，以保持抗原无硫氧还蛋白，而不需要蛋白酶。 硫氧还蛋白共表达使本发明的蛋白易于溶解。硫氧还蛋白共表达还对 蛋白纯化得率、对纯化蛋白的溶解度和质量产生显著影响。
合适宿主的代表性实例包括细菌细胞，如链球菌(Streptococci)、 葡萄球菌(Staphylococci)、大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)和枯草芽 孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞；真菌细胞，例如酵母细胞和曲霉属 (Aspergillus)的细胞；昆虫细胞，例如果蝇属(Drosophila)S2细胞和贪 夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞；动物细胞，例如CHO、COS、HeLa、C127、 3T3、BHK、HEK 293和Bowes黑素瘤细胞；和植物细胞。
可以使用各种各样的表达系统，例如染色体衍生的系统、附加体 衍生的系统和病毒衍生的系统，例如衍生自以下的载体：细菌质粒、 噬菌体、转座子、酵母附加体、插入元件、酵母染色体元件；衍生自 以下病毒的载体：杆状病毒、乳多空病毒(如SV40)、痘苗病毒、腺病 毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和反转录病毒；以及衍生自其组合的载 体，例如衍生自质粒和噬菌体遗传元件的那些载体，诸如粘粒和噬菌 粒。所述表达系统可以包含调节以及产生表达的控制区。一般而言， 可以使用能够在宿主中维持、繁殖或表达多核苷酸以产生多肽的任何 系统或载体。可以通过多种众所周知的常规技术中的任何一种，将合 适的核苷酸序列插入表达系统中，所述常规技术例如Sambrook等， Molecular Cloning：A Laboratory Manual(参见上文)所介绍的技术。为了 让翻译的蛋白分泌到内质网腔、壁膜间隙或胞外环境中，可以将合适 的分泌信号掺入到所需的多肽中。这些信号对于所述多肽可以是内源 的，或者它们可以是异源信号。
所述表达系统也可以是活的重组微生物，例如病毒或细菌。可以 将感兴趣的基因插入活的重组病毒或细菌的基因组中。用该活的载体 接种和体内感染，将使所述抗原在体内表达并诱导免疫应答。
因此，在某些实施方案中，采用众多已知基于病毒的系统中的任 一系统，将编码本发明免疫原性多肽的多核苷酸导入用于表达的合适 哺乳动物宿主细胞中。在一个说明性的实施方案中，反转录病毒提供 用于基因传递系统的便利有效的平台。采用本领域已知的技术，可以 将编码本发明多肽的选定核苷酸序列插入到载体中，然后在反转录病 毒颗粒中包装。然后可以分离所述重组病毒，将其给予受治疗者。许 多说明性的反转录病毒系统已有介绍(例如美国专利第5,219,740号； Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7：980-990；Miller，A.D.(1990) Human Gene Therapy 1：5-14；Scarpa等(1991)Virology 180：849-852； Burns等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8033-8037；和Boris- Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3：102-109)。
另外，许多说明性的基于腺病毒的系统也有介绍。与整合到宿主 基因组中的反转录病毒不同，腺病毒一直位于染色体外，因而将与插 入诱变相关的危险减至最小(Haj-Ahmad和Graham(1986)J.Virol. 57：267-274；Bett等(1993)J.Virol.67：5911-5921；Mittereder等(1994) Human Gene Therapy 5：717-729；Seth等(1994)J.Virol.68：933-940；Barr 等(1994)Gene Therapy 1：51-58；Berkner，K.L.(1988)BioTechniques 6：616-629；和Rich等(1993)Human Gene Therapy 4：461-476)。
还开发出各种腺伴随病毒(AAV)载体系统用以传递多核苷酸。采 用本领域众所周知的技术，可以容易地构建AAV载体。参见，例如， 美国专利第5,173,414号和第5,139,941号；国际公布号WO 92/01070 和WO 93/03769；Lebkowski等(1988)Molec.Cell.Biol.8：3988-3996； Vincent等(1990)Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press)； Carter，B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology 3：533-539； Muzyczka，N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.158：97- 129；Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy 5：793-801；Shelling和 Smith(1994)Gene Therapy 1：165-169；和Zhou等(1994)J.Exp.Med. 179：1867-1875。
可用于通过基因传移传递编码本发明多肽的核酸分子的其它病毒 载体包括衍生自痘病毒科(例如痘苗病毒和禽痘病毒)的病毒载体。作 为实例，可以如下构建表达所述新分子的痘苗病毒重组体。首先将编 码多肽的DNA插入到合适的载体中，使得它邻接一个痘苗病毒启动子 和侧翼痘苗病毒DNA序列，例如编码胸苷激酶(TK)的序列。然后用该 载体转染同时用痘苗病毒感染的细胞。同源重组使痘苗病毒启动子加 上编码感兴趣的多肽的基因插入到病毒基因组中。通过在5-溴脱氧尿 苷存下下培养细胞，然后挑出抗性病毒空斑，可以选择所产生的 TK.sup.(-)重组体。
可以方便地用基于痘苗病毒的感染/转染系统在某一生物的宿主 细胞内提供本文所述的一种或多种多肽的诱导型瞬时表达或共表达。 在这一特定系统中，首先在体外用编码噬菌体T7RNA聚合酶的痘苗 病毒重组体感染细胞。该聚合酶表现出灵敏的特异性，因为它只转录 带有T7启动子的模板。感染后，细胞用由T7启动子驱动的一种或多 种感兴趣的多核苷酸转染。来自痘苗病毒重组体在胞质内表达的聚合 酶将转染的DNA转录成RNA，然后通过宿主翻译机器将其翻译成多 肽。所述方法可供用于高水平、瞬时、胞质内生产大量的RNA及其翻 译产物。参见，例如，Elroy-Stein和Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1990)87：6743-6747；Fuerst等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986) 83：8122-8126。
或者，也可用诸如禽痘病毒(fowlpox virus)和金丝雀痘病毒的禽痘 病毒(avipoxvirus)传递感兴趣的编码序列。已知表达得自哺乳动物病原 体的免疫原的重组禽痘病毒(avipox virus)当给予非禽类物种时提供保 护性免疫。在人和其它哺乳动物物种中应用禽痘病毒载体是特别理想 的，这是由于禽痘病毒属的成员仅可以在易感的禽类物种中生产性地 复制，因此它们在哺乳动物细胞内是没有感染力的。制备重组禽痘病 毒的方法在本领域是已知的，并且使用如上所述的关于制备痘苗病毒 的遗传重组。参见，例如，WO 91/12882；WO 89/03429和WO 92/03545。
还可以用众多甲病毒载体中的任一种传递本发明的多核苷酸组合 物，例如在美国专利号5,843,723、6,015,686、6,008,035和6,015,694 中介绍的那些载体。也可以使用基于委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒的某些 载体，其说明性的实例可以在美国专利第5,505,947号和第5,643,576 号中找到。
此外，还可以使用Michael等J.Biol.Chem.(1993)268：6866-6869 和Wagner等Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：6099-6103中介绍的 诸如腺病毒嵌合载体的分子缀合载体来进行本发明的基因传递。
有关这些和其它已知的基于病毒的传递系统的其它说明性资料可 以在以下的文献中找到：例如Fisher-Hoch等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：317-321，1989；Flexner等，Ann.N.Y. Acad.Sci.569：86-103，1989； Flexner等，Vaccine 8：17-21，1990；美国专利号4,603,112、4,769,330和 5,017,487；WO 89/01973；美国专利号4,777,127；GB 2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner，Biotechniques 6：616-627，1988； Rosenfeld等，Science 252：431-434，1991；Kolls等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91：215-219，1994；Kass-Eisler等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11498-11502，1993；Guzman等，Circulation 88：2838-2848，1993；和 Guzman等，Cir.Res.73：1202-1207，1993。
上述活的重组微生物可以是有毒力的，或者是以各种方式减毒以 获得活疫苗。这样的活疫苗也构成本发明的一部分。
在某些实施方案中，可以将多核苷酸整合到靶细胞的基因组中。 这种整合可以在特定位置以特定方向通过同源重组进行(基因置换)， 或者它可以在随机、非特定位置内整合(基因扩增)。在另外一些实施 方案中，所述多核苷酸可以在细胞内作为独立的附加型DNA区段稳定 地保持。这样的多核苷酸区段或“附加体”编码的序列足以允许其保 持并且独立于宿主细胞周期进行复制或者与宿主细胞周期同步复制。 表达构建体传递至细胞的方式以及所述多核苷酸保持在所述细胞内的 位置取决于所用的表达构建体的类型。
在本发明的另一实施方案中，例如如在Ulmer等，Science 259：1745-1749，1993中的描述和Cohen，Science 259：1691-1692，1993的 综述，多核苷酸作为“裸”DNA给予/传递。通过将裸DNA包被到被 有效地转运到细胞内的生物可降解的微珠上，可以增加所述DNA的摄 入。
在再一实施方案中，本发明的组合物可以通过粒子轰击法传递， 其中许多方法已有介绍。在一个说明性的实施例中，用诸如Powderject Pharmaceuticals PLC(Oxford，UK)和Powderject Vaccines Inc.(Madison， WI)生产的装置可以实现气动粒子加速，其中某些实施例描述于美国专 利号5,846,796、6,010,478、5,865,796、5,584,807和欧洲专利号0500 799。该方法提供一种无针传递方法，其中诸如多核苷酸或多肽粒子的 微粒干粉制剂在由hand held deviee产生的氦气喷射流中被加速至高 速，推动所述粒子到达感兴趣的靶组织。
在一个相关实施方案中，可以用于气动无针注射本发明组合物的 其它装置和方法包括Bioject，Inc.(Portland，OR)提供的装置和方法，其 中某些实施例描述于美国专利号4,790,824、5,064,413、5,312,335、 5,383,851、5,399,163、5,520,639和5,993,412。
通过众所周知的方法，可以从重组细胞培养物中回收并纯化本发 明的多肽，所述方法包括硫酸铵沉淀或乙醇沉淀、酸提取、阴离子交 换层析或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、亲和层 析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。最优选使用离子金属亲和层析 (IMAC)进行纯化。当所述多肽在胞内合成、分离和/或纯化过程中变性 时，可以使用熟知的重折叠蛋白技术重建活性构象。
本发明的另一重要方面涉及诱导、加强或调节哺乳动物体内免疫 应答的方法，所述方法包括用足以产生抗体和/或T细胞免疫应答的本 发明的完整多肽或多核苷酸或其片段接种哺乳动物，用于免疫预防或 用于治疗性治疗癌症、更特别是结肠直肠癌和自身免疫病及相关病 症。本发明的再一方面涉及诱导、加强或调节哺乳动物体内免疫应答 的方法，所述方法包括通过在体内指导表达所述多核苷酸和编码所述 多肽的载体或细胞来传递本发明的多肽，以便诱导这样的免疫应答， 以产生预防或治疗所述动物免患疾病的免疫应答。
本发明的再一方面涉及免疫制剂/疫苗制剂(组合物)及其在医药领 域的应用。当所述组合物被引入哺乳动物宿主后，在该哺乳动物体内 诱导、加强或调节针对本发明多肽的免疫应答，其中所述组合物包含 如本文前面所限定的本发明的多肽或多核苷酸或其免疫学片段。更具 体地说，按照本发明的免疫原性组合物包含安全有效量的CASB7439 多肽或其免疫原性片段，其中所述CASB7439多肽选自SEQ ID NO：2、 SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14。在另一个实施方案中，所述免疫原性组合物 包含安全有效量的编码CASB7439的多核苷酸或其片段，其中所述编 码CASB7439的多核苷酸选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13 或SEQ ID NO：15。
按照本发明的疫苗制剂还可以包含一种合适的载体，即药学上可 接受的载体。由于多肽可能在胃中分解，因此它们最好是胃肠外给予 (例如皮下注射、肌内注射、静脉内注射或皮内注射)。适合于胃肠外 给药的制剂包括水性和非水无菌注射液，所述注射液可以包含抗氧化 剂、缓冲剂、抑菌剂和使得所述制剂与受体血液等渗的溶质；以及可 以包含悬浮剂或增稠剂的水性和非水无菌悬浮液。所述制剂可以盛装 在单位剂量容器或多剂量容器(例如密封安瓿和管形瓶)中，并且可以 在冻干条件下保存，只需要在临用前加入无菌液体载体即可。
本发明的再一方面涉及采用来自哺乳动物免疫系统的细胞，在体 外诱导针对本发明的完整多肽或多核苷酸或其片段的免疫应答或者是 针对包含本发明多肽或多核苷酸的分子的免疫应答，并且将这些活化 免疫细胞回输给所述哺乳动物以治疗疾病。通过与本发明完整多肽或 多核苷酸或者包含本发明多肽或多核苷酸的分子在有或无各种免疫调 节分子的情况下体外孵育，达到活化来自所述免疫系统的所述细胞。 本发明的再一方面涉及通过给予抗原呈递细胞免疫哺乳动物，所述抗 原呈递细胞通过在体外加载本发明的完整多肽或其部分或者包含本发 明多肽的分子而被修饰，然后以免疫原性方式将所述抗原呈递细胞给 予体内。或者，可以用含有本发明的完整多核苷酸或其片段或者包含 本发明多核苷酸的分子的载体，体外转染抗原呈递细胞，例如以表达 相应的多肽，然后以免疫原性方式将所述抗原呈递细胞给予体内。因 此，本发明的药用组合物包含有效量的抗原呈递细胞和药学上有效的 载体，所述抗原呈递细胞通过在体外加载CASB7439多肽而被修饰或 者在体外经遗传修饰而表达CASB7439多肽。
按照另一个实施方案，除本发明的免疫原性多核苷酸、多肽、抗 体、T细胞和/抗原呈递细胞(APC)组合物外，本文所述的药用组合物/ 免疫原性组合物还包含一种或多种免疫刺激剂。因此，本文提供生产 所述免疫原性组合物的方法，所述方法包括将CASB7439多肽或编码 CASB7439的多核苷酸与合适的佐剂/免疫刺激剂、稀释剂或其它药学 上可接受的载体混合。免疫刺激剂实质上是指提高或增强对外源性抗 原的免疫应答(抗体和/细胞介导)的任何物质。一种优选类型的免疫刺 激剂包括佐剂。许多佐剂含有设计周以保护抗原免遭快速分解的物 质，例如氢氧化铝或矿物油，以及含有免疫应答的刺激剂，例如脂质 A，百日咳博德特氏菌(Bortadella pertussis)或结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis)源性蛋白。某些佐剂是市售的，例如弗氏 不完全佐剂和弗氏完全佐剂(Dffco Laboratories，Detroit，MI)；Merck佐 剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，PA)；诸如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝的铝 盐；钙盐、铁盐或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮剂；酰化糖；阳离 子或阴离子衍生化的多糖；聚磷腈；生物可降解的微球体；单磷脂酰 脂质A和quil A。诸如GM-CSF、白介素-2、白介素-7、白介素-12的 细胞因子和其它类似的生长因子也可以用作佐剂。
在本发明的某些实施方案中，所述佐剂组合物最好是主要诱导 Th1型免疫应答的佐剂组合物。高水平的Th1型细胞因子(例如IFN-γ、 TNFα、IL-2和IL-12)往往促进诱导针对所给予抗原的细胞介导的免疫 应答。相反，高水平的Th2型细胞因子(例如IL-4、IL-5、IL-6和IL-10) 往往促进诱导体液免疫应答。应用本文提供的疫苗后，患者将支持包 括Th1型和Th2型应答的免疫应答。在应答主要为Th1型的一个优选 实施方案中，Th1型细胞因子的水平比Th2型细胞因子的水平增加的 程度更大。采用标准测定可以容易地评价这些细胞因子的水平。有关 细胞因子家族的综述，请参见Mosmann和Coffman，Ann.Rev.Immunol. 7：145-173，1989。
供诱导主要为Th1型应答的某些优选佐剂包括例如单磷脂酰脂质 A、最好是3-脱-O-酰化单磷脂酰脂质A与铝盐一起的组合。MPL佐 剂可得自Corixa Corporation(Seattle，WA；参见，例如，美国专利号 4,436,727、4,877,611、4,866,034和4,912,094)。含CpG的寡核苷酸(其 中CpG二核苷酸未被甲基化)也诱导主要为Th1型的应答。这样的寡 核苷酸是众所周知的，描述于例如WO 96/02555、WO99/33488和美国 专利号6,008,200和5,856,642。免疫刺激DNA序列也描述于例如Sato 等，Science 273：352，1996。另一优选的佐剂包含诸如Quil A的皂苷或 其衍生物，包括QS21和QS7(Aquila Biopharmaceuticals Inc.， Framingham，MA)；七叶皂苷；毛地黄皂苷；或丝石竹属(Gypsophila) 或Chenopodium quinoa皂苷。在本发明的佐剂组合中，其它优选的制 剂包括一种以上的皂苷，例如以下至少两种的组合：QS21、QS7、Quil A、β-七叶皂苷或毛地黄皂苷。
或者，可以将皂苷制剂与由脱乙酰壳多糖或其它聚阳离子聚合 物、聚交酯和聚丙交酯-乙交酯共聚物颗粒、基于聚-N-乙酰葡糖胺的 聚合物基质、由多糖或经化学修饰的多糖组成的颗粒、脂质体和基于 脂质的颗粒、由甘油单酯组成的颗粒等组成的疫苗载体混合。皂苷也 可以在胆固醇存在下进行配制，以形成颗粒性结构，例如脂质体或 ISCOM。此外，皂苷可以与聚氧乙烯醚或酯一起在非颗粒性溶液或悬 浮液或在诸如paucilamelar脂质体或ISCOM的颗粒性结构中进行配 制。皂苷也可以与诸如CarbopolR的赋形剂一起配制，以增加粘度，或 者可以以干粉形式与诸如乳糖的粉状赋形剂一起配制。
在一个优选的实施方案中，所述佐剂系统包括单磷脂酰脂质A和 皂苷衍生物的组合，例如在WO 94/00153中描述的QS21和3D-MPL 佐剂的组合或者在WO 96/33739中描述的其中QS21用胆固醇猝灭的 反应原性较低的组合物。其它优选的制剂包含水包油乳剂和生育酚。 WO 95/17210中描述了使用QS21、3D-MPL佐剂和生育酚的水包油乳 剂的另一特别优选的佐剂制剂。
另一增强的佐剂系统包括含CpG寡核苷酸和皂苷衍生物的组 合、尤其是WO 00/09159中公开的CpG和QS21的组合。所述制剂最 好另外包含水包油乳剂和生育酚。
可供用于本发明药用组合物中的其它说明性佐剂包括Montanide ISA 720(Seppic，法国)、SAF(Chiron，Califomia，美国)、ISCOMS (CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列的佐剂(例如SBAS-2或SBAS-4，可 得自SmithKline Beecham，Rixensart，比利时)、Detox(Enhanzyn) (Corixa，Hamilton，MT)、RC-529(Corixa，Hamilton，MT)和其它氨烷基氨 基葡糖苷4-磷酸酯(AGP)，例如待审的美国专利申请顺序号08/853,826 和09/074,720中描述的佐剂(所述专利申请的公开内容通过引用全部结 合到本文中)以及聚氧乙烯醚佐剂，例如WO 99/52549A1中描述的佐 剂。
其它优选的佐剂包括通式(I)的佐剂分子：
HO(CH2CH2O)n-A-R
其中n为1-50，A为一个键或-C(O)-，R为C1-50烷基或苯基C1-50 烷基。
本发明的一个实施方案包括含通式(I)的聚氧乙烯醚的疫苗制剂， 其中n为1-50、优选为4-24、最优选为9；R组分为C1-50烷基、优选 为C4-20烷基、最优选为C12烷基；A为一个键。聚氧乙烯醚的浓度范 围应该为0.1-20％、优选为0.1-10％、最优选为0.1-1％。优选的聚氧乙 烯醚选自以下组：聚氧乙烯9-十二烷基醚、聚氧乙烯-9-硬脂酰基醚、 聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-十二烷基醚、聚氧乙烯-35-十二 烷基醚和聚氧乙烯-23-十二烷基醚。诸如聚氧乙烯十二烷基醚的聚氧 乙烯醚在Merck index(第12版：entry 7717)中有描述。这些佐剂分子在 WO 99/52549中有描述。
如果需要，按照上述通式(I)的聚氧乙烯醚可以与另一佐剂组合。 例如一种优选的佐剂组合最好是与待审的英国专利申请GB 9820956.2 中描述的CpG组合。
按照本发明的疫苗组合物中最好还存在一种载体。所述载体可以 是水包油乳剂，或者是一种铝盐，例如磷酸铝或氢氧化铝。
优选的水包油乳剂包含一种可代谢的油，例如角鲨烯、α-生育酚 和吐温80。在一个特别优选的方面，按照本发明疫苗组合物中的抗原 与这种乳剂中的QS21和3D-MPL混合。另外，所述水包油乳剂可以 含有span 85和/或卵磷脂和/或三辛酰甘油酯。
给予人时，通常疫苗中的QS21和3D-MPL含量范围为每剂1μg- 200μg、例如10μg-100μg、最好是10μg-50μg。而水包油乳剂通常包含 2-10％角鲨烯、2-10％α-生育酚和0.3-3％吐温80。角鲨烯：α-生育酚的 比例最好等于或小于1，因为这样的比例提供更稳定的乳剂。Span 85 的含量也可以为1％。在某些情况下，本发明的疫苗另外含有一种稳定 剂可能是有利的。
无毒的水包油乳剂最好在含水载体中含有一种无毒的油例如角鲨 烷或角鲨烯，以及一种乳化剂例如吐温80。所述含水载体可以是例如 磷酸缓冲盐溶液。
WO 95/17210中描述了一种特别有效的佐剂制剂，该制剂为包含 QS21、3D-MPL和生育酚的水包油乳剂。
本发明也提供多价疫苗组合物，所述多价疫苗组合物包含本发明 疫苗制剂以及其它抗原，尤其是可用于治疗癌症、更特别是结肠直肠 癌、自身免疫病和相关病症的抗原。这样的多价疫苗组合物可以包括 如上文所述的TH-1诱导佐剂。
按照本发明的另一个实施方案，将本文所述的免疫原性组合物通 过抗原呈递细胞(APC)传递至宿主，所述抗原呈递细胞(APC)例如树突 细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞和其它可以被工程改造以成为有 效的APC的细胞。这类细胞可以但不一定被遗传修饰，以增加呈递抗 原的能力、改进T细胞应答的活化和/或保持、本身具有抗肿瘤效应和 /或与受体在免疫学上是相容的(即匹配HLA单倍型)。APC一般可以从 各种各样的生物体液或器官(包括肿瘤和肿瘤周围组织)的任一种中分 离出来，或可以是自体细胞、同种异体细胞、同种同基因细胞或异种 细胞。
本发明的某些优选的实施方案使用树突细胞或其祖细胞作为抗原 呈递细胞。树突细胞是非常有效的APC(Banchereau和Steinman，Nature 392：245-251，1998)，并且已表明作为诱导预防性或治疗性抗肿瘤免疫 的生理佐剂是有效的(参见Timmerman和Levy，Ann.Rev.Med.50：507- 529，1999)。一般而言，树突细胞可能根据其典型的形状(原位为星状， 体外可见明显的胞质突(树突))、其摄入、突起和以高效率呈递抗原的 能力以及其活化原初T细胞应答的能力来鉴定。当然，可以对树突细 胞进行工程改造，以表达通常在体内或离体树突细胞上不存在的特异 性细胞表面受体或配体，本发明考虑了这类经修饰的树突细胞。作为 树突细胞的替代物，在疫苗中可以使用加载分泌型小泡抗原的树突细 胞(称为外来体)(参见Zitvogel等，Nature Med 4.594-600，1998)。
树突细胞和祖细胞可以从外周血、骨髓、肿瘤浸润细胞、肿瘤周 围组织浸润细胞、淋巴结、脾、皮肤、脐带血或任何其它合适的组织 或体液获得。例如，可以通过将细胞因子例如GM-CSF、IL-4、IL-13 和/或TNFα的组合加到从外周血收获的单核细胞培养物中，使树突细 胞离体分化。或者，可以通过将GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配体、 LPS、flt3配体和/或其它诱导树突细胞分化、成熟和增殖的化合物加入 到所述培养基中，使从外周血、脐带血或骨髓收获的CD34阳性细胞 分化成树突细胞。
树突细胞常规分为“未成熟”细胞和“成熟”细胞，可用简单的 方式将两种充分表征的表型区分开来。然而，这种命名不应该解释为 排除所有可能的中间分化阶段。未成熟树突细胞的特征为与Fcγ受体和 甘露糖受体高表达相关的抗原摄入和加工能力高的APC。成熟表型通 常的特征在于这些标记的表达较低，但负责T细胞活化的细胞表面分 子(例如I类MHC和II类MHC)、粘着分子(例如CD54和CD11)和共 同刺激分子(例如CD40、CD80、CD86和4-1BB)的表达高。
一般可以用本发明的多核苷酸(或其部分或其它变异体)转染 APC，使得所编码的多肽或其免疫原性部分在所述细胞表面表达。可 以离体进行这样的转染，然后包含这样的转染细胞的药用组合物可以 用于本文所述的治疗目的。或者，可以将靶向树突细胞或其它抗原呈 递细胞的基因传递载体给予患者，导致在体内发生转染。一般而言， 采用本领域已知的任何方法，例如WO 97/24447中介绍的方法或Mahvi 等，Immunology and cell Biology 75：456-460，1997介绍的基因枪方法， 可以进行例如树突细胞的体内和离体转染。通过将树突细胞或祖细胞 与肿瘤多肽、DNA(裸DNA或在质粒载体内的DNA)或RNA一起孵 育；或者与表达抗原的重组细菌或病毒(例如痘苗病毒、禽痘病毒、腺 病毒或慢病毒属载体)一起孵育，可以达到树突细胞的抗原加载。在加 载前，可以将多肽与提供T细胞辅助的免疫配偶体(例如载体分子)共 价缀合。或者，树突细胞可以单独地或在所述多肽存在下用未缀合的 免疫配偶体脉冲处理。
在本发明药用组合物中可以使用本领域技术人员已知的任何合适 载体的情况下，载体类型通常随给药模式而变。本发明的组合物可以 配制用于任何合适的给药方式，包括例如局部、口服、鼻腔、粘膜、 静脉内、颅内、腹膜内、皮下和肌内给药。
供这类药用组合物使用的载体是生物相容的，并且也可是生物可 降解的。在某些实施方案中，所述制剂最好提供以相对恒定水平释放 有效成分。然而，在其它实施方案中，可能需要在给药后以更加快的 速率立即释放有效成分。采用已知技术配制这类组合物是在本领域技 术人员的知识范围内。可用于该方面的说明性载体包括聚丙交酯-乙交 酯共聚物、聚丙烯酸酯、胶乳、淀粉、纤维素、葡聚糖的微粒等。其 它说明性延迟释放的载体包括超分子生物载体，它包含不流动的亲水 核心(例如交联多糖或寡糖)以及任选的包含两亲化合物的外层(例如磷 脂)(参见例如，美国专利第5,151,254号和PCT申请WO 94/20078、 WO 94/23701和WO 96/06638)。在缓释制剂中所含的活性化合物的量 取决于植入部位、释放的速率和预期持续时间以及待治疗或预防的病 症性质。
在另一个说明性实施方案中，生物可降解的微球体(例如聚乳酸酯 聚乙醇酸酯)用作本发明组合物的载体。合适的生物可降解的微球体公 开于例如美国专利号4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128； 5,820,883；5,853,763；5,814,344，5,407,609和5,942,252。经修饰的乙 型肝炎核心蛋白载体系统，例如WO/99 40934和其中引用的参考文献 中描述的载体系统，也可用于许多应用中。另一说明性载体/传递系统 使用包含颗粒性蛋白复合物的载体，例如在美国专利第5,928,647号中 描述的载体，所述载体能够在宿主体内诱导I类限制的细胞毒性T淋 巴细胞应答。
本发明的药用组合物通常还包含一种或多种缓冲剂(例如中性缓 冲盐溶液或磷酸缓冲盐溶液)、糖类(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡 聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸(例如甘氨酸)、抗氧化剂、抑 菌剂、螯合剂(例如EDTA)或谷胱甘肽、佐剂(例如氢氧化铝)、使制剂 与受体的血液等渗、低渗或弱高渗的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐 剂。或者，本发明组合物可以配制为冻干制剂。
本文所述的药用组合物可以盛装在单位剂量容器或多剂量容器 (例如密封安瓿或管形瓶)中。这类容器通常的密封方式使得保持所述 制剂在使用之前的无菌和稳定性。一般而言，制剂可以作为油性或水 性溶媒中的混悬剂、溶液剂或乳剂保存。或者，药用组合物可以在冷 冻-干燥条件下保存，只需要在临用前加入无菌液体载体即可。
对于在各种各样的治疗方案中使用本文所述的特定组合物而言， 合适给药方案和治疗方案(包括例如口服、胃肠外、静脉内、鼻内和肌 内给药和所用制剂)的开发是本领域众所周知的，为了说明，下文将扼 要地论述其中的某些方案。
在某些应用中，可以将本文公开的药用组合物通过口服给药传递 至动物。因此，这些组合物可以与惰性稀释剂或与可吸收的食用载体 一起配制，或者它们可以包封在硬壳明胶胶囊或软壳明胶胶囊内，或 者它们可以挤压成片剂，或者它们可以直接掺入到膳食的食物中。
所述活性化合物甚至可能与赋形剂一起掺入，以可食用的片剂、 口含片、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂形式等使 用(参见，例如，Mathiowitz等，Nature 1997年3月27日；386(6623)：410-4； Hwang等，Crit Rev Tjer Drug Carrier Syst 1998；15(3)：243-84；美国专利 5,641,515；美国专利5,580,579和美国专利5,792,451)。片剂、锭剂、 丸剂、胶囊剂等也可以含有许多额外组分中的任一种，可以加入例如 粘合剂，例如西黄蓍胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，例 如磷酸二钙；崩解剂，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸等；润滑剂， 例如硬脂酸镁；和甜味剂，例如蔗糖、乳糖或糖精或者矫味剂，例如 薄荷、冬青油或樱挑矫味剂。当剂量单位形式为胶囊时，除上述类型 物质以外它还可以含有液体载体。各种其它物质可能作为包衣剂存 在，或者在其它方面改进剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或 胶囊剂可以用虫胶、糖或者同时用虫胶和糖包衣。当然，在制备任何 剂量单位形式中所用的任何材料都应该是药学纯的并且在所使用的量 内基本上是无毒的。另外，所述活性化合物可以掺入到缓释制剂中。
通常，这些制剂含有至少约0.1％活性化合物或更高剂量的活性化 合物，当然尽管有效成分的百分率可以变化，但是可能常规为总制剂 重量或体织的约1％或2％至约60％或70％或更高。当然，在可能制备 的每种治疗上有效的组合物中活性化合物的用量的方式使得以所述化 合物的任何给定单位剂量获得合适的剂量。在制备这种药用制剂时， 本领域技术人员会考虑诸如溶解性、生物利用度、生物半寿期、给药 途径、制品贮藏期的诸多因素以及其它药理学考虑，因此各种各样的 剂量和治疗方案可能都是理想的。
另一方面，对于口服给药，本发明的组合物可以在漱口药、洁牙 剂、口含片、口腔喷雾剂或舌下口服给药制剂形式中掺入一种或多种 赋形剂。或者，可以将所述有效成分掺入到口服溶液例如含有硼酸钠、 甘油和碳酸氢钠的口服溶液中，或者在洁牙剂中分散，或以治疗有效 量加入到可能包括水、粘合剂、磨擦剂、矫味剂、起泡剂和润湿剂的 组合物中。或者，所述组合物可以精加工成可以放入舌下或者在口腔 内溶解的片剂或溶液形式。
在某些情况下，理想的是胃肠外、静脉内、肌内、或者甚至腹膜 内给予本文公开的药用组合物。这样的方法是本领域技术人员熟知 的，其中某些方法进一步描述于例如美国专利5,543,158；美国专利 5,641,515和美国专利5,399,363。在某些实施方案中，在水中适当与表 面活性剂(例如羟丙基纤维素)混合，可以制备所述活性化合物作为游 离碱或药理学上可接受的盐的溶液。在甘油、液体聚乙二醇及其混合 物和在油中也可以制备分散剂。在通常的贮藏和使用条件下，这些制 剂一般含有防腐剂，以防止微生物的生长。
适合于注射用的说明性药物形成包括无菌的水溶液或分散剂和用 于临时制备无菌的注射液或分散液的无菌粉末(例如，参见美国专利 5,466,468)。在所有情况下，，所述形式必须是无菌的且在易于注射方 面必须是液体。在生产和贮藏的条件下它必须是稳定的且必须防止微 生物(例如细菌和真菌)的污染作用。所述载体可以是溶剂或含有例如 水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的适 宜混合物和/或植物油的分散介质。例如通过利用诸如卵磷脂的包衣 剂，在分散的情况下通过保持所需颗粒大小和/或利用表面活性剂，可 以保持适当的流动性。可以利用各种抗细菌剂或抗真菌药(例如，对羟 基苯甲酸酯类、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)防止微生物的 作用。在许多情况下，最好包括等渗剂，例如糖或氯化钠。注射组合 物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收的药剂，例如单硬脂 酸铝和明胶来实现。
在一个实施方案中，对于胃肠外给予水溶液，必要时所述溶液应 该进行适当缓冲，所述液体稀释剂首先用足量的盐水或葡萄糖使其等 渗。这些特定的水溶性尤其适合于静脉内、肌内、皮下和腹膜内给药。 在这一方面，根据本发明的公开内容，可以使用的无菌水性介质对于 本领域技术人员是已知的。例如，可以将一个剂量溶于1ml等渗氯化 钠溶液中，然后或者加入到1000ml皮下灌注用液体或者在建议的输 注部位注射(参见例如，“Remington’s Pharmaceutical Sciences”，第15 版，第1035-1038页和第1570-1580页)。根据待治疗的受治疗者的病 症，剂量的某些变化是必需的。此外，对于人类给药，当然制剂最好 符合无菌、无热原并且依照FDA Office of Biologics标准所要求的一般 性安全和纯度标准。
在本发明的另一个实施方案中，本文公开的组合物可以配制成中 性形式或盐形式。说明性的药学上可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质 的游离氨基生成的)，并且与诸如盐酸或磷酸的无机酸或者与诸如乙 酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等的有机酸生成的酸加成盐。与游离羧基 形成的盐也可衍生自无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、 氢氧化钙或氢氧化铁；和有机碱，例如异丙胺、三乙胺、组氨酸、普 鲁卡因等。在配制时，溶液给予的方式需与给药制剂相容，而给予的 剂量为治疗有效量。
所述载体还可以包含任何和所有的溶剂、分散介质、溶媒、包衣 剂、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌药、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲剂、 载体溶液、混悬剂、胶体等。供药用活性物质使用的这类介质和药剂 是本领域众所周知的。除在任何常规介质和药剂与有效成分不相容的 情况外，考虑其在治疗组合物中的应用。也可以将补充的有效成分掺 入到所述组合物中。短语“药学上可接受的”是指当给予人类时不产 生变态反应或相似的不想要的反应的分子实体和组合物。
在某些实施方案中，所述药用组合物可以通过鼻内喷雾、吸入和/ 或其它气雾剂传递载体来传递。将基因、核酸和肽组合物通过鼻气雾 剂喷雾直接给予肺部的方法描述于例如美国专利5,756,353和美国专 利5,804,212。同样，采用鼻内微粒树脂(Takenaga等，J Controlled Release 1998年3月2日；52(1-2)：81-7)和溶血磷脂酰甘油化合物(美国专利 5,725,871)给药也是制药领域众所周知的。同样，聚四氟乙烯支持体骨 架形式的说明性的经粘膜给药在美国专利5,780,045中有描述。
在某些实施方案，使用脂质体、纳米囊、微粒、脂质颗粒、小泡 等将本发明的组合物引入合适的宿主细胞/生物中。具体地说，本发明 的组合物可以配制成用于在脂质颗粒、脂质体、小泡、纳米球或纳米 粒子等中包囊传递。或者，本发明的组合物可以与这样的载体表面或 者共价结合或者非共价结合。
脂质体和脂质体样制剂作为潜在药物载体的制备和应用对于本领 域技术人员一般是已知的(参见例如，Lasic，Trends Biotechnol 1998年7 月；16(7)：307-21；Takakura，Nippon Rinsho 1998年3月；56(3)：691-5； Chandran等，Indian J Exp Biol.1997年8月；35(8)：801-9；Margalit，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1995；12(2-3)：233-61；美国专利5,567,434； 美国专利5,552,157；美国专利5,565,213；美国专利5,738,868和美国专 利5,795,587；每个文献具体地通过引用全部结合到本文中)。
脂质体已成功地与许多通常难以通过其它方法转染的细胞类型一 起使用，包括T细胞混悬剂、原代肝细胞培养物和PC 12细胞 (Renneisen等，J Biol Chem.1990年9月25日；265(27).16337-42；Muller 等，DNA Cell Biol.1990年4月；9(3)：221-9)。另外，脂质体没有基于病 毒给药系统中通常的DNA长度限制。脂质体已有效地用来将基因、各 种药物、放射治疗药、酶、病毒、转录因子、别构效应剂等导入各种 各样的培养细胞系和动物中。此外，看来脂质体的应用与系统给药后 自身免疫性应答或不可接受的毒性无关。
在某些实施方案中，脂质体由在水性介质中分散的磷脂形成并且 自动形成多层同心双层小泡(也称为多层脂质体(MLV))。
另一方面，在其它实施方案中，本发明提供本发明组合物的药学 上可接受的纳米囊制剂。纳米囊一般可以以稳定和可重现的方式包封 化合物(参见，例如，Quintanar-Guerrero等，Drug Dev Ind Pharm.1998 年12月；24(12)：1113-28)。为了避免由于胞内聚合物负荷过多引起的副 作用，这样的超微颗粒(大小约0.1μm)可以采用能够体内降解的聚合 物来设计。这样的颗粒可以按下述文献所述进行制备：例如Couvreur 等，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1988；5(1)：1-20；zur Muhlen等，Eur J Pharm Biopharm.1998年3月；45(2)：149-55；Zambaux等，J Controlled Release.1998年1月2日；50(1-3)：31-40；和美国专利5,145,684。
本发明也涉及得自本发明多核苷酸的引物形式的多核苷酸和特异 性针对本发明多肽的抗体或试剂形式的多肽作为诊断试剂的用途。
鉴定能够检测出癌发生途径中极早期变化的血液或组织中遗传标 记或生化标记，将有助于确定用于患者的最佳疗法。可以使用诸如多 核苷酸表达的替代肿瘤标记，诊断不同形式和病期的癌症。对本发明 多核苷酸表达水平的鉴定既可用于癌性疾病的病期分类，又可用于癌 性组织的性质分级。病期分类方法监测癌症的进展，并且根据在活组 织检查区内是否存在恶性肿瘤组织来确定。本发明的多核苷酸可以有 助于通过鉴定癌症攻击力的标记、例如在机体不同部位中的存在来完 善所述病期分类方法。癌症的分级描述肿瘤与其相同类型的正常组织 多么密切相似，并且通过其细胞形态和其它分化标记进行评价。本发 明的多核苷酸可用于确定肿瘤级别，因为它们可能有助于确定肿瘤细 胞的分化状态。
通过包括确定得自受治疗者样品中多肽或mRNA水平的异常减少 或增加在内的方法进行诊断，所述诊断分析提供一种用于诊断癌症、 自身免疫病和相关病症或确定对所述病症的易感性的方法。该诊断方 法称为差异表达。比较患病组织和正常组织中特定基因的表达。所比 较的这两种组织中所述多核苷酸相关基因、mRNA或蛋白之间的差 异，例如在分子量、氨基酸序列或核苷酸序列或相对丰度方面的差异， 表明在怀疑患病的人的组织中所述基因或调节它的基因的变化。
可以在RNA水平上测定表达的减少或增加。首先从这两种组织中 分离出PolyA RNA，然后由对应于差异表达的本发明多核苷酸的基因 编码的mRNA的检测可以通过以下方法进行检测：例如组织切片的原 位杂交、反转录酶-PCR、使用含PolyA+mRNA的RNA印迹或任何其 它直接或间接RNA检测方法。与正常组织相比给定RNA在患病组织 中表达的增加或减少，提示所述转录物和/或所表达的蛋白在所述疾病 中起作用。因此，检测出相对应于SEQ ID NO：1的mRNA水平比正常 水平高或低，表明所述患者患有癌症。
样品中的mRNA表达水平可以通过从所述样品产生已表达序列标 志(EST)的文库来确定。可以用EST在所述文库中的相对表现度，评 价所述基因转录物在原始样品中的相对表现度。然后可以将所述测试 的EST分析与参比样品的EST分析进行比较，从而测定感兴趣的多核 苷酸的相对表达水平。
可以采用基因表达的连续分析(SAGE)方法(Velculescu等，Science (1995)270：484)、差异展示法(例如，US 5,776,683)或依赖于核苷酸相 互作用专一性的杂交分析，进行其它mRNA分析。
另一方面，可以在蛋白质水平上进行比较。使用抗体检测来自所 述两种组织中的蛋白提取物的蛋白质印迹中的多肽，可以对两种组织 中的蛋白质大小进行比较。使用抗相应蛋白的抗体，还可以在免疫学 上检测表达水平和亚细胞定位。可以用来测定得自宿主的样品中的蛋 白质水平(例如本发明的多肽水平)的其它分析技术，对于本领域技术 人员而言是熟知的。在患病组织中多肽表达水平与正常组织中相同蛋 白表达水平相比升高或降低，表明所表达的蛋白可能与所述疾病有 关。
在本发明的测定中，通过检测由SEQ ID NO：1中所示的至少一种 序列编码的基因产物的表达水平，可以确定所述诊断。也可以用患病 组织与正常组织中的mRNA水平或蛋白质水平的比较，来跟踪疾病的 发展或缓解。
采用多核苷酸阵列，可以分析样品中的许多多核苷酸序列。这些 多核苷酸可以用来检测基因的差异表达，从而确定基因的功能。例如， 可以用多核苷酸序列SEQ ID NO：1的阵列来确定所述多核苷酸的任一 种是否在正常细胞和癌症细胞间有差异表达。在本发明的一个实施方 案中，可以构建一个包含SEQ ID NO：1核苷酸序列或其片段的寡核苷 酸探针的阵列，以进行例如遗传突变的有效筛选。阵列技术方法是众 所周知的并且具有普遍的可应用性，可以用来解决分子遗传学方面的 各种各样的问题，包括基因表达、遗传连锁和遗传变异性(参见例如： M.Chee等，Science，第274卷，第610-613页(1996))。
本文所用的“诊断”包括确定受治疗者对疾病的易感性、确定受 治疗者目前是否患有所述疾病，还可以对受所述疾病影响的受治疗者 作预后。
本发明还涉及用于进行诊断分析的诊断试剂盒，所述试剂盒包 括：
(a)一种本发明的多核苷酸或其片段，所述多核苷酸最好是SEQ ID NO：1的核苷酸序列；
(b)一种与(a)的核苷酸序列互补的核苷酸序列，最好是SEQ ID NO：6的核苷酸序列；
(c)一种本发明的多肽或其片段，所述多肽最好是SEQ ID NO：2 或SEQ ID NO：3的多肽；或
(d)一种抗本发明多肽的抗体，最好是抗SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3多肽的抗体。
对于染色体定位而言，本发明的核苷酸序列也是有价值的。所述 序列特异性地靶向人单个染色体上的特定位置，并且可以与其杂交。 按照本发明将有关序列作图至染色体上，在使那些序列与基因相关疾 病发生联系中是重要的第一步。一旦将序列作图至染色体上的精确位 置，就可以使所述序列在所述染色体上的物理位置与基因图谱数据相 联系。这样的数据可以在例如V.McKusick，Mendelian Inheritance in Man(可通过Johns Hopkins University Welch Medical Library在线得到) 中找到。然后通过连锁分析(物理上相邻的基因的共遗传)鉴定已作图 至同一染色体区的基因和疾病之间的关系。也可以确定受影响个体和 未受影响个体之间的cDNA序列或基因组序列中的差别。
本发明的多肽或其片段或其类似物、或表达它们的细胞还可以用 作免疫原，以产生抗本发明多肽的免疫专一性抗体。术语“免疫专一 性”是指所述抗体对本发明多肽的亲和性比它们对现有技术中其它相 关多肽的亲和性高得多。
再一方面，本发明提供如上文所限定的按照本发明多肽的免疫专 一性抗体或其免疫学片段。所述抗体最好是单克隆抗体。
采用常规方法，通过将所述多肽或携带表位的片段、类似物或细 胞给予动物、最好是非人类动物，可以获得针对本发明多肽产生的抗 体。为了制备单克隆抗体，可以使用提供由连续细胞系培养物生产的 抗体的任何技术。实例包括杂交瘤技术(Kohler，G.和Milstein，C.，Nature (1975)256：495-497)、trioma技术-人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等， Immunology Today(1983)4：72)和EBV杂交瘤技术(Cole等，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，77-96，Alan R.Liss，Inc.，1985)。
产生单链抗体的技术，例如在美国专利第4,946,778号中描述的技 术，可能也适用于产生抗本发明多肽的单链抗体。另外，可以用转基 因小鼠或其它生物(包括其它哺乳动物)表达人源化抗体。
可以使用上述抗体分离或鉴定表达所述多肽的克隆、或者通过亲 和层析纯化所述多肽。也可以使用本发明的抗体预防或治疗癌症、尤 其是结肠直肠癌、自身免疫病和相关病症。
本发明的另一方面涉及诱导或调节哺乳动物体内免疫应答的方 法，所述方法包括用足以产生抗体和/或T细胞免疫应答的本发明多肽 接种所述哺乳动物，以保护或改善所述疾病的症状或进程。本发明的 再一方面涉及诱导或调节哺乳动物体内免疫应答的方法，所述方法包 括通过在体内指导表达所述多核苷酸并编码所述多肽的载体传递本发 明的多肽，以便诱导产生抗体的这种免疫应答，从而保护所述动物免 患疾病。
因此人们会认识到，本发明提供治疗与CASB7439多肽活性的存 在、过量表达或表达不足有关的异常病症例如癌症和自身免疫病、尤 其是结肠直肠癌的方法。本发明试图治疗的其它与CASB7439表达有 关的异常病症是慢性淋巴细胞白血病和生殖细胞肿瘤。
本发明还提供筛选化合物以鉴定刺激或抑制CASB7439多肽功能 的那些化合物的方法。一般而言，对于上文所提到的这类疾病，为了 治疗和预防目的可以使用激动剂或拮抗剂。可以从各种来源例如细 胞、无细胞制备物、化学文库以及天然产物的混合物来鉴定化合物。 根据具体情况，如此鉴定的这类激动剂、拮抗剂或抑制剂可以是所述 多肽的天然或经修饰的底物、配体、受体、酶等，或者也可以是它们 的结构模拟物或功能模拟物(参见Coligan等，Current Protocols in Immunology 1(2)：第5章(1991))。筛选方法是本领域技术人员已知的。 其它筛选方法还可以在例如D.Bennett等，J Mol Recognition，8：52-58 (1995)；和K.Johanson等，J Mol Biol，270(16)：9459-9471(1995)以及其 中的参考文献中找到。
因此，本发明提供鉴定刺激或抑制本发明多肽功能的化合物的筛 选方法，所述方法包括一种选自以下的方法：
(a)利用直接或间接结合候选化合物的标记，测定所述候选化合物 与所述多肽(或与携带所述多肽的细胞或细胞膜)或与其融合蛋白的结 合；
(b)在标记竞争物的存在下，测定候选化合物与所述多肽(或与携 带所述多肽的细胞或细胞膜)或与其融合蛋白的结合；
(c)使用适合于携带所述多肽的细胞或细胞膜的检测系统，测试所 述候选化合物是否引起由于所述多肽的活化或抑制而产生的信号；
(d)将候选化合物与含权利要求1多肽的溶液混合，形成混合物， 然后测定所述混合物中所述多肽的活性，并且将所述混合物的活性与 标准品的活性进行比较；或
(e)采用例如ELISA测定，检测候选化合物对在细胞中编码所述 多肽的mRNA和所述多肽的产生的影响。
通过本领域已知的标准受体结合技术，本发明的多肽还可用来鉴 定膜结合受体或可溶性受体(如果有的话)。还可以用众所周知的筛选 方法鉴定与本发明多肽竞争与其受体结合的本发明多肽的激动剂和拮 抗剂(如果有的话)。
因此，另一方面，本发明涉及用于鉴定本发明多肽的激动剂、拮 抗剂、配体、受体、底物、酶等；或者减少或增加这类多肽产生的化 合物的筛选试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)一种本发明的多肽；
(b)一种表达本发明多肽的重组细胞；
(c)一种表达本发明多肽的细胞膜；或
(d)抗本发明多肽的抗体；
所述多肽最好是SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3的多肽。
本领域技术人员会容易地认识到，本发明的多肽还可以用于基于 结构设计所述多肽的激动剂、拮抗剂或抑制剂的方法中，使用方法包 括：
(a)首先确定所述多肽的三维结构；
(b)推导激动剂、拮抗剂或抑制剂可能的活性部位或结合部位的 三维结构；
(c)合成预测与推导的结合部位或活性部位结合或反应的候选化 合物；和
(d)测试所述候选化合物是否是真正的激动剂、拮抗剂或抑制 剂。
还可以使用基因治疗实现由受治疗者体内的有关细胞内源性产生 CASB7439多肽。有关基因治疗的综述，参见Human Molecular Genetics， 第20章，基因治疗和其它基于分子遗传学的治疗方法(Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches)，T Strachan 和A P Read，BIOS Scientific Publishers Ltd(1996)(和其中引用的参考文 献)。
在Pharmaceutical Biotechnology，第61卷，疫苗设计一亚单位和佐 剂方法(Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach)，Powell和 Newman编著，Plenurn Press，1995。New Trends and Developments in Vaccines，Voller等编著，University Park Press，Baltimore，Maryand， U.S.A.1978中全面描述了疫苗制剂。用脂质体包封描述于例如 Fullerton的美国专利4,235,877。蛋白质与大分子缀合公开于例如 Likhite的美国专利4,372,945和Armor等的美国专利4,474,757。
每种疫苗剂量中的蛋白质量选定为在典型的疫苗中诱导免疫保护 性应答而无明显毒副作用的量。这样的量随所使用的特定免疫原而变 化。一般而言，预期每个剂量包含1-1000μg蛋白、优选2-100μg蛋白、 最优选4-40μg蛋白。通过包括观察受治疗者体内抗体效价和其它反应 的标准研究，可以确定特定疫苗的最佳量。初次疫苗接种后，受治疗 者还可以在大约4周内接受一次加强接种。
“分离的”是指从天然状态“人为”改变的。如果一种“分离的” 组合物或物质在自然界中存在，那么它的原始环境已改变或从其原始 环境中取出、或两者兼而有之。作为本文使用的此术语，例如在活的 动物中天然存在的多核苷酸或多肽并不是“分离的”，但与其天然状态 共存的物质分开的所述相同多核苷酸或多肽是“分离的”。
“多核苷酸”一般是指任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸， 它们可以是包括单链区和双链区的未修饰的RNA或DNA或者经修饰 的RNA或DNA。
“变异体”是指与参比多核苷酸或多肽不同的但保留基本特性的 多核苷酸或多肽。典型多核苷酸变异体在核苷酸序列上与另一参比多 核苷酸不同。所述变异体核苷酸序列的变化可能改变或不改变参比多 核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下文所论述，核苷酸的改变可能 导致参比序列编码的多肽的氨酸取代、添加、缺失、融合和截短。典 型的多肽变异体在氨基酸序列上与另一参比多肽不同。一般而言，差 异是有限的，致使参比多肽和变异体的序列在总体上非常相似并在许 多区是相同的。变异体和参比多肽可能由于任何组合的一个或多个取 代、添加、缺失而氨基酸序列不同。取代或插入的氨基酸残基可以是 或不是由遗传密码编码的氨基酸残基。多核苷酸或多肽的变异体可以 是天然存在的变异体如等位基因变异体，或者所述变异体可以是已知 非天然存在的变异体。可以通过诱变技术或通过直接合成，制备多核 苷酸和多肽的非天然存在的变异体。
“同一性”正如本领域所知的，是指通过比较序列而确定的两种 或两种以上多肽序列、或两种或两种以上多核苷酸序列之间的关系。 在本领域中，根据具体情况，“同一性”也指根据多肽或多核苷酸序列 的字符串之间的匹配而确定的多肽或多核苷酸序列之间的序列相关性 程度。采用已知方法可以容易地计算出“同一性”和“相似性”，所述 方法包括但不限于以下文献中描述的方法：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.编著，Oxford University Press，New York，1988； Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Smith，D.W.编著， Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data， 第I部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编著，Humana Press，New Jersey， 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.编 著，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.和Lipman，D.， SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)。设计测定同一性的优选方法用 以给出所测试序列之间的最大匹配。测定同一性和相似性的方法已编 纂成公众可得到的计算机程序。用于测定两个序列之间的同一性和相 似性的优选计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等， Nucleic Acids Research 12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA (Atschul，S.F.等，J.Molec.Biol.215：403-410(1990))。公众可从NCBI和 其它来源得到BLAST X程序(BLAST Manual，Altschul，S.等，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；Atschul，S.等，J.Mol.Biol.215：403-410 (1990))。也可以使用众所周知的Smith Waterman算法测定同一性。
所用的优选算法是FASTA。运用该算法进行多肽或多核苷酸序列 比较的优选参数包括以下参数：
Gap Penalty(空位罚分)：12
Gap extension penalty(空位拓展罚分)：4
Word size(字串大小)：2，最大为6
用其它方法比较多肽序列的优选参数包括以下参数：
1)算法：Needleman和Wunsch，J.Mol Biol.48：443-453(1970)
Comparison matrix(比较矩阵)：Hentikoff和Hentikoff的 BLOSSUM62，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：10915-10919(1992)
Gap Penalty：12
Gap Length penalty(空位长度罚分)：4
可使用这些参数的程序为“gap”程序，公众可从Genetics Computer Group，Madison WI获得。上面所提到的参数是进行多肽比较的缺省参 数(同时对末端空位没有罚分)。
用于多核苷酸比较的优选参数包括以下参数：
1)算法：Needleman和Wunsch，J.Mol Biol.48：443-453(1970) Comparison matrix：matches(匹配)＝+10，mismatch(错配)＝0 Gap Penalty：50
Gap Length penalty：3
可使用这些参数的程序为“gap”程序，公众可从Genetics Computer Group，Madison WI获得。上面所提到的参数是进行多核苷酸比较的缺 省参数。
作为实例，本发明的多核苷酸序列可与SEQ ID NO：1的参比序列 相同，也就是100％相同，或者它可以包括与所述参比序列相比，多至 某一整数的核苷酸改变。这样的改变选自至少一个核苷酸缺失、取代 (包括碱基转换和碱基颠换)或插入，并且其中所述改变可以发生在所 述对比核苷酸序列的5’或3’末端位置或这两个末端位置间的任何地 方，或者各自单独散置于参比序列的核苷酸中，或者散置于参比序列 的一个或多个连续组中。核苷酸改变的数目如下确定：SEQ ID NO：1 核苷酸总数乘以相应的同一性百分率的数值百分率(除以100)，随后从 所述SEQ ID NO：1核苷酸总数减去该乘积，或
                nn≤xn-(xn·y)，
其中nn是核苷酸改变的数目，xn是SEQ ID NO：1核苷酸总数，y 例如是0.70(70％)、0.80(80％)、0.85(85％)、0.90(90％)、0.95(95％) 等，并且其中将xn和y的任何非整数乘积从xn减去之前，将该乘积舍 入到最近的整数。编码SEQ ID NO：2多肽的多核苷酸序列的改变可能 在该编码序列中产生无义、错义或移码突变，从而在这样的改变后改 变由所述多核苷酸编码的多肽。
同样，本发明的多肽序列可与SEQ ID NO：2的参比序列相同，也 就是100％相同，或者它可以包括与所述参比序列相比，多至某一整数 的氨基酸改变，以致同一性百分率小于100％。这样的改变选自至少一 个氨基酸缺失、取代(包括保守取代和非保守取代)或插入，并且其中 所述改变可以发生在所述参比多肽序列的氨基末端或羧基末端位置或 这两个末端位置间的任何地方，或者各自单独散置于参比序列的氨基 酸中，或者散置于参比序列的一个或多个连续组中。对于特定的同一 性百分率如下确定所述氨基酸改变的数目：SEQ ID NO：2氨基酸总数 乘以相应的同一性百分率的数值百分率(除以100)，随后从所述SEQ ID NO：2氨基酸总数减去该乘积，或
                 na≤xa-(xa·y)，
其中na是氨基酸改变的数目，xa是SEQ ID NO：2氨基酸总数，y 例如是0.70(70％)、0.80(80％)、0.85(85％)等，并且其中将xa和y的 任何非整数乘积从xa减去之前，将该乘积舍入到最近的整数。
“同系物”是本领域所用的一个类别的术语，是指具有与主题序 列高度序列相关性的多核苷酸序列或多肽序列。这样的相关性可以通 过确定如上所述的所比较序列之间的同一性程度和/或相似性程度而 定量。属于该类别术语范围内的是术语“直向同源物”和共生同源物”， “直向同源物”是指作为一种多核苷酸或多肽在另一物种中的功能等 同物的多核苷酸或多肽，而“共生同源物”是指在同一物种内被认为 功能上相似的序列。
附图说明
图1：显示采用Taqman探针的实时PCR数据。所述说明如下： 肾上腺：Ad_Gl；膀胱：Bl；骨髓：Bo_Ma；宫颈：Ce；结肠：Co； 输卵管：Fa_Tu；回肠：Il；肝：Li；肺：Lu；淋巴结：Ly_No；食管： Oe；甲状旁腺：Pa_Thy；胎盘：Pl；前列腺：Pr；直肠：Re；皮肤： Sk；骨骼肌：Sk_Mu；小肠：Sm_In；脾：Sp；睾丸：Te；甲状腺： Thy；气管：Tr。
图2显示采用Sybr方案的实时PCR表达。所述说明如下：肾上 腺：Ad_Gl；膀胱：Bl；骨髓：Bo_Ma；宫颈：Ce；结肠：Co；淋巴 结：Ly_No；食管：Oe；甲状旁腺：Pa_Thy；胎盘：Pl；前列腺：Pr； 直肠：Re；皮肤：Sk；骨骼肌：Sk_Mu；小肠：Sm_In；脾：Sp；睾 丸：Te；甲状腺：Thy；气管：Yr；心脏：He。
图3显示得自表达CASB7439的菌株的细胞提取物的孝马斯蓝染 色的SDS PAGE。泳道1显示分子量标准参照物，泳道2显示于39℃ 诱导5小时的细胞提取物；泳道3显示所诱导的细胞提取物的上清液； 泳道4显示所诱导的细胞提取物的沉淀。
图4显示NS1-CASB7439表达蛋白的蛋白质印迹分析。将表达 CASB7439的菌株的细胞提取物加样至该凝胶，并且用抗NS1单克隆 抗体揭示。
图5显示CASB7439在纯化后的考马斯蓝染色的SDS-PAGE。泳 道1和泳道5代表分子量标准参照物；泳道2、3、4分别加入2μl、4μl 和6μl纯化蛋白。
图6显示根据抗多聚组氨酸单克隆抗体揭示的CASB7439在纯化 后的蛋白质印迹。
实施例
实施例1
实时RT-PCR分析
使用实时RT-PCR(U.Gibson.1996.Genome Research：6，996)比较 来自多个患者的配对的肿瘤结肠组织和正常结肠组织中候选抗原的 mRNA转录物的丰度。另外，通过该方法评价一组正常组织中所述候 选基因的mRNA水平。
使用TriPure试剂(Boehringer)，从速冻活检组织中提取正常结肠和 肿瘤结肠的总RNA。正常组织的总RNA购自InVitrogen或者使用 TriPure试剂从速冻活检组织中提取。使用寡脱氧胸苷酸磁珠(Dynal)， 从经DNA酶处理后的总RNA中纯化Poly-A+mRNA。使用SybrII染 料(Molecular Probes)，通过分光荧光测定法(VersaFluor，BioRad)进行 mRNA的定量。采用TaqMan扩增条件的缺省选项，用Perkin-Elmer Primer Express软件设计用于实时PCR扩增的引物。
每次反应使用2ng纯化mRNA，按照标准PCR方法进行实时反 应。为了实时检测，以终稀释度1/75000加入SybrI染料(Molecular Probes)。采用常规仪器设定值，在Perkin-Elmer Biosystems PE7700系 统中进行扩增(40个循环)和实时检测。使用PE7700Sequence Detector 软件计算Ct值。对于每个样品得到若干个Ct值：对于患者样品，候 选TAA上的肿瘤Ct(CtT)值和配对的正常结肠Ct(CtN)值，而对于该 组正常组织样品，每个正常组织XY的CtXY。对于所有样品也计算肌 动蛋白基因的另一Ct(CtA)，作为所有样品的内部参照物。另一方面， 可以采用Taqman探针监测实时PCR扩增。采用常规仪器设定值，在 Perkin-Elmer Biosystems PE7700系统中进行扩增(40个循环)和实时检 测。使用PE7700 Sequence Detector软件计算Ct值。从每个组织样品 获得靶mRNA(CtX)和肌动蛋白mRNA(CtA)的Ct值。
因为在普通实验条件下的PCR扩增效率接近于理论扩增效率，所 以2(CtN/T/XY-CtA)值是所述样品的相对TAA转录水平的估计值，即相对 于肌动蛋白转录水平进行标准化的值。因此，数值为1表示候选抗原 和肌动蛋白的表达水平相同。
首先对来自12个患者的活检组织的肿瘤结肠和配对的正常结肠 进行实时PCR反应。然后在总共18个患者的更全面的数据集上进行 反应(前12个患者的数据集包括在内)。在该数据集中这18个患者中的 6个患者的数据以复份制成。还测试了其它6个患者，结果与前18个 患者的数据合并。对最终合并值进行的统计学分析结果示于表3中， 并且在图1中加以说明。
也依照相同方法测试代表29种不同组织的一系列48个正常组织 样品(所分析的正常组织示于表3中)。如上所述计算TAA转录水平。 也根据该数据集计算出过量表达候选抗原的患者的比例以及相对于正 常组织的转录物过量表达平均值。结果示于图1中。
表1：CASB7439实时PCR表达结果：12个患者的数据集   mRNA水平在配对的肿瘤结肠中较高的患者百分率(阳性患   者)   92％   mRNA水平在配对的肿瘤结肠中至少高3倍的患者百分率   92％   mRNA水平在配对的肿瘤结肠中至少高10倍的患者百分率   92％   mRNA水平在配对的肿瘤结肠中至少低3倍的患者百分率   8％   配对的正常结肠mRNA水平平均值(用肌动蛋白标准化)   0.0026   在阳性患者中配对的正常结肠mRNA水平平均值(用肌动蛋   白标准化)   0.265   mRNA过量表达倍数平均值   2028   mRNA过量表达倍数中值   115   正常组织mRNA水平平均值   0.0079   正常组织mRNA水平中值   0.0016   正常组织mRNA水平平均值   0.0064   正常组织mRNA水平中值   0.0017   mRNA水平比正常组织平均值高的患者百分率   92％   mRNA水平比正常组织平均值高10倍的患者百分率   75％   比正常组织的mRNA水平中值高的必需(non-dispensable)正   常组织   无
表2：CASB7439实时PCR表达结果：18个患者的数据集  mRNA水平在配对的肿瘤结肠中较高的患者百分率(阳性患  者)   89％  mRNA水平在配对的肿瘤结肠中至少高3倍的患者百分率   89％  mRNA水平在配对的肿瘤结肠中至少高10倍的患者百分率   78％  mRNA水平在配对的肿瘤结肠中至少低3倍的患者百分率   5％  配对的正常结肠mRNA水平平均值(用肌动蛋白标准化)   0.005  在阳性患者中配对的正常结肠mRNA水平平均值(用肌动蛋  白标准化)   0.152  mRNA过量表达倍数平均值   1100  mRNA过量表达倍数中值   60  正常组织mRNA水平平均值   0.0065  正常组织mRNA水平中值   0.0015  正常组织mRNA水平平均值   0.005  正常组织mRNA水平中值   0.0015  mRNA水平比正常组织平均值高的患者百分率   94％  mRNA水平比正常组织平均值高10倍的患者百分率   94％  比正常组织的mRNA水平中值高的必需正常组织   无
表3：CASB7439实时PCR表达结果：24个患者的数据集   CASB7439转录物水平在肿瘤结肠中比在相邻的正常结肠   中高的患者百分率(阳性患者)   92％   CASB7439转录物水平在肿瘤结肠中比在相邻的正常结肠   中至少高10倍的阳性患者百分率   75％   在阳性患者的肿瘤结肠中转录物过量表达倍数平均值   1289   CASB7439转录物水平在肿瘤结肠中比正常组织平均值高   的患者百分率   96％   mRNA水平在肿瘤结肠中比正常组织平均值至少高10倍   的患者百分率   62.5％   其中CASB7439转录物表达等于肿瘤中的肿瘤转录物水平   的正常组织   无
也采用Taqman方法(如上所述)，对来自6个患者活检组织的肿瘤 结肠和相邻的正常结肠进行实时PCR反应。对于每个样品采用三个复 份测定，用平均值进行进一步的计算。结果示于图1中。此外，也依 照相同方法测试代表28种不同组织的36个正常组织样品(参见表5)。 结果示于图2中。
表4：采用Taqman探针的CASB7439实时PCR表达结果   来自不同患者的肿瘤样品数   6   CASB7439转录物水平在肿瘤结肠中比相邻的正常结肠高   的患者百分率(阳性患者)   100％   CASB7439转录物水平在肿瘤结肠中比相邻的正常结肠至   少高10倍的阳性患者百分率   83％   在阳性患者的肿瘤中转录物过量表达倍数平均值   109   CASB7439转录物水平在肿瘤结肠中比正常组织平均值高   的患者百分率   100％   mRNA水平在肿瘤结肠中比正常组织平均值至少高10倍   的患者百分率   100％   其中CASB7439转录物表达等于肿瘤中的肿瘤转录物水平   的正常组织   无
结果清楚地表明，与相邻的正常结肠和所有的上述正常组织相 比，CASB7439转录物在结肠直肠肿瘤中过量表达。与相邻的正常结 肠相比，90％以上的所述患者的肿瘤中CASB7439转录物强过量表 达。所述肿瘤中的平均过量表达倍数至少为100。此外，与其它正常 组织相比，90％以上的所述患者的结肠肿瘤中CASB7439转录物过量 表达，其中过量表达CASB7439转录物的所述患者中的60％以上的过 量表达倍数为至少10倍。
表5：用于CASB7439转录物表达分析的正常组织一览表   组织   缩写   肾上腺   Ad_Gl   主动脉   Ao   膀胱   Bl   骨髓   Bo_Ma   脑   Bra   宫颈   Ce   结肠   Co   输卵管   Fa_Tu   心脏   He   回肠   Il   肾   Ki   肝   Li   肺   Lu   淋巴结   Ly_No   食管   Oe   甲状旁腺   Pa_Thy   直肠   Re   皮肤   Sk   骨骼肌   Sk_Mu   小肠   Sm_In   脾   Sp   胃   St   甲状腺   Thy   气管   Tra   卵巢   Ov   胎盘   Pl   前列腺   Pr   睾丸   Te
实施例2
cDNA阵列的示差筛选
通过示差筛选完成对扣除cDNA文库中的肿瘤相关基因的鉴定。
从100μl过夜培养物中提取细菌总DNA。用异硫氰酸胍裂解细 菌，使用磁性玻璃(Boehringer)对细菌DNA进行亲和纯化。通过 Advantage PCR扩增(Clontech)从细菌DNA回收质粒插入片段。采用 Biomek 96 HDRT工具(Beekman)，将PCR产物点样至两个尼龙膜上， 产生高密度cDNA阵列。斑点状cDNA经UV照射与膜共价结合。将 第一张膜与从单个患者的肿瘤制备的混合cDNA探针杂交。将第二张 膜与等量的从相同患者的正常结肠制备的混合cDNA探针杂交。如上 所述通过PCR扩增制备探针cDNA，并且采用AlkPhos Direct System (Amersham)将其标记。杂交条件和严格洗涤如AlkPhos Direct试剂盒所 述。杂交探针用化学发光进行检测。通过薄膜光密度测定法或直接测 定法(BioRad Fluor-S Max)测定两个印迹上的每种cDNA片段的杂交强 度。计算每个基因的肿瘤杂交强度与正常杂交强度的比率(T/N)，以评 价肿瘤中的过量表达程度。对在结肠肿瘤中显著过量表达的基因进行 跟踪研究。显著性任意地定义为T/N频率分布的一个标准偏差。采用 来自多个患者供体(＞18)的RNA，重复示差筛选实验，以估计在该患 者群体中过量表达的肿瘤的频率。另外，将DNA阵列与来自除结肠以 外的正常组织(参见上文一览表)的混合cDNA探针杂交，以测定所述 候选基因在这些组织中的表达水平。
实施例3
DNA微阵列
用DNA微阵列检测多个样品中基因大集合物的mRNA表达分布 型。用该信息补充通过实时PCR获得的数据，并且提供在肿瘤组织和 正常组织中基因表达水平的独立测量。
目前用于产生DNA微阵列的技术的实例包括1)Affymetrix “GeneChip”阵列，其中采用光刻法通过固相化学合成在所述芯片的表 面合成寡核苷酸，2)DNA点样(spotting)技术，其中由机器人将小体积 DNA溶液沉积到固相(例如玻璃)的表面，然后将其固定化。在这两种 情况下，将所述芯片与从目标组织(例如正常组织、肿瘤等……)提取 并且用放射性或者用荧光报道分子标记的cDNA或cRNA杂交。使标 记材料与所述芯片杂交，然后使用特殊扫描仪，测定与所述芯片上每 一序列结合的探针量。所述实验可以用单一荧光报道分子(或放射性) 建立，或者可以用两种荧光报道分子进行。在后一种情况下，所述两 个样品中的每个用其中一种报道分子标记。然后将这两个已标记的样 品与所述DNA芯片上的序列竞争性杂交。确定所述芯片上每一序列的 两种荧光信号的比例。用该比例计算所述两个样品中所述转录物的相 对丰度。详细方案可得自许多来源，包括“DNA微阵列：一种实用方 法(DNA Microarrays：A practical approach)。Schena M.Oxford Universty Press1999”和万维网 (http：//cmgm.stanford.edu/pbrown/protocols/index.html)， http：//arrayit.com/DNA-Microarray-Protocols/)和许多专业销售商(例如 Affymetrix)。
实施例5
RNA-DNA印迹分析
通过Advantage PCR(参见上文)扩增有限量的混合的肿瘤结肠 cDNA和配对的正常结肠cDNA。也使用相同方法扩增来自多个正常 组织的信使RNA。将所扩增的cDNA(1μg)在1.2％琼脂糖凝胶上电 泳，然后转移至尼龙膜上。将所述膜与用候选TAA cDNA片段制备的 探针杂交(AlkPhos Direct System)。RNA-DNA印迹分析提供有关肿瘤 组织和正常组织中转录物大小、是否存在剪接变异体以及转录物丰度 的信息。
实施例6
RNA印迹分析
按照标准方法使用1μg poly A+mRNA产生RNA印迹。采用 Ready-to-Go系统(Pharmacia)制备放射性探针。
实施例7
全长cDNA序列的实验鉴定
采用Lambda ZapII系统(Stratagene)从5μg poly A+mRNA构建结 肠肿瘤cDNA文库。采用所提供的方案，只是使用SuperscriptII(Life Technologies)进行反转录步骤。构建寡聚dT引物文库和随机引物文 库。对于文库的每次筛选，平板接种约1.5×106个独立噬菌体。将噬 斑转移至尼龙滤膜上，并且采用用AlkPhos Direct标记的cDNA探针 杂交。通过化学发光检测阳性噬菌体。将阳性噬菌体从琼脂板上切下， 在500μl SM缓冲液中洗脱，通过基因特异性PCR进行证实。通过体 内移除将洗脱的噬菌体转变成单链M13噬菌体。然后通过大肠杆菌的 感染，将所述噬菌体转变成双链质粒DNA。将受感染细菌平板接种， 然后用所述cDNA探针进行第二轮筛选。从阳性细菌克隆纯化出质粒 DNA，然后对两条链测序。
当全长基因不能直接从cDNA文库中获得时，采用RACE技术 (Marathon Kit，ClonTech)分离丢失序列。该方法依赖于将mRNA反转 录成双链cDNA，将接头与cDNA的两个末端连接，采用基因特异性 引物和接头寡核苷酸的特异性引物扩增cDNA的所需端。将Marathon PCR产物克隆到质粒(pCRII-TOPO，InVitrogen)中，然后测序。
使用该方法获得SEQ ID NO：1的多核苷酸。
实施例8.
EST分布型
实验抗原组织表达表征的一种互补方法是搜索人EST数据库。 EST(“已表达序列标志”)是从特定组织或细胞系提取的mRNA集合 物制备的cDNA的小片段。目前这样的数据库提供来自数千种cDNA 组织文库(包括来自各种类型和病期的疾病的肿瘤组织)的大量的人 EST(2 106)。借助于信息工具(Blast)，进行CASB7439序列的比较搜 索，以便更加深入地了解组织表达。
CASB7439的EST分布   EST GenBank   登记号   EST cDNA组织文库   C00634   成人(K.Okubo)   AA468668   NCI_CGAP_Co3   AA565752   NCI_CGAP_Co11   AA565766   NCI_CGAP_Co11   AA565767   NCI_CGAP_Co11   AI337239   NCI_CGAP_Co16   AI337448   NCI_CGAP_Co16   AI393930   NCI_CGAP_CLL1   AI473673   NCI_CGAP_Co14   AI632444   NCI_CGAP_GC6   AI861937   NCI_CGAP_Co16   AI825214   NCI_CGAP_GC6   AW080652   NCI_CGAP_Co19   AW083899   NCI_CGAP_Co19   AW206058   NCI_CGAP_Sub3   AW237006   NCI_CGAP_GC6   AW364626   DT0036   AW449612   NCI_CGAP_Sub5
这些EST与CASB7439完美匹配。该表包括9个来自4个不同肿 瘤结肠文库的EST、1个来自1个正常结肠文库的EST、3个来自1个 肿瘤生殖细胞文库的EST、1个来自1个慢性淋巴细胞白血病细胞文 库的EST、2个来自2个混合肿瘤文库的EST、2个来自未知类型文库 的EST。这清楚地表明，同预期的一样，与正常组织相比，CASB7439 在肿瘤组织中过量表达，尤其是在结肠直肠肿瘤组织中过量表达。
实施例9：
9.1肿瘤特异性抗原的表达和纯化
采用在微生物宿主中表达或者在体外转录/翻译，产生用于疫苗目 的本发明抗原以及产生蛋白片段或完整蛋白，用于快速纯化以及产生 通过免疫组织化学法鉴定天然已表达蛋白或者纯化跟踪所需的抗体。
可以在两种微生物宿主-大肠杆菌和酵母(例如酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiar)或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))中表达 重组蛋白。这允许选择具有最佳特征的表达系统，以供生产该特定抗 原。一般而言，让重组抗原在大肠杆菌中表达，而让试剂蛋白在酵母 中表达。
表达策略首先包括设计重组抗原的一级结构。一般将表达融合配 偶体(EFP)置于N末端，以提高表达水平，所述表达融合配偶体也可以 包括一个可用于调节所述抗原免疫原性特性的区域一免疫融合配偶体 (IFP)。另外，在C-末端包括可用于有助于进一步纯化的亲和融合配偶 体(AFP)。
如上所述，可以对若干个构建体进行比较评价：
对于快速表达和纯化以及产生针对CASB7439的抗体，建议在大 肠杆菌中产生具有NS1作为EFP和组氨酸尾作为AFP的全长 CASB7439蛋白。
因此，提出两种构建体：
构建体1：与NS1 cDNA(作为EFP)以及组氨酸尾编码cDNA(作 为AFP)融合的全长野生型CASB7439 cDNA(SEQ ID NO：8)。所编码的 融合蛋白序列为SEQ ID NO：10。
构建体2：与NS1 cDNA(作为EFP)以及组氨酸尾编码cDNA(作 为AFP)融合的全长突变型CASB7439 cDNA(SEQ ID NO：9)。建议在该 构建体中具有被大肠杆菌密码子选择特异性的密码子取代天然 CASB7439cDNA的前50个密码子，以增强CASB7439在其大肠杆菌 宿主中的表达潜力。所编码的融合蛋白序列为SEQ ID NO：10。
所述CASB7439蛋白设计如下所示：

“NS1”是流感病毒蛋白NS1的N-端片段(80个氨基酸)。“HIS”是多聚组 氨酸尾。
所用的重组菌株是AR58：衍生于N99和cI857的隐蔽性λ溶原体， N99是gal E∷Tn 10，Δ-8(chlD-pgl，Δ-H1(cro-chlA)，N+ (Proc.Natl.Acad.Sci.USA第82卷，第88-92页，1985年1月 Biochemistry)。
当重组菌株可得到时，通过评价表达水平并且通过分析粗提物的 行为进一步预测所述蛋白的溶解度来表征重组产物。
在合适培养基上生长并且诱导重组蛋白表达后，通过SDS-PAGE 分析总提取物。使重组蛋白在染色凝胶上显现，然且使用特异性抗体 通过蛋白质印迹分析进行鉴定。
质粒：
名称：TCM 281           pRIT..15143
复制子：pMB1
选择：Kan
启动子：PL long
插入片段：NS1-C74-39-His 用构建体1表达重组蛋白：
让细菌在LB培养基+50μg/ml Kan中于30℃生长
当培养物达到OD＝0.5(620nm)时，将培养物加热到至多39℃，
诱导5小时后，收获细胞
提取物的制备：
细胞浓度：    .50X..在缓冲液PBS+完全…中
破碎：        弗氏压碎器3X
离心：        于14000t 30分钟
备注：        在细胞提取物的上清液中＞90％
将细胞提取物在12.5％SDS PAGE上电泳，随后用考马斯蓝染 色。也使用市售的针对多聚组氨酸尾的单克隆抗体(Quiagen)进行蛋白 质印迹分析。所得凝胶(图3和图4)显示该蛋白被表达，并且在细胞提 取物上清液中显现。
纯化方案采用基于重组蛋白中组氨酸亲和性尾存在的经典方法。 在一个典型实验中，过滤破碎的细菌，然后将无细胞提取物加样到特 异性地保留所述重组蛋白的离子金属亲和层析柱(IMAC；Ni++NTA，得 自Qiagen)上。在磷酸盐缓冲液中，用0-500mM咪唑梯度(可能在去垢 剂存在下)洗脱所述保留的蛋白。
将得自收获培养物的上清液在6M尿素、100mM NaH2PO4、10mM Tris、pH8中变性，然后在以下条件下上样到层析柱IMAC Qiagen NTA Ni++：
平衡缓冲液：NaH2PO4          100mM            pH8
            Tris                10mM
            尿素                6M
样品：尿素6M、100mM NaH2PO4、10mM Tris中的上清液
洗涤缓冲液：    1)NaH2PO4    100mM          pH8
                Tris            10mM
                尿素            6M
                咪唑            25mM
                2)NaH2PO4    100mM          pH8
                Tris            10mM
                尿素            6mM
                咪唑            50mM
洗脱缓冲液：    NaH2PO4      100mM          pH5.5
                Tris            10mM
                尿素            6M
                咪唑            500mM
在500mM咪唑+6M尿素中的洗脱蛋白在以下条件下透析：
-PBS PH 7.2+sarkosyl 0.5％+4M尿素
-同前，于2M尿素2小时
-同前，于0M尿素2小时
将最终的物质冷冻保存。蛋白质含量采用Lowry蛋白测定来定量 (0.9mg/1.2ml)。通过用考马斯蓝染色的12.5％PAGE SDS评价纯度(图 5)，通过蛋白质印迹、采用抗多聚组氨酸单克隆抗体检查重组蛋白的 存在(图6)。
对不同形式的所表达抗原的比较评价，将使得能够选择出最有前 途的候选物，然后将其用于进一步纯化和免疫学评价。
9.2抗体的产生和免疫组织化学
可以用少量相对纯化的蛋白产生免疫学工具，以便
a)在正常或癌症组织切片中通过免疫组织化学检测所述表达；
b)检测所述表达，并且在纯化过程期间跟踪所述蛋白(ELISA/蛋 白质印迹)；或
c)鉴定/定量所述纯化蛋白(ELISA)。
9.2.1多克隆抗体：
免疫
兔子用100μg配制在佐剂3D-MPL/QS21中的蛋白以3周间隔肌 内(I.M.)免疫3次。每次免疫后3周，抽取血样，然后使用所述蛋白作 为包被抗原，根据标准方法，通过ELISA，估计所述血清中的抗体效 价。
ELISA
将96孔微量培养板(maxisorb Nunc)用5μg蛋白于4℃包被过夜。 用1％PBS NCS 1％于37℃饱和1小时后，于37℃加入连续稀释的兔 血清(起始于1/10)达1小时30分钟。用PBS吐温洗涤3次后，加入抗 兔生物素化抗血清(Amersham)(1/5000)。洗涤培养板，然后于37℃加 入过氧化物酶偶联链霉抗生物素蛋白(1/5000)达30分钟。洗涤后，加 入50μl TMB(BioRad)达7分钟，然后用0.2M H2SO4终止反应。可以 在450nm测定OD，并且用SoffmaxPro计算中点稀释度。
9.2.2单克隆抗体
免疫
用5μg纯化蛋白对5只BALB/c小鼠以3周间隔免疫3次。第2 次免疫后14天以及第3次免疫后1周进行放血。用纯化蛋白作包被抗 原，通过Elisa测试所述血清。根据这些结果(中点稀释度＞10000)，选 择1只小鼠用于融合。
融合/HAT选择
按照标准方法，使用40％PEG和5％DMSO，将脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞融合。然后以2.5×104-105细胞/孔将细胞接种于96孔板， 然后在HAT培养基中选择抗性克隆。测试这些杂交瘤上清液中特异性 抗体的含量，当杂交瘤上清液为阳性时，将其进行2个循环的有限稀 释。经过2轮筛选后，选择3个杂交瘤用于腹水生产。
9.2.3免疫组织化学
当抗体可得到时，对正常组织切片或癌组织切片进行免疫染色， 以便确定：
◇相对于正常组织而言癌组织中本发明抗原的表达水平或
◇表达所述抗原的某一类型癌的比例
◇是否其它癌类型也表达所述抗原
◇在一种癌组织中表达所述抗原的细胞比例
组织样品制备
解剖后，将组织样品用OCT化合物固定在软木盘上，然后在先前 已在液氮(-160℃)中过冷的异戊烷中快速冷冻。使用之前一直将所述冷 冻块在-70℃保存。7-10μm切片在恒冷切片机室(-20，-30℃)中完成。
染色
将组织切片在室温(RT)下干燥5分钟，室温下在丙酮中固定10分 钟，再次干燥，然后用PBS 0.5％BSA 5％血清饱和。于室温下30分钟 后，用抗原特异性抗体进行直接或间接染色。直接染色产生特异性更 好但强度较低的染色，而间接染色产生强度较高但特异性较低的染 色。
9.3针对本发明抗原的人细胞免疫应答的分析
通过在体外使人T细胞接触抗原，可以评价本发明抗原的免疫相 关性。所有T细胞淋巴细胞系和树突细胞均来源于健康供体(优选为 HLA-A2亚型)的PBMC(外周血单核细胞)。HLA-A2.1/Kb转基因小鼠 模型也用来筛选HLA-A2.1肽。
通过每周体外刺激，产生并维持新发现的抗原特异性CD8+T细胞 系。采用标准方法，测试所述CD8+系应答所述抗原或抗原衍生肽的裂 解活性和γ-IFN的产生。
使用两种策略来产生所述CD8+T细胞系：一种基于肽的方法和一 种基于完整基因的方法。两种方法均要求将新发现抗原正确读框的全 长cDNA或者在合适传递系统中克隆或者用来预测HLA结合肽的序 列。
基于肽的方法
概述地说，用含佐剂的HLA-A2肽免疫转基因小鼠，不能诱导 CD8+应答(根据肽脉冲处理的自身脾细胞有效裂解来确定)的那些肽在 人系统中进一步分析。
人树突细胞(按照Romani等所述方法培养)用肽进行脉冲处理，并 且用来刺激CD8+分类的T细胞(通过Facs)。通过数次每周刺激后，首 先在肽脉冲处理的自身BLCL(EBV-B转化细胞系)上测试所述CD8+ 系。为了确证在体内正确加工所述肽，在cDNA转染的肿瘤细胞 (HLA-A2转染的LnCap、Skov3或CAMA肿瘤细胞)上测试所述CD8+ 系。
基于完整基因的方法
使CD8+T细胞系接触抗原，然后用基因枪转染的树突细胞、反转 录病毒转导的B7.1转染的成纤维细胞、重组痘病毒或腺病毒感染的树 突细胞刺激。病毒感染的细胞非常有效地呈递抗原肽，因为所述抗原 以高水平表达，而且可以只使用一次，以避免病毒T细胞系的过度生 长。
改变刺激后，如上所述，在cDNA转染的肿瘤细胞上测试所述 CD8+系。测定肽特异性和同一性以证实免疫学检验。
CD4+T细胞应答
同样，也可以评价CD4+T细胞免疫应答。采用加载用以刺激T 细胞的重组纯化蛋白或肽的树突细胞产生特异性CD4+T细胞。
预测结合HLA等位基因的表位(九聚体和十聚体)：
根据Parker算法(Parker，K.C.，M.A.Bednarek和J.E.Coligan.1994. 根据个别肽单链的独立结合将潜在的HLA-A2结合肽分等级的方案J. Immunol.152：163和http：//bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind)或 Rammensee方法(Rammensee，Friede，Stevanovic，MHC配体和肽基序： 第一列表，Immunogenetics 41，178-228，1995；Rammensee，Bachmann， Stevanovic：MHC配体和肽基序。Landes Bioscience 1997和 http：//134.2.96.221/scripts/hlaserver.dll/home.htm)，预测HLAI类结合肽 序列。然后在HLA-A2.1/Kb转基因小鼠模型(Vitiello等)中筛选肽。
运用Tepitope算法，用截止计分设置为6(Stumiolo，Hammer等， Nature Biotechnology.1999.17；555-561)，预测HLA II类结合肽序列。
下表搜集了I类和II类预测的表位序列：   HLA-A 0201：十聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表   Parker计分°   SEQ ID：   1   64   KLVNLGFQAL   142.060   SEQ ID NO：16
°：含有所述亚序列的分子解离半衰期的估计。   HLA A0201：九聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表   Parker计分°   SEQ ID：   1   182   ELLDFSSWL   507.976   SEQ ID NO：17   2   104   RLLAEHDAV   126.098   SEQ ID NO：18   3   64   KLVNLGFQA   100.850   SEQ ID NO：19
°：含有所述亚序列的分子解离半衰期的估计。   HLA-A 24：九聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表 Parker计分°  SEQ ID：   1   97   EYIRALQRL 360.000  SEQ ID NO：20
°：含有所述亚序列的分子解离半衰期的估计。   HLA-A 24：十聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表   Parker计分°  SEQ ID：   1   97   EYIRALQRLL   360.000  SEQ ID NO：21
°：含有所述亚序列的分子解离半表期的估计。   HLA-B 7：十聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表   Parker计分°  SEQ ID：   1   111   AVRNALAGGL   600.000  SEQ ID NO：22
°：含有所述亚序列的分子解离半衰期的估计。   HLA-B 4403：十聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表   Parker计分°   SEQ ID：   1   156   SEPGSPRSAY   360.000   SEQ ID NO：23   2   89   VETLRSAVEY   180.000   SEQ ID NO：24
°：含有所述亚序列的分子解离半衰期的估计。   HLA-DRB1*1501：九聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表   Tepitope计分  SEQ ID：   1   99   IRALQRLLA   5.6  SEQ ID NO：25   HLA-DRB1*1502：九聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表   Tepitope计分 SEQ ID：   1   99   IRALQRLLA   4.6 SEQ ID NO：25   HLA-DRB1*0402：九聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表   Tepitope计分   SEQ ID：   1   120   LRPQAVRPS   5.4   SEQ ID NO：26   HLA-DRB1*1101：九聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表   Tepitope计分  SEQ ID：   1   99   IRALQRLLA   4.8  SEQ ID NO：25   HLA-DRB1*1102：九聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表 Tepitope计分  SEQ ID：   1   120   LRPQAVRPS 6.2  SEQ ID NO：26   HLA-DRB1*1104：九聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表   Tepitope计分   SEQ ID：   1   99   IRALQRLLA   5.8   SEQ ID NO：25   HLA-DRB1*1106：九聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表   Tepitope计分   SEQ ID：   1   99   IRALQRLLA   5.8   SEQ ID NO：25   HLA-DRB1*1301：九聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表   Tepitope计分   SEQ ID：   1   120   LRPQAVRPS   6.6   SEQ ID NO：26   2   73   LRQHVPHGG   4.9   SEQ ID NO：27   3   31   LLRCSRRRR   4.4   SEQ ID NO：33   HLA-DRB1*1302：九聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表 Tepitope计分  SEQ ID：   1   120   LRPQAVRPS 5.6  SEQ ID NO：26   HLA-DRB1* 1304：九聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表 Tepitope计分  SEQ ID：   1   120   LRPQAVRPS 6.2  SEQ ID NO：26   2   73   LRQHVPHGG 4.8  SEQ ID NO：27   3   31   LGFQALRQH   4.6  SEQ ID NO：28   HLA-DRB1*1305：九聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表 Tepitope计分  SEQ ID：   1   99   IRALQRLLA 4.8  SEQ ID NO：25   HLA-DRB1*0703：九聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表   Tepitope计分  SEQ ID：   1   112   VRNALAGGL   5.1  SEQ ID NO：29   2   98   YIRALQRLL   4.8  SEQ ID NO：30   3   65   LVNLGFQAL   4.5  SEQ ID NO：31   HLA-DRB5*0101：九聚体   等级   起始位置   亚序列残基列表   Tepitope计分  SEQ ID：   1   96   VEYIREALQR   4.3  SEQ ID NO：32
本申请是以下申请的分案申请：申请日：2001年2月16日；申请号： 01808411.7(PCT/EP01/01779)；发明名称：“肿瘤特异性动物蛋白”。
序列信息
SEQ ID NO：1
GTACCTTGCTTTGGGGGCGCACTAAGTACCTGCCGGGAGCAGGGGGCGCACCGGGAACTCGCAGATTTCGCC
AGTTGGGCGCACTGGGGATCTGTGGACTGCGTCCGGGGGATGGGCTAGGGGGACATGCGCACGCTTTGGGCC
TTACAGAATGTGATGGCGCGAGGGGGAGGGCGAAGCGTGGCGGGAGGGCGAGGCGAAGGAAGGAGGGCGTGA
GAAAGGCGACGGCGGCGGCGCGGAGGAGGGTTATCTATACATTTAAAAACCAGCCGCCTGCGCCGCGCCTGC
GGAGACCTGGGAGAGTCCGGCCGCACGCGCGGGACACGAGCGTCCCACGCTCCCTGGCGCGTACGGCCTGCC
ACCACTAGGCCTCCTATCCCCGGGCTCCAGACGACCTAGGACGCGTGCCCTGGGGAGTTGCCTGGCGGCGCC
GTGCCAGAAGCCCCCTTGGGGCGCCACAGTTTTCCCCGTCGCCTCCGGTTCCTCTGCCTGCACCTTCCTGCG
GCGCGCCGGGACCTGGAGCGGGCGGGTGGATGCAGGCGCGatggacggcggcacactgcccaggtccgcgcc
ccctgcgccccccgtccctgtcggctgcgctgcccggcggagacccgcgtccccggaactgttgcgctgcag
ccggcggcggcgaccggccaccgcagagaccggaggcggcgcagcggccgtagcgcggcgcaatgagcgcga
gcgcaaccgcgtgaagctggtgaacttgggcttccaggcgctgcggcagcacgtgccgcacggcggcgccag
caagaagctgagcaaggtggagacgctgcgctcagccgtggagtacatccgcgcgctgcagcgcctgctggc
cgagcacgacgccgtgcgcaacgcgctggcgggagggctgaggccgcaggccgtgcggccgtctgcgccccg
cgggccgccagggaccaccccggtcgccgcctcgccctcccgcgcttcttcgtccccgggccgcgggggcag
ctcggagcccggctccccgcgttccgcctactcgtcggacgacagcggctgcgaaggcgcgctgagtcctgc
ggagcgcgagctactcgacttctccagctggttagggggctactgaGCGCCCTCGACCTATGAGCCTCAGCC
CCGGAAGCCGAGCGAGCGGCCGGCGCGCTCATCGCCGGGGAGCCCGCCAGGTGGACCGGCCCGCGCTCCGCC
CCCAGCGAGCCGGGGACCCACCCACCACCCCCCGCACCGCCGACGCCGCCTCGTTCGTCCGGCCCAGCCTGA
CCAATGCCGCGGTGGAAACGGGCTTGGAGCTGGCCCCATAAGGGCTGGCGGCTTCCTCCGACGCCGCCCCTC
CCCACAGCTTCTCGACTGCAGTGGGGCGGGGGGCACCAACACTTGGAGATTTTTCCGGAGGGGAGAGGATTT
TCTAAGGGCACAGAGAATCCATTTTCTACACATTAACTTGAGCTGCTGGAGGGACACTGCTGGCAAACGGAG
ACCTATTTTTGTACAAAGAACCCTTGACCTGGGGCGTAATAAAGATGACCTGGACCCCTGCCCCCACTATCT
GGAGTTTTCCATGCTGGCCAAGATCTGGACACGAGCAGTCCCTGAGGGGCGGGGTCCCTGGCGTGAGGCCCC
CGTGACAGCCCACCCTGGGGTGGGTTTGTGGGCACTGCTGCTCTGCTAGGGAGAAGCCTGTGTGGGGCACAC
CTCTTCAAGGGAGCGTGAACTTTATAAATAAATCAGTTCTGTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAA
SEQ ID NO-2
MDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRCSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVKLVNLGFQA
LRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGTTPVAASPS
RASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGY
SEQ ID NO：3
MSAPAARSASGAEAHRSRALSSPLTSWRSRVARAPQDSARLRSRCRPTSRRNAGSRAPSCPRGPGTKKRGR
ARRRPGWSLAAGAQTAARPAASALPPARRCARRRARPAGAAARGCTPRLSAASPPCSASCWRRRAARAAAA
PGSPSSPASRGCARAHCAALRPLRRLRSLRWPVAAAGCSATVPGTRVSAGQRSRQGRGAQGARTWAVCRRP
SRLHPPARRSRRAAGRCRQRNRRRRGKLWRPKGASGTAPPGNSPGHAS
SEQ ID NO：4
GTACCTTGCTTTGGGGGCGCACTAAGTACCTGCCGGGAGCAGGGGGCGCACCGGGAACTCGCAGATTTCGCC
AGTTGGGCGCACTGGGGATCTGTGGACTGCGTCCGGGGGATGGGCTAGGGGGACATGCGCACGCTTTGGGCC
TTACAGAATGTGATCGCGCCGAGGGGGAGGGCCGAAGCGTGGCGGGAGGGCGAGGCGAAGGAAGGAGGGCGT
GAGAAAGGCGACGGCGGCGGCGCGGAGGAGGGTTATCTATACATTTAAAAACCAGCCGCCTGCGCCGCGCCT
GCGGAGACCTGGGAGAGTCCGGCCGCACGCGCGGGACACGAGCGTCCCACGCTCCCTGGCGCGTACGGCCTG
CCACCACTAGGCCTCCTATCCCCGGGCTCCAGACGACCTAGGACGCGTGCCCTGGGGAGTTGCCTGGCGGCG
CCGTGCCAGAAGCCCCCTTGGGGCGCCACAGTTTTCCCCGTCGCCTCCGGTTCCTCTGCCTGCACCTTCCTG
CGGCGCGCCGGGACCTGGAGCGGGCGGGTGGATGCAGGCGCGatggacggcggcacactgcccaggtccgcg
ccccctgcgccccccgtccctgtcggctgcgctgcccggcggagacccgcgtccccggaactgttgcgctgc
agccggcggcggcgaccggccaccgcagagaccggaggcggcgcagcggccgtagcgcggcgcaatgagcgc
gagcgcaaccgcgtgaagctggtgaacttgggcttccaggcgctgcggcagcacgtgccgcacggcggcgcc
agcaagaagctgagcaaggtggagacgctgcgctcagccgtggagtacatccgcgcgctgcagcgcctgctg
gccgagcacgacgccgtgcgcaacgcgctggcgggagggctgaggccgcaggccgtgcggccgtctgcgccc
cgcgggccgccagggaccaccccggtcgccgcctcgccctcccgcgcttcttcgtccccgggccgcgggggc
agctcggagcccggctccccgcgttccgcctactcgtcggacgacagcggctgcgaaggcgcgctgagtcct
gcggagcgcgagctactcgacttctccagctggttagggggctactgaGCGCCCTCGACCTAATAAGCCTCA
AGCCCCGGAAACCCGAGCGAACGGGCCGGCGCGCTTCATCGCCGGGGAAGCCCGCCAAGGTGGACCGGGCCC
GCGCTCCGCCCCCAGCGAGCCGGGGACCCACCCACCACCCCCCGCACCGCCGACGCCGCCTCGTTCGTCCGG
CCCAGCCTGACCAATGCCGCGGTGGAAACGGGCTTGGAGCTGGCCCCATAAGGGCTGGCGGCTTCCTCCGAC
GCCGCCCCTCCCCACAGCTTCTCGACTGCAGTGGGGCGGGGGGCACCAACACTTGGAGATTTTTCCGGAGGG
GAGAGGATTTTCTAAGGGCACAGAGAATCCATTTTCTACACATTAACTTGAGCTGCTGGAGGGACACTGCTG
GCAAACGGAGACCTATTTTTGTACAAAGAACCCTTGACCTGGGGCGTAATAAAGATGACCTGGACCCCTGCC
CCCACTATCTGGAGTTTTCCATGCTGGCCAAGATCTGGACACGAGCAGTCCCTGAGGGGCGGGGTCCCTGGC
GTGAGGCCCCCGTGACAGCCCACCCTGGGGTGGGTTTGTGGGCACTGCTGCTCTGCTAGGGAGAAGCCTGTG
TGGGGCACACCTCTTCAAGGGAGCGTGAACTTTATAAATAAATCAGTTCTGTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAACCGAGGGGGGGCCCGGAGCCAACAAA
SEQ ID NO：5
GGTAAACAGAACTGATTTATTTATAAAGTTCACGCTCCCTTGAAGAGGTGTGCCCCACACAGGCTTCTCCC
TAGCAGAGCAGCAGTGCCCACAAACCCACCCCAGGGTGGGCTGTCACGGGGGCCTCACGCCAGGGACCCCG
CCCCTCAGGGACTGCTCGTGTCCAGATCTTGGCCAGCATGGAAAACTCCAGATAGTGGGGGCAGGGGTCCA
GGTCATCTTTATTACGCCCCAGGTCAAGGGTTCTTTGTACAAAAATAGGTCTCCGTTTGCCAGCAGTGTCC
CTCCAGCAGCTCAAGTTAATGTGTAGAAAATGGATTCTCTGTGCCCTTAGAAAATCCTCTCCCCTCCGGAA
AAATCTCCAAGTGTTGGTGCCCCCCGCCCCACTGCAGTCGAGAAGCTGTGGGGAGGGGCGGCGTCGGAGGA
AGCCGCAGCCCATTATGGGGCCAGCTCCAAGCCCGTTTCCACCGCGGCATTGGTCAGGCTGGGCGGACGAA
CGAGGCGGCGTCGGCGGTGCGGGGGGTGGTGGGTGGGTCCCCGGCTCGCTGGGGGCGGAGCAGCGGGCCGG
TCCACCTGGCGGGCTCCCC
SEQ ID NO：6
TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAAACAGAACTGATTTATTTATAAAGTTCACGCTCCCTTGAAGAGGTGTGCCCC
ACACAGGCTTCTCCCTAGCAGAGCAGCAGTGCCCACAAACCCACCCCAGGGTGGGCTGTCACGGGGGCCTCA
CGCCAGGGACCCCGCCCCTCAGGGACTGCTCGTGTCCAGATCTTGGCCAGCATGGAAAACTCCAGATAGTGG
GGGCAGGGGTCCAGGTCATCTTTATTACGCCCCAGGTCAAGGGTTCTTTGTACAAAAATAGGTCTCCGTTTG
CCAGCAGTGTCCCTCCAGCAGCTCAAGTTAATGTGTAGAAAATGGATTCTCTGTGCCCTTAGAAAATCCTCT
CCCCTCCGGAAAAATCTCCAAGTGTTGGTGCCCCCCGCCCCACTGCAGTCGAGAAGCTGTGGGGAGGGGCGG
CGTCGGAGGAAGCCGCCAGCCCTTATGGGGCCAGCTCCAAGCCCGTTTCCACCGCGGCATTGGTCAGGCTGG
GCCGGACGAACGAGGCGGCGTCGGCGGTGCGGGGGGTGGTGGGTGGGTCCCCGGCTCGCTGGGGGCGGAGCG
CGGGCCGGTCCACCTGGCGGGCTCCCCGGCGATGAGCGCGCCGGCCGCTCGCTCGGCTTCCGGGGCTGAGGC
TCATAGGTCGAGGGCGCTCAGTAGCCCCCTAACCAGCTGGACAAGTCGAGTAGCTCGCGCTCCGCAGGACTC
AGCGCGCCTTCGCAGCCGCTGTCGTCCGACGAGTAGGCGGAACGCGGGGAGCCGGGCTCCGAGCTGCCCCCG
CGGCCCGGGGACGAAGAAGCGCGGGAGGGCGAGGCGGCGACCGGGGTGGTCCCTGGCGGCCCGCGGGGCGCA
GACGGCCGCACGGCCTGCGGCCTCAGCCCTCCCGCCAGCGCGTTGCGCACGGCGTCGTGCTCGGCCAGCAGG
CGCTGCAGCGCGCGGATGTACTCCACGGCTGAGCGCAGCGTCTCCACCTTGCTCAGCTTCTTGCTGGCGCCG
CCGTGCGGCACGTGCTGCCGCAGCGCCTGGAAGCCCAAGTTCACCAGCTTCACGCGGTTGCGCTCGCGCTCA
TTGCGCCGCGCTACGGCCGCTGCGCCGCCTCCGGTCTCTGCGGTGGCCGGTCGCCGCCGCCGGCTGCAGCGC
AACAGTTCCGGGGACGCGGGTCTCCGCCGGGCAGCGCAGCCGACAGGGACGGGGGGCGCAGGGGGCGCGGAC
CTGGGCAGTGTGCCGCCGTCCATCGCGCCTGCATCCACCCGCCCGCTCCAGGTCCCGGCGCGCCGCAGGAAG
GTGCAGGCAGAGGAACCGGAGGCGACGGGGAAAACTGTGGCGCCCCAAGGGGGCTTCTGGCACGGCGCCGCC
AGGCAACTCCCCAGGGCACGCGTCCTAGGTCGTCTGGAGCCCGGGGATAGGAGGCCTAGTGGTGGCAGGCCG
TACGCGCCAGGGAGCGTGGGACGCTCGTGTCCCGCGCGTGCGGCCGGACTCTCCCAGGTCTCCGCAGGCGCG
GCGCAGGCGGCTGGTTTTTAAATGTATAGATAACCCTCCTCCGCGCCGCCGCCGTCGCCTTTCTCACGCCCT
CCTTCCTTCGCCTCGCCCTCCCGCCACGCTTCGCCCTCCCCCTCGCGCGATCACATTCTGTAAGGCCCAAAG
CGTGCGCATGTCCCCCTAGCCCATCCCCCGGACGCAGTCCACAGATCCCCAGTGCGCCCAACTGGCGAAATC
TGCGAGTTCCCGGTGCGCCCCCTGCTCCCGGCAGGTACTTAGTGCGCCCCCAAAGCAAGGTAC
SEQ ID NO：7
MCRKWILCALRKSSPLRKNLQVLVPPAPLQSRSCGEGRRRRKPPALMGPAPSPFPPPHWSGWAGRTRRRRR
CGGWWVGPRLAGGGARARSTLAGFPGDEARRPVRSGFRGLRLIRSRALSSPLTSWRSRVARAPQDSARLRS
RCRPTSRRNAGSRAPSCPRGPGTKKRGRARRRPGWSLAARGACTAARPAASALPPARCARRRARPAGAAAR
GCTPRLSAASPPCSASCWRPRAARAAAAPGSPSSPASRGCARAHCAALRPLRRLRSLRWPVAAAGCSATVP
GTRVSAGQRSRQGRGAQGARTWAVCRRPSRLHPPARSRSRRAAGRCRQRNRRRRGKLWRPKGASGTAPPGN
SPGHAS
SEQ ID NO：8
ATGGATCCAAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGAC
CAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAGATCAGAAATCCCTAAGAGGAAGGGGCAGC
ACcCTcGGTCTGGACATCGAGACAGCCACACGTGCTGGAAAGCAGATAGtGGAGCGGAttctGAAAGAAGAA
TCCGATGAGGCACTTAAAATGACCATGGACGGCGGCACACTGCCCAGGTCCGCGCCCCCTGCGCCCCCCGTC
CCTGTCGGCTGCGCTGCCCGGCGGAGACCCGCGTCCCCGGAACTGTTGCGCTGCAGCCGGCGGCGGCGACCG
GCCACCGCAGAGACCGGAGGCGGCGCAGCGGCCGTAGCGCGGCGCAATGAGCGCGAGCGCAACCGCGTGAAG
CTGGTGAACTTGGGCTTCCAGGCGCTGCGGCAGCACGTGCCGCACGGCGGCGCCAGCAAGAAGCTGAGCAAG
GTGGAGACGCTGCGCTCAGCCGTGGAGTACATCCGCGCGCTGCAGCGCCTGCTGGCCGAGCACGACGCCGTG
CGCAACGCGCTGGCGGGAGGGCTGAGGCCGCAGGCCGTGCGGCCGTCTGCGCCCCGCGGGCCGCCAGGGACC
ACCCCGGTCGCCGCCTCGCCCTCCCGCGCTTCTTCGTCCCCGGGCCGCGGGGGCAGCTCGGAGCCCGGCTCC
CCGCGTTCCGCCTACTCGTCGGCGACAGCGGCTGCGAAGGCGCGCTGAGTCCTGCGGAGCGCGAGCTACTC
GACTTCTCCAGCTGGTTAGGGGGCTACactagtggccaccatcaccatcaccattaa
SEQ ID NO：9
TTGGATCCAAACACTGTGTCAAGCTTTCAGGTAGATTGCTTTCTTTGGCATGTCCGCAAACGAGTTGCAGA
CCAAGAACTAGGTGATGCCCCATTCCTTGATCGGCTTCGCCGAGATCAGAAATCCCTAAGAGGAAGGGGCA
GCACCCTCGGTCTGGACATCGAGACAGCCACACGTGCTGGAAAGCAGATAGTGGAGCGGATTCTGAAAGAA
GAATCCGATGAGGCACTTAAAATGACCATGGACGGCGGCACCCTGCCGCGTTCCGCGCCGCCGGCGCCGCC
AGTTCCGGTTGGCTGCGCTGCCCGTCGCCGTCCCGCGTCCCCGGAACTGCTGCGCTGCAGCCGTCGCCGTC
GCCCGGCCACCGCAGAGACCGGAGGCGGCGCAGCGGCCGTAGCGCGGCGCAATGAGCGCGAGCGCAACCGC
GTGAAGCTGGTGAACTTGGGCTTCCAGGCGCTGCGGCAGCACGTGCCGCACGGCGGCGCCAGCAAGAAGCT
GAGCAAGGTGGAGACGCTGCGCTCAGCCGTGGAGTACATCCGCGCGCTGCAGCGCCTGCTGGCCGAGCACG
ACGCCGTGCGCAACGCGCTGGCGGGAGGGCTGAGGCCGCAGGCCGTGCGGCCGTCTGCGCCCCGCGGGCCG
CCAGGGACCACCCCGGTCGCCGCCTCGCCCTCCCGCGCTTCTTCGTCCCCGGGCCGCGGGGGCAGCTCGGA
GCCCGGCTCCCCGCGTTCCGCCTACTCGTCGGACGACAGCGGCTGCGAAGGCGCCCTGAGTCCTGCGGAGC
GCGAGCTACTCGACTTCTCCAGCTGGTTAGGGGGCTACACTAGTGGCCACCATCACCATCACCATTAA
SEQ ID NO：10
MDPNTVSSFQVDCFLWHVRKRVADQELGDAPFLDRLRRDQKSLRGRGSTLGLDIETATRAGKQIVERILKEE
SDEALKMTMDGGTLPRSAPPAPPVPVGCAARRRPASPELLRSSRRRRPATAETGGGAAAVARRNERERNRVK
LVNLGFQALRQHVPHGGASKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRNALAGGLRPQAVRPSAPRGPPGT
TPVAASPSRASSSPGRGGSSEPGSPRSAYSSDDSGCEGALSPAERELLDFSSWLGGYTSGHHHHHH
SEQ ID NO：11
MYSTAERSVSTLLSFLLAPPCGTCCRSAWKPKFTSFTRLRSRSLRRATAAAPPPVSAVAGRRRRLQRNSSG
DAGLRRAAQPTGTGGAGGADLGSVPPSIAPASTRPLQVPARRRKVQAEEPEATGKTVAPQGGFWHGAARQL
PRARVLGRLEPGDRRPSGGRPYAPGSVGRSCPARAAGLSQVSAGAAQAAGF
SEQ ID NO：12
MEAHLDWYGVPGLQEASDACPRESCSSALPEAREGANVHFPPHPVPREHFSCAAPELVAGAQGLNASLMDG
GALPRLMPTSSGVAGACAARRRQASPELLRCSRRRRSGATEASSSSAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALR
QHVPHGGANKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRAALAGGLLTPATPPSDECAQPSASPASASLSC
ASTSPSPDRLGCSEPTSPRSAYSSEESSCEGELSPMEQELLDFSSWLGGY
SEQ ID NO：13
GCCCGGAGCATGGAAGCACGTCAGCTAGGCCATGAACTGCACCCGGGAGGGGTGGGGGTGGAAGCGCACGG
TGTCAGCTTTGCAGAATGTGTACACCAAGGGGAGGGCGAGGCGAAGGAAGGAGGGCGTAAGAAAGGAGGCG
GTGGCGGGGCGGAGGAGATTATCTATACTTTTTAAAAAAAAGGAGCCTCTTAGCCGCGTAAAGGAGACTTG
GGGAGCGCCTGACAGCACGCGCGGGACACGAGAGTACCACGCTTCCCTACTCTTTTCAGACCTTGACTGGT
ACGGGGTCCCAGGACTGCAGGAGGCCAGCGACGCSTGCCCTAGGGAGTCCTGCAGCAGTGCCCTGCCTGAG
GCCCGTGAAGGTGCAAACGTCCACTTCCCACCGCACCCGGTTCCTCGCGAGCACTTTTCCTSTGCCGCACC
AGAACTCGTAGCAGGGGCCCAGGGGCTGAATGCAAGCTTGATGGACGGCGGCGCGCTGCCCAGACTCATGC
CCACCTCGTCTGGAGTCGCTGGAGCCTGCGCTGTCCGGCGGAGACAAGCGTCTCCGGAATTGCTGCGCTGC
AGCCGGCGGCGGCGATCTGGAGCAACCGAGGCCAGCAGCAGCTCGGCGTCCGTGGCACGCCGCAATGAGCG
CGAGCGCAACCGCGTAAAGCTGGTAAACTTGGGCTTCCAGGCGCTGCGGCAGCACGTGCCGCACGGCGGCG
CCAACAAGAAGCTGAGTAAGGTGGAGACGCTGCGCTCCGCGGTAGAGTACATTCGTGCGCTGCAGCGGCTG
CTCGCAGAGCACGACACGGTGCGGCCGGNGCTCGCTGGGGGGCTGTTAACACCCGCTACTCCGCCGTCCGA
TGAGTGCACGCAGCCCTCTGCCTCCCCTGCCAGCGGGTCTCTGTCCTGCGCCTCTACGTCTCCGTCCCGGA
CCCTGGGCTGCTCTGAGCCTACCTCCCCGCGCTCCGCCTACTCGTCGGAGGAAAGCAGCTGCGAGGGAGAG
CTAAGCCCGATGGAGCAGGAGCTGCTTGACTTTTCCAGTTGGTTAGGGGGCTACTGA
SEQ ID NO：14
MESHFNWYGVPRLQKASDACPRESCSSALPEAREGANVHFPPHPVPREHFSCGAPKPVAGAPALNASLMDG
GALPRLVPTSSGVAGACTARRRPPSPELLRCSRRRRSGATEASSSSAAVARRNERERNRVKLVNLGFQALR
QRVPHGGANKKLSKVETLRSAVEYIRALQRLLAEHDAVRAALSGGLLTPATRPSDVCTQPSASPASASLSC
TSTSPDRLGCSEPASPRSAYSSEDSSCEGETYPMGQMFDFSNWLGGY
SEQ ID NO：15
TTCACCCGGCTGCAAGCGCTAGGTGTACGGAGACCTGGCAGCTCTTGGGGCTTAAGGACTGAGCRCCAGAG
CCGGTGGAGGTTCCTGTGGAGTACATTCGGACCCTCTCACAGCCCCCGAGAGTGCGGGACGTGCGGAGCGC
AGTTCGGGATCTGCACTCGAGGACTTGTCGAGGACGCATTAAGCTAAGCATCTGCTCGGAGCATGGAATCG
CACTTTAACTGGTACGGGGTCCCAAGGCTCCAGAAGGCTAGCGACGCGTGCCCTAGGGAATCCTGCAGCAG
TGCCCTGCCTGAGGCCCGTGGAAGGTGCGAACGTCCACTTCCCACCGCACCCGGTTCCTCGCGAGCCTTTT
CCTGTGGCGCACCGAAACCCGTAGCGGGGGCCCCGGCGCTGAATGCAAGCTTGATGGACGGCGGCGCGCTG
CCCAGACTCGTGCCCACCTCGTCTGGAGTCGCTGGAGCCTGCACTGCTCGGCGGAGACCCCCGTCCCCGGA
ACTGCTTCGCTGCAGCCGACGGCGGCGATCGGGAGCAACCGAGGCCAGCAGCAGCTCGGCGGCCGTGGCAC
GCCGCAATGAGCGTGAGCGCAACCGCGTAAAGCTGGTAAACTTGGGCTTCCAGGCGCTGCGGCAGCACGTG
CCGCACGGCGGCGCCAACAAGAAGCTGAGTAAGGTGGAGACGCTGCGCTCCGCGGTAGAGTACATCCGTGC
GCTGCAGCGGCTGCTAGCAGAGCACGACGCGGTGCGTGCTGCGCTCTCTGGGGGTCTATTAACACCCGCTA
CTCGGCCGTCCGATGTGTGCACGCAGCCCTCCGCCTCCCCTGCCAGCGCGTCTCTGTCCTGCACCTCTACA
TCCCCAGACCGCCTAGGCTGCTCCGAGCCHCCTCTCCGCGCTCCGCCTTACTCGTCGGAGGACAGCAGCTG
CGAGGGAGAGACTTACCCGATGGGGCAGATGTTTHACTTTTCCAATTGGTTAGGGGGCTACTGAGCACCCC
ACACCCCTAAGCTGCGTCCCTGGGTGTCCCCTGGTGGACCTACCTGCGTTTCTTGCCCAGGAAACCTGGGC
CCATGCCTTACCCATGCTGTCTAGTGCAGCCTGACCAAATGCCAAGTACTGACCTCTGCTCGGCCTCCACG
CCGCGGAATGACATCTTCCATCTCCCAGTCCTTGCCGAACCAGGACTTGGAAATTTCTCAGGAGAAAGAAT
TTTACAATGACAATCTGCTTTTTATCAATTAACTTGAACTGCTGGAGGACTCTGCTGAAAATATGAAGAAT
TATTTTTATACAAAGGATCCTTAAGCTTGGAGCACAATAAAGATGACCTCTGTCTCTCACCCCCACTGTCT
AGAACTTTCCAACCTGGCCAAAGTGTGGACGGGTCGGGCCCTGAGGGCAAGATGCCTGGCTGCACCCTTCT
TCCTCTTCCGAAGCCTATCCTGACGCTGATGTTTGGCCAGTGTGGGAACCCTGCTATTGCAAAGTGTACTA
TTCTATAAAAGTTGTTTTTCATTGGAAAGGAATTC
SEQ ID NO：16
KLVN1GFQAL
SEQ ID NO：17
ELLDFSSWL
SEQ ID NO：18
RLLAEHDAV
SEQ ID NO：19
KLVNLGFQA
SEQ ID NO：20
EYIRALQRL
SEQ ID NO：21
EYIRALQRLL
SEQ ID NO：22
AVRNALAGGL
SEQ ID NO：23
SEPGSPRSAY
SEQ ID NO：24
VETLRSAVEY
SEQ ID NO：25
IRALQRLLA
SEQ ID NO：26
LRPQAVRPS
SEQ ID NO：27
LRQHVPHGG
SEQ ID NO：28
LGFQALRQH
SEQ ID NO：29
VRNALAGGL
SEQ ID NO：30
YIRALQRLL
SEQ ID NO：31
LVNLGFQAL
SEQ ID NO：32
VEYIRALQR
SEQ ID NO：33
LLRCSRRRR
<110>史密丝克莱恩比彻姆生物有限公司
     (SmithKline Beecham Biologicals s.a.)
<120>新化合物
<130>BC45300
<160>33
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>1791
<212>DNA
<213>人类
<400>1
gtaccttgct ttgggggcgc actaagtacc tgccgggagc agggggcgca ccgggaactc      60
gcagatttcg ccagttgggc gcactgggga tctgtggact gcgtccgggg gatgggctag     120
ggggacatgc gcacgctttg ggccttacag aatgtgatcg cgcgaggggg agggcgaagc     180
gtggcgggag ggcgaggcga aggaaggagg gcgtgagaaa ggcgacggcg gcggcgcgga     240
ggagggttat ctatacattt aaaaaccagc cgcctgcgcc gcgcctgcgg agacctggga     300
gagtccggcc gcacgcgcgg gacacgagcg tcccacgctc octggcgcgt acggcctgcc     360
accactaggc ctcctatccc cgggctccag acgacctagg acgcgtgccc tggggagttg     420
cctggcggcg ccgtgccaga agcccccttg gggcgccaca gttttccccg tcgcctccgg     480
ttcctctgcc tgcaccttcc tgcggcgcgc cgggacctgg agcgggcggg tggatgcagg     540
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ctgcgctgcc cggcggagac ccgcgtcccc ggaactgttg cgctgcagcc ggcggcggcg     660
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cggcggcgcc agcaagaagc tgagcaaggt ggagacgctg cgctcagccg tggagtacat     840
ccgcgcgctg cagcgcctgc tggccgagca cgacgccgtg cgcaacgcgc tggcgggagg     900
gctgaggccg caggccgtgc ggccgtctgc gccccgcggg ccgccaggga ccaccccggt     960
cgccgcctcg ccctcccgcg cttcttcgtc cccgggccgc gggggcagct cggagcccgg    1020
ctccccgcgt tccgcctact cgtcggacga cagcggctgc gaaggcgcgc tgagtcctgc    1080
ggagcgcgag ctactcgact tctccagctg gttagggggc tactgagcgc cctcgaccta    1140
tgagcctcag ccccggaagc cgagcgagcg gccggcgcgc tcatcgccgg ggagcccgcc    1200
aggtggaccg gcccgcgctc cgcccccagc gagccgggga cccacccacc accccccgca    1260
ccgccgacgc cgcctcgttc gtccggccca gcctgaccaa tgccgcggtg gaaacgggct    1320
tggagctggc cccataaggg ctggcggctt cctccgacgc cgcccctccc cacagcttct    1380
cgactgcagt ggggcggggg gcaccaacac ttggagattt ttccggaggg gagaggattt    1440
tctaagggca cagagaatcc attttctaca cattaacttg agctgctgga gggacactgc    1500
tggcaaacgg agacctattt ttgtacaaag aacccttgac ctggggcgta ataaagatga    1560
cctggacccc tgcccccact atctggagtt ttccatgctg gccaagatct ggacacgagc    1620
agtccctgag gggcggggtc cctggcgtga ggcccccgtg acagcccacc ctggggtggg    1680
tttgtgggca ctgctgctct gctagggaga agcctgtgtg gggcacacct cttcaaggga    1740
gcgtgaactt tataaataaa tcagttctgt ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa a             1791
<210>2
<211>193
<212>PRT
<213>人类
<400>2
Met Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val
 1               5                  10                  15
Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu
            20                  25                  30
Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly
        35                  40                  45
Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys
    50                  55                  60
Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly
65                  70                  75                  80
Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val
                85                  90                  95
Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val
            100                 105                 110
Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser
        115                 120                 125
Ala Pro Arg Gly Pro Pro Gly Thr Thr Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser
    130                 135                 140
Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser
145                 150                 155                 160
Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu
                165                 170                 175
Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly
            180                 185                 190
Tyr
<210>3
<211>262
<212>PRT
<213>人类
<400>3
Met Ser Ala Pro Ala Ala Arg Ser Ala Ser Gly Ala Glu Ala His Arg
 1                   5              10                  15
Ser Arg Ala Leu Ser Ser Pro Leu Thr Ser Trp Arg Ser Arg Val Ala
                20                  25                  30
Arg Ala Pro Gln Asp Ser Ala Arg Leu Arg Ser Arg Cys Arg Pro Thr
            35                  40                  45
Ser Arg Arg Asn Ala Gly Ser Arg Ala Pro Ser Cys Pro Arg Gly Pro
        50                  55                  60
Gly Thr Lys Lys Arg Gly Arg Ala Arg Arg Arg Pro Gly Trp Ser Leu
65                  70                  75                  80
Ala Ala Arg Gly Ala Gln Thr Ala Ala Arg Pro Ala Ala Ser Ala Leu
                85                  90                  95
Pro Pro Ala Arg Cys Ala Arg Arg Arg Ala Arg Pro Ala Gly Ala Ala
            100                 105                 110
Ala Arg Gly Cys Thr Pro Arg Leu Ser Ala Ala Ser Pro Pro Cys Ser
        115                 120                 125
Ala Ser Cys Trp Arg Arg Arg Ala Ala Arg Ala Ala Ala Ala Pro Gly
    130                 135                 140
Ser Pro Ser Ser Pro Ala Ser Arg Gly Cys Ala Arg Ala His Cys Ala
145                 150                 155                 160
Ala Leu Arg Pro Leu Arg Arg Leu Arg Ser Leu Arg Trp Pro Val Ala
                165                 170                 175
Ala Ala Gly Cys Ser Ala Thr Val Pro Gly Thr Arg Val Ser Ala Gly
            180                 185                 190
Gln Arg Ser Arg Gln Gly Arg Gly Ala Gln Gly Ala Arg Thr Trp Ala
        195                 200                 205
Val Cys Arg Arg Pro Ser Arg Leu His Pro Pro Ala Arg Ser Arg Ser
    210                 215                 220
Arg Arg Ala Ala Gly Arg Cys Arg Gln Arg Asn Arg Arg Arg Arg Gly
225                 230                 235                 240
Lys Leu Trp Arg Pro Lys Gly Ala Ser Gly Thr Ala Pro Pro Gly Asn
                245                 250                 255
Ser Pro Gly His Ala Ser
            260
<210>4
<211>1830
<212>DNA
<213>人类
<400>4
gtaccttgct ttgggggcgc actaagtacc tgccgggagc agggggcgca ccgggaactc      60
gcagatttcg ccagttgggc gcactgggga tctgtggact gcgtccgggg gatgggctag     120
ggggacatgc gcacgctttg ggccttacag aatgtgatcg cgccgagggg gagggccgaa     180
gcgtggcggg agggcgaggc gaaggaagga gggcgtgaga aaggcgacgg cggcggcgcg     240
gaggagggtt atctatacat ttaaaaacca gccgcctgcg ccgcgcctgc ggagacctgg     300
gagagtccgg ccgcacgcgc gggacacgag cgtcccacgc tccctggcgc gtacggcctg     360
ccaccactag gcctcctatc cccgggctcc agacgaccta ggacgcgtgc cctggggagt     420
tgcctggcgg cgccgtgcca gaagccccct tggggcgcca cagttttccc cgtcgcctcc     480
ggttcctctg cctgcacctt cctgcggcgc gccgggacct ggagcgggcg ggtggatgca     540
ggcgcgatgg acggcggcac actgcccagg tccgcgcccc ctgcgccccc cgtccctgtc     600
ggctgcgctg cccggcggag acccgcgtcc ccggaactgt tgcgctgcag ccggcggcgg     660
cgaccggcca ccgcagagac cggaggcggc gcagcggccg tagcgcggcg caatgagcgc     720
gagcgcaacc gcgtgaagct ggtgaacttg ggcttccagg cgctgcggca gcacgtgccg     780
cacggcggcg ccagcaagaa gctgagcaag gtggagacgc tgcgctcagc cgtggagtac     840
atccgcgcgc tgcagcgcct gctggccgag cacgacgccg tgcgcaacgc gctggcggga     900
gggctgaggc cgcaggccgt gcggccgtct gcgccccgcg ggccgccagg gaccaccccg     960
gtcgccgcct cgccctcccg cgcttcttcg tccccgggcc gcgggggcag ctcggagccc    1020
ggctccccgc gttccgccta ctcgtcggac gacagcggct gcgaaggcgc gctgagtcct    1080
gcggagcgcg agctactcga cttctccagc tggttagggg gctactgagc gccctcgacc    1140
taataagcct caagccccgg aaacccgagc gaacgggccg gcgcgcttca tcgccgggga    1200
agcccgccaa ggtggaccgg gcccgcgctc cgcccccagc gagccgggga cccacccacc    1260
accccccgca ccgccgacgc cgcctcgttc gtccggccca gcctgaccaa tgccgcggtg    1320
gaaacgggct tggagctggc cccataaggg ctggcggctt cctccgacgc cgcccctccc    1380
cacagcttct cgactgcagt ggggcggggg gcaccaacac ttggagattt ttccggaggg    1440
gagaggattt tctaagggca cagagaatcc attttctaca cattaacttg agctgctgga    1500
gggacactgc tggcaaacgg agacctattt ttgtacaaag aacccttgac ctggggcgta    1560
ataaagatga cctggacccc tgcccccact atctggagtt ttccatgctg gccaagatct    1620
ggacacgagc agtccctgag gggcggggtc cctggcgtga ggcccccgtg acagcccacc    1680
ctggggtggg tttgtgggca ctgctgctct gctagggaga agcctgtgtg gggcacacct    1740
cttcaaggga gcgtgaactt tataaataaa tcagttctgt ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa    1800
aaaaccgagg gggggcccgg agccaacaaa                                     1830
<210>5
<211>587
<212>DNA
<213>人类
<400>5
ggtaaacaga actgatttat ttataaagtt cacgctccct tgaagaggtg tgccccacac      60
aggcttctcc ctagcagagc agcagtgccc acaaacccac cccagggtgg gctgtcacgg     120
gggcctcacg ccagggaccc cgcccctcag ggactgctcg tgtccagatc ttggccagca     180
tggaaaactc cagatagtgg gggcaggggt ccaggtcatc tttattacgc cccaggtcaa     240
gggttctttg tacaaaaata ggtctccgtt tgccagcagt gtccctccag cagctcaagt     300
taatgtgtag aaaatggatt ctctgtgccc ttagaaaatc ctctcccctc cggaaaaatc     360
tccaagtgtt ggtgcccccc gccccactgc agtcgagaag ctgtggggag gggcggcgtc     420
ggaggaagcc gcagcccatt atggggccag ctccaagccc gtttccaccg cggcattggt     480
caggctgggc ggacgaacga ggcggcgtcg gcggtgcggg gggtggtggg tgggtccccg     540
gctcgctggg ggcggagcag cgggccggtc cacctggcgg gctcccc                   587
<210>6
<211>1791
<212>DNA
<213>人类
<400>6
tttttttttt ttttttttta aacagaactg atttatttat aaagttcacg ctcccttgaa      60
gaggtgtgcc ccacacaggc ttctccctag cagagcagca gtgcccacaa acccacccca     120
gggtgggctg tcacgggggc ctcacgccag ggaccccgcc cctcagggac tgctcgtgtc     180
cagatcttgg ccagcatgga aaactccaga tagtgggggc aggggtccag gtcatcttta     240
ttacgcccca ggtcaagggt tctttgtaca aaaataggtc tccgtttgcc agcagtgtcc     300
ctccagcagc tcaagttaat gtgtagaaaa tggattctct gtgcccttag aaaatcctct     360
cccctccgga aaaatctcca agtgttggtg ccccccgccc cactgcagtc gagaagctgt     420
ggggaggggc ggcgtcggag gaagccgcca gcccttatgg ggccagctcc aagcccgttt     480
ccaccgcggc attggtcagg ctgggccgga cgaacgaggc ggcgtcggcg gtgcgggggg     540
tggtgggtgg gtccccggct cgctgggggc ggagcgcggg ccggtccacc tggcgggctc     600
cccggcgatg agcgcgccgg ccgctcgctc ggcttccggg gctgaggctc ataggtcgag     660
ggcgctcagt agccccctaa ccagctggag aagtcgagta gctcgcgctc cgcaggactc     720
agcgcgcctt cgcagccgct gtcgtccgac gagtaggcgg aacgcgggga gccgggctcc     780
gagctgcccc cgcggcccgg ggacgaagaa gcgcgggagg gcgaggcggc gaccggggtg     840
gtccctggcg gcccgcgggg cgcagacggc cgcacggcct gcggcctcag ccctcccgcc     900
agcgcgttgc gcacggcgtc gtgctcggcc agcaggcgct gcagcgcgcg gatgtactcc     960
acggctgagc gcagcgtctc caccttgctc agcttcttgc tggcgccgcc gtgcggcacg    1020
tgctgccgca gcgcctggaa gcccaagttc accagcttca cgcggttgcg ctcgcgctca    1080
ttgcgccgcg ctacggccgc tgcgccgcct ccggtctctg cggtggccgg tcgccgccgc    1140
cggctgcagc gcaacagttc cggggacgcg ggtctccgcc gggcagcgca gccgacaggg    1200
acggggggcg cagggggcgc ggacctgggc agtgtgccgc cgtccatcgc gcctgcatcc    1260
acccgcccgc tccaggtccc ggcgcgccgc aggaaggtgc aggcagagga accggaggcg    1320
acggggaaaa ctgtggcgcc ccaagggggc ttctggcacg gcgccgccag gcaactcccc    1380
agggcacgcg tcctaggtcg tctggagccc ggggatagga ggcctagtgg tggcaggccg    1440
tacgcgccag ggagcgtggg acgctcgtgt cccgcgcgtg cggccggact ctcccaggtc    1500
tccgcaggcg cggcgcaggc ggctggtttt taaatgtata gataaccctc ctccgcgccg    1560
ccgccgtcgc ctttctcacg ccctccttcc ttcgcctcgc cctcccgcca cgcttcgccc    1620
tccccctcgc gcgatcacat tctgtaaggc ccaaagcgtg cgcatgtccc cctagcccat    1680
cccccggacg cagtccacag atccccagtg cgcccaactg gcgaaatctg cgagttcccg    1740
gtgcgccccc tgctcccggc aggtacttag tgcgccccca aagcaaggta c             1791
<210>7
<211>361
<212>PRT
<213>人类
<400>7
Met Cys Arg Lys Trp Ile Leu Cys Ala Leu Arg Lys Ser Ser Pro Leu
 1               5                  10                  15
Arg Lys Asn Leu Gln Val Leu Val Pro Pro Ala Pro Leu Gln Ser Arg
            20                  25                  30
Ser Cys Gly Glu Gly Arg Arg Arg Arg Lys Pro Pro Ala Leu Met Gly
        35                  40                  45
Pro Ala Pro Ser Pro Phe Pro Pro Arg His Trp Ser Gly Trp Ala Gly
    50                  55                  60
Arg Thr Arg Arg Arg Arg Arg Cys Gly Gly Trp Trp Val Gly Pro Arg
65                  70                  75                  80
Leu Ala Gly Gly Gly Ala Arg Ala Arg Ser Thr Leu Ala Gly Phe Pro
                85                  90                  95
Gly Asp Glu Ala Arg Arg Pro Val Arg Ser Gly Phe Arg Gly Leu Arg
            100                 105                 110
Leu Ile Arg Ser Arg Ala Leu Ser Ser Pro Leu Thr Ser Trp Arg Ser
        115                 120                 125
Arg Val Ala Arg Ala Pro Gln Asp Ser Ala Arg Leu Arg Ser Arg Cys
    130                 135                 140
Arg Pro Thr Ser Arg Arg Asn Ala Gly Ser Arg Ala Pro Ser Cys Pro
145                 150                 155                 160
Arg Gly Pro Gly Thr Lys Lys Arg Gly Arg Ala Arg Arg Arg Pro Gly
                165                 170                 175
Trp Ser Leu Ala Ala Arg Gly Ala Gln Thr Ala Ala Arg Pro Ala Ala
            180                 185                 190
Ser Ala Leu Pro Pro Ala Arg Cys Ala Arg Arg Arg Ala Arg Pro Ala
        195                 200                 205
Gly Ala Ala Ala Arg Gly Cys Thr Pro Arg Leu Ser Ala Ala Ser Pro
    210                 215                 220
Pro Cys Ser Ala Ser Cys Trp Arg Arg Arg Ala Ala Arg Ala Ala Ala
225                 230                 235                 240
Ala Pro Gly Ser Pro Ser Ser Pro Ala Ser Arg Gly Cys Ala Arg Ala
                245                 250                 255
His Cys Ala Ala Leu Arg Pro Leu Arg Arg Leu Arg Ser Leu Arg Trp
            260                 265                 270
Pro Val Ala Ala Ala Gly Cys Ser Ala Thr Val Pro Gly Thr Arg Val
        275                 280                 285
Ser Ala Gly Gln Arg Ser Arg Gln Gly Arg Gly Ala Gln Gly Ala Arg
    290                 295                 300
Thr Trp Ala Val Cys Arg Arg Pro Ser Arg Leu His Pro Pro Ala Arg
305                 310                 315                 320
Ser Arg Ser Arg Arg Ala Ala Gly Arg Cys Arg Gln Arg Asn Arg Arg
                325                 330                 335
Arg Arg Gly Lys Leu Trp Arg Pro Lys Gly Ala Ser Gly Thr Ala Pro
            340                 345                 350
Pro Gly Asn Ser Pro Gly His Ala Ser
        355                 360
<210>8
<211>849
<212>DNA
<213>流感病毒和人类
<400>8
atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa      60
cgagttgcag accaagaact aggtgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag     120
aaatccctaa gaggaagggg cagcaccctc ggtctggaca tcgagacagc cacacgtgct     180
ggaaagcaga tagtggagcg gattctgaaa gaagaatccg atgaggcact taaaatgacc     240
atggacggcg gcacactgcc caggtccgcg ccccctgcgc cccccgtccc tgtcggctgc     300
gctgcccggc ggagacccgc gtccccggaa ctgttgcgct gcagccggcg gcggcgaccg     360
gccaccgcag agaccggagg cggcgcagcg gccgtagcgc ggcgcaatga gcgcgagcgc     420
aaccgcgtga agctggtgaa cttgggcttc caggcgctgc ggcagcacgt gccgcacggc     480
ggcgccagca agaagctgag caaggtggag acgctgcgct cagccgtgga gtacatccgc     540
gcgctgcagc gcctgctggc cgagcacgac gccgtgcgca acgcgctggc gggagggctg     600
aggccgcagg ccgtgcggcc gtctgcgccc cgcgggccgc cagggaccac cccggtcgcc     660
gcctcgccct cccgcgcttc ttcgtccccg ggccgcgggg gcagctcgga gcccggctcc     720
ccgcgttccg cctactcgtc ggacgacagc ggctgcgaag gcgcgctgag tcctgcggag     780
cgcgagctac tcgacttctc cagctggtta gggggctaca ctagtggcca ccatcaccat     840
caccattaa                                                             849
<210>9
<211>849
<212>DNA
<213>流感病毒和人类
<400>9
atggatccaa acactgtgtc aagctttcag gtagattgct ttctttggca tgtccgcaaa      60
cgagttgcag accaagaact aggtgatgcc ccattccttg atcggcttcg ccgagatcag     120
aaatccctaa gaggaagggg cagcaccctc ggtctggaca tcgagacagc cacacgtgct     180
ggaaagcaga tagtggagcg gattctgaaa gaagaatccg atgaggcact taaaatgacc     240
atggacggcg gcaccctgcc gcgttccgcg ccgccggcgc cgccagttcc ggttggctgc     300
gctgcccgtc gccgtcccgc gtccccggaa ctgctgcgct gcagccgtcg ccgtcgcccg     360
gccaccgcag agaccggagg cggcgcagcg gccgtagcgc ggcgcaatga gcgcgagcgc     420
aaccgcgtga agctggtgaa cttgggcttc caggcgctgc ggcagcacgt gccgcacggc     480
ggcgccagca agaagctgag caaggtggag acgctgcgct cagccgtgga gtacatccgc     540
gcgctgcagc gcctgctggc cgagcacgac gccgtgcgca acgcgctggc gggagggctg     600
aggccgcagg ccgtgcggcc gtctgcgccc cgcgggccgc cagggaccac cccggtcgcc     660
gcctcgccct cccgcgcttc ttcgtccccg ggccgcgggg gcagctcgga gcccggctcc     720
ccgcgttccg cctactcgtc ggacgacagc ggctgcgaag gcgcgctgag tcctgcggag     780
cgcgagctac tcgacttctc cagctggtta gggggctaca ctagtggcca ccatcaccat     840
caccattaa                                                             849
<210>10
<211>282
<212>PRT
<213>流感病毒和人类
<400>10
Met Asp Pro Asn Thr Val Ser Ser Phe Gln Val Asp Cys Phe Leu Trp
 1               5                  10                  15
His Val Arg Lys Arg Val Ala Asp Gln Glu Leu Gly Asp Ala Pro Phe
            20                  25                  30
Leu Asp Arg Leu Arg Arg Asp Gln Lys Ser Leu Arg Gly Arg Gly Ser
        35                  40                  45
Thr Leu Gly Leu Asp Ile Glu Thr Ala Thr Arg Ala Gly Lys Gln Ile
    50                  55                  60
Val Glu Arg Ile Leu Lys Glu Glu Ser Asp Glu Ala Leu Lys Met Thr
65                  70                  75                  80
Met Asp Gly Gly Thr Leu Pro Arg Ser Ala Pro Pro Ala Pro Pro Val
                85                  90                  95
Pro Val Gly Cys Ala Ala Arg Arg Arg Pro Ala Ser Pro Glu Leu Leu
            100                 105                 110
Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Pro Ala Thr Ala Glu Thr Gly Gly Gly
        115                 120                 125
Ala Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg Asn Arg Val Lys
    130                 135                 140
Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His Val Pro His Gly
145                 150                 155                 160
Gly Ala Ser Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val
                165                 170                 175
Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val
            180                 185                 190
Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser
        195                 200                 205
Ala Pro Arg Gly Pro Pro Gly Thr Thr Pro Val Ala Ala Ser Pro Ser
    210                 215                 220
Arg Ala Ser Ser Ser Pro Gly Arg Gly Gly Ser Ser Glu Pro Gly Ser
225                 230                 235                 240
Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Asp Asp Ser Gly Cys Glu Gly Ala Leu
                245                 250                 255
Ser Pro Ala Glu Arg Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu Gly Gly
            260                 265                 270
Tyr Thr Ser Gly His His His His His His
        275                 280
<210>11
<211>193
<212>PRT
<213>人类
<400>11
Met Tyr Ser Thr Ala Glu Arg Ser Val Ser Thr Leu Leu Ser Phe Leu
 1               5                  10                  15
Leu Ala Pro Pro Cys Gly Thr Cys Cys Arg Ser Ala Trp Lys Pro Lys
            20                  25                  30
Phe Thr Ser Phe Thr Arg Leu Arg Ser Arg Ser Leu Arg Arg Ala Thr
        35                  40                  45
Ala Ala Ala Pro Pro Pro Val Ser Ala Val Ala Gly Arg Arg Arg Arg
    50                  55                  60
Leu Gln Arg Asn Ser Ser Gly Asp Ala Gly Leu Arg Arg Ala Ala Gln
65                  70                  75                  80
Pro Thr Gly Thr Gly Gly Ala Gly Gly Ala Asp Leu Gly Ser Val Pro
                85                  90                  95
Pro Ser Ile Ala Pro Ala Ser Thr Arg Pro Leu Gln Val Pro Ala Arg
            100                 105                 110
Arg Arg Lys Val Gln Ala Glu Glu Pro Glu Ala Thr Gly Lys Thr Val
        115                 120                 125
Ala Pro Gln Gly Gly Phe Trp His Gly Ala Ala Arg Gln Leu Pro Arg
    130                 135                 140
Ala Arg Val Leu Gly Arg Leu Glu Pro Gly Asp Arg Arg Pro Ser Gly
145                 150                 155                 160
Gly Arg Pro Tyr Ala Pro Gly Ser Val Gly Arg Ser Cys Pro Ala Arg
                165                 170                 175
Ala Ala Gly Leu Ser Gln Val Ser Ala Gly Ala Ala Gln Ala Ala Gly
            180                 185                 190
Phe
<210>12
<211>263
<212>PRT
<213>小鼠
<400>12
Met Glu Ala His Leu Asp Trp Tyr Gly Val Pro Gly Leu Gln Glu Ala
 1               5                  10                  15
Ser Asp Ala Cys Pro Arg Glu Ser Cys Ser Ser Ala Leu Pro Glu Ala
            20                  25                  30
Arg Glu Gly Ala Asn Val His Phe Pro Pro His Pro Val Pro Arg Glu
        35                  40                  45
His Phe Ser Cys Ala Ala Pro Glu Leu Val Ala Gly Ala Gln Gly Leu
    50                  55                  60
Asn Ala Ser Leu Met Asp Gly Gly Ala Leu Pro Arg Leu Met Pro Thr
65                  70                  75                  80
Ser Ser Gly Val Ala Gly Ala Cys Ala Ala Arg Arg Arg Gln Ala Ser
                85                  90                  95
Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Ser Gly Ala Thr Glu
            100                 105                 110
Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg
        115                 120                 125
Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His
    130                 135                 140
Val Pro His Gly Gly Ala Asn Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu
145                 150                 155                 160
Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu
                165                 170                 175
His Asp Ala Val Arg Ala Ala Leu Ala Gly Gly Leu Leu Thr Pro Ala
            180                 185                 190
Thr Pro Pro Ser Asp Glu Cys Ala Gln Pro Ser Ala Ser Pro Ala Ser
        195                 200                 205
Ala Ser Leu Ser Cys Ala Ser Thr Ser Pro Ser Pro Asp Arg Leu Gly
    210                 215                 220
Cys Ser Glu Pro Thr Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Glu Glu Ser
225                 230                 235                 240
Ser Cys Glu Gly Glu Leu Ser Pro Met Glu Gln Glu Leu Leu Asp Phe
                245                 250                 255
Ser Ser Trp Leu Gly Gly Tyr
            260
<210>13
<211>1051
<212>DNA
<213>小鼠
<400>13
gcccggagca tggaagcacg tcagctaggc catgaactgc acccgggagg ggtgggggtg      60
gaagcgcacg gtgtcagctt tgcagaatgt gtacaccaag gggagggcga ggcgaaggaa     120
ggagggcgta agaaaggagg cggtggcggg gcggaggaga ttatctatac tttttaaaaa     180
aaaggagcct cttagccgcg taaaggagac ttggggagcg cctgacagca cgcgcgggac     240
acgagagtac cacgcttccc tactcttttc agaccttgac tggtacgggg tcccaggact     300
gcaggaggcc agcgacgcgt gccctaggga gtcctgcagc agtgccctgc ctgaggcccg     360
tgaaggtgca aacgtccact tcccaccgca cccggttcct cgcgagcact tttcctgtgc     420
cgcaccagaa ctcgtagcag gggcccaggg gctgaatgca agcttgatgg acggcggcgc     480
gctgcccaga ctcatgccca cctcgtctgg agtcgctgga gcctgcgctg ctcggcggag     540
acaagcgtct ccggaattgc tgcgctgcag ccggcggcgg cgatctggag caaccgaggc     600
cagcagcagc tcggcgtccg tggcacgccg caatgagcgc gagcgcaacc gcgtaaagct     660
ggtaaacttg ggcttccagg cgctgcggca gcacgtgccg cacggcggcg ccaacaagaa     720
gctgagtaag gtggagacgc tgcgctccgc ggtagagtac attcgtgcgc tgcagcggct     780
gctcgcagag cacgacacgg tgcggccggn gctcgctggg gggctgttaa cacccgctac     840
tccgccgtcc gatgagtgca cgcagccctc tgcctcccct gccagcgggt ctctgtcctg     900
cgcctctacg tctccgtccc ggaccctggg ctgctctgag cctacctccc cgcgctccgc     960
ctactcgtcg gaggaaagca gctgcgaggg agagctaagc ccgatggagc aggagctgct    1020
tgacttttcc agttggttag ggggctactg a                                   1051
<210>14
<211>260
<212>PRT
<213>大鼠
<400>14
Met Glu Ser His Phe Asn Trp Tyr Gly Val Pro Arg Leu Gln Lys Ala
 1               5                  10                  15
Ser Asp Ala Cys Pro Arg Glu Ser Cys Ser Ser Ala Leu Pro Glu Ala
            20                  25                  30
Arg Glu Gly Ala Asn Val His Phe Pro Pro His Pro Val Pro Arg Glu
        35                  40                  45
His Phe Ser Cys Gly Ala Pro Lys Pro Val Ala Gly Ala Pro Ala Leu
    50                  55                  60
Asn Ala Ser Leu Met Asp Gly Gly Ala Leu Pro Arg Leu Val Pro Thr
65                  70                  75                  80
Ser Ser Gly Val Ala Gly Ala Cys Thr Ala Arg Arg Arg Pro Pro Ser
                85                  90                  95
Pro Glu Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg Ser Gly Ala Thr Glu
            100                 105                 110
Ala Ser Ser Ser Ser Ala Ala Val Ala Arg Arg Asn Glu Arg Glu Arg
        115                 120                 125
Asn Arg Val Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His
    130                 135                 140
Val Pro His Gly Gly Ala Asn Lys Lys Leu Ser Lys Val Glu Thr Leu
145                 150                 155                 160
Arg Ser Ala Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala Glu
                165                 170                 175
His Asp Ala Val Arg Ala Ala Leu Ser Gly Gly Leu Leu Thr Pro Ala
            180                 185                 190
Thr Arg Pro Ser Asp Val Cys Thr Gln Pro Ser Ala Ser Pro Ala Ser
        195                 200                 205
Ala Ser Leu Ser Cys Thr Ser Thr Ser Pro Asp Arg Leu Gly Cys Ser
    210                 215                 220
Glu Pro Ala Ser Pro Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Glu Asp Ser Ser Cys
225                 230                 235                 240
Glu Gly Glu Thr Tyr Pro Met Gly Gln Met Phe Asp Phe Ser Asn Trp
               245                 250                 255
Leu Gly Gly Tyr
            260
<210>15
<211>1526
<212>DNA
<213>大鼠
<400>15
ttcacccggc tgcaagcgct aggtgtacgg agacctggca gctcttgggg cttaaggact    60
gagcrccaga gccggtggag gttcctgtgg agtacattcg gaccctctca cagcccccga     120
gagtgcggga cgtgcggagc gcagttcggg atctgcactc gaggacttgt cgaggacgca     180
ttaagctaag catctgctcg gagcatggaa tcgcacttta actggtacgg ggtcccaagg     240
ctccagaagg ctagcgacgc gtgccctagg gaatcctgca gcagtgccct gcctgaggcc     300
cgtgaaggtg cgaacgtcca cttcccaccg cacccggttc ctcgcgagca cttttcctgt     360
ggcgcaccga aacccgtagc gggggccccg gcgctgaatg caagcttgat ggacggcggc     420
gcgctgccca gactcgtgcc cacctcgtct ggagtcgctg gagcctgcac tgctcggcgg     480
agacccccgt ccccggaact gcttcgctgc agccgacggc ggcgatcggg agcaaccgag     540
gccagcagca gctcggcggc cgtggcacgc cgcaatgagc gtgagcgcaa ccgcgtaaag     600
ctggtaaact tgggcttcca ggcgctgcgg cagcacgtgc cgcacggcgg cgccaacaag     660
aagctgagta aggtggagac gctgcgctcc gcggtagagt acatccgtgc gctgcagcgg     720
ctgctagcag agcacgacgc ggtgcgtgct gcgctctctg ggggtctatt aacacccgct     780
actcggccgt ccgatgtgtg cacgcagccc tccgcctccc ctgccagcgc gtctctgtcc     840
tgcacctcta catccccaga ccgcctaggc tgctccgagc ctgcctctcc gcgctccgcc     900
tactcgtcgg aggacagcag ctgcgaggga gagacttacc cgatggggca gatgtttgac     960
ttttccaatt ggttaggggg ctactgagca ccccacaccc ctaagctgcg tccctgggtg    1020
tcccctggtg gacctacctg cgtttcttgc ccaggaaacc tgggcccatg ccttacccat    1080
gctgtctagt gcagcctgac caaatgccaa gtactgacct ctgctcggcc tcaacgccgc    1140
ggaatgacat cttccatctc ccagtccttg ccgaaccagg acttggaaat ttctcaggag    1200
aaagaatttt acaatgacaa tctgcttttt atcaattaac ttgaactgct ggaggactct    1260
gctgaaaata tgaagaatta tttttataca aaggatcctt aagcttggag cacaataaag    1320
atgacctctg tctctcaccc ccactgtcta gaactttcca acctggccaa agtgtggacg    1380
ggtcgggccc tgagggcaag atgcctggct gcacccttct tcctcttccg aagcctatcc    1440
tgacgctgat gtttggccag tgtgggaacc ctgctattgc aaagtgtact attctataaa    1500
agttgttttt cattggaaag gaattc                                         1526
<210>16
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>16
Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu
 1               5                  10
<210>17
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>17
Glu Leu Leu Asp Phe Ser Ser Trp Leu
 1               5
<210>18
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>18
Arg Leu Leu Ala Glu His Asp Ala Val
 1               5
<210>19
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>19
Lys Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala
 1               5
<210>20
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>20
Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu
 1               5
<210>21
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>21
Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu
 1               5                  10
<210>22
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>22
Ala Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu
 1               5                  10
<210>23
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>23
Ser Glu Pro Gly Ser Pro Arg Ser Ala Tyr
 1               5                  10
<210>24
<211>10
<212>PRT
<213>人类
<400>24
Val Glu Thr Leu Arg Ser Ala Val Glu Tyr
 1               5                  10
<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>25
Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu Ala
 1               5
<210>26
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>26
Leu Arg Pro Gln Ala Val Arg Pro Ser
 1               5
<210>27
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>27
Leu Arg Gln His Val Pro His Gly Gly
 1               5
<210>28
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>28
Leu Gly Phe Gln Ala Leu Arg Gln His
 1               5
<210>29
<211>9
<212>PRT
<213>Human
<400>29
Val Arg Asn Ala Leu Ala Gly Gly Leu
 1               5
<210>30
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>30
Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg Leu Leu
 1               5
<210>31
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>31
Leu Val Asn Leu Gly Phe Gln Ala Leu
 1               5
<210>32
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>32
Val Glu Tyr Ile Arg Ala Leu Gln Arg
 1               5
<210>33
<211>9
<212>PRT
<213>人类
<400>33
Leu Leu Arg Cys Ser Arg Arg Arg Arg
 1               5