合成的寡核苷酸为在交叉领域诸如分子生物学和基于DNA的诊 断学和治疗学中广泛使用的化合物。
治疗学
在治疗学中，例如，寡核苷酸已成功用于在体内阻断特异性的 mRNAs的翻译，由此阻止对细胞/有机体不需要的或有害的蛋白的合 成。寡核苷酸介导的翻译阻断的概念称之为“反义”方法。从机理上 讲，杂交的(hybridising)寡核苷酸被认为或者是通过对翻译过程产生物 理阻断，或者是通过补充其特异性降解双链体(RNAseH)的mRNA部 分的细胞酶而发挥其作用。
最近，将RNAse催化活性与序列和互补RNA靶的(核酶)特异性 相互作用的能力结合的寡核糖核苷酸和寡脱氧核糖核苷酸及其类似物 作为反义探针已获得了极大的关注。迄今已有报道核酶在细胞培养中 对抑制靶病毒和癌基因是有效的。
为了完全阻止通过反义方法给定的蛋白质合成，必须阻断/破坏编 码特殊蛋白的所有mRNAs，并且在许多情况下，这些mRNA的数量 是相当大的。一般来说，编码特殊蛋白的mRNAs从一个基因或几个 基因转录。因此，通过定向(targeting)基因(“antigene”方法)而非其 mRNA产物，应该有可能更有效地阻断其同源蛋白的生成，或者获得 为了发挥所需作用必需的寡核苷酸的量的显著减少。为了阻断转录， 所述寡核苷酸必须能够将序列特异性地杂交到双链DNA中。在1953 年，Watson和Crick证明，脱氧核糖核酸(DNA)由两条链组成(Nature， 1953，171，737)，这两条链通过链上相对互补的核苷酸碱基之间形成的 氢键以螺旋构型保持在一起。在DNA中常见的四个核苷酸碱基为鸟 嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)和胞嘧啶(C)，其中核苷酸碱基G 与C配对，而核苷酸碱基A与T配对。在RNA中，核苷酸碱基胸腺 嘧啶由与A配对的核苷酸碱基T相类似的核苷酸碱基尿嘧啶(U)替 代。在核苷酸碱基中参与标准双链体形成的化学基团组成沃森-克里克 面(Watson-Crick face)。在1959年，Hoogsteen表明，嘌呤核苷酸碱基 (G和A)除了它们的Watson-Crick面外，还具有可从双链体外面识别 的Hoogsteen面，并用于经氢键连接嘧啶寡核苷酸，由此形成三链螺 旋状物结构。虽然制备“antigene”的方法在理论上是可行的，但三链 螺旋状物形成的寡聚体的实践有效性目前受到几个因素的限制，这些 因素包括对靶基因的同源嘌呤序列基序(motif)的需求以及非生理学上 的高离子强度和稳定复合物的低pH的需要。
称为aptamers的寡核苷酸的用途也正在积极的研究中。这类新的 具有前景的治疗性寡核苷酸被选择在体外特异性地与具有高亲和力的 给定的靶例如配体受体结合。它们的结合特征可能为寡核苷酸通过分 子内核苷酸碱基配对保持在一起形成三维结构的能力的反映。
同样地，已证明核苷和核苷类似物在许多病毒性感染和癌症的化 疗中是有效的。
各种类型的双链RNAs也已表明可有效地抑制几种类型的癌生 长。
诊断学
在分子生物学中，寡核苷酸被常规用于多种目的，例如(i)在靶核 酸的捕获、鉴定和定量中作为杂交探针，(ii)在靶核酸的纯化中作为亲 和探针，(iii)在序列反应和靶扩增方法如聚合酶链反应(PCR)中作为引 物，(iv)克隆和突变核酸以及(vi)在大分子结构的装配中作为构件。
诊断学使用了许多基于寡核苷酸的上述技术，特别是那些使其易 于自动化操作和有助于获得高灵敏度的可重现结果的技术。本领域的 目标是使用基于寡核苷酸的技术作为例如(i)检测人、动物和食物中致 病性微生物的存在，(ii)测定对疾病的遗传易感性，(iii)鉴定先天性和 获得性遗传疾病，(iv)在犯罪试验中将生物学沉积物与嫌疑人联系起来 和(v)确证与食物和饮料生产中有关的微生物的存在的方法。
一般考虑
为在以上概述的广泛的不同应用范围中是有用的，寡核苷酸必须 满足大量的不同需要。在反义治疗学中，例如，一个有用的寡核苷酸 必须能够渗透细胞膜，对细胞外和细胞内核酸酶有良好的抵抗力并优 选具有补充内源性酶像RNAseH的能力。在基于DNA的诊断学和分 子生物学中，其它的特性例如寡核苷酸作为对进化的作用于天然核酸 的不同酶(如聚合酶、激酶、连接酶和磷酸酶)的广泛范围有效底物起 作用的能力是重要的。然而，为所有用途基础的寡核苷酸的基本特性 是它们能够用沃森-克里克氢键(A-T和G-C)或其它氢键模式如 Hoogsteen模式来特异性识别和杂交序列到互补的单链核酸。两个重要 的术语亲和力和特异性常用于鉴定给定的寡核苷酸的杂交性质。亲和 力是所述寡核苷酸与其互补的靶序列结合强度的量度(表示为双链体 的耐热性(Tm))。该双链体中的每一个核苷酸碱基对增加耐热性，并且 因此亲和力随着所述寡核苷酸的大小(核苷酸碱基的数目)的增加而增 加。特异性是寡核苷酸在完全互补的和失配的靶序列之间进行区别的 能力的量度。换言之，特异性是与靶中失配核苷酸碱基对有关的亲和 力的丧失的量度。在恒定大小的寡核苷酸中，其特异性随着所述寡核 苷酸及其靶之间的失配数的增加(即失配的百分数增加)而增加。反 之，当所述寡核苷酸的大小增加而失配数不变(即失配的百分数降低) 时，特异性降低。另一种说法即寡核苷酸亲和力的增加是以特异性为 代价的，反之亦然。
寡核苷酸的此种性质对它们的实际使用产生一些问题。例如，在 费时的诊断步骤中，所述寡核苷酸需要兼有高亲和力以确保足够的实 验灵敏度和高特异性以避免假阳性结果。同样，用作反义探针的寡核 苷酸需要兼有对其靶mRNA的高亲和力以有效削弱它的翻译和高特 异性以避免无意的阻断其它蛋白的表达。采用酶反应如PCR扩增时， 所述寡核苷酸引物的亲和力必须高到足以使该引物/靶双链体在所述 酶显示活性的温度范围内是稳定的，并且特异性需要高到足以确保只 有正确的靶序列得以扩增。
根据所举出的天然寡核苷酸的缺点，增强特异性和亲和力的新方 法对于基于DNA的治疗学、诊断学和分子生物学技术来说通常是非 常有用的。
构象限制的核苷
已知寡核苷酸在杂交到靶序列的过程中经受构象由单链状态的 相对随机的螺旋结构向双链状态的有序结构的转换。
一些构象受限的寡核苷酸包括双环和三环核苷类似物(图1A和 1B，其中B＝核苷酸碱基)已被合成，并结合到寡核苷酸和寡核苷酸类 似物中以及测试了它们杂交和其它性质。
双环[3.3.0]核苷(bcDNA)与另外的C-3′，C-5′-桥亚乙基-桥(A和B) 已由全部5个核苷酸碱基(G、A、T、C和U)合成，其中(C)仅由T和 A核苷酸碱基合成(M.Tarkoy，M.Bolli，B.Schweizer和C.Leumann， Helv.Chim.Acta，1993，76，481；Tarkoy和C.Leumann，Angew.Chem.， Int.Ed.Engl.，1993，32，1432；M.Egli，P.Lubini，M.Dobler和C. Leumann，J.Am.Chem.Soc.，1993，115，5855；M.Tarkoy，M.Bolli和C. Leumann，Helv.Chim.Acta，1994，77，716；M.Bolli和C.Leumann， Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.，1995，34，694；M.Bolli，P.Lubini和C. Leumann，Helv.Chim.Acta，1995，78，2077；J.C.Litten，C.Epple和C. Leumann，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1995，5，1231；J.C.Litten和C. Leumann，Helv.Chim.Acta，1996，79，1129；M.Bolli，J.C.Litten，R schultz和C.Leumann，Chem.Biol.，1996，3，197；M.Bolli，H.U.Trafelet 和C.Leumann，核苷酸研究，1996，24，4660)。含有几个这些类似物或 完全由这些类似物组成的DNA寡核苷酸在大多数情况下能与互补的 DNA和RNA寡核苷酸形成沃森-克里克键合的双链体。然而，生成的 双链体的耐热性明显偏低(C)，中等程度偏低(A)或是与天然DNA和 RNA配对物的稳定性是可资比较的(B)。与天然配对物相比，所有 bcDNA寡聚物显示出对杂交介质离子强度的灵敏性的明显增加。α- 双环-DNA(B)对3′-氧代核酸酶蛇毒磷酸二酯酶比β-双环-DNA(A)更 稳定，后者仅比未修饰的寡核苷酸较稳定。
在环戊烷环上具有另外的C-1′、C-6′-或C-6′、C-4′-亚甲基桥(分别 为D和E)的双碳环[3.1.0]核苷可由全部5个核苷酸碱基(T、A、G、C 和U)合成。然而，只有T-类似物结合到寡聚物中。将1个或10个单 体D结合于混合的聚-嘧啶DNA寡核苷酸与未修饰的对照寡核苷酸相 比较其导致对DNA和RNA两者寡核苷酸的亲和力基本上降低。此降 低在使用ssDNA时比用ssRNA更为明显。一种单体E结合于两种不 同的聚-嘧啶DNA寡核苷酸引起对ssRNA的双链体在0.8℃和2.1℃的 Tm′s的中等程度的增加(与未修饰的对照双链体比较)。当10个T-类似 物结合到只含有硫代磷酸酯核苷间键合的15聚体寡核苷酸中时，互补 RNA寡核苷酸的Tm与相同的未修饰硫代磷酸酯序列比较，每一修饰 增加约1.3℃。与对照序列相反，含有双环核苷E的寡核苷酸不能介导 RNAseH的裂解。含有E的G、A、C和U-类似物的寡核苷酸的杂交 特性尚未报道。而且，该类似物的化学并不有助于对完全修饰的寡核 苷酸的进一步深入研究(K.-H.Altmann，R.Kesselring，E.Francotte和G. Rihs，Tetrahedron Lett.，1994，35，2331；K.-H.Altmann，R.Imwinkelried， R.Kesselring和G.Rihs.Tetrahedron Lett.，1994，35，7625；V.E. Marquez，M.A.Siddiqui，A.Ezzitouni，P.Russ，J.Wang，R.W.Wagner 和M.D.Matteucci，J.Med.Chem.，1996，39，3739；A.Ezzitouni和V.E. Marquez，J.Chem.Soc.Perkin Trans.1，1997，1073)。
含有另外的C-2′，C-3′-dioxalane环的双环[3.3.0]核苷已被合成为具 有未修饰核苷的二聚体，其中所述另外的环为取代天然磷酸二酯键合 (F)的核苷间键合部分。该类似物仅合成为胸腺嘧啶-胸腺嘧啶或胸腺嘧 啶-5-甲基胞嘧啶区。含有7个这些二聚体区并且具有交替的磷酸二酯 键合和核糖乙缩醛键合的15-聚体聚嘧啶序列与只具有天然磷酸二酯 核苷间键合的对照序列相比较，显示出对互补ssRNA的一种明显降低 的Tm(R.J.Jones，S.Swaminathan，J.F.Millagan，S.Wadwani，B.S. Froehler和M.Matteucci，J.Am.Chem.Soc.，1993，115，9816)。
具有另外的在乙缩醛类型核苷间键合中形成双环[4.3.0]-体系C- 2′，C-3′-二氧六环的两个二聚体(G和H)已被合成为T-T二聚体并一次 结合到12聚体聚嘧啶寡核苷酸的中部。与未修饰的对照寡核苷酸相比 较，含有G或者H的寡核苷酸均与互补ssRNA和ssDNA形成明显的 不太稳定的双链体(J.Wang和M.D.Matteucci，Bioorg.Med.Chem. Lett.，1997，7，229)。
含有具有作为酰胺和磺酰胺类型(I和J)核苷间键合部分的C- 2′，C-3′-亚甲基桥的双环[3.1.0]核苷二聚体已被合成并结合到寡核苷酸 中。含有一个或多个这些类似物的寡核苷酸与未修饰的天然寡核苷酸 参照物相比较，显示其Tm明显减少(C.G.Yannopoulus，W.Q.Zhou，P. Nower，D.Peoch，Y.S.Sanghvi和G.Just，Synlett，1997，378)。
具有甲缩醛(formacetal)核苷间键合和在(K)中间的双环[3.3.0]葡 萄糖衍生的核苷类似物的三聚体已被合成并连接到一个核苷酸的3′- 端。互补ssRNA的Tm与对照序列相比较降低了4℃，与在3′-端含有 2′，5′-甲缩醛键合的序列相比较降低了1.5℃(C.G.Yannopoulus，W.Q. Zhou，P.Nower，D.Peoch，Y.S.Sanghvi和G.Just，Synlett，1997，378)。
最近已报道由三环核苷类似物(L)组成的寡聚体与天然DNA相比 较，显示出增加的双链体稳定性(R.Steffens和C.Leumann(Poster SB-B4)，Chimia，1997，51，436)。
具有另外的C-2′，C-3′-连接的6元环(M和N)或5元环(O)的三个双 环([4.3.0]和[3.3.0])核苷已被合成为T-类似物。所述双环核苷M和N 已被一次和两次结合到14-聚体寡-T序列中。互补ssRNA的Tm值和 ssDNA的Tm′值，与未修饰的对照序列相比较每一修饰降低了6-10℃。 与对照DNA寡核苷酸比较，类似物O的全修饰的寡核苷酸对互补 RNA寡核苷酸的Tm显示出每一修饰增加约1.0℃。而且，所述全修饰 序列对蛇毒磷酸二酯酶的水解作用与未修饰的对照序列相比基本上是 更稳定的。然而，其中结合了多达4个类似物O的部分修饰的寡核苷 酸比相应的未修饰的寡核苷酸的耐热性低。对互补DNA寡核苷酸与 未修饰的寡核苷酸比较所有含类似物O的(完全的和部分修饰的)寡核 苷酸显示出基本上降低的耐热性(P.Nielsen，H.M.Pfundheller，J. Wengel，Chem.Commun.，1997，826；P.Nielsen，H.M.Pfundheller，J. Wengel，Xll International Roundtable：核苷、核苷酸及其生物学应用；La Jolla，Califomia，1996年9月15-19日，Poster PPI 43)。
由原料4′-C-羟甲基核苷P制备拟含有另外的O-2′，C-4′-5元环的 双环尿嘧啶核苷类似物Q的尝试失败了(K.D.Nielsen，Specialerapport (Odense University，Denmark)，1995)。
直到目前，寻找用于形成具有明显改善的杂交特性的合成寡核苷 酸的构象受限的核苷几乎未获得任何成功。在大多数情况下，与未修 饰的寡核苷酸相比较，含有这些类似物的寡核苷酸与互补核酸形成较 低稳定性的双链体。在其它的情况下，观察到双链体的中等程度改善， 这仅仅与DNA或RNA靶有关，或者它与完全(但并非部分)修饰的寡 核苷酸有关或者反之亦然。对大多数报道的类似物的评价因缺乏具有 G、A和C核苷酸碱基的类似物的资料和缺乏指明杂交特异性和方式 的资料而变得更加复杂。在许多情况下，所报道的单体类似物的合成 是非常复杂的，而在其它情况下，全修饰的寡核苷酸的合成是与广泛 使用的亚磷酰胺的化学标准不相容的。
发明概述
有鉴于先前已知的核苷类似物的缺点，本发明者现已提供新的核 苷类似物(LNA)并且在此寡核苷酸已包括了LNA核苷类似物。已提供 具有所有常用核苷酸碱基的新的LNA核苷类似物，由此提供结合于寡 核苷酸的一整套核苷类似物。从下面明显得知，LNA核苷类似物和 LNA修饰的寡核苷酸提供广泛范围的用于诊断学和治疗学领域的寡 核苷酸的改进。此外，LNA核苷类似物和LNA修饰的寡核苷酸还提 供了基于核苷和寡核苷酸的诊断学和治疗学的全新观点。
因此，本发明涉及含有至少一个通式I的核苷类似物(此后称为 “LNA”)的寡聚体及其碱性盐和酸加成盐

其中X选自-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-、-O-C(R7R7*)-、-C(R6R6*)-O-、 -S-C(R7R7*)-、-C(R6R6*)-S-、-N(RN*)-C(R7R7*)-、-C(R6R6*)-N(RN*)-和 -C(R6R6*)-C(R7R7*)-；
B选自氢、羟基、任选取代的C1-4-烷氧基、任选取代的C1-4-烷基、任 选取代的C1-4-酰氧基、核苷酸碱基、DNA嵌入剂、光化学活性基团、 热化学活性基团、螯合基团、报道基团和配体；
P指明核苷间键合于后面单体的基团位置，或5′-端基，这样的核苷间 键合或5′-端基任选包括取代基R5；
取代基R2、R2*、R3和R3*之一为基团P*，它表示连接于前面的单体的 核苷间键合，或3′-端基；
选自R1*、R4*、R5、R5*、R6、R6*、R7、R7*、RN*的一对或两对非孪位 取代基以及不为P*的取代基R2、R2*、R3和R3*中，每一个均表示由1-8 个选自下列基团/原子组成的双基：-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Ra)-、 -C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、-S-、-SO2-、-N(Ra)-和＞C＝Z，其中Z选自 -O-、-S-和-N(Ra)-，并且Ra和Rb各自独立选自氢、任选取代的C1-12- 烷基、任选取代的C2-12-链烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12- 烷氧基、C2-12-链烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、 甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基 -羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、一-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基 甲酰基、一-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、一- 和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、 C1-6-链烷酰基氧基、sulphono、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫 烷基、C1-6-烷基硫代、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学 活性基团、螯合基团、报道基团和配体，其中芳基和杂芳基可任选被 取代，其中两个孪位取代基Ra和Rb一起可表示任选取代的亚甲基 (＝CH2)，而其中选自Ra和Rb的两个非孪位或孪位取代基以及存在的 且不涉及P、P*或双基的取代基R1*、R2、R2*、R3、R3*、R4*、R5、R5*、 R6和R6*、R7和R7*可一起形成选自如前定义的同类双基的有关双基； 所述成对的非孪位取代基与(i)所述非-孪位取代基连接的原子和(ii)与 任何插入原子(interventing atoms)一起由此形成一-或二环实体；并且 存在的且不涉及P、P*或双基的取代基R1*、R2、R2*、R3、R4*、R5、 R5*、R6和R6*、R7和R7*每一个独立选自氢、任选取代的C1-12-烷基、 任选取代的C2-12-链烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、 C2-12-链烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、 芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、 杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、一-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、 一-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、一-和二(C1-6 -烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-链烷 酰基氧基、sulphono、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、 C1-6-烷基硫代、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基 团、螯合基团、报道基团和配体，其中芳基和杂芳基可任选被取代， 并且其中两个孪位取代基可一起表示氧代、硫代、亚氨基或任选取代 的亚甲基，或可一起可形成任选被一个或多个选自-O-、-S-和-(NRN)-的杂原子/基团间断和/或终止的由1-5个碳原子亚烷基链组成的螺环 双基，其中RN选自氢和C1-4-烷基，其中两个相邻(非孪位)的取代基可 以表示产生双键的另一个键；RN*(如果存在则与双基无关)选自氢和 C1-4-烷基；
前提是，
(i)当LNA为二环核苷类似物时，R2和R3不能共同表示选自-O-CH2-CH2-和-O-CH2-CH2-CH2-的双基；
(ii)当LNA为二环核苷类似物时，R3和R5不能共同表示选自-CH2-CH2-和-O-CH2-的双基；
(iii)当LNA为三环核苷类似物时，R3、R5和R5*不能共同表示 -CH2-CH(-)-CH2-的三基；
(iv)当LNA为二环核苷类似物时，R1*和R6*不能共同表示-CH2-的双 基；和
(v)当LNA为二环核苷类似物时，R4*和R6*不能共同表示-CH2-的双 基。
此外，本发明还涉及通式II的核苷类似物(此后称为LNA)及其碱 性盐和酸加成盐

其中取代基B选自核苷酸碱基、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化 学活性基团、螯合基团、报道基团和配体；
X选自-O-、-S-、-N(RN*)-和-C(R6R6*)-；
取代基R2、R2*、R3和R3*之一为基团Q*；
Q和Q*各自独立选自氢、叠氮基、卤素、氰基、硝基、羟基、Prot-O-、 Act-O-、巯基、Prot-S-、Act-S-、C1-6-烷基硫代、氨基、Prot-N(RH)-、 Act-N(RH)-、一-或二(C1-6-烷基)氨基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取 代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-链烯基、任选取代的C2-6-链烯基氧基、 任选取代的C2-6-炔基、任选取代的C2-6-炔基氧基、一磷酸盐、二磷酸 盐、三磷酸盐、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯 合基团、报道基团和配体、羧基、sulphono、羟甲基、Prot-O-CH2-、 Act-O-CH2-、氨基甲基、Prot-N(RH)-CH2-、Act-N(RH)-CH2-、羧甲基、 sulphono甲基，其中Prot是分别对-OH、-SH和-NH(RH)的保护基团， Act是分别对-OH、-SH和-NH(RH)的活化基团，并且RH选自氢和C1-6 -烷基；
(i)R2*和R4*共同表示选自下列的双基：-O-、-(CR*R*)r+s+1-、-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-、 -O-(CR*R*)r+s-O-、-S-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-S-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-S-(CR*R*)r+s-S-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-N(R*)-、 -N(R*)-(CR*R*)r+s-S-和-S-(CR*R*)r+s-N(R*)-；
(ii)R2和R3共同表示选自-O-、-(CR*R*)r+s-、-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、 -(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；
(iii)R2*和R3共同表示选自-O-、-(CR*R*)r+s-、-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、 -(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；
(iv)R3和R4*共同表示选自-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；
(v)R3和R5共同表示选自-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；或
(vi)R1*和R4*共同表示选自-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；
(vii)R1*和R2*共同表示选自-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；
其中每个R*独立选自氢、卤素、叠氮基、氰基、硝基、羟基、巯基、 氨基、一-或二(C1-6-烷基)氨基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取代的 C1-6-烷基、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基 团、报道基团和配体，和/或两个相邻(非孪位)的R*可以共同表示双键， 并且r和s各自为0-3，前提是r+s之和为1-4；
每一个取代基R1*、R2、R2*、R3、R4*、R5和R5*(不涉及Q、Q*或双基) 独立选自氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-链烯基、任选 取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-链烯基氧基、羧基、C1-12- 烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、 芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、 一-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、一-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、 氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、一-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰 基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-链烷酰基氧基、sulphono、C1-6- 烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷基硫代、卤素、DNA 嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基团和 配体，其中芳基和杂芳基可任选被取代，并且其中两个孪位取代基可 一起表示氧代、硫代、亚氨基或任选取代的亚甲基，或可一起形成任 选被一个或多个选自-O-、-S-及-(NRN)-的杂原子/基团间断和/或终止的 由1-5个碳原子亚烷基链组成的螺环双基，其中RN选自氢和C1-4-烷 基，并且其中两个相邻(非孪位)的取代基可以表示产生双键的另一个 键；并且RN*(如果存在且不涉及双基)选自氢和C1-4-烷基；
第一个前提是，
(i)R2和R3不能共同表示选自-O-CH2-CH2-和-O-CH2-CH2-CH2-的双 基；和
(ii)R3和R5不能共同表示选自-CH2-CH2-、-O-CH2-和 -O-Si(iPr)2-O-Si(iPr)2-O-的双基；
第二个前提是在寡核苷酸合成中普遍采用的条件下为反应性的任何化 学基团(包括核苷酸碱基)是任选被保护的官能团。
本发明还涉及所述核苷类似物(LNA)在寡聚体的制备中的用途和 所述寡聚体以及核苷类似物(LNA)在诊断学、分子生物学研究和治疗 中的用途。
图的简述
图1A和1B说明已知的构象受限制的核苷酸。
图2说明本发明的核苷酸/核苷类似物。
图3说明在序列特异性捕获的PCR扩增子中的LNA修饰的寡核 苷酸的性能。
图4A和4B说明LNA修饰的寡核苷酸能够通过链侵入捕获其同 源PCR扩增子。
图5说明固定于固体表面的LNA修饰的寡核苷酸在序列特异性 捕获的PCR扩增子中能有效起作用。
图6说明LNA修饰的寡核苷酸能作为T4聚核苷酸激酶的底物起 作用。
图7说明LNA修饰的寡核苷酸能作为核酸聚合酶的引物起作 用。
图8说明LNA修饰的寡核苷酸可作为靶扩增过程的引物起作 用。
图9说明携带5′蒽醌的LNA修饰的寡核苷酸通过放射可以共价 的方式固定于固体载体上且所述固定的寡聚体在互补DNA寡聚物的 捕获中是有效的。
图10说明LNA-胸苷-5′-三磷酸(LNA-TTP)可以作为末端脱氧核 糖核酸转移酶(TdT)的底物起作用。
图11说明对具有不同排列的LNA修饰的Cy3-标记的8聚体的杂 交和检测。
图12和13说明对LNA修饰的Cy3-标记的8聚体排列的末端失 配的杂交和检测。
图14说明在清醒大鼠热水弹尾(tail flick)试验中由[D-Ala2]δ啡肽 LNA诱导的抗伤害感受的阻断。
图15A、15B和15C说明对At和所有LNA修饰的Cy3-标记的8 聚体排列的末端失配的杂交和检测。
图16和17说明LNA可传递至活的人MCF-7乳腺癌细胞中。
图18和19说明[α33P]ddNTP′s和ThermoSequenaseTM DNA聚合 酶对含有LNA T单体的DNA序列模板的用途。
图20和21说明无外切核酸酶的Klenow区段DNA聚合酶1可以 将LNA腺苷、胞嘧啶、鸟苷和尿苷-5′-三磷酸结合到DNA链中。
图22说明末端脱氧核糖核酸转移酶(TdT)对尾LNA修饰的寡核苷 酸的能力。
图23A和23B说明完全混合的LNA单体可用于显著增加在序列 特异性捕获的PCR扩增子中固定的生物素化-DNA寡聚物的性能。
图24-41说明本发明LNA单体可能的合成途径。
本发明详述
用于本文时，术语“LNA”(闭合的核苷类似物)意指或者与本发 明寡聚体(通式I)结合，或者为分离的化学种类(通式II)的本发明二环 和三环核苷类似物。术语“单体LNA”特指后一情况。
寡聚体和核苷类似物
如上所述，本发明特别涉及由一个或多个二环-、三环或多环核苷 类似物(以下称作“LNA”)组成的新的寡聚体(寡核苷酸)。已发现将这 样的LNA掺入以代替已知的核苷，或者作为已知核苷的补充物赋予了 寡核苷酸重要的和极其有用的性质。在本发明范围内，二环和三环(尤 其是二环)LNA似乎是特别重要的。
每个掺入寡聚体(寡核苷酸)的可能的LNA具有通式I

其中X选自-O-(呋喃糖基元)、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-、-O-C(R7R7*)-、 -C(R6R6*)-O-、-S-C(R7R7*)-、-C(R6R6*)-S-、-N(RN*)-C(R7R7*)-、 -C(R6R6*)-N(RN*)-和-C(R6R6*)-C(R7R7*)-，其中R6、R6*、R7、R7*、RN* 如在下文进一步定义。因此，掺入到寡聚体中的所述LNA可以包含作 为二环-、三环或多环结构基本部分的5-元环或者6-元环。确信5-元环 (X＝-O-、-S-、-N(RN*)-、-C(R6R6*)-)是特别重要的，其原因在于它们 能够如同天然产生的核苷的母体(native)呋喃糖环一样，基本占据相同 的构象(但通过引入一个或多个双基而闭合(见下文))。在可能的5-元环 中，其中X表示-O-、-S-和-N(RN*)-的情形似乎是特别重要的，其中X 为-O-的情形似乎是尤其重要的。
当寡聚体与DNA或RNA复合时，取代基B可以表示能与DNA 或RNA，尤其是DNA或RNA的核苷酸碱基相互作用(如通过氢键或 共价键或电子相互作用)的基团。或者取代基B可以表示作为标记或报 道起作用的基团，或者取代基B可以表示期望与DNA或RNA只有很 少的或没有相互作用的基团(如氢)。因此，取代基B优选选自氢、羟 基、任选取代的C1-4-烷氧基、任选取代的C1-4-烷基、任选取代的C1-4 -酰氧基、核苷酸碱基、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性 基团、螯合基团、报道基团和配体。
在本文中，术语“核苷酸碱基”包括天然存在的核苷酸碱基以及 非天然存在的核苷酸碱基。这对本领域技术人员来说应该是很明显 的，即以前认为是“非天然存在的”各种核苷酸碱基后来在自然界均 已发现。因而，“核苷酸碱基”不仅包括已知的嘌呤和嘧啶杂环，而 且还包括其杂环类似物和互变异构体。核苷酸碱基的示范性例子有腺 嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、嘌呤、黄嘌呤、二氨基 嘌呤、8-氧代-N6-甲基腺嘌呤、7-二氮杂黄嘌呤、7-二氮杂鸟嘌呤、N4， N4-桥亚乙基胞嘧啶、N6，N6-桥亚乙基-2，6-二氨基嘌呤、5-甲基胞嘧啶、 5-(C3-C6)-炔基胞嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、假异胞嘧啶、2-羟基 -5-甲基-4-三唑吡啶、异胞嘧啶、异鸟嘌呤、肌苷和描述于Benner等 的美国专利号5432272中的“非天然存在的”核苷酸碱基。术语“核 苷酸碱基”打算包括这些例子中的每一种和全部及其类似物和互变异 构体。特别重要的核苷酸碱基有腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶 和尿嘧啶，它们被认为是与人类治疗学和诊断学应用有关的天然存在 的核苷酸碱基。
当应用本文时，术语“DNA嵌入剂”意为可嵌入到DNA或RNA 螺旋、双链体或三链体内的基团。DNA嵌入剂的官能部分的例子有吖 啶、蒽、醌如蒽醌、吲哚、喹啉、异喹啉、二氢醌、蒽环、四环素、 亚甲蓝、anthracyclinone、补骨脂素、香豆素、乙锭卤化物、dynemicin、 金属配合物如1，10-二氮杂啡-铜、三(4，7-二苯基-1，10-二氮杂啡)铑-钴 -enediynes如calcheamicin、卟啉、远端酶素、纺锤菌素、紫罗碱、道 诺酶素。特别重要的例子有吖啶、醌如蒽醌、亚甲蓝、补骨脂素、香 豆素和乙锭卤化物。
在本文中，术语“光化学活性基团”包括能经受光辐射所致化学 反应的化合物。其官能基团的示范性例子有醌，尤其是6-甲基-1，4-萘 并醌、蒽醌、萘并醌和1，4-二甲基-蒽醌、diazirines、芳香叠氮化物、 二苯酮、补骨脂素、重氮化合物和diazirino化合物。
在本文中，术语“热化学活性基团”定义为能与其它基团经受热 化学诱导的共价键形成的官能团。热化学反应性基团官能部分的示范 性例子有羧酸、羧酸酯如活性酯、酰卤如酰氟、酰氯、酰溴和酰碘、 羧酸叠氮化物、羧酸酰肼、磺酸、磺酸酯、磺酸卤化物、氨基脲、硫 代氨基脲、醛、酮、伯醇、仲醇、叔醇、酚、烷基卤化物、硫醇、二 硫化物、伯胺、仲胺、叔胺、肼、环氧化物、顺丁烯二酰亚胺和硼酸 衍生物。
在本文中，术语“螯合基团”意为含有一个以上结合位点同时通 过一个以上的结合位点频繁结合于其它分子、原子或离子的分子。螯 合基团的官能部分的例子有亚氨基二乙酸、次氮基三乙酸、乙二胺、 四乙酸(EDTA)、氨基膦酸等。
在本文中，术语“报道基团”意指其本身为可检测的，或者为一 个检测系列的一部分的基团。报道基团的官能部分的例子有生物素、 地高辛配基、荧光基团(能够吸收电磁辐射，例如某种波长的光或X- 射线，以及随后再发射被吸收为长波辐射的能量的基团；示范性例子 为丹酰(5-二甲基氨基)-1-萘磺酰基)、DOXYL(N-氧基-4.4-二甲基噁唑 烷)、PROXYL(N-氧基-2，2，5，5-四甲基吡咯烷)、TEMPO(N-氧基- 2，2，6，6-四甲基哌啶)、二硝基苯基、吖啶、香豆素、Cy3和Cy5(Biological Detection Systems，Inc.公司的商标)、erytroxine、香豆基酸、7-羟基香 豆素、德克萨斯红、罗丹明、四甲基罗丹明、Rox、7-硝基苯并-2-氧 杂-1-二唑(NBD)、芘、荧光素、铕、钌、钐和其它稀土金属)、放射性 同位素标记物、化学发光标记物(在化学反应期间通过光的发射而可检 测的标记物)、自旋标记物(一种自由基(如取代的有机硝基氧)或其它的 结合于通过采用顺磁共振光谱可检测的生物分子的顺磁探剂(如 Cu2+、Mg2+))、酶(过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶和葡糖氧 化酶、抗原、抗体、半抗原(能与抗体结合，但其本身不激发免疫应答 基团，如肽和类固醇激素)、用于细胞膜渗透的载体系统如：脂肪酸残 基、类固醇部分(胆甾烯基)、维生素A、维生素D、维生素E、特异性 受体的叶酸肽、介导细胞内含物(endocytose)的基团、表皮生长因子 (EGF)、缓激肽和血小板源生长因子(PDGF)。特别重要的例子有生物 素、荧光素、德克萨斯红、罗丹明、二硝基苯基、地高辛配基、钌、 铕、Cy5、Cy3等。
在本文中，“配体”意为结合的某种物质。配体可含有官能基团， 例如：芳族基团(如苯、吡啶、萘、蒽和菲)、杂芳族基团(如噻吩、呋 喃、四氢呋喃、哌啶、二氧六环和嘧啶)、羧酸、羧酸酯、酰卤羧酸叠 氮化物、羧酸酰肼、磺酸、磺酸酯、磺酸卤化物、氨基脲、硫代氨基 脲、醛、酮、伯醇、仲醇、叔醇、酚、烷基卤化物、硫醇、二硫化物、 伯胺、仲胺、叔胺、肼、环氧化物、顺丁烯二酰亚胺、任选被一个或 多个杂原子如氧原子、氮原子和/或硫原子间断或终止的C1-C20烷基， 任选含有芳族或单/多不饱和烃、聚氧乙烯如聚乙二醇、寡/聚酰胺如聚 -β-丙氨酸、聚甘氨酸、聚赖氨酸、肽、寡/多糖、寡/多磷酸、毒素、 抗体、细胞毒素和胆固醇，还含有“亲和配体”，即对特殊蛋白、抗 体、多-和寡糖上面的位点具有特异性亲和力的官能团或生物分子以及 其它生物分子。
上述特殊的例子在DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性 基团、螯合基团、报道基团和配体情况下与正在讨论的基团的“活性/ 官能”部分相符，这对本领域技术人员来说应是清楚的。对本领域技 术人员来说，DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合 基团、报道基团和配体通常以形式M-K-表示，其中M为正在讨论的 基团的“活性/官能”部分而K为间隔区，“活性/官能”部分通过间 隔区连接于5-或6-元环上，这对本领域技术人员来说也是清楚的。因 此，应该理解，基团B(其中B选自DNA嵌入剂、光化学活性基团、 热化学活性基团、螯合基团、报道基团和配体情况下)具有形式M-K-， 其中M分别为DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯 合基团、报道基团和配体的“活性/官能”部分，而K为5-或6-元环 和所述“活性/官能”部分之间含有1-50个原子，优选1-30个原子， 特别是1-15个原子的任选的间隔区。
在本文中，术语“间隔区”意指热化学和光化学非活性距离构成 基团(non-active distance-making group)并用于连接两个或多个上述定 义类型的不同部分。间隔区根据各种特征包括其疏水性、亲水性、分 子柔性和长度进行选择(如，参见Hermanson等，“Immobilized Affinity Ligand Techniques”，Academic Press，San Diego，Califomia(1992)，p. 137-ff)。一般来说，所述间隔区的长度小于或为约400，在一些应用 中，优选小于100。因此，所述间隔区含有任选由一个或多个杂原子 如氧原子、氮原子和/或硫原子间断或终止的碳原子链。因此，间隔区 K可含有一个或多个酰胺、酯、氨基、醚和/或硫醚官能度，并任选含 有芳族或单/多不饱和烃、聚氧乙烯如聚乙二醇、寡/聚酰胺如聚-β-丙 氨酸、聚甘氨酸、聚赖氨酸和肽(普遍)、寡糖、寡/多磷酸。而且，所 述间隔区可由其结合的单元组成。考虑到正在讨论的基团的“活性/官 能”相对于5-或6-元环所需的或必须的定位和空间取向，所述间隔区 的长度可以变化。在特别重要的实施方案中，所述间隔区包括化学可 裂解的基团。此类化学可裂解的基团包括在还原条件下可裂解的二硫 化物基团、肽酶可裂解的肽片段等。
在本发明的一个实施方案中，K表示使提及基团的“活性/官能” 部分直接连接5-或6-元环的一个单键。
在一个优选的实施方案中，在通式I和II中的取代基B优选选自 核苷酸碱基，特别是来自腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧 啶。
在本发明(式I)的寡聚体中，P表示核苷间键合连接于后面的单体 的基团位置，或5′-端基。前一种可能性适用于提及的LNA不是5′-末 端“单体”时，而后一种可能性适用于提及的LNA为5′-末端“单体” 时。应该理解(从下面核苷间键合和5′-端基的定义也是非常清楚的)， 此种核苷间键合或5′-端基可包括取代基R5(或同样适用的取代基 R5*)，由此形成基团P的双键。(5′-末端指对应于核苷中核糖部分5′碳 原子的位置。)
另一方面，对前面单体或3′-端基(P*)的核苷间键合可起始于取代 基R2、R2*、R3和R3*之一定义的位置，优选始于取代基R3和R3*之一 定义的位置。类似地，前一种可能性适用于提及的LNA不是3′-末端 “单体”时，而后一种可能性适用于提及的LNA为3′-末端“单体” 时。(3′-末端指对应于核苷中核糖部分3′碳原子的位置。)
在本文中，术语“单体”指天然存在的核苷、非天然存在的核苷、 PNAs等以及LNA。因此，术语“后面的单体”指5′-末端方向相邻的 单体，而“前面的单体”指3′-末端方向相邻的单体。这种后面的和前 面的单体(从LNA单体的位置可见)可以是天然存在的核苷、非天然存 在的核苷，甚至还可以是LNA单体。
结果，在本文中(由上述定义衍化而来)，术语“寡聚体”意指经 一个或多个LNA(s)的结合修饰的寡核苷酸。
本发明的至关重要的部分是存在与用通式I图示的5-或6-元环稠 合的一个或多个环。因此，选自存在的取代基R1*、R4*、R5、R5*、R6、 R6*、R7、R7*、RN*的一对或两对非孪位取代基及不表示P*的R2、R2*、 R3和R3*中，每一个均表示由1-8个，优选1-4个独立选自下列的基团 /原子组成的双基：-C(RaRb)-、-C(Ra)＝C(Ra)-、-C(Ra)＝N-、-O-、-Si(Ra)2-、 -S-、-SO2-、-N(Ra)-和＞C＝Z。(术语“存在的”指一些取代基，即R6、 R6*、R7、R7*、RN*的存在取决于X是否包括这样的取代基。)
在构成双基的基团中，Z选自-O-、-S-及-N(Ra)-，而Ra和Rb各自 独立选自氢、任选取代的C1-12-烷基、任选取代的C2-12-链烯基、任选 取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12-烷氧基、C2-12-链烯基氧基、羧基、C1-12- 烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、 芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基-羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、 一-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、一-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、 氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、一-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰 基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、C1-6-链烷酰基氧基、sulphono、C1-6- 烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫烷基、C1-6-烷基硫代、卤素、DNA 嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基团和 配体(其中后面的基团可包括如对取代基(B)定义的间隔区)，其中芳基 和杂芳基可任选被取代。而且，两个孪位取代基Ra和Rb一起可表示 任选取代的亚甲基(用对芳基定义的任选的取代基任选取代一次或两 次的＝CH2)，而选自Ra和Rb的两个非孪位或孪位取代基，以及可存在 的且不涉及P、P*或双基的R1*、R2、R2*、R3、R3*、R4*、R5、R5*、R6、 R6*、R7和R7*任何取代基可一起形成选自如上定义的同类双基的有关 双基。很明显，所述每一对的非孪位取代基与(i)所述非孪位取代基连 接的原子和(ii)与任何干涉原子一起由此形成一-或二环实体。
相信与5-或6-元环的环原子结合的双基是优选的，其中包括取代 基R5和R5*可引起与核苷间键合的不需要的空间相互作用。因此，分 别由一个或两个双基组成的一对或两对非孪位取代基选自R1*、R4*、 R6、R6*、R7、R7*、RN*存在的取代基是优选的，且R2、R2*、R3和R3* 中的取代基不表示P*。优选地结合于寡聚体中的LNA包括仅由一个 双基通过一对(两个)非孪位取代基组成。特别是，优选R3*表示P*和所 述双基在R2*和R4*或R2和R3之间形成。
这就是说，应该理解(尤其是考虑到已知的二-和三环核苷类似 物，参见“发明背景”部分)，本发明不涉及含有下列二-或三环核苷 类似物的寡聚体：
(i)当LNA为二环核苷类似物时，R2和R3共同表示选自-O-CH2-CH2-和-O-CH2-CH2-CH2-的双基；
(ii)当LNA为二环核苷类似物时，R3和R5共同表示选自-CH2-CH2-和 -O-CH2-的双基；
(iii)当LNA为三环核苷类似物时，R3、R5和R5*共同表示 -CH2-CH(-)-CH2-的三基；
(iv)当LNA为二环核苷类似物时，R1*和R6*共同表示-CH2-的双基； 或
(v)当LNA为二环核苷类似物时，R4*和R6*共同表示-CH2-的双基； 除非这样的二-或三环核苷类似物与一个或多个在此定义的新LNA结 合。
在本文中，即在本说明书和权利要求书中，所述双基的定向应该 如此以使左手侧表示具有最低数字的取代基，而右手侧表示具有最高 数字的取代基，因此，当R3和R5一起表示双基“-O-CH2-”时，应该 理解氧原子表示R3，因而该氧原子例如连接于R3位置，而亚甲基表示 R5。
根据本发明，考虑到结合于寡聚体的LNA(s)中双基结构的大量的 有意义的可能性，相信由成对的非孪位取代基组成的双基优选选自 -(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-Y-、-(CR*R*)r+s-Y-、 -Y-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r+s-、-Y-、-Y-Y-、其中每个Y独立选自 -O-、-S-、-Si(R*)2-、-N(R*)-、＞C＝O、-C(＝O)-N(R*)-和-N(R*)-C(＝O)-， 每个R*独立选自氢、卤素、叠氮基、氰基、硝基、羟基、巯基、氨基、 一-或二(C1-6-烷基)氨基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取代的C1-6-烷 基、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报 道基团和配体，和/或两个相邻(非孪位)的R*可以共同表示双键，r和s 各自为0-4，前提是r+s之和为1-5。特别重要的情形是其中每个双基 独立选自-Y-、-(CR*R*)r+s-、-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-和-Y-(CR*R*)r+s-Y-， 其中r和s各自为0-3，前提是r+s之和为1-4。
考虑到双基在LNA(s)中的定位，相信(根据初步结果(参见实施例)) 下列结构是特别重要的，即其中：R2*和R4*共同表示选自下列的双 基：-Y-、-(CR*R*)r+s+1-、-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-和-Y-(CR*R*)r+s-Y-；R2 和R3共同表示选自-Y-、-(CR*R*)r+s-、-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-和 -Y-(CR*R*)r+s-Y-的双基；R2*和R3共同表示选自-Y-、-(CR*R*)r+s-、 -(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-和-Y-(CR*R*)r+s-Y-的双基；R3和R4*共同表示选自 -Y-、(CR*R*)R+s-、-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-和-Y-(CR*R*)r+s-Y-的双基；R3 和R5共同表示选自-Y′-、-(CR*R*)r+s+1-、-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-和 -Y-(CR*R*)r+s-Y-的双基；R1*和R4*共同表示选自-Y′-、-(CR*R*)r+s+1-、 -(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-和-Y-(CR*R*)r+s-N(R*)-的双基；或其中R1*和R2* 共同表示选自-Y-、-(CR*R*)r+s-、-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-和-Y-(CR*R*)r+s-Y-的双基；其中r和s各自为0-3，前提是r+s之和为1-4，Y如上所 定义，其中Y′选自-NR*-C(＝O)-和-C(＝O)-NR*-。
特别重要的寡聚体是其中下列标准之一用于寡聚体中的至少一 个LNA的那些寡聚体：R2*和R4*共同表示选自下列的双基：-O-、-S-、 -N(R*)-、-(CR*R*)r+s+1-、-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-、 -(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-、-O-(CR*R*)r+s-O-、-S-(CR*R*)r+s-O-、 -O-(CR*R*)r+s-S-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-N(R*)-、 -S-(CR*R*)r+s-S-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-S-和 -S-(CR*R*)r+s-N(R*)-；R2和R3共同表示选自-O-、-(CR*R*)r+s-、-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基； R2*和R3共同表示选自-O-、-(CR*R*)r+s-、-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、 -(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；R3和R4*共同 表示选自-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和 -(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；R3和R5共同表示选自-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、 -(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；R1*和R4*共同 表示选自-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和 -(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；或者R1*和R2*共同表示选自-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；其 中r和s各自为0-3，前提是r+s之和为1-4，RH表示氢或C1-4-烷基。
也优选R*选自氢、羟基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取代的 C1-6-烷基、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合 基团、报道基团和配体，并且任何其余的取代基R*为氢。
在一个优选的实施方案中，在至少一个LNA的双基中的一个基 团R*选自DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基 团、报道基团和配体(其中后面的基团可包括如对取代基B定义的间隔 区)。
至于存在的且不涉及P、P*或双基的取代基R1*、R2、R2*、R3、 R4*、R5、R5*、R6和R6*、R7和R7*，其可独立选自氢、任选取代的C1-12- 烷基、任选取代的C2-12-链烯基、任选取代的C2-12-炔基、羟基、C1-12- 烷氧基、C2-12-链烯基氧基、羧基、C1-12-烷氧基羰基、C1-12-烷基羰基、 甲酰基、芳基、芳氧基-羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基 -羰基、杂芳氧基、杂芳基羰基、氨基、一-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基 甲酰基、一-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、一- 和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、 C1-6-链烷酰基氧基、sulphono、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、叠氮基、硫 烷基、C1-6-烷基硫代、卤素、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学 活性基团、螯合基团、报道基团和配体(其中后面的基团可包括如对取 代基B定义的间隔区)，其中芳基和杂芳基可任选被取代，其中两个孪 位取代基可一起表示氧代、硫代、亚氨基或任选取代的亚甲基，或可 一起形成任选被一个或多个选自-O-、-S-及-(NRN)-的杂原子/基团间断 和/或终止的由1-5个碳原子亚烷基链组成的螺双基，其中RN选自氢和 C1-4-烷基，其中两个相邻(非孪位)的取代基可以表示产生双键的另一个 键；而RN*(如果存在则与双基无关)选自氢和C1-4-烷基。
优选LNA(s)的每一个取代基R1*、R2、R2*、R3、R3*、R4*、R5、 R5*、R6、R6*、R7和R7*(存在且不涉及P、P*或双基的取代基)可独立 选自氢、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-链烯基、羟基、C1-6- 烷氧基、C2-6-链烯基氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲 酰基、氨基、一-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、一-和二(C1-6-烷基)- 氨基-羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、叠氮基、C1-6-链烷酰基氧基、 sulphono、硫烷基、C1-6-烷基硫代、DNA嵌入剂、光化学活性基团、 热化学活性基团、螯合基团、报道基团和配体及卤素，其中两个孪位 取代基可一起表示氧代，而RN*(如果存在且不涉及双基)选自氢和C1-4- 烷基。
在本发明的一个优选实施方案中，X选自-O-、-S-和-NRN*-，特别 是为-O-，每个LNA(s)的取代基R1*、R2、R2*、R3、R3*、R4*、R5、R5*、 R6、R6*、R7和R7*(如果存在且不涉及P、P*双基)表示氢。
在本发明的一个甚至更优选的实施方案中，结合到一个寡聚体中 LNA的R2*和R4*共同表示双基。优选X为O，R2选自氢、羟基和任 选取代的C1-6-烷氧基，而R1*、R3、R5和R5*表示氢，且更特别地，所 述双基选自-O-、-(CH2)0-1-O-(CH2)1-3-、-(CH2)0-1-S-(CH2)1-3-、 -(CH2)0-1-N(RN)-(CH2)1-3-和-(CH2)2-4-，特别是选自-O-CH2-、-S-CH2-和-N(RH)-CH2-。一般来说，根据到目前为止所得结果，优选R2*和R4*构成的双 基形成两个碳原子桥，即该双基形成一个具有呋喃糖环(X＝O)的5元 环。
在本发明的另一个实施方案中，结合到一个寡聚体中的LNA的 R2和R3共同表示双基。优选X为O，R2*选自氢、羟基和任选取代的 C1-6-烷氧基，R1*、R4*、R5和R5*表示氢，且更特别地，所述双基选自 -(CH2)0-1-O-(CH2)1-3-、-(CH2)0-1-S-(CH2)1-3-、-(CH2)0-1-N(RN)-(CH2)1-3-和 -(CH2)1-4-，特别是选自-O-CH2-、-S-CH2-和-N(RH)-CH2-。在后面的情 况下，氨基和硫代变量似乎是特别重要的。
在本发明的又一个实施方案中，结合到一个寡聚体中的LNA的 R2*和R3共同表示双基。优选X为O，R2选自氢、羟基和任选取代的 C1-6-烷氧基，R1*、R4*、R5和R5*表示氢，且更特别地，所述双基选自 -(CH2)0-1-O-(CH2)1-3-和-(CH2)2-4-。
在本发明的又一个实施方案中，结合到一个寡聚体中的LNA的 R3和R4*共同表示双基。优选X为O，R2*选自氢、羟基主任选取代的 C1-6-烷氧基，R1*、R2、R5和R5*表示氢，且更特别地，所述双基为 -(CH2)0-2-O-(CH2)0-2-。
在本发明的又一个实施方案中，结合到一个寡聚体中的LNA的 R3和R5*共同表示双基。优选X为O，R2*选自氢、羟基和任选取代的 C1-6-烷氧基，R1*、R2、R4和R5表示氢，且更特别地，所述双基选自 -O-(CHR*)2-3-和-(CHR*)1-3-O-(CHR*)0-3-。
在本发明的又一个实施方案中，结合到一个寡聚体中的LNA的 R1*和R4*共同表示双基。优选X为O，R2*选自氢、羟基和任选取代的 C1-6-烷氧基，R2、R3、R5和R5*表示氢，且更特别地，所述双基为 -(CH2)0-2-O-(CH2)0-2-。
在这些实施方案中，也优选结合到寡聚体中的至少一个LNA包 括选自腺嘌呤和鸟嘌呤的核苷酸碱基(取代基B)。特别是，优选具有结 合到那里的LNA的寡聚体包括至少一个选自胸腺嘧啶、尿嘧啶和胞嘧 啶的核苷酸碱基和至少一个选自腺嘌呤和鸟嘌呤的核苷酸碱基。对于 LNA单体，特别优选所述核苷酸碱基选自腺嘌呤和鸟嘌呤。
对于这些重要的实施方案，还优选LNA(s)具有通式Ia(见下文)。
在这些重要的不同实施方案中，寡核苷酸的所有单体均为LNA 单体。
从通式I(寡聚体中的LNA(s))(和通式II(单体的LNA)，见下文) 明显得知，根据取代基和可能的双基的性质(见下文)，在寡聚体中可 存在一个或多个不对称碳原子(和单体的LNA)。打算将根据本发明的 方法制备的寡聚体以及寡聚体本身包括在单独的单体区段及其混合物 (包括外消旋混合物)的任何和所有异构体存在所产生的所有立体异构 体。然而，当考虑5-或6-元环时，相信某些立体化学构型(例如下面的) 将是特别重要的，

其中波浪线表示从提及的两个取代基互变产生的两种非对映体的可 性。
一种特别重要的立体异构体的代表是其中LNA(s)具有下面通式 Ia的情形

也作为本发明的一个分开的重要方面是其中B为“α-构型”的式 Ia的变体。
在这些情况下，优选R3*也一般表示P*。
本发明的寡聚体一般包含1-10000个通式I(或更具体为通式Ia) 的LNA(s)和0-10000个选自天然存在的核苷和核苷类似物的核苷。核 苷数和LNA(s)数的总和至少为2，优选至少为3，特别是至少为5，尤 其是至少为7，例如在2-15000的范围内，优选在2-100的范围内，例 如3-100，特别是在2-50范围内，例如3-50或5-50或7-50。
优选至少一个LNA包含作为取代基B的核苷酸碱基。
在本文中，术语“核苷”指杂环碱基的糖苷。术语“核苷”从广 义上用来包括非天然存在的核苷、天然存在的核苷以及其它的核苷类 似物。核苷的示范性例子为含有核糖部分的核糖核苷以及含有脱氧核 糖部分的脱氧核糖核苷。至于这样的核苷的碱基，应该理解它们可以 是任何天然存在的碱基，例如，腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶 和尿嘧啶及其任何修饰的变体或任何可能的非天然碱。
当考虑到定义和已知的核苷(天然存在的和非天然存在的)和核苷 类似物(包括已知的二-和三环类似物)时，很明显，一个寡聚体可以包 含一个或多个LNA(s)(其可以是相同的或不同的，这两种情况涉及取 代基的选择和涉及双基的选择)和一个或多个核苷和/或核苷类似物。在 本文中，“寡核苷酸”指核苷通过核苷间键合连接的连续的链，然而， 应该理解，在一个寡聚体(寡核苷酸)的一个或多个核苷酸单元(单体) 中的核苷酸碱基可以用如上定义的取代基B修饰。
所述寡聚体可以是线性的、分支的或环状的。在分支的寡聚体的 情况下，分支点可以位于核苷内，核苷间键合内或在设计的实施方案 中的LNA中。相信在后一种情况中，取代基R2、R2*、R3、R3*可以表 示两个基团P*，每个P*表示连接于前面单体的核苷间键合，特别是， R2和R2*中之一表示P*和R3、R3*之一表示另一个P*。
如上所述，寡聚体的LNA(s)通过核苷间键合与其它单体连接。在 本文中，术语“核苷间键合”意指由2-4个，优选3个选自下列的基 团/原子组成的键：-CH2-、-O-、-S-、-NRH-、＞C＝O，＞NRH、＞C＝S， -Si(R”)2-、-SO-、-S(O)2-、-P(O)2-、-PO(BH)3-、-P(O，S)-、-P(S)2-、 -PO(R”)-、-PO(OCH3)-和-PO(NHRH)-，其中RH选自氢和C1-4-烷基， R”选自C1-6-烷基和苯基。此类核苷间键合的示范性例子为 -CH2-CH2-CH2-、-CH2-CO-CH2-、-CH2-CHOH-CH2-、-O-CH2-O-、-O-CH2-CH2-、-O-CH2-CH＝(当用作连接于后面的单体键合时包括R5)、-CH2-CH2-O-、-NRH-CH2-CH2-、-CH2-CH2-NRH-、-CH2-NRH-CH2-、 -O-CH2-CH2-NRH-、-NRH-CO-O-、-NRH-CO-NRH-、-NRH-CS-NRH-、 -NRH-C(＝-NRH)-NRH-、-NRH-CO-CH2-NRH-、-O-CO-O-、-O-CO-CH2-O-、-O-CH2-CO-O-、-CH2-CO-NRH-、-O-CO-NRH-、-NRH-CO-CH2-、 -O-CH2-CO-NRH-、-O-CH2-CH2-NRH-、-CH＝N-O-、-CH2-NRH-O-、 -CH2-O-N＝(当用作连接于后面单体的键合时包括R5)、-CH2-O-NRH-、 -CO-NRH-CH2-、-CH2-NRH-O-、-CH2-NRH-CO-、-O-NRH-CH2-、 -O-NRH-、-O-CH2-S-、-S-CH2-O-、-CH2-CH2-S-、-O-CH2-CH2-S-、 -S-CH2-CH＝(当用作连接于后面单体的键合时包括R5)、-S-CH2-CH2-、 -S-CH2-CH2-O-、-S-CH2-CH2-S-、-CH2-S-CH2-、-CH2-SO-CH2-、 -CH2-SO2-CH2-、-O-SO-O-、-O-S(O)2-O-、-O-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-NRH-、 -NRH-S(O)2-CH2-、-O-S(O)2-CH2-、-O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、 -O-P(S)2-O-、-S-P(O)2-O-、-S-P(O，S)-O-、-S-P(S)2-O-、-O-P(O)2-S-、 -O-P(O，S)-S-、-O-P(S)2-S-、-S-P(O)2-S-、-S-P(O，S)-S-、-S-P(S)2-S-、 -O-PO(R”)-O-、-O-PO(OCH3)-O-、-O-PO(O CH2CH3)-O-、 -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-、-O-PO(BH3)-O-、-O-PO(NHRN)-O-、-O-P(O)2-NRH-、 -NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-、-CH2-P(O)2-O-、-O-P(O)2-CH2-和-O-Si(R”)2-O-；其中-CH2-CO-NRH-、-CH2-NRH-O-、-S-CH2-O-、 -O-P(O)2-O-、-O-P(O，S)-O-、-O-P(S)2-O-、-NRH-P(O)2-O-、-O-P(O，NRH)-O-、-O-PO(R”)-O-、-O-PO(CH3)-O-和-O-PO(NHRN)-O-(其中 RH选自氢和C1-4-烷基，R”选自C1-6-烷基和苯基)是特别优选的。其它 的示范性例子在Mesmaeker等，Current Oponion in Structural Biology 1995，5，343-355中给出。所述核苷间键合左手侧结合于作为取代基P* 的5-或6-元环，而右手侧连接于前面单体的5′-位上。
从上述还可清楚地知道，在提及的LNA为5′-末端单体的情况下， 基团P也可以表示5′-端基。这样的5′-端基的例子有氢、羟基、任选取 代的C1-6-烷基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取代的C1-6-烷基羰基氧 基、任选取代的芳氧基、一磷酸盐、二磷酸盐、三磷酸盐和-W-A′， 其中W选自-O-、-S-和-N(RH)-，其中RH选自氢和C1-6-烷基，并且其 中A′选自DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基 团、报道基团和配体(其中后面的基团可包括如对取代基(B)定义的间 隔区)。
在本发明说明书和权利要求书中，术语“一磷酸盐”、“二磷酸 盐”和“三磷酸盐”分别指下式的基团：-O-P(O)2-O-、 -O-P(O)2-O-P(O)2-O-和-O-P(O)2-O-P(O)2-O-P(O)2-O-。
在特别重要的实施方案中，基团P表示选自一磷酸盐、二磷酸盐 和三磷酸盐的5′-端基。特别是三磷酸盐变体作为底物是重要的。
类似地，在提及的LNA为3′-末端单体的情况下，基团P*可以表 示3′-端基。这样的3′-端基的例子有氢、羟基、任选取代的C1-6-烷氧 基、任选取代的C1-6-烷基羰基氧基、任选取代的芳氧基和-W-A′，其 中W选自-O-、-S-和-N(RH)-，其中RH选自氢和C1-6-烷基，并且其中 A′选自DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、 报道基团和配体(其中后面的基团可包括如对取代基(B)定义的间隔 区)。
在本发明优选的实施方案中，所述寡聚体具有下式V：
G-[Nu-L]n(o)-{[LNA-L]m(q)-[Nu-L]n(q)}q-G*       V 其中
q是1-50；
每个n(o)，..，n(q)独立为0-10000；
每个m(l)，..，m(q)独立为1-10000；
前提是n(o)，..，n(q)和m(l)，..，m(q)的总和为2-15000；
G表示5′-端基；
每个Nu独立表示选自天然存在的核苷和核苷类似物的核苷；
每个LNA独立表示核苷类似物；
每个L独立表示在两个选自Nu和LNA基团之间的核苷间键合，或L 与G*一起表示3′-端基；并且每个LNA-L独立表示如上定义的通式I 或优选如上定义的通式Ia的核苷类似物。
在该实施方案中，本发明一般提供包括具有两种不同的核苷酸碱 基，特别是选自胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶的核苷酸碱基和选自腺嘌 呤和鸟嘌呤的核苷酸碱基的LNA的设计可能性。
在本发明的另一个实施方案中，所述寡聚体还包含下式的PNA 单-或寡聚体区段

其中B如同上面对式I的定义，AASC表示氢或氨基酸侧链，t是1-5 和W是1-50。
在本文中，术语“氨基酸侧链”指结合于α-氨基酸即相对于提及 的α-氨基酸而无甘氨酸部分(优选天然存在的或容易获得的α-氨基酸) 的α-原子的基团。示范性例子有氢(甘氨酸自身)、氘(氘化甘氨酸)、甲 基(丙氨酸)、氰基甲基(β-氰基-丙氨酸)、乙基、1-丙基(正缬氨酸)、2- 丙基(缬氨酸)、2-甲基-1-丙基(亮氨酸)、2-羟基-2-甲基-1-丙基(β-羟基- 亮氨酸)、1-丁基(正亮氨酸)、2-丁基(异亮氨酸)、甲基硫代乙基(蛋氨 酸)、苄基(苯丙氨酸)、对-氨基-苄基(对-氨基-苯丙氨酸)、对-碘代-苄 基(对-碘代-苯丙氨酸)、对-氟代-苄基(对-氟代-苯丙氨酸)、对-溴代-苄 基(对-溴代-苯丙氨酸)、对-氯代-苄基(对-氯代-苯丙氨酸)、对-硝基-苄 基(对-硝基-苯丙氨酸)、3-吡啶基甲基(β-(3-吡啶基)-丙氨酸)、3，5-二碘 代-4-羟基-苄基(3，5-二碘代-酪氨酸)、3，5-二溴代-4-羟基-苄基(3，5-二溴 代-酪氨酸)、3，5-二氯代-4-羟基-苄基(3，5-二氯代-酪氨酸)、3，5-二氟代 -4-羟基-苄基(3，5-二氟代-酪氨酸)、4-甲氧基-苄基(O-甲基-酪氨酸)、2- 萘基甲基(β-(2-萘基)-丙氨酸)、1-萘基甲基(β-(1-萘基)-丙氨酸)、3-吲哚 基甲基(色氨酸)、羟甲基(丝氨酸)、1-羟乙基(苏氨酸)、巯基甲基(半胱 氨酸)、2-巯基-2-丙基(青霉胺)、4-羟苄基(酪氨酸)、氨基羰基甲基(天 冬酰胺)、2-氨基羰基乙基(谷氨酰胺)、羧甲基(天冬氨酸)、2-羧乙基(谷 氨酸)、氨基甲基(α，β-二氨基丙酸)、2-氨基乙基(α，γ-二氨基丁酸)、3- 氨基-丙基(鸟氨酸)、4-氨基-1-丁基(赖氨酸)、3-胍基-1-丙基(精氨酸) 和4-咪唑基甲基(组氨酸)。
PNA单-或寡聚体区段可以结合于如EP 0672677 A2所述的寡聚 体中。
本发明的寡聚体也意欲包括嵌合寡聚体。“嵌合寡聚体”意指具 有直接或通过间隔区连接的不同来源的单体的两个或多个寡聚体。此 类可结合的寡聚体的示范性例子为肽、PNA-寡聚体、含有LNA′s的寡 聚体和寡核苷酸寡聚体。
除了如上定义的寡聚体外，本发明还提供例如用于在寡聚体的制 备中作为底物(例如核酸聚合酶、多核苷酸激酶、末端转移酶)和用作 治疗药物(见下述)的单体LNA。所述单体LNA在整体结构上(特别是 对于可能的双基)与作为寡聚体成分所定义的LNA相符，然而至于基 团P和P*，所述单体LNA如下面将要解释的那样稍有不同。而且， 所述单体LNA可以包含官能团的保护基团，特别是在所述单体LNA 经化学合成结合到寡聚体的情况下。
所述可能的单体LNA的一个重要的亚基包含通式II的二环核苷 类似物(LNA)

其中取代基B选自核苷酸碱基、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化 学活性基团、螯合基团、报道基团和配体；X选自-O-、-S-、-N(RN*)-和-C(R6R6*)-，优选选自-O-、-S-和-N(RN*)-；取代基R2、R2*、R3和R3* 之一为基团Q*；
Q和Q*各自独立选自氢、叠氮基、卤素、氰基、硝基、羟基、Prot-O-、 Act-O-、巯基、Prot-S-、Act-S-、C1-6-烷基硫代、氨基、Prot-N(RH)-、 Act-N(RH)-、一-或二(C1-6-烷基)氨基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取 代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-链烯基、任选取代的C2-6-链烯基氧基、 任选取代的C2-6-炔基、任选取代的C2-6-炔基氧基、一磷酸盐、二磷酸 盐、三磷酸盐、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯 合基团、报道基团和配体、羧基、sulphono、羟甲基、Prot-O-CH2-、 Act-O-CH2-、氨基甲基、Prot-N(RH)-CH2-、Act-N(RH)-CH2-、羧甲基、 sulphono甲基，其中Prot分别是-OH、-SH和-NH(RH)的保护基团，Act 分别是-OH、-SH和-NH(RH)的活化基团，并且RH选自氢和C1-6-烷基； R2*和R4*共同表示选自下列的双基：-O-、-S-、-N(R*)-、-(CR*R*)r+s+1-、 -(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-、-O-(CR*R*)r+s-O-、-S-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-S-、 -N(R*)-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-S-(CR*R*)r+s-S-、 -N(R*)-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-S-和-S-(CR*R*)r+s-N(R*)-；R2和R3 共同表示选自-O-、-(CR*R*)r+s-、-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、 -(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；R2*和R3共同表示选自 -O-、-(CR*R*)r+s-、-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和 -(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；R3和R4*共同表示选自 -(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；R3 和R5共同表示选自-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和 -(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；R1*和R4*共同表示选自 -(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；或 者R1*和R2*共同表示选自-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-和-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-的双基；其中R*如同上面对寡聚体的定 义；取代基R1*、R2、R2*、R3、R4*、R5和R5*(不涉及Q、Q*或双基) 各自如同上面对寡聚体的定义；
还应该理解，出于对已知的二环核苷类似物的考虑，R2和R3不 能共同表示选自-O-CH2-CH2-和-O-CH2-CH2-CH2-的双基；R3和R5不能 共同表示选自-CH2-CH2-、-O-CH2-和-O-Si(iPr)2-O-Si(iPr)2-O-的双基。
所述单体LNA还包括其碱性盐和酸加成盐。而且，应该理解， 在化学的寡核苷酸合成中普遍采用的条件下为反应性的任何化学基团 (包括核苷酸碱基)是该领域已知的任选被保护的官能基团。这意味着 单体LNA的基团如羟基、氨基、羧基、sulphono、巯基以及核苷酸碱 基是任选被保护的官能基团。保护(和去保护)通过本领域技术人员已 知的方法进行(参见例如Greene，T.W和Wutz，P.G.M.，“Protective Groups in Organic Synthesis”，第二版，John Wiley，N.Y.(1991)，和M.J. Gait，寡聚物nucleotide Synthesis，IRL Press，1984)。
羟基保护基团的示范性例子为任选取代的三苯甲基例如4，4′-二甲 氧基三苯甲基(DMT)、4-一甲氧基三苯甲基(MMT)和三苯甲基，任选 取代的9-(9-苯基)呫吨基(pixyl)、任选取代的乙氧基羰基氧基、对-苯 基苯偶氮基氧基羰基氧基、四氢吡喃基(thp)、9-芴基甲氧基羰基 (Fmoc)、甲氧基四氢吡喃基(mthp)、甲硅烷基氧基如三甲基甲硅烷基 (TMS)、三异丙基甲硅烷基(TIPS)、叔丁基二甲基甲硅烷基(TBDMS)、 三乙基甲硅烷基和苯基二甲基甲硅烷基，苄氧基羰基或取代的苄氧基 羰基醚如2-溴苄氧基羰基、叔丁基醚、烷基醚如甲基醚，缩醛(包括两 个羟基)、酰氧基如乙酰基或卤素取代的乙酰基，如氯代乙酰基或氟代 乙酰基、异丁酰基、新戊酰基、苯甲酰基和取代的苯甲酰基、甲氧基 甲基(MOM)、苄基醚或取代的苄基醚如2，6-二氯代苄基(2，6-Cl2Bzl)。 或者，所述羟基可以任选通过键连接于固体载体上而加以保护。
氨基保护基团的示范性例子有Fmoc(芴基甲氧基羰基)、BOC(叔 丁氧基羰基)、三氟乙酰基、烯丙氧基羰基(alloc，AOC)、苄氧基羰基 (Z，Cbz)、取代的苄氧基羰基如2-氯苄氧基羰基((2-CIZ)，一甲氧基三苯 甲基(MMT)、二甲氧基三苯甲基(DMT)、邻苯二甲酰基和9-(9-苯基) 呫吨基(pixyl)。
羧基保护基团的示范性例子有烯丙基酯、甲酯、乙酯、2-氰基乙 酯、三甲基硅烷基乙酯、苄酯(Obzl)、2-金刚烷基酯(O-2-Ada)、环己 基酯(OcHex)、1，3-噁唑啉、噁唑、1，3-噁唑烷、酰胺或酰肼。
巯基保护基团的示范性例子有三苯甲基(Trt)、乙酰胺基甲基 (acm)、三甲基乙酰胺基甲基(Tacm)、2，4，6-三甲氧基苄基(Tmob)、叔 丁基亚磺酰基(StBu)、9-芴基甲基(Fm)、3-硝基-2-吡啶亚磺酰基(Npys) 和4-甲基苄基(Meb)。
而且，保护包括在单体LNA中的任何核苷酸碱基可以是必要的 或需要的，尤其是所述单体LNA被结合于本发明的寡聚体中时更是如 此。在本文中，术语“保护的核苷酸碱基”意指提及的核苷酸碱基具 有选自本领域技术人员所熟知的基团中的保护基团(参见例如， Protocols for寡核苷酸and Analogs，第20卷，(Sudhir Agrawal编辑)， Humana Press，1993，Totowa，NJ；S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedron， 1993，49，6123；S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedron，1992，48，2223； 和E.Uhlmann和A.Peyman，Chem.Rev.，90，543.)。实范性例子有苯甲 酰基、异丁酰基、叔丁基、叔丁氧基羰基、4-氯-苄氧基羰基、9-芴基 甲基、9-芴基甲氧基羰基、4-甲氧基苯甲酰基、4-甲氧基三苯基甲基、 任选取代的三唑并、对-甲苯磺酰基、任选取代的磺酰基、异丙基、任 选取代的脒、任选取代的三苯甲基、苯氧基乙酰基、任选取代的酰基、 pixyl、四氢吡喃基、任选取代的甲硅烷基、醚和4-甲氧基苄氧基羰基。 在“Protocols for寡核苷酸and conjugates”，Methods in Molecular Biology，第26卷，(Sudhir Agrawal编辑)，Humana Press，1993，Totowa， NJ中第一章和S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedron，1992，48，2223 公开了其它合适的例子。
在优选的实施方案中，单体LNA的基团B优选选自核苷酸碱基 和保护的核苷酸碱基。
在本发明的单体LNA的实施方案中，Q和Q*之一(优选Q*)表示 选自Act-O-、Act-S-、Act-N(RH)-、Act-O-CH2-、Act-S-CH2-、 Act-N(RH)-CH2-的基团，Q和Q*的另一个(优选Q)表示选自氢、叠氮基、 卤素、氰基、硝基、羟基、Prot-O-、巯基、Prot-S-、C1-6-烷基硫代、 氨基、Prot-N(RH)-、一-和二(C1-6-烷基)氨基、任选取代的C1-6-烷氧基、 任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-链烯基、任选取代的C2-6-链烯 基氧基、任选取代的C2-6-炔基、任选取代的C2-6-炔基氧基、一磷酸盐、 二磷酸盐、三磷酸盐、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基 团、螯合基团、报道基团、配体、羧基、sulphono、羟甲基、 Prot-O-CH2-、氨基甲基、Prot-N(RH)-CH2-、羧甲基、sulphono甲基，并且RH 选自氢和C1-6-烷基。
在上述的情况中，基团Prot分别表示对-OH、-SH和-NH(RH)的保 护基团，此类保护基团选自以上分别对羟基保护基团、巯基保护基团 和氨基保护基团定义的相同基团，但应考虑对稳定的和可逆的保护基 团的需求。然而，优选对-OH的任何保护基团选自任选取代的三苯甲 基例如二甲氧基三苯甲基(DMT)、一甲氧基三苯甲基(MMT)和三苯甲 基和9-(9-苯基)呫吨基(pixyl)、任选取代的，四氢吡喃基(thp)，(其它适 合于亚磷酰胺寡核苷酸合成的羟基保护基团描述在Agrawal编辑的 “Protocols for寡核苷酸and conjugates”，Methods in Molecular Biology，第26卷，Humana Press，Totowa，NJ(1994)和Protocols for寡 核苷酸and Analogs，第20卷，(Sudhir A，awal编辑)，Humana Press， 1993，Totowa，NJ)，或作为缩醛保护；适于-SH的任何巯基保护基团选 自三苯甲基例如二甲氧基三苯甲基(DMT)、一甲氧基三苯甲基(MMT) 和三苯甲基及9-(9-苯基)呫吨基(pixyl)、任选取代的，四氢吡喃基 (thp)，(Agrawal描述了其它适合于亚磷酰胺寡核苷酸合成的巯基保护 基团(见上文)；适于-NH(RH)的任何保护基团选自三苯甲基例如二甲氧 基三苯甲基(DMT)、一甲氧基三苯甲基(MMT)、三苯甲基及9-(9-苯基) 呫吨基(pixyl)、任选取代的，四氢吡喃基(thp)，(其它适合于亚磷酰胺 寡核苷酸合成的氨基保护基团Agrawal也有描述(见上文))。
在上述实施方案中，以及对于在此定义的任何单体LNA，Act分 别表示对-OH、-SH和-NH(RH)的活化基团。此类活化基团有，例如选 自任选取代的O-亚磷酰胺、任选取代的O-磷三酯、任选取代的O-磷 二酯、任选取代的H-膦酸酯和任选取代的O-膦酸酯。
在本文中，术语“亚磷酰胺”指式-P(ORX)-N(RY)2基团，其中RX 表示任选取代的烷基，例如甲基、2-氰基乙基或苄基，且每个RY表示 任选取代的烷基，例如乙基或异丙基，或基团-N(RY)2形成吗啉代基团 (-N(CH2CH2)2O)。RX优选表示2-氰基乙基和两个RY优选相同并表示 异丙基。因此，一个特别相关的亚磷酰胺为N，N-二异丙基-O-(2-氰基 乙基)亚磷酰胺。
应该理解，用于此处对单一的单体LNA或几个单体LNA的保护 基团可以这样进行选择，即当LNA(s)结合于本发明的寡聚体时，有可 能同时进行去保护或者使官能团依次去保护。后一种情况为区域选择 性地引入一个或多个“活化/官能”基团例如DNA嵌入剂、光化学活 性基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基团和配体开辟了可能性， 其中这样基团可以通过如上所述的间隔区连接起来。
在优选的实施方案中，Q选自氢、叠氮基、卤素、氰基、硝基、 羟基、Prot-O-、巯基、Prot-S-、C1-6-烷基硫代、氨基、Prot-N(RH)-、 一-或二(C1-6-烷基)氨基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取代的C1-6-烷 基、任选取代的C2-6-链烯基、任选取代的C2-6-链烯基氧基、任选取代 的C2-6-炔基、任选取代的C2-6-炔基氧基、一磷酸盐、二磷酸盐、三磷 酸盐、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、 报道基团和配体、羧基、sulphono、羟甲基、Prot-O-CH2-、氨基甲基、 Prot-N(RH)-CH2-、羧甲基、sulphono甲基，其中Prot为分别对于-OH、 -SH和-NH(RH)的保护基团，并且RH选自氢和C1-6-烷基；并且Q*选自 氢、叠氮基、卤素、氰基、硝基、羟基、Act-O-、巯基、Act-S-、C1-6- 烷基硫代、氨基、Act-N(RH)-、一-或二(C1-6-烷基)氨基、任选取代的 C1-6-烷氧基、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-链烯基、任选取 代的C2-6-链烯基氧基、任选取代的C2-6-炔基、任选取代的C2-6-炔基氧 基、一磷酸盐、二磷酸盐、三磷酸盐、DNA嵌入剂、光化学活性基团、 热化学活性基团、螯合基团、报道基团和配体、羧基、sulphono，其 中Act是分别对-OH、-SH和-NH(RH)的活化基团，并且RH选自氢和 C1-6-烷基。
LNA结合于寡聚体时，通式II的单体LNA代表各种立体异构体。 因此，相信如上所述的对LNA结合于寡聚体的立体化学变体可同样应 用于单体LNA的情况(但应该注意，其后P应被Q取代)。
在本发明的优选实施方案中，单体LNA具有通式IIa

其中所述取代基如上所定义。
而且，关于取代基、双基、R*等的定义，如上对本发明的寡聚体 所定义的相同的优选实施方案也同样适用于单体LNA的情况。
在本发明的单体LNA的特别重要的实施方案中，B表示核苷酸碱 基，核苷酸碱基优选选自胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤和鸟嘌 呤(尤其是腺嘌呤和鸟嘌呤)，X为-O-、R2*和R4*共同表示选自 -(CH2)0-1-O-(CH2)1-3-、-(CH2)0-1-S-(CH2)1-3-和-(CH2)0-1-N(RN)-(CH2)1-3-，特 别是选自-O-CH2-、-S-CH2-和-RN-CH2-的双基，其中RN选自氢和C1-4- 烷基，Q表示Prot-O-，R3*为表示Act-OH的Q*，R1*、R2、R3、R5和 R5*各自表示氢。在该实施方案中，RN也可选自DNA嵌入剂、光化学 活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基团和配体。
在本发明的单体LNA的另一个特别重要的实施方案中，B表示核 苷酸碱基，核苷酸碱基优选选自胸腺嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤 和鸟嘌呤(尤其是腺嘌呤和鸟嘌呤)，X为-O-、R2*和R4*共同表示选自 -(CH2)0-1-O-(CH2)1-3-、-(CH2)0-1-S-(CH2)1-3-和-(CH2)0-1-N(RN)-(CH2)1-3-， 特别是选自-O-CH2-、-S-CH2-和-RN-CH2-的双基，其中RN选自氢和C1-4- 烷基，Q选自氢、巯基、C1-6-烷基硫代、氨基、一-和二(C1-6-烷基)氨基、 任选取代的C1-6-烷氧基、任选取代的C2-6-链烯基氧基、任选取代的C2-6- 炔基氧基、一磷酸盐、二磷酸盐和三磷酸盐，R3*为Q*，它选自氢、叠 氮基、卤素、氰基、硝基、羟基、巯基、C1-6烷基硫代、氨基、一-和 二(C1-6-烷基)氨基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取代的C1-6-烷基、任 选取代的C2-6-链烯基、任选取代的C2-6-链烯基氧基、任选取代的C2-6- 炔基和任选取代的C2-6-炔基氧基，R3选自氢、任选取代的C1-6-烷基、 任选取代的C2-6-链烯基、任选取代的C2-6-炔基，并且R1*、R2、R5和 R5*各自表示氢。在这里RN也可选自DNA嵌入剂、光化学活性基团、 热化学活性基团、螯合基团、报道基团和配体。
在本发明的单体LNA的又一个特别重要的实施方案中，B表示核 苷酸碱基，X为-O-、R2和R3共同表示选自-(CH2)0-1-O-CH＝CH-、 -(CH2)0-1-S-CH＝CH-和-(CH2)0-1-N(RN)-CH＝CH-的双基，其中RN选自氢 和C1-4-烷基，Q选自羟基、巯基、C1-6-烷基硫代、氨基、一-和二(C1-6- 烷基)氨基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取代的C2-6-链烯基氧基、任 选取代的C2-6-炔基氧基、一磷酸盐、二磷酸盐和三磷酸盐，R3*为Q*， 它选自氢、叠氮基、卤素、氰基、硝基、羟基、巯基、C1-6-烷基硫代、 氨基、一-和二(C1-6-烷基)氨基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取代的 C1-6-烷基、任选取代的C2-6-链烯基、任选取代的C2-6-链烯基氧基、任 选取代的C2-6-炔基和任选取代的C2-6-炔基氧基，并且R1*、R2*、R4*、 R5和R5*各自表示氢。
本发明的一个方面是提供以固相和/或溶液相结合于寡聚体的 LNA的各种衍生物。作为示范性例子，分别使用亚磷酰胺途径、磷三 酯途径和H-膦酸酯途径适用于结合(1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-3- (胸腺嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷、(1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1- 羟甲基-3-(胞嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷、(1S，3R，4R，7S)-7- 羟基-1-羟甲基-3-(尿嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷、 (1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-3-(鸟嘌呤-1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1] 庚烷和(1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-3-(腺嘌呤-1-基)-2，5-二氧杂二 环[2.2.1]庚烷的单体分别为(1R，3R，4R，7S)-7-(2-氰基乙氧基(二异丙基 氨基)膦氧基(phosphinoxy)-1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(胸 腺嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷、(1R，3R，4R，7S)-7-羟基-1-(4，4′- 二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(胸腺嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1] 庚烷-7-O-(2-氯苯基磷酸酯)和(1R，3R，4R，7S)-7-羟基-1-(4，4′-二甲氧基 三苯甲基氧基甲基)-3-(胸腺嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷-7- O-(H-膦酸酯)及其3-(胞嘧啶-1-基)、3-(尿嘧啶-1-基)、3-(腺嘧啶-1-基) 和3-(鸟嘌呤-1-基)的类似物。而且，其中所述单体的亚甲基氧基双基 由亚甲基硫代亚甲基氨基或1，2-亚乙基双基取代的类似物也可期望构 成本发明范围内的特别重要的变体。相信亚甲基硫代和亚甲基氨基类 似物可同样用作亚甲基氧基类似物，因而，相应于所提及的用于结合 (1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-3-(胸腺嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂二环 [2.2.1]庚烷、(1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-3-(胞嘧啶-1-基)-2，5-二氧 杂二环[2.2.1]庚烷、(1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-3-(尿嘧啶-1-基)- 2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷、(1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-3-(鸟嘌呤 -1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷和(1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-3- (腺嘌呤-1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷的特殊的反应物也应该认为 是本发明范围内的特别重要的活性单体。对于亚甲基胺类似物，应该 注意到伯胺可以带有选自任选取代的C1-6-烷基如甲基和苄基、任选取 代的C1-6-烷基羰基如三氟乙酰基、任选取代的芳基羰基和任选取代的 杂芳基羰基的取代基。
在特别重要的实施方案中，本发明涉及至少含有一个通式Ia的 LNA的寡聚体及其碱性盐和酸加成盐

其中X为-O-；B选自核苷酸碱基、DNA嵌入剂、光化学活性基团、 热化学活性基团、螯合基团、报道基团和配体；P表示核苷间键合接 于后面的单体的基团位置或5′-端基，这样的核苷间键合或5′-端基任选 包括取代基R5；R3*为基团P*，其表示连接于前面的单体的核苷间键合 或3′-端基；R2*和R4*共同表示选自下列的双基：-O-、-S-、-N(R*)-、 -(CR*R*)r+s+1-、-(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-、 -(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-、-O-(CR*R*)r+s-O-、-S-(CR*R*)r+s-O-、 -O-(CR*R*)r+s-S-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-N(R*)-、 -S-(CR*R*)r+s-S-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-S-和 -S-(CR*R*)r+s-N(R*)-；其中每个R*独立选自氢、卤素、叠氮基、氰基、硝 基、羟基、巯基、氨基、一-和二(C1-6-烷基)氨基、任选取代的C1-6-烷 氧基、任选取代的C1-6-烷基、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学 活性基团、螯合基团、报道基团和配体和/或两个相邻(非孪位)的R*可 以共同表示双键，r和s各自为0-3，前提是r+s之和为1-4；取代基 R1*、R2、R3、R5和R5*各自独立选自氢、任选取代的C1-6-烷基、任选 取代的C2-6-链烯基、羟基、C1-6-烷氧基、C26-链烯基氧基、羧基、 C1- 6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、氨基、一-和二(C1-6-烷基)氨基、 氨基甲酰基、一-和二(C1-6-烷基)-氨基-羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲 基、叠氮基、C1-6-链烷酰基氧基、sulphono、硫烷基、C1-6-烷基硫代、 DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基 团、配体及卤素，其中两个孪位取代基可一起表示氧代。特别是，一 个R*选自氢、羟基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取代的C1-6-烷基、 DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基 团和配体，而其余的R*为氢。尤其是，所述双基选自-O-、 -(CH2)0-1-O-(CH2)1-3-、-(CH2)0-1-S-(CH2)1-3-、-(CH2)0-1-N(RN)-(CH2)1-3-和-(CH2)2-4-。
在另一个特别重要的实施方案中，本发明涉及通式IIa的LNA及 其碱性盐和酸加成盐

其中X为-O-；B选自核苷酸碱基、DNA嵌入剂、光化学活性基团、 热化学活性基团、螯合基团、报道基团和配体；R3*为基团Q*；Q和 Q*各自独立选自氢、叠氮基、卤素、氰基、硝基、羟基、Prot-O-、Act-O-、 巯基、Prot-S-、Act-S-、C1-6-烷基硫代、氨基、Prot-N(RH)-、Act-N(RH)-、 一-和二(C1-6-烷基)氨基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取代的C1-6-烷 基、任选取代的C2-6-链烯基、任选取代的C2-6-链烯基氧基、任选取代 的C2-6-炔基、任选取代的C2-6-炔基氧基、一磷酸盐、二磷酸盐、三磷 酸盐、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、 报道基团、配体、羧基、sulphono、羟甲基、Prot-O-CH2-、Act-O-CH2-、 氨基甲基、Prot-N(RH)-CH2-、Act-N(RH)-CH2-、羧甲基、sulphono甲基、 其中Prot是分别对-OH、-SH和-NH(RH)的保护基团，Act是分别对 -OH、-SH和-NH(RH)的活化基团，并且RH选自氢和C1-6-烷基；R2*和 R4*共同表示选自下列的双基：-O-、-S-、-N(R*)-、-(CR*R*)r+s+1-、 -(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-、-O-(CR*R*)r+s-O-、-S-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-S-、 -N(R*)-(CR*R*)r+s-O-、-O-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-S-(CR*R*)r+s-S-、 -N(R*)-(CR*R*)r+s-N(R*)-、-N(R*)-(CR*R*)r+s-S-和-S-(CR*R*)r+s-N(R*)-；其中每 个R*独立选自氢、卤素、叠氮基、氰基、硝基、羟基、巯基、氨基、 一-和二(C1-6-烷基)氨基、任选取代的C1-6-烷氧基、任选取代的C1-6-烷 基、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、螯合基团、报 道基团和配体，和/或两个相邻(非孪位)的R*可以共同表示双键，r和s 各自为0-3，前提是r+s之和为1-4；取代基R1*、R2、R3、R5和R5*各 自独立选自氢、任选取代的C1-6-烷基、任选取代的C2-6-链烯基、羟基、 C1-6-烷氧基、C2-6-链烯基氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、 甲酰基、氨基、一-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、一-和二(C1-6- 烷基)-氨基-羰基、C1-6-烷基-羰基氨基、脲基、叠氮基、C1-6-链烷酰基 氧基、sulphono、硫烷基、C1-6-烷基硫代、DNA嵌入剂、光化学活性 基团、热化学活性基团、螯合基团、报道基团、配体及卤素，其中两 个孪位取代基可一起表示氧代；前提是在寡核苷酸合成中普遍采用的 条件下为反应性的任何化学基团(包括任何核苷酸碱基)是任选被保护 的官能团。优选，一个R*选自氢、羟基、任选取代的C1-6-烷氧基、任 选取代的C1-6-烷基、DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基团、 螯合基团、报道基团和配体，而其余的取代基R*为氢。尤其是所述双 基选自-O-、-(CH2)0-1-O-(CH2)1-3-、-(CH2)0-1-S-(CH2)1-3-、 -(CH2)0-1-N(RN)-(CH2)1-3-和-(CH2)2-4-。
一般来说，本发明提供具有令人惊异的良好的涉及亲和力和特异 性的杂交性质的寡聚体。因此，本发明提供包括至少一个核苷类似物 组成的寡聚体，这种核苷类似物能将与补充的DNA寡核苷酸有关的 Tm给予所述寡聚体。而此种寡核苷酸与不含任何核苷类似物的相应的 未修饰对照寡核苷酸相比较，其Tm至少高2.5℃，优选至少高3.5℃， 特别是至少高4.0℃，尤其是至少高5.0℃。特别是所述寡聚体的Tm 至少高2.5×N℃，优选至少高3.5×N℃，特别是至少高4.0×N℃， 尤其是至少高5.0×N℃，其中N为核苷类似物数。
在与补体DNA寡核苷酸杂交的情况中，至少一个核苷类似物能 将与补体DNA寡核苷酸有关的Tm给予所述寡聚体。而此种寡核苷酸 与不含任何核苷类似物的相应的未修饰对照寡核苷酸相比较，其Tm 至少高4.0℃，优选至少高5.0℃。特别是至少高6.0℃。尤其是至少高 7.0℃，特别是所述寡聚体的Tm至少高4.0×N℃，优选至少高5.0×N ℃，特别是至少高6.0×N℃，尤其是至少高7.0×N℃，其中N为核 苷类似物数。
术语“相应的未修饰对照寡核苷酸”意指仅由代表相同的绝对顺 序(和相同的取向)的相同核苷酸碱基的天然存在的核苷组成的寡核苷 酸。
在下列条件之一(即与实施例129中所述基本相同)的情况下测定 Tm：
a)10mM Na2HPO4，pH 7.0，100mM NaCl，0.1mM EDTA；
b)10mM Na2HPO4，pH 7.0，0.1mM EDTA；或
c)3M四甲基氯化铵(TMAC)，10mM Na2HPO4，pH 7.0，0.1mM EDTA； 优选在条件a)即等摩尔量(通常1.0μM)的寡聚体和补体DNA寡核苷酸 的情况下。
所述寡聚体优选如上所定义，其中至少一个核苷类似物具有式I， 其中B为核苷酸碱基。特别重要的是其中至少一个核苷类似物包括选 自腺嘌呤和鸟嘌呤的核苷酸碱基的情况。
而且，关于特异性和亲和力，所述寡聚体在与部分补体DNA寡 核苷酸或部分补体RNA寡核苷酸杂交(具有一个或多个与所述寡聚体 的失配)时，应表现出因所述失配而降低的Tm′，它等于或大于不含任 何核苷类似物的相应的未修饰对照寡核苷酸所观察到的Tm′的降低。而 且，所述寡聚体的Tm对杂交缓冲区离子强度的敏感性应与相应的未修 饰对照寡核苷酸基本相同。
在此定义的寡聚体一般至少30％被修饰，优选至少50％被修饰， 特别是70％被修饰，而在一些重要的应用中为100％的被修饰。
本发明的寡聚体与相应的未修饰对照寡核苷酸比较，具有基本上 更高的3′-核酸外切稳定性。此种重要的特性可如实施例136中所述检 测。
定义
在本文中，术语“C1-12-烷基”指具有1-12个碳原子的线性、环状 或分支烃基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、叔丁 基、异丁基、环丁基、戊基、环戊基、己基、环己基和十二烷基。类 似地，术语“C1-6-烷基”指具有1-6个碳原子的线性、环状或分支烃 基，例如甲基、乙基、丙基、异丙基、戊基、环戊基、己基、环己基， 术语“C1-4-烷基”指具有1-4个碳原子的线性、环状或分支烃基，例 如甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、叔丁基、环 丁基。
“C1-6-烷基”的优选例子有甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、 叔丁基、异丁基、戊基、环戊基、己基、环己基，特别是甲基、乙基、 丙基、异丙基、叔丁基、异丁基和环己基。“C1-4-烷基”的优选例子 有甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基和异丁基。
相似地，术语“C2-12-链烯基”包括具有2-12个碳原子且包含一个 未饱和键的线性、环状或分支烃基。链烯基的例子有乙烯基、烯丙基、 丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、十二烯基。类似地，术 语“C2-6-链烯基”意欲包括具有2-6个碳原子且包含一个未饱和键的 线性、环状或分支烃基。链烯基的优选例子有乙烯基、烯丙基、丁烯 基，特别是烯丙基。
相似地，术语“C2-12-链炔基”指具有2-12个碳原子且包含一个叁 键的线性或分支烃基。其实例有乙炔基、丙炔基、丁炔基、辛炔基和 十二炔基。
在本文中，即关于术语“烷基”、“链烯基”和“炔基”，术语 “任选取代的”意指提及的基团可以由选自以下的基团取代一次或多 次(优选1-3次)：羟基(当其结合于不饱和碳原子时可以互变异构体酮 基形式存在)、C1-6-烷氧基(即C1-6-烷基-氧基)、C2-6-链烯基氧基、羧基、 氧代(形成酮或醛官能度)、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、 芳基、芳氧基羰基、芳氧基、芳基羰基、杂芳基、杂芳氧基羰基、杂 芳氧基、杂芳基羰基、氨基、一-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、 一-和二(C1-6-烷基)-氨基羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、一-和二(C1-6- 烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基羰基氨基、氰基、胍基、脲 基、C1-6-链烷酰基氧基、sulphono、C1-6-烷基磺酰氧基、硝基、硫烷基、 C16-烷基硫代、卤素，其中任何芳基和杂芳基可如下文对“任选取代 的芳基和杂芳基”中特别描述被取代。
所述取代基优选选自羟基、C1-6-烷氧基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、 C1-6烷基羰基、甲酰基、芳基、芳氧基羰基、芳基羰基、杂芳基、氨 基、一-和二(C1-6-烷基)氨基、氨基甲酰基、一-和二(C1-6-烷基)-氨基羰 基、氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、一-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基 羰基、C1-6-烷基羰基氨基、氰基、脲基、卤素，其中芳基和杂芳基可 由C1-4-烷基、C1-4-烷氧基、硝基、氰基、氨基和卤素取代1-5次，优 选1-3次。特别优选的例子为羟基、C1-6-烷氧基、羧基、芳基、杂芳 基、氨基、一-和二(C1-6-烷基)氨基和卤素，其中芳基和杂芳基可由C1-4- 烷基、C1-4-烷氧基、硝基、氰基、氨基和卤素取代1-3次。
在本文中，术语“芳基”意指完全的或部分的芳族碳环或环系， 如苯基、萘基、1，2，3，4-四氢萘基、蒽基、菲基、芘基、苯并芘基、芴 基和呫吨基，其中苯基是优选的实例。
术语“杂芳基”意指完全的或部分的芳族碳环或环系，其中一个 或多个碳原子由杂原子，例如氮(＝N-或-NH)、硫和/或氧原子替代。此 类杂芳基的实例为噁唑基、异噁唑基、噻唑基、异噻唑基、吡咯基、 咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、哒嗪基、哌啶基、香豆基、呋喃 基、喹啉基、苯并噻唑基、苯并三唑基、苯并二唑基、benzooxozolyl、 2，3-二氮杂萘基-、phthalanyl、三唑基、四唑基、异喹啉基、吖啶基、 咔唑基、二苯并氮杂基、吲哚基、苯并吡唑基、吩噁嗪基。
在本文中，即关于术语“芳基”和“杂芳基”，术语“任选取代 的”意指提及的基团可以被选自以下的基团取代一次或多次(优选1-5 次，特别是1-3次)：羟基(当其存在于烯醇系统时，可以互变异构体酮 基形式表示)、C1-6-烷基、C1-6-烷氧基、氧代(其可以互变异构的烯醇形 式表示)、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、甲酰基、芳基、芳 氧基、芳氧基羰基、芳基羰基、杂芳基、氨基、一-和二(C1-6-烷基)氨 基、氨基甲酰基、一-和二(C1-6-烷基)-氨基羰基、氨基-C1-6-烷基-氨基 羰基、一-和二(C1-6-烷基)氨基-C1-6-烷基-氨基羰基、C1-6-烷基-羰基氨 基、氰基、胍基、脲基、C1-6-链烷酰基氧基、sulphono、C1-6-烷基磺酰 氧基、硝基、硫烷基、二卤素-C1-4-烷基、三卤素-C1-4-烷基、卤素，其 中代表取代基的芳基和杂芳基可由C1-4-烷基、C1-4-烷氧基、硝基、氰 基、氨基或卤素取代1-3次。优选的实例为羟基、C1-6-烷基、C1-6-烷氧 基、羧基、C1-6-烷氧基羰基、C1-6-烷基羰基、芳基、氨基、一-和二(C1-6- 烷基)氨基和卤素，其中芳基可由C1-4-烷基、C1-4-烷氧基、硝基、氰基、 氨基或卤素取代1-3次。
“卤素”包括氟、氯、溴和碘。
应该理解，寡聚体(其中LNA为结合的)和像这样的LNA包括其 可能的盐，其中药学上可接受的盐是特别相关的。盐包括酸加成盐和 碱性盐，酸加成盐的实例为盐酸盐、钠盐、钙盐、钾盐等。碱性盐的 实例为其中(剩余的)相反离子选自碱金属如钠和钾、碱土金属如钙和 铵离子(+N(Rg)3Rh，其中Rg和Rh各自独立表示任选取代的C1-6-烷基、任 选取代的C2-6-链烯基、任选取代的芳基或任选取代的杂芳基)。药学上 可接受的盐为例如那些描述在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第 17版，Alfonso R.Gennaro(Ed.)，Mack Publishing Company，Easton，PA， U.S.A.，1985和更新的版本以及在Encyclopedia of Pharmaceutical Technology中。因此，本文所用的术语“其酸加成盐或碱性盐”意欲 包括此类盐。而且，所述寡聚体和LNA及其任何中间体或原料也可以 水合物形式存在。
单体的制备
在优选的实施方案中，含有另外的2′-O，4′-C-连接的环的核苷通过 下列方法合成：
早期报道了一些4′-C-羟甲基核苷的合成(R.D.Youssefyeh，J.P.H. Verheyden和J.G.Moffatt，J.Org.Chem.，1979，44，1301；G.H.Jones，M. Taniguchi，D.Tegg和J.G.Moffatt，J.Org.Chem.，1979，44，1309；C.O- Yang，H.Y.Wu，E.B.Fraser-Smith和K.A.M.Walker，Tetrahedron Lett.，1992，33，37；H.Thrane，J.Fensholdt，M.Regner和J.Wengel， Tetrahedton，1995，51，10389；K.D.Nielsen，F.Kirpekar，P.Roepstorff和 J.Wengel，Bioorg.Med.Chem.1995，3，1493)。为举例说明2′-O，4′-C-连 接的二环核苷的合成，我们选择了用4′-C-羟甲基呋喃糖衍生物31作 为原料的策略。苄基化、乙酰化、乙酸水解，接着再次乙酰化得到呋 喃糖33，其为一种用于核苷偶合的重要中间体。与甲硅烷基化的胸腺 嘧啶的立体选择性反应得到化合物34，将其脱乙酰化得到核苷二醇 35。甲苯磺酰化后，经碱诱导的闭环得到2′-O，4′-C-连接的二环核苷衍 生物36。去苄基化产生未保护的二环核苷衍生物37。将其转化为5′- O-4，4′-二甲氧基三苯甲基保护的类似物38，随后再转化为用于寡核苷 酸合成的亚磷酰胺衍生物39。如同在实施例部分中举例说明的那样， 一种类似的方法已用于合成相应的尿嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤 核苷类似物。这种偶合方法仅仅是几种可能的方法中的一种，因为这 对于本领域技术人员来说将是显而易见的。用预先形成的核苷作为原 料的考虑也是有可能的。因此，例如通过甲苯磺酰化、去异亚丙基化 和碱诱导的闭环已成功地实现尿嘧啶衍生物62向衍生物44的转化。 作为另一个例子，如图34中所示完成了核苷67向核苷61B的转化。 通过已知的反应顺序，使用三唑和POCl3，接着经苯甲酰化，并用氨 处理实现了二环胸腺嘧啶核苷37向相应的5-甲基-胞嘧啶核苷65的转 化。相似的方法对于由44合成57C应是可用的。作为另一个可能的 策略的实例，使已含有另一个环的预先环化的呋喃糖衍生物与核苷酸 碱基衍生物偶合是可能的。此种策略还可能制备相应的α-核苷类似 物。当与4-C，2-O-亚甲基-D-呋喃核糖保护的甲基呋喃糖苷偶合时，主 要获得开环产物。然而，1-O-乙酰基呋喃糖207或硫代苯基呋喃糖212 的偶合成功产生作为一种产物的具有α-异头物的LNA核苷。采用产生 α-LNA寡聚体的标准寡聚技术(如对于含Z的LNA寡聚体)掺入此类 α-LNA核苷将是可能的。此外，采用为闭环而活化的4′-C-羟甲基呋喃 糖进行核苷偶合的合成策略(例如，通过在4′-C-羟甲基上含有甲磺酰基 或对甲苯磺酰基)是可行的，如通过将呋喃糖78转化为核苷79，接着 去保护和闭环得到36。适宜的呋喃糖衍生物或核苷的化学或酶的转葡 糖基作用或正位异构化作用仍然是另一个可能的合成策略。这些和其 它有关的策略使通过与所述核苷酸碱基或类似物偶合，或以预先形成 的核苷衍生物作为原料来合成含有其它核苷酸碱基或其类似物的二环 核苷成为可能。
所述的实例意在说明本发明的方法和实施例。需要1D或2D NMR 技术例如NOE实验可以证实合成的化合物的结构。
本发明的另一个实施方案将提供含有不同大小和不同化学结构 的另外的环的二环核苷。有机合成领域的技术人员从这些所述方法可 明显得知，采用类似方法有可能环化其它的核苷，含有不同的C-支链 的核苷也可照此进行。本领域技术人员将能够在本文献中发现制备取 代的核苷类似物中间体的灵感和指导原则，参见例如WO 96/14329。 至于不同化学组成的环，很明显采用类似的方法或有机化学领域已普 遍确立的方法进行，例如，示例性的氧代类似物的硫代类似物的合成 可能像相应的氨基类似物的合成方法那样进行(例如，采用亲核取代反 应或还原性烷基化反应)。
在实施例部分，描述了氨基LNA类似物73-74F的合成。按照标 准方法进行5′-O-DMT保护和3′-O-亚磷酸化有可能使74和74D转化 为寡核苷酸的标准构件。对于氨基LNA类似物，为控制线性的寡聚化 需要保护2′-氨基官能度。这样的保护可采用标准的氨基基团保护技 术。例如Fmoc、三氟乙酰基或BOC而得以实现。或者，在核苷转换 和寡聚化期间，可以保持N-烷基(例如苄基、甲基、乙基、丙基或官 能化烷基)。在图35和36中，显示了采用N-三氟乙酰基和N-甲基衍 生物的策略。如图37所示，如同亚磷酰胺衍生物76F的随后的合成那 样。已成功地进行核苷75向2′-硫代-LNA核苷类似物76D的转化。化 合物76F具有自动合成2′-硫代-LNA寡核苷酸所需的结构。N-三氟乙 酰基2′-氨基-LNA合成子74A具有自动合成2′-氨基-LNA寡核苷酸所 需的结构。
所述2′-硫代和2′-氨基-LNA核苷的相应的胞嘧啶、鸟嘌呤和腺嘌 呤衍生物的合成可采用类似于图35、36和37中所示的策略完成。或 者，在环化前，通过使用方便构型的，例如阿拉伯-构型的呋喃糖合成 子，或通过一开始就转化原料的核糖-构型的核苷/呋喃糖的C-2′位碳原 子周围的构型可以转化C-2′周围的立体化学。随后通过例如对甲苯磺 酰化、如在以上尿嘧啶/胸腺嘧啶例子中所述的双亲核取代来活化 2′-β-OH，可以得到所需的2′-硫代-LNA或2′-氨基-LNA核苷。采用如上 对其它例子所述的标准反应(DMT-保护和亚磷酸化)，可以制备用于寡 聚化的由此得到的恰当保护的胞嘧啶、鸟嘌呤和腺嘌呤类似物。
寡聚体的制备
采用有机化学领域普通技术人员熟知的核酸化学的聚合技术可 以制备本发明的线性-、分支-(M.Grtli和B.S.Sproat，J.Chem.Soc.， Chem.Commun.，1995，495；R.H.E.Hudson和M.J.Damha，J.Am. Chem.Soc.，1993，115，2119；M.Von Buren，G.V.Petersen， K.Rasmussen，G.Brandenburg，J.Wengel和F.Kirpekar，Tetrahedron， 1995，51，8491)和环状-(G.Prakash和E.T.Kool，J.Am.Chem.Soc.， 1992，114，3523)寡-和多核苷酸。使用亚磷酰胺化学方法(S.L.Beaucage 和R.P.Iyer，Tetrahedton，1993，49，6123，S.L.Beaucage和R.P.Iyer， Tetrahedton，1992，48，2223)，但也可使用例如H-膦酸酯化学、磷酸三 酯化学或酶合成方法。一般使用标准偶合条件和亚磷酰胺途径，但是 对于较长偶合时间的本发明的某些单体，和/或用新鲜试剂重复偶合， 和/或使用浓度更高的偶合试剂。作为另一种可能性，也可以使用比1H- 四唑更有活性的活化剂以增加偶合反应速率。亚磷酰胺39、46、53、 57D、61D和66以满意的＞95％的逐步偶合收率进行偶合。采用标准方 法可合成全-硫代磷酸酯LNA寡聚体(表7)。因此，通过使用Beaucage 氏试剂(可从市售获得)氧化替换通常的氧化剂例如碘/吡啶/水，用于磷 酸二酯寡聚体合成的氧化，可有效地合成硫代磷酸酯LNA寡聚体(逐 步偶合收率＞＝98％)。使用亚酰胺化物(amidites)74A和74F可有效地 合成2′-氨基-LNA和2′甲基氨基-LNA寡核苷酸(表9)(逐步偶合收率 ≥98％)。采用如上所述的用于LNA寡核苷酸的标准亚磷酰胺方法，使 用亚酰胺化物76F可有效地合成2′-硫代-LNA寡核苷酸(表8)。所需序 列合成后，采用标准条件进行后处理(于55℃用30％氨从固体载体裂 解并除去保护基团5小时)。使用一次性的反相纯化筒和/或反相HPLC 和/或从乙醇或丁醇中沉淀可对LNA寡核苷酸进行纯化。采用毛细管 凝胶电泳、反相HPLC和MALDI-MS检验合成的寡核苷酸类似物的 纯度，并确定本发明的二环核苷类似物是否达到设计所需掺入的数 目。
本发明的另一个方面是提供含有通过非天然核苷间键合连接的 LNA的寡核苷酸类似物的方法。例如，采用寡核苷酸化学领域确立的 策略有可能合成相应的硫代磷酸酯或氨基磷酸酯类似物(Protocols for 寡核苷酸and Analogs，第20卷(Sudhir Agrawal，ed.)，Humana Press， 1993，Totowa，NJ；S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedton，1993，49， 6123；S.L.Beaucage和R.P.Iyer，Tetrahedton，1992，48，2223；E. Uhlmann和A.Peyman.Chem.Rev.90，543)。
因而，本发明一般还提供在此定义的LNA用于制备LNA修饰的 寡核苷酸的用途。应该理解，LNA修饰的寡核苷酸可以包括通常的核 苷(即天然存在的核苷如核糖核苷和/或二氧基核糖核苷)以及与通式II 定义的核苷不同的修饰的核苷。在特别重要的实施方案中，LNA的掺 入调节所述寡核苷酸用作核酸活性酶底物的能力。
而且已经固定于任选保护的核苷酸碱基和任选5′-OH保护的LNA 的固体载体物质是作为合成其中在3′末端含有LNA单体的LNA修饰 的寡核苷酸的极其重要的物质。在该例子中，所述固体载体物质优选 CPG，例如容易(市售)获得的CPG物质，采用该特殊物质供应商所述 的条件，可使3′-官能的、任选保护的核苷酸碱基和任选5′-OH保护的 LNA连接于该物质上。例如，可以使用BioGenex Universial CPG Support(BioGenex，U.S.A.)。5′-OH保护基团可以是例如DMT基团。应 该根据可用于提及的CPG物质的条件选择3′-官能团。
应用
本发明公开令人吃惊的结果，即当其掺入寡核苷酸时，二环核苷 单体(LNA)的各种新的衍生物，与未修饰的寡核苷酸比较，会极大地 增加这些修饰的寡核苷酸对互补ssDNA或ssRNA的亲和力。本发明 进一步公开令人吃惊的结果，即完全和部分LNA修饰的两种寡核苷酸 对它们的互补核酸序列显示出大大增强的杂交性质。根据应用的情 况，使用这些LNA由此提供了有趣的可能性，即大大增加标准寡核苷 酸的亲和力而不减弱其特异性(恒定大小的寡核苷酸)或者显著增加特 异性而不减弱其亲和力(减小所述寡核苷酸的大小)。本发明也公开意 外的发现，即LNA修饰的寡核苷酸除大大增加杂交性质外，还显示出 正常DNA和RNA寡核苷酸的许多有用的生理化学特性。在此给出的 例子包括良好的溶解度，LNA修饰的寡核苷酸对盐如氯化钠和四甲基 氯化铵(可模拟未修饰的寡核苷酸的特性)的应答，LNA修饰的寡核苷 酸作为各种聚合酶的引物的能力，LNA修饰的核苷酸在使用热稳定的 DNA聚合酶的靶扩增反应中用作引物的能力，LNA修饰的寡核苷酸 用作T4多核苷酸激酶底物的能力，生物素化的LNA将PCR扩增子序 列特异性捕获到链霉抗生物素包被的固体表面的能力，固定的LNA修 饰的寡核苷酸序列特异性捕获扩增子的能力以及非常重要的是LNA 修饰的寡核苷酸经过链侵入序列特异性的靶向双链DNA的能力。因 此，对本领域一个普通技术人员来说，明显的是这些新的核苷类似物 在治疗学、诊断学和分子生物学领域基本以寡核苷酸为基础的技术是 改进功能的极其有用的工具。
本发明的一个目的是提供可使用寡核苷酸合成领域技术人员熟 知的方法和设备掺入寡核苷酸中的本发明的单体LNA。
本发明的另一个目的是提供完全或部分LNA修饰的寡核苷酸(寡 聚体)，它们能够以序列特异性的方式与互补寡核苷酸杂交形成具有比 未修饰的寡核苷酸的复合物更高亲和力的双链体或三链体。
本发明的另一个目的是使用LNA增强正常寡核苷酸的特异性而 不减弱其亲和力。这可通过减小正常寡核苷酸的大小(和亲和力)至由 于掺入LNA能够获到相等亲和力的程度。
本发明的另一个目的是提供含有LNA、正常核苷和其它核苷类似 物的完全或部分修饰的寡核苷酸。
本发明的另一个目的是利用高亲和力的LNA以产生具极强亲和 力的修饰的寡核苷酸，它们能通过“链置换”的方式结合于其dsDNA 分子的靶序列上。
本发明的另一个目的是提供不同类型的LNA，当其掺入到寡核苷 酸中时，它们在对于其互补核苷的亲和力方面是不同的。根据本发明， 这点可通过用例如具有改变的氢键可能性的衍生物替换正常的核苷酸 碱基G、A、T、C和U，或者使用不同于其骨架结构的LNA来实现。 此类不同的LNA的可获得性促进了修饰的寡核苷酸亲和力的精确调 节。
本发明的另一个目的是提供比未修饰的相对的寡核苷酸更能抵 抗核酸酶的LNA修饰的寡核苷酸。
本发明的另一个目的是提供能够补充RNAseH的LNA修饰的寡 核苷酸。
本发明的另一个目的是提供能够用作DNA和RNA聚合酶的底物 的LNA，由此而使得所述类似物掺入生长的核酸链中或者作为链的终 止子。
本发明的另一个目的是提供能够用作治疗剂的LNA。治疗性的核 苷类似物的许多例子是已知的，在此公开的核苷类似物的相似衍生物 可以采用从文献中得知的方法合成(E.De Clercq，J.Med.Chem.1995， 38，2491；P.Herdewijn和E.De Clercq：Classical Antiviral Agents and Design og New Antiviral Agents.In：A Textbook of Drug Design and Development；Eds.P.Krogsgaard-Larsen，T.Liljefors and U.Madsen； Harwood Academic Publishers，Amsterdam，1996，第425页；I.K.Larsin： Anticancer Agents.In：A Textbook of Drug Design and Development；Eds. P.Krogsgaard-Larsen，T.Liljefors and U.Madsen；Harwood Academic Publishers，Amsterdam，1996，第460页)。
双链的RNA已显示具有抗病毒活性和肿瘤抑制活性(Sharp等.， Eur.J.Biochem.230(1)：97-103，1995，Lengyel-P等，Proc.Natl.Acad. Sci.U.S.A.，90(13)：5893-5，1993，和Laurent-Crawford等，AIDS Res. Hum.Retroviruses，8(2)：285-90，1992)。可能是双链LNA可以模拟治疗 活性的双链RNAs的作用，因而此类双链LNA具有作为治疗剂的潜在 性。
术语“天然的核酸”用于本文时指广义的核酸，像例如存在于任 何来源的完整细胞或病毒(vira)的核酸或由这样来源通过化学或物理 方式释放的核酸或由这样的原始来源经扩增方式衍生的核酸。天然核 酸可以是单链、双链或部分双链的，可以是相对纯的种类或不同核酸 的混合物。它也可以是含有其它核酸和其它细胞成分的粗制生物样品 的一种成分。另一方面，术语“合成的核酸”指通过化学合成产生的 任何核酸。
本发明也提供LNA修饰的寡核苷酸在以核酸为基础的治疗学、 诊断学和分子生物学中的用途。LNA修饰的寡核苷酸可以用于天然的 或合成的核酸的检测、鉴定、捕获、定性、定量和片段化，并在体内 和体外作为翻译和转录的阻断剂。在许多情况下，将各种分子附着于 LNA修饰的寡核苷酸将具有重要意义。这样的分子可以附着于所述寡 核苷酸的末端或者它们可以附着于一个或多个内部位置上。或者它们 可以通过附着于5′或3′末端的间隔区而附着于所述寡核苷酸上。此类 分子的代表性基团有DNA嵌入剂、光化学活性基团、热化学活性基 团、螯合基团、报道基团或配体。通常也可采用以这些分子标记未修 饰的DNA和RNA寡核苷酸的所有方法来标记LNA修饰的寡核苷酸。 同样地，用于检测标记的寡核苷酸的所有方法一般可应用于相应的标 记的LNA修饰的寡核苷酸。
治疗
术语“链置换”指一种可用来将寡核苷酸结合到它的双链DNA 或RNA中的互补靶序列上，以便从所述靶序列中置换另一条链的方 法。
在本发明的一个方面，能够进行“链置换”的LNA修饰的寡核 苷酸被用于开发基于“antigene”途径的新药物。与能形成三股螺旋 的寡核苷酸形成对照，这样的“链置换”寡核苷酸允许dsDNA中的任 何序列被靶向(在一定的生理学离子强度和pH下)。
“链置换”寡核苷酸也可有利地用于反义途径上，为防止由于分 子内氢键的原因，RNA靶序列是隐蔽的。这种分子内结构可以发生在 mRNAs中并且当试图通过反义途径“抑制”mRNA的翻译时，可能 引起严重的问题。
其它类的细胞RNAs像例如tRNAs、rRNAs、snRNAs和scRNAs 含有对其功能重要的细胞内结构。这些类型的结构复杂的RNAs不能 编码蛋白，但却(以RNA/蛋白颗粒的形式)在细胞功能内参与如mRNA 拼接、聚腺苷酸化、翻译、编辑、染色体末端完整性的维持等。由于 它们具有损伤或者甚至防止正常的寡核苷酸避免有效的杂交的高度结 构，这些类型的RNAs作为反义靶迄今并没有多少吸引人的意义。
使用高亲和力的LNA单体应能促进具有足够热稳定性的反义探 针的构建以有效杂交至这样的靶RNAs。由此，在一个优选的实施方 案中，LNA被用于将足够的亲和力给予寡核苷酸，以使其能杂交到这 些RNA类，由此调节其中发现有RNAs的颗粒的定性和/或定量功能。
在一些情况中，下调基因的表达可能是有利的，而在其它情况 下，活化它可能是有利的。如Mllegaard等(Mllegaard，N.E.；Buchardt， O.；Egholm，M.；Nielsen，P.E.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1994，91， 3892)所表明的，能够“链置换”的寡聚体可作为RNA转录激活剂发 挥作用。在本发明的一个方面中，能够“链置换”的LNA用于激活具 有治疗意义的基因。
在大量的病毒感染和癌症的化疗中，已证明核苷和核苷类似物是 有效的。LNA核苷有效用作此类基于核苷的药物。
各种类型的双链RNAs抑制几种类型的癌生长。包含一个或多个 LNA寡核苷酸的双链体有效用作此类双链的药物。
本发明还涉及含有如上定义的药用活性的LNA修饰的寡核苷酸 或药用活性的LNA单体以及与药学上可接受的载体的组合物。
这样的组合物可以为适合于口服、非肠道(静脉、腹膜内)、肌内、 直肠、鼻内、皮肤、阴道、颊下、眼内或肺内给药的形式，优选适合 于口服给药的形式，这样的组合物可以以本领域技术人员熟知的方 法，例如通常描述于“Remington′s Pharmaceutical Sciences”，第17 版，Alfonso R.Gennaro(Ed.)，Mark Publishing Company，Easton，PA， U.S.A.，1985以及较近的版本以及“Drugs and the Pharmaceutical Sciences”系列丛书的单行本中(Marcel Dekker)的方法制备。
诊断学
已开发出几种诊断学和分子生物学方法，这些方法使用一系列不 同的寡核苷酸以同时分析靶核酸，以检测可能的突变的多血症存在。 通常，这一系列寡核苷酸以预定模式固定于固体载体上，这样靶核酸 中特殊的突变的存在可通过其在固体载体中的杂交位置而被揭示。对 于在核酸分析成功地使用一系列不同的寡核苷酸来说，一个重要的先 决条件就是它们在单一应用的杂交条件下对其特定的靶序列均应是特 异性的。因为标准寡核苷酸对于其互补靶序列的亲和力和特异性严重 依赖其序列和大小，因此，这个标准迄今为止很难予以实施。
由此，在一个优选的实施方案中，LNA被用作增加探针的亲和力 和/或特异性的手段并用作补充不同的寡核苷酸对其互补序列亲和力 的手段。如在此所公开的，这种亲和力的调节可通过例如用带有类似 的核苷酸碱基的LNA置换所述寡核苷酸中选定的核苷来实现。如在此 进一步所表明的，不同类的LNA对其互补核苷显示出不同的亲和力。 例如，具T-核苷酸碱基的2-3桥接LNA比相应的2-4桥接LNA对A- 核苷显示出较少的亲和力。因此，使用不同类的LNA可提供用于对寡 核苷酸亲和力进行微调的额外水平。
在另一个优选的实施方案中，高亲和力和特异性的LNA修饰的 寡核苷酸被用于天然或合成核酸的序列特异性捕获和纯化。在一个方 面，天然或合成核酸与固定于固体表面的LNA修饰的寡核苷酸接触。 在这种情况下，杂交和捕获同时发生。捕获的核酸可以例如通过本领 域熟知的各种方法直接在表面进行检测、鉴定、定量或扩增，或者在 定性或扩增前，通过使固定的、修饰的寡核苷酸和捕获的核酸经受去 杂交条件如加热或通过使用低离子强度的缓冲液使其从表面释放出 来。
所述固体载体可以从较宽范围的聚合物材料如CPG (可控孔度玻 璃)、聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚乙烯中选择并且可以采取各种 形式例如管、微量滴定板、柱、珠、滤器等。通过各种常用于寡核苷 酸固定的化学或光化学方法或经非共价偶合例如通过将生物素化 LNA修饰的寡核苷酸结合到固定的链霉抗生物素中，所述LNA修饰 的寡核苷酸可以通过5′和3′末端(或通过连接于5′和3′末端的键的尾端) 固定于所述固体载体中。将LNA修饰的寡核苷酸固定于不同的固体载 体上的一个优选方法是如WO 96/31557中所述，使用共价连接于所述 修饰的寡核苷酸的5′和3′末端(任选通过键)的光化学活性的蒽醌的光 化学方法。因此，本发明也提供带有LNA修饰的寡核苷酸的面。
在另一方面，所述LNA修饰的寡核苷酸带有共价连接于5′或3′ 末端的配体。在这种情况中，所述LNA修饰的寡核苷酸在溶液中与天 然或合成核酸接触，其后形成的杂化物被捕获于带有能特异性结合配 体的分子的固体载体中。
在另一方面，能够进行“链置换”的LNA修饰的寡核苷酸被用 于捕获天然和合成核酸而不必预先变性。在由于稳定的分子内结构的 快速形成，正常寡核苷酸很难或不可能进入所述靶序列的情况下，这 样修饰的寡核苷酸是特别有用的。含有这些结构的核酸的例子有 rRNA、tRNA、snRNA和scRNA。
在另一个优选的实施方案中，设计为具有高特异性的LNA修饰 的寡核苷酸在核酸测序中用作引物并在几种已知的扩增反应中的任一 种(例如PCR反应)中用作引物。如在此所表明的，LNA修饰的寡核苷 酸的设计决定其是否将维持指数或线性靶扩增。扩增反应的产物可通 过能用于用正常DNA引物产生的扩增产物的分析的各种方法进行分 析。在其中LNA修饰的寡核苷酸引物被设计为维持线性扩增的特殊情 况下，所得到的扩增子将带有可被互补探针(无变性)视为目标的单链 末端。通过附着于固体表面的其它互补LNA修饰的寡核苷酸，可使用 这样的末端捕获扩增子。
在另一方面，能够进行“链置换”的LNA修饰的寡核苷酸在线 性或指数扩增反应中用作引物。期望这种寡聚体(寡聚物)通过在扩增 反应的后阶段与扩增子有效竞争重杂交来增加扩增子的总收率。 Demers等(Nucl.Acid Res.1995，第23卷，3050-3055)公开高亲和力、 非延伸的寡聚体作为增加PCR反应的总收率的一种手段。相信所述寡 聚体通过在扩增反应的后阶段干扰与扩增子的重杂交而发挥这些作 用。期望在其3′-末端阻断的LNA修饰的寡聚体将提供相同的优势。 可采用许多方法例如用氢或磷酸酯交换3′-羟基来阻塞3′末端。这种3′ 阻断的LNA修饰的寡聚体也可以类似于Yu等(Biotechniques，1997，23， 714-716)中所述相似的方法用于选择性地扩增密切相关的核酸序列。
近年来，已经发明了可用于例如经靶扩增反应产生的扩增子的即 时(real-time)检测的新型探针。有一类这样的探针已被称作“Molecular Beacons”。这些探针被合成为在一端含有荧光团而另一端含有猝灭剂 分子的部分自身互补的寡核苷酸。当探针游离于溶液中时，会折叠成 发夹状结构(由自身互补区引导)，这使得该猝灭剂能定位于充分接近 荧光团的位置以便猝灭其荧光信号。当与其靶核酸杂交时，该发夹打 开，由此该荧光团与猝灭剂分开并发出荧光信号。
另一类探针被称作“Taqman probes”。这些探针也含有荧光团 和猝灭剂分子。然而，与Molecular Beacons相反，猝灭剂猝灭发自荧 光团的荧光信号的能力是在探针与其靶序列杂交后来维持的。作为替 代，通过聚合酶的5′外切核酸酶活性的作用，杂交后经探针中的猝灭 剂或荧光团的物理接触而发出荧光信号，该聚合酶从位于5′的引物至 Taqman探针的结合位点开始合成。
对靶位点的高亲和力是两型探针的重要特征，结果此类探针都趋 向于是相当大的(一般为30-40mers)。结果，在制备高质量的探针方面 遇到很大的问题。因此，在优选的实施方案中，使用LNA通过减少 Taqman探针和Molecular Beacons的大小同时维持所需的亲和力以改 进它们的制备及随之而来的性能。
在另一方面，使用LNA构建新的亲和对(完全或部分修饰的寡核 苷酸)。亲和力常数可容易地在宽范围内进行调节，可以设计并合成大 数量的亲和对。一部分亲和对可通过标准方法附着于有关的分子(如蛋 白、扩增子、酶、多糖、抗体、半抗原、肽、PNA等)，而另一部分亲 和对可附着于例如固体载体如珠、膜、微量滴定板、柱、管等。所述 固体载体可以从较宽范围的聚合物材料如聚丙烯、聚苯乙烯、聚碳酸 酯或聚乙烯中选择。所述亲和对可用于上述各种靶分子的选择性分 离、纯化、捕获和检测。
捕获LNA-标记分子的原理是通过与另一个(完全或部分修饰的) 互补LNA寡核苷酸的相互作用的方式进行的，该原理可用来创造无穷 数的新亲和对。
在另一个优选的实施方案中，高亲和力和特异性的LNA修饰的 寡核苷酸被用于构建用于原位杂交的探针。例如，可以使用LNA减 少传统的DNA探针的大小，同时又维持所需的亲和力，由此增加探 针的动力学及其对样品标本的渗透能力。LNA修饰的寡核苷酸对“链 侵入”双链核酸结构的能力在原位杂交中也具有很大的优点，因为它 有利于杂交，而无需靶DNA/RNA的预变性。
在另一个优选的实施方案中，用于反义治疗学的LNA修饰的寡 核苷酸被设计为具有高亲和力和补充RNAseH的能力的双重目的。这 可通过例如使LNA片段与未修饰的中心DNA片段侧面接触来实现。
本发明也提供用于天然的或合成核酸的分离、纯化、扩增、检测、 鉴定、定量或捕获的试剂盒，该盒包含反应体和一个或多个如本文所 定义的LNA修饰的寡核苷酸(寡聚体)。所述LNA修饰的寡核苷酸优 选固定于所述反应体上。
本发明也提供用于天然的或合成核酸的分离、纯化、扩增、检测、 鉴定、定量或捕获的试剂盒，该盒包含反应体和一个或多个如本文所 定义的LNA。所述LNA优选固定于所述反应体(如通过采用上述的固 定技术)上。
对于本发明的试剂盒，所述反应体优选为固体载体材料，例如硼 硅酸盐玻璃、钠钙玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、聚乙烯、聚 乙二醇对苯二酸酯、聚乙烯乙酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基甲基丙 烯酸酯和聚乙烯基氯化物，优选为聚苯乙烯和聚碳酸酯。所述反应体 可以为样品管、小瓶、玻片、薄片、薄膜、珠、小丸、盘、平板、环、 棒、网、滤器、托盘、微量滴定板、柱或多叶片柱的形式。
所述试剂盒一般还附有说明试剂盒使用的最佳条件的印刷说明 书。
本发明上述的诊断和治疗方面用下列实例加以说明。
实验
概论
所有的试剂均从供应商获得并无需进一步纯化就可使用。用硫酸 钠干燥有机相后，进行过滤。用于柱层析的硅胶(0.040-0.063mm)购自 Merck。在300MHz或250MHz记录1H NMR的NMR谱，在62.9MHz 记录13C NMR和在202.33MHz记录31P NMR的NMR。δ-值是相对于 作为内部标准的四甲基硅烷(1H NMR和13C NMR)和相对于作为外部 标准的85％磷酸(31P NMR)的ppm值。根据标准的核苷命名法给出 NMR峰的排布。记录EI质谱、FAB质谱和等离子体解吸质谱以获得 合成化合物的分子量的信息。用亚磷酰胺方法学合成寡核苷酸类似 物。必要时用一次性的反相层析柱或反相HPLC实现5′-O-DMT-ON 或5′-O-DMT-OFF寡核苷酸类似物的纯化。获得基质-促进的激光解吸 质谱以确证代表性的寡核苷酸样品的分子量和单体组分。进行毛细管 凝胶电泳以检验代表性的寡核苷酸样品的纯度。
以下的特定描述附有图2-41和表1-10。除非在以下实施例中另外 说明，否则“LNA”表示用图2式Z所示的2′-4′-桥接变体。
LNA单体的制备
实施例1
3-C-烯丙基-1，2-O-异亚丙基-α-D-呋喃核糖(0A)
方法1：于0℃搅拌5-O-叔丁基二甲基硅烷基-1，2-O-异亚丙基-α- D-呋喃核-3-酮糖(Y.Yoshimura，T.Sano，A.Matsuda和T.Ueda，Chem. Pharm.Bull.，1988，36，162)(17.8g，58.9mmol)的无水THF(980cm3)溶 液并滴加在无水乙醚(130cm3，130mmol)中的1M烯丙基溴化镁。搅拌 2小时后，加入氯化铵的饱和水溶液(800cm3)并用二氯甲烷(3×400 cm3)提取该混合物。用盐水(3×450cm3)洗涤有机相并干燥(硫酸钠)。 减压除去溶剂并使残留物溶于无水THF(700cm3)中。加入1.1M四丁 基氟化铵的THF(54.4cm3，59.8mmol)溶液，于室温下搅拌该混合物1 小时并蒸发至干。使残留物溶于二氯甲烷(1700cm3)中并用碳酸氢钠饱 和水溶液(3×500cm3)洗涤有机相并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂，残 留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(98∶2，v/v)作为洗脱剂得到为 白色固体物质的呋喃糖0A(9.42g，69％)。
方法2：使用无水THF(450cm3)、1M烯丙基溴化镁的无水乙醚(130cm3， 130mmol)溶液、氯化铵的饱和水溶液(490cm3)、用于提取的乙醚(350 +2×160cm3)、盐水(2×160cm3)、1.1M四丁基氟化铵的THF(22.3cm3， 24.6mmol)溶液、无水THF(400cm3)、二氯甲烷(1400cm3)、碳酸氢钠 饱和水溶液(3×500cm3)、盐水(500cm3)和(硫酸钠)，类似地从5-O-叔 丁基二苯基硅烷基-1，2-O-异亚丙基-α-D-呋喃核-3-酮糖合成呋喃糖0A (T.F.Tam和B.Fraser-Reidm，J.Chem.Soc.，Chem.Commum.，1980， 556)(9.5g，22.2mmol)。δH((CD3)2SO)5.84(1H，m，2′-H)，5.65(1H，d，J 3.8，1-H)，5.12(1H，d，J6.1，3′-Ha)，5.06(1H，br s，3′-Hb)，4.76(1H，s， 3-OH)，4.64(1H，t，J5.4，5-OH)，4.16(1H，d，J3.8，2-H)，3.84(1H，dd，J 2.2，8.1，4-H)，3.56(1H，ddd，J2.3，5.6，11.8，5-Ha)，3.42(1H，m，5-Hb)， 2.16(1H，dd，J6.1，14.3，1′-Ha)，1.98(1H，dd，J8.2，14.3，1′-Hb)，1.46(3 H，s，CH3)，1.25(3H，s，CH3)。δC(CDCl3)133.5(C-2′)，117.9(C-3′)， 110.8(C(CH3)2)，102.9(C-1)，82.6，81.0，77.7(C-2，C-3，C-4)，59.4(C-5)， 36.4(C-1′)，26.4，26.3(CH3)(实测值：C，57.4；H，8.0；C11H18O5的计算值 C，57.4；H，7.9％)。
实施例2
3-C-烯丙基-3，5-二-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-α-D-呋喃核糖(0B)
于0℃搅拌氢化钠(4.9g，123mmol)的无水DMF(100cm3)中的60 ％悬浮液并用45分钟滴加呋喃糖0A(9.42g，40.9mmol)的无水DMF(65 cm3)溶液。于50℃搅拌该溶液1小时并冷却至0℃。滴加苄基溴(14.5cm3， 121mmol)和无水DMF(14.5cm3)的混合物并于室温下搅拌18小时。将 该反应混合物蒸发至干，用碳酸氢钠饱和水溶液(2×450cm3)洗涤残留 物的二氯甲烷(700cm3)溶液并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂，残留物经 硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸乙酯(9∶1，v/v)作为洗脱剂得到为油状 的化合物0B(14.5g，86％)。δH(CDCl3)7.39-7.21(10H，m，Bn)，5.92(1H， m，2′-H)，5.71(1H，d，J3.8，1-H)，5.17-5.09(2H，m，3′-Ha，3′-Hb)，4.67(2 H，m，Bn)，4.60(1H，d，J12.2，Bn)，4.52(1H，d，J12.1，Bn)，4.43(1H， m，4-H)，4.42(1H，d，J3.8，2-H)，3.73(1H，dd，J3.2，10.8，5-Ha)，3.66(1 H，dd，J7.4，10.8，5-Hb)，2.50(1H，dd，J7.7，14.9，1′-Ha)，2.39(1H，dd，J 6.5，14.9，1′-Hb)，1.60(3H，s，CH3)，1.34(3H，s，CH3)。δC(CDCl3)138.7， 138.1(Bn)，132.6(C-2′)，128.3，128.2，127.7，127.5，127.4，127.4(Bn)， 118.5(C-3′)，112.6(C(CH3)2)，104.1(C-1)，86.5，82.1，80.4(C-2，C-3，C- 4)，73.4，68.6(Bn)，67.0(C-5)，35.8(C-1′)，26.8，26.6(CH3)。FAB-MS m/z 433[M+Na]+(实测值：C，73.4；H，7.4；C25H30O5的计算值C，73.2；H， 7.4％)。
实施例3
3-C-烯丙基-1，2-二-O-乙酰基-3，5-二-O-苄基-D-呋喃核糖(0C)
于90℃搅拌呋喃核糖0B(12.42g，30.3mmol)在80％乙酸(150cm3) 水溶液中的溶液3小时。减压除去溶剂，用乙醇(3×75cm3)、甲苯(3 ×75cm3)的无水吡啶(2×75cm3)与残留物共蒸发并再溶解于无水吡啶 (60cm3)。加入乙酸酐(46cm3)并于室温下搅拌该溶液48小时。加入冰 和水(300cm3)的混合物，用二氮甲烷(2×300cm3)提取生成的混合物。 用碳酸氢钠饱和水溶液(3×200cm3)洗涤合并的有机相并干燥(硫酸 钠)。蒸发溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸乙酯(4∶1，v/v) 作为洗脱剂得到为油状的异头混合物0C(β∶α～2∶1)(13.3g，97％)。δC (CDCl3)169.7，169.6(C＝O)，138.7，138.4，137.7，137.6(Bn)，132.4，132.2 (C-2′)，128.4 128.4，128.2，128.2，127.8，127.7，127.7，127.6，127.3，127.3， 126.9，126.8(Bn)，118.5(C-3′)，99.4，93.5(C-1)，84.8，83.7，83.2，82.0， 79.1，75.5(C-2，C-3，C-4)，73.7，73.5，69.3，68.7(Bn)，66.1(C-5)，35.5， 34.9(C-1)，21.1，21.0，20.7，20.6(CH3)。(实测值：C，68.7；H，6.7； C26H30O7的计算值C，68.8；H，6.6％)。
实施例4
1-(2-O-乙酰基-3-C-烯丙基-3，5-二-O-苄基-β-D-呋喃核糖基)胸腺嘧啶 (1)
将N，O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(44.9cm3，182mmol)加入异头混 合物0C(β∶α～2∶1，11.8g，26.0mmol)(P.Nielsen，H.M.Pfundheller和J. Wengel，Chem.Commun.，1997，825；P.Nielsen，H.M.Pfundhelle，C.E. Olsen和J.Wengel，J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1，1997，出版中)和胸腺 嘧啶(6.55g，52.0mmol)的无水乙腈(250cm3)的搅拌溶液中。于回流下搅 拌该反应混合物1小时并冷却至0℃。滴加三甲基硅烷基三氟甲磺酸 酯(8.00cm3，44.0mmol)并于室温下搅拌该溶液12小时。加入冰冷的饱 和碳酸氢钠水溶液(270cm3)并用二氯甲烷(3×125cm3)提取该混合 物。用饱和碳酸氢钠水溶液(2×125cm3)和盐水(2×125cm3)洗涤有机 相并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用二 氯甲烷/甲醇(98∶2，v/v)作为洗脱剂得到为白色固体的核苷1(11.6g， 86％)。δH(CDCl3)8.64(1H，br s，NH)，7.75(1H，d，J1.1，6-H)，7.41-7.25 (10H，m，Bn)，6.43(1H，d，J8.2，1′-H)，5.88(1H，m，2″-H)，5.66(1H，d， J8.2，2′-H)，5.12(1H，s，3″-Ha)，5.07(1H，dd，J1.5，8.5，3″-Hb)，4.85(1H， d，J11.2，Bn)，4.64(2H，s，Bn)，4.63(1H，d，J11.2，Bn)，4.33(1H，br s， 4′-H)，3.81(1H，dd，J2.7，11.1，5′-Ha)，3.65(1H，m，5′-Hb)，2.81-2.65(2 H，m，1″-Ha，1″-Hb)，2.08(3H，s，COCH3)，1.52(3H，d，J0.8，CH3)。δC (CDCl3)170.1(C＝O)，163.6(C-4)，150.9(C-2)，138.1，136.6(Bn)，136.0 (C-6)，131.6(C-2″)，128.8，128.4，128.3，127.6，127.5，127.1(Bn)，118.5 (C-3″)，111.1(C-5)，84.2，83.4，83.1，77.4(C-1′，C-2′，C-3′，C-4′)，73.6， 69.2(Bn)，65.6(C-5′)，33.7(C-1″)，20.8(COCH3)，11.9(CH3)。(实测值：C， 66.8；H，6.3；N，5.1。C29H32N2O5的计算值C，66.9；H，6.2；N，5.4％)。
实施例5
1-(3-C-烯丙基-3，5-二-O-苄基-β-D-呋喃核糖基)胸腺嘧啶(2)
将甲醇钠(3.03g，55.5mmol)加入核苷1(11.6g，22.3mmol)的甲醇 (110cm3)的搅拌溶液中。于室温下搅拌该反应混合物16小时并用稀盐 酸中和。部分蒸发溶剂，残留物溶于二氯甲烷(2×400cm3)。用饱和碳 酸氢钠水溶液(3×250cm3)洗涤有机相并干燥(硫酸钠)。减压除去溶 剂，得到为白色固体的物质2(10.1g，95％)。δH(CDCl3)8.77(1H，br s， NH)，7.58(1H，d，J1.2，6-H)，7.41-7.25(10H，m，Bn)，6.14(1H，m，2″- H)，6.12(1H，d，J7.8，1′-H)，5.23(1H，m，3″-Ha)，5.17(1H，br s，3″-Hb)， 4.68(1H，d，J10.8，Bn)，4.59(2H，s，Bn)，4.55(1H，d，J10.9，Bn)，4.39 (1H，br s，4′-H)，4.26(1H，ddJ7.8，10.7，2′-H)，3.84(1H，dd，J3.1，11.0， 5′-Ha)，3.58(1H，dd，J1.4，11.0，5′-Hb)，3.04(1H，d，J10.8，2′-OH)，2.82- 2.78(2H，m，1″-Ha，1″-Hb)，1.51(3H，d，J1.0，CH3)。δC(CDCl3)163.5 (C-4)，151.1(C-2)，137.3，136.7(Bn)，136.0(C-6)，132.1(C-2″)，128.8， 128.5，128.3，127.9，127.6(Bn)，118.4(C-3″)，111.1(C-5)，87.4，82.6，81.1， 79.3(C-1′，C-2′，C-3′，C-4′)，73.7，69.8(Bn)，64.7(C-5′)，35.1(C-1″)，11.9 (CH3)。(实测值：C，67.8；H，6.1；N，5.5。C27H30N2O6的计算值C，67.8；H， 6.3；N，5.9％)。
实施例6
1-(3-C-烯丙基-3，5-二-O-苄基-2-O-甲磺酰基-β-D-呋喃核糖基)胸腺嘧 啶(3)
于0℃，将甲磺酰氯(1.69cm3，21.89mmol)加入核苷2(3.50g，7.31 mmol)的无水吡啶(23cm3)的搅拌溶液中。于室温下搅拌该反应混合物 1小时，加入水(100cm3)并用二氯甲烷(3×150cm3)提取。用饱和碳酸 氢钠水溶液(3×200cm3)洗涤有机相并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂， 残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1)作为洗脱剂得到为 白色固体的物质3(3.64g，89％)。δH(CDCl3)8.95(1H，br s，NH)，7.71(1 H，d，J1.1，6-H)，7.39-7.25(10H，m，Bn)，6.52(1H，d，J8.0，1′-H)，5.90 (1H，m，2″-H)，5.34(1H，d，J7.9，2′-H)，5.20-5.09(2H，m，3″-Ha，3″-Hb)， 4.91(1H，d，J11.2，Bn)，4.68(1H，d，J11.3，Bn)，4.64(2H，s，Bn)，4.33 (1H，br s，4′-H)，3.81(1H，dd，J2.5，11.1，5′-Ha)，3.73(1H，dd，J1.1， 11.1，5′-Hb)，3.08(1H，dd，J5.5，5.7，1″-Ha)，2.99(3H，s，CH3)，2.68(1H， m，1″-Hb)，1.51(3H，d，J0.8，CH3)。δC(CDCl3)163.4(C-4)，150.8(C-2)， 137.9，136.3(Bn)，135.5(C-6)，131.0(C-2″)，128.8，128.3，127.5，127.2 (Bn)，119.3(C-3″)，111.6(C-5)，84.1，83.6，82.4，82.2(C-1′，C-2′，C-3′，C- 4′)，73.7，68.9(Bn)，66.2(C-5′)，38.7(CH3)，33.0(C-1″)，11.9(CH3)。(实测 值：C，60.5；H，5.8；N，4.9。C28H32N2O8S的计算值C，60.4；H，5.8；N， 5.0％)。
实施例7
1-(3-C-烯丙基-3，5-二-O-苄基-β-D-阿拉伯呋喃糖基)胸腺嘧啶(4)
于回流下，将核苷3(3.59g，6.45mmol)在乙醇(72cm3)、水(72cm3) 和1M氢氧化钠水溶液(20.6cm3)中的溶液搅拌18小时。用稀盐酸中和 后，减压除去溶剂，残留物溶于二氯甲烷(3×150cm3)。用饱和碳酸氢 钠水溶液(3×200cm3)洗涤有机相并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂，残 留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v)作为洗脱剂得到为 白色固体的物质4(2.32g，74％)。δH(CDCl3)7.60(1H，d，J1.2，6-H)， 7.50-7.23(10H，m，Bn)，6.22(1H，d，J2.9，1′-H)，5.80(1H，m，2″-H)， 5.15-5.08(2H，m，3″-Ha，3″-Hb)，4.86-4.33(6H，m，2×Bn，2′-H，4′-H)， 3.82-3.71(2H，m，5′-Ha，5′-Hb)，2.72(1H，m，1″-Ha)，2.52(1H，dd，J7.6， 16.1，1″-Hb)，1.70(3H，d，J0.9，CH3)。δC(CDCl3)165.1(C-4)，150.4(C- 2)，138.4，136.8(Bn)，137.7(C-6)，132.3(C-2″)，128.77128.4，128.3， 128.0，127.9，127.6(Bn)，118.5，(C-3″)，107.8(C-5)，88.0，87.8，83.7(C-1′， C-3′，C-4′)，73.7，72.9，69.4(Bn，C-2′)，64.7(C-5′)，31.1(C-1″)，12.4 (CH3)。(实测值：C，67.5；H，5.3；N，5.3。C27H30N2O6，0.25H2O的计算值C， 67.1；H，6.4；N，5.8％)。
实施例8
1-(3，5-二-O-苄基-3-C-(2-羟乙基)-β-D-阿拉伯呋喃糖基)胸腺嘧啶(5)
将高碘酸钠(3.04g，14.2mmol)和在叔丁醇(w/w，0.603cm3，40μmol) 中的2.5％四氧化锇溶液加入核苷4(2.26g，4.68mmol)的THF(12cm3) 和水(12cm3)的搅拌溶液中。于室温下搅拌该溶液45分钟。加入水(25 cm3)并用二氯甲烷(2×50cm3)提取该溶液。用饱和碳酸氢钠水溶液(3 ×30cm3)洗涤有机相并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂，使残留物再溶 于THF(12cm3)和水(12cm3)中。于室温下搅拌该混合物并加入硼氢化 钠(182mg，4.71mmol)。搅拌1.5小时后，加入水(25cm3)并用二氯甲烷 (2×50cm3)提取该溶液。用饱和碳酸氢钠水溶液(3×30cm3)洗涤有机 相并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用二 氯甲烷/甲醇(98∶2，v/v)作为洗脱剂得到为白色固体物质的5(1.13g， 49％)。δH(CDCl3)9.29(1H，br s，NH)，7.47(1H，d，J1.1，6-H)，7.38- 7.25(10H，m，Bn)，6.22(1H，d，J3.4，1′-H)，4.62(2H，s，Bn)，4.60(1H， m，4′-H)，4.46(2H，s，Bn)，4.35(1H，dd，J3.4，7.5，2′-H)，3.83-3.73(4H， m，2×5′-H，2×2″-H)，2.67(1H，br s，OH)，2.07-2.01(2H，m，2×1″-H)， 1.77(3H，d，J0.5，CH3)。δC(CDCl3)164.3(C-4)，150.3(C-2)，137.6， 137.4(Bn，C-6)，136.7(Bn)，128.6，128.4，128.2，127.8，127.6，127.3， 127.1(Bn)，108.4(C-5)，88.0，87.7，81.6，74.7(C-1′，C-2′，C-3′，C-4′)，73.7， 69.6(Bn)，64.6(C-5′)，57.7(C-2″)，28.6(C-1″)，12.4(CH3)。FAB-MSm/z 483[M+H]+，505[M+Na]+(实测值：C，63.6；H，6.2；N，5.4。C26H30N2O7， 0.5H2O的计算值C，63.5；H，6.4；N，5.7％)。
实施例9
(1S，5R，6R，8R)-5-羟基-6-(羟甲基)-8-(胸腺嘧啶-1-基)-2，7-二氧杂二环 [3.3.0]-辛烷(6)
于0℃搅拌核苷5(1.08g，2.20mmol)的无水吡啶(5.0cm3)溶液并滴 加对甲苯磺酰氯(462mg，2.47mmol)的无水吡啶(2.0cm3)溶液。于室温下 搅拌20小时后，加入水和冰(70cm3)的混合物，用二氯甲烷(2×75cm3) 提取。用饱和碳酸氢钠水溶液(3×50cm3)洗涤有机相并干燥(硫酸钠)。 减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v) 作为洗脱剂得到中间体，将其蒸发后溶于无水DMF(4.0cm3)中。于0 ℃将该溶液滴加到60％氢化钠(203mg，4.94mmol)在无水DMF(4.0cm3) 中的搅拌悬浮液中。搅拌该混合物18小时，加入水(20cm3)。用盐酸 中和后，加入二氯甲烷(75cm3)。用饱和碳酸氢钠水溶液(3×50cm3)洗 涤有机相并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化， 用二氯甲烷/甲醇(98∶2，v/v)作为洗脱剂得到为白色固体的物质 (858mg)。于室温下搅拌该白色固体物质(846mg，1.80mmol)的乙醇 (10.0cm3)溶液并加入载于碳(400mg)上的20％氢氧化钯。用氩气使该混 合物脱气并置于氢气中。搅拌2小时后，经硅胶柱层析直接纯化该混 合物，用二氯甲烷/甲醇(97∶3，v/v)作为洗脱剂得到为白色固体的物质6 (444mg，82％)。δH((CD3)2SO)11.3(1H，br s，NH)，7.36(1H，d，J1.1，6- H)，5.80(1H，d，J4.3，1′-H)，5.61(1H，s，OH)，4.86(1H，m，5′-Ha)，3.89 (1H，d，J4.2，2′-H)，3.85(1H，m，2″-Ha)，3.83-3.64(3H，m，4′-H，5′-Hb， 2″-Hb)，2.14(1H，m，1″-Ha)，1.81(1H，m，1″-Hb)，1.78(3H，d，J1.0， CH3)。δC(CD3OD)166.7(C-4)，152.2(C-2)，139.7(C-6)，110.1(C-5)， 89.4，89.1，85.5，85.2(C-1′，C-2′，C-3′，C-4′)，71.4(C-2″)，61.6(C-5′)，37.0 (C-1″)，12.7(CH3)。(实测值：C，47.4；H，5.7；N，9.0。C12H16N2O8，H2O的 计算值C，47.7；H，6.0；N，9.3％)。
实施例10
(1S，5R，6R，8R)-6-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-5-羟基-8-(胸腺嘧 啶-1-基)-2，7-二氧杂二环[3.3.0]-壬烷(7)
于室温下搅拌核苷6(310mg，1.09mmol)的无水吡啶(2.5cm3)溶液 并加入4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(593mg，1.83mmol)。搅拌3小时后， 加入另外的4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(100mg，0.310mmol)。再搅拌2 小时后，加入甲醇(0.5cm3)并蒸发该混合物。使残留物溶于二氯甲烷 (5cm3)并用饱和碳酸氢钠水溶液(3×5cm3)洗涤。干燥(硫酸钠)有机相并 减压蒸发。残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v)作为 洗脱剂得到为白色固体的物质7(618mg，97％)。δH(CDCl3)9.04(1H，br s，NH)，7.47-7.16(10H，m，6-H，DMT)，6.86-6.82(4H，m，DMT)，6.06(1 H，d，J4.1，1′-H)，4.35(1H，d，J4.1，2′-H)，4.03(1H，m，4′-H)，3.89(1H， m，2″-Ha)，3.79(6H，s，2×OCH3)，3.61(1H，m，5′-Ha)，3.32-3.26(2H，m， 5′-Hb，2″-Hb)，1.94-1.69(2H，m，1″-Ha，1″-Hb，)，1.89(3H，s，CH3)。δC (CDCl3)163.4(C-4)，158.6(DMT)，150.1(C-2)，144.3(DMT)，137.2(C- 6)，135.6，135.3，129.9，129.9，128.9，128.1，127.9，126.9，125.2，113.2 (DMT)，109.3(C-5)，88.7，87.3，86.9，83.5，81.0(DMT，C-1′，C-2′，C-3′， C-4′)，69.7(C-2″)，62.1(C-5′)，55.1(OCH3)，36.5(C-1″)，12.5(CH3))。
实施例11
(1S，5R，6R，8R)-5-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)-6-(4，4′-二甲氧 基三苯甲基氧基甲基)-8-(胸腺嘧啶-1-基)-2，7-二氧杂二环[3.3.0]-壬烷 (8)
于室温下搅拌核苷7(436mg，0.743mmol)的无水二氯甲烷(2.2cm3) 和二异丙基乙胺(0.62cm3)的溶液并加入2-氰基乙基N，N-二异丙基磷酰 胺基chloridite(0.33cm3，1.46mmol)。搅拌1.5小时后，加入甲醇(0.4cm3) 和乙酸乙酯(5cm3)，用饱和碳酸氢钠水溶液(3×5cm3)和盐水(3×5cm3) 洗涤该混合物。干燥(硫酸钠)有机相并减压蒸发。残留物经硅胶柱层 析纯化，用二氯甲烷/三乙胺(97∶3，v/v)作为洗脱剂，蒸发溶剂得到一油 状物，将其溶于甲苯(1cm3)，于-30℃从己烷中沉淀得到为白色固体的 物质8(517mg，88％)。δP(CDCl3)142.0，141.9。
实施例12
1-(3，5-二-O-苄基-3-C-(2-羟乙基)-β-D-呋喃核糖基)胸腺嘧啶(9)
将高碘酸钠(1.34g，6.27mmol)和在叔丁醇(w/w，0.265cm3，19μmol) 中的2.5％四氧化锇溶液加入核苷2(1.00g，2.09mmol)的THF(5.4cm3) 和水(5.4cm3)的搅拌溶液中。于室温下搅拌该溶液45分钟。加入水(25 cm3)并用二氯甲烷(2×50cm3)提取该溶液。用饱和碳酸氢钠水溶液(3 ×30cm3)洗涤有机相并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂，使残留物再溶 于THF(5.4cm3)和水(5.4cm3)中。于室温下搅拌该混合物并加入硼氢化 钠(79mg，2.08mmol)。搅拌1.5小时后，加入水(25cm3)并用二氯甲烷(2 ×50cm3)提取该溶液。用碳酸氢钠饱和水溶液(3×30cm3)洗涤有机相 并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯 甲烷/甲醇(98∶2，v/v)作为洗脱剂得到为白色固体物质的核苷9(448mg， 49％)。δH(CDCl3)9.14(1H，br s，NH)，7.60(1H，d，J1.1，6-H)，7.40- 7.22(10H，m，Bn)，6.25(1H，d，J7.7，1′-H)，4.59(1H，d，J7.1Bn)，4.49 (1H，d，J7.1Bn)，4.39-3.30(m，8H，4′-H，2′-H，Bn，5′-Ha，5′-Hb，2″-Ha，2″- Hb)，2.23-2.00(2H，m，1″-Ha，1″-Hb)，1.49(3H，d，J0.7，CH3)。δC(CDCl3) 163.5(C-4)，151.2(C-2)，137.1，136.5(Bn)，135.7(C-6)，128.7，128.5， 128.2，127.8，127.6，127.2(Bn)，111.3(C-5)，87.0，82.7，81.1，78.3(C- 1′，C-2′，C-3′，C-4′)，73.7，69.6(Bn)，64.4(C-5′)，57.0(C-2″)，32.4(C-1″)， 11.8(CH3)。(实测值：C，63.9；H，6.3；N，5.4。C26H30N2O7，0.25H2O的计 算值C，64.1；H，6.3；N，5.57％)。
实施例13
1-[3-C-(2-O-叔丁基二甲基硅烷基氧基乙基)-3，5-二-O-苄基-β-D-呋喃 核糖基)胸腺嘧啶(10)
将核苷9(1.80g，3.4mmol)和叔丁基二甲基硅烷基氯(0.585g， 3.9mmol)的混合物溶于无水吡啶(20cm3)中。于室温下2小时后，蒸发 该反应混合物至干，与甲苯(2×10cm3)共蒸发两次并再溶于二氯甲烷 (150cm3)中。用饱和碳酸氢钠水溶液(2×30cm3)洗涤该溶液并蒸发得 到一泡沫物。该物质经制备性硅胶HPLC纯化，用梯度洗脱液(，0-3％ 甲醇二氯甲烷，v/v)洗脱得到为白色固体物质的核苷10(1.86g，92％)。 δH(CDCl3)7.61(1H，d，J1.1，6-H)，7.35-7.20(10H，m，Bn)，6.27(1H，d，J 7.9，1′-H)，4.65-4.40(4H，m，Bn，2′-H)，4.37(1H，s，Bn)，4.28(1H，t，J7.9， 4′-H)，4.35-3.55(4H，m，2″-Ha，2″-Hb，5′-Ha，5′-Hb)，2.30-2.05(2H，m，1″- Ha，1″-Hb)，1.46(3H，s，5-CH3)，0.90(9H，m，CH3-C-Si)，0.08(6H，m， CH3-Si)。δC(CDCl3)163.6(C-6)，151.0(C-2)，137.5，136.6，135.8(C-5， Bn)，128.3，128.1，127.8，127.2，127.1，126.8，126.7(Bn)，110.7(C-4)， 86.8，82.5，81.6，78.3(C-1′，C-2′，C-3′，C-4′)，73.3，69.8(Bn)，64.46(C-5′)， 58.2(C-2″)，32.9(C-1″)，25.6，25.4，17.9，-3.9，-5.7(TBDMS)，11.6 (CH3)。FAB+-MS：m/z 597.19[M+H]+，619.18[M+Na]+(实测值：C，64.2； H，7.4；N，4.2；C32H44O7N2Si的计算值C，64.4；H，7.4；N，4.7％)。
实施例14
1-[3-C-(2-叔丁基二甲基硅烷基氧基乙基)-3，5-二-O-苄基-β-D-赤-呋喃 戊-2-糖基)胸腺嘧啶(11)
将核苷10(2.14g，3.59mmol)、1.48g(3.95mmol)重铬酸吡啶鎓 (1.48g，3.95)和活化的3A分子筛粉(4g)的混合物悬浮于无水二氯甲烷 (80cm3)中。将该混合物冷却至-10℃后，在剧烈搅拌下滴加乙酸酐 (10cm3，98mmol)。使该悬浮液温热至室温，继续搅拌1.5小时，再通 过加入三乙胺(20cm3)猝灭该反应。用二氯甲烷将该混合物稀释至 300cm3并用水(2×200cm3)洗涤。蒸发有机相，残留物经快速硅胶层 析HPLC纯化，用1.0、1.2、1.3、1.4，1.5％甲醇在二氯甲烷中的梯度 液(v/v，每份总体积250cm3)洗脱得到为白色固体物质的核苷11(1.89g， 84.4％)。δH(CDCl3)7.35-7.20(11H，m，Bn，6-H)，6.40(1H，s，1′-H)，4.57 (1H，s，Bn)，4.52(1H，s，Bn)，4.46(1H，d，J11.0，Bn)，4.29(1H，d，J11.0， Bn)，4.07(1H，dd，J′0.5，2.2，4′-H)，3.95-3.70(4H，m，2″-Ha，2″-Hb，5′-Ha， 5′-Hb)，2.05(1H，m，1″-Ha)，2.42(1H，m，1″-Hb)，1.42(3H，d，J1.1，5-CH3)， 0.86(9H，s，CH3-C-Si)，0.01(6H，s，CH3-Si)。δC(CDCl3)202.6(C-2′)， 163.7(C-4)，151.2(C-2)，137.7，136.6，136.5(Bn，C-6)，128.7，128.5， 128.2，128.1，127.7，126.4，126.3(Bn)，110.9(C-5)，84.5，81.3，80.2(C-1′， C-3′，C-4′)，73.6，70.4(Bn)，66.0(C-5′)，57.6(C-2″)，27.3(C-1″)，25.9， 25.7，18.2，-5.8，-5.9(TBDMS)，11.7(CH3)。FAB-MS m/z 595.14
[M+H]+(实测值：C，64.1；H，6.9；N，4.5；C32H42O7N2Si的计算值C， 64.6；H，7.1；N，4.7％)。
实施例15
(1S，5R，6R，8R)-1-羟基-5-苄氧基-6-苄氧基甲基-8-(胸腺嘧啶-1-基)-2，7- 二氧杂二环[3.3.0]-辛烷(12)
将化合物11(1.08g，30.3mmol)溶于0.5％HCl的甲醇(w/w，20cm3) 中，于室温下搅拌该混合物30小时。蒸发至干后，使残留物溶于二氯 甲烷(100cm3)并用饱和碳酸氢钠水溶液(2×40cm3)洗涤。蒸发有机相， 残留物经快速硅胶层析纯化，用在二氯甲烷中的2％甲醇(v/v)洗脱得到 为白色固体物质的核苷12(1.35g，93.5％)。δH(CDCl3)7.37-7.27(11H，m， Bn，6-H)，5.87(1H，s，1′-H)，4.71(2H，s，Bn)，4.64(1H，d，J12.0，Bn)， 4.56(1H，d，J12.0，Bn)，4.36(1H，t，J5.7，4′-H)，4.16(1H，m，2″-Ha)，3.96 (1H，m，2″-Hb)，3.74(2H，m，5′-Ha，5′-Hb)，2.35-2.15(2H，m，1″-Ha，1″-Hb)， 1.88(3H，s，CH3)。δC(CDCl3)163.7(C-4)，151.4(C-2)，137.8，137.3， 136.7(Bn，C-6)，128.5，128.4，128.0，127.8，127.5(Bn)，109.9(C-5)，108.6 (C-2′)，88.8，87.1，80.9(C-1′，C-3′，C-4′)，73.6，68.5，68.1，67.9(C-5′，C-2″， Bn)，30.9(C-1″)，12.6(CH3)。FAB-MS：m/z 481.03[M+H]+，503.02
[M+Na]+(实测值：C，64.6；H，5.8；N，5.7；C26H28O7N2的计算值C，65.0； H，5.9；N，5.8％)。
实施例16
(1S，5R，6R，8R)-1，5-二羟基-6-羟甲基-8-(胸腺嘧啶-1-基)-2，7-二氧杂-二 环[3.3.0]-辛烷(13)
通过制备6所述相同的方法催化除去苄基保护基团从化合物12 连续衍生出化合物13。经硅胶柱层析纯化，用在二氯甲烷中的甲醇的 梯度浓度液(6-14％)洗脱实现13的纯化。分析量的化合物13(高达 15mg)经在Nucleosil C18(μm)包被的柱(10×250mm)反相HPLC进一 步纯化。流速：8cm3/min；洗脱剂：0-10％乙腈60分钟，收率82％。δH (CD3OD)7.44(1H d，J1.2，6-H)，5.83(1H，s，1′-H)，4.10-3.80(5H，m，5′- Ha，5′-Hb，2″-Ha，2″-Hb，4′-H)，2.39-2.25(1H，m，1″-Ha)，2.00-1.90(1H，m， 1″-Hb)，1.87(3H，d，J1.2，CH3)。δC(CD3OD)166.3(C-4)，152.7(C-2)， 139.8(C-6)，110.0，109.6(C-2′，C-5)，87.8，85.8，84.6(C-1′，C-3′，C-4′)， 68.8，61.6(C-5′，C-2″)，35.6(C-1″)，12.4(CH3)。FAB-MS：m/z 301.03
[M+H]+(实测值：C，46.6；H，5.7；N，8.5；C12H16O7N2的计算值C，48.0；H， 5.4；N，9.3％)。
实施例17
(1S，5R，6R，8R)-5-苄氧基-6-苄氧基甲基-1-甲氧基-8-(3-N-甲基胸腺嘧啶 -1-基)-2，7-二氧杂二环[3.3.0]-辛烷(14)，(1S，5R，6R，8R)-5-苄氧基-6-苄氧 基甲基-1-羟基-8-(3-N-甲基胸腺嘧啶-1-基)-2，7-二氧杂二环[3.3.0]-辛烷 (15)和(1S，5R，6R，8R)-5-苄氧基-6-苄氧基甲基-1-甲氧基-8-(胸腺嘧啶-1- 基)-2，7-二氧杂二环[3.3.0]-辛烷(16)
搅拌下，用10分钟将化合物12(1.04g，2.16mmol)和氢化钠(171mg 在矿物油中的60％悬浮液，4.30mmol)溶于无水二氯甲烷(4cm3)中。加入 甲基碘(1cm3，16mmol)，将该反应混合物于36℃孵育23小时。蒸发后， 残留物经硅胶柱层析纯化，用在二氯甲烷中的0.4-2.4％甲醇的梯度液 (v/v)洗脱，得到产物14、产物15和产物16以及原料12(212mg， 20.5％)。化合物14(47mg，4.3％)。δH(CDCl3)7.25-7.37(11H，m，Bn，6- H)，6.15(1H，s，1′-H)，4.74(1H，d，J11.5，Bn)，4.67(1H，d，J11.3，Bn)， 4.62(1H，d，J12.1，Bn)，4.55(1H，d，J11.9，Bn)，4.34(1H，t，J5.6，4′-H)， 3.99，(1H，m，2″-Ha)，4.22(1H，m，2″-Hb)，3.72(2H，m，5′-Ha，5′-Ha)，3.41 (3H，s，CH3-O)，3.35(3H，s，CH3-N3)，2.27(1H，m，1″-Ha)，2.41(1H，m，1″- Hb)，1.93(3H，s，5-CH3)。δC(CDCl3)163.3(C-4)，151.0(C-2)，138.2，137.3， 135.7(Bn，C-6)，128.3，128.2，127.8，127.6，127.4，126.9(Bn)，111.8(C-5)， 108.5(C-2′)，89.1，84.8，79.5(C-1′，C-3′，C-4′)，73.5，68.4，68.2，67.3(Bn， C-5′，C-2″)，50.8(CH3-O)，32.6(C-1″)，27.9(CH3-N)，13.2(CH3)。FAB-
MS：m/z 508.88[M+H]+(实测值：C，65.7；H，6.9；N，4.8；C28H32O7N2的计 算值C，66.1；H，6.3；N，5.5％)。化合物15(97mg，9.1％)。δH(CDCl3) 7.37-7.28(11H，m，Bn，6-H)，5.86(1H，s，1′-H)，4.72(2H，s，Bn)，4.64(1H， d，J11.9，Bn)，4.58(1H，d，J11.9，Bn)，4.37(1H，t，J5.6，4′-H)，4.13(1H， m，2″-Ha)，3.93(1H，m，2″-Hb)，3.75(2H，m，5′-Ha，5′-Hb)，3.34(1H，s， CH3-N)，2.32-2.16(2H，m，1″-Ha，1″-Hb)，1.93(3H，s，CH3).δC(CDCl3) 163.2(C-4)，151.9(C-2)，137.5，137.1，134.0(Bn，C-6)，128.4，128.3， 128.1，127.9127.7，127.6，127.3(Bn)，108.8，108.5(C-2′，C-5)，88.7(C-1′)， 88.0，81.0(C-3′，C-4′)，73.5，68.3，67.9，67.7(Bn，C-5′，C-2″)，30.6(C-1″)， 27.8(CH3-N)，13.2(CH3)。FAB-MS m/z 495.28[M+H]+，517.24[M+Na]+.
化合物16(665mg，62.3％)。δH(CDCl3)7.35-7.25(11H，m，Bn，6-H)，6.06 (1H，s，1′-H)，4.73(1H，d，J11.5，Bn)，4.66(1H，d，J11.3，Bn)，4.61(1H，d， J11.9，Bn)，4.55(1H，d，J12.0，Bn)，4.34(1H，t，J5.6，4′-H)，4.20(1H，m， 2″-Ha)，3.98(1H，m，2″-Hb)，3.72(2H，m，5′-Ha，5′-Hb)，3.40(3H，s，CH3-O)， 2.45-2.35(1H，m，1″-Ha)，2.30-2.20(1H，m，1″-Hb)，1.90(3H，d，J1.1， CH3)。δC(CDCl3)163.2(C-4)，150.1(C-2)，138.2，137.9，137.3(Bn，C-6)， 128.4，128.2，127.8，127.6 127.4，127.1(Bn)，110.8(C-5)，109.3(C-2′)， 89.2，84.2，79.6(C-1′，C-3′，C-4′)，73.6，68.5，68.3，67.4(Bn，C-5′，C-2″)， 50.8(CH3-O)，32.6(C-1″)，12.5(CH3)。FAB-MS m/z 495.22[M+H}+，
517.23[M+Na]+(实测值：C，66.2；H，7.2；N，4.4；C27H30O7N2的计算 值：C，65.6；H，6.1；N，5.7％)。
实施例18
(1S，5R，6R，8R)-5-羟基-6-羟甲基-1-甲氧基-8-(胸腺嘧啶-1-基)-2，7-二氧 杂二环[3.3.0]-辛烷(17)
将载于活性炭(250mg)上的20％氢氧化钯加入核苷16(1.20g， 2.43mmol)的甲醇(10cm3)的溶液中，减压下小心地使该混合物脱气。使 用氢气并继续搅拌12小时。使该反应混合物通过一包被有在甲醇中的 硅胶的玻璃柱(1×8cm)过滤除去催化剂。用甲醇(20cm3)再次洗柱。收 集所有的部分，蒸发至干并与石油醚共蒸发得到玻璃样固体。残留物 经硅胶层析纯化，用在二氯甲烷中的5-10％甲醇的梯度液(v/v)洗脱。 收集含有产物的部分，合并并蒸发至干。使残留物溶于无水甲醇(5cm3) 中，加入无水苯(100cm3)中。冻干得到为白色固体物质的核苷17(0.61g， 79％)。δH(CD3OD)7.45(1H，s，6-H)，5.93(1H，s，1′-H)，4.15-3.81(5H，m， 5′-Ha，5′-Hb，2″-Ha，2″-Hb，4′-H)，3.43(3H，s，CH3-O)，2.47-2.40(1H，m， 1″-Ha)，2.03-1.93(1H，m，1″-Hb)，1.92(3H，s，CH3)。δC(CD3OD)164.1 (C-4)，150.1(C-2)，138.3(C-6)，109.6(C-5)，108.3(C-2′)，84.4，84.1，82.4 (C-1′，C-3′，C-4′)，68.0，59.5(C-5′，C-2″)，49.6(CH3-O)，34.0(C-1″)，10.5 (CH3)。FAB-MS m/z 315.13[M+H]+，337.09[M+Na]+(C13H18O7N2的实 测值：C，49.9；H，5.7；N，8.2；计算值：C，49.7；H，5.8；N，8.9％)。
实施例19
(1S，5R，6R，8R)-6-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-5-羟基-1-甲氧基-8- (胸腺嘧啶-1-基)-2，7-二氧杂二环[3.3.0]-辛烷(18)
将化合物17(0.95g，3.03mmol)和4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(1.54g， 4.77mmol)的混合物溶于无水吡啶(20cm3)中并于室温下搅拌4小时。蒸 发该反应混合物得到一油状残留物，将其与甲苯(2×20cm3)共蒸发。 加入二氯甲烷(50cm3)和饱和碳酸氢钠水溶液(50cm3)，分离有机相并蒸 发，残留物经硅胶HPLC纯化(使残留物溶于最少量的含有0.5％三乙 胺(v/v)的二氯甲烷中并加于用同样的溶剂平衡的柱上。洗柱(乙酸乙酯∶ 石油醚∶三乙胺；15∶84.5∶0.5(v/v/v，1000cm3)，产物被洗脱于在二氯甲烷 中的含有0.5％三乙胺(v/v/v)的甲醇(0-2％)梯度液中，得到为白色固体 物质的化合物18(1.71g，92.8％)。δH(CDCl3)7.51-7.17(10H，m，DMT， 6-H)，6.79-6.85(4H，m，DMT)，6.04(1H，s，1′-H)，4.12-3.98(3H，m，5′-Ha， 5′-Hb，4′-H)，3.77(6H，s，CH3-DMT)，3.49(3H，s，CH3-O)，3.45-3.32(2H， m，2″-Ha，2″-Hb)，2.11-2.01(1H，m，1″-Ha)，1.94-1.87(1H，m，1″-Hb)，1.93 (3H，s，CH3)。δC(CDCl3)164.2(C-4)，158.6，144.7，135.7，130.1，128.2， 127.9，126.8，113.2(DMT)，150.7(C-2)，137.7(C-6)，109.8，109.7(C-5， C-2′)，86.5，85.3，85.0，81.4(DMT，C-1′，C-3′，C-4′)，69.2，62.4(C-5′，C- 2″)，55.2(CH3-DMT)，51.7(CH3-O)，35.5(C-1″)，12.7(CH3)。FAB-MS m/z 617.26[M+H]+，639.23[M+Na]+(C34H36O9N2的实测值：C，66.4；H， 6.1；N，4.2；计算值：C，66.2；H，5.9；N，4.5％)
实施例20
(1S，5R，6R，8R)-5-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)-6-(4，4′-二甲氧 基三苯甲基氧基甲基)-1-甲氧基-8-(胸腺嘧啶-1-基)-2，7-二氧杂二环 [3.3.0]-辛烷(19)。
将化合物18(1.2g，1.95mmol)溶于无水二氯甲烷(10cm3)中。于室 温下搅拌中加入N，N-二异丙基乙胺(1.35cm3，7.8mmol)和2-氰基乙基- N，N-二异丙基磷酰胺基chloridite(0.92g，3.9mmol)。72小时后，用二氯 甲烷稀释该混合物至100cm3并用饱和碳酸氢钠水溶液(5cm3)洗涤。蒸 发有机相并加于硅胶HPLC纯化，用在洗脱剂A(石油醚∶二氯甲烷∶吡 啶；50∶50∶0.5；v/v/v)中的洗脱剂B(石油醚∶二氯甲烷∶乙酸乙酯∶吡啶； 45∶45∶10∶0.5；v/v/v)梯度液洗脱。浓缩含有产物的部分，与甲苯(10cm3) 共蒸发并减压干燥。使残留物溶于无水苯(20cm3)中并通过将该溶液在 搅拌下加入到无水石油醚(400cm3)中沉淀。经过滤分离生成的白色固 体并干燥得到化合物19(0.96g，60.3％)。δP(CDCl3)142.64，142.52。 FAB-MS m/z 817.26[M+H]+，839.24[M+Na]+(C43H53O10N4P的实测值： C，62.8；H，6.4；N，6.9；计算值：C，63.2；H，6.5；N，6.9％)。
实施例21
1，2-O-异亚丙基-3-C-乙烯基-α-D-呋喃核糖(20)
于0℃搅拌5-O-叔丁基二甲基硅烷基-1，2-O-异亚丙基-α-D-赤-戊 糖酮-3-基呋喃核糖(pent-3-ulofuranose)(Y.Yoshimura，T.Sano，A. Matsuda，T.Ueda，Chem.Pharm.Bull.，1988，36，162)(6.05g，0.020mol) 的无水THF(250cm3)溶液，滴加1M的乙烯基溴化镁的乙醚(44cm3， 44mmol)溶液。于室温下搅拌该反应混合物2小时，其后加入饱和氯 化铵水溶液(200cm3)，用二氯甲烷(3×300cm3)进行提取。用盐水(3× 250cm3)洗涤合并的提取物并干燥(硫酸镁)。除去溶剂，使残留物再溶 于无水THF(225cm3)中。向该溶液加入1M四丁基氟化铵的THF (22cm3，22mmol)溶液，于室温下继续搅拌20分钟，其后减压蒸发该混 合物。使残留物溶于二氯甲烷(500cm3)并用饱和碳酸氢钠水溶液(2× 200cm3)洗涤。用连续提取法提取含水相12小时，干燥(硫酸钠)合并的 提取物并蒸发。残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v) 作为洗脱剂得到为白色固体物质的呋喃糖20(3.24g，75％)。δH(CDCl3) 5.84(1H，d，J3.7，1-H)，5.74(1H，dd，J11.0，17.2，1′-H)，5.52(1H，dd，J 1.6，17.1，2′-Ha)，5.29(1H，dd，J1.3，11.0，2′-Hb)，4.21(1H，d，J3.7，2-H)， 3.98(1H，t，J5.7，4-H)，3.68-3.64(2H，m，5-Ha，5-Hb)，2.88(1H，s，3-OH)， 1.99(1H，t，J6.3，5-OH)，1.60(3H，s，CH3)，1.35(3H，s，CH3)。δC(CDCl3 )133.6(C-1′)，116.2(C-2′)，113.0(C(CH3)2)，103.8(C-1)，83.4，82.4(C-4， C-2)，79.6(C-3)，61.3(C-5)，26.5，26.4(CH3)。
实施例22
3，5-二-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-3-C-乙烯基-α-D-呋喃核糖(21)
于0℃搅拌氢化钠(w/w，1.78g，44.5mmol)的无水DMF(50cm3)中 的60％悬浮液并用30分钟滴加呋喃糖20(3.20g，14.8mmol)的无水 DMF(35cm3)溶液。于50℃搅拌该溶液1小时并随后冷却至0℃。滴加 苄基溴(5.3ml，44.5mmol)的无水DMF(5.3cm3)溶液，并于室温下搅拌 该混合物20小时。蒸发该反应混合物，并再溶于二氯甲烷(300cm3)， 用饱和碳酸氢钠水溶液(3×200cm3)洗涤并干燥(硫酸钠)。减压除去溶 剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸乙酯(9∶1，v/v)作为洗脱 剂得到为白色固体物质的呋喃糖21(5.36g，91％)。δH(CDCl3)7.40-7.26 (10H，m，Bn)，5.90(1H，d，J3.6，1-H)，5.72(1H，dd，J11.1，17.9，1′-H)， 5.41(1H，dd，J0.7，11.1，2′-Ha)，5.30(1H，dd，J0.5，17.8，2′-Hb)，4.70-4.45 (6H，m，Bn，2-H，4-H)，3.69(1H，dd，J2.6，10.8，5-Ha)，3.50(1H，dd，J7.9， 10.9，5-Hb)，1.64(3H，s，CH3)，1.40(3H，s，CH3)。δC(CDCl3)138.6， 138.3(Bn)，134.5(C-1′)，128.3-127.4(Bn)，118.2(C-2′)，112.9(C(CH3)2)， 104.7(C-1)，84.7，81.1，81.0(C-2，C-3，C-4)，73.3(C-5)，69.4，67.0(Bn)， 26.8，26.6(CH3)。
实施例23
1，2-二-O-乙酰基-3，5-二-O-苄基-3-C-乙烯基-α，β-D-呋喃核糖(22)
于90℃，将呋喃糖21(4.40g，11.1mmol)的80％含水乙酸(50cm3) 溶液搅拌8小时。除去溶剂，残留物与99％乙醇(3×25cm3)、甲苯(3 ×25cm3)和无水吡啶(2×25cm3)共蒸发，再溶于无水吡啶(20cm3)中。 加入乙酸酐(17cm3)，于室温下搅拌该溶液48小时。用冰冷却的水 (100cm3)猝灭该反应，用二氯甲烷(3×100cm3)提取。用饱和碳酸氢钠 水溶液(3×100cm3)洗涤合并的提取物并干燥(硫酸钠)。蒸发溶剂，残 留物经硅胶柱层析纯化，用石油醚/乙酸乙酯(4∶1，v/v)作为洗脱剂得到 为油状的呋喃糖22(4.27g，87％，α∶β～1∶1)。δC(CDCl3)169.9，169.8 (C＝O)，139.0，138.6，138.0，137.8(Bn)，133.3，132.4(C-1′)，128.4-126.8 (Bn)，119.6，119.5(C-2′)，99.5，94.0(C-1)，85.4，85.0，84.3，83.6，77.7， 73.6，73.5，73.3，70.0，69.2，67.5，67.2(C-2，C-3，C-4，C-5，Bn)，21.0，20.9， 20.6，20.4(CH3)。
实施例24
1-(2-O-乙酰基-3，5-二-O-苄基-3-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)胸腺嘧啶 (23)
将N，O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(11.9cm3，48.1mmol)加入化合物 22(4.24g，9.6mmol)和胸腺嘧啶(2.43g，19.3mmol)的无水乙腈(100cm3) 的搅拌溶液中。于回流下搅拌反应混合物30分钟。冷却至0℃后，滴 加三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯(3.2cm3，16.4mmol)，于室温下搅拌该溶 液24小时。用冷的饱和碳酸氢钠水溶液(100cm3)猝灭该反应，生成的 混合物用二氯甲烷(3×50cm3)提取。用饱和碳酸氢钠水溶液(2×50cm3) 和盐水(2×50cm3)洗涤合并的提取物并干燥(硫酸钠)。减压蒸发提取 物，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v)作为洗脱剂 得到为白色泡沫物的核苷23(4.03g，83％)。δH(CDCl3)8.78(1H，br s， NH)，7.75(1H，s，6-H)，7.38-7.26(10H，m，Bn)，6.49(1H，d，J8.1，1′-H)， 5.99-5.88(2H，m，2′-H和1″-H)，5.54-5.48(2H，m，2″-Ha，2″-Hb)，4.91- 4.50(4H，m，Bn)，4.34(1H，s，4′-H)，3.80(1H，m，5′-Ha)，3.54(1H，m，5′- Hb)，2.11(3H，s，COCH3)，1.48(3H，s，CH3)。δC(CDCl3)170.1(C＝O)， 163.8(C-4)，151.0(C-2)，138.9，136.9(Bn)，136.1(C-6)，132.0(C-1″)， 128.7，128.5，128.2，127.8，127.7，127.5，127.5，127.1(Bn)，120.7(C-2″)， 111.3(C-5)，85.4(C-1′)，85.2(C-3′)，84.3(C-4′)，76.0(C-2′)，73.7(C-5′)， 69.3，67.6(Bn)，20.6(COCH3)，11.7(CH3)。C28H30N2O7的实测值：C，66.3； H，6.0；N，5.1；计算值：C，66.4；H，6.0；N，5.5％.
实施例25
1-(3，5-二-O-苄基-3-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)胸腺嘧啶(24)
将甲醇钠(0.83cm3，15.4mmol)加入核苷23(3.90g，7.7mmol)的无水 甲醇(40cm3)的搅拌溶液中。于室温下搅拌该化合物42小时，然后用 稀盐酸水溶液中和。用二氯甲烷(2×150cm3)提取该混合物，用饱和碳 酸氢钠水溶液(3×100cm3)洗涤合并的提取物并干燥(硫酸钠)。减压除 去溶剂，得到为白色泡沫物的核苷24(3.48g，97％)。δH(CDCl3)8.89(1H， br s，NH)，7.60(1H，d，J0.9，6-H)，7.36-7.26(10H，m，Bn)，6.23(1H，d，J 7.8，1′-H)，5.98(1H，dd，J11.2，17.7，1″-H)，5.66(1H，d，J17.7，2″-Ha)， 5.55(1H，d，J11.5，2″-Hb)，4.75-4.37(6H，m，2′-H，4′-H，Bn)，3.84(1H，dd， J2.7，10.8，5′-Ha)，3.58(1H，d，J11.2，5′-Hb)，3.23(1H，d，J10.6，2′-OH)， 1.50(3H，s，CH3)。δC(CDCl3)163.7(C-4)，151 3(C-2)，138.0，136.9 (Bn)，136.0(C-6)，131.2(C-1″)，128.8，128.6，128.3，127.8，127.7，127.3 (Bn)，120.7(C-2″)，111.3(C-5)，87.3(C-1′)，84.6(C-3′)，81.4(C-4′)，78.0 (C-2′)，73.7(C-5′)，70.0，66.4(Bn)，11.8(CH3)。C26H28N2O6的实测值：C， 66.8；H，6.2；N，5.9；计算值C，67.2；H，6.1；N，6.0％。
实施例26
1-(3，5-二-O-苄基-2-O-甲磺酰基-3-C-乙烯基-β-D-呋喃核糖基)胸腺嘧 啶(25)
将核苷24(2.57g，5.53mmol)溶于无水吡啶(18cm3)中并冷却至0℃ 滴加甲磺酰氯(1.28cm3，16.6mmol)，于室温下搅拌该混合物30分钟。 用水(5cm3)猝灭该反应，生成的混合物用二氯甲烷(3×80cm3)提取。用 饱和碳酸氢钠水溶液(3×120cm3)洗涤合并的提取物并干燥(硫酸钠)。 减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v) 作为洗脱剂得到为黄色泡沫物的核苷25(2.53g，84％)。δH(CDCl3)8.92 (1H，br s，NH)，7.71(1H，d，J1.4，6-H)，7.41-7.28(10H，m，Bn)，6.57(1H， d，J7.8，1′-H)，5.99-5.61(4H，m，2′-H，1″-H和2″-Ha，2″-Hb)，4.86-4.50 (4H，m，Bn)，4.37(1H，dd，J1.5，2.4，4′-H)，8.82(1H，dd，J2.6，11.0，5′- Ha)，3.55(1H，dd，J1.2，11.0，5′-Hb)，3.02(3H，s，CH3)，1.47(3H，d，J1.1， CH3)。δC(CDCl3)163.7(C-4)，151.5(C-2)，138.7，136.7(Bn)，135.7(C- 6)，130.9(C-1″)，128.8，128.5，128.4，127.6，127.0(Bn)，121.8(C-2″)， 111.9(C-5)，85.1(C-1′)，84.5(C-3′)，84.0(C-4′)，80.7(C-2′)，73.7(C-5′)， 69.2，67.7(Bn)，38.9(CH3)，11.8(CH3)。
实施例27
1-(3，5-二-O-苄基-3-C-乙烯基-β-D-阿拉伯呋喃糖基)胸腺嘧啶(26)
于回流下，将核苷25(2.53g，4.66mmol)在乙醇(50cm3)、水(50cm3) 和1M氢氧化钠水溶液(15cm3)的混合物中的溶液搅拌16小时。用稀盐 酸水溶液中和该混合物，减压除去溶剂，用二氯甲烷(3×120cm3)提取 残留物。用饱和碳酸氢钠水溶液(3×150cm3)洗涤合并的提取物并干燥 (硫酸钠)。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲 醇(99∶1)作为洗脱剂得到为白色泡沫物的26(1.61g，74％)。δH(CDCl3) 9.89(1H，br s，NH)，7.50(1H，d，J 1.1，6-H)，7.41-7.26(Bn)，6.28(1H，d， J2.8，1′-H)，6.05(1H，dd，J11.1，17.9，1″-H)，5.58-5.50(2H，m，2″-Ha，2″- Hb)，4.98(1H，d，J9.0，2′-OH)，4.64-4.31(6H，m，2′-H，4′-H，Bn)，3.73 (2H，m，5′-Ha，5′-Hb)，1.73(1H，d，J0.6，CH3)。δC(CDCl3)165.1(C-4)， 150.5(C-2)，138.4，138.0，136.7(C-6，Bn)，130.4(C-1″)，128.8，128.6， 128.5，128.1，128.0，127.8(Bn)，120.6(C-2″)，108.1(C-5)，88.6(C-1′)， 87.9(C-3′)，87.2(C-4′)，73.7(C-2′)，71.8(C-5′)，69.7，66.3(Bn)，12.3 (CH3)。C26H28N2O6的实测值：C，66.8；H，6.2；N，5.9；计算值：C，67.2；H， 6.1；N，6.0。
实施例28
1-(3，5-二-O-苄基-3-C-羟甲基-β-D-阿拉伯呋喃糖基)胸腺嘧啶(27)
向核苷26(2.00g，4.31mmol)在THF(15cm3)和水(15cm3)的混合物 中的溶液加入高碘酸钠(2.76g，12.9mmol)和2.5％的四氧化锇的叔丁醇 (w/w，0.54cm3，43mmol)溶液。于室温下搅拌该反应物18小时，用水 (50cm3)猝灭，混合物用二氯甲烷(2×100cm3)提取。用饱和碳酸氢钠水 溶液(3×75cm3)洗涤合并的提取物，干燥(硫酸钠)并减压蒸发。使残留 物溶于THF(15cm3)和水(15cm3)的混合物中，加入硼氢化钠(488mg， 12.9mmol)。于室温下搅拌该反应混合物1小时，加入水(50cm3)，用二 氯甲烷(2×100cm3)提取该混合物。用饱和碳酸氢钠水溶液(3×75cm3) 洗涤合并的有机相并干燥(硫酸钠)。除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯 化，用二氯甲烷/甲醇(98∶2，v/v)作为洗脱剂得到为白色泡沫物的核苷27 (732mg，36％)。δH(CDCl3)11.09(1H，br s，NH)，7.41(1H，d，J1.0，6- H)，7.38-7.26(Bn)，6.16(1H，d，J2.6，1′-H)，5.12(1H，d，J5.4，2′-OH)， 4.66-4.29(6H，m，2′-H，4′-H，Bn)，4.02-3.96(2H，m，1″-Ha，1″-Hb)，3.90 (1H，dd，J7.2，9.7，5′-Ha)，3.79(1H，dd，J5.6，9.7，5′-Hb)，2.49(1H，t，J6.4， 1″-OH)，1.68(3H，d，J0.6，CH3)；δC(CDCl3)166.1(C-4)，150.6(C-2)， 139.0，137.9，137.0(C-6，Bn)，128.7，128.6，128.4，128.3，128.0(Bn)， 107.5(C-5)，88.2(C-1′)，88.1(C-3′)，84.2(C-4′)，73.7(C-5′)，72.1(C-2′)， 69.3，65.4(Bn)，58.6(C-1″)，12.3(CH3)。
实施例29
(1R，2R，4R，5S)-1-苄氧基-2-苄氧基甲基-4-(胸腺嘧啶-1-基)-3，6-二氧杂 二环[3.2.0]庚烷(28)
于-40℃搅拌化合物27(2.26g，4.83mmol)的无水吡啶(20cm3)溶 液，加入甲磺酰氯(0.482cm3，4.83mmol)的无水吡啶(10cm3)溶液。于室 温下搅拌该反应混合物17小时，加入水(50cm3)，混合物用二氯甲烷(2 ×100cm3)提取。用饱和碳酸氢钠水溶液(3×100cm3)洗涤合并的有机 相，干燥(硫酸钠)并减压蒸发。残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷 /甲醇(99∶1，v/v)作为洗脱剂得到中间体，蒸发溶剂后将其溶于无水 DMF(15cm3)中。于0℃将该溶液滴加到60％氢化钠(461mg，11.5mmol) 在无水DMF(15cm3)中的悬浮液中。于室温下搅拌该反应物30分钟， 然后用水(60cm3)猝灭。用稀盐酸水溶液中和后，使该混合物溶于二氯 甲烷(150cm3)，用饱和碳酸氢钠水溶液(3×100cm3)洗涤并干燥(硫酸 钠)。蒸发溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v) 作为洗脱剂得到为白色泡沫物的核苷28(2.00g，93％)。δH(CDCl3)9.13 (1H，br s，NH)，7.55(1H，d，J1.4，6-H)，7.40-7.26(Bn)，5.99(1H，d，J2.5， 1′-H)，5.30(1H，d，J2.7，2′-H)，4.88-4.57(6H，m，1″-Ha，1″-Hb，Bn，4.22- 4.19(1H，m，4′-H)，3.92(1H，dd，J6.2，10.8，5′-Ha)，3.82(1H，dd，J3.7， 10.8，5′-Hb)，1.91(3H，d，J1.3，CH3)。δC(CDCl3)163.8(C-4)，150.3(C-2)， 137.6(C-6)，137.5，137.0(Bn)，128.7，128.6，128.2，128.0，127.8，127.3 (Bn)，109.8(C-5)，85.7(C-3′)，84.1(C-1′)，83.5(C-4′)，79.7(C-1″)，73.9 (C-2′)，73.6(C-5′)，68.6，67.8(Bn)，12.4(CH3)。FAB m/z 451[M+H]+，473 [M+Na]+。实测值：C，66.3；H，5.9；N，6.1；C25H26N2O6的计算值：C，66.7； H，5.8；N，6.2％.
实施例30
(1R，2R，4R，5S)-1-羟基-2-羟甲基-4-(胸腺嘧啶-1-基)-3，6-二氧杂二环 [3.2.0]庚烷(29)
将载于碳(90mg)上的10％氢氧化钯加入核苷28(180mg，0.40mmol) 的乙醇(3cm3)的搅拌溶液中。用氩气使该混合物脱气数次并置于氢气 下。于室温下搅拌该反应混合物6小时，然后通过硅藻土过滤。减压 蒸发滤液，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(96∶4，v/v)作为 洗脱剂得到为白色固体物质的核苷29(92mg，86％)。δH(CD3OD)7.79 (1H，d，J1.2，6-H)，5.91(1H，d，J2.5，1′-H)，4.96(1H，d，J2.5，2′-H)，4.92 (1H，d，J7.4，1″-Ha)，4.58(1H，dd，J0.9，7.4，1″-Hb)，3.98(1H，dd，J7.3， 12.8，5′-Ha)，3.87-3.82(2H，m，4′-H，5′-Hb)，3.34(2H，s，3′-OH，5′-OH)， 1.87(3H，d，J1.3，CH3)。δC(CD3OD)166.5(C-4)，152.1(C-2)，140.1(C- 6)，110.1(C-5)，91.2(C-2′)，85.1(C-1′)，84.0(C-4′)，79.6(C-3′)，78.6(C- 1″)，61.1(C-5′)，12.3(CH3)。
实施例31
(1R，2R，4R，5S)-1-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)-2-(4，4′-二甲氧 基三苯甲基氧基甲基)-4-(胸腺嘧啶-1-基)-3，6-二氧杂二环[3.2.0]庚烷 (30)
将4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(376mg，1.11mmol)加入二醇29 (250mg，0.925mmol)的无水吡啶(4cm3)溶液中并于室温下搅拌该混合 物18小时。用甲醇(1.5cm3)猝灭该反应，减压蒸发该混合物。用饱和 碳酸氢钠水溶液(2×20cm3)洗涤残留物的二氯甲烷(30cm3)溶液，干燥 (硫酸钠)并蒸发。残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(98∶2，v/v) 作为洗脱剂得到中间体，将其溶于无水二氯甲烷(7.0cm3)中。加入N，N- 二异丙基乙胺(0.64cm3，3.70mmol)，接着加入2-氰基乙基N，N-二异丙 基磷酰胺基chloridite(0.41cm3，1.85mmol)，于室温下搅拌该混合物25 小时。用甲醇(3cm3)猝灭该反应，使该混合物溶于乙酸乙酯(70cm3)， 用饱和碳酸氢钠水溶液(3×50cm3)和盐水(3×50cm3)洗涤，干燥(硫酸 钠)并减压蒸发。残留物经硅胶柱层析纯化，用石油醚/二氯甲烷/乙酸 乙酯/三乙胺(100∶45∶45∶10；v/v/v/v)作为洗脱剂。使获得的残留物溶于甲 苯(2cm3)中并于-50℃，搅拌下从石油醚中沉淀。蒸发溶剂后，使残留 物与无水乙腈(4×5cm3)共蒸发得到30，为白色泡沫物(436mg，61％)。 31P NMR(CDCl3)146.6。
实施例32
3，5-二-O-苄基-4-C-羟甲基-1，2-O-异亚丙基-α-D-呋喃核糖(31)
于-5℃，向3-O-苄基-4-C-羟甲基-1，2-O-异亚丙基-α-D-呋喃核糖(R. D.Youssefyeh，J.P.H.Verheyden和J.G.Moffatt，J.Org.Chem.，1979， 44，1301)(20.1g，0.064mmol)的无水DMF(100cm3)的溶液加入氢化钠 的悬浮液(60％在矿物油中(w/w)，在1小时30分钟的时间内分4次加 入，总量2.85g，0.075mol)。滴加苄基溴(8.9cm3，0.075mol)，于室温下继 续搅拌3小时，其后加入冰水(50cm3)。用乙酸乙酯(4×100cm3)提取该 混合物，干燥(硫酸钠)合并的有机相。蒸发后，残留物经硅胶柱层析 纯化，用在石油醚中的5％乙酸乙酯(v/v)洗脱得到化合物31(18.5g， 71％).δC(CDCl3)138.0，137.4，128.5，128.3，128.0，127.8，127.6(Bn)， 113.5(C(CH3)2)，104.4(C-1)，86.5(C-4)，78.8，78.6(Bn)，73.6，72.6，71.6 (C-2，C-3，C-5)，63.2，(C-1′)，26.7，26.1(CH3)。
实施例33
4-C-(乙酰氧基甲基)-3，5-二-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-α-D-呋喃核糖(32)
向呋喃糖31(913mg，2.28mmol)的无水吡啶(4.5cm3)溶液滴加乙酸 酐(1.08cm3，11.4mmol)并于室温下搅拌该反应混合物3小时。通过加入 冰水(50cm3)猝灭该反应，用二氯甲烷(3×50cm3提取。用饱和碳酸氢 钠水溶液(2×50cm3)洗涤合并的有机相，干燥(硫酸钠)并减压浓缩。残 留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷作为洗脱剂得到为澄清油状物的 化合物32(911mg，90％).δH(CDCl3)7.34-7.25(10H，m，Bn)，5.77(1H， d，J3.6，1-H)，4.78-4.27(8H，m，Bn，H-5a，H-5b，H-3，H-2)，3.58(1H，d，J 10.3，H-1′a)，3.48(1H，d，J10.5，H-1′b)，2.04(3H，s，COCH3)，1.64(3H，s， CH3)，1.34(3H，s，CH3)。δC(CDCl3)171.1(C＝O)，138.2，137.9，128.6， 128.1，128.0，128.0，127，8(Bn)，114.0(C(CH3)2)，104.5(C-1)，85.4(C-4)， 79.3，78.6(C-2，C-3)，73.7，72.7，71.2(Bn，C-5)，64.9(C-1′)，26.7，26.3 (C(CH3)2)，21.0(COCH3)。实测值：C，67.0；H，6.5；C25H30O7，1/4H2O的 计算值：C，67.2；H，6.9％。
实施例34
4-C-(乙酰氧基甲基)-1，2-二-O-乙酰基-3，5-二-O-苄基-呋喃核糖(33)
于90℃搅拌呋喃糖32(830mg，1.88mmol)在80％乙酸(10cm3)溶液 4小时。减压除去溶剂，残留物与乙醇(3×5cm3)、甲苯(3×5cm3)和无 水吡啶(3×5cm3)共蒸发，再溶于无水吡啶(3.7cm3)中。加入乙酸酐 (2.85cm3)，于室温下搅拌该溶液72小时。将该溶液倾入冰水(20cm3)， 用二氯甲烷(2×20cm3)提取该混合物。用饱和碳酸氢钠水溶液(2×20 cm3)洗涤合并的有机相，干燥(硫酸钠)并减压浓缩，残留物经硅胶柱层 析纯化，用二氯甲烷作为洗脱剂得到33(α∶β～1∶3)，为澄清油状物(789 mg，86％)。δC(CDCl3)171.0，170.3，170.0，169.3(C＝O)，138.1，137.6， 136.3，128.9，128.6，128.2，128.0，128.0，127.9，127.7，124.0(Bn)，97.8， 97.8(C-1)，87.0，85.0，78.9，74.5，74.4，73.8，73.6，72.0，71.8，71.0，70.9， 64.6，64.4(C-2，C-3，C-4，Bn，C-5，C-1′)，21.0，20.8，20.6(COCH3)。实测 值：C，64.2；H，6.3；C26H30O9的计算值：C，64.2；H，6.2％。
实施例35
1-(4-C-(乙酰氧基甲基)-2-O-乙酰基-3，5-二-O-苄基-β-D-呋喃核糖基)胸 腺嘧啶(34)
将N，O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(2.61cm3，10.6mmol)加入异头混 合物33(736mg，1.51mmol)和胸腺嘧啶(381mg，3.03mmol)的无水乙腈 (14.5cm3)的搅拌溶液中。于回流下搅拌反应混合物1小时，然后冷却 至0℃。搅拌下滴加三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯(0.47cm3，2.56mmol)， 于65℃搅拌该溶液2小时。用冷的饱和碳酸氢钠水溶液(15cm3)猝灭该 反应，用二氯甲烷(3×10cm3)提取。用饱和碳酸氢钠水溶液(2×10cm3) 和盐水(2×10cm3)洗涤合并的有机相并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂， 残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(98∶2，v/v)作为洗脱剂得到 为白色固体物质的核苷34(639mg，76％)。δH(CDCl3)8.98(1H，br s， NH)，7.39-7.26(11H，m，Bn，6-H)，6.22(1H，d，J5.3，1′-H)，5.42(1H，t， J5.4，2′-H)，4.63-4.43(5H，m，3′-H，Bn)，4.41(1H，d，J12.2，5′-Ha)，4.17 (1H，d，J12.1，5′-Hb)，3.76(1H，d，J10.2，1″-Ha)，3.51(1H，d，J10.4，1″- Hb)，2.09(3H，s，COCH3)，2.03(3H，s，COCH3)，1.53(3H，d，J0.9， CH3)。δC(CDCl3)170.8，170.4(C＝O)，163.9(C-4)，150.6(C-2)，137.4 (C-6)137.4，136.1，128.9，128.8，128.4，128.2，127，9(Bn)，111.7(C-5)， 87.2，87.2，86.1(C-1′，C-3′，C-4′)，77.6(C-2′)，74.8，73.9，71.1，63.8(Bn， C-1″，C-5′)，20.9，20.8(COCH3)，12.0(CH3)。FAB-MS m/z 553[M+H]+。
实测值：C，62.7；H，5.9；N，4.7；C29H32N2O9的计算值：C，63.0；H，5.8；N， 5.1％。
实施例36
1-(3，5-二-O-苄基-4-C-(羟甲基)-β-D-呋喃核糖基)胸腺嘧啶(35)
向核苷34(553mg，1.05mmol)的甲醇(5.5cm3)的搅拌溶液加入甲醇 钠(287mg，5.25mol)。于室温下搅拌该反应混合物10分钟，然后用稀 盐酸中和。部分蒸发溶剂，用二氯甲烷(2×20cm3)提取。用饱和碳酸 氢钠水溶液(3×20cm3)洗涤合并的有机相并干燥(硫酸钠)。减压除去溶 剂得到为白色固体物质的35(476mg，97％)。δH(CDCl3)7.47(1H，d，J 1.06-H)，7.36-7.22(10H，m，Bn)，6.07(1H，d，J3.8，1′-H)，4.87(1H，d， J11.7，Bn)，4.55(1H，d，J11.7，Bn)，4.50-4.32(4H，m，Bn，2′-H，3′-H)， 3.84-3.53(4H，m，5′-Ha，5′-Hb，1″-Ha，1″-Hb)，1.50(3H，d，J1.1，CH3)。δC (CDCl3)164.3(C-4)，151.3(C-2)，137.6(C-6)136.4，136.3，128.8，128.6， 128.4，128.3，127，9(Bn)，111.1(C-5)，91.1，91.0，88.1(C-1′，C-3′，C-4′)， 77.4(C-2′)，74.8，73.8，71.4，63，2(Bn，C-5′，C-1″)，12.0(CH3)。FAB-MS m/z 491[M+Na]+。实测值：C，63.4；H，6.0；N，5.5；C25H28N2O7，1/4H2O的 计算值：C，63.5；H，6.1；N，5.9％。
实施例37
中间体35A
于0℃搅拌核苷35(225mg，0.48mmol)的无水吡啶(1.3cm3)溶液， 分次少量加入对-甲苯磺酰氯(118mg，0.62mmol)。于室温下搅拌该溶液 16小时并加入另外的对-甲苯磺酰氯(36mg，0.19mmol)。再搅拌4小时 后，加入冰水(15cm3)，用二氯甲烷(2×15cm3)提取。用饱和碳酸氢钠 水溶液(3×15cm3)洗涤合并的有机相并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂， 残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v)作为洗脱剂得到 中间体35A(140mg)，它可不经进一步纯化而用于下一步骤。
实施例38
(1S，3R，4R，7S)-7-苄氧基-1-苄氧基甲基-3-(胸腺嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂 二环[2.2.1]庚烷(36)
使中间体35A(159mg)溶于无水DMF(0.8cm3)中。于0℃将该溶液 滴加到60％氢化钠在无水DMF(0.8cm3)的矿物油(w/w，32mg， 0.80mmol)中的搅拌悬浮液中。于室温下搅拌该混合物72小时，然后 减压浓缩。使残留物溶于二氯甲烷(10cm3)中，用饱和碳酸氢钠水溶液 (3×5cm3)洗涤并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析 纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v)作为洗脱剂得到为白色固体物质的二 环核苷36(65.7mg，57％)。δH(CDCl3)9.24(1H，br s，NH)，7.49(1H，s， 6-H)，7.37-7.26(10H，m，Bn)，5.65(1H，s，1′-H)，4.70-4.71(5H，m，Bn， 2′-H)，4.02-3.79(5H，m，3′-H，5′-Ha，5′-Hb，1″-Ha，1″-Hb)，1.63(3H，s， CH3)。δC(CDCl3)164.3(C-4)，150.1(C-2)，137.7，137.1(Bn)，135.0(C-6)， 128.8，128.7，128.4，128.0，127.9(Bn)，110.4(C-5)，87.5，87.3(C-1′，C-3′)， 76.7，75.8，73.9，72.3，72.1(Bn，C-5′，C-2′，C-4′)，64.5(C-1″)，12.3 (CH3)。FAB-MS m/z 451[M+H]+。
实施例39
(1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-3-(胸腺嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂二环 [2.2.1]庚烷(37)
于室温下搅拌核苷36(97mg，0.215mmol)的乙醇(1.5cm3)溶液，加 入20％的载于碳(50mg)上的氢氧化钯。用氩气使该混合物脱气数次并 置于氢气(氢气囊)下。搅拌4小时后，混合物经硅胶柱层析纯化，用 二氯甲烷/甲醇(97∶3，v/v)作为洗脱剂得到为白色固体物质的核苷37 (57mg，98％)。δH((CD3)2SO)11.33(1H，br s，NH)，7.62(1H，d，J1.1Hz， 6-H)，5.65(1H，d，J4.4Hz，3′-OH)，5.41(1H，s，1′-H)，5.19(1H，t，J5.6 Hz，5′-OH)，4.11(1H，s，2′-H)，3.91(1H，d，J4.2Hz，3′-H)，3.82(1H，d，J 7.7Hz，1″-Ha)，3.73(1H，s，H′-5a)，3.76(1H，s，5′-Hb)，3.63(1H，d，J7.7 Hz，1″-Hb)，1.78(3H，d，J0.7Hz，CH3)。δC(CDCl3)166.7(C-4)，152.1 (C-2)，137.0(C-6)，110.9(C-5)，90.5，88.4(C-1′，C-4′)，80.9，72.5，70.4 (C-2′，C-3′，C-5′)，57.7(C-1″)，12.6(CH3)。EI-MS m/z 270[M]+。
实施例40
(1R，3R，4R，7S)-1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-7-羟基-3-(胸腺嘧 啶-1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷(38)
于0℃，将4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(2.37g，7.0mmol)加入核苷37 (1.2g，4.44mmol)的无水吡啶(5cm3)的溶液中。于室温下搅拌该溶液2 小时，其后用冰水(10cm3)猝灭该反应，用二氯甲烷(3×15cm3)提取。 用饱和碳酸氢钠水溶液(3×10cm3)、盐水(2×10cm3)洗涤合并的有机相 并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯 甲烷/甲醇(98∶2，v/v)作为洗脱剂得到为白色固体物质的核苷38(2.35g， 93％)。δH(CDCl3)9.89(1H，br s，NH)，7.64(1H，s，6-H)，7.47-7.13(9H，m， DMT)，6.96-6.80(4H，m，DMT)，5.56(1H，s，1′-H)，4.53(1H，br s，2′-H)， 4.31(1H，m，3′-H)，4.04-3.75(9H，m，1″-Ha，1″-Hb，3′-OH，OCH3)，3.50 (2H，br s，5′-Ha，5′Hb)，1.65(3H，s，CH3)。δC(CDCl3)164.47(C-4)，158.66 (DMT)，150.13(C-2)，144.56，135.46，135.35，134.78，130.10，129.14， 128.03，127.79，127.05(C-6，DMT)，113.32，113.14(DMT)，110.36(C-5)， 89.17，88.16，87.05(C-1′，C-4′，DMT)，79.36，71.81，70.25，58.38(C-2′，C- 3′，C-5′，C-1″)，55.22(OCH3)，12.57(CH3)。FAB-MS m/z 595[M+Na]+， 573[M+H]+。
实施例41
(1R，3R，4R，7S)-7-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)-1-(4，4′-二甲氧 基三苯甲基氧基甲基)-3-(胸腺嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷 (39)
于室温下将N，N-二异丙基乙胺(4cm3)和2-氰基乙基-N，N-二异丙 基磷酰胺基chloridite(1cm3，4.48mmol)加入核苷38(2.21g，3.86mmol) 的无水二氯甲烷(6cm3)的溶液中，继续搅拌1小时。加入甲醇(2cm3)， 用乙酸乙酯(10cm3)稀释该混合物并用饱和碳酸氢钠水溶液(3×5cm3) 和盐水(3×5cm3)顺序洗涤并干燥(硫酸钠)。减压蒸发溶剂，残留物经 碱性氧化铝柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v)作为洗脱剂得到为 白色泡沫物的39。将其溶于二氯甲烷(2cm3)中并在剧烈搅拌下从石油 醚(100cm3，冷却至-30℃)中沉淀产物。过滤收集沉淀物，干燥得到为 白色固体物质的核苷39(2.1g，70％)。δP(CDCl3)149.06，148.74。 FAB-MS m/z 795[M+Na]+，773[M+H]+。
实施例42
1-(2-O-乙酰基-4-C-乙酰氧基甲基-3，5-二-O-苄基-β-D-呋喃核糖基)尿 嘧啶(40)
将N，O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(9.16cm3，37.0mmol)加入异头混 合物33(3.0g，6.17mmol)和尿嘧啶(1.04g，9.26mmol)的无水乙腈(65cm3) 的搅拌溶液中。于室温下搅拌反应混合物1小时并冷却至0℃。滴加 三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯(1.8cm3，10.0mmol)，于60℃搅拌该溶液2 小时。于0℃通过加入饱和碳酸氢钠水溶液(10cm3)猝灭该反应，用二 氯甲烷(3×20cm3)提取。用盐水(2×20cm3)洗涤合并的有机相并干燥 (硫酸钠)。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲 醇(99∶1，v/v)作为洗脱剂得到为白色固体物质的核苷40(2.5g，75％)。 δH(CDCl3)9.57(1H，br s，NH)，7.63(1H，d，J8.2，6-H)，7.40-7.24(10H， m，Bn)，6.18(1H，d，J4.5，1′-H)，5.39-5.32(2H，m，2′-H，5-H)，4.61(1H，d， J11.6，Bn)，4.49-4.40(5H，m，3′-H，Bn，1″-Ha)，4.37(1H，d，J12.3，1″-Hb)， 3.76(1H，d，J10.1，5′-Ha)，3.49(1H，d，J10.1，5′-Hb)，2.09(s，3H，COCH3)， 2.04(3H，s，COCH3)。δc(CDCl3)170.47，169.94(C＝O)，163.32(C-4)， 150.30(C-2)，140.24(C-6)，137.15，136.95，128.65，128.52，128.32， 128.19，128.02，127.77(Bn)，102.57(C-5)，87.41，86.14(C-1′，C-4′)，77.09， 74.84，74.51，73.75，70.60，63.73(C-2′，C-3′，C-5′，C-1″，Bn)，20.79，20.68 (COCH3)。FAB-MS m/z 539[M]+。
实施例43
1-(3，5-二-O-苄基-4-C-羟甲基-β-D-呋喃核糖基)尿嘧啶(41)
将甲醇钠(0.864g，95％，16.0mmol)加入核苷40(2.0g，3.7mmol)的 甲醇(25cm3)的搅拌溶液中。于室温下搅拌该反应混合物10分钟并用 20％盐酸水溶液中和。部分蒸发溶剂，用乙酸乙酯(3×50cm3)提取该残 留物。用饱和碳酸氢钠水溶液(3×20cm3)洗涤合并的有机相并干燥(硫 酸钠)。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇 (98.5∶1.5，v/v)作为洗脱剂得到为白色固体物质的41(1.58g，95％)。δH (CDCl3)9.95(1H，br s，NH)，7.69(d，J8.1，6-H)，7.35-7.17(10H，m，Bn)， 6.02(1H，d，J2.3，1′-H)，5.26(1H，d，J 8.1，5-H)，4.80(1H，d，J11.7，Bn)， 4.47(1H，d，J11.7，Bn)，4.45-4.24(4H，m，Bn，2′-H，3′-H)，3.81(1H，d，J 11.9，1″-Ha)，3.69(2H，br s，2′-OH，1″-OH)，3.67(2H，m，5′-Ha，1″-Hb)， 3.48(1H，d，J10.3，5′-Hb)。δC(CDCl3)163.78(C-4)，150.94(C-2)，140.61 (C-6)，137.33，137.22，128.59，128.18，128.01(Bn)，102.16(C-5)，91.46， 88.36(C-1′，C-4′)，76.73，74.66，73.71，73.29，70.81，62.81(C-2′，C-3′，C- 5′，C-1″，Bn)。FAB-MS m/z 455[M+H]+。
实施例44
中间体42
于-10℃搅拌核苷41(1.38g，3.0mmol)、无水吡啶(2cm3)和无水二 氯甲烷(6cm3)的溶液并在1小时内分次少量加入对甲苯磺酰氯(0.648g， 3.4mmol)的。于-10℃搅拌该溶液3小时。通过加入冰冷的水(10cm3) 猝灭该反应，用二氯甲烷(3×50cm3)提取该混合物。用饱和碳酸氢钠 水溶液(3×20cm3)洗涤合并的有机相并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂， 残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v)作为洗脱剂得到 中间体42(0.9g)，其可不经进一步纯化而用于下一步骤。
实施例45
(1S，3R，4R，7S)-7-苄氧基-1-苄氧基甲基-3-(尿嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂二 环[2.2.1]庚烷(43)
使化合物42(0.7g)溶于无水DMF(3cm3)中。于0℃，在10分钟 内分4次加入60％氢化钠(w/w，0.096g，24mmol)的悬浮液，于室温下搅 拌该反应混合物12小时。用甲醇(10cm3)猝灭该反应，减压除去溶剂。 使残留物溶于二氯甲烷(20cm3)中，用饱和碳酸氢钠水溶液(3×6cm3) 洗涤并干燥(硫酸钠)。然后减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化， 用二氯甲烷/乙醇(99∶1，v/v)作为洗脱剂得到核苷43(0.30g，60％)。δH (CDCl3)9.21(1H，br s，NH)，7.70(1H，d，J 8.2，6-H)，7.37-7.24(10H，m， Bn)，5.65(1H，s，1′-H)，5.52(1H，d，J 8.2，5-H)，4.68-4.45(5H，m，2′-H， Bn)，4.02-3.55(5H，m，3′-H，5′-Ha，1″-Ha，5′-Hb，1″-Hb)。δC(CDCl3)163.33 (C-4)，149.73(C-2)，139.18(C-6)，137.46，136.81，128.58，128.54，128.21， 128.10，127.79，127.53(Bn)，101.66(C-5)，87.49，87.33(C-1′，C-4′)，76.53， 75.71，73.77，72.33，72.00，64.35(C-2′，C-3′，C-5′，C-1″，Bn)。FAB-MS m/z 459[M+Na]+。
实施例46
(1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-3-(尿嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1] 庚烷(44)
将20％的载于碳(0.37g)上的氢氧化钯加入化合物43(0.35g， 0.8mmol)的无水乙醇(2cm3)的溶液中，用氢气使该混合物脱气数次并置 于氢气4小时。减压除去溶剂后，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯 甲烷/甲醇(9∶1，v/v)作为洗脱剂得到为白色固体物质的核苷44(0.16g， 78％)。δH(CD3OD)7.88(1H，d，J8.1，6-H)，5.69(1H，d，J8.1，5-H)，5.55 (1H，s，1′-H)，4.28(1H，s，2′-H)，4.04(1H，s，3′-H)，3.96(1H，d，J7.9，1″- Ha)，3.91(2H，s，5′-H)，3.76(1H，d，J7.9，1″-Hb)。δC(CD3OD)172.95(C- 4)，151.82(C-2)，141.17(C-6)，101.97(C-5)，90.52，88.50(C-1′，C-4′)， 80.88，72.51，70.50，57.77(C-2′，C-3′，C-5′，C-1″)。FAB-MS m/z 257 [M+H]+。
实施例47
(1R，3R，4R，7S)-1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-7-羟基-3-(尿嘧啶- 1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷(45)
于0℃，将4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(0.203g，0.6mmol)加入化合物 44(0.08g，0.31mmol)的无水吡啶(0.5cm3)的溶液中并于室温下搅拌该 混合物2小时。用冰冷的水(10cm3)猝灭该反应，用二氯甲烷(3×4cm3) 提取。用饱和碳酸氢钠水溶液(3×3cm3)和盐水(2×3cm3)洗涤合并的有 机相并干燥(硫酸钠)。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用 二氯甲烷/甲醇(98∶2，v/v)作为洗脱剂得到为白色固体物质的核苷45 (0.12g，69％)。δH(CDCl3)9.25(1H，br s，NH)，7.93(1H，d，J7.2，6-H)， 7.50-7.15(9H，m，DMT)，6.88-6.78(4H，m，DMT)，5.63(1H，s，1′-H)， 5.59(1H，d，J8.0，5-H)，4.48(1H，s，2′-H)，4.26(1H，s，3′-H)，3.88(1H，d， J8.1，1″-Ha)，3.85-3.55(7H，m，1″-Hb，OCH3)，3.58-3.40(2H，m，5′-Ha，5′- Hb)。δC(CDCl3)164.10(C-4)，158.60(DMT)，150.45(C-2)，147.53 (DMT)，144.51(C-6)，139.72，135.49，135.37，130.20，129.28，128.09， 127.85，127.07(DMT)，113.39，113.17(DMT)，101.79(C-5)，88.20，87.10， 86.87(C-1′，C-4′，DMT)，79.25，71.79，69.70，58.13(C-2′，C-3′，C-5′，C- 1″)，55.33(OCH3)。FAB-MS m/z 559[M+H]+。
实施例48
(1R，3R，4R，7S)-7-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)-1-(4，4′-二甲氧 基三苯甲基氧基甲基)-3-(尿嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷(46)
于室温下将N，N-二异丙基乙胺(0.1cm3)和2-氰基乙基N，N-二异丙 基磷酰胺基chloridite(0.07cm3，0.32mmol)加入化合物45(0.07g， 0.125mmol)的无水二氯甲烷(2cm3)的溶液中。搅拌1小时后，用甲醇 (2cm3)猝灭该反应，用乙酸乙酯(5cm3)稀释所得的混合物并用饱和碳酸 氢钠水溶液(3×2cm3)和盐水(3×2cm3)顺序洗涤并干燥(硫酸钠)。减压 蒸发溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v)作为 洗脱剂得到白色泡沫物。将该泡沫物溶于二氯甲烷(2cm3)中并在剧烈 搅拌下从石油醚(10cm3，冷却至-30℃)中沉淀产物。过滤收集沉淀物并 干燥得到为白色固体物质的化合物46(0.055g，58％)。δP(CDCl3)149.18， 149.02。
实施例49
9-(2-O-乙酰基-4-C-乙酰氧基甲基-3，5-二-O-苄基-β-D-呋喃核糖基)-2- N-异丁基-鸟嘌呤(47)
将N，O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(4cm3，16.2mmol)加入异头混合物 33(1.28g，5.6mmol)和2-N-异丁基鸟嘌呤(1.8g，3.7mmol)的无水二氯乙 烷(60cm3)的搅拌悬浮液中。于回流下搅拌该反应混合物1小时。于0 ℃滴加三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯(1.5ml，8.28mmol)，于回流下搅拌该 溶液2小时。在1.5小时内使该反应混合物冷却至室温。通过加入二氯 甲烷稀释至250cm3后，用饱和碳酸氢钠水溶液(200cm3)和水(250cm3) 洗涤该混合物。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用在二氯 甲烷中的1.25％(200cm3)和1.5％(750cm3)甲醇(v/v)作为洗脱剂得到白 色固体2.10g(87％)，根据1H NMR分析其由三种异构体(比率：12.5∶2.5∶1) 组成。在这种条件下形成的主要产物期望为化合物47(P.Garner，S. Ramakanth，J.Org.Chem.1988，53，1294；H.Vorbruggen，K. Krolikiewicz，B.Bennua，Chem.Ber，1981，114，1234)。未分离单一的异 构体，所述混合物可用于下一步骤。对于主要产物47：δH(CDCl3)12.25 (br s，NHCO)，9.25(br s，NH)，7.91(s，8-H)7.39-7.26(m，Bn)，6.07(d，J 4.6，1′-H)，5.80(dd，J5.8，J4.7，2′-H)，4.72(d，J5.9，3′-H)，4.59-4.43(m， Bn，1″-Ha)，4.16(d，J12.1，1″-Hb)，3.70(d，J10.1，5′-Ha)，3.58(d，J10.1， 5′-Hb)，2.65(m，CHCO)，2.05(s，COCH3)，2.01(s，COCH3)，1.22(d，J6.7， CH3CH)，1.20(d，J7.0，CH3CH)。δC(CDCl3)178.3(COCH)，170.6，179.8 (COCH3)，155.8，148.2，147.6(鸟嘌呤)，137.6，137.2(鸟嘌呤，Bn)，128.5， 128.4，128.2，128.1，128.0，127.8，127.7(Bn)，121.2(鸟嘌呤)，86.2，86.0 (C-1′，C-4′)，77.8(C-3′)，74.9，74.5，73.7，70.4(Bn，C-2′，C-5′)，63.5(C-1″)， 36.3(COCH)，20.8，20.6(COCH3)，19.0(CH3CH)。对于该混合物：FAB- MS m/z 648[M+H]+，670[M+Na]+。实测值：C，60.8；H，6.0；N，10.4； C33H36N5O9的计算值：C，61.3；H，5.6；N，10.8％。
实施例50
9-(3，5-二-O-苄基-4-C-羟甲基-β-D-呋喃核糖基)-2-N-异丁基-鸟嘌呤 (48)
将在实施例49中所述的含有化合物47(2.10g，3.25mmol)的混合 物的THF/吡啶/甲醇(2∶3∶4，v/v/v)(40cm3)的溶液冷却至-10℃，将甲醇 钠(320mg，5.93mmol)加入该搅拌溶液中。于10℃搅拌该反应混合物30 分钟并用2cm3乙酸中和。减压蒸发溶剂，残留物用二氯甲烷/水(2× 100cm3)体系提取两次。减压蒸发合并的有机部分。与甲苯共蒸发后， 残留物经硅胶柱层析纯化(甲醇在二氯甲烷(v/v)中的梯度(2-7％)液)得 到白色固体物质(1.62g)。根据1H NMR分析其由三种异构体(比率： 13.5∶1.5∶1)组成。对于主要产物48：δH(CD3OD)8.07(s，8-H)7.36-7.20 (m，Bn)，6.05(d，J3.9，1′-H)，4.81(d，J11.5，Bn)，4.75(m，2′-H)，4.56(d， J11.5，Bn)，4.51-4.43(m，Bn，3′-H)，3.83(d，J 11.7，1″-Ha)，3.65(d，J11.7， 1″-Hb)，3.64(d，J10.6，5′-Ha)，3.57(d，J10.3，5′-Hb)，2.69(m，CHCO)， 1.20(6H，d，J6.8，CH3CH)。δC(CD3OD)181.6(COCH)，157.3，150.2， 149.5(鸟嘌呤)，139.4，139.3，139.0(鸟嘌呤，Bn)，129.5，129.4，129.3， 129.2，129.1，129.0，128.9，128.8(Bn)，121.2(鸟嘌呤)，90.7，89.6(C-1′， C-4′)，79.2(C-3′)，75.8，74.5，74.3，72.2(Bn，C-2′，C-5′)，63.1(C-1″)，36.9 (COCH)，19.4(CH3CH)，19.3(CH3CH)。对于该混合物：FAB-MS m/z 564 [M+H]+。
实施例51
中间体49
于-20℃搅拌在实施例50中所述的含有化合物48(1.6g)的混合物 的无水吡啶(6cm3)的溶液，加入对甲苯磺酰氯(0.81g，4.27mmol)。于-20 ℃搅拌该溶液1小时。于-25℃搅拌2小时。然后通过加入二氯甲烷将 该混合物稀释至100cm3并立即用水(2×100cm3)洗涤。分离并减压蒸发 有机相。残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(1-2％，v/v)作为 洗脱剂得到中间体49(980mg)。从柱中洗脱化合物49后，用在二氯甲 烷中的8％甲醇(v/v)作为洗脱剂洗脱含有48(510mg)的起始混合物。浓 缩该物质，减压干燥并用如上所述的相同方式处理得到另外252mg的 中间体。该中间体(1.23g)经硅胶HPLC(PrepPak Cartridge，由Porasil 包被，15-20μm，125A，流速60cm3/min，洗脱液0-4％甲醇在二氯甲烷 (v/v)中，120min)纯化。收集含有中间体49的部分并浓缩得到白色固体 (1.04g)。根据1H-NMR分析其由两种主要产物组成，即约2∶1比率的 1″-O和2′-O一甲苯磺酰化衍生物。FAB-MS m/z 718[M+H]+.实测值： C，60.4；H，5.8；N，9.3；C36H39N5O9S的计算值：C，60.2；H，5.5；N，9.8％。
实施例52
(1S，3R，4R，7S)-7-苄氧基-1-苄氧基甲基-3-(2-N-异丁酰基鸟嘌呤-9-基)- 2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷(50)
向中间体49(940mg)的无水THF(20cm3)溶液加入60％氢化钠的 悬浮液(w/w，130mg，3.25mmol)并于室温下搅拌该混合物1小时。加入 乙酸(0.25ml)，减压浓缩该混合物。使残留物溶于二氯甲烷(100cm3) 中，用水(2×100cm3)洗涤。分离有机相并减压蒸发。残留物经硅胶柱 层析纯化，用甲醇/二氯甲烷(1-1.5％，v/v)作为洗脱剂洗脱得到为白色 固体物质的核苷50(451mg，57％)。δH(CDCl3)12.25(1H，br s，NHCO)， 10.12(1H，br s，NH)，7.84(1H，s，8-H)，7.31-7.15(10H，m，Bn)，5.72(1H， s，1′-H)，4.60-4.46(5H，m，Bn，2′-H)，4.14(1H，s，3′-H)，4.02(1H，d，J7.9， 1″-Ha)，3.85(1H，d，J7.9，1″-Hb)，3.78(2H，s，5′-H)，2.81(1H，m，CHCO)， 1.24(3H，d，J6.8，CH3CH)，1.22(3H，d，J6.4，CH3CH)。δC(CDCl3)179.5 (COCH)，155.6，148.1，147.3(鸟嘌呤)，137.3，136.9，136.0(鸟嘌呤，Bn)， 128.4，128.3，127.9，127.8，127.5，127.4(Bn)，121.2(鸟嘌呤)，87.1，86.2 (C-1′，C-4′)，77.0(C-3′)，73.6，72.5，72.1(Bn，C-2′，C-5′)，64.9(C-1″)，36.1 (COCH)，19.0(CH3CH)，18.9(CH3CH)。FAB-MS m/z 546[M+H]+.实测 值：C，63.3；H，5.9；N，12.5；C29H30N5O6的计算值：C，64.0；H，5.6；N， 12.9％。
化合物50.G1AQ制备的其它方法。
将BSA(N，O-双三甲基硅烷基乙酰胺；3.33ml，13.5mmol)加入化合 物78(1.5g，2.51mmol)、N2-异丁酰基鸟嘌呤(0.93g，4.06mmol)在无水 DCM(50ml)中的悬浮液中并使该混合物回流2小时。将三甲基硅烷基 三氟甲磺酸酯(1.25ml，6.9mmol)加入该混合物中并再回流2小时。使反 应混合物冷却至室温，用200ml DCM稀释并用饱和碳酸氢钠水溶液和 水洗涤。经硅胶柱(1-2.5％甲醇在二氯甲烷中)层析得到1.05g(55％)所 需异构体G1AQ和380mg具较高流动性的异构体，通过重复上述步骤 将其转化为G1AQ。将氢氧化铵(12ml 25％水溶液)加入G1AQ溶液 (1.05g在12ml甲醇中)中并于室温下搅拌该混合物1小时。浓缩后， 该产物经硅胶柱(1-3％甲醇在二氯甲烷中)层析纯化得到700mg为白 色固体物质的G3。用氢化钠(225mg 60％在矿物油中的悬浮液)处理在 无水THF(15ml)中的700mg G3。30分钟后，通过加入1.25ml乙酸猝 灭该反应，减压浓缩该混合物。使残留物溶于二氯甲烷中，用碳酸氢 钠和水洗涤，残留物经硅胶柱层析纯化(0.5-3％甲醇/DCM梯度液)。得 到400mg(75％)的50。
实施例53
(1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-3-(2-N-异丁酰基鸟嘌呤-9-基)-2，5-二氧 杂二环[2.2.1]庚烷(51)
于室温下，将核苷50(717mg，1.31mmol)和10％钯碳(500mg)的混 合物悬浮于甲醇(8cm3)溶液中。减压下使该混合物脱气数次并置于氢 气下。搅拌24小时后，该混合物经硅胶柱层析纯化，用甲醇/二氯甲 烷(8-20％，v/v)作为洗脱剂洗脱得到为玻璃状固体的核苷51(440mg， 92％)。δH(CD3OD)8.12(1H，br s，8-H)，5.86(1H，s，1′-H)，4.50(1H，s， 2′-H)，4.30(1H，s，3′-H)，4.05(1H，d，J8.0，1″-Ha)，3.95(2H，s，5′-H)，3.87 (1H，d，J7.9，1″-Hb)，2.74(1H，m，CHCO)，1.23(6H，d，J6.9，CH3CH)。δC (CD3OD，来自碳水化合物部分的信号)90.2，87.6(C-1′，C-4′)，81.1(C- 3′)，72.9，71.3(C-2′，C-5′)，58.2(C-1″)，37.1(COCH)，19.5(CH3CH)。 FAB-MS m/z 366[M+H]+。
实施例54
(1R，3R，4R，7S)-1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-7-羟基-3-(2-N-异 丁酰基鸟嘌呤-9-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷(53)
将化合物51(440mg，1.21mmol)和4，4′-二甲氧基三苯甲基氯 (573mg，1.69mmol)的混合物溶于无水吡啶(7cm3)中并于室温下搅拌4 小时。减压蒸发该混合物得到一油状物。用二氯甲烷/水(1∶1，v/v，40cm3) 体系提取。分离并浓缩有机相得到极少量体积的含有0.5％吡啶的二氯 甲烷溶液(v/v)，将其加于用相同溶剂平衡的硅胶柱上。用在含有0.5％ 吡啶(v/v)的二氯甲烷中梯度浓度的甲醇(0.6-2％，v/v)洗脱产物得到白 色固体物质的化合物52(695mg，86％)。δH(CDCl3)12.17(1H，br s， NHCO)，10.09(1H，br s，NH)，7.87(1H，s，8-H)，7.42-6.72(13H，m， DMT)，5.69(1H，s，1′-H)，4.59(1H，s，2′-H)，4.50(1H，s，3′-H)，3.98(1H， d，J8.1，1″-Ha)，3.69-3.39(9H，m，DMT，5′-H，1″-Hb)，2.72(1H，m， CHCO)，1.17(6H，d，J6.8，CH3CH)。δC(CDCl3)179.8(COCH)，158.8， 144.5，135.6，135.5，130.1，128.1，127.7，126.9，113.2(DMT)，155.8， 147.9，147.5，137.0，120.8(鸟嘌呤)，87.6，86.4，86.1(C-1′，C-4′，DMT)， 79.7(C-3′)，72.6，71.4(C-2′，C-5′)，59.8(C-1″)，55.2(DMT)，36.1(COCH)， 19.1，18.8(CH3CH)。FAB-MS m/z 668[M+H]+。
实施例55
(1R，3R，4R，7S)-7-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)-1-(4，4′-二甲氧 基三苯甲基氧基甲基)-3-(2-N-异丙酰基(propyonyl)鸟嘌呤-9-基)-2，5-二 氧杂二环[2.2.1]庚烷(53)
于室温下将化合物52(670mg，1.0mmol)溶于含有N，N-二异丙基 乙胺(0.38cm3，4mmol)的无水二氯甲烷(5cm3)中。搅拌下滴加2-氰基乙 基N，N-二异丙基磷酰胺基chloridite(0.36cm3，2.0mmol)。5小时后，加 入甲醇(2cm3)，通过加入二氯甲烷将该混合物稀释至100cm3，用饱和 碳酸氢钠水溶液(50cm3)洗涤。分离有机相并减压蒸发溶剂。使残留物 溶于最少量的含有0.5％吡啶(v/v)的二氯甲烷/石油醚(1∶1，v/v)中并加 于用相同溶剂混合物平衡的硅胶包被的柱上。用二氯甲烷/石油醚/吡啶 (75∶25∶0.5，v/v/v，250cm3)洗涤该柱，用在含有0.5％吡啶(v/v)的二氯甲 烷中甲醇梯度液(0-1％，v/v)洗脱该产物。蒸发含有该主要产物的部分并 用甲苯共蒸发。使残留物溶于无水二氯甲烷(5cm3)中，从石油醚(100cm3) 中沉淀，经过滤并干燥后得到为白色固体物质的化合物53(558mg， 64％)。δP(CDCl3)148.17，146.07。FAB-MS m/z 868[M+1]+。
实施例56
1-(2-O-乙酰基-4-C-乙酰氧基甲基-3，5-二-O-苄基-β-D-呋喃核糖基)-2- N-苯甲酰基-胞嘧啶(54)
将N，O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(8.16cm3，33.0mmol)加入异头混 合物33(4.0g，8.22mmol)和4-N-苯甲酰基胞嘧啶(2.79g，13.0mmol)的搅 拌液中。于室温下搅拌该反应混合物1小时并冷却至0℃。滴加三甲 基硅烷基三氟甲磺酸酯(3.0cm3，16.2mmol)，于60℃搅拌该混合物2小 时。顺序加入饱和碳酸氢钠水溶液(3×20cm3)和盐水(2×20cm3)，干燥 (硫酸钠)分离的有机相。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化， 用二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v)作为洗脱剂洗脱得到为白色固体物质的化 合物54(3.9g，74％)。δH(CDCl3)，8.28(1H，d，J7.5，6-H)，7.94-7.90(2H， m，Bz)，7.65-7.25(13H，m，Bn，Bz)，7.16(1H，d，J7.1，5-H)，6.22(1H，d， J2.8，1′-H)，5.51(1H，dd，J2.8，5.8，2′-H)，4.62(1H，d，J11.6，Bn)，4.51 (1H，d，J12.3，1″-Ha)，4.49-4.34(4H，m，3′-H，Bn)，4.21(1H，d，J12.3，1″- Hb)，3.85(1H，d，J10.3，5′-Ha)，3.47(1H，d，J10.3，5′-Hb)，2.13(3H，s， COCH3)，2.06(3H，s，COCH3)。δC(CDCl3)170.52，169.61(C＝O)，166.83， 162.27(C-4，C＝O)，154.26(C-2)，145.26(C-6)，137.25，136.93，133.18， 129.0，128.75，128.51，128，45，128.18，128.10，127.89，127.71(Bn，Bz)， 96.58(C-5)，89.42，86.52(C-1′，C-4′)，76.21，75.10，74.17，73.70，69.70， 63.97(C-2′，C-3′，Bn，C-5′，C-1″)，20.82(COCH3)。FAB-MS m/z 664 [M+Na]+，642[M+H]+。实测值：C，65.0；H，5.7，N，6.5；C35H35N3O9的计 算值：C，65.5；H，5.5；N，6.5％。
实施例57
1-(3，5-二-O-苄基-4-C-羟甲基-β-D-呋喃核糖基)-4-N-苯甲酰基-胞嘧啶 (55)
将甲醇钠(0.663g，11.66mmol)加入核苷54(3.4g，5.3mmol)的甲醇 (20cm3)的搅拌溶液中。于室温下搅拌该反应混合物10分钟，然后用 20％盐酸水溶液中和。部分蒸发溶剂，残留物用二氯甲烷(3×50cm3) 提取。用饱和碳酸氢钠水溶液(3×20cm3)洗涤合并的有机相并干燥(硫 酸钠)。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇 (98.5∶1.5，v/v)作为洗脱剂洗脱得到为白色固体物质的化合物55(1.6g， 54％)。δH(CDCl3)9.95(1H，br s，NH)，8.33(1H，d，J7.4，6-H)，7.98(2H， m，Bz)，7.60-7.12(14H，m，Bn，Bz，5-H)，6.17(1H，d，J1.6，1′-H)，4.78 (1H，d，J11.8，Bn)，4.48-4.27(5H，m，Bn，2′-H，3′-H)，3.85(1H，d，J11.8， 5′-Ha)，3.66-3.61(2H，m，5′-Hb，1″-Ha)，3.47(1H，d，J10.4，1″-Hb)。δC (CDCl3)167.5，162.31(C-4，C＝O)，155.36(C-2)，145.34(C-6)，137.49， 137.08，133.09，133.01，128.94，128.67，128.48，128.30，128.01，127.90， 127.80(Bn，Bz)，96.53(C-5)，93.97，89.35(C-1′，C-4′)，76.06，75.28， 73.70，72.76，70.26，62.44(C-2′，C-3′，Bn，C-5′，C-1″)。FAB-MS m/z 558 [M+H]+。
实施例58
中间体56
于-20℃搅拌核苷55(2.2g，3.94mmol)的无水四氢呋喃(60cm3)溶 液，在45分钟内分7次加入60％氢化钠在矿物油中的悬浮液(w/w， 0.252g，6.30mmol)。于-20℃搅拌该溶液15分钟，然后少量分次加入对 甲苯磺酰氯(0.901g，4.73mmol)。于-20℃搅拌该溶液4小时。加入另外 的氢化钠(0.252g，6.30mmol)和对甲苯磺酰氯(0.751g，3.93mmol)。将该 反应混合物维持于-20℃48小时。然后通过加入冰冷却的水(50cm3)猝 灭该反应，其后用二氯甲烷(3×60cm3)提取。用饱和碳酸氢钠水溶液(3 ×20cm3)洗涤合并的有机相并干燥(硫酸钠)。减压蒸发溶剂，残留物经 硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v)作为洗脱剂洗脱得到中间 体56(1.80g)。
实施例59
(1S，3R，4R，7S)-7-苄氧基-1-苄氧基甲基-3-(4-N-苯甲酰基胞嘧啶-1-基)- 2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷(57)
将中间体56(1.80g)溶于无水DMF(30.0cm3)中，于0℃在30分钟 内，分5次加入60％氢化钠在矿物油中的悬浮液(w/w，0.16g，3.9 mmol)。于室温下搅拌该反应混合物36小时。通过加入冰冷却的水 (70cm3)猝灭该反应，用二氯甲烷(3×50cm3)提取生成的混合物。用饱 和碳酸氢钠水溶液(3×30cm3)洗涤合并的有机相并干燥(硫酸钠)。减压 除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99.5∶0.5，v/v) 作为洗脱剂洗脱得到为白色固体物质的化合物57(1.08g，79％)。δH (CDCl3)8.95(1H，br s，NH)，8.20(1H，d，J7.5，6-H)，7.95-7.92(2H，m， Bz)，7.66-7.22(14H，m，Bn，Bz，5-H)，5.78(1H，s，1′-H)，4.70-4.65(3H，m， 2′-H，Bn)，4.60(1H，d，J11.6，Bn)，4.47(1H，d，J11.6，Bn)，4.05-3.78(5H， m，3′-H，5′-Ha，1″-Ha，5′-Hb，1″-Hb)。δC(CDCl3)167.0，162.36(C-4，C＝O)， 154.5(C-2)，144.58(C-6)，137.46，136.93，133.35，132.93，129.11，128.67， 128.50，128.16，128.11，127.68，127.60(Bn)，96.35(C-5)，88.38，87.67(C- 1′，C-4′)，76.14，75.70，73.79，72.27，72.09，64.34(Bn，C-5′，C-1″，C-2′，C- 3′)。FAB-MS m/z 540[M+H]+。实测值：C，68.0；H，5.5，N，7.5；
C31H29N3O6的计算值：C，69.0；H，5.4；N，7.8％)
实施例60
(1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-3-(胞嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1] 庚烷(57A)
向核苷57(0.3g，0.55mmol)的无水甲醇(22cm3)溶液加入1，4-环己 二烯(5.0cm3)和10％钯碳(0.314g)。回流下搅拌该混合物18小时。加入 另外的10％钯碳(0.380g)和1，4-环己二烯(5.5cm3)并使该混合物回流54 小时。通过硅胶垫过滤该反应混合物，随后用甲醇(1500cm3)洗涤。减 压蒸发合并的滤液，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇 (92.5∶7.5，v/v)作为洗脱剂洗脱得到为白色固体物质的化合物 57A(0.051g，36％)。δH((CD3)2SO)7.73(1H，d，J7.7，6-H)，7.12-7.20(2H， br s，NH2)，5.74(1H，d，J7.7，5-H)，5.61(1H，br s，3′-OH)，5.39(1H，s，1′- H)，5.12(1H，m，5′-OH)，4.08(1H，s，2′-H)，3.80(1H，d，J7.7，1″-Ha)，3.81 (1H，s，3′-H)，3.74(2H，m，5′-Ha，5′-Hb)，3.63(1H，d，J7.7，1″-Hb)。δc ((CD3)2SO)165.66(C-4)，154.58(C-2)，139.68(C-6)，93.19(C-5)，88.42， 86.73(C-1′，C-4′)，78.87，70.85，68.32，56.04(C-2′，C-1″，C-3′，C-5′)。 FAB-MS m/z 256[M+H]+。
实施例61
中间体57B
将三甲基硅烷基氯(0.14cm3，1.17mmol)加入悬浮于无水吡啶 (2.0cm3)中的核苷57A(0.030g，0.11mmol)中并于室温下继续搅拌1小 时。于0℃加入苯甲酰氯(0.07cm3，0.58mmol)并于室温下搅拌该混合物 2小时。该反应混合物冷却至0℃后，加入水(3.0cm3)。搅拌5分钟后， 加入氨的水溶液(1.5cm3，32％，w/w)并于室温下继续搅拌30分钟。减压 蒸发该混合物，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(97.5∶2.5， v/v)作为洗脱剂洗脱得到为白色固体物质的中间体57B(0.062g)。
实施例62
(1R，3R，4R，7S)-1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-7-羟基-3-(4-N-苯 甲酰基胞嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷(57C)
向中间体57B(0.042g，0.11mmol)的无水吡啶(1.5cm3)溶液加入 4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(0.06g，0.17mmol)。于室温下搅拌该反应混合 物3.5小时，冷却至0℃，加入饱和碳酸氢钠水溶液(20cm3)。用二氯 甲烷(3×10cm3)提取。干燥(硫酸钠)合并的有机相，减压蒸发至干。残 留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇/吡啶(98.0∶1.5∶0.5，v/v/v)作为 洗脱剂洗脱得到为白色固体物质的核苷57C(0.031g，约63％，得自 57A)。δH(C5D5N)12.32(1H，br s，NHCO)，8.75-7.06(20H，m，DMT，Bz， H-5，H-6)，6.24(1H，s，1′-H)，5.11(1-H，s，2′-H)，4.90(1H，s，3′-H)，4.38 (1H，d，J7.6，1″-Ha)，4.10(1H，d，J7.6，1″-Hb)，4.02(1H，d，J10.6，5′-Ha)， 3.87(1H，d，J10.6，5′-Hb)，3.77，3.76(2×3H，2×s，2×OCH3)。δC(C5D5N) 169.00(NHCO)，164.24(C-2)，159.39(DMT)，150.5，145.62(DMT)， 144.31，132.89，130.82，130.72，129.09，128.89，128.60，113.96(DMT)， 96.96，89.01，87.18，79.91，72.56，70.25(C-5，C-1′，C-4′，C-2′，C-1″，C-3′)， 59.51(C-5′)，55.33(OCH3)。FAB-MS m/z 662[M+H]+
实施例63
(1R，3R，4R，7S)-7-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)-1-(4，4′-二甲氧 基三苯甲基氧基甲基)-3-(4-N-苯甲酰基胞嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂二环 [2.2.1]庚烷(57D)
向核苷57C(0.025g，0.03mmol)的无水二氯甲烷(1.5cm3)溶液中加 入N，N-二异丙基乙胺(0.03cm3，0.17mmol)，接着滴加2-氰基乙基N，N- 二异丙基磷酰胺基chloridite(0.02cm3，0.09mmol)。于室温下搅拌5小 时后，使该反应混合物冷却至0℃，加入二氯甲烷/吡啶(10.0cm3， 99.5∶0.5；v/v)并用饱和碳酸氢钠水溶液(3×8cm3)洗涤。分离有机相，干 燥(硫酸钠)并减压蒸发至干。残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/ 甲醇/吡啶(99.0∶0.5∶0.5，v/v/v)作为洗脱剂洗脱得到为淡黄色油状的亚 酰胺化物(amidite)57D(0.038g)。δP(CDCl3)147.93。
实施例64
9-(2-O-乙酰基-4-C-乙酰氧基甲基-3，5-二-O-苄基-β-D-呋喃核糖基)-6- N-苯甲酰基-腺嘌呤(58)
将N，O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(15.54cm3，61.8mmol)加入异头混 合物33(5.0g10.3mmol)和6-N-苯甲酰基腺嘌呤(3.76g，15.7mmol)的无 水二氯甲烷(200cm3)的搅拌悬浮液中。于回流下搅拌该反应混合物1 小时，然后冷却至室温。滴加三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯(7.0cm3， 38.7mmol)，回流该混合物20小时。使该反应混合物冷却至室温，减 压使该混合物的体积减少至1/4。加入二氯甲烷(250cm3)，用饱和碳酸 氢钠水溶液(3×50cm3)和水(50cm3)洗涤该溶液。干燥(硫酸钠)并减压蒸 发有机相。残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99.5∶0.5，v/v) 作为洗脱剂洗脱得到为白色固体物质的核苷58(3.65g，52％)。δH (CDCl3)9.25(1H，br s，NH)，8.71(1H，s，8-H)，8.24(1H，s，2-H)，8.0(2H， d，J7.5，Bz)，7.60-7.23(13H，m，Bn，Bz)，6.35(1H，d，J4.6，1′-H)，5.99 (1H，dd，J4.9，5.3，2′-H)，4.78(1H，d，J5.6，3′-H)，4.64-4.42(5H，m，Bn， 1″-Ha)，4.25(1H，d，J12.1，1″-Hb)，3.72(1H，d，J10.1，5′Ha)，3.56(1H，d， J10.1，5′-Hb)，2.07(3H，s，COCH3)，2.02(3H，s，COCH3)。δC(CDCl3) 170.42，169.72(COCH3)，164.60(NHCO)，152.51(C-6)，151.45(C-2)， 149.46(C-4)，141.88(C-8)，137.04，137.00，133.50，132.60，128.86， 128.66，128.53，128.41，128.38，128.18，128.06，127.91，127.88，127.79， 127.63，123.26(Bz，Bn，C-5)，86.38(C-1′)，86.25(C-4′)，77.74，74.74， 74.44，73.48(C-2′，C-3′，2×Bn)，70.11(C-1″)，63.42(C-5′)，20.70，20.54 (COCH3)。FAB-MS m/z 666[M+H]+。
实施例65
9-(3，5-二-O-苄基-4-C-羟甲基-β-D-呋喃核糖基)-6-N-苯甲酰基腺嘌呤 (59)
于0℃，将甲醇钠(0.75g，13.8mmol)加入核苷58(4.18g，6.28mmol) 的甲醇(50cm3)的搅拌溶液中。搅拌该反应混合物2小时，加入冰。用 20％盐酸水溶液中和该混合物。用二氯甲烷(3×75cm3)提取，分离有机 相，干燥(硫酸钠)并减压蒸发。残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲 烷/甲醇(98.5∶1.5，v/v)作为洗脱剂洗脱得到为白色固体物质的核苷 59(2.68g，73％)。δH(CDCl3)9.42(1H，br s，NH)，8.58(1H，s，H-8)，8.16 (1H，s，2-H)，7.96(2H，d，J7.2，Bz)，7.52-7.08(13H，m，Bn，Bz)，6.18(1H， d，J2.5，1′-H)，4.85-4.38(4H，m，Bn，2′-H，3′-H)，4.33(2H，s，Bn)3.90 (1H，d，J11.9，1″-Ha)，3.71(1H，d，J11.8，1″-Hb)，3.50-3.39(2H，m，5- H)。δC(CDCl3)164.98(NHCO)，152.19(C-6)，151.00(C-2)，149.34(C-4)， 142.28(C-8)，137.32，137.25，133.46，132.70，128.69，128.49，128.40， 128.11，128.03，127.94，127.83，127.62，(Bz，Bn)，122.92(C-5)，90.94， 88.75(C-1′，C-4′)，77.65，74.08，73.44，73.20，71.12，62.39(C-1″，C-5′，C- 2′，C-3′，2×Bn)。FAB-MS m/z 582[M+H]+。实测值：C，65.6；H，5.5；N， 11.7；C32H31N5O6的计算值C，66.1；H，5.4；N，12.0％。
实施例66
中间体60
于-20℃搅拌核苷59(2.43g，4.18mmol)的无水四氢呋喃(25cm3)的 溶液，在30分钟内分4次加入氢化钠在矿物油中的60％悬浮液(w/w， 0.28g，7.0mmol)。搅拌1小时后，分次少量加入对甲苯磺酰氯(1.34g， 7.0mmol)。于-10℃搅拌该混合物15小时。加入冰冷却的水(50cm3)，用 二氯甲烷(3×50m3)提取。用饱和碳酸氢钠水溶液(2×25cm3)洗涤合并 的有机相，干燥(硫酸钠)并减压蒸发。残留物经硅胶柱层析纯化，用 二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v)作为洗脱剂洗脱得到中间体60(1.95g)。
实施例67
(1S，3R，4R，7S)-7-苄氧基-1-苄氧基甲基-3-(6-N-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)- 2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷(61)
将中间体60(1.90g)溶于无水DMF(20cm3)中，于0℃分次少量加 入氢化钠在矿物油中的60％悬浮液(w/w，0.16g，3.87mmol)。于室温下 搅拌该混合物10小时，然后减压浓缩。使残留物溶于二氯甲烷(75m3) 中，用饱和碳酸氢钠水溶液(2×25cm3)洗涤，干燥(硫酸钠)并减压蒸 发。残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v)作为洗脱剂 洗脱得到为白色固体物质的核苷61(1.0g，约44％，得自59)。δH(CDCl3) 8.71(H，s，8-H)，8.23(1H，s，2-H)，8.02(2H，m，J7.0，Bz)，7.99-7.19(13H， m，Bn，Bz)，6.08(1H，s，1′-H)，4.78(1H，s，2′-H)，4.61-4.50(4H，m，2× Bn)，4.24(1H，s，3′-H)，4.12(1H，d，J7.8，1″-Ha)，4.00(1H，d，J7.9，1″-Hb)， 3.85-3.78(2H，m，5′-Ha，5′-Hb)。δC(CDCl3)164.61(NHCO)，152.32(C-6)， 150.61(C-2)，149.35(C-4)，140.67(C-8)，137.24，136.76，133.33，132.66， 128.68，128.39，128.29，127.94，127.77，127.51(Bn，Bz)，123.43(C-5)， 87.14，86.52(C-1′，C-4′)，77.21，76.77，73.56，72.57，72.27，64.65(C-2′，C- 3′，C-1″，2×Bn，C-5′).FAB-MS m/z 564[M+H]+。实测值：C，66.2；H，5.5； N，11.4；C32H29N5O5的计算值：C，66.2；H，5.2；N，12.4％。
实施例68
(1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-3-(腺嘌呤-9-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1] 庚烷(61A)
于-78℃，在30分钟内向核苷61(0.80g，1.42mmol)的无水二氯甲 烷(30cm3)的搅拌溶液滴加BCl3(1M的己烷溶液；11.36cm3，11.36 mmol)。于-78℃搅拌该混合物4小时，滴加另外的BCl3(1M的己烷溶 液；16.0cm3，16.0mmol)，于-78℃搅拌该混合物3小时。然后使该反应 混合物的温度缓慢升至室温并继续搅拌30分钟。于-78℃加入甲醇 (25.0cm3)并于室温下搅拌该混合物12小时。减压蒸发该混合物，残留 物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(92∶8，v/v)作为洗脱剂洗脱得到 为白色固体物质的核苷61A(0.332g，84％)。δH((CD3)2SO)8.22(1H，s， 8-H)，8.15(1H，s，2-H)，7.33(2H，s，NH2)，5.89(1H，s，1′-H)，5.83(1H，d， J4.2，3′-OH)，5.14(1H，t，J5.9，5′-OH)，4.14(1H，s，2′-H)，4.25(1H，d，J 4.2，3′-H)，3.92(1H，d，J7.8，1″-Ha)，3.81-3.41(3H，m，5′-Ha，5′-Hb，1″- Hb)。δC((CD3)2SO)155.90(C-6)，152.64(C-2)，148.35(C-4)，137.72(C- 8)，118.94(C-5)，88.48，85.17(C-1′，C-4′)，79.09，71.34，69.83，56.51(C-2′， C-3′，C-1″，C-5′)。FAB-MS m/z 280[M+H]+。
实施例69
(1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-3-(6-N-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-2，5-二氧 杂二环[2.2.1]庚烷(61B)
向核苷61A(0.32g，1.15mmol)的无水吡啶(1cm3)的搅拌溶液加入 三甲基硅烷基氯(0.73cm3，5.73mmol)并于室温下搅拌该混合物20分 钟。于0℃加入苯甲酰氯(0.67cm3，5.73mmol)，于室温下搅拌该反应混 合物2小时。使该反应混合物冷却至0℃，加入冰冷的水(15.0cm3)。搅 拌5分钟后，加入氨(1.5cm3)的32％(w/w)水溶液并搅拌该混合物30 分钟。蒸发该混合物至干，使残留物溶于水(25cm3)中。减压蒸发该混 合物后，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(97∶3，v/v)作为 洗脱剂洗脱得到为白色固体物质的核苷61B(0.55g)。FAB-MS m/z 384 [M+H]+。
实施例70
(1R，3R，4R，7S)-7-羟基-1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯 甲酰基腺嘌呤-9-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷(61C)
向化合物61B(0.50g)的无水吡啶(20cm3)的搅拌溶液加入4，4′-二 甲氧基三苯甲基氯(0.71g，2.09mmol)和4-N，N-二甲基氨基吡啶(DMAP) (0.1g)。于室温下搅拌2小时和于50℃搅拌1小时后，使该反应混合 物冷却至0℃，加入饱和碳酸氢钠水溶液(100cm3)。用二氯甲烷(3× 50cm3)提取后，干燥(硫酸钠)合并的有机相并减压蒸发。残留物经硅胶 柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇/吡啶(98.0∶1.5∶0.5)洗脱得到为白色固体 物质的核苷61C(0.36g，约50％来自61A)。δH(C5D5N)12.52(NHCO)， 9.10(2H，d，J7.7，Bz)，8.88(1H，s，8-H)，8.50-7.11(17H，m，DMT，Bz，2- H)，6.65(1H，s，H-1′)，5.25(2H，s，H-2′，H-3′)，4.71(1H，d，J7.8，1″-Ha)， 4.56(1H，d，J7.8，1″-Hb)，4.20(1H，d，J10.8，5′-Ha)，4.07(1H，d，J10.8， 5′-Hb)，3.82，3.81(2×3H，2×s，2×OCH3)。δC(C5D5N)167.56(NHCO)， 159.24(C-6)，152.50，152.08，151.81，145.84，141.45，136.52，136.28， 132.55，130.76，130.70，129.32，128.85，128.76，128.46，127.38，126.33 (DMT，Bz，C-2，C-4，C-8)，113.84(C-5)，88.64，87.20，86.85，80.52，73.13， 72.16，60.86(C-1′，C-4′，DMT，C-2′，C-3′，C-1″，C-5′)，55.24(OCH3). FAB-MS m/z 686[M+H]+。实测值：C，68.3；H，5.0；N，9.7；C39H35N5O7的计算值：C，68.3；H，5.1；N，10.2％。
实施例71
(1R，3R，4R，7S)-7-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)-1-(4，4′-二甲氧 基三苯甲基氧基甲基)-3-(6-N-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-2，5-二氧杂二环 [2.2.1]庚烷(61D)
于0℃向化合物61C(190mg，0.277mmol)的无水二氯甲烷(1.5cm3) 溶液中加入N，N-二异丙基乙胺(0.16cm3，0.94mmol)和2-氰基乙基N，N- 二异丙基磷酰胺基chloridite(0.1cm3，0.42mmol)。使该混合物温热至室 温并搅拌5小时。用二氯甲烷(50cm3)稀释该溶液，用饱和碳酸氢钠水 溶液(3×30cm3)洗涤并减压蒸发。经硅胶HPLC(PrepPak柱，25×100 mm，填充Prep Nova-PakHR二氧化硅6μm 60；溶液B在溶液A中 的梯度液(在25分钟期间从0％至15％和在另外25分钟期间从15％至 100％，溶液A：石油/二氯甲烷/吡啶，60/39.6/0.4，v/v/v，溶液B：乙酸乙 酯)分离该产物。合并含有两种主要产物(保留时间30-40min)的部分， 减压浓缩，与无水甲苯(2×40cm3)共蒸发并真空干燥过夜。使残留物溶 于无水二氯甲烷(4cm3)中，剧烈搅拌下通过将该溶液加入无水石油醚 (80cm3)使其沉淀。过滤收集沉淀物，经石油醚(2×20cm3)洗涤，减压 干燥得到为白色固体物质的化合物61D(178mg，73％)。δP(CD3CN) 148.42，147.93。
实施例72
1-(2，3-O-异亚丙基-4-C-(4-甲苯磺酰基氧基甲基)-β-D-呋喃核糖基)尿苷 (62)
于-30℃，向1-(2，3-O-异亚丙基-4′-C-羟甲基1-β-D-呋喃核糖基)尿 苷(2.0g，6.4mmol)(R.Youssefyeh，D.Tegg，J.P.H.Verheyden，G.H. Jones和J.G.Moffat，Tetrahedron Lett.，1977，5，435；G.H.Jones，M. Taniguchi，D.Tegg和J.G.Moffat，J.Org.Chem.，1979，44，1309)的无水 吡啶(28cm3)的搅拌溶液中加入溶于无水吡啶(10cm3)中的对甲苯磺酰 氯(1.46g，7.3mmol)。30分钟后，使该反应混合物升至室温并于室温 下继续搅拌12小时。用甲醇(4cm3)猝灭该反应，加入硅胶(2g)，减压 除去溶剂。残留物经硅胶柱层析纯化，用0-3％甲醇的二氯甲烷(v/v) 梯度液作为洗脱剂洗脱得到为淡红色固体物质的核苷62(1.8g，60％)。 δH(CDCl3)9.80(1H，br s，NH)，7.80(2H，d，J8.3，Ts)，7.46(1H，d，J8.1， 6-H)，7.35(2H，d，J8.01，Ts)，5.72(1H，d，J8.0，5-H)，5.54(1H，d，J3.5， 1′-H)，5.08(1H，dd，J3.5，6.4，2′-H)，4.94(1H，d，J6.4，3′-H)，4.18(2H，s， 1″-H)，3.82-3.70(2H，m，5′-H)，2.45(3H，s，Ts)，1.46，1.29(6H，s，CH3)。 δC(CDCl3)163.6(C-4)，150.4(C-2)，145.2(C-6)，142.9，132.5，129.9， 128.0(Ts)，114.7(OCO)，102.6(C-5)，94.9，87.6，83.9，81.5(C-4′，C-1′，C- 3′，C-2′)，68.7，63.5(C-1″，C-5′)，26.4，24.7(CH3)，21.7(Ts)。FAB-MS m/z 469[M+H]+。
实施例73
1-(4-C-(对甲苯磺酰基氧基甲基-β-D-呋喃核糖基)尿苷(63)
使核苷62(1.33g，2.83mmol)溶于80％乙酸(25cm3)中并于80℃搅拌 3小时，其后减压除去溶剂。残留物与乙醇(10cm3)共蒸发并经硅胶柱 层析纯化，用0-2％甲醇的二氯甲烷(v/v)梯度液作为洗脱剂洗脱得到为 白色固体物质的核苷63(391mg，33％)。δH(CD3OD)7.81(1H，d，J8.1， 6-H)，7.77(1H，d，J8.4，Ts)，7.40(2H，d，J8.6，Ts)，5.74(1H，d，J6.6，1′- H)，5.69(1H，d，J8.1，5-H)，4.17-4.33(2H，m，2′-H，3′-H)，3.67-3.62(2H， m，1″-H)，3.26-3.20(2H，m，5′-H)，2.43(3H，s，Ts)。δC(CD3OD)166.0 (C-4)，153.0(C-2)，146.5(C-6)，142.5，130.9，129，15(Ts)，103.1(C-5)， 89.0，87.2(C-1′，C-4′)，75.1，72.7，71.3，63.8(C-1″，C-3′，C-2′，C-5′)，21.6 (Ts)。
实施例74
(1S，3R，4R，7S)-7-羟基-1-羟甲基-3-(尿嘧啶-1-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1] 庚烷(44)
于0℃，将氢化钠(8.4mg，21mmol，在矿物油中的60％悬浮液，w/w) 的无水DMF(2cm3)缓慢加入核苷63(64mg，0.14mmol)的无水DMF (2cm3)的搅拌溶液中。然后将该反应混合物加热至120℃6小时，用水 (2cm3)猝灭该反应后，减压除去溶剂后，残留物经硅胶柱层析纯化， 用5-7％甲醇的二氯甲烷梯度液(v/v)作为洗脱剂洗脱得到为白色固体 物质的核苷44(9mg，29％)。NMR数据与早先报道的化合物44的数据 一致。
实施例75
(1S，3R，4R，7S)-7-乙酰氧基-1-乙酰氧基甲基-3-(胸腺嘧啶-1-基)-2，5-二 氧杂二环[2.2.1]庚烷(64)。
向核苷37(209.8mg，0.78mmol)的无水吡啶(2.5cm3)的搅拌溶液加 入乙酸酐(0.3cm3，3.23mmol)和催化量的DMAP(5mg)。搅拌2小时后， 加入乙醇(4cm3)，减压蒸发该混合物。使残留物再溶于二氯甲烷中并 用饱和碳酸氢钠水溶液(7cm3)洗涤。干燥(硫酸钠)有机相并减压蒸发。 残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(97∶3，v/v)作为洗脱剂洗脱 得到为白色固体物质的64(249mg，90％)。δC(CDCl3)169.59，163.20， 149.50，133.55，110.64，87.05，85.38，77.84，71.70，71.02，58.60，20.62， 20.53，12.78。FAB-MS m/z 355[M+H]+。
实施例76
(1S，3R，4R，7S)-1-羟甲基-3-(5-甲基-4-N-苯甲酰基胞嘧啶-1-基)-7-羟基- 2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷(65)
向核苷64(232.7mg，0.66mmol)的无水乙腈(3cm3)的溶液加入 1，2，4-三唑(420mg，6.1mmol)和POCl3(0.12cm3，1.3mmol)的无水乙腈 (5cm3)溶液。将该反应混合物冷却至0℃，加入无水三乙胺(0.83cm3)，其 后将该混合物于室温下保持90分钟。加入三乙胺(0.54cm3)和水 (0.14cm3)，搅拌该反应混合物10分钟，减压蒸发。使残留物溶于EtOAc中并用饱和碳酸氢钠水溶液(2×9cm3)和水(9cm3)洗涤。用二氯甲烷(3 ×20cm3)提取有机相。减压蒸发合并的有机相，使残留物再溶于二噁 烷(4cm3)中，其后加入32％氨水溶液(0.7cm3)。搅拌3小时后，减压蒸 发该反应混合物并与无水吡啶共蒸发。使残留物溶于无水吡啶(3.6cm3) 中，加入苯甲酰氯(0.42cm3，3.6mmol)。搅拌2小时后，用水(1cm3)猝 灭该反应，减压蒸发该反应混合物。然后使残留物再溶于EtOAc中并 用水(3×7cm3)洗涤。减压蒸发该有机相至干，于0℃使残留物溶于吡 啶/甲醇/水(13∶6∶1，v/v/v，14cm3)中，加入2M氢氧化钠的吡啶/甲醇/水 (13∶6∶1，v/v/v，7cm3)溶液。搅拌20分钟后，用2M HCl的二噁烷溶液中 和该反应混合物，减压蒸发该反应混合物。残留物经硅胶柱层析纯化， 用二氯甲烷/甲醇(95∶5，v/v)作为洗脱剂洗脱得到为黄色泡沫状的核苷 65(94.6mg，38％)。δH(CD3OD)8.21(1H，br，s)，8.02(1H，m)，7.84-7.9 (1H，m)，7.41-7.58(4H，m)，5.61(1H，s)，4.36(1H，s)，4.10(1H，s)，3.98 (1H，d，J8.0)，3.94(2H，s)，3.78(1H，d，J7.9)，2.11(3H，d，J1.0)。δC (CD3OD，选定的信号)133.66，132.90，130.63，129.50，129.28，128.65， 90.71，88.86，80.57，72.47，70.22，57.53，14.01。FAB-MS m/z 374 [M+H]+。
实施例77
(1R，3R，4R，7S)-1-(4，4′-二甲氧基三苯甲基氧基甲基)-3-(5-甲基-4-N-苯 甲酰基胞嘧啶-1-基)-7-O-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦氧基)-2，5-二 氧杂二环[2.2.1]庚烷(66)
向核苷65(82mg，0.22mmol)的无水吡啶(1.5cm3)的搅拌溶液加入 4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(80mg，0.24mmol)，于室温下继续搅拌12小 时。加入另外的4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(80mg，0.24mmol)并继续搅拌 另外12小时。加入甲醇(0.5cm3)，减压蒸发该反应混合物。残留物经 硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇/吡啶(98.5∶1.0∶0.5，v/v/v)洗脱。生成 的中间体(FAB-MS m/z 676)(50.2mg)与无水乙腈共蒸发并溶于无水二 氯甲烷(0.62cm3)中。加入N，N-二异丙基乙胺(0.1cm3)，接着加入2-氰 基乙基N，N-二异丙基磷酰胺基chloridite(0.3cm3，0.11mmol)。于室温 搅拌3小时后，加入水(1cm3)，生成的混合物用乙酸乙酯(10cm3)稀释， 用饱和碳酸氢钠水溶液(3×6cm3)和盐水(3×6cm3)洗涤。干燥(硫酸钠) 有机相并减压蒸发。残留物经硅胶柱HPLC纯化。如制备化合物53 中所述进行沉淀提供为白色固体物质的化合物66(29.5mg，0.03mmol， 14％)。δP(CH3CN)148.46，147.49。
实施例78
9-(4-(羟甲基)-2，3-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖基)-6-N-苯甲酰基腺嘌呤 (67)
将草酰氯(0.93ml，10.75mmol)和二氯甲烷(26ml)的混合物冷却至- 70℃。剧烈搅拌下滴加二甲亚砜(DMSO，1.7ml，22mmol)。于-70℃搅拌 该混合物10分钟，在5分钟内加入9-(2，3-O-异亚丙基-β-D-呋喃核糖 基)-6-N-苯甲酰基腺嘌呤(3.4g，8.27mmol)在二甲亚砜/二氯甲烷(1∶9v/v， 20ml)中的溶液。于-60℃搅拌该混合物30分钟。加入三乙胺(7ml， 50.3mmol)并使该混合物温热至室温。用二氯甲烷(50ml)稀释该溶液并 用水(3×100ml)洗涤。用100ml二氯甲烷另外洗涤水部分。浓缩有机 相至油性物质，与二噁烷(50ml)共蒸发并再次溶于30ml二噁烷中。加 入37％甲醛水溶液(2.95ml，33.4mmol)和2M氢氧化钠水溶液 (8.26ml)；于室温下搅拌该混合物10分钟并冷却至0℃。加入硼氢化 钠(640mg，16.9mmol)，在15分钟内使该反应混合物温热至室温。通过 加入乙酸(5cm3)猝灭该反应，向该混合物加入二氯甲烷和饱和碳酸氢 钠水溶液(各100ml)。用水(100ml)洗涤有机相，真空浓缩，经硅胶柱 (2.5×25cm)层析分离产物，用2-3.2％甲醇的二氯甲烷(v/v)作为洗脱 剂。得到1.85g(50.7％)为白色固体物质的化合物67。δH(CDCl3)8.72 (1H，s)，8.14(1H，s)，8.03-8.00(2H，m)，7.60-7.57(1H，m)，7.56-7.46(2H， m)，6.00(1H，d，J4.9)，5.35(1H，dd，J′5.8，J″5.0)，5.13(1H，d，J5.8)，3.87- 3.78(4H，m)，1.65(3H，s)，1.38(3H，s)。δC(CDCl3)164.8，152.2，150.4， 150.2，142.6，133.3，132.9，128.8，128.0，124.1，114.7，93.3，90.2，83.8， 82.5，65.3，62.9，27.3，25.1。FAB-MS：m/z 442[M+H]+，464[M+Na]+。
67的另一合成方法
将三甲基硅烷基氯(15.5ml)加入2′，3′-O-异亚丙基腺苷(15g)的无水 吡啶(250ml)溶液中。于室温下搅拌反应混合物20分钟并冷却至0℃。 滴加苯甲酰氯(17ml)，将该混合物于室温下保持2-3小时。加入水(50ml) 和25％氢氧化铵水溶液(100ml)，继续搅拌3小时。然后减压浓缩该混 合物，与甲苯(2×200ml)共蒸发，加入二氯甲烷(DCM)和饱和碳酸氢 钠水溶液。蒸发有机相至干，得到一黄色固体。从乙醇中重结晶得到 12.5g(约80％)的白色固体中间体物质。将在无水DCM(120ml)中的草 酰氯(4.68ml)冷却至-70℃。在剧烈搅拌下加入DMSO(8.5ml)。随后(10 分钟)滴加(20分钟)如上所述合成的中间体(17g)的10％DMSO/DCM (100ml)溶液。用30分钟的时间使温度升至-50℃，其后用三乙胺(35ml) 猝灭该反应。向该混合物加入DCM(200ml)，将其用水(3×200ml)洗 涤。真空浓缩该中间体，与二噁烷共蒸发并再次溶于二噁烷(120ml) 中。加入甲醛(37％)和2M氢氧化钠水溶液(40ml)，搅拌该反应混合物 1小时。用乙酸(6cm3)中和该混合物，加入DCM(400ml)和饱和碳酸氢 钠水溶液(400ml)。浓缩有机相。经柱层析(硅胶，1.5-5.0％甲醇/DCM) 纯化产物67。得到8.5g(46％)的67。数据在该实施例中早有叙述。
实施例79
9-(2，3-O-异亚丙基-4-(对甲苯磺酰基氧基甲基)-β-D-呋喃核糖基)-6-N- 苯甲酰基腺嘌呤(68)和9-(4-羟甲基-2，3-O-异亚丙基-5-O-(对甲苯磺酰 基)-β-D-呋喃核糖基)-6-N-苯甲酰基腺嘌呤
于0℃，将化合物67(1.95g，4.42mmol)和对甲苯磺酰氯(1.26g， 6.63mmol)的混合物溶于10ml无水吡啶中。搅拌该反应混合物4小时， 然后用二氯甲烷(100ml)稀释，用水(2×100ml)洗涤并减压浓缩。该混 合物在甲醇的二氯甲烷的梯度液(1-4％)中经硅胶柱(2.5×20cm)层析纯 化而使原料67(360mg，18.5％)和两种结构的异构体，即为白色固体物 质的68(较少极性的异构体；971mg，36.7％)和9-(4-羟甲基-2，3-O-异亚 丙基-5-O-(4′-甲苯磺酰基)-β-D-呋喃核糖基)-N6-苯甲酰基腺嘌呤(较大 极性的异构体；352mg，13.1％)分离。68：δH(CDCl3)8.69(1H，s)，8.11 (1H，s)，8.00(2H，m)，7.79(2H，m)，7.58-7.55(1H，m)，7.50-7.46(2H，m)， 7.34-7.32(2H，m)，5.88(1H，d，J4.9)，5.35(1H，dd，J′5.8，J″5.0)，5.13(1H， d，J5.8)，3.87-3.78(4H，m)，1.65(3H，s)，1.38(3H，s)。δC(CDCl3)164.7， 152.0，150.2，150.1，144.9，142.5，133.2，132.7，132.3，129.6，128.6，127.9， 127.8，123.9，114.6，93.1，87.9，83.4，81.6，68.3，64.4，27.1，25.0，21.5。
FAB-MS：m/z 596[M+H]+。
实施例80
9-(4-(对甲苯磺酰基氧基甲基)-β-D-呋喃核糖基)-6-N-苯甲酰基腺嘌呤 (69)
将化合物68(940mg，1.58mmol)在10ml 90％三氟乙酸水溶液中的 溶液于室温下保持30分钟，真空浓缩至油性物质。与甲醇(2×20ml) 和甲苯(20ml)共蒸发后，该混合物经硅胶柱(2×25cm)层析分离该混合 物，用甲醇(2-5.0％)的二氯甲烷梯度液作为洗脱剂，得到为白色固体物 质的化合物69(825mg，94％)。δH(甲醇-d4)8.67(1H，s)，8.53(1H，s)， 8.05(2H，d，J7.7)，7.75(2H，d，J8.2)，7.63(1H，m)，7.53(2H，m)，7.32(2H， d，J8.0)，5.94(1H，d，J7.1)，4.92(1H，dd，J7.1，J″5.3)，4.41(1H，d，J5.1)， 4.38(1H，d，J10.2)，4.28(1H，d，J10.2)，3.80(1H，d，J12.0)，3.68(1H，d， J12.0)，2.35(3H，s)。δC(甲醇-d4)168.2，152.9，150.8，151.2，146.4，144.9， 134.7，134.1，134.0，130.8，129.7，129.4，129.1，125.1，90.0，88.4，75.3， 73.1，71.1，64.2，21.6。FAB-MS：m/z 556[M+H]+。
实施例81
9-(4-(对甲苯磺酰基氧基甲基)-3，5-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-β- D-呋喃核糖基)-6-N-苯甲酰基腺嘌呤(70)
于0℃，向化合物69(780mg，1.40mm0l)的无水吡啶(7ml)溶液加 入1，3-二氯代-1，1，3，3-四异丙基-二硅氧烷(500μl，1.57mmol)。于0℃搅 拌2小时后，加入另外的1，3-二氯代-1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷(50μl， 0.16mmol)。使反应混合物温热至室温，用二氯甲烷(100ml)稀释，用 水(2×100ml)洗涤。浓缩有机相，残留物经采用制备性HPLC(PrepPak 柱，Porasil 15-20μm 125；洗脱液：0-3％甲醇的二氯甲烷溶液(v/v)， 120min；流速：60ml/min)纯化。真空浓缩，得到870mg(78％)白色固体 物质的化合物70。δH(CDCl3)8.65(1H，s)，8.03(2H，m)，8.00(1H，s)，7.83 (2H，d，J8.4)，7.58(1H，m)，7.49(2H，m)，7.34(2H，d，J8.4)，5.87(1H，s)， 5.70(1H，d，J6.2)，4.68(1H，d，J6.2)，4.59(1H，d，J10.8)，4.31(1H，d， J11.0)，3.91(2H，s)，2.45(3H，s)，1.03-0.84(28H，m)。δC(CDCl3)164.9， 152.2，150.5，150.0，144.7，142.9，133.5，132.9，132.8，129.7，128.8，128.1， 128.0，123.6，90.3，85.3，76.0，75.0，68.7，65.2，21.6，17.5，17.4，17.2，17.1， 17.0，16.9，13.1，13.0，12.5，12.4。FAB-MS：m/z 798[M+H]+。
实施例82
9-(2-O，4-C-亚甲基-3，5-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基(disiloxa-1，3- diyl))-β-D-呋喃核糖基)-6-N-苯甲酰基腺嘌呤(71)
将化合物70(540mg，0.68mmol)的无水THF(20ml)溶液冷却至0 ℃，搅拌下加入氢化钠(130mg 60％的矿物油中的悬浮液，3.25mmol)。 搅拌该反应混合物30分钟，然后通过加入750μl乙酸中和。加入二氯 甲烷(50ml)，用饱和碳酸氢钠水溶液(2×50ml)洗涤该混合物并减压浓 缩。残留物加于硅胶柱(2.5×25cm)，用甲醇的二氯甲烷的梯度浓度液 (0.5-1.2％)作为洗脱剂洗脱该产物，得到为白色泡沫状的化合物71 (356mg，84％)。δH(CDCl3)8.77(1H，s)，8.28(1H，s)，8.03(2H，m)，7.59 (1H，m)，7.50(2H，m)，6.08(1H，s)，4.86(1H，s)，4.56(1H，s)，4.14(1H，d， J13.2)，4.06(1H，d，J7.7)，3.97(1H，d，J13.2)，3.89(1H，d，J7.7)，1.12- 0.95(28H，m)。δC(CDCl3)164.8，152.6，150.5，149.6，140.7，133.6，132.7， 128.7，127.9，123.1，89.4，86.5，78.9，71.7，71.2，56.7，17.3，17.1，17.0，16.9， 16.8，13.3，13.1，12.5，12.2。FAB-MS：m/z 626[M+H]+。
实施例83
7-羟基-1-羟甲基-3-(6-N-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-2，5-二氧杂二环[2.2.1]- 庚烷(61B)
将三乙胺三-氟化氢(300μl，1.84mmol)加入化合物71(420mg， 0.067mmol)的无水THF(7ml)溶液中。于室温下保持该反应混合物1 小时并浓缩成油状物，将其经硅胶柱(2×25cm)层析纯化，用4-10％甲 醇的二氯甲烷(v/v)洗脱。得到232mg(92％)为白色固体物质的化合物 61B。NMR数据与早先报道的化合物61B的数据相同。
实施例84
1-(3，5-二-O-苄基-4-C-(对甲苯磺酰基氧基甲基)-2-O-对甲苯磺酰基-β- D-呋喃核糖基)胸腺嘧啶(72)
于室温下，将1-(3，5-二-O-苄基-4-C-(羟甲基)-β-D-呋喃核糖基)胸 腺嘧啶35(1.48g，3.16mmol)、DMAP(1.344g，0.011mol)和对甲苯磺酰 氯(1.45g，7.6mmol)的二氯甲烷(20ml)溶液搅拌3小时。用二氯甲烷 (30ml)稀释该反应混合物并用饱和碳酸氢钠水溶液(3×20ml)和氯化钠 (2×25ml)洗涤。干燥(硫酸钠)有机相，过滤并减压蒸发。残留物经硅 胶柱层析纯化，用甲醇∶二氯甲烷(1.99，v/v)洗脱得到为白色固体物质的 核苷72(1.95g，80％)。FAB-MS m/e 776。δC(CDCl3)162.9，149.8(C-2， C-4)，145.8，145.2(2×Ts)，136.9，136.8(2×Bn)，134.3(C-6)，132.1， 132.0，130.0，129.9，129.0 128.9，128.4，128.3，128.2，128.0，127.7(2×Ts， 2×Bn)，111.2(C-5)，85.3，84.0(C-1′，C-4′)，78.9，78.3，75.2，74.3，72.7， 69.1(C-2′，C-3′，C-5′，C-1″，2×Bn)，21.7(2×CH3)，11.9(CH3)。 C39H40N2S2O11的分析计算值：C，60.30；H，5.19；N，3.61。实测值：C， 59.95；H，5.11，N 3.81。
实施例85
1-(2-苄基氨基-2-脱氧(deoxy)-3，5-二-O-苄基-2-N，4-C-亚甲基-β-D-呋喃 核糖基)胸腺嘧啶(73)
于130℃将72(8.6g，11.1mol)的苄基胺(10ml)的溶液搅拌36小 时。使该反应混合物直接经硅胶柱层析纯化，用甲醇：二氯甲烷(1.99，v/v) 洗脱得到为白色固体物质的核苷73(1.79g，30％)。FAB-MS m/e 540。δC (CDCl3)163.9，149.8(C-2，C-4)，139.2，137.6，137.3(3×Bn)，135.6(C-6)， 128.5，128.4，128.3，128.2，128.0，127.7，127.0(3×Bn)，109.6(C-5)，88.2， 86.3(C-1′，C-4′)，76.7，73.8，72.0，66.0，63.8，57.9，57.8(C-2′，C-3′，C-5′， C-1″，3×Bn)，12.2(CH3)。C32H33N3O5×0.5H2O的分析计算值：C，70.06； H，6.25；N，7.66。实测值：C，70.00；H，6.06；N，7.50。
实施例86
1-(2-氨基-2-脱氧-2-N，4-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖基)胸腺嘧啶(74)
将载于碳上的20％氢氧化钯(3g)加入核苷73(1.62g，0.003mol)的 乙醇(150ml)的溶液中，在氢气下搅拌该悬浮液5天。过滤除去(硅胶) 催化剂并用甲醇(20ml)洗涤。减压浓缩合并的滤液得到白色固体物 质，将其滤出后，用甲醇∶二氯甲烷(1∶4，v/v)洗涤得到一苄基化的中间 体(0.82g，76％)。FAB-MS：m/e 360(M+H)+。13C-NMR(DMSO-d6，250 MHz)：163.7，149.8(C-2，C-4)，138.2(Bn)，134.9(C-6)，128.2，127.5， 127.4(Bn)，107.8(C-5)，87.8，87.6(C-1′，C-4′)，72.7，68.9，65.9，61.7，49.4 (C-2′，C-3′，C-5′，C-1″，Bn)，11.9(CH3)。C18H21N3O5的分析计算值：C， 60.16；H，5.89；N，11.69。实测值：C，59.86；H，5.61；N，11.56。将该中间 体(0.1g，0.29mmol)、甲酸铵(0.085g，1.35mmol)、10％钯碳(130mg)在 无水甲醇(7ml)中的混合物于回流下加热2小时。过滤除去(硅胶)催化 剂并用甲醇(15ml)洗涤，减压浓缩合并的滤液至干。残留物经硅胶柱 层析纯化，用甲醇∶二氯甲烷(1∶9，v/v)作为洗脱剂，得到为白色固体物 质的标题化合物74。FAB-MS m/e 270。δH(DMSO-d6)11.29(bs，1H， NH)，7.73(d，1H，J1.1，6-H)，5.31(s，1H，1′-H)，5.29(br s，1H，3′-OH)， 5.13(m，1H，5′-OH)，3.81(s，1H，3′-H)，3.69(m，2H，5′-H)，3.23(s，1H，2′- H)，2.88(d，1H，J9.8，1″-Ha)，2.55(d，1H，J9.8，1″-Hb)，1.77(d，3H，J0.8， CH3)。δC(DMSO-d6)164.0，150.1(C-2，C-4)，135.6(C-6)，107.8(C-5)， 89.5，87.9(C-1′，C-4′)，68.7，61.9，57.1，49.4，(C-2′，C-3′，C-5′，C-1″)。 C11H15N3O5×0.5H2O的分析计算值：C，47.48；H，5.80；N，15.10。实测值： C，47.54；H，5.30；N，14.79。
73转化为74的替代方法
向73(0.045g，0.0843mmol)的甲醇(6ml)溶液中加入10％Pd碳 (0.118g)和在3小时内分3份加入甲酸铵(0.145g，0.0023mol)。使该悬 浮液回流4.5小时。过滤除去(硅胶)催化剂并用甲醇(4×3ml)洗涤。浓 缩合并的滤液，残留物经硅胶柱层析纯化，用甲醇∶二氯甲烷(1∶9，v/v) 作为洗脱剂，得到核苷74(0.015g，67％)。光谱数据与该实施例中早先 报道的化合物74的数据相同。
实施例87
1-(2-氨基-2-脱氧-2-N，4-C-亚甲基-2-N-三氟乙酰基-β-D-呋喃核糖基)胸 腺嘧啶(74-COCF3)
将DMAP(0.013g，0.106mmol)和三氟乙酸乙酯(0.029ml，0.242 mmol)加入核苷74(0.050g，0.186mmol)的甲醇(2ml)的悬浮液中，于室 温下搅拌该混合物2.5小时。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯 化，用甲醇∶二氯甲烷(2.5∶97.5，v/v)作为洗脱剂，减压蒸发溶剂后得到 为白色固体物质的标题核苷74-COCF3(0.055g，81％)。FAB-MS m/z 366[M+H]+.13C NMR(CD3OD，62.9MHz)δ166.5，157.7(q，2JC，F 37.5 Hz，COCF3)，157.6(q，1JC，F 37.2Hz，COCF3)，151.8，136.8，136.8，117.6 (d，1JC，F 287.5Hz，CF3)，117.5(d，1JC，F 286.5Hz，CF3)，110.8，110.8，90.7， 89.3，87.7，87.3，70.1，68.6，66.2，66.2，64.5，57.9，53.3，12.7。 C13H14N3O6F3的分析计算值：C，42.8；H，3.9；N，11.5。实测值：C，42.5；H， 4.0；N，11.2。
实施例88
1-(2-氨基-2-脱氧-5-O-4，4′-二甲氧基三苯甲基-2-N，4-C-亚甲基-2-N-三 氟乙酰基-β-D-呋喃核糖基)胸腺嘧啶(74-DMT)
于0℃向核苷74-COCF3(0.030g，0.082mmol)的无水吡啶(0.6ml)的 溶液滴加(20分钟)溶于无水吡啶∶二氯甲烷(0.6ml，1∶1，v/v)中的4，4′-二 甲氧基三苯甲基氯(0.054g，0.159mmol)，于室温下搅拌该混合物10小 时。加入冰和水的混合物(5ml)，生成的混合物用二氯甲烷(3×5ml)提 取。用饱和碳酸氢钠水溶液(3×2ml)洗涤合并的有机相，干燥(硫酸钠) 并过滤。减压蒸发滤液至干，残留物经硅胶柱层析纯化，用甲醇∶二氯 甲烷∶吡啶(1.5∶98.0∶0.5，v/v/v)作为洗脱剂，经减压蒸发溶剂后得到为白 色固体物质的核苷74-DMT(0.051g，93％)。FAB-MS m/z 667[M]+，668 [M+H]+。C34H32N3O8F3+的FAB-HRMS计算值：667.2142。实测值： 667.2146。13C NMR(C5D5N，100.6MHz)δ165.1，165.0，159.5，159.5， 151.4，145.7，136.3，136.1，134.8，134.6，130.9，130.9，130.9，128.9，128.9， 128.7，128.7，128.4，127.7，123.2，114.1，114.1，114.0，110.4，89.4，87.9， 87.5，87.4，87.2.70.8，69.0，66.0，64.4，60.5，60.2，55.5，53.6，53.4，49.9， 13.2，13.1。
实施例89
1-(2-氨基-3-O-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦基-2-脱氧)-5-O-4，4′-二 甲氧基三苯甲基-2-N，4-C-亚甲基-2-N-三氟乙酰基-β-D-呋喃核糖基)胸 腺嘧啶(74A)
于0℃向核苷74-DMT(0.121g，0.181mmol)的无水二氯甲烷(2ml) 的溶液加入N，N-二异丙基乙胺(0.093ml，0.54mmol)和2-氰基乙基N，N- 二异丙基磷酰胺基chloridite(0.057ml，0.26mmol)，于室温下搅拌该混 合物10小时。用二氯甲烷(20ml)稀释该混合物，用饱和碳酸氢钠水溶 液(3×10ml)提取，干燥(硫酸钠)并过滤。减压蒸发滤液至干，残留物 经硅胶柱层析纯化，用甲醇∶二氯甲烷∶吡啶(1.5∶98.0∶0.5，v/v/v)作为洗脱 剂，减压蒸发溶剂后得到粗产物(0.107g)。使残留物溶于无水二氯甲烷 (1ml)中，于-30℃滴加到剧烈搅拌的石油醚(60-80℃，30ml)中，沉淀的 核苷74A经过滤后得到白色固体物质(0.090g，57％).FAB-MS m/z 868 [M+H]+，890[M+Na]+。31P NMR(CD3CN，121.5MHz)δ150.4，150.2， 148.8，149.1。
实施例90
1-(2-氨基-2-N，4-C-亚甲基-3，5-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-β-D-呋 喃核糖基)胸腺嘧啶(74B)
于-15℃，向核苷74(0.20g，0.74mmol)的无水吡啶(3ml)溶液滴加 1，3-二氯代-1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷(0.305ml，0.0011mol)，于室温下 搅拌该混合物10小时。加入甲醇(3ml)，将该混合物减压蒸发至干。 残留物经硅胶柱层析纯化，用甲醇∶二氯甲烷(1∶99，v/v)洗脱，减压蒸发 溶剂后得到为白色固体物质的核苷74B(0.370mg，97％)。FAB-MS m/z 512[M+H]+。1H NMR((CD3)2SO，400MHz)δ11.37(bs，1H)，7.48(s， 1H)，5.32(s，1H)，4.06(d，1H，J13.5Hz)，4.00(s，1H)，3.84(d，1H，J13.5 Hz)，3.41(s，1H)，2.92(d，1H，J10.2Hz)，2.64(d，1H，J10.2Hz)，1.74(s， 3H)，1.10-0.92(m，28H)。13C NMR((CD)3SO2，62.9MHz)δ163.8，149.8， 134.1，107.9，89.5，87.9，70.1，61.1，57.9，49.3，17.2，17.2，17.0，16.9，16.8， 16.7，12.6，12.2，11.7。C23H41N3O6Si2的分析计算值：C，54.0；H，8.1；N， 8.2。实测值：C，54.0；H，8.3；N，7.8。
实施例91
1-(2-脱氧-2-甲基氨基-2-N，4-C-亚甲基-3，5-O-(四异丙基二硅噁烷-1，3- 二基)-β-D-呋喃核糖基)胸腺嘧啶(74C)
于-10℃，向核苷74B(0.33g，0.64mmol)的无水THF∶二氯甲烷(4∶1， v/v)溶液滴加(30分钟)1，8-二氮杂二环[5.4.0]十一-7-烯(DBU，0.125ml， 0.836mmol)和甲基碘(0.05ml，0.79mmol)，于10℃搅拌该混合物48小 时。将另外的DBU(0.05ml，0.33mmol)和甲基碘(0.020ml，0.32mmol) 滴加(15分钟)到该反应混合物中并于10℃继续搅拌24小时。将该混 合物减压蒸发至干，残留物经硅胶柱层析纯化，用甲醇∶二氯甲烷(1∶99， v/v)作为洗脱剂，蒸发溶剂后得到为白色固体物质的核苷74C(0.25g， 74％)。FAB-MS m/z 526[M+H]+。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ8.19(bs， 1H)，7.65(d，1H，J1.3Hz)，5.59(s，1H)，4.11(s，1H)，4.05(d，1H，J13.2 Hz)，3.87(d，1H，J13.2Hz)，3.44(s，1H)，2.98(d，1H，J9.5Hz)，2.71(d， 1H，J9.5Hz)，2.72(s，3H)，1.91(d，1H，J1.1Hz)，1.12-0.96(m，28H). 13C NMR(CDCl3，62.9MHz)δ163.7，149.6，135.2，109.7，90.9，85.7， 71.4，67.3，58.6，58.2，41.2，17.5，17.4，17.3，17.2，17.1，16.9，13.3，13.1， 13.0，12.6，12.1。C24H44N3O6Si2，0.25H2O的分析计算值：C，54.4；H，8.3；N， 7.9。实测值：C，54.4；H，8.1；N，7.7。
实施例92
1-(2-脱氧-2-甲基氨基-2-N，4-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖基)胸腺嘧啶 (74D)
于室温下，向核苷74C(0.40g，0.76mmol)的THF溶液加入四丁基 氟化铵的THF(1.0M，2.2ml，2.2mmol)溶液，搅拌该反应混合物20分 钟，其后加入吡啶∶水∶甲醇(6ml.3∶1∶1，v/v/v)。将该混合物加到悬浮于 吡啶∶水∶甲醇(6ml.3∶1∶1，v/v/v)的Dowex 50×200树脂(2.2g，H+(吡啶鎓) 形式，100-200目)上，搅拌生成的混合物20分钟。过滤后，残留物用 吡啶∶水∶甲醇(3×3ml.3∶1∶1，v/v/v)洗涤，减压蒸发合并的滤液至干，于 甲醇(2×5ml)共蒸发后得到油性残留物。经硅胶柱层析，用甲醇∶二氯 甲烷(1∶49，v/v)作为洗脱剂，减压蒸发溶剂后得到为白色固体物质的核 苷74D(0.17g，79％)。FAB-MS m/z 284[M+H]+。C12H18N3O5+的FAB- HRMS计算值：284.12465。实测值：284.12402。1H NMR((CD3)2SO，400 MHz)δ11.3(bs，1H，NH)，7.70(d，1H，J1.1Hz，6-H)，5.50(s，1H，1′-H)， 5.26(d，1H，J4.9Hz，3′-OH)，5.12(t，1H，J5.7Hz，5′-OH)，3.87(d，1H，J 4.8Hz，3′-H)，3.67(d，2H，J5.5Hz，5′-H)，3.12(s，1H，2′-H)，2.87(d，1H， J9.3Hz，5″-Ha)，2.56(s，3H，NCH3)，2.52-2.49(1H，m，5″-Hb)，1.77(s，3H， CH3)。1H NMR(CD3OD，400MHz)δ7.80(d，1H，J1.3Hz，6-H)，5.71(s， 1H，1′-H)，4.07(s，1H，3′-H)，3.83(s，2H，5′-H)，3.36(s，1H，2′-H)，3.08(d， 1H，J9.9Hz，5″-Ha)，2.68(s，3H，NCH3)，2.57(d，1H，J9.9Hz，5″-Hb)， 1.88(d，3H，J1.1Hz，CH3)。13C NMR(CD3OD，62.9MHz)δ166.6， 151.9，137.4，110.4，91.3，85.2，71.4，69.1，59.4，58.7，40.2，12.2。
实施例93
1-(2-脱氧-5-O-4，4′-二甲氧基三苯甲基-2-甲基氨基-2-N，4-C-亚甲基-β- D-呋喃核糖基)胸腺嘧啶(74E)
于0℃，向核苷74D(0.135g，0.447mmol)的无水吡啶(1.5ml)溶液滴 加(20分钟)4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(0.238g，0.702mmol)的无水吡啶∶ 二氯甲烷(1.0ml.1∶1，v/v)溶液，于室温下搅拌生成的混合物10小时。 加入冰和水的混合物(5ml)，该混合物用二氯甲烷(3×10ml)提取。用饱 和碳酸氢钠水溶液(3×5ml)洗涤合并的有机相，干燥(硫酸钠)并过滤。 减压蒸发滤液至干，残留物经硅胶柱层析纯化，用甲醇∶二氯甲烷∶吡啶 (1∶98∶1，v/v/v)作为洗脱剂，经减压蒸发溶剂后得到为白色固体物质的 核苷74E(0.20g，72％)。FAB-MS m/z 586[M+H]+。1H NMR(C5D5N，400 MHz)δ13.2(bs，1H)，7.98(d，1H，J1.3Hz)，7.98-7.00(m，13H)，6.12(s， 1H)，4.78(d，1H，J3.7Hz)，3.88-3.79(m，4H)，3.71(s，3H)，3.71(s，3H)， 3.29(d，1H，J9.3Hz)，2.84(d，1H，J9.3Hz)，2.81(s，3H)，1.85(d，3H，J 0.9Hz)。13C NMR(C5D5N，62.9MHz)δ165.1，159.2，151.4，145.9， 136.5，136.4，130.8，130.7，128.7，128.4，127.4，113.8，109.6，89.8，86.8， 85.1，72.0，68.7，60.9，59.4，55.2，40.1，13.1。C33H35N3O7，0.25H2O的分析 计算值：C，67.2；H，6.1；N，7.1。实测值：C，67.2；H，6.2；N，6.9。
实施例94
1-(3-O-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦基)-5-O-4，4′-二甲氧基三苯甲 基-2-甲基氨基-2-N，4-C-亚甲基-2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)胸腺嘧啶 (74F)
于0℃向核苷74E(0.130g，0.222mmol)的无水二氯甲烷(2ml)的溶 液加入N，N-二异丙基乙胺(0.088ml，0.514mmol)和2-氰基乙基N，N-二 异丙基磷酰胺基chloridite(0.065ml，0.291mmol)，于室温下搅拌该混合 物10小时。加入二氯甲烷(30ml)，用饱和碳酸氢钠水溶液(3×10ml) 提取该混合物，干燥(硫酸钠)并过滤。减压蒸发滤液至干，残留物经 硅胶柱层析纯化，用甲醇∶二氯甲烷∶吡啶(0.5∶98.5∶1.0，v/v/v)作为洗脱 剂，减压蒸发溶剂后得到粗产物(0.120g)。使残留物溶于无水二氯甲烷 (1ml)中，于-30℃滴加到剧烈搅拌的石油醚(60-80℃，30ml)中，过滤后 得到为白色固体物质沉淀的核苷74F(0.090g，52％)。31P NMR (CD3CN，121.5MHz)δ147.7。
实施例95
1-(3，5-二-O-苄基-4-C-(对甲苯磺酰基氧基甲基)-2-O-对甲苯磺酰基-β- D-呋喃核糖基)尿嘧啶(75)
于室温下，向1-(3，5-二-O-苄基-4-C-羟甲基-β-D-呋喃核糖基)尿嘧 啶41(3.55g，7.81mmol)的二氯甲烷(50cm3)搅拌溶液加入DMAP(3.82g) 和对甲苯磺酰氯(4.47g，23.5mmol)。继续搅拌2小时，加入二氯甲烷 (100cm3)。用饱和碳酸氢钠水溶液(2×75cm3)洗涤该反应混合物并干燥 (硫酸钠)。减压蒸发有机相，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/ 甲醇(99.5∶0.5，v/v)作为洗脱剂，得到为白色固体物质的核苷75(4.65g， 78％)。δH(CDCl3)8.49(1H，br s，NH)，7.67(1H，d，J8.3，6-H)，7.51-7.03 (18H，m，Bn，Ts)，6.0(1H，d，J7.6，1′-H)，5.05(1H，m，2′-H)，4.91(2H，m， 5-H，Bn)，4.56(2H，m，Bn)，4.42(1H，d，J10.4，Bn)，4.31(1H，d，J4.9，3′- H)，4.05(2H，m，1″-H)，3.75-3.64(2H，m，5′-H)，2.41(3H，s，CH3)，2.34 (3H，s，CH3)。δC(CDCl3)162.2(C-4)，149.5(C-2)，146.0，145.3(Ts)， 139.0(C-6)，136.7，131.9，130.0，129.9，128.9，128.7，128.5，128.4，128.3， 128.2，128.0，127.6(Bn，Ts)102.7(C-5)，85.5(1′-C)，84.4(4′-C)，79.2， 78.3，75.1，74.3，72.4，69.1(Bn，3′-C，2′-C，5′-C，1″-C)，21.7，21.6(Ts). FAB-MS m/z 763。实测值：C，61.2；H，4.4；N，3.3；C38H38N2O11S2的计算 值：C，59.8；H，5.0；N，3.6。
实施例96
1-(2-脱氧-3，5-二-O-苄基-2-S，4-C-亚甲基-2-巯基-β-D-呋喃核糖基)胸腺 嘧啶(76)
将硫代乙酸钾(0.83g，7.28mmol)加入核苷75(3.70g，4.86mmol)的 DMF(40cm3)的搅拌溶液中。搅拌该混合物并于110℃加热80小时。 减压蒸发后，加入水(100cm3)。用二氯甲烷(4×50cm3)提取，干燥(硫 酸钠)合并的有机相。过滤并减压蒸发。残留物经硅胶层析纯化，用二 氯甲烷∶甲醇(99.6∶0.4，v/v)作为洗脱剂，得到为白色固体物质的核苷76 (1.65g，75％)。δH(CDCl3)9.08(1H，br s，NH)，7.98(1H，d，J8.1，6-H)， 7.39-7.20(10H，m，Bn)，5.85(1H，s，1′-H)，5.26(1H，d，J8.1，5-H)，4.61 (1H，dJ 11.4，5′-H)，4.56(2H，s，Bn)，4.45(1H，d，J 11.4，Bn)，4.14(1H，d， J1.7，3′-H)，3.82(2H，m，Bn)，3.72(1H，d，J1.9，2′-H)，3.02(1H，d，J9.9， 1″-Ha)，2.78(1H，d，J9.9，1″-Hb)。δC(CDCl3)163.4(C-4)，150.0(C-2)， 139.9(C-6)，137.2，136.8，128.6，128.5，128.2，127.9，127.7(Bn)，100.8 (C-5)，90.8，88.8(C-1′，C-4′)，76.5，73.8，72.0，70.0(2×Bn，C-3′，C-5′)， 49.52(C-2′)，35.63(C-1″)。FAB-MS m/z 453。实测值：C，63.4；H，5.1；N， 5.9；C24H24N2O5S的计算值：C，63.7；H，5.3；N，6.1。
实施例97
1-(2-O-对甲苯磺酰基-4-C-(对甲苯磺酰基氧基甲基)-β-D-呋喃核糖基) 尿嘧啶(76A)
向化合物75(0.80g，1.0mmol)的无水乙醇(2cm3)溶液加入载于碳 上的20％氢氧化钯(0.80g)，用氢气使该混合物脱气数次并在氢气下持 续搅拌48小时。过滤除去催化剂并减压蒸发滤液。残留物经硅胶柱层 析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1，v/v)作为洗脱剂得到为白色固体物质的 核苷76A(0.30g，49％)。δH(CD3OD)7.67(4H，m)，7.45(1H，d，J8.2Hz)， 7.34(4H，m)；5.86(1H，d，J8.0Hz)，5.40(1H，d，J8.1Hz)，4.95(1H，m)， 4.35(1H，d，J 5.0Hz)，4.17(2H，m)，3.61(2H，s)，2.40(6H，s)。δC (CD3OD)165.4，151.6，147.5，146.6，141.3，134.0，133.8，131.4，130.9， 129.2，128.9，103.7，88.0，85.4，80.7，72.4，71.0，64.3，21.7，21.6。FAB-MS m/z 583[M+H]+。
实施例98
1-(3，5-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)-2-O-对甲苯磺酰基-4-C-(对甲 苯磺酰基氧基甲基)-β-D-呋喃核糖基)尿嘧啶(76B)
向核苷76A(0.27g，0.46mmol)的无水吡啶(4cm3)的搅拌溶液加入 1，3-二氯代-1，1，3，3-四异丙基二硅氧烷(0.22cm3，0.70mmol)。搅拌48小 时后使该混合物冷却至0℃，加入饱和碳酸氢钠水溶液(15cm3)。用二 氯甲烷(3×10cm3)提取该混合物，干燥(硫酸钠)合并的有机相并过滤。 减压蒸发溶剂，残留物经硅胶层析纯化，用二氯甲烷∶甲醇(99.5∶0.5，v/v) 作为洗脱剂，得到为白色固体物质的核苷76B(0.37g，97％)。δH(CDCl3) 8.70(1H，br s)，7.80(4H，m)，7.36(4H，m)，6.98(1H，d，J8.1Hz)，5.64 (1H，d，J8.0Hz)，5.18(2H，m)，4.98(1H，d，J7.0Hz)，4.39-4.32(2H，m)， 3.92-3.76(2H，s)，2.45(6H，s)，1.27-0.66(28H，m)。δC(CDCl3)162.9， 149.3，145.6，144.8，143.9，132.9，130.1，129.9，128.2，128.1，102.2，94.6， 84.7，80.4，72.8，67.8，64.6，21.7，17.3，17.2，17.1，16.9，16.8，13.1，12.8， 12.3。FAB-MS m/z 825[M+H]+。
实施例99
1-(2-脱氧-2-巯基-2-S，4-C-亚甲基-3，5-O-(四异丙基二硅氧烷-1，3-二基)- β-D-呋喃核糖基)尿嘧啶(76C)
将硫代乙酸钾(0.054g，0.47mmol)加入核苷76B(0.26g，0.32mmol) 的DMF(5cm3)的搅拌溶液中。于110℃搅拌该反应混合物20小时。减 压蒸发该混合物后，加入水(20cm3)。用二氯甲烷(3×10cm3)提取，干 燥(硫酸钠)合并的有机相，过滤并减压蒸发。残留物经硅胶层析纯化， 用二氯甲烷∶甲醇(99.25∶0.75，v/v)作为洗脱剂，得到为白色固体物质的 核苷76C(0.125g，77％)。δH(CDCl3)8.55(1H，br s)，8.02(1H，d，J8.1Hz)， 5.82(1H，s，1′-H)，5.65(1H，d，J8.1Hz)，4.37(1H，d，J2.1Hz)，4.10(1H， d，J13.2Hz)，3.90(1H，d，J13.1Hz)，3.53(1H，d，J2.1Hz)，2.92(1H，d， J10.1Hz)，2.74(1H，d，J10.0Hz)，1.30-0.80(28H，m)。δC(CDCl3)163.2， 149.8，139.6，100.9，91.4，90.7，71.5，59.8，51.5，34.4，17.5，17.3，17.1， 16.9，15.5，13.6，13.3，13.1，12.9，12.3。FAB-MS m/z 515[M+H]+。
实施例100
1-(2-脱氧-2-巯基-2-S，4-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖基)尿嘧啶(76D)
于0℃，向核苷76C(25mg，0.094mmol)的THF(1.0cm3)的搅拌溶 液加入四丁基氟化铵(0.20cm3的1M溶液，在THF中，0.20mmol)溶 液。于0℃搅拌该混合物1小时后，加入水(5cm3)，蒸发该混合物。残 留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(97∶3，v/v)作为洗脱剂，得到 为白色固体物质的核苷76D(9.0mg，69％)。δH(CD3OD)8.19(1H，d，J 8.1Hz，6-H)，5.77(1H，s，1′-H)，5.65(1H，d，J8.1Hz，5-H)，4.31(1H，d，J 2.1Hz，3′-H)，3.86(2H，s，5′-H)，3.53(1H，d，J2.2Hz，2′-H)，2.93(1H，d， J10.3Hz，1″-Ha)，2.73(1H，d，J10.3Hz，1″-Hb)。δC(CD3OD)166.5，152.0， 141.7，101.2，92.1，92.0，71.4，59.9，53.6，35.4。FAB-MS m/z 273[M+H]+
实施例101
1-(2-脱氧-5-O-(4，4′-二甲氧基三苯甲基)-2-巯基-2--S，4-C-亚甲基-β-D- 呋喃核糖基)尿嘧啶(76E)
于室温下，向76D(0.2g，0.37mmol)的无水吡啶(5cm3)溶液加入 4，4′-二甲氧基三苯甲基氯(0.186g，0.55mmol)。搅拌该溶液5小时，其 后将该反应混合物冷却至0℃。加入饱和碳酸氢钠水溶液(30cm3)，生 成的混合物用二氯甲烷(3×50cm3)提取。分离合并的有机相，干燥(硫 酸钠)。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇/ 吡啶(98.5∶1.0∶0.5，v/v/v)作为洗脱剂，得到为棕白色固体物质的核苷 76E(0.175g；83％)。δC(CDCl3)164.5，159.4，151.6，145.7，139.9，136.4， 136.0，135.6，130.9，130.8，128.8，128.5，128.4，127.5，127.4，122.7，113.9， 101.5，91.7，90.2，87.6，71.8，61.9，55.3，53.7，36.2，30.6。FAB-MS m/z 574 [M]+，575[M+H]+(实测值：C，65.2；H，5.4；N，5.0；C31H30N2O7S的计算 值：C，64.8；H，5.3；N，4.9％)。
实施例102
1-(3-O-(2-氰基乙氧基(二异丙基氨基)膦基)-(2-脱氧-5-O-(4，4′-二甲氧基 三苯甲基)-2-巯基-2--S，4-C-亚甲基-β-D-呋喃核糖基)尿嘧啶(76F)
于0℃向核苷76E(0.160g，0.28mmol)的无水二氯甲烷(2cm3)的溶 液加入N，N-二异丙基乙胺(0.27cm3)和2-氰基乙基N，N-二异丙基磷酰 胺基chloridite(97mg，0.42mmol)。于室温下继续搅拌5小时。使该反 应混合物冷却至0℃，加入饱和碳酸氢钠水溶液(30cm3)。用二氯甲烷 (3×20cm3)提取，干燥(硫酸钠)合并的有机相并减压蒸发至干。残留物 经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇/吡啶(99∶0.5∶0.5，v/v/v)作为洗脱 剂得到白色泡沫物。使残留物溶于二氯甲烷(2cm3)中，剧烈搅拌下使 该产物从轻石油(100cm3，冷却至-40℃)中沉淀。过滤收集沉淀物，最 后干燥得到为白色固体物质的核苷76F(95mg，44％)。δP(CDCl3)148.9， 149.0。
实施例103
3，5-二-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-4-C-(对甲苯磺酰基氧基甲基)-β-D-呋喃 核糖(77)
于-5℃搅拌3，5-二-O-苄基-4-C-羟甲基-1，2-O-异亚丙基-α-D-呋喃 核糖(31)(15.38g，38.4mmol)、无水吡啶(20cm3)和无水二氯甲烷(80ml) 的溶液。在15分钟内，加入溶于无水二氯甲烷(8cm3)中的对甲苯磺酰 氯(8.75g，46.0mmol)。于室温下搅拌该溶液17小时。用冰冷却的水 (200cm3)猝灭该反应。用二氯甲烷(5×150cm3)提取，用饱和碳酸氢钠 水溶液(3×100cm3)和盐水(3×100cm3)洗涤合并的有机相，干燥(硫酸 钠)，过滤并减压蒸发。残留物经硅胶层析纯化，用二氯甲烷∶甲醇 (98.5∶1.5，v/v)作为洗脱剂，得到为澄清油状的77(17.4g，82％)。δH (CDCl3)7.79-7.19(14H，m，Bn)，5.66(1H，d，J3.6，1-H)，4.69-4.20(8H， m，Bn，5-Ha，5-Hb，3-H，2-H)，3.53(1H，d，J10.3，1′-Ha)，3.46(1H，d，J 10.3，1′-Hb)，2.40(3H，s，CH3)，1.29(3H，s，CH3)，1.26(3H，s，CH3)。δC (CDCl3)144.6，137.9，137.3，133.0，129.8，128.4，128.3，128.1，128.0， 127.9，127.7，127.6(芳族的)，113.6(C(CH3)2)，104.2，(C-1)，84.7(C-4)， 79.0，78.7，73.7，72.7，70.7，70.2，(Bn，C-2，C-3，C-5，C-1′)，26.3，26.0 (C(CH3)2)，21.6(CH3)。FAB-MS m/z 555[M+H]+。(实测值：C，64.8；H， 6.2；C30H34O8S的计算值：C，64.9；H，6.1％)。
实施例104
1，2-二-O-乙酰基-3，5-二-O-苄基-4-C-(对甲苯磺酰基氧基甲基)-α，β-D- 呋喃核糖(78)。
于60℃将呋喃糖77(17.4g，31.4mmol)的80％乙酸(250cm3)溶液搅 拌20小时。真空除去溶剂，残留物与甲苯(3×20cm3)共蒸发。使残留 物再溶于无水吡啶(100cm3)中。加入乙酸酐(14.2cm3)，于室温下搅拌 该溶液15小时。通过加入冰冷却的水(200cm3)猝灭该反应，用二氯甲 烷(4×150cm3)提取该混合物。用饱和碳酸氢钠水溶液(2×125cm3)和盐 水(3×150cm3)洗涤合并的有机相，干燥(硫酸钠)，过滤并减压蒸发。 残留物经硅胶层析纯化，用二氯甲烷∶甲醇(98.5∶1.5，v/v)作为洗脱剂， 得到为澄清油状的78(α∶β约1∶1)(13.5g，72％)。δC(CDCl3)169.8，169.6， 69.4，168.8(C＝O)，144.7，137.7，137.5，132.8，129.7，129.6，128.5，128.4， 128.3，128.2，128.0，127.8，127.7，127.6(Bn)，97.4，94.2(C-1)，86.4，84.2 (C-4)，78.9，77.5，74.5，74.1，73.7，73.5，71.8，70.6，70.5，69.6，69.5(Bn， C-2，C-3，C-1′)，21.6，21.0，20.8，20.6；20.4(COCH3，C(CH3)2)。FAB-MS m/z 599[M+H]+。
制备化合物78的替代方法
3-O-苄基-1，2：5，6-二-O-异亚丙基-α-D-呋喃葡萄糖(30B)
于0℃将氢化钠分次少量加入1，2：5，6-二-O-异亚丙基-α-D-异呋喃 糖(allofuranose)(30A)(得自Pfanstiehl Laboratories Inc.)(40g)的二甲基 甲酰胺中。搅拌该反应混合物1小时，用1小时的时间滴加苄基溴。 于室温下搅拌该反应混合物16小时。加入甲醇以猝灭该反应，减压除 去二甲基甲酰胺。用乙酸乙酯提取该糖浆并用盐水洗涤。蒸发乙酸乙 酯层得到一半固体(93％)。经TLC匀化。
3-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-α-D-呋喃葡萄糖(30C)
用20小时的时间，在75％乙酸中获得30B(50g)的部分水解。浓 缩至少量体积并用乙酸乙酯提取得到30C，40g(90％)。经TLC匀化。 3-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-α-D-戊二醛呋喃核糖(ribo- pentodialdofuranose)(30D)
于0℃将30C(40g)的水/甲醇(1∶1)溶液缓慢搅拌加入高碘酸钠的 水溶液中。搅拌该反应物2小时，加入乙二醇并用乙酸乙酯提取该混 合物。蒸发干燥的提取物得到30D，32g(89％)。经TLC匀化。在该步 骤中，甲醇的加入对该反应的完成是重要的。
3-O-苄基-4-(羟甲基)-1，2-O-异亚丙基-α-D-赤-呋喃戊糖(30E)
于0℃将37％甲醛水溶液和1N氢氧化钠加入30D(32g)的水和四 氢呋喃(1∶1)的搅拌水溶液中，继续该反应16小时，用乙酸乙酯提取， 用盐水洗涤。蒸发有机层得到一浆状物，其经从乙醚/石油醚中结晶为 白色固体(23g)，滤液为油状物，经固化为一低熔点固体(10g)，30E总 收率，92％。[23g(白色固体经TLC为99％纯度)，10g低熔点固体(经 TLC具有快速移动的不纯物，约75％纯度)]。在该步骤中，四氢呋喃 的加入对时间和该反应的完成是非常重要的。
3，5-二-O-苄基-4-C-羟甲基-1，2-O-异亚丙基-α-D-呋喃核糖(31)
于-10℃，用60％氢化钠和BnBr使30E(20g)苄基化得到两种异构 体的混合物。快速柱层析提供为主要异构体的31，14g(54％)。经TLC 匀化。
3，5-二-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-4-C-甲苯磺酰基-α-D-呋喃核糖(77)
于0℃，用对甲苯磺酰氯处理31(12.5g)的吡啶溶液，于室温下继 续该反应14-16小时。除去吡啶，用二氯甲烷和饱和碳酸氢盐溶液提 取提供77，14g(80％)。经TLC匀化。
1，2-二-O-乙酰基-3，5-二-O-苄基-4-C-甲苯磺酰基-α-D-呋喃核糖(78)
于50℃在75％乙酸中使77(14g)水解18小时。减压除去溶剂， 用乙醇(3×100)、甲苯(3×50)和无水吡啶(2×50)处理残留物。(从石油 醚中结晶出为精细白色固体的化合物78。)使残留物溶于无水吡啶 中，于室温下用乙酸酐处理8小时。用乙酸乙酯和饱和碳酸氢盐提取， 接着用盐水洗涤得到为α和β异头物的混合物78，12g(83％)。与78的 真实样品(TLC、HPLC、NMR)直接比较证实其同一性和纯度。
实施例105
1-(2-O-乙酰基-3，5-二-O-苄基-4-C-(对甲苯磺酰基氧基甲基)-β-D-呋喃 核糖基)-胸腺嘧啶(79)。
将N，O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(31.68ml，128.23mmol)加入异头 混合物78(12.8g，21.4mmol)和胸腺嘧啶(5.38g，42.7mmol)的无水乙腈 (182cm3)的搅拌溶液中。于室温下搅拌该反应混合物1小时，于60℃ 继续搅拌1.5小时。冷却至0℃后，滴加三甲基硅烷基三氟甲磺酸酯 (6.57ml，30.33mmol)，于60℃搅拌该混合物10小时。用冰冷的饱和碳 酸氢钠水溶液(90ml)中和该反应混合物。过滤该反应混合物，减压浓 缩滤液至一半体积。用二氯甲烷(4×200cm3)提取。用饱和碳酸氢钠水 溶液(3×150cm3)和盐水(3×150ml)洗涤合并的有机相，干燥(硫酸钠) 并减压蒸发滤液。残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷/甲醇(99∶1， 98∶2v/v)作为洗脱剂得到为白色固体物质的核苷79(13.1g，92％)。δH (CDCl3)9.04(s，1H，NH)，7.73-7.19(15H，m，6-H，芳族的)，5.94(1H，d， J5.5，1′-H)，5.37(1H，d，J5.6，2′-H)，4.57-4.40(5H，m，3′-H，5′-Ha，5′-Hb， Bn)，4.14(2H，s，Bn)，3.75(1H，d，J10.2，1″-Ha)，3.57(1H，d，J10.2，1″- Hb)，2.41(3H，s，CH3C6H5)，2.02(3H，s，COCH3)，1.54(3H，s，CH3)。δC (CDCl3)169.8(C＝O)，163.5(C-4)，150.2(C-2)，145.0，136.8，135.6，132.1， 129.7，128.5，128.0，127.9，127.8，127.5(芳族的)，113.5(C-5)，86.8，85.3， 77.6，74.6，74.3，73.6，70.8，68.8(Bn，C-1′，C-3′，C-2′，C-4′)，21.3(CH3)， 20.5(COCH3)，11.8(CH3)。FAB-MS m/z 665[M+H]+(实测值：C，61.2；H， 5.3；N，4.1；S，4.7，C34H36O10N2S的计算值：C，61.4；H，5.4；N，4.2；S， 4.8)。
实施例106
1-(3，5-二-O-苄基-4-C-(对甲苯磺酰基氧基甲基)-β-D-呋喃核糖基)胸腺 嘧啶(80)。
将核苷79(13.1g，19.7mmol)溶于氨的甲醇溶液(200cm3，通过用 等体积甲醇稀释饱和的甲醇氨制备)中，于室温下搅拌4小时。随后蒸 发该反应混合物，使残留物溶于二氯甲烷(400cm3)中。用盐水(3× 150cm3)洗涤有机相，干燥(硫酸钠)，过滤并减压蒸发。残留物经硅胶 层析纯化，用二氯甲烷∶甲醇(99.5∶0.5，v/v)作为洗脱剂，得到为白色固 体物质的核苷80(10.7g，87％)。δH(CDCl3)9.66(s，1H，NH)，7.71-7.21 (15H，m，6-H，芳族的)，5.72(1H，d，J5.1，1′-H)，4.75，4.55(2H，各个d，J 11.5，Bn)，4.51(2H，s，Bn)，4.37(1H，t，J5.4，2*-H)，4.30-4.12(3H，m，3′- H，Bn)，3.76(1H，d，J10.2，1″-Ha)，3.59(1H，d，J10.2，1″-Hb)，2.39(3H，s， CH3C6H5)，1.48(3H，s，CH3)。δC(CDCl3)163.8(C-4)，150.9(C-2)，145.0， 137.0，136.9，135.9，132.3，129.8，128.7，128.6，128.2，128.1，128.0，127.6 (芳族的)，111.0(C-5)，89.6，85.3，78.4，74.5，73.8，71.1，69.7，(Bn，C-1′， C-3′，C-2′，C-4′，C-1″)，21.6(CH3)，12.0(CH3)。FAB-MS m/z 623[M+H]+ (实测值：C，61.5；H，5.2；N，4.4；S，5.2，C32H34O9N2S的计算值：C，61.7； H，5.4；N，4.5；S，5.1)。
实施例107
(1S，3R，4R，7S)-7-苄氧基-1-苯甲酰基氧基甲基-3-(胸腺嘧啶-1-基)-2，5- 二氧杂二环[2.2.1]庚烷(36)
于0℃，将氢化钠在矿物油(0.9g，22.2mmol)中的60％悬浮液分次少 量加入核苷80(10.65g，17.1mmol)的无水DMF(150cm3)的搅拌溶液 中。于0℃搅拌该混合物15小时，其后加入另外的60％氢化钠(0.205g， 5.12mmol)，于0℃搅拌该反应混合物22小时。加入甲醇(20cm3)，随 后减压浓缩该反应混合物至一半体积。加入冰冷却的水(300cm3)，用 二氯甲烷(5×150cm3)提取。用饱和碳酸氢钠水溶液(3×40cm3)和盐水 (3×40cm3)洗涤合并的有机相，干燥(硫酸钠)，过滤并减压蒸发。残留 物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷∶甲醇(99.5∶0.5，v/v)作为洗脱剂得到 为白色固体物质的核苷36(7.1g，92％)。光谱数据与早先报道的化合物 36的数据一致(实测值：C，66.2；H，5.8；N，6.1；C25H26N2O6的计算值C， 66.6；H，5.8；N，6.2)。
实施例108
3，5-二-O-苄基-1，2-O-异亚丙基-4-C-甲磺酰基氧基甲基-α-D-呋喃核糖 (200)
于0℃，将甲磺酰氯(0.61ml，16.0mmol)滴加到呋喃糖31(2.16g， 5.39mmol)的无水吡啶(3ml)的搅拌溶液中。于室温下搅拌该反应混合 物20分钟，用冰冷却的水(300ml)猝灭，用二氯甲烷(2×300ml)提取。 用饱和碳酸氢钠水溶液(300ml)洗涤合并的提取物，然后干燥(硫酸 钠)。通过减压蒸馏除去溶剂，残留物经硅胶层析纯化，用二氯甲烷作 为洗脱剂，得到为澄清油状的产物200(2.55g，99％)；1H NMR(CDCl3)： δ7.37-7.24(10H，m，Bn)，5.78(1H，d，J3.8Hz，H-1)，4.85(1H，d，J 11.7Hz，Bn)，4.73(1H，d，J11.9Hz，Bn)，4.64(1H，dd，J4.0，5.3Hz，H- 2)，4.54(1H，d，J11.9Hz，H-5′)，4.52(1H，d，J11.9Hz，Bn)，4.46(1H，d， J11.9Hz，H-5′)，4.41(1H，d，J11.8Hz，Bn)，3.60(1H，d，J10.4Hz，H- 5)，3.50(1H，d，J10.5Hz，H-5)，3.06(3H，s，SO2CH3)，1.68(3H，s，CH3)， 1.34(3H，s，CH3)；13C NMR(CDCl3)：δ137.79，137.31，128.54，128.48， 128.16，128.01，127.87，127.79(Bn)，113.66(C(CH3)2)，104.46(C-1)， 84.88(C-4)，78.48，78.41(C-2，C-3)，73.65，72.63，70.78，70.16(Bn，C-5， C-5′)，37.84(SO2CH3)，26.20(CH3)，25.69(CH3)；MS FAB：501(M+Na， 100％)。实测值：C，60.37；H，6.29；S，6.53；C24H30O8S的计算值：C，60.24； H，6.32；S，6.70％。
实施例109
甲基3，5-二-O-苄基-4-C-甲磺酰基氧基甲基-α-D-呋喃核糖苷(201)
于室温下，将呋喃糖200(1.133g，2.37mmol)的甲醇化的盐酸(20％ w/w，31.7ml)和水(4.4ml)的溶液搅拌2小时。用碳酸氢钠中和后，用二 氯甲烷(2×150ml)提取该溶液。用水(150ml)洗涤合并的提取物，然后 干燥(硫酸镁)。通过减压蒸馏除去溶剂，残留物经硅胶层析纯化，用 二氯甲烷∶甲醇(99∶1)作为洗脱剂，得到为澄清油状的产物201(β∶α约2∶1) (1.018g，95％)；1H NMR(CDCl3)：δ7.39-7.22(m，Bn)，4.86(br s，Bn)， 4.69-3.99(m，Bn，H-5′，H-1，H-2，H-3)，3.68(d，J8.9Hz，H-5β)，3.51(d，J 9.8Hz，H-5α)，3.46(s，OCH3α)，3.34(d，J9.1Hz，H-5β)，3.32(d，J9.7 Hz，H-5α)，3.28(s，OCH3β)，2.97(3H，s，SO2CH3β)，2.93(3H，s， SO2CH3α)；13C NMR(CDCl3)：δ137.74，136.98，128.70，128.64，128.58， 128.56，128.37，128.21，128.15，128.09，127.98，127.86，127.83(Bn)， 107.54(C-1β)，103.39(C-1α)，84.65，83.18，81.90，78，87(C-4，C-3)， 75.04，74.07，73.73，73.70，73.38，72.56，72.11，70.85，70.55，70.20(C-2， Bn，C-5，C-5′)，55.90(OCH3α)，54.96(OCH3β)，37.18(SO2CH3β)，37.07 (SO2CH3α)；MS FAB：475(M+Na，25％)。C24H30O8S的实测值：C，58.40； H，6.33；计算值：C，58.39；H，6.24％。
实施例110
(3R)-和(3S)-(1S，4R，7S)-7-苄氧基-1-苄氧基甲基-3-甲氧基-2，5-二氧杂 二环[2.2.1]庚烷(202和203)
于0℃搅拌201(3.32g，7.34mmol)的无水DMF(25ml)的溶液，加 入氢化钠的60％油悬浮液(700mg，16.9mmol)。于室温下搅拌该混合物 90分钟，用水(300ml)猝灭并用乙醚(2×300ml)提取。用水(200ml)洗涤 合并的提取物并干燥(硫酸镁)。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析 纯化，用二氯甲烷作为洗脱剂得到为澄清油状的两种产物202和203 (分别为1.571g，60％和0.777g，30％)。(1S，3R，4R，7S)-7-苄氧基-1-苄氧基 甲基-3-甲氧基-2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷(202)1H NMR(CDCl3)：δ 7.36-7.26(10H，m，Bn)，4.81(1H，s，H-1)，4.65(1H，d，J11.9Hz，Bn)， 4.61(2H，s，Bn)，4.56(1H，d，J11.9Hz，Bn)，4.11(1H，s，H-2)，4.09(1 H，s，H-3)，4.01(1H，d，J7.5Hz，H-5′)，3.80-3.77(3H，m，H-5′，H-5)， 3.39(3H，s，OCH3)；13C NMR(CDCl3)：δ138.05，137.36，128.47，128.44， 127.88，127.73，127.63(Bn)，104.97(C-1)，85.13(C-4)，79.16(C-3)，77.18 (C-2)，73.64(Bn)，72.26，72.10(Bn，C-5′)，66.50(C-5)，55.34(OCH3)；MS FAB：379(M+Na，28％)。实测值：C，70.55；H，6.97；C21H24O5的计算值： C，70.77；H，6.79％。(1S，3R，4R，7S)-7-苄氧基-1-苄氧基甲基-3-甲氧基- 2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷(203)1H NMR(CDCl3)：δ7.36-7.26(10H，m， Bn)，5.00(1H，s，H-1)，4.67-4.54(4H，m，Bn)，4.18(1H，s，H-2)，3.99(1 H，s，H-3)，3.99-3.90(2H，m，H-5′)，3.75-3.68(2H，m，H-5)，3.49(3H，s， OCH3)；13C NMR(CDCl3)：δ137.83，137.53，128.51，128.48，127.96， 127.82，127.71，127.62(Bn)，104.05(C-1)，88.44(C-4)，79.54(C-3)，77.16 (C-2)，73.68(Bn)，72.61(C-5′)，72.24(Bn)，65.73(C-5)，56.20(OCH3)； MS FAB：379(M+Na，100％)
实施例111
(1R，2S，3S)-2-苄氧基-3-苄氧基甲基-1-(甲氧基(胸腺嘧啶-1-基)甲基)-3- 三甲基硅烷基氧基四氢呋喃(204)
将BSA(N，O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺，0.90ml，3.6mmol)加入202 (216mg，0.606mmol)和胸腺嘧啶(153mg，1.22mmol)的无水乙腈(9.3ml) 的溶液中并在回流下搅拌15分钟。将该溶液冷却至0℃，滴加三甲基 硅烷基三氟甲磺酸酯(0.153ml，0.777mmol)。于室温下搅拌18小时和于 60℃搅拌24小时后，用饱和碳酸氢钠水溶液(20ml)猝灭该反应，用二 氯甲烷(2×50ml)提取。用饱和碳酸氢钠水溶液(50ml)洗涤合并的提取 物并干燥(硫酸镁)。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用二 氯甲烷∶甲醇(98∶2，v/v)作为洗脱剂得到为固体的产物204(约1.7∶1的非 对映体混合物)(196mg，67％).1H NMR(CDCl3)：δ7.36-7.14(m，Bn，H- 6)，5.77(1H，d，J7.9Hz，H-1′)，5.57(1H，d，J5.8Hz，H-1′)，4.68-4.43(m， Bn，H-2′)，4.12-3.68(m，H-5′，H-5′，H-3′)，3.32(s，OCH3)，3.24(s，OCH3)， 1.93(d，J0.9Hz，CH3)，1.86(d，J1.1Hz，CH3)，0.14(s，Si(CH3)3)，0.12(s， Si(CH3)3)；13C NMR(CDCl3)：δ163.68，163.55(C-4)，151.58，151.07(C- 2)，137.84，137.74，137.32(Bn)，135.93，135.10(C-6)，128.57，128.42， 128.41，128.10，127.95，127.85，127.77，127.74(Bn)，111.38，111.01(C-5)， 86.89，85.61，85.40，84.72，83.40，83.31，82.10(C-1′，C-2′，C-3′，C-4′)， 75.20，73.98，73.62，73.59，72.55，72.13，71.04，70.74(Bn，C-5′，C-5″)， 56.82，56.54(OCH3)，12.47，12.38(CH3)，1.72，1.69(Si(CH3)3)；MS FAB： 555(M+H，65％)，577(M+Na，70％)。实测值：C，62.76；H，6.88；N，4.94； C29H38N2O7Si的计算值：C，62.79；H，6.90；N，5.05％。
实施例112
(1R，2S，3S)-2-苄氧基-3-苄氧基甲基-1-(甲氧基(6-N-苯甲酰基腺嘌呤-9- 基)-甲基)-3-三甲基硅烷基氧基四氢呋喃(205)
将BSA(0.67ml，2.7mmol)加入202(240mg，0.673mmol)和6-N-苯 甲酰基腺嘌呤(301mg，1.26mmol)的无水乙腈(8.2ml)的溶液中并于室温 下搅拌1小时。将该溶液冷却至0℃，滴加三甲基硅烷基三氟甲磺酸 酯(0.25ml，1.33mmol)。于65℃搅拌18小时后，用饱和碳酸氢钠水溶 液(20ml)猝灭该反应，用二氯甲烷(2×50ml)提取。干燥(硫酸镁)合并 的提取物。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷∶甲 醇(98∶2)作为洗脱剂得到为固体的产物205(约1.8∶1的非对映体混合物) (185mg，41％).1H NMR(CDCl3)：δ8.78(s，H-8)，8.21(s，H-2)，8.17(s， H-2)，8.03-8.00(m，Bz)，7.61-7.49(m，Bz)，7.36-7.23(m，Bn)，7.07-7.04 (m，Bz)，5.85(1H，d，J7.9Hz，H-1′)，5.76(1H，d，J6.0Hz，H-1′)，4.74- 4.40(m，Bn，H-2′)，4.22-3.62(m，H-5′，H-5′，H-3′)，3.33(s，OCH3)，3.24(s， OCH3)，0.15(s，Si(CH3)3)，0.14(s，Si(CH3)3)；13C NMR(CDCl3)：δ164.68 (HNC＝O)，153.17，152.99(C-6)，149.47(C-2)，141.82，141.66(C-8)， 137.74，137.71，137.65(Bn)，133.87，132.87，132.78(Bz)，128.97，128.93， 128.45，128.42，128.38，128.14，127.97，127.88，127.82，127.78(Bn，Bz)， 123.66，122.85(C-5)，86.41，86.23，85.70，85.24，84.78，83.73，83.58， 82.79(C-1′，C-2′，C-3′，C-4′)，75.32，74.55，73.61，72.18，71.98，70.85， 70.59(Bn，C-5′，C-5”)，57.23，57.04(OCH3)，1.78(Si(CH3)3)；MS FAB： 668(M+H，50％)，690(M+Na，100％)。实测值：C，64.07；H，6.01；N，9.94； C29H38N2O7Si，0.5H2O的计算值：C，63.88；H，6.25；N，10.34％。
实施例113
(1R，2R，3R)-2-苄氧基-3-苄氧基甲基-3-羟基四氢糠醛(206)
于90℃搅拌202/203(252mg，0.707mmol)在80％乙酸(3.8ml)中的 溶液2小时，其后通过减压蒸馏除去溶剂。残留物与甲苯(3×10ml)共 蒸发得到为油状物的产物206(242mg，100％).1H NMR(CDCl3)：δ9.66 (1H，d，J0.8Hz，H-1)，7.36-7.25(10H，m，Bn)，4.68(1H，d，J11.9Hz， Bn)，4.60-4.39(5H，m，Bn，H-2，H-3)，3.98-3.92(2H，m，H-5)，3.85(1H， d，J9.3Hz，H-5′)，3.52(1H，d，J9.2Hz，H-5′)；13C NMR(CDCl3)：δ 203.64(C-1)，137.39，137.19，128.61，128.54，128.29，128.12，127.87， 127.83(Bn)，87.17，87.05(C-4，C-2)，80.98(C-3)，75.00，73.70，71.86(Bn， C-5′)，67.84(C-5)；MS FAB：707(2×M+Na，100％)
实施例114
(1S，3S，4R，7S)-3-乙酰氧基-7-苄氧基-1-苄氧基甲基-2，5-二氧杂二环 [2.2.1]-庚烷(207)
将乙酸酐(0.18ml，1.91mmol)加入206(230mg，0.672mmol)的无水 吡啶(2.0ml)的搅拌溶液中。于室温下搅拌该反应混合物23小时，加入 水(0.13ml)，通过减压蒸馏除去溶剂。残留物与甲苯(3×10ml)共蒸发 并经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷∶甲醇(99∶1)作为洗脱剂得到为澄清 油状的产物207(56.7mg，23％)；1H NMR(CDCl3)：δ7.38-7.26(10H，m， Bn)，6.00(1H，s，H-1)，4.68(1H，d，J12.0Hz，Bn)，4.62(1H，d，J12.2 Hz，Bn)，4.60(1H，d，J12.4Hz，Bn)，4.56(1H，d，J12.2Hz，Bn)，4.17(1 H，s，H-2)，4.14(1H，s，H-3)，4.01(1H，d，J7.7Hz，H-5′)，3.81-3.78(3H， m，H-5′，H-5)，20.06(3H，s，COCH3)；13C NMR(CDCl3)：δ169.18(C＝O)， 137.92，137.48，128.52，128.45，128.03，127.77，127.73，127.68(Bn)， 95.95(C-1)，86.49(C-4)，78.27，76.58(C-3，C-2)，73.65(Bn)，72.26， 71.96(Bn，C-5′)，65.49(C-5)，20.98(COCH3)；MS FAB：407(M+Na， 55％)。实测值：C，68.80；H，6.11；C22H24O6的计算值：C，68.74；H，6.29 ％。
实施例115
(1S，3S，4R，7S)-3-(6-N-苯甲酰基腺嘌呤-9-基)-7-苄氧基-1-苄氧基甲基- 2，5-二氧杂二环[2.2.1]庚烷(208)
将BSA(0.43ml，1.76mmol)加入呋喃糖207(167mg，0.434mmol) 和6-N-苯甲酰基腺嘌呤(194mg，0.813mmol)的无水乙腈(5.3ml)溶液 中，于室温下搅拌1小时。将该溶液冷却至0℃，滴加三甲基硅烷基 三氟甲磺酸酯(0.16ml，0.86mmol)。于65℃搅拌2小时后，用饱和碳酸 氢钠水溶液(40ml)猝灭该反应，用二氯甲烷(2×50ml)提取该混合物。 干燥(硫酸镁)合并的提取物。减压除去溶剂，残留物经硅胶柱层析纯 化，用二氯甲烷∶甲醇(98∶2)作为洗脱剂得到为固体的产物208(111mg， 45％)；1H NMR(CDCl3)：δ8.82(1H，s，H-8)，8.14(1H，s，H-2)，7.59-7.26 (15H，m，Bz，Bn)，6.74(1H，s，H-1′)，4.92(1H，s，H-2′)，4.74-4.39(4H， m，Bn)，4.42(1H，s，H-3′)，4.19-4.10(2H，m，H-5”)，3.92(1H，d，J11.8 Hz，H-5′)，3.88(1H，d，J11.5Hz，H-5′)；MS FAB：564(M+H，100％)。
实施例116
甲基2-O-乙酰基-3，5-二-O-苄基-4-C-甲磺酰基氧基甲基-D-呋喃核糖苷 (209)
将乙酸酐(0.43ml，4.56mmol)滴加入201(687mg，1.52mmol)的无 水吡啶(4ml)的搅拌溶液中。于室温下搅拌该反应混合物2天，用饱和 碳酸氢钠水溶液(75ml)猝灭该反应，用二氯甲烷(150+75ml)提取。干 燥(硫酸镁)合并的提取物，通过减压蒸馏除去溶剂，残留物经硅胶柱 层析纯化，用二氯甲烷作为洗脱剂得到为澄清油状的产物209(β∶α约 3∶1，750mg，100％)；MS FAB：463(M-OCH3，100％)，517(M+Na，28％)； 实测值：C，58.53；H，6.16；C24H30O9S的计算值：C，58.29；H，6.11％。 甲基2-O-乙酰基-3，5-二-O-苄基-4-C-甲磺酰基氧基甲基-β-D-呋喃核糖 苷(209β)。1H NMR(CDCl3)：δ7.36-7.18(10H，m，Bn)，5.27(1H，d，J4.9 Hz，H-2)，4.88(1H，s，H-1)，4.55-4.44(6H，m，H-5′，Bn)，4.35(1H，d，J 5.O Hz，H-3)，3.73(1H，d，J9.2Hz，H-5)，3.38(1H，d，J9.3Hz，H-5)， 3.30(3H，s，OCH3)，2.95(3H，s，SO2CH3)，2.11(3H，s，OCCH3)；13C NMR(CDCl3)：δ169.91(C＝O)，137.83，137.28，128.49，128.44，127.99， 127.87，127.77(Bn)，105.40(C-1)，82.65，81.05，74.55，73.62，73.56， 71.86，70.22(C-2，C-3，C-4，C-5，C-5′，Bn)，55.03(OCH3)，37.14 (SO2CH3)，20.73(OCCH3)。甲基2-O-乙酰基-3，5-二-O-苄基-4-C-甲磺酰 基氧基甲基-α-D-呋喃核糖苷(209α)。1H NMR(CDCl3)：δ7.36-7.18(10 H，m，Bn)，5.09(1H，d，J4.5Hz，H-1)，4.95(1H，dd，J4.5，6.8Hz，H-2)， 4.65-4.44(6H，m，H-5′，Bn)，4.27(1H，d，J6.6Hz，H-3)，3.49(1H，d，J 9.9Hz，H-5)，3.46(3H，s，OCH3)，3.36(1H，d，J9.9Hz，H-5)，2.92(3H， s，SO2CH3)，2.14(3H，s，OCCH3)；13C NMR(CDCl3)：δ170.41(C＝O)， 137.59，137.28，128.56，128.51，128.49，128.44，127.98，127.88(Bn)， 102.35(C-1)，84.25，77.53，74.66，73.67，72.12，70.39，70.28(C-2，C-3，C- 4，C-5，C-5′，Bn)，56.07(OCH3)，36.94(SO2CH3)，20.63(OCCH3)。
实施例117
苯基2-O-乙酰基-3，5-二-O-苄基-4-C-甲磺酰基氧基甲基-1-硫代-β-D-呋 喃核糖苷(210)
方法A
将209(738mg，1.49mmol)的无水二氯甲烷(6.4ml)的搅拌溶液加入 苯基硫代三甲基硅烷(2.42ml，12.8mmol)中并冷却至0℃。滴加三甲基 硅烷基三氟甲磺酸酯(0.67ml，3.67mmol)，于室温下搅拌该溶液4小 时。用饱和碳酸氢钠水溶液(100ml)猝灭该反应，用二氯甲烷(2×200ml) 提取。干燥(硫酸镁)合并的提取物，通过减压蒸馏除去溶剂。残留物 经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷作为洗脱剂得到为澄清油状的产物210 (564mg，66％)和未反应的原料(191mg，26％)；
方法B
将211(86mg，0.165mmol)的无水二氯甲烷(0.49ml)的搅拌溶液加 入苯基硫代三甲基硅烷(0.16ml，0.825mmol)中并冷却至0℃。加入三甲 基硅烷基三氟甲磺酸酯(0.037ml，0.206mmol)，于室温下搅拌该溶液2 小时。用饱和碳酸氢钠水溶液(15ml)猝灭该反应，用二氯甲烷(2×25ml) 提取生成的混合物。干燥(硫酸镁)合并的提取物，通过减压蒸馏除去 溶剂。残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷作为洗脱剂得到为澄清 油状的产物210(75mg，79％)；1H NMR(CDCl3)：δ7.47-7.19(15H，m， Bn，SPh)，5.48(1H，d，J3.6Hz，H-2)，5.34(1H，dd，J3.7，5.2Hz，H-1)， 4.54-4.36(7H，m，H-3，H-5′，Bn)，3.66(1H，d，J9.7Hz，H-5)，3.48(1H， d，J9.5Hz，H-5)，2.89(3H，s，SO2CH3)，2.09(3H，s，OCCH3)；13C NMR (CDCl3)：δ169.93(C＝O)，137.69，137.08，132.65，132.45，129.15，128.53， 128.52，128.18，128.14，128.08，127.91，127.85(Bn，SPh)，87.99，84.35， 80.34，75.33，74.20，73.67，70.83，69.34(C-1，C-2，C-3，C-4，C-5，C-5′， Bn)，37.27(SO2CH3)，20.68(OCCH3)；MS FAB：463(M-SPh，100％)，595 (M+Na，24％)；实测值：C，61.17；H，5.55；C29H32O8S2的计算值：C，60.82； H，5.63％。
实施例118
1，2-二-O-乙酰基-3，5-二-O-苄基-4-C-甲磺酰基氧基甲基-D-呋喃核糖 (211)
于90℃将201(150mg，0.313mmol)在80％乙酸水溶液(1.5ml)中的 溶液搅拌3小时。通过减压蒸馏除去溶剂，残留物在乙醇(3×5ml)、 甲苯(3×5ml)和吡啶(2×5ml)中共蒸发。使残留物再溶于无水吡啶 (0.62ml)并加入乙酸酐(0.47ml)中，于室温下搅拌该溶液16小时。用水 (50ml)猝灭该反应，用二氯甲烷(2×50ml)提取生成的混合物。用饱和 碳酸氢钠水溶液(50ml)洗涤合并的提取物并干燥(硫酸镁)。蒸发溶剂， 残留物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷作为洗脱剂得到为油状的产物 211(99mg，60％)；1H NMR(CDCl3)：δ7.39-7.21(m，Bn)，6.38(d，J4.6 Hz，H-1β)，6.15(s，H-1α)，5.35(d，J4.9Hz，H-2α)，5.17(dd，J6.3，4.9 Hz，H-2β)，4.69-4.23(m，H-3，Bn)，3.64(d，J9.7Hz，H-5α)，3.52(d，J 10.1Hz，H-2β)，3.45(d，J9.7Hz，H-5α)，3.39(d，J9.9Hz，H-2β)，2.99 (s，SO2CH3α)，2.96(s，SO2CH3β)，2.14，2.13，2.06，1.90(4xs，COCH3)； 13C NMR(CDCl3)：δ169.68，169.00(C＝O)，137.68，137.05，128.60， 128.55，128.50，128.21，128.12，128.04，127.94，127.82，127.79(Bn)， 99.35(C-1α)，94.24(C-1β)，86.36(C-4β)，84.28(C-4α)，79.15，77.47， 74.58，74.06，73.73，73.56，71.67，70.57，70.19，69.84(Bn，C-2，C-3，C-5， C-5′)，37.61(SO2CH3β)，37.48(SO2CH3α)，21.07，20.74，20.63，20.39 (COCH3)；MS FAB：545(M+Na，13％)。实测值：C，57.70；H，5.56；
C25H30O10S的计算值：C，57.46；H，5.79％。
实施例119
(3R)-和(3S)-(1S，4R，7S)-7-苄氧基-1-苄氧基甲基-3-苯硫基-2，5-二氧杂 二环[2.2.1]庚烷(212)
于室温下，将210(553mg，0.966mmol)在用氨饱和的甲醇(3.5ml) 中的溶液搅拌2小时，其后通过减压蒸馏除去溶剂。使残留物再溶于 无水DMF(3.5ml)并于0℃搅拌该溶液。加入60％氢化钠的悬浮液 (118mg，2.88mmol)，于室温下搅拌该混合物12小时。用饱和碳酸氢钠 水溶液(100ml)猝灭该反应，用二氯甲烷(2×100ml)提取生成的混合 物。干燥(硫酸镁)合并的提取物，通过减压蒸馏除去溶剂。残留物经 硅胶柱层析纯化，用二氯甲烷作为洗脱剂得到为澄清油状的产物212 (404mg，96％)。MS FAB：435(M+H，35％)，457(M+Na，16％)；实测值： C，71.76；H，6.18；C26H26O4S的计算值：C，71.86；H，6.03％。 (1S，3R，4R，7S)-7-苄氧基-1-苄氧基甲基-3-苯硫基-2，5-二氧杂二环[2.2.1] 庚烷(212β)1H NMR(CDCl3)：δ7.46-7.26(15H，m，Bn，SPh)，5.35(1H， s，H-1)，4.68-4.56(4H，m，Bn)，4.31(1H，s，H-2)，4.10(1H，s，H-3)，4.09 (1H，d，J7.3Hz，H-5′)，3.93(1H，d，J7.8Hz，H-5′)，3.79(2H，m，H-5)； 13C NMR(CDCl3)：δ138.03，137.45，133.42，132.36，129.19，128.55， 128.46，128.05，127.84，127.83，127.76(Bn，SPh)，89.96(C-1)，87.18(C- 4)，79.71(C-2)，79.40(C-3)，73.64(Bn)，73.23(C-5′)，72.30(Bn)，66.31 (C-5)。(1S，3R，4R，7S)-7-苄氧基-1-苄氧基甲基-3-苯硫基-2，5-二氧杂二环 [2.2.1]庚烷(212α)1H NMR(CDCl3)：δ7.52-7.19(15H，m，Bn，SPh)， 5.52(1H，s，H-1)，4.70-4.50(4H，m，Bn)，4.41(1H，s，H-2)，4.18(1H，d， J7.8Hz，H-5′)，4.08(1H，d，J8.4Hz，H-5′)，4.07(1H，s，H-3)，3.78(1H， d，J11.3Hz，H-5)，3.72(1H，d，J11.5Hz，H-5)；13C NMR(CDCl3)：δ 137.89，137.46，135.29，130.93，129.13，128.99，128.57，128.48，127.81， 127.76，127.58，126.95(Bn，SPh)，91.87(C-1)，88.59(C-4)，80.07，79.14 (C-2，C-3)，73.65，73.40，72.04(Bn，C-5′)，65.62(C-5)。
实施例120
(3R)-和(3S)-(1S，4R，7S)-7-苄氧基-1-苄氧基甲基-3-(胸腺嘧啶-1-基)-2，5- 二氧杂二环[2.2.1]庚烷(36+213)
于回流下搅拌在六甲基二硅氮烷(6.8ml)中的胸腺嘧啶(175mg， 1.38mmol)，加入硫酸铵(5mg)。搅拌16小时后，将澄清的溶液冷却至 40℃，通过减压蒸馏除去溶剂。向残留物中加入212(201mg，0.463 mmol)的无水二氯甲烷(4.6ml)溶液和4分子筛(180mg)。于室温下搅 拌10分钟后，加入NBS(107mg，0.602mmol)并再搅拌该混合物30分 钟。用饱和硫代硫酸钠水溶液(25ml)猝灭该反应，用二氯甲烷(2×50ml) 提取生成的混合物。干燥(硫酸镁)合并的提取物并蒸发，残留物经硅 胶柱层析纯化，用二氯甲烷∶甲醇(97∶3)作为洗脱剂得到产物36+213， 为异头物的混合物(β∶α约1∶2)(127mg，61％)；1H NMR(CDCl3)：δ7.49 (d，J0.9Hz，H-6β)，7.46(d，J1.0Hz，H-6α)，7.39-7.25(m，Bn)，5.94(s， H-1′α)，5.64(s，H-1′β)，4.71-4.50(m，Bn，H-2′)，4.23(s，H-3′α)，4.16(d， J8.6Hz，H-5”α)，4.09-3.78(m，H-5′，H-5”，H-3′β)，1.94(d，J0.9Hz， CH3α)，1.62(d，J1.2Hz，CH3β)；MS FAB：551(M+H，96％)。
实施例121
(3R)-和(3S)-(1S，4R，7S)-7-羟基-1-羟基甲基-3-(胸腺嘧啶-1-基)-2，5-二氧 杂二环[2.2.1]庚烷(37+214)
于室温下搅拌在乙醇(2.7ml)中36+213(175mg，0.39mmol)溶液， 加入载于碳上的20％氢氧化钯(50mg)。用氩气使该混合物脱气数次并 置于氢气中。搅拌18小时后，该混合物经硅胶柱层析纯化，用二氯甲 烷∶甲醇(95∶5)作为洗脱剂得到产物37和214(1∶1.2)的混合物(26mg， 25％)；1H NMR(CD3OD)：δ7.78(d，J 1.3Hz，H-6α)，7.73(d，J1.2Hz， H-6β)，5.88(s，H-1′α)，5.53(s，H-1′β)，4.38(s，H-2′α)，4.34(s，H-3′α)， 4.26(s，H-2′β)，4.08-3.69(m，H-5′，H-5”，H-3′β)，1.92(d，J1.2Hz，CH3α)，1.88(d，J1.1Hz，CH3β)；13C NMR(CD3OD)：δ138.00(C-6α)， 136.96(C-6β)，110.80(C-5β)，110.08(C-5α)，92.49，89.01(C-4′，C-1′ α)，90.46，88.37(C-4′，C-1′β)，80.89，74.27，73.34(C-2′，C-3′，C-5′α)， 80.59，72.47，70.39(C-2′，C-3′，C-5′β)，59.29(C-5”α)，57.61(C-5”β)， 12.52(CH3α)，12.39(CH3β)；MS EI：270(M+，100％)
LNA亚磷酰胺的制备
实施例122
4-N-苯甲酰基-LNA-C[(1R，3R，4R，7S)-3-(4-N-苯甲酰基胞嘧啶-1-基)-1- (羟甲基)-7-羟基-2，5-二氧杂二环{2.2.1}庚烷]
将LNA-C(式Z)溶于无水乙醇中并加热至回流。向该回流溶液加 入苯甲酸酐(2当量)，接着通过HPLC(洗脱液：20％乙腈的0.1M TEAA， pH 7.0，流速：1ml/min.，Novapak C-18分析柱)进行反应。以0.5-2小时 的间隔加入另外的酸酐，直至经HPLC未观察到产物增加。经旋转蒸 发浓缩反应混合物。残留物用乙醚重复洗涤，过滤并干燥得到灰白色 固体。产率：45％。
碱保护的LNA核苷(LNA-CBz，LNA-T，LNA-GiBu，LNA-ABz)的二甲氧基 三苯甲基化的通用方法
将碱保护的LNA核苷与吡啶(2x)共蒸发并与二甲氧基三苯甲基氯 (1.5当量)在吡啶(约10ml/g核苷)中一起搅拌。通过HPLC(50％乙腈的 0.1M TEAA，pH 7.0，5分钟，50-100％乙腈，10分钟和100％乙腈，5分钟 流速：1ml/min.，Novapak C-18柱)进行反应。当反应原料达到＞95％时， 在冰上冷却反应混合物。通过加入冷的饱和NaHCO3(约15ml×vol吡 啶)使反应猝灭。用二氯甲烷(3x碳酸氢钠的一半体积)提取该混合物。 合并有机提取物，经无水硫酸钠干燥，过滤并经旋转蒸发浓缩。真空 干燥残留物并经硅胶层析纯化，用在二氯甲烷中的0.5％吡啶和0-2％ 甲醇作为洗脱剂。合并含有纯产物的部分并经旋转蒸发浓缩。残留物 与无水乙腈(3x)共蒸发并真空干燥。
保护的LNA核苷亚磷酸化的通用方法
将碱保护的二甲氧基三苯甲基LNA核苷与无水二氯甲烷(2x)共蒸 发并溶解于无水二氯甲烷(10ml/g核苷用于A，G&T和约30ml/g用 于C)。向其中加入双(二异丙基氨基)(2-氰基乙基)亚磷酸酯(1.05-1.10 当量)，接着加入四唑(0.95当量)。于室温下搅拌该混合物，通过HPLC (70％乙腈在0.1M TEAA，pH 7.2，5分钟，70-100％乙腈，8分钟和100％ 乙腈，5分钟，流速：1ml/min.，Novapak C-18分析柱)进行反应。一旦反 应进行＞95％且在搅拌下未观察到酰胺化物的形成进一步增加，则在冰 上冷却该混合物。将其用二氯甲烷(约15-20倍的原体积)稀释，用冷的 饱和碳酸氢钠(2x)洗涤，接着用冷盐水(1x)洗涤。经无水硫酸钠干燥有 机层，过滤并经旋转蒸发浓缩。残留物与无水乙腈(3x)共蒸发并真空干 燥过夜。HPLC纯度范围为93-98％。
LNA5′-三磷酸核苷的制备
实施例123
LNA5′三磷酸核苷的合成(Tetrahedron Letters 1988，29 4525)
在13×100mm聚丙烯试管中，使核苷37，44，51，4-N-苯甲酰基化 的57A或61B(93.8μmol)悬浮于1ml吡啶(经CaH2干燥)。在高真空 下，在真空离心蒸发浓缩器中蒸发该溶液至干。使残留物两次悬浮于 乙腈(经CaH2干燥)并蒸发至干。使核苷悬浮于313μL磷酸三甲酯(经 4分子筛干燥)，向其中加入30.1mg Proton SpongeTM(1.5当量)。使该 混合物密封、涡流并冷却至0℃。在涡流下加入POCl3(9.8μL，1.1 当量)。于0℃进行该反应2.5小时。在此段时间内，将469μmol焦磷 酸钠(5当量)溶于5ml水中并通过5mL Dow 50 H+离子交换树脂。流 出物转为酸性时，将其收集于220μl三丁基胺中并蒸发成桨状物。将 TBA焦磷酸盐与无水乙腈共蒸发3次。最后，使干燥的焦磷酸盐溶于 1.3mL DMF(4筛)。反应2.5小时后，在剧烈涡流下将TBA焦磷酸 盐和130μl三丁基胺加入核苷溶液中。1分钟后，通过加入3ml 0.1M 三乙基乙酸铵(pH 7.5)猝灭该反应。经Mono Q色谱法分析显示有49％ 的5′-三磷酸核苷。用水将该反应混合物稀释至100ml并吸附于Q Sepharose离子交换柱中，用水洗涤，用0-700mM NaCl在5mM磷酸 钠(pH 7.5)中的线性梯度液洗脱。含有三磷酸盐的部分经。Mono Q离子 交换色谱分析。收集含有三磷酸盐的部分并浓缩至NaCl的饱和点。在 C18筒柱中使产物脱盐。经UV光谱对triphospate定量并调节至10mM 溶液。得率为17-44％。通过该方法制备的LNA核苷为U、T、A、G 和C。
LNA修饰的寡核苷酸的制备
实施例124
含有式V，X，Y和ZT，ZU，ZG，ZC，ZA，ZMeC的LNA的寡核苷酸的合成
使用二环核苷3′-O-亚磷酰胺类似物8，19，30，39，46，53，57D，61D 和66以及市售的3′-O-亚磷酰胺合成含有一个或多个V，X，Y和ZT， ZU，ZG，ZC，ZA，和ZMeC型LNA的本发明的示例性LNA寡核苷酸(0.2- 5μmol)。通过毛细管凝胶电泳和/或HPLC和/or MALDI-MS证实合成 的LNA寡核苷酸的纯度和组成。一般来说，对所有的单体均获得满意 的偶联效果。当合成全修饰LNA寡核苷酸或当LNA掺入其它未修饰 的DNA或RNA链或LNA掺入全-硫代磷酸寡核苷酸时，对LNA 39，46， 53，57D，61D和66(导向式Z的LNA单体)获得最好的偶联效率(约 95-100％)，给出了满意的结果。使LNA寡核苷酸溶于纯净水中并如 OD260测定其浓度。在所有情况下，溶解度都是良好的。对于普通的 DNA/RNA合成和部分修饰的LNA寡聚体，使用了标准CPG支持体 或聚苯乙烯支持体。对于合成全修饰的LNA寡聚体(如5′- d(GTGATATGC)-3′)，使用了一种BioGenex Universial CPG Support (BioGenex，U.S.A.)或使用LNA衍生的支持体。
实施例125
硫代磷酸LNA寡核苷酸的合成
采用类似于上述的条件(实施例124)，在自动DNA合成仪上合成 全-硫代磷酸LNA(表7)。使用Beaucages′试剂作为硫化剂。分步偶联 率为＞98％。合成完毕后，使用浓氨进行去保护和从固体支持体切割 分离出来(55℃，14h)。
实施例126
2′-硫代-LNA寡核苷酸的合成
采用标准条件(实施例124)在自动DNA合成仪上合成2′-硫代- LNA寡核苷酸(含有单体US(图2的式Z(硫代-变异体)，图37，表 8)。亚酰胺化物76F的分步偶联得率约为85％(偶联12min；期望亚酰 胺化物76F的改进的纯度引起偶联得率的增加)。合成完毕后，使用浓 氨进行去保护和从固体支持体切割分离出来(55℃，8h)。
实施例127
2′-氨基-LNA寡核苷酸的合成
通过与实施例126所述方法类似的方法，使用亚酰胺化物74A 和76F在自动DNA合成仪上有效获得2′-氨基-LNA寡核苷酸(含有单 体TNH和单体TNMe(图2的式Z(氨基变异体)，图35和36))(分步偶联 得率≥98％)。
实施例128
荧光素标记的LNA寡聚体
采用生产商(Promega)所述的FluoroAmp T4Kinase Green寡聚 物nucleotide Labeling System用荧光素成功地标记LNA寡聚体(图2 的式Z)AL16(5′-d(TGTGTGAAATTGTTAT)-3′；黑体为LNA核苷) 和AL17(5′-d(ATAAAGTGTAAAG)-3′；黑体为LNA核苷)。简言之， 16nmol的LNA-寡聚体AL16或AL17在含有T4激酶和γ-S-ATP的50 μl反应缓冲液中标记5′-硫代磷酸盐。该反应物于37℃孵育2小时。通 过加入5μl的寡核苷酸沉淀剂(Promega)和165μl冰冷却的(-20℃) 95％乙醇沉淀硫代磷酸化的LNA寡聚物。离心后用500μl冰冷却的(- 20℃)70％乙醇洗涤沉淀物一次并再溶于25μl PBSE缓冲液。将新鲜 制备的5-马来酰亚胺-荧光素溶液(50μg在5μl DMSO中)加入硫代磷 酸化的LNA寡聚物中并于68℃孵育该反应混合物30min。将另外的 5-马来酰亚胺-荧光素(50μg在5μl DMSO中)加入各LNA寡聚物中并将 该反应混合物再孵育60分钟。孵育后将10μl寡核苷酸沉淀剂加入每 份反应混合物中，接着加入180μl冰冷却的(-20℃)和100μl N，N-二 甲基甲酰胺。通过离心，接着吸出上清液来分离荧光素标记的LNA寡 聚物。荧光素标记的LNA-寡聚体如下通过反相HPLC纯化：Delta-Pack C-18柱，300A，0.4×30cm；洗脱剂为0-50％乙腈的0.04M三乙基铵缓 冲液(pH 7.0)；流速1.5ml/min。在12小时内收集含有LNA-寡聚物的 部分并减压蒸发(油泵和真空离心蒸发浓缩器(speed-vac system))。
杂交数据
实施例129
含有式V，X，Y和ZT，ZU，ZG，ZC，ZA，ZMeC单体的寡核苷酸的耐热性
使用配有热调节Peltier元件的分光光度计经分光光度法测定 LNA修饰的寡核苷酸的耐热性。制备含有3种不同的缓冲液(10mM Na2HPO4，pH 7.0，100mM NaCl，0.1mM EDTA；10mM Na2HPO4pH 7.0， 0.1mM EDTA；3M四甲基氯化铵(TMAC)，10mM Na2HPO4，pH 7.0， 0.1mM EDTA)和等摩尔量的(1μM或1.5μM)的不同LNA修饰的寡核 苷酸及其互补的或失配的DNA或RNA寡核苷酸的杂交混合物1ml。 使用未修饰的寡核苷酸的相同杂交混合物制备为对照物。Tm作为解链 曲线的一阶导数而获得。表1-4概括了结果(LNA用黑体标记)。图2说 明使用的单体LNA。V，X，Y和ZT，ZU，ZG，ZC，ZA，ZMeC的命名参照 图2的V，X，Y和Z的结构。在表中，指明了LNA单体的核苷酸碱 基。而且，对于最后两个表的LNA结构Z的硫代和氨基变异体来说， 使用的名称分别为例如ZTS和ZTNH。
对含有结构Z的LNA进行特别全面的检查(见表1)。当3种ZT残 基掺入混合序列的寡核苷酸中时，在NaCl缓冲液中获得的互补DNA (10)和RNA(16)寡核苷酸的Tm显著高于(RNA：约7℃，DNA：约5 ℃每次修饰)相应的具未修饰寡核苷酸(1和8)的双链体的Tm。用含 有两个ZT残基和一个ZG(21和24B)或ZU(25)、ZC(69)、ZMeC(65)、 及ZA(58)残基的LNA获得相似的结果。当失配被导入靶RNA或 DNA寡核苷酸时，LNA修饰的寡核苷酸的Tm在所有的情况下均明显 降低(11-15A和17；18-20和22-24A；26-31；57和59-60；63-64和66，和 67)，清楚地表明LNA修饰的寡核苷酸与其靶序列按照Watson-Crick 氢键规则杂交。在所有的情况下，导入失配的LNA修饰的寡核苷酸的 Tm的降低等于或大于相应的未修饰的寡核苷酸(2-7和9；33-38)的Tm， 表明LNA修饰的寡核苷酸在特异性方面至少与其天然的对应物相 同。杂交缓冲液中的离子强度的降低(从10mM Na2HPO4，pH 7.0， 100mM NaCl，0.1mM EDTA至10mM Na2HPO4 pH 7.0，0.1mM EDTA) 降低了LNA修饰的寡核苷酸对其互补DNA寡聚物(40，41)或RNA寡核 苷酸(40A，41A)的Tm。用未修饰的寡核苷酸和其互补DNA寡聚物(39) 或RNA寡聚物(39A)观察到类似结果。
3M四甲基氯化铵(TMAC)加入杂交缓冲液中明显增加LNA修饰 的寡核苷酸对其互补DNA寡聚物(10，21，25)的Tm。而且，TMAC使在 NaCl缓冲液中观察到的不同寡核苷酸Tm差消失(与在TMAC中的Tm 为56℃和57℃相反，在NaCl缓冲液中的最低Tm44℃和最高 Tm49℃)。失配的引入明显降低LNA修饰的寡核苷酸对其DNA靶 (11-13，18-20，和26-28)的Tm。未修饰的对照寡核苷酸(1-4和32-35) 出现类似的现象。
使用低盐缓冲液的数据表明，LNA修饰的寡核苷酸显示出与正 常寡核苷酸类似的对杂交缓冲液的离子强度的敏感性。由使用TMAC 缓冲液的Tm数据，可以推出TMAC显示出对LNA修饰的寡核苷酸的 Tm平衡作用类似于用正常DNA寡核苷酸所观察到的作用。LNA修饰 的寡核苷酸在两种杂交缓冲液中维持其灵敏的特异性。
与未修饰的对照寡核苷酸(39和39A；1和8)比较，含有全部4种 单体(71和75)的全修饰的LNA寡核苷酸，含有两种ZG和ZT(41和41A) 接近全修饰的LNA寡核苷酸(除了3′-末端DNA核苷)和含有ZT和ZG (40和40A)中心区的部分修饰的寡核苷酸也显示出显著增加的亲和 力。这表明式Z的LNA在全修饰的和部分修饰的寡聚体的制备中是非 常有用的。我们注意到接近全修饰的寡聚体(41和41A)显示出对两种 互补RNA(＞93℃)和DNA(83℃)的空前高的亲和力。使用仅含有ZT 的接近全修饰的LNA寡聚体(表1：52和53)和全修饰的LNA寡聚体 (71和75)可观察到类似的极强的亲和力(对于RNA和DNA两种)。部 分修饰的poly-T寡核苷酸的亲和力取决于掺入ZT单体(44-51)的位置和 数目。尽管用RNA靶(45，47，49和51)的Tm在所有情况下均高于相 应的未修饰寡核苷酸(43)，而用DNA靶(46)获得较低Tm。由于含有3 个ZT残基的混合序列的寡核苷酸与未修饰的对照寡核苷酸(1和8)比 较，显示出对其DNA(10)和RNA靶(16)的明显增加的亲和力，这提示 其它结合基元而非Watson-Crick(如Hoogsteen结合基元)对poly-T寡 核苷酸开放并且这些结合基元对修饰的寡核苷酸的精细结构有些敏 感。在所有的情况下，将单一的碱基失配引入全ZT修饰的poly-T寡核 苷酸和DNA靶(54-56)之间的复合体引起Tm的明显降低。
对含有结构V(表2)，X(表3)和Y(表4)的寡核苷酸进行全修饰的 和部分修饰的poly-T序列分析。与未修饰的寡核苷酸(表1，42和43) 比较，结构V和Y的全修饰的寡核苷酸显示出与RNA(表2，14和表4， 14)和DNA靶(表2，13和表4，13)的Tm的增加(尽管比ZT修饰的寡核 苷酸低得多)。含有结构V和Y的单体部分修饰的寡核苷酸与含有ZT 的部分修饰寡核苷酸的表现相似，这可能是由于如上所述序列的同聚 物性质的缘故。含有XT的寡核苷酸在所有的情况下与对照DNA寡核 苷酸比较，显示出明显降低的Tm。
实施例130
全修饰的LNA寡聚核苷酸与反向平行和平行互补(parallel orientation)DNA形成稳定杂合物
将全修饰的LNA寡核苷酸与其反向平行和平行互补DNA杂交。 杂交溶液(1ml)含有10mM Na2HPO4(pH 7)，100mM NaCl和0.1mM EDTA和各1μM的两种寡核苷酸。如表1所示，反向平行(71)和平行 结合方向(77)均产生稳定的双链体。反向平行明显是两种形式中最稳定 的一种。然而，甚至平行的双链体明显比未修饰的DNA寡核苷酸相应 的反向平行双链体更稳定(表1，1)。
实施例131
可以使用LNA单体增加RNA寡聚体对其互补核酸的亲和力
含有3种LNA-T单体(ZT)的9-mer RNA寡核苷酸和互补DNA或 RNA寡核苷酸间的复合物的耐热性经分光光度法测定。杂交溶液(1ml) 含有10mM Na2HPO4(pH 7.0)，100mM NaCl，0.1mM EDTA和各1μM 的两种寡核苷酸。对用未修饰的RNA寡核苷酸的相同杂交混合物进行 测定以作为对照。如表5所示，LNA修饰的RNA寡核苷酸与其互补 DNA(1)和RNA(3)寡核苷酸两者杂交。如前面对LNA修饰的DNA寡 核苷酸所观察到的，LNA修饰的RNA寡核苷酸对RNA互补体(3)的结 合亲和力是最强的。在两种情况下，LNA修饰的RNA寡核苷酸的亲 和力明显高于未修饰的对照物(2和4)。表5也显示LNA修饰的RNA 寡核苷酸保留对DNA和RNA靶的特异性。
实施例132
LNA-LNA碱基配对
将含有3种ZT LNA单体的RNA或DNA寡核苷酸或完全由LNA Z单体组成的寡核苷酸与互补的未修饰DNA寡核苷酸或含有3种ZA LNA单体的DNA寡核苷酸杂交，用分光光度法测定杂合物的Tm。杂 交溶液(1ml)含有10mM Na2HPO4(pH 7.0)，100mM NaCl和0.1mM EDTA和各1μM的两种寡核苷酸。如表6所示，所有的LNA修饰的 寡核苷酸与互补的未修饰DNA(2和3)以及互补的LNA修饰的寡核苷 酸(4，5和6)杂交。如前面所观察到的，LNA单体存在于杂合物(2和3) 的一个链中，与未修饰的对照杂合物(1)比较，明显升高TM。在杂合物 中存在LNA-LNA碱基甚至进一步升高(4和5)TM。而且，可以在全修 饰的LNA寡核苷酸和部分LNA-ZA修饰的DNA寡核苷酸(6)之间形成 高度稳定的杂合物。这构成杂合物中LNA-LNA碱基对的第一个例子。
实施例133
LNA全一硫代磷酸(all-phosphoromonothioate)寡核苷酸显示出比相应 的全硫代磷酸DNA寡核苷酸更低的对互补DNA和RNA的耐热性
在如实施例132中所述相同条件下，但没有EDTA(表7)，评价含 有3种ZT LNA单体(LNA寡核苷酸)的全一硫代磷酸DNA寡核苷酸和 相应的全一硫代磷酸对照DNA寡核苷酸对互补DNA和RNA的耐热 性。当与相应的对照DNA寡核苷酸(表1，10和16)比较时，可观察到 含有3种LNA ZT单体的LNA全一硫代磷酸寡核苷酸仅显示稍稍降低 耐热性(表7，3和4)。当与相应的对照DNA寡核苷酸(表1，1和8) 比较时，相应的全一硫代磷酸DNA寡核苷酸(表7，1和2)显示显著降 低的耐热性。这强烈地暗示全或部分的一硫代磷酸LNA寡核苷酸有可 能用于反义和其它治疗应用中。从而证实了LNA单体和未修饰的单体 在一硫代磷酸寡核苷酸中的相容性。预测此类构成物将显示出核糖核 酸酶H活性和核酸酶的抗性以及LNA增强的杂交特性。
实施例134
2′-硫代-LNA显示与LNA(单体Z)相似的核酸识别特性
杂交条件如实施例132中所述，但没有EDTA。2′-硫代-LNA的 结果(表8)清楚地表明对通过引入2′-硫代-LNA单体US(该单体对应于 图2式Z，其中亚甲基氧基桥由亚甲基硫代桥取代)DNA和RNA两者 的双链体的热稳定性的正影响。该影响(ΔTm约+5℃/对DNA的修饰； ΔTm约+8℃/对RNA的修饰)与亲代LNA中所观察的影响相近。该 图象通过同时引入两种修饰(2′-硫代官能度和尿嘧啶取代胸腺嘧啶)而 变得复杂。然而，如同我们在前面已观察到的，LNA胸腺嘧啶和尿嘧 啶单体的相同的解链温度和预期含有代替胸腺嘧啶的2′-脱氧尿苷(如 果有的话)的对照物将显示较低的Tm值，所述比较是相关的。
实施例135
2′-氨基-LNA(单体ZTNH)和2′-甲基氨基-LNA(单体ZTNMe)显示出与亲代 DNA(单体Z)相当的核酸识别特性
杂交条件如实施例132中所述，但没有EDTA。2′-氨基-LNA的 熔点结果(表9)清楚地指明对通过引入2′-氨基-LNA单体TNH或TNMe (该单体相应于图2式Z，其中亚甲基氧基桥分别由亚甲基氨基桥或亚 甲基-(N-甲基)氨基桥取代)DNA和RNA两者的双链体的热稳定性的正 影响。该影响(ΔTm约+3℃/对DNA的修饰；ΔTm约+6℃至8℃/对 RNA的修饰)与亲代LNA中所观察的影响具有可比性。引人注目的是 使用由2′-烷基氨基-LNA单体和非烷基化的2′-氨基-LNA单体的混合 物组成的寡聚物。也可观察到增加的热亲和力。
作为酶底物的LNA和LNA修饰的寡核苷酸
实施例136
寡聚体5′-VT13T和5′-ZT13T的3′-核酸外切稳定性
25℃用1.2U SVPDE(蛇毒磷酸二酯酶)消化寡核苷酸(0.2OD) 在2ml以下缓冲液(0.1M Tris-HCl，pH 8.6，0.1M NaCl，14mM MgCl2)中 的溶液。在消化中，在260nm处的吸光度出现增加。尽管未修饰的对 照T14经10分钟降解后被完全降解，但5-ZT13T和5′-VT13T保持完整 达60min。
实施例137
作为T4多核苷酸激酶底物的LNA修饰的寡聚物
将20pmoles的每种引物(FP2：5′-GGTGGTTTGTTTG-3′；DNA 探针)、(AL2：5′-GGTGGTTTGTTTG-3′，LNA核苷用黑体表示)和 (AL3：5′-GGTGGTTTGTTTG-3′，LNA核苷用黑体表示)与T4多核苷 酸激酶(5单位；New England Biolabs)和6μl γ-32PATP(3000Ci/mmol， Amersham)在含有70mM Tris-HCl(pH 7.6)，10mM MgCl2，5mM二硫 苏糖醇(dithiotretiol)的缓冲液(终体积20μl)中混合。于37℃将样品孵育 40分钟，然后加热至65℃5分钟。向每份反应物加入2μl tRNA(1μg/μl)， 29μl 3M乙酸铵和100μl乙醇。将该反应物于-20℃孵育30分钟，通 过以15000g离心30分钟沉淀标记的寡聚物。使沉淀物再悬浮于20μl H2O中。使样品(1μl)与加样缓冲液(甲酰胺(pH 8.0)，0.1％二甲苯苯 胺(cyanol)FF，0.1％溴酚蓝和10mM EDTA)混合并在TBE电泳缓冲液 (90mM Tris-HCl(pH 8.3)，90mM硼酸和2.5mM二钠EDTA-2H2O) 中，在变性聚丙烯酰胺凝胶(16％丙烯酰胺/双丙烯酰胺溶液，7M脲，1 X TBE和0.1mM EDTA)上电泳。将凝胶在凝胶干燥器(BioRad 583型) 上干燥并经放射自显影成X-光片(CL-XPosure片，Pierce 34075)20分 钟。结果示于图6(FP2：泳道1和2；AL2：泳道3和4；AL3：泳道5 和6)中。根据该试验可得出3个结论。第一个结论是，部分或全LNA 修饰的寡聚物在其作为核酸特异性酶像多核苷酸激酶的底物的能力方 面为天然核酸的优良的模拟物。第二个结论是，LNA修饰的寡聚物可 通过常规用于沉淀标准核酸的方法有效地沉淀。事实上，未修饰的(泳 道1，2)、部分修饰的(泳道3，4)和全修饰的寡聚物(泳道5，6)在放射自显 影图中的相对信号强度提示，一标准的DNA寡聚物含有的LNA核苷 越多，其通过盐/醇方法进行沉淀就越有效。第三个结论是，未修饰的、 部分修饰的和全修饰的寡聚物的放射自显影图信号的类似位置表明， 将LNA核苷掺入DNA寡聚物中并不能改变其在聚丙烯酰胺凝胶中的
电泳迁移率。
实施例138
用末端脱氧核苷酸转移酶的3′-端标记的含LNA的寡核苷酸
含有LNA单体的寡核苷酸是用末端脱氧核苷酸基转移酶的酶在3′ 端-标记的。LNA修饰的序列和程度(其中LNA单体用黑体表示)：
对照    5′GGT GGT TTG TTT G 3′
(1)     5′GGT GGT TTG TTT G 3′
(2)     5′GGT GGT TTG TTT G 3′
(3)     5′GGT GGT TTG TTT G 3′
将寡核苷酸(50pmol)与250μCi[α-32P]ddATP(3000Ci/mmol)和 100单位末端脱氧核苷酸转移酶在250μl 100mM二甲砷酸盐缓冲液 pH 7.2，2mM CoCl2和0.2mM 2-巯基乙醇于37℃孵育2小时。然后通 过加入甲酰胺加样缓冲液并加热至100℃5分钟，再置于冰上使该反应 停止。将样品(0.2pmol)在含有7M脲的19％丙烯酰胺凝胶电泳，通过 磷成像仪(phosphorimager)(Molecular Dynamics)对放射活性掺入寡核 苷酸带的百分率进行定量。结果显示，在所有情况下，包括具有高LNA 含量的寡核苷酸，均掺入了放射活性：对照94.9％，(1)39.7％，(2)83.7％， (3)31.7％。结论LNA修饰的寡聚物是TdT酶的底物。
实施例139
末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)对LNA修饰的寡核苷酸加尾的能力取决 于对寡聚体的设计
下面的15mer引物和8-32碱基寡核苷酸标记物的混合物用[γ33P] ATP和T4多核苷酸激酶在5′端进行标记(其中LNA单体用黑体表示)：
P1    5′-TGC ATG TGC TGG AGA-3′
P2    5′-GC ATG TGC TGG AGA T-3′
PZ1   5′-TGC ATG TGC TGG AGA-3′
PZ2    5′-GC ATG TGC TGG AGA T-3′
在标记后将该反应物煮沸5分钟以除去任何PNK活性。将4picomoles 的各标记的引物、25U末端脱氧核苷酸转移酶和16μM dATP在25μl 100mM二甲胂酸盐缓冲液pH 7.2，2mM CoCl2和0.2mM 2-巯基乙醇中 于37℃孵育90分钟。通过加入甲酰胺终止溶液使该反应停止并使该反 应产物在具有标记的标记物的19％聚丙烯酰胺7M脲凝胶中电泳。在干 燥凝胶中用Biomax胶片进行放射自显影成像。如图22所示，P1(泳道2)， P2(泳道4)和PZ1(泳道3)均基于8-32碱基标记(泳道1和6)给出一估计大 于70碱基长度的尾部。在这些反应条件下，引物PZ2(泳道5)未延长。 得出的结论是TdT酶将耐受寡核苷酸中的LNA单体，但在最末端的3′ 端除外。
实施例140
作为末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)底物的LNA-胸腺嘧啶-5′-三磷酸 (LNA-TTP)
为检测LNA-TTP三磷酸(实施例123)被末端脱氧核苷酸转移酶接 受为底物的能力，进行了寡核苷酸加尾反应。15mer引物(序列：5′-TGC ATG TGC TGG AGA-3′)和8-32碱基寡核苷酸标记物的混合物用[γ33P] ATP和T4多核苷酸激酶在5′端进行标记。标记后将该反应物煮沸5分钟 以除去任何PNK活性，。将4picomoles的各标记的引物、25U末端脱氧 核苷酸转移酶和32、64或128μM dTTP或LNA-TTP在25μl 100mM二甲 胂酸盐缓冲液pH 7.2，2mM CoCl2和0.2mM 2-巯基乙醇中于37℃孵育90 分钟。通过加入甲酰胺终止溶液使该反应停止并使该反应产物在具有 标记的标记物的19％聚丙烯酰胺7M脲凝胶中电泳。在干燥凝胶中用 Biomax胶片进行放射自显影成像。如图10所示，与32μM dTTP(泳道 B)，64μM dTTP(泳道C)或128μM dTTP(泳道D)的反应均产生加尾的 寡核苷酸，根据8-32碱基寡核苷酸标记物(最左边泳道和最右边泳道)， 估计该加尾寡核苷酸大于100个核苷。LNA-TTP反应物(32μM dTTP(泳 道E)、64μM dTTP(泳道F)或128μM dTTP(泳道G))均引起引物延长一 个碱基而且～50％的这种延长还延长一个碱基。该结果非常类似于使用 核糖核苷和TdT所得到的结果。结论是LNA衍生的三磷酸可被识别并 可通过TdT酶掺入DNA寡核苷酸。后一发现，即LNA-TTP可结合于聚 合酶，强调了将LNA-单体衍生物成功用作核苷药物的可能性。
实施例141
无Klenow片段DNA聚合酶I的外切核酸酶可将LNA腺苷、胞嘧啶、鸟 苷和尿苷-5′-三磷酸(LNA ATP、LNA CTP、LNA GTP、LNA UTP)掺 入DNA链中
使用引物延长测定法评价作为无Klenow片段DNA聚合酶I(EFK) 的外切核酸酶的底物LNA NTP(见实施例123)核糖核苷。该测定使用与 4种不同的24mer模板之一杂交的33P 5′端标记的15mer引物。引物和模 板序列为(LNA单体用黑体表示)：
引物     5′TGCATGTGCTGGAGA 3′
模板1    3′ACGTACACGACCTCTACCTTGCTA 5′
模板2    3′ACGTACACGACCTCTCTTGATCAG 5′
模板3    3′ACGTACACGACCTCTTGGCTAGTC 5′
模板4    3′ACGTACACGACCTCTGAACTAGTC 5′
将1picomole 33P标记的引物与2picomoles的模板在x2 Klenow缓冲液中 杂交。向该缓冲液中加入4μM dNTPαS或500μM LNA NTP或4μM dNTPαS和500μM LNA NTP的混合物。将2单位EFK DNA聚合酶加入 各反应物中。向各反应物加入2mU无机焦磷酸酶。也进行引物加模板 加酶对照的实验。所有的反应均在20μl的总体积中进行。将该反应物 于37℃孵育3min。然后通过加入10μl甲酰胺EDTA终止溶液使该反应 停止并使该反应产物在19％聚丙烯酰胺7M脲凝胶中分离，在暴露于 Kodak Biomax放射自显影胶片后，经与33P标记的8-32个碱基寡核苷酸 梯(ladder)比较确定产物片段大小。
图20显示与使用模板1的LNA-UTP的结果。泳道(1-12)相应于下列 反应：通过EFK掺入LNA UTP，泳道1-引物，模板和酶，泳道2-加 dTTPαS，泳道3-加LNA UTP，泳道4-加dTTPαS和dGTPαS，泳道5-加 LNA UTP和dGTPαS，泳道6-加dATPαS，dGTPαS和dTTPαS，泳道7- 加LNA UTP，dCTPαS，dGTPαS和dTTPαS，泳道8-加dGTPαS，泳道9- 加dCTPαS，dGTPαS和dTTPαS，泳道10-加LNA UTP，dATPαS， dCTPαS和dGTPαS，泳道11-加dATPαS，dCTPαS和dGTPαS，泳道12- 全部4种dNTPαS。两侧的泳道显示用于测定产物大小的8-32个碱基寡 核苷酸标记物。
从图20明显得知LNA UTP特别地以″T″掺入。用dNTPαS从LNA UTP终止的3′端的进一步延长是非常缓慢的。
图21显示用模板2-4以及LNA-ATP、LNA CTP和LNA GTP的结 果。泳道(1-21)相应于以下反应：泳道1、7、13和17-引物，模板和酶， 泳道2-加dGTPαS，泳道3-加dATPαS和dGTPαS，泳道4-加LNA GTP， 泳道5-加dGTPαS和LNA ATP，泳道6-加LNA ATP和LNA GTP，泳道 8-加dATPαS，泳道9-加dATPαS和dCTPαS，泳道10-加LNA ATP，泳 道11-加dCTPαS和LNA ATP，泳道12-加dATPαS和LNA CTP，泳道14- 加dTTPαS，泳道15-加dGTPαS和dTTPαS，泳道16-加dTTPαS和LNA GTP，泳道18-加dCTPαS，泳道19-加dCTPαS和dTTPαS，泳道20-加LNA CTP，泳道21-dTTPαS和LNA CTP，两侧的泳道显示用于测定产物大 小的8-32个碱基寡核苷酸标记物。
使用模板2(泳道1-6)的试验表明LNA GTP能够产生具有效延长 引物的+1产物(泳道4)。加入dGTPαS和LNA ATP主要产生+2产 物(泳道5)。这是来自dGTPαS的掺入以得到随后用LNA ATP延长的 +1产物。有少量源于LNA ATP的连续掺入的+3产物的证据。使用模 板3(泳道7-12)的试验表明LNA GTP能够有效掺入以得到+1产物(泳 道10)。使用dCTPαS延长该产物是缓慢的(泳道11)。加入dATPαS和 LNA CTP产生+2和+3产物(泳道12)。缺乏任何重要的+1产物表明第 一个LNA CTP的加入是有效的，而第二个LNA CTP的加入却是缓慢 的。得自对模板1(泳道13-16)和4(泳道17-21)的试验结果显示出对其 它模板的试验的类似趋向。有效地掺入LNA CTP产生对模板4(泳道 20)的+1产物。这种产物经dTTPαS的延长仍然是缓慢的(泳道21)。将 LNA GTP和dTTPαS加入模板1的反应物上产生+2产物(泳道16)。这 也表明加入单一的LNA三磷酸是相当有效的，但加入连续的LNA三 磷酸却是缓慢的。
实施例142
LNA单体可以用来增强寡核苷酸对外切核酸酶III的消化的耐受性
为检验含有LNA的寡核苷酸对外切核酸酶III降解的耐受性，进行 下面的反应。下面的15mer引物和8-32碱基寡核苷酸标记物用[γ33P] ATP和T4多核苷酸激酶在5′端进行标记(其中LNA单体用黑体表示)：
    P2         5′-GC ATG TGC TGG AGA T-3′
    PZ2        5′-GC ATG TGC TGG AGA T-3′
在标记后将该反应物煮沸5分钟以除去任何PNK活性，将8picomoles 的各引物杂交到在x2Klenow缓冲液中的25pmoles模板(序列：3′- ACG TAC ACG ACC TCT ACC TTG CTA-5′)中。将10单位外切核酸 酶III加入各反应物中。也设立对照物，其中加入1μl水以代替酶。于 37℃孵育该反应物5分钟。通过加入10μl甲酰胺/EDTA终止溶液使该 反应停止。于95℃加热该反应物3分钟，然后加样到19％聚丙烯酰胺 7M脲凝胶中。使凝胶在10％乙酸/10％甲醇中固定，然后转移至3MM 滤纸并干燥。使干燥的凝胶暴露于磷光体屏(phosphor screen)3小时。 在Molecular Dynamics Storm 860设备上用ImageQuant软件分析磷光 体屏。磷光体屏分析显示，在缺乏酶时，P2全长带为99％的信号，而 PZ2全长带为96％的信号。在存在酶时，经5分钟孵育后，只有20％的 P2全长产物留下。然而，经同样处理后，62％的全长PZ2产物保留。 这表明寡核苷酸3′端的单一LNA单体可增强对外切核酸酶III降解的 耐受性。
PCR的应用
实施例143
LNA单体可以用来明显增加生物素化的DNA寡聚物以MTP形式在 PCR扩增子的序列特异性捕获方面的性能。经如下PCR扩增产生来自 pUC19的两种DIG标记的扩增子：
对扩增子1的PCR反应混合物
1μl pUC19(1ng/μl)，
1μl反向引物(5′-AACAGCTATGACCATG-3′)(20μM)，
1μl正向引物(5′-GTAAAACGACGGCCAGT-3′)(20μM)，
10μl dUTP-混合物(2mM dATP、2mM dCTP、2mM dGTP和6mM dUTP)，
1.5μl DIG-11-dUTP(1mM)
10μl 10x Taq缓冲液(Boehringer Mannheim incl MgCl2)
1μl Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)5U/μl
H2O ad 100μl
对扩增子2的PCR反应混合物
1μl pUC19(1ng/μl)，
0.4μl引物3(5′-GATAGGTGCCTCACTGAT-3′)(50μM)，
0.4μl引物4(5′-GTCGTTCGCTCCAAGCTG-3′)(50μM)，
10μl dUTP-混合物(2mM dATP、2mM dCTP、2mM dGTP和6mM dUTP)，
1.5μl DIG-11-dUTP(1mM)
10μl 10x Taq缓冲液(Boehringer Mannheim incl MgCl2)
1μl Taq聚合酶(Boehringer Mannheim)5U/μl
H2O ad 100μl
PCR反应：(Cycler：Perkin Elmer 9600)94℃5min；加聚合酶；94℃1 min，45℃1min，70℃2min(29个循环)72℃10分钟
将得自各PCR反应物的10μl在标准琼脂糖凝胶上分析并观察到 约100bp和500bp的预期的片段。
将10μl DIG-标记的扩增子1或扩增子2与5pmol 5′生物素化捕获 探针在1×SSC(0.15M NaCl、15mM柠檬酸盐，pH 7.0)中以总体积450 μl混合。使用下列的捕获探针：B-DNA1(生物素- ATGCCTGCAGGTCGAC-3′；扩增子1特异性的DNA探针)，B-DNA2 (生物素-GGTGGTTTGTTTG-3′；扩增子2特异性的DNA探针)和B- LNA2(生物素-GGTGGTTTGTTTG-3′，LNA核苷用黑体表示；扩增 子2特异性的LNA探针)。将反应物加热至95℃5分钟以使扩增子变 性，冷却至25℃15分钟以有利于所述探针和靶扩增子链杂交。杂交 后，将190μl的各反应物转移至链霉抗生物素包被的微量滴定板(Pierce， cat.no.15124)并于37℃孵育1小时。用磷酸缓冲盐水(PBST，0.15M Na+，pH 7.2，0.05％Tween 20，3×300μl)洗涤该滴定板后，加入200μl 过氧化物酶标记的抗-DIG抗体(Boehringer Mannheim，在PBST中稀释 至1∶1000)。将滴定板于37℃孵育30分钟并洗涤(PBST，3×300μl)。通 过加入100μl底物溶液(0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液pH 5.0， 0.66mg/ml邻-亚苯基二胺二盐酸盐，0.012％H2O2)测定各孔的过氧化物 酶活性。通过加入100μl H2SO4(0.5M)终止该反应8分钟后，在微量滴 定板读出仪上读出492nm处的吸光度。如图3所示，未修饰的bio- DNAs捕获探针(B-DNA1和B-DNA2)两者均如所期望的那样，各自 仅捕获其靶PCR扩增子。与B-DNA1探针比较，B-DNA2探针在捕获 其同源扩增子方面是相当无效的。然而，通过用相应的LNA核苷代替 B-DNA2探针的13个DNA核苷中的12个，可以极大地改变其捕获 效率。如图3所示，用B-LNA2探针代替B-DNA2探针可使该测定的 灵敏度增加10倍以上。同时B-LNA2保留了未修饰的B-DNA2有效 区分相关的和不相关的扩增子的能力，突出了LNA-寡聚物的良好的特 异性。我们得出结论：1)共价连接于LNA修饰的寡聚物的生物素保留 其结合链霉抗生物素的能力，2)LNA修饰的寡聚物在基于MTP的扩增 子捕获测定中有效地起作用。3)LNA提供大大改善标准DNA寡聚物 在PCR扩增子的亲和性捕获中的功能。
实施例144
LNA取代的寡聚物能够通过链侵入捕获其同源PCR扩增子
将相同的两组10μl扩增子1或2的反应物(如实施例143所述制 备)与1、5或25pmol的B-LNA2捕获探针(生物素- GGTGGTTTGTTTG-3′，LNA核苷用黑体表示；扩增子2特异性的探 针)在1×SSC(0.15M NaCl，15mM柠檬酸盐，pH 7.0)中以总体积450μl 混合。将一组反应物加热至95℃5分钟以使扩增子变性，使冷却至 25℃以有利于所述探针和靶扩增子链杂交。另一组反应物维持不变 性。从每份反应物中取190μl转移至链霉抗生物素包被的微量滴定板 (Pierce，cat.no.15124)并于37℃孵育1小时。用磷酸缓冲盐水(PBST， 0.15M Na+，pH 7.2，0.05％Tween 20，3×300μl)洗涤该滴定板后，加入 200μl过氧化物酶标记的抗-DIG抗体(Boehringer Mannheim，在PBST 中稀释至1∶1000)。将滴定板于37℃孵育30分钟并洗涤(PBST，3× 300μl)。通过加入100μl底物溶液(0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液pH 5.0，0.66mg/ml邻-亚苯基二胺二盐酸盐，0.012％H2O2)测定各孔的过氧 化物酶活性。通过加入100μl H2SO4(0.5M)终止该反应10分钟后，在 微量滴定板读出仪上读出492nm处的吸光度。当扩增子在与捕获探针 (图4A)杂交前被变性时，观察到类似于如实施例143中所示那种有效 的序列特异性扩增子的捕获。将B-LNA2的浓度由1增加至5pmol引 起捕获效率的增加。进一步增加至25pmol的探针产生降低的信号。这 种观察与链霉抗生物素MTP上可获得的生物素结合位点的饱和作用 一致。扩增子在用捕获探针(图4B)杂交前未被变性时，也观察到有效 的序列特异性扩增子的捕获。事实上，数据显示无变性的扩增子捕获 与变性的扩增子捕获是同样有效的和特异性的。这强烈提示Bio-LNA2 探针能够通过链侵入与其靶序列结合。据我们所知，这构成了第一个 实例：即在生理盐条件下，经混合的嘌呤/嘧啶探针使序列特异性的导 向dsDNA。除了其明显化简基础研究范围和DNA诊断程序的潜在用 途外，LNA修饰的寡聚物的这种意外特性在经反义方法，特别是反 基因方法开发有效新药方面具有重要的意义。
实施例145
固定于固体表面的LNA取代的寡聚物在序列特异性捕获PCR扩增子 方面有效地起作用
将链霉抗生物素包被的微量滴定板(Boehringer Mannheim)的各孔与5 pmol B-DNA2探针(生物素-GGTGGTTTGTTTG-3′；扩增子2特异性的 DNA探针)或B-LNA2探针(生物素-GGTGGTTTGTTTG-3′，LNA核 苷用黑体表示；扩增子2特异性的LNA探针)在总体积100μl 1×SSC (0.15M NaCl，15mM柠檬酸盐，pH 7.0)中孵育1小时。总体来说，4个孔 与B-DNA2探针孵育，4个孔与B-LNA2探针孵育，而4个孔与单独的缓 冲液孵育。孵育后，用1×SSC洗涤各孔3次。将DIG-标记的扩增子1(60μl) 或扩增子2(60μl)(如实施例143所述制备)与540μl的1×SSC混合，于 95℃加热变性5分钟，将100μl转移至微量滴定板孔中。使含有B- DNA2、B-LNA2或无捕获探针的两个孔接受扩增子1而含有B-DNA2、 B-LNA2或无捕获探针的两个孔接受扩增子2。于37℃1小时后，用磷 酸缓冲盐水(PBST，0.15M Na+，pH 7.2，0.05％Tween 20，3×300μl)洗涤 该滴定板3次，加入200μl过氧化物酶标记的抗-DIG抗体(Boehringer Mannheim，在PBST中稀释为1∶1000)。将滴定板于37℃孵育30分钟并 用300μl PBST洗涤3次。通过加入100μl底物溶液(0.1M柠檬酸盐-磷酸 盐缓冲液pH 5.0、0.66mg/ml邻-亚苯基二胺二盐酸盐、0.012％H2O2)测 定各孔的过氧化物酶活性。通过加入100μl H2SO4(0.5M)6分钟后终止 该反应，在微量滴定板读出仪上读出492nm处的吸光度。如图5所示， LNA修饰的捕获探针(B-LNA2)非常有效地捕获其特异性的扩增子(扩 增子2)并显著优于(灵敏度增加约5倍)相应的未修饰的DNA捕获探针 (B-DNA2)。当B-LNA2探针与无关的扩增子(扩增子1)孵育时未获得信 号，说明了B-LNA2探针的精细的特异性。结论是：当LNA修饰的寡 聚物固定于固体表面可有效地在序列特异性捕获PCR扩增子方面起作 用。进一步推断：使用LNA修饰的寡聚物取代标准DNA寡聚物提供较 好的信噪比(signal to noise ratio)。因此，LNA提供有效改善现有的基 于DNA的测定法的效能的方法，该测定法采用了固定的捕获探针，例 如其中使用多种固定的探针以同时检测一样品中几个不同的靶序列的 存在的矩阵式。
实施例146
可使用全混合的LNA单体以有效增加固定的生物素化的DNA寡聚物 以MTP格式在序列特异性捕获PCR扩增子中的效能
如下通过PCR扩增作用产生来自Nras序列(参考：Nucleic Acid Research，1985，第13卷，第4期，52-55页)的三种DIG标记的扩增子：
PCR引物：
正向引物：根据NAR对照的5′-CCAGCTCTCAGTAGTTTAGTACA-3′ 碱基701-723。
910bp反向引物：5′-GTAGAGCTTTCTGGTATGACACA-3′碱基1612- 1590(根据NAR对照的反向序列)。
600bp反向引物：5′-TAAGTCACAGACGTATCTCAGAC-3′碱基1331 -1308(根据NAR对照的反向序列)。
200bp反向引物：5′-CTCTGTTTCAGACATGAACTGCT-3′碱基909- 886(根据NAR对照的反向序列)。
用于Nras扩增子的PCR反应混合物：2.3μl人胎盘基因组的DNA(440 ng/μl)，50μl 10×PCR缓冲液(无MgCl2 Perkin Elmer)、30μl 25mM MgCl2、50μl dNTP-混合物(2mM dATP、dCTP、dGTP和1.8mM dTTP)、10μl 1mM Dig-11-dUTP、10μl 25μM正向引物、10μl 25μM反 向引物、5μl 5U/μl AmpliTaq Gold(Perkin Elmer)和水约500μl。PCR 反应物：制备用于所有Nras PCR产物的上述混合物。唯一的区别是一 次加入反向引物910bp、600bp或200bp。将PCR混合物等分于10 个PCR管中并于Perkin Elmer 9600中在下列条件下循环：95℃3min； 55℃2min，72℃3min，95℃1min(循环30次)；55℃2min，72℃10 min和4℃浸入(soak)。从各PCR反应物中取10μl在标准琼脂糖凝胶 上进行分析并观察到约910bp、600bp和200bp的预计的片段。分析 条件：将链酶抗生物素包被的微量滴定板孔(Boehringer Mannheim；每 孔20pmol生物素的结合容量)与1pmol的DNA Nras Cap A(生物素- 5′-TTCCACAGCACAA-3′)、LNA/DNA Nras Cap A(生物素-5′- TTCCACAGCACAA-3′)、LNA Nras Cap A(生物素-5′- TTCCACAGCACAA-3′)、DNA Nras Cap B(生物素-5′- AGAGCCGATAACA-3′)、LNA/DNA Nras Cap B(生物素-5′- AGAGCCGATAACA-3′)或LNA Nras Cap B(生物素-5′- AGAGCCGATAACA-3′)在5×SSCT(0.75M NaCl、75mM柠檬酸 盐、pH 7.0、0.1％Tween 20)于37℃孵育1小时；LNA核苷用黑体表 示。Nras Cap A捕获探针捕获扩增子Nras 910、Nras 600和Nras 200。 Nras Cap B捕获探针捕获特异性扩增子Nras 910和Nras 600。与不同 的捕获探针孵育后，在5×SSCT洗涤各孔，将5μl天然或变性(95℃5 分钟和10分钟于冰上)的DIG-标记的扩增子(Nras 910、Nras 600或Nras 200)的95μl 1×SSCT(0.15M NaCl、15mM柠檬酸盐、pH 7.0、0.1％ Tween 20)加入各孔中并于37℃孵育1小时。用磷酸缓冲盐水(1×PBST， 0.15M Na+，pH 7.2，0.05％Tween 20)洗涤各孔3次，于37℃与200μl 过氧化物酶标记的抗-DIG抗体(Boehringer Mannheim，在1×PBST中 稀释为1∶1000)孵育30分钟。最后用1×PBST洗涤各孔3次，通过加 入100μl底物溶液(0.1M柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液pH 5.0，0.66mg/ml邻 -亚苯基二胺二盐酸盐，0.012％H2O2)测定各孔的过氧化物酶活性。通过 加入100μl 0.5M H2SO4终止该反应9分钟后，在H2SO4中稀释4倍， 在微量滴定板读出仪上读出492nm处的吸光度。如图23A所示，掺有 12个LNA核苷钉入(spiked)的捕获探针(LNA Nras Cap A和LNA CapB) 非常有效地捕获特异性的扩增子而无需预先变性(天然扩增子)。掺有4 个LNA核苷的捕获探针(LNA/DNA Nras Cap A和LNA/DNA Nras Cap B)以较低的效率捕获相同的扩增子，而DNA捕获探针(DNA Nras Cap A和DNA Nras Cap B)则完全不捕获特异性的扩增子。LNA Cap B 或LNA/DNA Nras Cap B探针不能捕获对照扩增子Nras 200，证明了 LNA掺入的捕获探针精密的特异性。图23B显示用变性扩增子进行的 相同试验。基本上出现具重要差别即捕获效率普遍增加的相同图象。 结论是：当LNA修饰的含有混合的LNA核苷(A、T、G或C LNA核 苷的寡聚物固定于固体表面时，可有效地在序列特异性捕获PCR扩增 子方面起作用。可进一步推断：LNA提供能有效在扩增子捕获方面(无 需预先变性，即通过链取代来捕获)起作用的构建捕获探针的方法。这 种能力有利于现有的基于DNA的扩增子检测方式的明显简化。
实施例147
LNA修饰的寡聚物用作核酸聚合酶的引物
用3种不同类型的聚合酶对LNA修饰的寡聚物(5′- GGTGGTTTGTTTG-3′，LNA核苷用黑体表示)作为模板依赖(enmplate dependent)性酶促延长(enzymatic elongation)中的引物的能力进行研 究。三种聚合酶是逆转录酶M-MuLV(Boehringer Mannheim)可使用 RNA和DNA两者作为模板，Klenow聚合酶为代表性的标准DNA聚合 酶和热稳定性的聚合酶BM-TAQ(Boehringer Mannheim)。作为对照， 用相同的未修饰的DNA引物(5′-GGTGGTTTGTTTG-3′)进行延伸反 应。LNA和DNA引物如前面实施例137所述用33P-γ-ATP标记。一 个50mer DNA寡聚物(5′- AAAAATCGACGCTCAAGTCAGAAAAGCATCTCACAAACAAAC- AAACCACC-3′)用作模板。用M-MuLV(Boehringer Mannheim)的反应 物含有2μl标记的LNA-引物或DNA引物(10μM)，2μl DNA模板 (10μM)、2μl 2mM dNTP、2μl 10x缓冲液(500mM Tris-HCl、300mM KCl， 60mM MgCl2、100mM DTT，pH 8.3(37℃))、1μl酶(20U/μl)和水(至 20μl)。将该反应物于37℃孵育60min。用Klenow聚合酶(USB)的反应 物含有2μl标记的LNA或DNA引物(10μM)、2μl DNA模板(10μM)、 2μl 2mM dNTP、2μl 10x缓冲液(100mM Tris-HCl、50mM MgCl2、75mM DTT，pH 7.5)、1μl酶(10U/μl)和水(至20μl)。将该反应物于37℃孵育60 min。用BM-Taq(Boehringer Mannheim)的反应物含有2μl标记的LNA 或DNA-引物(10μM)、2μl DNA模板(10μM)、2μl 2mM dNTP、2μl 10 x缓冲液(100mM Tris-HCl、15mM MgCl2、50mM KCL，pH 8.3)、1μl 酶(5U/μl)和水(至20μl)。将该反应物于37℃的初始温度孵育，以1℃/min 的速率升温至60℃并维持于该温度30分钟。孵育期结束后，通过加入 10μl加样缓冲液(0.25％(w/v)溴酚蓝、0.25％(w/v)二甲苯苯胺、80％(v/v) 甲酰胺(formamid))使该反应终止。加热该样品至95℃1分钟，置于冰 上，取2μl加入8％测序(sequencing)的聚丙烯酰胺凝胶并在Life Technologies Inc.BRL 52型上电泳。电泳后，将该凝胶在玻璃平板上 干燥并接受放射自显影成像(X-光片：Kodak X-Omat AR)。如图7所示， 当使用Klenow聚合酶(泳道3)或BM-Taq聚合酶(泳道5)时，可观察到 用LNA和DNA两种引物的清晰的类似延伸产物。使用M-MuLV逆转 录酶(泳道2)时，只有在LNA-引物的情况下才能检测延伸产物。未经 受酶延长的标记的LNA和DNA引物存在于1，4和6泳道。结论是， 将LNA核苷掺入标准DNA寡聚物不会阻止核酸聚合酶识别寡聚物/ 模板双链体。可进一步推断LNA修饰的寡聚物可如同未修饰的DNA 寡聚物一样有效作为引物起作用。
实施例148
LNA修饰的寡聚物在靶扩增方法中用作引物
用3种仅仅在其所含LNA核苷数目上不同的寡聚物分析LNA修 饰的寡聚物作为PCR扩增作用的引物的能力：4LNA核苷(AL2引物： 5′-GGTGGTTTGTTTG-3′，LNA核苷用黑体表示)，1LNA核苷(AL10 引物：5′-GGTGGTTTGTTTG-3′，LNA核苷用黑体表示)和无LNA的核 苷(FP2引物：5′-GGTGGTTTGTTTG-3′)。PCR反应物(100μl)含有：无 模板(对照)，0.01ng，0.1ng或1ng模板(pUC19质粒)，0.2μM反向引物 (5′-GTGGTTCGCTCCAAGCTG-3′)，0.2μM AL2、AL10或FP2正向引 物，200μM dATP，dGTP，dCTP和dTTP，10mM Tris-HCl pH 8.3，1.5mM MgCl2，50mM KCl和2.5U BM-Taq聚合酶。在Techne Genius热循环 仪(therm℃ycler)共进行50个循环，每一循环由94℃1分钟，-45℃1 分钟，-72℃1.5分钟组成(在前面30个循环后，加入另外2.5U Taq聚 合酶)。最后的循环后，将该反应物于72℃孵育3分钟，然后于4℃过 夜。向30μl的各反应物中加入6μl加样缓冲液(0.25％(w/v)溴酚蓝和 40％(v/v)甘油)，将样品(与AmplisizeTM大小标记物(size marker)一起) 加于2％琼脂糖凝胶中于150V电泳45分钟。最后用溴化乙锭染色并 照相。如图8所示，使用未修饰的正向引物FP2和未修饰的反向引物 的PCR反应产生具有所用各种量的模板的正确大小(泳道9：0.01ng模 板、泳道10：0.1ng和泳道11：1ng)的可检测的扩增子。在无模板的对 照反应(泳道12)中未获得信号。当FP2正向引物由含有1个中心LNA 核苷(AL10)的引物取代时，扩增子也可用所使用的所有量的模板检测 (泳道5：0.01ng、泳道6：0.1ng和泳道7：1ng)。这清楚地表明AL10引 物维持指数扩增，即AL10引物可以延伸并可整个用作模板。而且， 无模板(泳道8)的对照反应不产生扩增子。当FP2正向引物由含有4个 中心LNA核苷(AL2)的引物取代时，正确大小的扩增子在任何反应中 均不能被检测。(泳道1：0.01ng模板、泳道2：0.1ng、泳道3：1ng和泳 道4：无模板)。然而，使用最高浓度的模板(1ng)，在凝胶(泳道3)中出 现高分子量的带。但这是RP1引物的人为现象，正如其中用最高量模 板(1ng)测试每种引物AL2(泳道A)、AL10(泳道B)、FP2(泳道C)和 RP1(泳道D)产生扩增子的能力的对照反应所示。由于AL2在实施例 147中用作引物，缺乏可检测的扩增子强烈提示它缺乏用作模板的能 力，即4个连续的LNA核苷区阻断聚合酶的进展，并藉此将该反应 转变为线性扩增的能力(其产物无法用所用的实验装置检测)。结论是 LNA修饰的寡聚物可在PCR扩增中用作引物。进一步的结论是扩增的 程度(从指数到线性扩增的程度)可能受LNA修饰的寡聚物的设计的控 制。我们注意到有可能通过将LNA核苷掺入引物中以阻断聚合酶的 进展有利于带有单一链端的扩增子的形成。此类末端容易进行杂交而 无需扩增子的变性，这一特性在许多应用中是有用的。
实施例149
携带5′蒽醌的LNA修饰的寡聚体可通过照射(irradiation)共价固定于固 体载体上且固定的寡聚体在互补DNA寡聚物的捕获中是有效的
将25pmol/μl或12.5pmol/μl蒽醌DNA寡聚物(5′-AQ-CAG CAG TCG ACA GAG-3′)或蒽醌LNA修饰的DNA寡聚物(5′-AQ-CAG CAG TCG ACA GAG-3′；LNA单体用下划线表示)在0.2M LiCl中点样(1μl/斑 点)于聚碳酸酯玻片(Nunc)上。用软紫外光(soft UV light)照射该寡聚物 15分钟。照射后，在Milli-Q水中洗涤该玻片3次并风干。将25ml 0.5 pmol/μl互补生物素化寡聚体(5′-生物素-CTC TGT CGA CTG CTG-3′) 与固定的寡聚体在5×SSCT(75mM柠檬酸盐，0.75M NaCl，pH 7.0， 0.1％Tween 20)中于50℃杂交2小时。用1×SSCT洗涤4次和用磷酸缓冲 盐水(PBST，0.15M Na+，pH 7.2，0.05％Tween 20)洗涤1次后，将含有 0.06μg/ml链酶抗生物素结合的辣根过氧化物酶和1μg/ml链酶抗生物素 的25ml PBST加至玻片中。将该玻片孵育30分钟并用25ml PBST洗涤4 次。如制造商所述，通过使用化学发光底物(SuperSignal；Pierce)和X- 光片(CL-XPosure胶片，Pierce 34075)使该玻片成像。如图9所示，AQ- DNA寡聚物和AQ-LNA修饰的DNA寡聚物两者产生明显的可检测 的信号。我们得出结论，蒽醌连接的LNA修饰的DNA寡聚物可通过照 射有效连接于固体表面且以这种方式附着的寡聚物能够杂交于其互补 靶DNA寡聚物上。
实施例150
在具不同LNA修饰的Cy3-标记的8聚体的排列的杂交和检测
玻片的制备：在丙酮中用10％氨基丙基三乙氧基硅烷溶液使该玻片氨 基硅烷基化，接着用丙酮洗涤。将下列寡核苷酸点滴于该玻片上：   使用的寡聚物   寡聚物序列   Pens   1+2+3   序列对照探针   序列3   5′-GTA TGG AG-3’   1pmol/μl   1个内失配   序列6   5′-GTA TGA AG-3’   1pmol/μl   配对
在12块玻片上，对来自每一剂量笔(pen)的每一个寡核苷酸进行10 个重复点样(每次点样约1nl)。
探针(LNA单体用黑体表示)：
a)序列号aZ1  5′-Cy3-CTT CAT AC-3′
b)序列号aZ2  5′-Cy3-CTT CAT AC-3′
c)序列号aZ3  5′-Cy3-CTT CAT AC-3′
d)序列号16  5′-Cy3-CTT CAT AC-3′
玻片和杂交条件
玻片1、2和3与aZ1探针@300fmol/μl，30fmol/μl，3fmol/μl杂交 玻片4、5和6与aZ2探针@300fmol/μl，30fmol/μl，3fmol/μl杂交 玻片7、8和9与aZ3探针@300fmol/μl，30fmol/μl，3fmol/μl杂交 玻片10、11和12与序列16探针@300fmolμl，30fmol/μl，3fmol/μl杂交
将用30μl杂交缓冲液(5×SSC，7％月桂基肌氨酸钠)稀释的探针沿 着每块玻片的长度滴定，用盖玻片覆盖，置于塑料内插板(insert)上层 的塑料箱中，放于用水润湿的纸巾上。将箱用铝箔包裹以避免光照， 于4℃孵育过夜。
玻片洗液：移去盖玻片，洗涤置于玻片碟中的玻片(插入支架，每一支 架6块玻片)，用铝箔包裹：   玻片号   洗涤缓冲液(4℃)   洗涤时间   探针序列   1，2，3   5×SSC，0.1％Tween-20   2×5min   序列号aZ1   4，5，6   5×SSC，0.1％Tween-20   2×5min   序列号aZ2   7，8，9   5×SSC，0.1％Tween-20   2×5min   序列号aZ3   10，11，12   5×SSC，0.1％Tween-20   2×5min   序列号16
洗涤后，吹干玻片并扫描。荧光在玻片扫描仪上成像，数据由 ImageQuant software(Molecular Dynamics)分析。如图11所示，未观察 到Cy3标记的探针与具未修饰探针(玻片10-12)、单个LNA修饰的探针 aZ1(玻片1-3)、单个LNA修饰的探针aZ2(玻片4-6)或三个LNA修饰的 探针aZ3(玻片7-9)的失配寡聚物3的结合(即用失配的寡聚物3获得的 信号与本底信号相当)。用互补的寡聚物6，在任何情况下均观察到特 异性信号。这些信号的强度明显与存在于所述探针中的LNA数以及探 针的浓度相关。每一个LNA T残基增加信号强度约是正常DNA寡聚物 探针的2倍，即aZ1和aZ2＝2x序列16的信号，而aZ3＝8x序列16的信 号。配对/失配的辨别用LNA T碱基取代较好，用信号强度的增加辩别 失配似乎更容易。
实施例151
在具LNA修饰Cy3-标记的8mers的排列的末端失配的杂交和检测
玻片的制备：在丙酮中用10％氨基丙基三乙氧基硅烷溶液使该玻片氨 基硅烷基化，接着用丙酮洗涤。将下列寡核苷酸以1pmol/μl点样于该
玻片上：
序列号9    5′-GTGTGGAG-3′
序列号15   5′-GTGTGGAA-3′
序列号131  5′-GTGTGGAT-3′
序列号132  5′-GTGTGGAC-3′
序列号133  5′-ATGTGGAA-3′
序列号134  5′-CTGTGGAA-3′
序列号135  5′-TTGTGGAA-3′
在12块玻片的每一块上，对来自6支剂量笔中的每一支剂量笔的 每一个寡核苷酸进行10个重复点样(每次点样约1nl)。
探针(LNA单体用黑体表示)：
DNA
探针号1：    5′-Cy3-TTCCACAC-3′
探针号2：    5′-Cy3-GTCCACAC-3′
探针号3：    5′-Cy3-ATCCACAC-3′
探针号4：    5′-Cy3-CTCCACAC-3′
探针号5：    5′-Cy3-TTCCACAT-3′
探针号6：    5′-Cy3-TTCCACAG-3′
LNA
探针号35Z-1：    5′-Cy3-TTCCACAC-3′
探针号35Z-2：    5′-Cy3-GTCCACAC-3′
探针号35Z-3：    5′-Cy3-ATCCACAC-3′
探针号35Z-4：    5′-Cy3-CTCCACAC-3′
探针号35Z-5：    5′-Cy3-TTCCACAT-3′
探针号35Z-6：    5′-Cy3-TTCCACAG-3′
将具LNA单体的探针与作为序列数部分的35Z-预先固定。特异性 的LNA单体以斜体/黑体表示且位于LNA寡聚物的3′和5′端。
玻片和杂交条件：在分开的玻片上对各探针序列进行杂交，所有 的探针浓度为1fmol/μl。每一探针用杂交缓冲液(5×SSC，7％月桂基肌 氨酸钠)稀释，取其中30μl沿着每块玻片的长度滴定，用盖玻片覆盖， 置于塑料内插板上层的塑料箱中，放于用水润湿的纸巾上。将箱用铝 箔包裹以避免光照，于+4℃孵育过夜。
玻片洗液：移去盖玻片，将玻片插入位于玻片碟的支架中(每一支 架8块玻片)，用铝箔包裹。所有的玻片于+4℃用5×SSC洗涤2×5分 钟。+4*C。洗涤后，将玻片吹干并扫描。荧光在玻片扫描仪上成像， 数据由ImageQuant software(Molecular Dynamics)分析。
结论：如图12和13所示，在大多数情况下，其3′和5′端含有LNA核 苷的探针在配对的和失配的靶序列的辨别上优于它们相应的未修饰的 寡核苷酸。
对于DNA寡聚物，C＝T失配是最难辨别的，例如在探针序列1与 靶序列132杂交和探针序列5与靶序列134杂交的情况下。其它的失配， 例如T＝T和G＝T失配也可发现，但这些斑点的强度较低，例如在探针 序列5和6分别与其靶序列135杂交的情况下。LNA寡聚物明显使这些 C＝T和T＝T失配的斑点强度降至其它失配相近的水平。探针序列1、2 和3的相对斑点强度与DNA和LNA寡聚物相似。然而，用探针序列4、 5和6分别与其相配的靶序列9、133和134杂交时，LNA寡聚物得到显著 增加的斑点强度。
实施例152
在具AT和全LNA修饰的Cy3-标记的8聚体的排列的端失配的杂交和检 测
玻片制备：在丙酮中用10％氨基丙基三乙氧基硅烷溶液使该玻片氨基 硅烷基化，接着用丙酮洗涤。将下列寡核苷酸以1pmol/μl点样于该玻 片上：
序列号9    5′-GTGTGGAG-3′
序列号15   5′-GTGTGGAA-3′
序列号131  5′-GTGTGGAT-3′
序列号132  5′-GTGTGGAC-3′
序列号133  5′-ATGTGGAA-3′
序列号134  5′-CTGTGGAA-3′
序列号135  5′-TTGTGGAA-3′
在36块玻片的每一块上，对来自6支剂量笔(pen)中的每一支剂量 笔的各寡核苷酸进行10个重复点样(每次点样约1nl)。
探针(LNA单体用黑体表示)：
DNA：
探针号1：5′-Cy3-TTCCACAC-3′
探针号2：5′-Cy3-GTCCACAC-3′
探针号3：5′-Cy3-ATCCACAC-3′
探针号4：5′-Cy3-CTCCACAC-3′
探针号5：5′-Cy3-TTCCACAT-3′
探针号6：5′-Cy3-TTCCACAG-3′
LNA修饰：
探针号ATZ-1：5′-Cy3-TTCCACAC-3′
探针号ATZ-2：5′-Cy3-GTCCACAC-3′
探针号ATZ-3：5′-Cy3-ATCCACAC-3′
探针号ATZ-4：5′-Cy3-CTCCACAC-3′
探针号ATZ-5：5′-Cy3-TTCCACAT-3′
探针号ATZ-6：5′-Cy3-TTCCACAG-3′
全LNA修饰：
探针号AllZ-1：5′-Cy3-TTCCACAC-3′
探针号AllZ-2：5′-Cy3-GTCCACAC-3′
探针号AllZ-3：5′-Cy3-ATCCACAC-3′
探针号AllZ-4：5′-Cy3-CTCCACAC-3′
探针号AllZ-5：5′-Cy3-TTCCACAT-3′
探针号AllZ-6：5′-Cy3-TTCCACAG-3′
将具LNA单体的探针与作为序列数部分的ATZ-或AllZ-预先固 定。LNA寡聚物的特异性LNA单体以斜体表示。
玻片和杂交条件：在分开的玻片上对各探针序列进行杂交，所有 的探针浓度为1fmol/μl。每一探针用杂交缓冲液(5×SSC，7％月桂基肌 氨酸钠)稀释，取其中30μl沿着每块玻片的长度滴定，用盖玻片覆盖， 置于塑料内插板上层的塑料箱中，放于用水润湿的纸巾上。将箱用铝 箔包裹以避免光照，于室温下孵育过夜。
玻片洗液：移去盖玻片，将玻片插入位于玻片碟的支架中(每一支 架9块玻片)，用铝箔包裹。所有的玻片于室温下用5×SSC洗涤2×5分 钟。洗涤后，将玻片吹干并扫描。荧光在玻片扫描仪上成像，数据由 ImageQuant software(Molecular Dynamics)分析。
结论：如图15A、15B和15C所示，室温下DNA杂交平均强度是用 AT或全LNA修饰的寡聚物杂交所获得的强度的约10％。在玻片上未见 到与DNA探针5和6杂交的斑点。因此，这些条件对于DNA探针并不是 最佳的。然而，用LNA核苷代替A和T碱基来辨别匹配/失配是很好的。 对于全LNA寡聚物的严格性可能不够大，因为匹配/失配辩别不如AT LNA寡聚物好。
具有LNA修饰的寡聚物可很好地发挥作用，而最难辨别的失配 是：
探针1对靶135＝CT失配
探针2对靶131＝GT失配
探针3对靶15＝AA失配
探针4对靶131＝CT失配
探针5对靶135＝TT失配
探针6对靶135＝GT失配
探针6对靶133＝GA失配
AT LNA寡聚物提供很好的辨别，其中这些失配的最大斑点强度 一般为相配斑点强度(match spot intensities)的50％。对于这些失配来 说，全LNA寡聚物得到失配斑点强度为相配斑点强度的约50-70％。从 整体来说，LNA修饰允许在高温下用于杂交和洗涤，可以辨别末端失 配。这些结果至少与在4℃得自DNA探针杂交的结果(见实施例151)一 样好。
实施例153
[α33P]ddNTP′s和ThermoSequenaseTM DNA聚合酶用于具有LNA T单体 的序列DNA模板
为检验LNA T单体被接受为DNA聚合酶的模板的能力，设立放 射标记的末端测序反应。使用15聚体引物(序列：5′-TGC ATG TGC TGG AGA-3′)以起动(prime)下列短的寡核苷酸序列(LNA单体用黑体 表示)：
模板1    3′- ACG TAC ACG ACC TCT ACC TTG CTA-5′
模板TZ1  3′- ACG TAC ACG ACC TCT ACC TTG CTA-5′
制得下列反应混合物：
模板1混合物：
2μl×16ThermoSequenase Buffer
6μl引物2pmole/μl
6μl模板11pmole/μl
4μl水
2μl ThermoSequenase DNA聚合酶(4U/μl)
20μl  总体积
模板TZ1混合物
2μl×16ThermoSequenase Buffer
6μl引物2pmole/μl
6μl模板TZ1 1pmole/μl
4μl水
2μl ThermoSequenase DNA聚合酶(4U/μl)
20μl 总体积
将2μl核苷酸混合物(各7.5μM dNTP)加入8个Eppendorf试管中。将 0.5μl[α33P]ddATP加入管1和5中。将0.5μl[α33P]ddCTP加入管2和6中。 将0.5μl[α33P]ddGTP加入管3和7中。将0.5μl[α33P]ddTTP加入管4和8 中。将4.5μl的模板1的混合物加入管1-4的各管中。将4.5μl的模板TZ1混 合物加入管5-8的各管中。全部反应物于60℃孵育3分钟。通过加入4μl 甲酰胺/EDTA终止溶液使该反应停止。于95℃加热反应物3分钟，然后 载于19％聚丙烯酰胺7M脲凝胶中。将该凝胶固定于10％乙酸10％甲醇 中，然后转移至3MM滤纸(paper)上并干燥。使干燥的凝胶曝光于Kodak Biomax放射自显影胶片。
结果描述于图18(泳道1-4)和图19(5-8)中。各泳道相对于下列反应： (图18)：泳道1-ddATP道(track)，泳道2-ddCTP道，泳道3-ddGTP道，泳 道4-ddTTP道，泳道5-8-32碱基寡聚物标记物；图19：泳道A-8-32碱 基寡聚物标记物，泳道5-ddATP道，泳道6-ddCTP道，泳道7-ddGTP道， 泳道8-ddTTP道。
如图18和19所示，两种模板的全序列可以容易地从autorad读出。 该序列为相对于模板序列3′-ACC TTG CTA-5的5′-TGG AAC GTA- 3。这表明单一LNA T单体可作为DNA聚合酶的模板起作用。所述LNA T单体被特别复制为掺入的ddATP的″T″。
冶疗应用
实施例154
LNA修饰的寡聚物可以转移至细胞中。用放射标记的LNA寡聚物进行 的实验
将10pmol的寡脱氧核苷酸(ODN)(ODN#10：5’-TTA ACG TAG GTG CTG GAC TTG TCG CTG TTG TAC TT-3’，与人组织蛋白酶D 互补的35-mer)和10pmole的两个LNA寡聚物：AL16(5′-d(TGT GTG AAA TTG TTA T)-3′，LNA核苷用黑体表示)和AL17(5′-d(ATA AAG TGT AAA G)-3′，LNA核苷用黑体表示)与T4多核苷酸激酶(10单位， BRL cat.no.510-8004SA)，5μl γ-32P-ATP 5000Ci/mmol，10uCi/μl (Amersham)在激酶缓冲液(50mM Tris/HCl pH 7，6，10mM MgCl2，5 mM DTT，0.1mM EDTA)中混合。将样品于37℃孵育45分钟，其后加 热至68℃10分钟，然后调至+0℃。通过上Chroma Spin TE-10柱 (Clontech cat.no.K1320-1)除去未掺入的核苷酸。对于ODN#10、AL16 和AL17的得率分别为5×105cpm/μl、2×105cpm/μl和0.8×105cpm/μl。 在25cm2细胞培养烧瓶(Nunclon，NUNC)中，将源于人Cell Culture Bank (Mason Research Institute，R℃kville)获得的MCF-7人乳腺癌细胞在 DME/F12培养基(1∶1)(补充有1％热灭活的胎牛血清(Gibco BRL)、6 ng/ml牛胰岛素(Novo)和2.5mM glutamax(Life Technologies))中培养并 于37℃，5％CO2，20％O2，75％N2气氛下，在湿化培养箱孵育。实验时， 约40％的MCF-7细胞是融合的。将少量(低于0.1pmol)的激酶的寡聚物 与1.5μg pEGFP-NI质粒(Clontech cat.no 60851)混合并与100μl稀释的 FuGENE6转染剂(transfection agent)(Boehringer Mannheim cat.no 1 814443)混合，稀释液：5μl FuGENE6在95μl无血清DME/F12培养基 中。严格按照生产商说明，将FuGENE6/DNA/寡聚物-混合物直接加入 贴壁生长的MCF-7细胞培养基(5ml)中并与细胞孵育18小时。建立3种 类型的实验：1)ODN#10+pEGFP-NI；2)AL16+pEGFP-NI；3)AL17+ pEGFP-NI。通过移去含FuGENE6/DNA/寡聚物-混合物的培养基(等份 移至闪烁小瓶中)研究DNA/LNA物质的细胞摄取。用磷酸缓冲盐水 (PBS)冲洗细胞1次，加入新鲜培养基并通过荧光显微镜检查法检查细 胞。约30％的转染细胞含有绿色荧光物质，表明约30％的细胞已摄取 pEGFP-NI质粒并表达由该质粒编码的绿色荧光蛋白。在荧光显微镜检 查后，从培养烧瓶中移去贴壁MCF-7细胞。简言之，移去培养基，然 后用0.25％胰蛋白酶(Gibco BRL)1mM EDTA在PBS(无Mg2+和Ca2+)中 冲洗细胞，加入1ml胰蛋白酶/EDTA并于37℃孵育细胞10分钟。在孵 育期间，使细胞松散，以便容易地悬浮和转移至闪烁小瓶中。然后加 入10mlOptifluor闪烁混合物(Packard cat.no 6013199)使细胞完全溶 解，并在Wallac 1409闪烁计数器中计数。结果如下：1)ODN#10+ pEGFP-NI：细胞物质结合约1.4％加入的放射活性；2)AL16+pEGFP- NI：细胞物质结合约0.8％加入的放射活性；和3)AL17+pEGFP-NI： 细胞物质结合约0.4％加入的放射活性。结论是0.4-0.8％加入的LNA寡 聚物被细胞摄取。
实施例155
LNA有效地传递至活的人MCF-7乳腺癌细胞
为增加人MCF-7细胞的LNA-摄取效率，用各种浓度的5′FITC-标 记的LNA和DNA测试不同的转染剂。对述于下表中的寡核苷酸进行实 验。
表：所测试的寡核苷酸   名称   序列(LNA单体用黑体表示)   特征鉴定   AL16   5′-TGT GTG AAA TTG TTA T-3′   FITC-标记的LNA，酶   AL17   5′-ATA AAG TGT AAA G-3′   FITC-标记的LNA，酶   EQ3009-01   5′-TGC CTG CAG GTC GAC T-3′   LNA-FITC-标记的   EQ3008-01   5′-TGC CTG CAG GTC GAC T-3′   DNA-FITC-标记的
如实施例128所述，用FITC对AL16和L17进行酶标记。通过标准 固相化学方法用FITC标记EQ3009-01和EQ3008-01。测试3种转染剂： FuGENE-6(Boehringer Mannheim cat.no 1814443)，SuperFect (Quiagen cat.no 301305)和Lipofectin(Gibco BRL cat.no 18292-011)。如 前(实施例154)所述孵育人MCF-7乳腺癌细胞。实验前3天，使细胞以0.8 ×104细胞/cm2的细胞密度接种。根据实验的类型，将MCF-7细胞接种 于标准T25烧瓶(Nunc，LifeTechnologies cat.no 163371A)，24孔多碟板 (multidish)(Nunc，LifeTechnologies cat.no 143982A)或玻片烧瓶(Nunc， LifeTechnologies ca.no 170920A)中。当细胞有30-40％融合时进行实 验。在无血清的情况下，即除去含有正常血清的DME/F12培养基并代 之以DME/F12，研究细胞摄取LNA和DNA，然后将转染-混合物加入细 胞中。在这些条件下，证明SuperFect对MCF-7细胞是有毒性的。由 SuperFect和质粒DNA(pEGFP-N1，Clontech cat.no 6085-1)，或寡聚物 DNA或寡聚物LNA组成的转染混合物对MCF-7细胞同样是有毒性 的。与SuperFect形成对照，FuGene6和Lipofectin与质粒DNA(pEGFP- N1)很好地发挥作用。然而，只有脂转染试剂(lipofectin)能够有效地传 递寡核苷酸至活MCF-7。简言之，通过在具有1％FCS至约40％融合 物的DME/F12中培养细胞可获得FITC-标记的LNA和DNA向MCF-7 细胞的有效传递。然后用无血清的DME/F12培养基稀释(40X)该脂转 染试剂并与浓度750nM寡聚物结合。于室温下形成寡聚物-脂转染试 剂复合物15分钟，进一步用无血清培养基稀释至终浓度250nM寡聚 物，0.8ug/ml脂转染试剂。然后，从细胞中除去培养基，代之以含有寡 聚物-脂转染试剂复合物的培养基。于37℃孵育该细胞6小时，用无血 清的DME/F12培养基冲洗1次，进一步于37℃在具有1％FCS的 DME/F12中孵育18小时。实验结果为对培养瓶或24孔多孔碟板上的活 性细胞的直接评价或对在玻片烧瓶培养并在4％冰冷的PFA中固定的 细胞的评价。在所有的情况下均使用装配有高分辨率CCD相机的Leica DMRB荧光显微镜。用活细胞的结果示于图16中，而使用在玻片烧瓶 培养的固定细胞的结果示于图17。将图16和17的两种细胞用FITC-标记 的AL16LNA分子转染。经对几个视野的细胞总数和绿色荧光细胞计 数，我们观察到FITC-标记的AL16LNA被转染入约35％的MCF-7细 胞。重要的是，我们看到LNA主要定位于细胞核中(图17)。值得注意 的是，荧光寡聚物的核摄取其反义活性相关(Stein C，A等，(1997) Making sense of antisense：A debate。在HMS Beagle：A BioMedNet Publication(http：//hmsbeagle.com/06/cutedge/overwiev.htm)中)。将寡聚 物和脂转染试剂的量增加至终浓度为1250nM寡聚物和4ug/ml脂转 染试剂仅增加边际(marginally)绿色荧光细胞的百分率。增加浓度甚至 对细胞还是有毒性的。用其它LNA和FITC-标记的寡聚物DNA(见上 表)获得类似的结果。结论是：1)通过脂转染试剂-介导的转染可将LNA 有效地传递给活MCF-7乳腺癌细胞。2)用终浓度为每毫升无血清生长 培养基250nM LNA，0.8ug脂转染试剂转染相应较高部分(30％或更高) 的细胞。增加LNA和脂转染试剂浓度至5倍仅增加边际的转染得率。3) 根据文献将LNA转染入细胞核的方法是一个好的指标，即这样的转染 的LNA可显示对细胞的反义作用。
实施例156
LNA修饰的寡聚物可转移入细胞中。用荧光标记的LNA寡聚物的实验
如实施例128所述，用荧光素标记两种LNA寡聚物：AL16(5′- TGT GTG AAA TTG TTA T-3′，LNA核苷用黑体表示)和AL17(5′- ATA AAG TGT AAA G-3′，LNA核苷用黑体表示)。如实施例154所述 孵育人MCF-7乳腺癌细胞。建立3种类型的实验：1)约1.5μg FITC-标 记的AL16；2)约1.5μg FITC-标记的AL17；和3)约0.75μg FITC-标记 的AL16和0.75μg pRSVβgal质粒(表达细菌lac Z基因编码的β-半乳糖 苷酶的质粒，Tulchinsky等，(1992)PNAS，89，9146-50)。如实施例154所 述，将两种LNA寡聚物和LNA-质粒混合物与FuGENE6混合并加入到 MCF-7细胞中。孵育18小时后，通过荧光显微镜检查细胞培养物评价 LNA寡聚物的细胞摄取。一部分处理过的细胞含有绿色荧光物质(见 图16)，表明细胞摄取荧光素标记的LNA。在这方面，荧光素标记的 AL16似乎优于荧光素标记的AL17。荧光显微镜检查后，从荧光素标 记的AL16和pRSVβgal两者处理的细胞移去培养基。用PBS洗涤该细胞 1次，用2％(v/v)甲醛，0.2％(v/v)戊二醛于4℃固定5分钟，用X-gal(5-溴 代-4-氯代-3-吲哚基(indoyl)β-D-吡喃半乳糖苷(galactopyranosid)，(它能 在β-半乳糖苷酶活性存在下由无色转变为蓝色)将含有β-半乳糖苷酶的 细胞染成蓝色。X-gal染色表明pRSVβgal可有效地转移入细胞。结论是 细胞可摄取荧光素LNA寡聚物。
实施例157
LNA修饰的寡聚物在细胞培养条件下是相对稳定的
如实施例156所述进行荧光显微镜检查后，仅用荧光素标记的 AL16LNA处理的细胞允许孵育另外3天。在此期间绿色荧光细胞的数 目似乎未改变。结论是：荧光素标记的LNA寡聚物在细胞培养的现行 条件下具有良好的稳定性。
实施例158
在Warm Water清醒大鼠弹尾实验中反义密闭的核酸(LNA)的[D-Ala2]δ 啡肽-诱导的抗伤害感受的阻断
将聚乙烯导管鞘内(i.th)植入到雄性Sprague-Dawley大鼠(300g)体 内，在开始注射(包括对照)前，至少恢复5天。以5μl体积一日两次(08.00 和17.00时)给予反义LNA化合物(每次注射12.5和2.5μg)，共给药3 天。如观察运动行为和体重测量所表明的，未检测出非特异性的作用 和毒性体征。在最后注射后的那天给大鼠注射[D-Ala2]δ啡肽(60μg.th) 并在温水(52℃)进行δ阿片样物质受体-介导的抗伤害感受的弹尾试 验。数据示于图14中，为基于每组6-8只动物的中位数(数据转化为 最大可能应答的百分数，％MPE)。通过Kruskal-Wallis 1-向ANOVA 排秩方法进行统计学分析，接着对处理组和对照组进行比较。如图14 所示，δ啡肽在盐水-处理的对照组中产生强烈的抗伤害感受作用。与 盐水-处理的对照组比较，这种应答在两个反义LNA组(12.5和2.5μg) 中受到具统计学显著意义的抑制。
LNA固体载体
实施例159
用于DMT-LNA核苷琥珀酸盐的通用方法
将碱保护的DMT-LNA核苷和琥珀酸酐(1.5当量)溶于无水二氯乙 烷(约10ml/g核苷)中。向该混合物中加入三乙胺(2当量)，于室温下搅 拌该混合物。通过HPLC进行反应(条件与三苯甲基化作用相同)。反应 完毕后(＞95％)，浓缩反应混合物，与二氯乙烷和乙腈共蒸发，真空干 燥除去三乙胺。使残留物溶于二氯乙烷或乙酸乙酯(约100ml/g原料核 苷)中，用冷的10％柠檬酸(3×80ml/g)和冷水(3×80ml/g)洗涤。经无 水磷酸钠干燥有机层，过滤并在加入或不加入1-2当量三乙胺的情况 下浓缩。残留的固体与无水乙腈(2-3x)共蒸发，真空干燥得到为白色固 体的纯产物。
用于LNA核苷载体的通用方法
将碱保护的DMT-LNA-核苷琥珀酸盐(游离酸或三乙基铵盐 (triethylammonium salt)、65mmol/g载体)、氨基衍生物载体(Primer SupportTM 30HL，160mmol氨基基团/g的载体)、DMAP(3mg/g载体) 和1-(3-[二甲基氨基]丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(80mg/g载体)溶于 无水吡啶(6ml/g载体)中。向该混合物中加入三乙胺(16微升/克载 体)，将该混合物以150rpm保持在振动器中过夜。过滤载体，用甲醇 (3×10ml/g载体)和二氯甲烷(3×10ml/g载体)洗涤。空气干燥后，真 空干燥载体0.5小时。向其中加入6％DMAP的无水乙腈(Cap A，约3 ml/g载体)和20％乙酸酐/30％2，4，6-三甲基吡啶/50％乙腈(Cap B，约 3ml/g载体)的混合物。将该混合物保持于振动器中5小时。过滤载体， 用无水二氯甲烷(2×10ml/g载体)洗涤并如上干燥。将其再悬浮于Cap A和Cap B的混合物(总体积6ml/g载体)并保持于振动器中过夜。过 滤载体，用甲醇(6×10ml/g载体)、二氯甲烷(3×10ml/g载体)洗涤， 风干。再真空干燥载体5-6小时。通过二甲氧基三苯甲基测定法确定 填充量并发现为约40μmol/g。
实施例160
用含有LNA T单体的聚dT引物合成第一链cDNA
设立反应物以检验含有LNA T残基的poly dT残基起动第一链 cDNA合成的能力。检验以下的聚dT引物(LNA单体用黑体表示)：
RTZ1    5′-TTT TTT TTT TTT TT-3′
RTZ2    5′-TTT TTT TTT TTT TT-3′
RTZ3    5′-TTT TTT TTT TTT TT-3′
RTZ4    5′-TTT TTT TTT TTT TT-3′
RTZ5    5′-TTT TTT TTT T-3′
来自RPK0140kit Cy Dye cDNA标记试剂盒的锚式聚dT引物 (Amersham Pharmacia Biotech)用作对照物。
对上面的每一种引物设立如下的反应物：
1μl    Arabidopsis mRNA 0.5μg/μl
2μl    聚dT引物8pmoles/μl
4μl    x5AMV逆转录酶缓冲液
1μl   水
8μl    总体积
然后将该混合物加热至75℃3min，再于室温下冷却至少10分钟。
将下列物质加入每一反应物中：
          1μl    80mM焦磷酸钠
          1μl    人胎盘核糖核酸酶抑制剂20U/μl
          7μl    0.5mM dNTP溶液
          2μl    [α33P]dATP 10mCi/ml 3000Ci/mmole
          1μl    AMV逆转录酶20U/μl
          20μl   总体积
将该反应物于42℃孵育2小时。然后于95℃加热该反应物3分钟，然 后加样于6％聚丙烯酰胺7M脲凝胶中。将该凝胶固定于10％乙酸 /10％甲醇中，然后转移至3MM滤纸上并干燥。使干燥的凝胶暴露于 Kodak Biomax放射自显影胶片过夜。
放射自显影图清楚地表明，含有LNA的寡核苷酸引物RTZ1-4能 够有效地引发cDNA的合成。在这些反应中产生的cDNA产物的量和 密度等于用锚式聚dT对照寡核苷酸所产生的产物的量和密度。RTZ 5 也产生一些cDNA，但得量显著低于对照寡聚物引物所产生的量。
实施例161
共价连接于Separose珠的LNA-修饰的寡核苷酸在序列特异性捕获 RNA分子中有效地发挥作用
经化学方法(Amy Mueller)合成3种寡聚物以在聚(rA)结合中进行 评价。
-NH2(T8)-T            对照
-NH2(T15)-T           对照
-NH2(LNA-T8)-T        试验
将200nmol各寡聚物偶联到按每一个小册子指示制备的50mg CNBr-活化的Separose 4B(Pharmacia)。在100nM Tris pH 8.0中封闭树 脂上未结合的部位。
寡聚物结合数据表   步骤   T9寡聚物   A260单位   T16寡聚物   A260单位   LNA T9寡聚   物   A260单位   无寡聚物   对照   反应的寡聚物   14.7   (200nM)   26.0   (200nM)   14.7   (200nM)   0   未结合的寡聚   物   5.50   10.43   4.20   -   ∴结合的寡聚物   9.20   15.57   10.50   -   ％结合率   62.6％   59.9％   71.4％   -
将寡聚物结合的树脂分成两部分(每份约25mg树脂)以进行双份 的聚(rA)结合分析。使用聚(rA)Pharmacia#27-4110-01(以28.2A260单 位/ml溶于结合缓冲液中)以便结合。使5个A260单位双份结合于每 SOP QC 5543 25mg份的各寡聚物结合树脂上。未结合的″透过的 (breakthrough)″聚(rA)通过A260吸光度定量并用于计算结合率。使结合 的poly(rA)通入低盐缓冲洗液并多次洗脱。如表10所示，LNA和DNA 包被的两种珠在捕获poly(rA)靶分子中有效地发挥作用。然而，如不 同珠poly(rA)洗脱分布模式所证实的，LNA包被的珠比DNA包被的 珠更紧密地结合于poly(rA)靶。结论是：1)LNA T9寡聚物有效地捕 获含有A残基的RNA分子；2)捕获的RNA分子比对照DNA T9和 DNA T16寡聚物更紧密地结合于LNA T9寡聚物珠。
表1
单体Z  寡聚物   靶   Tm   No.   Tm(℃)   Na2HPO4/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/NaCl/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/TMAC  5′-d(GTGATATGC)-3′                   5′-d(GTGATATGC)-3′                  5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-d(GCATTTCAC)-3′   5′-d(GCATGTCAC)-3′   5′-d(GCATCTCAC)-3′   5′-d(GCATAACAC)-3′   5′-d(GCATAGCAC)-3′   5′-d(GCATACCAC)-3′   5′-(GCAUAUCAC)-3′   5′-(GCAUCUCAC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-d(GCATTTCAC)-3′   5′-d(GCATGTCAC)-3′   5′-d(GCATCTCAC)-3′   5′-d(GCATAACAC)-3′   5′-d(GCATAGCAC)-3′   5′-d(GCATACCAC)-3′   5′-(GCAUAUCAC)-3′   5′-(GCAUCUCAC)-3′   1   2   3   4   5   6   7   8   9   10   11   12   13   14   15   15A   16   17   28   12   19   11   12   ＜10   ＜10   28   10   44   27   30   23   28   28   29   50   33   42   31   23   30             56   43   43   38
表1(续)  寡聚物   靶   Tm   No.   Tm(℃)   Na2HPO4/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/NaCl/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/TMAC  5′-d(GTGAGATGC)-3′                   5′-d(GTGAUATGC)-3′               5′-d(GTGAGATGC)-3′  5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-d(GCATTTCAC)-3′   5′-d(GCATGTCAC)-3′   5′-d(GCATCTCAC)-3′   5′-d(GCATAACAC)-3′   5′-d(GCATAGCAC)-3′   5′-d(GCATACCAC)-3′   5′-(GCAUAUCAC)-3′   5′-(GCAUCUCAC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-d(GCATTTCAC)-3′   5′-d(GCATGTCAC)-3′   5′-d(GCATCTCAC)-3′   5′-d(GCATAACAC)-3′   5′-d(GCATAGCAC)-3′   5′-d(GCATACCAC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-d(GCATTTCAC)-3′   5′-d(GCATGTCAC)-3′   5′-d(GCATCTCAC)-3′   5′-d(GCATAACAC)-3′   5′-d(GCATAGCAC)-3′   5′-d(GCATACCAC)-3′   5′-(GCAUCUCAC)-3′   18   19   20   21   22   23   24   24A   24B   25   26   27   28   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38   38A   26   33   28   49   ＜15   ＜15   ＜15   34   59   44   25   32   24   27   28   20   17   16   15   33   9.0   ＜5   ＜5   33   39   44   38   57             56   44   43   37         34   30   28   44
表1(续)  寡聚物   靶   Tm   No.   Tm(℃)   Na2HPO4/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/NaCl/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/TMAC  5′-d(GGTGGTTTGTTTG)-3′     5′-d(CAAACAAACCACA)-3′   5′-(CAAACAAACCACA)-3′   5′-d(GGTGGTTTGTTTG)-3′   5′-d(CAAACAAACCACA)-3′   5′-(CAAACAAACCACA)-3′   d(GGTGGTTTGTTTG)-3′   5′-d(CAAACAAACCACA)-3′   5′-(CAAACAAACCACA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′       39   39A     40   40A     41   41A     42   43     44   45     46   47       31   32     40   50     67   85       47   52     57   70     83   ＞93     36   32     36   32     34   40       55       67       ＞90
表1(续)  寡聚物 靶   Tm   No.   Tm(℃)   Na2HPO4/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/NaCl/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/TMAC  5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(AAAACAAAA)-3′   5′-d(AAAAGAAAA)-3′   5′-d(AAAATAAAAA)-3′   5′-d(GTGAAATGC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-d(GCATTTCAC)-3′   5′-d(GCATGTCAC)-3′   5′-d(GCATCTCAC)-3′   5′-d(GTGAMeCATGC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-d(GTGAMeCATGC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-d(GCATTTCAC)-3′     5′-d(GCATGTCAC)-3′   5′-d(GCATCTCAC)-3′     48   49     50   51     52   53   54   55   56     57   58   59   60     61     63   64     65   66     42   52     47   53     80   70   63   55   65     26   45   23   25     ＜15     32     27   53   32
表1(续)  寡聚物 靶   Tm   No.   Tm(℃)   Na2HPO4/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/NaCl/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/TMAC  5′-d(GTGACATGC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-d(GCATGTCAC)-3′   5′-d(GTGATATGMeC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-d(GCATGTCAC)-3′   5′-(GCAUAUCAC)-3′   5′-(GCAUCUCAC)-3′   5′-d(CACTATACG)-3′   5′-d(GTGTTTTGC)-3′   5′-d(GCAAAACAC)-3′     67   69     71   73   75   76   77     78     32   52     64   52   74   60   40     52
表2
单体V  寡聚物 靶   Tm   No.   Tm(℃)   Na2HPO4/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/NaCl/EDTA   Tm(℃)  Na2HPO4/TMAC  5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAGAAAAAAA)-3′   5′-d(GTGATATGC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-(GCAUAUCAC)-3′     32   27     31   28     30   23     23   31     23   16     ＜10   42   37     26   27
表3
单体X  寡聚物 靶   Tm   No.   Tm(℃)   Na2HPO4/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/NaCl/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/TMAC  5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAA)-3  5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3  5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′     23   23     19   23     9   15     5   14
表4
单体Y  寡聚物 靶   Tm   No.   Tm(℃)   Na2HPO4/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/NaCl/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/TMAC  5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-d(TTTTTTTTTTTTTT)-3′   5′-d(AAAAAAAAAAAAAA)-3′   5′-(AAAAAAAAAAAAAA)-3′     36   37     35   37     35   36     32   33     36   36     58   58
表4(续)
单体Y  寡聚物 靶   Tm   No.   Tm(℃)   Na2HPO4/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/NaCl/EDTA   Tm(℃)   Na2HPO4/TMAC  5′-d(GTGATATGC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-(GCAUAUCAC)-3′   35   35
表5
单体Z   寡聚物   靶   Tm   No.   解链温度(Tm/℃)   Y＝A   Y＝C   Y＝T   Y＝G  5′-r(GTGATATGC)-3′   5′-r(GUGAUAUGC)-3′   5′-r(GTGATATGC)-3′   5′-r(GUGAUAUGC)-3′  5′-d(GCATYTCAC)-3′   5′-d(GCATYTCAC)-3′   5′-r(GCAUYUCAC)-3′   5′-r(GCAUYUCAC)-3′   1   2   3   4   55   27   63   38   34   ＜10   45   22   38   ＜10   -   -   37   ＜10   -   -
表6
单体Z  寡聚物  靶   Tm   No.   解链温度(Tm/℃)  5′-d(GTGATATGC)-3′   5′-d(GTGATATGC)-3′   5′-d(GTGATATGC)-3′   5′-d(GTGATATGC)-3′   5′-r(GTGATATGC)-3′   5′-(GTGATATGMeC)-3′  5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   1   2   3   4   5   6   28   44   40   63   74   85
表7
单体Z(全一硫代磷酸酯寡核苷酸)  寡聚物  靶   Tm   No.   解链温度(Tm/℃)  5′-d(GSTSGSASTSASTSGSC)-3′     5′-d(GSTSGSASTSASTSGSC)-3′   5′-d(GSTSGSASTSASTSGSC)-3′   5′-d(GSTSGSASTSASTSGSC)-3′  5′-d(GCATATCAC)-3′     5′-r(GCAUAUCAC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-r(GCAUAUCAC)-3′   1     2   3   4     21   17   41   47
表8
单体硫代-Z(US)  寡聚物  靶   Tm   No.   解链温度(Tm/℃)  5′-d(GTGAUsATGC)-3′     5′-d(GTGAUsATGC)-3′   5′-d(GUsGAUsAUsGC)-3′   5′-d(GUsGAUsAUsGC)-3′   5′-d(GTGTTTTGC)-3′   5′-d(GUsGUsUsUsUsGC)-3′  5′-d(GCATATCAC)-3′     5′-(GCAUAUCAC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-(GCAUAUCAC)-3′   5′-(GCAAAACAC)-3′   5′-d(GCAAAACAC)-3′   1     2   3   4   5   6     34   36   42   52   27   51
表9
单位氨基-Z(TNH)和甲基氨基-Z(TNMe)  寡聚物  靶   Tm   No.  解链温度(Tm/℃)  5′-d(GTGATNHATGC)-3′   5′-d(GTGATNHATGC)-3′   5′-d(GTNHGATNHATNHGC)-3′     5′-d(GTNHGATNHATNHGC)-3′   5′-d(GTGATNMeATGC)-3′   5′-d(GTGATNMeATGC)-3′   5′-d(GTNMeGATNMeATNMeGC)-3′   5′-d(GTNMeGATNMeATNMeGC)-3′   5′-d(GTNMeGTNHTNMeTNHTNMeGC)-3′   5′-d(GTNMeGTNHTNMeTNHTNMeGC)-3′  5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-(GCAUAUCAC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′     5′-(GCAUAUCAC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-(GCAUAUCAC)-3′   5′-d(GCATATCAC)-3′   5′-(GCAUAUCAC)-3′   5′-d(GCAAAACAC)-3′   5′-(GCAAAACAC)-3′   1   2   3     4   5   6   7   8   9   10   33   34   39     47   33   36   39   49   47   63
表10   步骤   T9寡聚物   A260单位   T16寡聚物   A260单位   LNAT9寡聚物   A260单位   无寡聚物   对照   加入的poly(rA)   5.0/5.0   5.0/5.0   5.0/5.0   5.0/5.0   透过的poly(rA)   1.75/1.61   1.84/1.78   1.83/1.82   5.09/5.14   ∴结合的聚(rA)   3.25/3.39   3.16/3.22   3.17/3.18   0.0/0.0   ％结合的聚(rA)   65.0％/67.8％   63.2％/64.4％   63.4％/63.6％   0.0％/0.0％   低盐洗涤/洗脱液   0.24/0.24   0.11/0.12   .053/.055   0.14/0.13   室温下TE洗脱15分钟   2.37/2.72   0.83/0.93   0.02/0.04   0.01/0.02   室温下TE洗脱过敏   0.38/0.37   1.76/1.69   0.11/0.07   .003/.004   65℃TE洗脱30分钟   .047/.040   0.38/0.46   1.62/1.70   .005/.004   10mM Tris pH 10洗脱液   .002/.002   0.03/0.03   0.10/0.10   0.01/0.01   1mM HCl pH 4.0洗脱液   0.07/0.06   0.06/0.04   0.26/0.23   0.01/0.01   回收的平均A260   3.20   3.14   2.18   -   回收的平均％A260   96.4％   98.4％   68.7％   -