具有治疗作用的癌症成像：治疗诊断学
阅读：572发布：2020-05-12
专利汇可以提供具有治疗作用的癌症成像：治疗诊断学专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了包含报告基因的基因构建体，所述报告基因被可操作地连接于癌症特异性的或者癌症选择性的启动子（比如进展升级基因-3（PEG-3）启动子），它们可用于癌症成像、 癌症 治疗 、以及组合成像和 治疗方案 的方法。还提供了其中报告基因被连接于癌症特异性的或者癌症选择性的启动子的转基因动物，该动物可以通过进一步基因工程化而被繁殖或者选择成具有发展癌症的倾向。，下面是具有治疗作用的癌症成像：治疗诊断学专利的具体信息内容。
1.一种在个体中使肿瘤或者癌症细胞或组织成像的方法，包括下述步骤：
将包含成像报告基因的核酸构建体给药于所述个体，所述成像报告基因被可操作地连接于癌症特异性的或者癌症选择性的启动子；
将显像剂给药于所述个体，所述显像剂与所述成像报告基因互补；以及
通过检测来自所述显像剂的可检测信号，使所述个体中的肿瘤或者癌症组织或细胞成像。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成像报告基因选自于由荧光素酶和单纯疱疹病毒1胸苷激酶（HSV1-tk）所构成的组。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成像报告基因是HSV1-tk，所述个体是癌症病人。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述显像剂是放射性标记的核苷类似物。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述放射性标记的核苷类似物是2'-氟-2'
125
脱氧-β-D-5-[ I]碘尿嘧啶-阿拉伯呋喃糖苷。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成像步骤是通过单光子发射计算机化断层显像（SPECT）或者通过正电子发射成像术（PET）进行的。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成像报告基因是荧光素酶，并且所述个体是实验室动物。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述显像剂是荧光素酶底物。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸构建体存在于具有阳离子聚合物的复合物中。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述阳离子聚合物是聚乙烯亚胺。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述给药核酸构建体的步骤是通过静脉注射进行的。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述肿瘤、癌症组织或细胞包括选自下组类型的癌细胞：乳腺癌、黑素瘤、原发部位不明癌（CUP）、成神经细胞瘤、恶性神经胶质瘤、子宫颈癌、结肠癌、肝癌（hepato carcinoma）、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、以及前列腺癌。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸构建体存在于质粒中。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸构建体存在于病毒载体中。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述病毒载体是有条件地有复制能力的腺病毒。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述癌症特异性的或者癌症选择性的启动子是进展升级基因-3（PEG-3）启动子。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，系统地执行所述给药步骤中的至少一个步骤。
18.一种同时成像和治疗个体中的肿瘤、或者癌症组织或细胞的方法，包括下述步骤：
将一种以上包含成像报告基因和编码抗肿瘤试剂基因的核酸构建体给药于所述个体，所述成像报告基因被可操作地连接于癌症特异性的或者癌症选择性的启动子；
将显像剂给药于所述个体，所述显像剂与所述成像报告基因互补；以及
通过检测来自所述显像剂的可检测信号，使所述个体中的肿瘤或者癌症组织或细胞成像，其中，编码所述抗肿瘤试剂的所述基因被所述肿瘤或者癌症组织或细胞中的细胞表达以便作用于所述细胞。
19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述编码抗肿瘤试剂基因被可操作地连接于串联基因表达元件。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述串联基因表达元件是内部核糖体进入位点（IRES）。
21.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述编码抗肿瘤试剂基因被可操作地连接于癌症特异性的或者癌症选择性的启动子。
22.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述抗肿瘤试剂是mda-7/IL-24。
23.如权利要求18所述的方法，其特征在于，系统地执行所述给药步骤中的至少一个步骤。
24.一种适合于系统性给药的癌症选择性的或者癌症特异性的成像系统，其包括含有成像报告基因的核酸构建体，所述成像报告基因被可操作地连接于癌症特异性的或者癌症选择性的启动子。
25.如权利要求24所述的癌症选择性的或者癌症特异性的成像系统，其特征在于，所述癌症特异性的或者癌症选择性的启动子是PEG-PROM。
26.一种转基因动物，其通过基因工程而包含并且表达被连接于癌症特异性或者癌症选择性启动子的报告基因。
27.如权利要求26所述的转基因动物，其特征在于，所述转基因动物也被预先安排为发展癌症。
具有治疗作用的癌症成像：治疗诊断学
技术领域
背景技术
[0002] 癌症的目标成像保留了重要、但是易忘的目标。这样的成像可能提供早期诊断、检测转移、协助性治疗计划和有益的治疗监控。通过平衡肿瘤的特定分子特征的扩展列表和它们的微环境，分子成像也有产生肿瘤特异性试剂的潜能。但在肿瘤特异性成像处的许多努力都伴随着假定标靶试剂的非特异性定位，引起不可接受的高本底噪声。
[0003] 虽然研究者采用了许多策略来提供肿瘤特异性显像剂，主要在保持较高的标靶背景比（target-to-background ratio）的服务中，但它们落入了两个普通类型，即直接方法1
和间接方法 。直接方法采用这样一种试剂：通常通过直接地结合靶蛋白质，可直接地报告特定参数比如受体、转运蛋白或酶的浓度。间接方法采用报告转基因策略，和绿色荧光蛋白（GFP）在体外的应用类似，通过利用外部图像设备，可提供在体内发生的细胞代谢过程的读出。分子基因成像使用间接技术，已经能显象和定量多种与体内疾病进程和治疗有关的基
2 3 4,5
因启动子、转录因子和关键酶包括Gli、E2F1、端粒酶 、以及数种激酶的活性，包括已经证
6,7
明可用于人类基因治疗实验 。令人遗憾地，迄今为止，这些技术都不能提供显像剂的足够的特异性定位，并且不可接受的高本底噪声仍然占优势。
和间接方法 。直接方法采用这样一种试剂：通常通过直接地结合靶蛋白质，可直接地报告特定参数比如受体、转运蛋白或酶的浓度。间接方法采用报告转基因策略，和绿色荧光蛋白（GFP）在体外的应用类似，通过利用外部图像设备，可提供在体内发生的细胞代谢过程的读出。分子基因成像使用间接技术，已经能显象和定量多种与体内疾病进程和治疗有关的基
2 3 4,5
因启动子、转录因子和关键酶包括Gli、E2F1、端粒酶 、以及数种激酶的活性，包括已经证
6,7
明可用于人类基因治疗实验 。令人遗憾地，迄今为止，这些技术都不能提供显像剂的足够的特异性定位，并且不可接受的高本底噪声仍然占优势。
[0004] 在过去的几十年，癌症治疗也已经取得了显著进展。然而，它们仍然受到抗肿瘤试剂对正常细胞的非特异性释药的阻碍，对于病人来说导致可怕的副作用。由于需要以聚焦方式将活性试剂释放至它们最被需要的地方（即只是癌症细胞处）的能力，因此特异性的缺乏也导致治疗的效力低。
[0005] 美国专利No.6,737,523（Fisher et al.）描述了一种进展升级基因-3（progression elevated gene-3）（PEG-3）启动子，其对于针对在癌细胞中基因表达是特异的，此将其全部内容并入本文作为参考。该专利描述了应用启动子来以特异性方式在癌细胞中表达所关注的基因。然而，未讨论成像和组合成像以及治疗。
[0006] 美国专利申请No.2009/0311664描述了使用病毒载体进行的癌细胞的检测和成像，所述病毒载体有条件胜任仅在癌细胞中表达报告基因。然而，该技术未在体内使用，未讨论成像和治疗的组合方法，并且仅详细讨论了疱疹病毒和牛痘病毒。
[0007] 一直需要开发出改进的对癌细胞高度特异的癌症成像和治疗方法，其可方便病人和医生具有可利用单一方法中合并了癌症成像手段和治疗癌症的治疗性手段的方法。
发明内容
[0008] 本发明一般涉及基因构建体和它们用于i）癌症成像、ii）癌症治疗；以及iii）组合治疗和成像的方法。组合治疗和成像在此可以被称为对癌症的“治疗诊断（theranostic）”方法。在该方法中使用的基因构建体包含在癌细胞中为特异性或者选择性活性的启动子。这些启动子可以在此被称作“癌症启动子”或者“癌症特异性（的）/选择性（的）启动子”或者简单地称作“特异性（的）/选择性（的）启动子”。由于这些启动子提供的特异性，包括本发明的构建体的组合物可能被有利地系统地给药于需要癌症成像或者癌症治疗、或同时需要两者的个体。
[0009] 本发明的治疗方面提供了一种高水平的抗肿瘤试剂对癌细胞的精确释药，即使当释药被系统地产生时，因为与该方法有关的抗肿瘤试剂仅在癌细胞内部被表达。这有利地导致对于通过该方法治疗的病人来说极少的副作用或没有副作用。
[0010] 类似地，本发明的成像方面提供了一种具有很少有或者没有背景信号的高水平的癌细胞和肿瘤的精确成像。重要的是，因为很少有或者没有背景“噪音”，所以本发明的成像技术能够容易地检测转移性的癌症，甚至检测用其他方法检不出的转移性癌症（即由于例如非常小尺寸的新发展的肿瘤、或者癌细胞的扩散模式实际上没有形成肿瘤而检不出）。因为本领域技术人员熟知，肿瘤的早期检测能够显著地改进肿瘤治疗的结果。类似地，在形成肿瘤之前患癌症组织的检测将提供显著的益处。
[0011] 组合成像和治疗方法在许多方面比现有技术领域有利。合并成像和治疗的方法是更有效率，并且要求较少的工序，因此就病人和癌症专家而言较省力。因为活性限制在癌细胞，故副作用减少。另外，组合成像和治疗方法提供了精确地监控在前治疗效果的能力，附随地提供治疗，这就为癌症治疗专家提供了一种无法估价的和精确的治疗进展窗口，允许治疗性的参数在与治疗紧密结合中精细调谐。
[0012] 另外，本发明提供了转基因动物，已经通过基因工程而包含编码报告基因的核苷酸序列，所述报告基因被可操作地连接于癌症特异性的或者癌症选择性的启动子。并且本发明提供它们用于治疗临床评估的用途。在一些实施方式中，转基因动物具有发展癌症的倾向。
[0013] 本发明的目的在于提供一种在个体中使肿瘤或者癌症细胞或组织成像的方法。该方法包括下述步骤：1）将包含成像报告基因的核酸构建体给药于所述个体，所述成像报告基因被可操作地连接于癌症特异性的或者癌症选择性的启动子；2）将显像剂给药于所述个体，所述显像剂与所述成像报告基因互补；以及3）通过检测来自所述显像剂的可检测信号，在所述个体中使肿瘤或者癌症组织或细胞成像。在一些实施方式中，成像报告基因选自下组：荧光素酶和单纯疱疹病毒1胸苷激酶（HSV1-tk）；所述个体可以是癌症病人。显像125
剂可以是放射性标记的核苷类似物2'-氟-2'脱氧对D-5-[ I]碘尿嘧啶阿拉伯呋喃糖苷（arabinofuranoside）。可以通过单光子发射计算机化断层显像（SPECT）或者通过正电子发射成像术（PET）进行成像步骤。成像报告基因可以是荧光素酶，并且所述个体是实验动物，而在这样情况下显像剂是荧光素酶底物。在一些实施方式中，核酸构建体存在于具有阳离子聚合物比如聚乙烯亚胺的复合物（polyplex）中。上述给药步骤中的一个或者两个可以系统地进行。给药核酸构建体的步骤可以通过静脉注射进行。在一些实施方式中，肿瘤、癌症组织或细胞包括选自下组类型的癌细胞：乳腺癌、黑素瘤、原发部位不明癌（CUP）、成神经细胞瘤、恶性神经胶质瘤、子宫颈癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、以及前列腺癌。
在一些实施方式中，核酸构建体存在于质粒中。在其他实施方式中，核酸构建体存在于病毒载体中，比如存在于条件地有复制能力的腺病毒中。在一些实施方式中，癌症特异性的或者癌症选择性的启动子是进展升级基因-3（progression elevated gene-3，PEG-3）启动子。
剂可以是放射性标记的核苷类似物2'-氟-2'脱氧对D-5-[ I]碘尿嘧啶阿拉伯呋喃糖苷（arabinofuranoside）。可以通过单光子发射计算机化断层显像（SPECT）或者通过正电子发射成像术（PET）进行成像步骤。成像报告基因可以是荧光素酶，并且所述个体是实验动物，而在这样情况下显像剂是荧光素酶底物。在一些实施方式中，核酸构建体存在于具有阳离子聚合物比如聚乙烯亚胺的复合物（polyplex）中。上述给药步骤中的一个或者两个可以系统地进行。给药核酸构建体的步骤可以通过静脉注射进行。在一些实施方式中，肿瘤、癌症组织或细胞包括选自下组类型的癌细胞：乳腺癌、黑素瘤、原发部位不明癌（CUP）、成神经细胞瘤、恶性神经胶质瘤、子宫颈癌、结肠癌、肝癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、以及前列腺癌。
在一些实施方式中，核酸构建体存在于质粒中。在其他实施方式中，核酸构建体存在于病毒载体中，比如存在于条件地有复制能力的腺病毒中。在一些实施方式中，癌症特异性的或者癌症选择性的启动子是进展升级基因-3（progression elevated gene-3，PEG-3）启动子。
[0014] 本发明还提供了一种同时成像和治疗个体中的肿瘤、或者癌症组织或细胞的方法。该方法包括下述步骤：
[0015] 1）将一种以上包含成像报告基因和编码抗肿瘤试剂基因的核酸构建体给药于所述个体，所述成像报告基因被可操作地连接于癌症特异性的或者癌症选择性的启动子；
[0016] 2）将显像剂给药于所述个体，所述显像剂与所述成像报告基因互补；以及[0017] 3）通过检测来自所述显像剂的可检测信号，使所述个体中的肿瘤或者癌症组织或细胞成像，其中，编码所述抗肿瘤试剂的所述基因被所述肿瘤或者癌症组织或细胞中的细胞表达以便作用于所述细胞。在一些实施方式中，所述给药步骤中的至少一个、可能两个可以系统地进行。在一些实施方式中，所述编码抗肿瘤试剂基因被可操作地连接于串联基因表达元件，例如，内部核糖体进入位点（IRES）。在其他实施方式中，编码抗肿瘤试剂的基因被可操作地连接于癌症特异性的或者癌症选择性的启动子。抗肿瘤试剂可以是mda-7/lL-24。
[0018] 本发明还提供了一种癌症特异性的或者癌症选择性的基因表达成像系统，其包括含有成像报告基因的核酸构建体，所述成像报告基因被可操作地连接于癌症特异性的或者癌症选择性的启动子。在一些实施方式中，癌症特异性的或者癌症选择性的启动子是PEG-PROM。在一些实施方式中，该系统适合于系统给药。
[0020] 图1A和图1B.PEG-Prom介导的报告基因表达系统。图A：含有受控于PEG-Prom下的荧光虫荧光素酶（Luc）编码基因的pPEG-Luc的构建体示图；图B：具有在PEG-Prom下游的HSV1-tk编码基因的pPEG-HSVltk的构建体示图。
[0021] 图2A-图2C.在人类黑素瘤转移（Mel）实验模型中通过生物发光成像（BLI）显示的癌症特异性的PEG-Prom活性。在pPEG-Luc/EI复合物的静脉内（IV）释药之后48h时得到了图像。每一个动物都被从四个方向（V，腹部的；L，左侧；R，右侧；D，背视图）成像，以便覆盖整个身体。来自两个组的伪彩色图像被调节成相同的阈值。在黑素瘤转移模型中具体地观察到生物发光信号。图A：在注射pPEG-Luc/PEI复合物后24h和48h在对照组（Ctrl）和Mel组中BLI信号强度的定量。对于所有四个位置，在获得的每个图像上绘画所关注的区域（ROIs），跨越动物的胸腔。以总流量（光子每秒，p/s）为单位显示定量数值。***P<0.0001；图B和图C：来自对照组（B）和黑素瘤转移组（C）的一个代表性动物的肺的CT扫描和大体解剖图（gross anatomical view）。黑色箭头表示在肺中观察到的转移性瘤。图3A-图3B.在人类乳腺癌转移（BCa）实验模型中通过BLI显示的癌症特异性的PEG-Prom活性。来自对照组和实验性乳腺癌转移组一个代表性动物的BLI。在pPEG-Luc/PEI复合物的IV释药之后48h时获得了图像。每一个小鼠都被从四个方向（V，腹部的；L，左侧；R，右侧；D，背视图）成像。来自两个组的伪彩色图像被调节成相同的阈值。图A：从每个方向获得的在跨越动物胸腔绘画的ROIs中测量的生物发光信号强度的定量。以总流量（p/s）为单位表达定量强度。**P=0.0066。图B：来自有代表性的人类乳腺癌转移模型的肺的CT图像和肉眼观察的视图。黑色箭头表示在肺中观察到的转移性瘤。
[0022] 图4.基因释药至肺的效率的组间比较。在BLI开始48h后，在每个动物的肺组织中pPEG-Luc的绝对量通过定量实时PCR被定量。图A：CT数值对Log ng pDNA（pPEG-Luc）的标准曲线图。图B：使用标准曲线方法绘制的pDNA释药至肺的效率的绝对定量。虽然没有观察到在对照和人类黑素瘤转移（Mel）实验模型之间的显著差异，但乳腺癌转移模型（BCa）具有与对照相比显著更低的转染效率。误差柱图代表平均值±s.e.m.（对于对照，n=3；对于Mel，n=3；对于BCa，n=4）（NS，没有显著差异；*p=0.0345）。
[0023] 图5A和图5B.在健康对照组（Ctrl）和实验性黑素瘤转移（Mel）组中组成性CMV启动子活性的比较。图A：来自对照组和Mel组的一个代表性动物的系列BLI。该图像是在pCMV-Tri/PEI复合物的系统释药之后8h、24h和45h获得的。按照“方法”部分中描述的方法产生动物模型和pDNA/PEI复合物。两个组的伪彩色图像被调节成相同的阈值。图B：在跨越动物胸腔绘画的ROIs中测量的生物发光信号强度的定量。在任何时间点都没有观察到在对照组和Mel组之间CMV启动子活性的显著差异。误差柱图代表平均值±SEM（对于对照，n=3；对于Mel，n=3）。
[0024] 图6A-图6C.在人类黑素瘤转移（Mel）实验模型中通过SPECT-CT成像显示的由PEG-Prom驱动的HSV1-tk的癌症特异性表达。图A和图C：在健康对照组（图A，n=3；对照，125
1-3）和黑素瘤转移模型（图C，n=5；Mel，1-5）中肺的CT、SPECT和图像融合的[ I]FIAU SPECT-CT图像。在[I]FIAU的IV注射后48h,即在pPEG-HSVltk/PEI复合物IV给药后
94h,获得图像。图B：在图A和C中的肺SPECT图像的定量。在每个动物的肺的右叶中绘画相同大小与形状的ROIs。定量放射性被表达为平均值%ID/g（每克组织的注射剂量平均百分率）。**P=0.0070。
1-3）和黑素瘤转移模型（图C，n=5；Mel，1-5）中肺的CT、SPECT和图像融合的[ I]FIAU SPECT-CT图像。在[I]FIAU的IV注射后48h,即在pPEG-HSVltk/PEI复合物IV给药后
94h,获得图像。图B：在图A和C中的肺SPECT图像的定量。在每个动物的肺的右叶中绘画相同大小与形状的ROIs。定量放射性被表达为平均值%ID/g（每克组织的注射剂量平均百分率）。**P=0.0070。
[0025] 图7A-图7D.通过SPECT-CT成像检测并定位在系统给药pPEG-HSVltk之后的黑素瘤转移块。来自图6C的Mel-2（图A）和Mel-3（图B、C和D）的图像融合SPECT-CT成像125
的横向的、冠状和矢状视图。在[ I]FIAU注射后24h,即在pPEG-HSVltk/PEI复合物IV给药后70h，获得所有图像。以图A、B、C和D中的SPECT-CT成像为基础定位转移块的大体解剖细节。通过在Mel-2中的SPECT-CT成像（图A，有斑点的圆圈），检出多个转移位点。对应区域的尸体解剖显示了在上背部区域中在棕色脂肪组织下面的黑素瘤块。图B：邻近胸部中脊柱朝向左侧（白色箭头），对应于在该位置处的肿瘤块，检测累积放射性。通过SPECT-CT成像显示的附加的转移位点被显示在图C和D中（白色箭头和有斑点的圆圈）。黑素瘤被立刻揭开上面的隔膜（f，白色有斑点的圆圈），并且在左侧腹股沟淋巴结中，与图C和D相关联。受PEG-Prom调节的成像的大体比较和在乳腺癌转移模型BCa-1中的FDG-PET。在心脏
125
附近通过[ I]FIAU-SPECT检测两个瘤（Tu-1和Tu-2），并且通过尸体解剖来证实。虽然通
125
过两种方法检测Tu-1，但连接于心脏的更小的瘤Tu-2在PET成像中不明显。在[ I]FIAU注射后48h，即在pPEG-HSV1tk/PEI释药后94h，获得SPECT图像。与获得SPECT数据同一天获得该PET图像。
的横向的、冠状和矢状视图。在[ I]FIAU注射后24h,即在pPEG-HSVltk/PEI复合物IV给药后70h，获得所有图像。以图A、B、C和D中的SPECT-CT成像为基础定位转移块的大体解剖细节。通过在Mel-2中的SPECT-CT成像（图A，有斑点的圆圈），检出多个转移位点。对应区域的尸体解剖显示了在上背部区域中在棕色脂肪组织下面的黑素瘤块。图B：邻近胸部中脊柱朝向左侧（白色箭头），对应于在该位置处的肿瘤块，检测累积放射性。通过SPECT-CT成像显示的附加的转移位点被显示在图C和D中（白色箭头和有斑点的圆圈）。黑素瘤被立刻揭开上面的隔膜（f，白色有斑点的圆圈），并且在左侧腹股沟淋巴结中，与图C和D相关联。受PEG-Prom调节的成像的大体比较和在乳腺癌转移模型BCa-1中的FDG-PET。在心脏
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附近通过[ I]FIAU-SPECT检测两个瘤（Tu-1和Tu-2），并且通过尸体解剖来证实。虽然通
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过两种方法检测Tu-1，但连接于心脏的更小的瘤Tu-2在PET成像中不明显。在[ I]FIAU注射后48h，即在pPEG-HSV1tk/PEI释药后94h，获得SPECT图像。与获得SPECT数据同一天获得该PET图像。
[0026] 图8.通过受体内jetPEITM调节的系统释药来评估pDNA转染至骨和脑的效率。(图A、B：通过使用定量实时PCR、采用标准曲线，进行释放至骨和脑的pDNA量的绝对定量。在pPEG-Luc/PEI复合物系统释药进入雌性NCR nu/nu小鼠（Charles River）后24h和48h，与作为阳性对照的肺一起收集骨髓、股骨、膝关节和髋关节以及脑，从新鲜解冻的组织提取总的DNA。以ngpDNA（图A）为单位、以pDNA拷贝数每100ng总DNA（图B）为单位来定量释入每个器官的pPEG-Luc绝对量。误差柱图代表平均值±s.e.m.（n=3/每个时间点）。*股骨：在从股骨中除去骨髓后，仅股骨皮层骨被用于总DNA的提取。
[0027] 图9.使用BLI分析了双重转基因（MMTV-neu/PEG-Prom-Luc；MnPp-Luc）的小鼠的荧光素酶表达。被麻痹的小鼠被腹膜内注射3mg/小鼠荧光素（Xenogen公司，Alameda，加利福尼亚州）并且成像。顶部画面：MMTV-neu/PEG-Prom-Luc（MnPp-Luc）小鼠；MMTV-neu小鼠。
[0028] 图10A-图10E.PEG-Prom启动子。图A，2.0kb的PEG-3启动子（SEQ ID NO:1）；图B，示例性的最小启动子（SEQ ID NO：2）；图C，PEA3蛋白质结合序列；图D，TATA序列；图E，API蛋白质结合序列。
具体实施方式
[0029] 本发明的具体实施方式提供了核酸基因构建体和它们用于癌症成像、癌症治疗、以及用于组合成像和治疗的方法。设计用于治疗的构建体一般包含癌症特异性的启动子和编码治疗剂（例如，其表达对癌细胞不利的蛋白质或者多肽）的、被可操作地连接于该癌症特异性的启动子的重组基因。因此，即使当构建体被系统地给药时，发生癌细胞的靶向杀灭。设计用于成像的构建体包含癌症特异性的启动子和编码报告分子的、被可操作地连接于该癌症特异性的启动子的重组基因。该报告分子或者依靠自身性能可检测，并且因此当其在癌细胞中被表达时致使癌细胞可检测；或者该报告分子能够由于相互作用而与“补体”相关联、或者互相作用，所以是可检测的、或者由于该相互作用而变得可检测。因为报告分子仅在癌细胞中被表达，所以编码报告分子和报告分子补体的构建体能够被安全地系统地给药：尽管报告分子和补体两者广泛地分布在个体的整个身体，但补体仅在癌细胞内部会遇到报告分子并且与其互相作用，在一些应用中，还可以使用直接注射入肿瘤的方法。在一些实施方式中，报告分子-补体关系导致成像潜力和癌细胞死亡性。在下文中详细地讨论这些构建体和方法、以及它们的不同组合和转换。
[0030] 启动子
[0031] 本发明的构建体包括至少一个可转录的元件（例如由核酸序列组成的基因），该元件被可操作地连接或者接合于启动子，所述启动子可特异性地或者选择性地驱动癌细胞内部的转录。可转录元件的表达可以是可诱导的或者组成性的。可以使用的合适的癌症选择性的/特异性的启动子（和或启动子/增强子序列）包括但不限于：PEG-Prom，星形细胞升级基因1（astrocyte elevated gene1）（AEG-1）启动子，存活蛋白-Prom，人类端粒酶逆转录酶（hTERT）-Prom，缺氧诱导性启动子（HIF-1-α），DNA损伤诱导性启动子（例如GADD启动子），与转移有关的启动子（金属蛋白酶、胶原酶等），血浆铜蓝蛋白启动子（Lee et al.,Cancer Res.，2004年3月1日,64；1788），粘蛋白-1启动子比如DF3/MUC1（参见美国专利No7,247,297），如美国专利申请No.2001/00111128中描述的HexII启动子；前列腺特异性的抗原增强子/启动子（Rodriguez et al.,Cancer Res.,）；α-胎蛋白基因启动子（Hallenbeck et al.,Hum Gene Ther.,10：1721-1733,1999）；表面活性剂蛋白质B基因启动子（Doronin et al.,J.Virol.,75：3314-3324,2001）；MUC1启动子（Kurihara et al.,J.Clin.Investig.,106：763-771,2000）；根据美国专利No.8,034,914的H19启动子；在美国专利No.7,816,131、6,897,024、7,321,030、7,364,727及其它中描述的那些启动子等，以及它们的衍生物形式。可以在本发明实践中使用任何对驱动基因仅在癌细胞中表达特异的启动子，或者任何可选择性用于驱动基因仅在癌细胞中、或者至少在特定类型癌症的细胞中表达（从而治疗并且显像前列腺癌、结肠癌、乳腺癌等原发性和转移性癌症）的启动子。述及“对驱动基因在癌细胞中表达特异（的）”，我们是指这样的启动子：当被可操作地连接于基因时，其仅当位于癌症的恶性的细胞内部时具有促进基因转录的作用、当位于正常的非癌症的细胞内部时不具有促进基因转录的作用。述及“选择性（用于）驱动基因在癌细胞中表达（的）”，我们是指这样的启动子：当其被可操作地连接于基因时，其当位于癌细胞内部时，与当位于非癌症细胞内部时相比，具有在更大程度上促进基因转录的作用。例如，当启动子位于癌症细胞内部时，当使用已为本领域的技术人员所熟知的标准基因表达测量技术进行测量时，该启动子驱动基因表达的表达量是当该启动子位于非癌症细胞内部时基因表达量的大约2倍、或者大约3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或者10倍、甚至大约20倍、或者30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或者100倍以上（例如500-1000倍）。
[0032] 在一种实施方式中，启动子是PEG-Prom启动子（参见图10A，SEQ ID NO:1）或其功能性衍生物。该启动子例如在美国专利No.6,737,523中被详细描述，在此将该专利引入本文以供参考。在优选的实施方式中，使用“最小的”PEG-Prom启动子，即包括下述核苷酸序列的最小启动子：PEA3蛋白质结合核苷酸序列（图10C，SEQ ID NO：1的核苷酸1507-1970），TATA序列（例如图10D，SEQ ID NO：1的核苷酸1672-1677），以及API蛋白质结合核苷酸序列（图10E，SEQ ID NO：1的核苷酸1748-1753），例如图10B中描述的序列（SEQ ID NO:2），如美国专利No.6,737,523中描述的序列。还包括使用显示出与PEG-PROM启动子序列和最小PEG-PROM启动子序列的同源性的核苷酸序列，该核苷酸序列具有至少大约50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、或99%的同源性，所述同源性是通过本技术领域已知的标准核苷酸序列比较程序测定的。
[0033] 载体
[0034] 本发明的具体实施方式还包括含有在此描述的构建体的载体，并且包括病毒载体和非病毒载体。例举的可以被使用的非病毒载体包括但不限于，例如：柯斯质粒或者质粒；以及特别地用于克隆大核酸分子的、细菌的人工染色体载体（BACs）和酵母的人工染色体载体（YACs）；以及脂质体（包括被靶向的脂质体在内）；阳离子聚合物；被配体共轭的脂质复合物；聚合物-DNA复合物；聚L-赖氨酸-molossin-DNA复合物；壳聚糖-DNA纳米颗粒；聚乙烯亚胺（PEI，例如支链PEI）-DNA复合物；各种纳米颗粒和/或纳米壳体比如多功能的纳米颗粒、金属纳米颗粒或者壳体（例如，荷正电、荷负电或者荷中性电的黄金颗粒、硒化镉等）；
受超声波调节的微泡释药系统；各种树状聚体（例如聚亚苯基）和基于聚（酰胺基胺）的树状聚体；等等。
受超声波调节的微泡释药系统；各种树状聚体（例如聚亚苯基）和基于聚（酰胺基胺）的树状聚体；等等。
[0035] 另外，可以使用病毒载体。例举的病毒载体包括但不限于：噬菌体、各种杆状病毒、反向病毒等。本领域的技术人员熟悉可在“基因治疗”应用中使用的病毒载体包括但不限于：单纯疱疹病毒载体（Geller et al.,Science,241:1667-1669（1988））；牛痘病毒载体（Piccini etal.,Meth.Enzymology,153:545-563（1987））；巨细胞病毒载体（Mocarski et al.,Viral Vectors,Y.Gluzman and S.H.Hughes编辑,冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1988、第78-84页））；莫洛尼鼠科白血病毒载体（Danos et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:6460-6464（1988）；Blaese et al.,Science,270:475-479（1995）；Onodera et al.,J.Virol.,72：1769-1774（1998））；腺病毒载体（Berkner,Biotechniques,6:616-626（1988）；Cotten et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:6094-6098（1992）；Graham et al.,Meth.Mol.Biol.,7:109-127（1991）；Li et al.,Human Gene Therapy,4:403-409（1993）；Zabner et al.,Nature Genetics,6:75-83（1994））；腺病毒相关病毒载体（Goldman et al.,Human Gene Therapy,10:2261-2268（1997）；Greelish et al.,Nature Med,5:439-443（1999）；Wang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96:3906-3910（1999）；Snyder et al.,Nature Med.,5:64-70（1999）；Herzog et al.,Nature Med.,5:56-63（1999））；反向病毒载体（Donahue et al.,Nature Med.,4:181-186（1998）；Shackleford et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:9655-9659（1988）；美国专利No.4,405,712、4,650,764和5,252,479、以及WIPO公开的WO92/07573、WO90/06997、WO89/05345、WO92/05266和WO92/14829；以及慢病毒载体（Kafri et al.,Nature Genetics,17:314-317（1997）；以及如美国专利申请No.2009/0311664所述的在癌细胞中有复制能力的有条件的病毒，比如溶瘤细胞的疱疹病毒NV1066和牛痘病毒球GLV-1h68。特别地，可以使用腺病毒的载体，例如在美国专利申请No.2008/0213220中描述的靶向病毒载体。
[0036] 本领域的技术人员将认识到，特定载体的选择将取决于其精确的用途。典型地，由于插入突变的风险，人们不会使用可整合入寄主细胞基因组的载体。人们应该设计载体以便避免或者最小化在载体核酸序列内部或者在载体之间发生重组。
[0037] 含有构建体和本发明的载体的宿主细胞还包括，例如，体外细胞比如被培养的细胞、或者被用于储存、产生或者操控载体的细菌细胞或者昆虫细胞等。通过使用重组体技术或者通过合成手段，可以产生这些构建体和载体。
[0038] 成像
[0039] 成像构建体和载体
[0040] 在一些实施方式中，本发明提供了用于癌细胞和肿瘤成像的基因构建体。该构建体包括至少一种可转录的元件，该元件或者可通过使用成像技术直接地检测、或者与一种以上附加的分子一起作用，所述作用方式是产生通过使用成像技术可检测的信号。该可转录的元件被可操作地连接于如上所述癌症选择性的/特异性的启动子，并且一般被称作“报告”分子。这些报告分子能够以如下数种方式中的任一方式引起可检测信号的生产：它们可以编码具有依靠自身性能可被检测的特性的蛋白质或多肽；它们可以编码与第二物质互相作用、并且造成第二物质可被检测的蛋白质或多肽；它们可以编码汇集可检测的物质、借此提高其局部浓度而足以使周围环境（例如癌细胞）可被检测的蛋白质或多肽。如果报告基因的基因产物与另一种物质互相作用而产生可检测信号，则另一种物质在此被称作所述报告分子的“补体”。
[0041] 依靠自身性能可被检测（直接地检测）的报告分子蛋白质或多肽的例子包括当暴露于例如特定波长或者波长范围的能量时显示出可检测特性的蛋白质或多肽。该类型的可检测的蛋白质的例子包括但不限于：绿色荧光蛋白（GFP）和其变体，包括突变体比如有蓝色、青色、以及黄色荧光性的蛋白质；基因工程化而可发射近红外区光谱的蛋白质；基因工程化而可发射短、中、长、及远红外区光谱的蛋白质等。本领域的技术人员将认识到，取决于涉及的试剂的毒性或者免疫原性，这样的可检测的蛋白质可能或者不可能适合于在人类中使用。然而，本实施方式可应用于例如实验室用途或者研究用途所涉及的动物、细胞培养物、组织培养、各种体外工序等。
[0042] 另一类报告分子蛋白质是可与补体分子一起作用的蛋白质。本实施方式中，包含编码报告分子的基因的构建体被系统地给药于需要成像的个体，作为报告分子补体的分子在构建体给药之前、之后或者与构建体一起也被系统地给药于需要成像的个体。如果在构建体给药之前或之后被给药，则这两个给药可以被分时间进行，以使得每个实体扩散进入细胞（包括被靶向的癌细胞）以如下方式发生：导致在癌细胞内部每个物质有足够的浓度来（例如典型地在大约1小时以下内）产生可检测信号。如果这两个物质被“一起”给药，那么单独的组合物可以同时、或者接近同时（例如在大约30、20、15、10、或5分钟以下内）被给药，或者包含构建体和补体的单一组合物可以被给药。在任何情形中，没有在报告分子和补体之间的相互作用能够发生在癌细胞外侧，因为报告分子未被产生、因而不存在于任何其他位置，因为其转录受控制于癌症特异性（的）/选择性（的）启动子。
[0043] 本实施方式的一个例子是作为氧化性酶的荧光素酶和其各种修饰型，其补体是荧光素。简言之，作为其补体的荧光素被荧光素酶的氧化催化容易产生可探测数的光量。本领域的技术人员将认识到，由于需要将作为补体的荧光素给药至个体，该体系一般不在人类中使用。然而，本实施方式适合于在动物中、以及在涉及细胞培养物、组织培养、以及各种体外工序的研究中使用。
[0044] 该类型的另一种示例性的蛋白质是胸苷激酶（TK），例如来自单纯性疱疹病毒1（HSV1）、或者来自其它来源的TK。TK是磷酸转移酶酶（激酶），可催化磷酸基从腺苷三磷酸加到胸腺嘧啶脱氧核苷上，借此活化胸腺嘧啶脱氧核苷用于并入核酸例如DNA中。胸腺嘧啶脱氧核苷的各种类似物也被TK视作底物，并且胸腺嘧啶脱氧核苷的放射性标记形式或者胸腺嘧啶脱氧核苷类似物可以被用作报告分子蛋白质TK的补体分子。无需结合理论，人们相信一旦被TK磷酸化，放射性标记的核苷酸就由于带负电荷的磷酸基而被保留在细胞内；或者，可选地，放射性标记的核苷酸可以被并入癌细胞中的例如DNA，并且因此累积在癌细胞内部。无论是这两种方式中的哪一个，它们都提供了一种可容易地检测的信号，并且可同本底放射性区分开来。而且，在成像时被结合于TK的底物可在癌细胞中提供额外的信号。
实际上，具有对于底物非常低Kms的突变体TK可以通过捕获底物而增大该效果。核苷酸发射的放射性可通过使用多种在此描述的技术而被检测。TK应用的这一方面利用了该酶的标记潜力；TK的毒性能力描述如下。
实际上，具有对于底物非常低Kms的突变体TK可以通过捕获底物而增大该效果。核苷酸发射的放射性可通过使用多种在此描述的技术而被检测。TK应用的这一方面利用了该酶的标记潜力；TK的毒性能力描述如下。
[0045] 在本发明实践中可以使用各种TK酶或其修饰型或者突变体形式，包括但不限于：HSVl-TK、HSVl-sr39TK、具有增强或减弱的对不同底物亲合性的突变体、热敏的TK突变体、密码子优化TK、美国专利No.6,451,571和美国专利申请No.2011/0136221中描述的突变体（在此通过引用将两者都并入本文）；各种合适的人TK和突变体人TK等。
[0046] 可以使用的可检测的TK底物包括但不限于：胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，比如：“非阿尿苷”即[l-（2-脱氧-2-氟-l-D-阿拉伯呋喃糖苷）-5-碘尿嘧啶]、又名“FIAU”，125 125
和其各种形式，例如2'-氟-2'-脱氧-β-D-5-[ I]碘尿嘧啶-阿拉伯呋喃糖苷（[ I]
124
FIAU）、[ I]FIAU；在3-位处含有正碳硼烷基（carboranylalkyl）的胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，参见Al Mahoud et al.（Cancer Res.,2004年9月1日，64：6280）的描述，其可以在其介导细胞毒性时具有双重作用，如下文所述；羟甲基]丁基）鸟嘌呤（HBG）衍生物比如
18 18 18
9-(4- F-氟-3-[羟甲基]丁基）鸟嘌呤（ F-FHBG）；2'-脱氧-2'-[ F]-氟-1-β-D-阿
18
拉伯呋喃糖苷-5-碘尿嘧啶（F-FEAU）、2'-脱氧-2'-[ F]-氟-5-甲基-1-β-L-阿拉伯呋
18 18
喃糖苷尿嘧啶（ F-FMAU）、1-（2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖苷）-5-[ F]碘尿嘧
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啶（ F-FIAU）、2'-脱氧-2'-[ F]-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃糖苷-5-碘尿嘧啶（ F-FIAC），参见例如Chanet al.Nuclear Medicine and Biology,38（2011）987-995；以及Caiet al.,Nuclear Medicine and Biology,38（2011）659-666）；各种烷基化嘧啶衍生物，比如Muller et al.（Nuclear Medicine and Biology,2011,出版中）描述的C-6烷基化嘧啶衍生物；以及其它的化合物。
和其各种形式，例如2'-氟-2'-脱氧-β-D-5-[ I]碘尿嘧啶-阿拉伯呋喃糖苷（[ I]
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FIAU）、[ I]FIAU；在3-位处含有正碳硼烷基（carboranylalkyl）的胸腺嘧啶脱氧核苷类似物，参见Al Mahoud et al.（Cancer Res.,2004年9月1日，64：6280）的描述，其可以在其介导细胞毒性时具有双重作用，如下文所述；羟甲基]丁基）鸟嘌呤（HBG）衍生物比如
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9-(4- F-氟-3-[羟甲基]丁基）鸟嘌呤（ F-FHBG）；2'-脱氧-2'-[ F]-氟-1-β-D-阿
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拉伯呋喃糖苷-5-碘尿嘧啶（F-FEAU）、2'-脱氧-2'-[ F]-氟-5-甲基-1-β-L-阿拉伯呋
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喃糖苷尿嘧啶（ F-FMAU）、1-（2'-脱氧-2'-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖苷）-5-[ F]碘尿嘧
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啶（ F-FIAU）、2'-脱氧-2'-[ F]-氟-1-β-D-阿拉伯呋喃糖苷-5-碘尿嘧啶（ F-FIAC），参见例如Chanet al.Nuclear Medicine and Biology,38（2011）987-995；以及Caiet al.,Nuclear Medicine and Biology,38（2011）659-666）；各种烷基化嘧啶衍生物，比如Muller et al.（Nuclear Medicine and Biology,2011,出版中）描述的C-6烷基化嘧啶衍生物；以及其它的化合物。
[0047] 其他示例性的报告分子可以通过多种机制中的任何一种保留或者引起可检测地标记的补体的保持。例如，报告分子可以非常坚固地（例如不可逆地）结合于补体，并且因此提高在癌细胞内部补体的局部浓度；或者报告分子可以以使得补体从细胞中排出很困难或至少很缓慢、以至于导致补体在所述细胞内部可检测到网状累积的方式修饰所述补体；或者报告分子可以致使补体适合于参与一种以上反应，该反应可“捕获”或者固定所述补体、或者其修饰型，所述修饰型在所述细胞内部仍然包括可检测的标签，就如同上述TK例子的情形。
[0048] 这样一种体系的一个实例是酶-底物复合物，其中报告分子通常是酶，而补体通常是底物，虽然并不需要总是如此：报告分子可以编码作为酶的底物、具有“补体”功能的多肽或肽。在一些实施方式中，底物用可检测的标签（例如放射性的、有荧光性的、磷光的、比色的、发射光的、或者其他的标签）进行标记，并且由于如下原因而在癌细胞内部累积：例如，与酶的不可逆结合反应（即，其为自杀底物）、或者因为其从酶中释放的速率很慢以至于导致在癌细胞内部可检测的累积、或者与酶反应造成底物的特性改变以至于其不能容易地离开细胞、或者离开细胞非常慢（例如由于尺寸增大、或者电荷、疏水性或亲水性改变等）；或者因为作为与酶的相互作用或结合的结果，底物被改性并且然后参加随后的反应，引起底物（与其可检测的标签或标记一起）被保留在细胞中，等。
[0049] 在本发明实践中可以作为报告分子的其他蛋白质是转运蛋白分子，其位于细胞表面，或者是跨膜蛋白质（transmembrane protein）例如输送各种离子跨越细胞膜并进入细胞的离子泵。一个示例性的离子泵是钠-碘同向转运蛋白（NIS），又名溶质载体家族5成-员5（SLC5A5）。在本质上，该离子泵主动地输送碘（I）跨越例如基底外侧细胞膜进入甲状腺上皮细胞。由在此描述的构建体序列编码的转运蛋白的重组形式可以被选择性地转录入癌细胞中，并且输送放射性标记的碘进入癌细胞。可以在本发明实践中使用的该家族的转运蛋白的其他实例包括但不限于：降肾上腺素转运蛋白（NET）；多巴胺受体；各种雌激素受体系统，肝配蛋白比如细胞膜锚定的肝配蛋白A（EFNA）和跨膜蛋白肝配蛋白-B（EFNB）；
表皮生长因子受体（EGFR）；胰岛素样生长因子受体（例如IGF-1、IGF-2）等）；转化生长因子（TGF）受体比如TGFα；等等。在这些情形中，蛋白质或其功能改性型被本发明的载体表达，并且配体分子被给药于病人。通常，配体用在此描述的可检测的标签进行标记，或者一旦与转运蛋白连接或者交互作用就变成可检测的。在一些实施方式中，检测可以要求第三实体与配体例如金属离子相连接。该配体还可以是蛋白质、多肽或者肽。
表皮生长因子受体（EGFR）；胰岛素样生长因子受体（例如IGF-1、IGF-2）等）；转化生长因子（TGF）受体比如TGFα；等等。在这些情形中，蛋白质或其功能改性型被本发明的载体表达，并且配体分子被给药于病人。通常，配体用在此描述的可检测的标签进行标记，或者一旦与转运蛋白连接或者交互作用就变成可检测的。在一些实施方式中，检测可以要求第三实体与配体例如金属离子相连接。该配体还可以是蛋白质、多肽或者肽。
[0050] 另外，在本发明实践中可以使用抗体。例如，本发明的载体可以被设计成表达作为抗原的、或者包含抗原性表位的蛋白质、多肽、或者肽。对于这些抗原或者抗原性表位，已经或者能够制备出特异性的抗体。例举的抗原包括但不限于：肿瘤特异性的蛋白质，其由于突变（原癌基因、肿瘤抑制剂、ras和p53基因等的异常产物）而具有反常结构；各种与肿瘤有关的抗原，比如通常以非常低的数量产生、但是其在肿瘤细胞中的产量显著地增大的蛋白质（例如酶，酪氨酸酶，其在黑素瘤细胞中被增加）；各种胎性癌抗原（例如甲胎蛋白（AFP）和癌胚抗原（CEA））；感染了致癌病毒的细胞产生的异常蛋白质，例如EBV和HPV；在肿瘤细胞中具有反常结构的各种细胞表面糖脂和糖蛋白；等等。抗体可以是单克隆或多克隆抗体，其用可检测的标签进行标记并且在载体给药之后或者与载体一起被给药于病人。抗体遇到仅（或者至少主要）在癌细胞中产生的被表达的抗原或表位，并且与其发生反应，借此标记癌细胞。相反，可以通过本发明的载体生产抗体，并且可以将标记后的抗原给药于病人。本实施方式中，使用抗体或其片段、例如Fab（片段、抗原结合性）片段、或者已为本领域的技术人员所熟知的其它抗体或其片段。本实施方式中，抗体特异性的抗原或含有抗原或表位的物质被标记并且被给药于待成像的个体。
[0051] 这样的体系的其他例子包括各种配体结合系统，比如可结合能够被成像的配体的报告蛋白质/多肽，其实例包括但不限于：可结合或者螯合具有可检测信号的金属的蛋白质（例如金属酶）；基于铁蛋白的铁储存蛋白质，比如Ordanova and Ahrnes（Neurolmage,2011,出版中）描述的那些；以及其它蛋白质/多肽。这样的报告分子和补体体系可以在本发明实践中使用，只要报告分子或者补体能够在癌症启动子控制下被转录、并且其他的结合伴侣可被检测或者能够被可检测地标记即可。所述报告分子或者补体被给药于个体，并且能够扩散进入癌细胞。本领域的技术人员将认识到，一些这样的体系适合于例如在人类个体身上使用，而其他的体系由于例如毒性而不适合。然而，后一类型的的体系可能非常适合于实验室使用。
[0052] 在其他的实施方式中，在本发明的载体中的癌症特异性的或者癌症选择性的启动子驱动被分泌蛋白质的表达，所述蛋白质在循环中通常见不到。本实施方式中，通过标准的（甚至可在市场上买到的）在血清或者尿液中具有高灵敏度的方法可以检测蛋白质的存在。换句话说，在液体中检测待检测的癌细胞。
[0053] 在其他的实施方式中，在本发明的载体中的癌症特异性的或者癌症选择性的启动子驱动待在细胞表面上表达的蛋白质或者抗原的转录，其能够然后用合适的可检测抗体或其他的亲合性试剂标记。用于分泌和细胞表面表达的候选蛋白质包括但不限于：人绒毛膜促性腺激素的β-亚基（βhCG）；人α-胎蛋白（AFP）、以及链霉抗生物素蛋白（SA）。
[0054] βhCG在孕妇中表达并且在开始怀孕期间促进黄体的维持。在未怀孕的正常妇女和男人中βhCG的水平是0-5mIU/mL。hCG被分泌到血清和尿液中，并且βhCG已经被用于妊娠试验，因为hCG的α-亚基被与其他激素一起分配。通过家庭医生办公室的和基于实验室设置的色谱免疫测定（即妊娠试验条带，检测阈值是20-100mIU/mL），能够容易地检测尿中βhCG。通过化学发光的或者有荧光性的免疫测定，使用2-4mL的静脉血用于更定量的检测，能够测量血清水平，已经显示当在猴子细胞中被表达时，βhCG分泌到介质中。人AFP是仅在胎儿发育期间、以及在具有特定类型癌症的成年人中被表达的胎性癌抗原。能够在肝细胞癌、睾丸肿瘤和转移性肝癌中发现成年人中的AFP。通过色谱免疫测定和通过用于定量测量的酶免疫测定，能够在血清、血浆、或者全血中检测出AFP。
[0055] 链霉抗生物素蛋白（SA）也可以在本发明实践中用作细胞表面标靶。
[0056] SA与生物素的异乎寻常高的亲和性提供了非常有效的和强有力的成像和治疗标靶。为了使SA到达癌细胞的质膜，能够将SA融合于被糖基磷脂酰肌糖
（glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚定的人CD14信号。GPI锚定的SA将适合于治疗性应用，因为GPI锚定的蛋白质能够被内吞至再循环核内体。一旦在细胞表面上表达，SA就能够被含有毒性或者放射性毒弹头的抗生物素蛋白共轭物结合。毒性蛋白质和毒物比如蓖麻毒、相思豆毒蛋白、假单胞菌外毒素（PE，比如PE37、PE38、以及PE40）、白喉毒素（DT）、肥皂草毒蛋白、局限曲菌素、霍乱毒素、多花白树毒蛋白、志贺氏菌毒素、以及商陆抗病毒蛋白、百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素、或者它们的改性毒素、或者其他直接或间接地抑制细胞生长或者杀灭细胞的毒性剂可以被连接于抗生物素蛋白；例如可能是毒性的低分子量种类，比如阿霉素或者紫杉醇或者放射性核素比如125I、131I、111In、177Lu、211At、225Ac、
213Bi和90Y；抗血管生成试剂，比如萨力多胺（thalidomide）、血管抑素、反义分子、COX-2抑制剂、整联蛋白拮抗剂、内皮抑制素、凝血栓蛋白-1、以及干扰素α、维塔素（vitaxin）、塞来考昔、罗非考西；以及化学治疗剂，比如：嘧啶类似物（5-氟尿嘧啶、5-氟脱氧尿苷、卡培他滨（capecitabine）、吉西他滨（gemcitabine）和阿糖胞苷）和嘌呤类似物，叶酸拮抗剂和相关抑制剂（巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、戊制菌素（pentostatin）和2-氯脱氧腺苷（克拉屈滨，cladribine））；抗增殖活性剂/抗有丝分裂剂，包括：天然产物比如长春花生物碱（长春花碱、长春新碱、以及长春瑞滨（vinorelbine）），微小管破坏剂比如紫杉烷（紫杉醇、紫杉萜）、新长春碱，长春灭瘟碱，诺可唑，埃博霉素（epothilone）和诺维本（navelbine）、表鬼臼毒素（epidipodophyllotoxin）（鬼臼亚乙苷、替尼泊苷(teniposide)）、DNA杀伤剂（放线菌素、胺苯吖啶(amsacrine)、小红莓素(anthracycline)、博莱霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环磷酰胺、放线菌素、道诺红菌素、阿霉素、表柔比星、六甲基三聚氰胺奥沙利铂（hexamethylmelamineoxaliplatin）、异环磷酰胺、米尔法兰、甲二氯二乙胺（merchlorehtamine）、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素（plicamycin）、甲基苄肼、紫杉醇、紫杉萜、替尼泊苷、三来乙基硫代磷酰胺和鬼臼亚乙苷（VP16））；抗生素比如放线菌素（放线菌素D）、道诺红菌素、阿霉素（阿霉素）、伊达比星(idarubicin)、小红莓素、米托蒽醌、博莱霉素、普卡霉素（光辉霉素）和丝裂霉素；酶（L-天冬酰胺酶，其系统地代谢L-天冬酰胺，并且使细胞丧失合成自身的天门冬酰胺的能力）；抗血小板试剂；抗增殖活性/抗有丝分裂的烷基化剂，比如氮芥类（氮芥、环磷酰胺和类似物、米尔法兰、苯丁酸氮芥）、氮丙啶和甲基三聚氰胺（六甲三聚氰胺和硫替派）、烷基磺酸酯-白消安、亚硝基脲（亚硝脲氮芥（BCNU）和类似物、链脲霉素）、三氮烯类（trazenes）-达卡巴嗪（dacarbazinine）（DTIC）；抗增殖活性/抗有丝分裂的代谢拮抗剂，比如叶酸类似物（氨甲蝶呤）；铂配位络合物（顺铂、卡铂）、甲基苄肼、羟基脲、米托坦、氨基苯乙哌啶酮；激素、激素类似物（雌激素、三苯氧胺、性激素素阻滞药、比卡鲁胺、尼鲁米特（nilutamide）和芳化酶（aromatase）抑制剂（来曲唑（letrozole）、阿那曲唑（anastrozole））；抗凝血剂（肝素，合成肝素盐、以及其他凝血酶抑制剂）；纤维蛋白溶解剂（比如组织纤溶酶原激活物、链激酶和尿激酶）、乙酰水杨酸、双嘧哌胺醇、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗（abciximab）；抗迁移（antimigratory）剂；抗分泌（antisecretory）试剂（布雷菲德菌素（breveldin））；免疫抑制剂（环孢素、他索罗辛（FK-506）、西罗莫司（sirolimus）（雷帕霉素）、咪唑硫嘌呤、钠美芬）；抗血管生成化合物（TNP-470、高金雀花碱）和生长因子抑制剂（脉管内皮生长因子（VEGF）抑制剂、成纤维细胞生长因子（FGF）抑制剂）；血管紧张素受体阻断剂；氧化氮供体；反义寡核苷酸；
抗体（曲妥珠单抗（trastuzumab）、利妥昔单抗（rituximab））；细胞周期抑制剂和分化诱导剂（维甲酸）；mTOR抑制剂、局部异构酶抑制剂（亚德利亚霉素（阿霉素）、胺苯吖啶、喜树碱、道诺红菌素、放线菌素、京尼平苷（eniposide）、表柔比星、鬼臼亚乙苷、伊达比星、伊立替康（irinotecan）（CPT-11）和米托蒽醌、拓扑替康（topotecan）、伊立替康、皮质甾类（可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙（methylpednisolone）、强的松、以及泼尼松龙（prenisolone）；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体机能障碍诱导剂；胱天蛋白酶活化剂；以及染色质破坏剂，尤其能够被共轭于纳米颗粒的那些物质。
（glycosylphosphatidylinositol，GPI）锚定的人CD14信号。GPI锚定的SA将适合于治疗性应用，因为GPI锚定的蛋白质能够被内吞至再循环核内体。一旦在细胞表面上表达，SA就能够被含有毒性或者放射性毒弹头的抗生物素蛋白共轭物结合。毒性蛋白质和毒物比如蓖麻毒、相思豆毒蛋白、假单胞菌外毒素（PE，比如PE37、PE38、以及PE40）、白喉毒素（DT）、肥皂草毒蛋白、局限曲菌素、霍乱毒素、多花白树毒蛋白、志贺氏菌毒素、以及商陆抗病毒蛋白、百日咳杆菌腺苷酸环化酶毒素、或者它们的改性毒素、或者其他直接或间接地抑制细胞生长或者杀灭细胞的毒性剂可以被连接于抗生物素蛋白；例如可能是毒性的低分子量种类，比如阿霉素或者紫杉醇或者放射性核素比如125I、131I、111In、177Lu、211At、225Ac、
213Bi和90Y；抗血管生成试剂，比如萨力多胺（thalidomide）、血管抑素、反义分子、COX-2抑制剂、整联蛋白拮抗剂、内皮抑制素、凝血栓蛋白-1、以及干扰素α、维塔素（vitaxin）、塞来考昔、罗非考西；以及化学治疗剂，比如：嘧啶类似物（5-氟尿嘧啶、5-氟脱氧尿苷、卡培他滨（capecitabine）、吉西他滨（gemcitabine）和阿糖胞苷）和嘌呤类似物，叶酸拮抗剂和相关抑制剂（巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、戊制菌素（pentostatin）和2-氯脱氧腺苷（克拉屈滨，cladribine））；抗增殖活性剂/抗有丝分裂剂，包括：天然产物比如长春花生物碱（长春花碱、长春新碱、以及长春瑞滨（vinorelbine）），微小管破坏剂比如紫杉烷（紫杉醇、紫杉萜）、新长春碱，长春灭瘟碱，诺可唑，埃博霉素（epothilone）和诺维本（navelbine）、表鬼臼毒素（epidipodophyllotoxin）（鬼臼亚乙苷、替尼泊苷(teniposide)）、DNA杀伤剂（放线菌素、胺苯吖啶(amsacrine)、小红莓素(anthracycline)、博莱霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、环磷酰胺、放线菌素、道诺红菌素、阿霉素、表柔比星、六甲基三聚氰胺奥沙利铂（hexamethylmelamineoxaliplatin）、异环磷酰胺、米尔法兰、甲二氯二乙胺（merchlorehtamine）、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素（plicamycin）、甲基苄肼、紫杉醇、紫杉萜、替尼泊苷、三来乙基硫代磷酰胺和鬼臼亚乙苷（VP16））；抗生素比如放线菌素（放线菌素D）、道诺红菌素、阿霉素（阿霉素）、伊达比星(idarubicin)、小红莓素、米托蒽醌、博莱霉素、普卡霉素（光辉霉素）和丝裂霉素；酶（L-天冬酰胺酶，其系统地代谢L-天冬酰胺，并且使细胞丧失合成自身的天门冬酰胺的能力）；抗血小板试剂；抗增殖活性/抗有丝分裂的烷基化剂，比如氮芥类（氮芥、环磷酰胺和类似物、米尔法兰、苯丁酸氮芥）、氮丙啶和甲基三聚氰胺（六甲三聚氰胺和硫替派）、烷基磺酸酯-白消安、亚硝基脲（亚硝脲氮芥（BCNU）和类似物、链脲霉素）、三氮烯类（trazenes）-达卡巴嗪（dacarbazinine）（DTIC）；抗增殖活性/抗有丝分裂的代谢拮抗剂，比如叶酸类似物（氨甲蝶呤）；铂配位络合物（顺铂、卡铂）、甲基苄肼、羟基脲、米托坦、氨基苯乙哌啶酮；激素、激素类似物（雌激素、三苯氧胺、性激素素阻滞药、比卡鲁胺、尼鲁米特（nilutamide）和芳化酶（aromatase）抑制剂（来曲唑（letrozole）、阿那曲唑（anastrozole））；抗凝血剂（肝素，合成肝素盐、以及其他凝血酶抑制剂）；纤维蛋白溶解剂（比如组织纤溶酶原激活物、链激酶和尿激酶）、乙酰水杨酸、双嘧哌胺醇、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗（abciximab）；抗迁移（antimigratory）剂；抗分泌（antisecretory）试剂（布雷菲德菌素（breveldin））；免疫抑制剂（环孢素、他索罗辛（FK-506）、西罗莫司（sirolimus）（雷帕霉素）、咪唑硫嘌呤、钠美芬）；抗血管生成化合物（TNP-470、高金雀花碱）和生长因子抑制剂（脉管内皮生长因子（VEGF）抑制剂、成纤维细胞生长因子（FGF）抑制剂）；血管紧张素受体阻断剂；氧化氮供体；反义寡核苷酸；
抗体（曲妥珠单抗（trastuzumab）、利妥昔单抗（rituximab））；细胞周期抑制剂和分化诱导剂（维甲酸）；mTOR抑制剂、局部异构酶抑制剂（亚德利亚霉素（阿霉素）、胺苯吖啶、喜树碱、道诺红菌素、放线菌素、京尼平苷（eniposide）、表柔比星、鬼臼亚乙苷、伊达比星、伊立替康（irinotecan）（CPT-11）和米托蒽醌、拓扑替康（topotecan）、伊立替康、皮质甾类（可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙（methylpednisolone）、强的松、以及泼尼松龙（prenisolone）；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体机能障碍诱导剂；胱天蛋白酶活化剂；以及染色质破坏剂，尤其能够被共轭于纳米颗粒的那些物质。
[0057] 成像信号的检测
[0058] 在本发明的成像实施方式中使用的体系中的可检测组分（通常为补体或者底物）可以用多种可检测的标签中的任何一种标记，所述可检测的标签的例子在上文中进行了描述。另外，尤其有用的可检测的标签是高灵敏度的并且能够被非侵入性地检测的标签，比如124 123 99 18 86 11 125 64 67 68 201 76 75 111 82 13
同位素 I、I、mTc、F、Y、C、 I、Cu、Ga、Ga、Tl、Br、Br、 In、Rb、N、以及其它同位素。
同位素 I、I、mTc、F、Y、C、 I、Cu、Ga、Ga、Tl、Br、Br、 In、Rb、N、以及其它同位素。
[0059] 本领域的技术人员将认识到，在本发明的实施方式中可以使用许多不同的现有检测技术，选择一个特定的技术而不选择另一种技术一般取决于产生的信号类型，也取决于检测信号所在的介质，例如在人体中、在实验动物中、在细胞或组织培养液中、体外等。例如，生物发光成像（BLI）；荧光成像；磁共振成像[MRI]，例如按照Gilad et al.,Nature Biotechnology,25,2(2007)描述的方法使用富含赖氨酸的蛋白质（LRp）；或者肌酸激酶、酪氨酸酶、β-半乳糖苷酶、基于铁的报告基因比如转移、铁蛋白、以及MagA；与低密度脂蛋白受体相关的蛋白（LRP）；多肽，比如聚L-赖氨酸、聚L-精氨酸和聚L-苏氨酸；以及其它文献（例如Gilad et al.,J.Nucl.Med.,2008）所述的方法；计算机化断层显像（CT）；正电子发射成像术（PET）；单光子发射计算机化断层显像（SPECT）；硼中子俘获；用于金属：同步加速器X射线荧光（SXRF）显微术、次级离子质谱法（SIMS）、以及用于金属成像的激光烧蚀感应耦合等离子体质谱分析法（LA-ICP-MS）；光热成像（photothermal imaging）（例如使用磁胞质（magneto-plasmonic）纳米颗粒）等。
[0060] 治疗
[0061] 靶向癌症疗法是通过按照在此描述的方法将构建体、载体等给药于需要其的病人而进行的。本实施方式中，编码对癌细胞有害的治疗性分子例如蛋白质或多肽的基因被可操作地在“治疗性构建体”或者“治疗性载体”中连接于在此描述的癌症特异性的启动子。该治疗性蛋白质可以杀灭癌细胞（例如通过启动或者引起程序性细胞死亡）、或者可以减慢它们的生长速度（例如，可以减慢它们的增殖速度）、或者可以阻止它们的生长发育、或者以某种方式另外损伤癌细胞、或者甚至可以导致癌细胞对其他的抗癌症试剂更敏感等。
[0062] 可以在本发明中使用的编码治疗性分子的基因包括但不限于：自杀基因，包括编码各种酶的基因；致癌基因；肿瘤抑制基因；毒素；细胞因子；制瘤素；TRAIL等。示例性的酶包括，例如：胸苷激酶（TK）和其各种衍生物；TNF相关的程序性细胞死亡诱导配体（TRAIL）、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（GPT）；胞嘧啶脱氨酶（CD）；次黄嘌呤转磷酸核糖基酶（HPRT）；等等。例举的肿瘤抑制基因包括neu、EGF、ras（包括H、K、以及N ras）、p53、成视网膜细胞瘤肿瘤抑制基因（Rb）、胚胎性癌肉瘤基因产物、磷酸酪氨酸磷酸酶（PTPase）、AdEl A和nm23。合适的毒素包括假单胞菌外毒素A和S；白喉毒素（DT）；大肠杆菌LT毒素、Shiga毒素、Shiga样毒素（SLT-1、SLT-2）、蓖麻毒、相思豆毒蛋白、Supporin、多花白树毒蛋白等。合适的细胞因子包括干扰素和白介素，比如白介素1（IL-1）、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-18、β-干扰素、α-干扰素、γ-干扰素、血管抑素、凝血栓蛋白、内皮抑制素、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、METH1、METH2、肿瘤坏死因子、TGFβ、LT及它们的组合物。其他的抗肿瘤试剂包括：GM-CSF白介素、肿瘤坏死因子（TNF）；干扰素-β和病毒诱导的人类Mx蛋白；TNFα和TNFβ；与人类黑素瘤分化相关的基因-7（mda-7）、又名白介素-24（IL-24）、各种截断型的mda-7/IL-24比如M4；靶向重要生长调控的siRNA和shRNA、或者在癌细胞中需要的或者过表达的致癌基因；抗体，比如对于攻击性癌细胞特异性的或者选择性的抗体；等等。
[0063] 当治疗剂是TK（例如病毒的TK）时，TK底物比如无环鸟苷、9-[1,3-二羟-2-丙氧甲基]鸟嘌呤（ganciclovir）、各种胸腺嘧啶脱氧核苷类似物（例如在3-位处含有正碳硼烷基的那些类似物[CancerRes.,2004年9月1日,64：6280]）被给药于个体。这些药物用作前体药物，其本身是无毒的，但是通过病毒TK的磷酸化作用会被转化成毒性药品。TK基因和底物两个都必须并行地使用，从而对寄主癌细胞产生毒性。
[0064] 成像加治疗
[0065] 在一些实施方式中，本发明提供了癌症治疗方案，其中癌细胞和肿瘤的成像与治疗疾病相结合，即同时会杀灭、破坏、减缓慢生长、减弱分裂（再生）能力、或者另外损伤癌细胞。这些方案在此可以被称作“治疗诊断”或者“组合治疗”或者“组合方案”、或者称作同类术语。
[0066] 在一些实施方式中，组合治疗涉及把在同时包含报告基因（用于成像）和至少一种所关注的治疗性基因（用于治疗疾病）的单一构建体中的基因构建体（例如质粒）给药于癌症病人。本实施方式中，报告基因或者治疗性基因的表达，或者优选报告基因和治疗性基因两者的表达，被在此描述的癌细胞特异性的或者选择性的启动子介导。优选在本实施方式中使用两个不同的启动子以便预防或者减少在构建体内部交叉和重组的机会。作为另一种选择，可以使用串联翻译机制，例如，一个以上内部核糖体进入位点（IRES）插入构建体中，允许从单一的mRNA翻译多个mRNA转录产物。以这种方式，在被靶向的癌细胞内部选择性地或者特异性地同时产生对于癌细胞而言是致命的或者有毒性的报告分子蛋白质/多肽和蛋白质/多肽。
[0067] 可选地，被本发明的构建体（例如质粒）编码的多肽可以经基因工程化而包含连续序列和间插序列。所述连续序列包含两个以上所关注的多肽（例如报告分子和毒性剂）；所述间插序列在癌细胞内部可裂解，例如间插序列可被细胞内的蛋白酶酶促解离、或者甚至对非酶促水解裂解机制敏感。该情况下，间插序列的裂解导致功能性多肽的产生，所述功能性多肽能够进行它们的预定作用，例如，当通过使用已为本领域的技术人员所熟知的标准技术测量时，它们的活性是蛋白质序列的活性至少50、60、70、80、90、或100%（或者可能更多），其中所述多肽在所述蛋白质序列上建模、或者衍生于所述蛋白质序列（例如是在自然界中产生的序列）。
[0068] 在其他的组合成像和治疗的实施方式中，两个不同的载体可以被给药，其中一个是在此描述的“成像用载体或者构建体”，并且另一个是在此描述的“治疗性载体或者构建体”。
[0069] 在其他的组合成像和治疗的实施方式中，所关注的基因在病毒载体的基因组中被编码，借助于病毒固有的特性，所述病毒载体能够转录和/或翻译多个mRNA和/或它们编码的多肽或者蛋白质。本实施方式中，这样的病毒载体经基因工程化而包含、并且在一个以上癌症特异性的启动子的原理控制下表达所关注的基因（例如报告基因和治疗性基因）。
[0070] 组合物
[0071] 本发明提供了组合物，其包含一个以上在此描述的载体或者构建体和药理学合适的载体。该组合物通常是用于系统的给药。这样的组合物的制备已为本领域的技术人员所熟知。典型地，它们被制成液体溶液或者悬浮液、或者作为适合于在给药之前加入溶液中、或者悬浮液中、或者液体中的固体形式。该制品还可以被乳化。可以将活性成分与药学可接受的、并且与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂例如是水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等、或它们的组合。另外，组合物可以含有较小含量的辅助物质比如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。如果希望口服形式给药该组合物，则可以加入不同的增稠剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、分散助剂或者粘合剂等。本发明的组合物可以含有任何一种以上本技术领域已知的成分，从而以适合给药的形式提供该组合物。在制剂中载体的最终含量可以变化。然而，一般来讲，在制剂中的含量是大约1-99%。
[0072] 给药
[0073] 本发明的载体组合物（制品）典型地被系统地给药，虽然并不需要总是如此，但不排除定位给药（例如，肿瘤内、或者进入外部孔口比如阴道、鼻咽管区域、口腔；或者进入内部孔穴比如胸腔、颅腔、腹腔、脊髓空腔等）。为了载体的系统分布，优选的给药途径包括但不限于：静脉内、注射、透皮、吸入或者鼻饲、或者通过基于阳离子聚合物的媒介TM物（例如体内jetPEI ）的注射或者静脉内给药。当脂质体（liposomal）释药与靶向组成部分相结合时，增强了释药。超声波靶向的微泡破坏技术（UTMD）也可以被用于释放成像试剂和治疗诊断试剂（Dash et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2011年5月24日，
108(21):8785-90.Epub，2011年5月9日]、羟基磷灰石-壳聚糖纳米复合物（Venkatesan et al.，Biomaterials.2011年5月；32（15）:3794-806）、以及其它的试剂（Dash et al.，Discov.2011年1月；11（56）:46-56.述评）等等。可以使用已为本领域的技术人员所熟知的任何方法、以及与所使用的构建体类型相称的方法。另外，组合物可以与本技术领域已知的其他治疗形态一起给药（比如各种化疗剂例如Pt药物、加强免疫系统的物质、抗生素剂等）、或者与其他的检测和成像方法一起进行给药（例如用于证实或者提供提高的更具体的成像的方法，例如与乳房X线照片、X-射线、Pap斑迹、前列腺特异性的抗原（PSA）测试等一起进行）。
108(21):8785-90.Epub，2011年5月9日]、羟基磷灰石-壳聚糖纳米复合物（Venkatesan et al.，Biomaterials.2011年5月；32（15）:3794-806）、以及其它的试剂（Dash et al.，Discov.2011年1月；11（56）:46-56.述评）等等。可以使用已为本领域的技术人员所熟知的任何方法、以及与所使用的构建体类型相称的方法。另外，组合物可以与本技术领域已知的其他治疗形态一起给药（比如各种化疗剂例如Pt药物、加强免疫系统的物质、抗生素剂等）、或者与其他的检测和成像方法一起进行给药（例如用于证实或者提供提高的更具体的成像的方法，例如与乳房X线照片、X-射线、Pap斑迹、前列腺特异性的抗原（PSA）测试等一起进行）。
[0074] 本领域的技术人员将认识到，被给药的构建体或者载体含量将因病人不同而改变，并且可能因对于相同的病人采用不同的给药方式而改变，这取决于多种因素，所述因素包括但不限于：重量、年龄、性别、总体健康状态、待治疗的具体疾病、以及其他因素。并且给药的量和频度由保健专业人员比如医生进行最佳的确立。典型地，例如在动物试验期间和在标准临床试验期间建立最佳的或者有效的肿瘤抑制或者肿瘤杀灭量。本领域的技术人员熟悉例如从小鼠到人类的转化剂量，其一般按照Freireich et al.（Cancer Chemother Rep1966；50(4):219-244）描述的方法通过身体表面面积来进行；并且参见下面的表1和表2，其取自网址dtp.nci.nih.gov。
[0075] 表1.以mg/kg为单位的换算系数
[0076]小鼠重20g 大鼠重150g 猴子重3kg 狗重8kg 人重60kg
小鼠 1 1/2 1/4 1/6 1/12
大鼠 2 1 1/2 1/4 1/7
猴子 4 2 1 3/5 1/3
狗 6 4 12/3 1 1/2
人 12 7 3 2 1
小鼠 1 1/2 1/4 1/6 1/12
大鼠 2 1 1/2 1/4 1/7
猴子 4 2 1 3/5 1/3
狗 6 4 12/3 1 1/2
人 12 7 3 2 1
[0077] 例如，假定在小鼠中的剂量为50mg/kg，那么在猴子中的剂量为50mg/kg×1/4=13mg/kg将是合适的；或者在小鼠中约1.2mg/kg的剂量在人类中采用大约0.1mg/kg的剂量将是合适的。
[0078] 表2.有代表性的表面积对体重的比率
[0079]种类 体重(kg) 表面面积(平方米) Km因子
小鼠 0.02 0.0066 3.0
大鼠 0.15 0.025 5.9
猴子 3.0 0.24 12
狗 8.0 0.4 20
儿童 20 0.8 25
成人 60 1.6 37
小鼠 0.02 0.0066 3.0
大鼠 0.15 0.025 5.9
猴子 3.0 0.24 12
狗 8.0 0.4 20
儿童 20 0.8 25
成人 60 1.6 37
[0080] 为了将剂量表达为等效的mg/sq.m.剂量，剂量要乘以合适的系数。在成年人中，100mg/kg相当于100mg/kgx37kg/sq.m.=3700mg/sq.m.。
[0081] 一般来讲，对于治疗方法，载体比如质粒的含量范围将是大约0.01mg/kg至约5mg/kg、或者大约0.05mg/kg至约1mg/kg（例如，大约0.1mg/kg），并且基于病毒的载体的含量范围是大约105个至约1020个感染单位（IU）、或者大约108个至约1013个IU。一般来讲，对于成像方法，载体的含量范围将是大约0.01mg/kg至约5mg/kg、或者大约0.05mg/kg至约1mg/kg（例如，大约0.1mg/kg），并且基于病毒的载体的含量范围是大约105个至约1020个感染单位（IU）、或者大约108个至约1013个IU。对于组合成像和治疗，载体的量将在如上所述范围内。本领域的技术人员熟悉计算或者测定充分检测所要求的图像信号的水平。
例如，对于防辐射药物比如[124]FIAU，依次序注射或者大约1mCi至大约10mCi、通常大约
5mCi（即大约1mg的材料）一般是足够的。
例如，对于防辐射药物比如[124]FIAU，依次序注射或者大约1mCi至大约10mCi、通常大约
5mCi（即大约1mg的材料）一般是足够的。
[0082] 另外，一个类型的载体或一个以上类型的载体可以以单个给药的方式被给药，例如治疗载体加成像用载体、或者两个（以上）不同的治疗载体（例如，每个治疗载体具有有不同的作用方式从而最优化或者提高治疗结果）、或者两个以上不同的成像用载体等。
[0083] 典型地，癌症治疗要求组合物的重复给药。例如，可以每天、或者每隔几天（例如每隔2、3、4、5、或6天）、或者每周、每两周、或者每隔3-4周、或者每月给药一次，或者以这些周期的任何组合、或者这些周期的交替模式进行给药。例如，“一轮”的治疗（例如，一周给药一次，持续一个月）后，不给药的周期可以持续一个月，然后接着进行第二轮的每周给药一次持续一个月，如此用于任何合适的时间周期，根据需要来最佳地治疗病人。
[0084] 成像方法还可以定期进行，尤其当个体已知或者怀疑处于发展癌症的危险之中时。发展癌症是由于例如存在特定的遗传突变、家族史、暴露于致癌物质、癌症前史、老年等。例如，对于这样的个体，每年一次、半年一次、或者每两年一次、或者其他周期的监测可以被认为是谨慎的。作为另一种选择，没有风险系数的个体可能简单地希望作为常规保健的一部分进行监控、以便排除疾病。
[0085] 对于本发明的同时包括治疗和成像的实施方式，给药方案可以是任何保持病人最大利益的方案。例如，最初、成像用载体可以被单独给药以便确定个体是否的确患有癌症、或者鉴别在已经诊断患有癌症的病人中癌细胞的位置。应注意，本发明的方法非常特异的，以至于通过使用该方法甚至能够目测检验非常小的癌细胞块。如果癌症的确被显示出来，那么具有治疗性载体的组合物需要被给药，以便治疗疾病。通常，正如以上的讨论，要求多次给药；并且至少一种、通常更多种、有时所有这些给药包括至少一种成像用载体与至少一种治疗性载体一起；或者任选地，单一的载体同时具有两种能力。在治疗和成像之间交替变化、或者两者以伴随方式进行的能力对于癌症治疗领域而言是不同的请求。该方法论允许医疗专业人员以紧密控制的方式监控治疗的进展，并且调节和/或改进为病人利益所必需的治疗。例如，治疗性载体和成像用载体的给药可以交替；或者，在早期的治疗期间，最初成像用载体可以被给药、接着治疗性载体和成像用载体一起被给药，直到肿瘤不再看得见。接着单独的成像用载体被给药，保持认为对排除或者检测疾病再发生或潜伏说来是必需的一段时期。
[0087] 能够被治疗的癌症类型
[0088] 本发明的构建体和方法不是具体地用于任何一个类型的癌症。述及“癌症”，我们是指恶性赘生物，其中细胞不可控地分裂和生长、形成恶性肿瘤、并且侵入身体中的附近部分。癌症还可以通过淋巴系统或者血流而扩散到或者转移到身体的更远部分。本发明的构建体和方法可以被用于成像、诊断、治疗、监控等任何类型的癌症、肿瘤、赘生细胞或者肿瘤细胞，包括但不限于：骨肉瘤、卵巢癌、乳腺癌、黑素瘤、肝癌、肺癌、脑癌、结肠直肠癌、造血细胞、前列腺癌、宫颈癌、成视网膜细胞瘤、食道癌、膀胱癌、成神经细胞瘤、肾癌、胃癌、胰腺癌、以及其它的癌症。
[0089] 另外，还可以将本发明应用于良性瘤的成像和治疗，所述良性瘤一般被认为是不侵入附近组织或者转移，例如痣、子宫纤维瘤等。
[0090] 转基因动物
[0091] 本发明也还包括转基因的非人类动物，其已经通过基因工程而包含编码报告基因的核苷酸序列，所述报告基因被可操作地连接于PEG-PROM启动子。并且它们用于治疗的临床评估。在转基因动物中，核苷酸序列被牢固地整合入动物的基因组中。在健康的动物中，启动子不被激活，并且报告基因不被表达。然而，如果这样的动物发展癌症，那么启动子就被诱导或者活化，并且报告基因被表达。一旦将报告分子补体给药于动物，癌细胞的发展、位置和去向就能够被详细地监控。这样的动物可以被用于实验室目的，例如用于测试物质的致癌性、评估化学预防（chemoprevention）策略并且监控治疗。动物能够被暴露于潜在的致癌物、被给药补体，然后监视，以便观察潜在致癌物的效果。同样地，通过在尝试诱导癌症之前、或者在确立癌症之后将候选抗癌症试剂给药，候选抗癌症试剂的效果能够在动物中被测试或者筛选，并且试剂的有效性能够被跟踪并测量。本领域的技术人员熟悉评估候选药物的效力的方法，包括，例如：监控肿瘤位置、阶段、尺寸、体积、外观、频率、持续时间等。
[0092] 在其他的实施方式中，本发明的PEG-PROM动物被进一步通过基因工程而改变成具有癌症发展的倾向。这可以例如，通过动物与动物杂交繁育来进行，所述动物（例如，许多已经被选择或者经基因工程化而用作各种癌症模型体系的小鼠中的任何一个）已经具有癌症发展的倾向性。作为另一种选择，这可以通过在PEG-PROM动物中诱导期望的遗传突变（与癌症发展有关的突变）、或者通过进一步的基因工程使动物具有发展癌症的倾向来完成。
[0093] 有癌症倾向的动物的示例性类型包括如下这样的动物中的任何一种：其对于癌症是敏感的（或者一定会发展成癌症），所述癌症比如是乳腺癌（例如，小鼠，比如小鼠乳腺瘤病毒（MMTV）-neu转基因小鼠）；前列腺癌（例如，小鼠，比如Hi-Myc、TRAMP）；C3(1)/SV40T抗原转基因的前列腺和乳腺癌小鼠模型；以及作为黑素瘤、脑癌、结肠直肠癌和肠癌等模型的动物。这样的小鼠可被用于实施例，来自缅因州Bar Harbor市的Jackson实验室。
[0094] 用这样的方式通过基因工程而被改性的动物包括但不限于：小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗、猪、小鸡、山羊、灵长类动物比如狨等。本领域的技术人员很了解基因工程和/或杂交繁育、以及选择动物用于研究的方法。
[0095] 实施例
[0096] 实施例1.通过进展升级基因-3启动子驱动的基因表达进行肿瘤特异性成像[0097] 提要
[0098] 分子遗传学成像是从有价值的临床前的工具到引导病人管理的进展。该策略涉及在体系中成像报告基因与互补成像试剂的配对，该体系能够被用于在体内测量基因表达、蛋白质相互作用或者跟踪基因标记的细胞。组织特异性的启动子能够被用于描绘在特定组织中的基因表达，特别是当与合适的扩增机制联合时。此处我们显示了由啮齿动物的调节恶性表现型的基因衍生的进展升级基因-3启动子（PEG-PROM），能够被用于选择性地驱动成像用报告分子，以便能够通过使用生物发光和基于放射性核素的分子成像技术来检测人类黑素瘤和乳腺癌的鼠科模型中的微转移疾病。因为有强力的启动子、肿瘤特异性和临床翻译能力，PEG-PROM驱动的基因表达可以代表实际的、新的系统，借助该系统可便于癌症成像、以及成像与治疗的结合。
[0099] 引言
[0100] 作为啮齿动物基因的进展升级基因-3（PEG-3）中的最小启动子区域此前通过使8
用减法杂交 被鉴别其与恶性转化和肿瘤进展的结合性。PEG-PROM以肿瘤特异性方式驱动
9-11
下游的基因表达，并且已经在各种组织比如脑、前列腺、乳房和胰腺 的癌细胞系中、以及
12
在转移性黑素瘤中 进行测试。转录因子AP-1和E1AF/PEA3（ETS-1）已知介导PEG-Prom
8,9,13
的癌症特异性的活性 。先前的研究已经显示了PEG-PROM通过肿瘤内释药而应用于癌
9-12,14
症基因治疗 。在这里我们描述了一种新颖的方法，用于通过PEG-PROM的系统释药而显像多种转移性癌症。基于这些实验，能够看出PEG-PROM驱动的成像用构建体的系统释药将使报告基因能够以一种广泛适用于不同组织来源或亚型的肿瘤的方式不仅在原发瘤内部、而且在相关的转移瘤中进行肿瘤特异性的表达。
用减法杂交 被鉴别其与恶性转化和肿瘤进展的结合性。PEG-PROM以肿瘤特异性方式驱动
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下游的基因表达，并且已经在各种组织比如脑、前列腺、乳房和胰腺 的癌细胞系中、以及
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在转移性黑素瘤中 进行测试。转录因子AP-1和E1AF/PEA3（ETS-1）已知介导PEG-Prom
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的癌症特异性的活性 。先前的研究已经显示了PEG-PROM通过肿瘤内释药而应用于癌
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症基因治疗 。在这里我们描述了一种新颖的方法，用于通过PEG-PROM的系统释药而显像多种转移性癌症。基于这些实验，能够看出PEG-PROM驱动的成像用构建体的系统释药将使报告基因能够以一种广泛适用于不同组织来源或亚型的肿瘤的方式不仅在原发瘤内部、而且在相关的转移瘤中进行肿瘤特异性的表达。
[0101] 方法
[0102] 在下面的“附图说明”部分能够发现到关于实验工序和结果的补充细节。
[0103] 质粒。按照此前描述的方法9构建pPEG-Luc。在pPEG-Luc中的Luc编码基因被来自pORF-HSVltk质粒（InvivoGen）的HSV1-tk编码序列替代，从而产生pPEG-HSVltk。用EndoFree质粒试剂盒（Qiagen）制备pDNA，并且将DNA团粒溶于无内毒素的水（Lonza）中。用ToxinSensor凝胶凝血内毒素测定试剂盒（GenScript）确保内毒素水平为<2.5内毒素单位（EU）/mgpDNA。
[0104] 系统的DNA释药。低分子量的基于l-PEI的阳离子聚合物、体内jetPEITM、（Polyplus-转染）提供了基因释药媒介物。根据制造商的说明书形成DNA-复合物。分别TM将30μg的pDNA和3.6μl的150mM体内-jetPEI 稀释在无内毒素的5%葡萄糖溶液中，然后混合一起，得到在总体积400μL中的N:P比为6:1。该DNA-聚合物混合物在室温下孵育15分钟。在5分钟间隔内，作为两个200μL的注射，把400μL注入到动物的外侧尾部静脉。
[0105] 实验性转移模型的产生。根据约翰霍普金斯动物护理和使用委员会（Johns Hopkins Animal Care and Use Committee）的规章制度进行动物研究。BLI研究使用实验性的人类黑素瘤（Mel）和乳腺癌（BCa）转移模型。5-6周大的雌性NCRnu/nu小鼠（NCI-Frederick）接受全身照射（5Gy）以确保在裸鼠中残留免疫系统的抑制。在辐射之后6
24h内，动物被随机分成三个组。一个组被静脉内（IV）注射5x10 个细胞人类恶性黑色素
6
瘤细胞系MeWo（ATCC）以便产生Mel。另一个组的小鼠接受静脉内注射2x10 个细胞人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231用于产生BCa。再一个组被维持作为对照。在两个模型中，在细胞注射后4-7周，在肺中的转移性瘤形成通过CT被证实。对于SPECT-CT研究，按如上所述方法（除全身照射被省略以外）产生Mel模型。作为对照组，我们使用相同年龄的雌性NCR nu/nu小鼠。MeWo和MDA-MB-231细胞系分别被保持在补充有10%FBS和1%青霉素/链霉素的MEM和RPMI-1640介质中。
24h内，动物被随机分成三个组。一个组被静脉内（IV）注射5x10 个细胞人类恶性黑色素
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瘤细胞系MeWo（ATCC）以便产生Mel。另一个组的小鼠接受静脉内注射2x10 个细胞人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231用于产生BCa。再一个组被维持作为对照。在两个模型中，在细胞注射后4-7周，在肺中的转移性瘤形成通过CT被证实。对于SPECT-CT研究，按如上所述方法（除全身照射被省略以外）产生Mel模型。作为对照组，我们使用相同年龄的雌性NCR nu/nu小鼠。MeWo和MDA-MB-231细胞系分别被保持在补充有10%FBS和1%青霉素/链霉素的MEM和RPMI-1640介质中。
[0106] 体内生物发光成像。在基因释药后24和48h，用IVIS光谱（Xenogen/Caliper）使动物显像。对于每个成像，小鼠在使用1.5-2.5%异氟烷/氧气混合物麻醉下被腹膜内注射D-荧光素（150mg/kg）。在注射D-荧光素后从5分钟至35分钟逐次获得图像。为了抵消2D图像的局限性，使大多数动物在下述四个不同的位置中显像：腹部、左侧、右侧、背部。覆盖整个胸腔的相同大小与形状的ROIs被应用于图像，来计算在转移性位点定位中的组内变化。测量了在ROIs中的总通量（p/s）。一个未接受任何试剂的NCR nu/nu雌性小鼠被显像，所用的包括重新分级和曝置时间在内的设置相同。将相同的ROIs将应用于图像，并且定量的总流量被用作背景信号，将其从来自实验动物的测量计数中减去。使用生动映象软件（Caliper Life Sciences）进行图像采集和BLI数据分析。
[0107] SPECT-CT成像和数据分析。在注射pPEG-HSVltk/PEI复合物后46h，动物用125
51.8mBq（1.4mCi）的[ I]FIAU静脉内注射。在放射性示踪剂注射后24h和48h，用采用低能量单孔准直仪（1.0mm孔径）的X-SPECT小动物SPECT-CT系统（Gamma Medica-Ideas公司）获得图像数据。用3.35cm的转动半径（ROR）获得聚焦的肺部成像，并且用6.75cm的ROR获得全身成像。在注射后24h，用5.625度增量和每个突出部30sec的采集在64个突出部中使动物显像，并且在注射后48h用每个突出部60sec使动物显像。SPECT图像与512-片段CT图像的图像融合。用2D秩序亚设定预期最大值（2D ordered sub sets-expectation maximum，OS-EM）算法重构断层X光摄影图像数据集，具有两个重复和四个子集，并且将AMIDE38and Amira（Visage Imaging）软件用于分析。
51.8mBq（1.4mCi）的[ I]FIAU静脉内注射。在放射性示踪剂注射后24h和48h，用采用低能量单孔准直仪（1.0mm孔径）的X-SPECT小动物SPECT-CT系统（Gamma Medica-Ideas公司）获得图像数据。用3.35cm的转动半径（ROR）获得聚焦的肺部成像，并且用6.75cm的ROR获得全身成像。在注射后24h，用5.625度增量和每个突出部30sec的采集在64个突出部中使动物显像，并且在注射后48h用每个突出部60sec使动物显像。SPECT图像与512-片段CT图像的图像融合。用2D秩序亚设定预期最大值（2D ordered sub sets-expectation maximum，OS-EM）算法重构断层X光摄影图像数据集，具有两个重复和四个子集，并且将AMIDE38and Amira（Visage Imaging）软件用于分析。
[0108] PET-CT成像和数据分析。在9.25mBq（0.25mCi）的FDG静脉内注射给药后1h，使用采用250-700keV能窗的eXplore Vista小动物PET扫描仪（GE保健公司）获得全身图像。在接受FDG之前动物被绝食6-12h，并且在取暖电毯上保温，以便使非肿瘤组织中的放射性示踪剂累积最小化。PET图像与512-片段CT图像的图像融合。用3D有序子集最大期望值（OS-EM）算法重构断层X光摄影图像数据集，该算法具有三个叠代和十二子集，并且用AMIDE38软件分析。
[0109] 免疫组织化学。在pPEG-Luc/PEI复合物释药后48h获取BLI数据之后，采集每个显示Luc表达的每个器官，并且固定在10%中性缓冲的福尔马林中。石蜡包埋的5μm厚的切片和25μm厚的肺低温切割片被用兔抗荧光素酶多克隆抗体（1:25稀释的50μg/ml保藏液，Fitzgerald工业国际公司）在室温下染色1h。被辣根过氧化物酶（HRP）共轭的多克隆TM的山羊抗兔抗体被用作第二抗体。用3,3'-二氨基联苯胺底物-色原（EnVision +试剂盒，Dako）检测HRP活性。数理统计分析。在图解数据中的误差柱图代表平均值±s.e.m.。进行双尾研究检验t检验（two-tailed Student's t test），具有统计上认为显著的P<0.05。
[0110] 结果
[0111] 通过体内生物发光成像进行的PEG-Prom的癌症特异性活性
[0112] 为了测试PEG-Prom对于体内肿瘤显影的特异性，我们使用两种不同的报告分子，即荧光虫荧光素酶（Luc）和单纯疱疹病毒1胸苷激酶（HSV1-tk）。Luc经常与生物发光成像（BLI）一起使用，以便确立在临床模型中成像特异性的基因表达或者被基因标记的细胞的原理论证（proof-of-principle），虽然HSV1-tk（也经常被预临床地使用）已经被翻译为临床研究。因此，我们产生了两个质粒构建体，即pPEG-Luc和pPEG-HSVltk（图1）。我们选择人类黑素瘤和乳腺癌这两种不同组织的实验性转移模型来成像。作为基因释药媒介物，TM我们使用基于直链聚乙烯亚胺（1-PEI）的体内-jetPEI ，直链聚乙烯亚胺是最广泛使用的用于基因释药的阳离子聚合物。我们选择惰性的（非病毒的）媒介物而不是选择病毒释药系统，以避免用病毒载体可以看出的偏向的（biased）系统释药，病毒释药系统具有一旦静脉
15,16
内（IV）给药就定位于肝脏的倾向 。
15,16
内（IV）给药就定位于肝脏的倾向 。
[0113] 在人类恶性黑色素瘤细胞系MeWo、或人类转移性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的静脉内给药之后4-6周，在通过计算机断层显像（CT）确认肺中转移性瘤的存在之后，动物接受IV剂量的pPEG-Luc PEI复合物（图1A）。在质粒DNA（pDNA）释药后24小时和48小时，通过BLI评估PEG-Prom驱动的基因表达。相同的pDNA释药和成像方案被应用于一组作为阴性对照的健康的动物。仅在黑素瘤转移模型（Mel）中观察到由PEG-Prom驱动的Luc表达，并且在对照动物中没有观察到（未显示）。对照动物显示出接近背景水平的在24h时间点处的BLI产出，该BLI产出在成像开始48h消失（未显示）。在pPEG-Luc给药之后的两个时间点处，与对照相比，代表主要在肺中Luc表达的来自胸腔的BLI信号强度的定量显示出明显更高的Mel组中PEG-Prom活性（图2A），在48h处更是如此。在乳腺癌转移（BCa）模型中观察到类似的结果（图3A和图3B）。对于BCa模型，再调整对照组的相同的假彩色图像，以使得对照组和BCa组被换算成相同的阈值。如同Mel模型那样，与对照组相比，在BCa组中，定量的来自胸腔的生物发光强度显示出更高的PEG-Prom活性，并且在pPEG-Luc释药后48h更是明显如此（图3A）。与使用MeWo转移的Mel组相比，包埋MDA-MB-231转移的BCa组需时更长，以便提供BLI信号相对于背景的显著增强，可能导致在BCa模型中基因释药的较低效率，如同下文中讨论的那样。在Mel组、BCa组和对照组中每个组的所有动物中的BLI图像，得到了相同的假彩色阈值。
[0114] 平均起来，从Mel组与BCa组在48h处相比可以看出，Luc表达大约高三倍的水平。在两个模型的肺中，CT扫描和大体解剖图显示了极为不同的转移性瘤形成模式。虽然MeWo细胞形成均匀散布于整个肺（图2C，黑色箭头）的小瘤，但MDA-MB-231细胞趋向于形成的分离大的瘤（图3B，黑色箭头）。使用福尔马林固定的石蜡包埋（FFPE）肺剖面的苏木精和曙红（H&E公司）染色的组织学分析显示，在Mel模型中来源于MeWo细胞的转移被较好地血管化（未显示），虽然在包埋来源于MDA-MB-231细胞的转移的BCa动物的肺中形成的瘤中观察到坏死的中心（未显示）。除了降低基因释药的效率之外，很少的血管化和随之发生的BCa肿瘤中心坏死可以限制D-荧光素和氧气接近肿瘤，所述血管化和中心坏死对于产生BLI信号是必需的伴随物。
[0115] 为了排除通过BLI显示的Luc的肿瘤特异性表达或许由在正常小鼠肺组织和恶性小鼠肺组织之间的转染效率差异导致的可能性，我们定量了被释放至每个动物肺部的pDNA的量。我们进行了定量实时PCR（qRT-PCR），使用被设计成扩增pPEG-Luc质粒中Luc编码基因区域的引物对。从肺组织提取的总DNA被用作模板。在对照组和Mel组之间转染效率的差异不显著（图4A和图4B）。另一方面，BCa组具有与对照相比显著更低的转染效率。该结果证实，在这些模型中观察到的Luc的肿瘤特异性表达应归因于PEG-Prom的肿瘤选择性活性、而不是在正常肺和恶性肺之间有差异的转染效率。很少的血管化和被解离的较大瘤很可能对在BCa模型的肺中观察到的较低转染效率做出了贡献。作为对上述肿瘤显影的特异性的、PEG-Prom介导的本质的进一步检查，我们还比较了在健康对照组和Mel组的肺中组成性的巨细胞病毒（CMV）启动子活性（图5A和图5B）。BLI显示出在对照组和Mel组之间在pCMV-Tri/PEI复合物系统释药之后直至45h的任何时间，CMV启动子驱动的Luc表达水平没有显著差异。该结果建议，这不是肿瘤微环境的独特特性，比如增强的血管分布或者增强的渗透性，引起在肿瘤中相对于正常肺组织更大的质粒表达。
[0116] 使用系统地给药的pPEG-Luc进行的BLI还使得在Mel模型和BCa模型中肺柔软组织外侧的较小的转移性沉积，即微转移（micrometastases），能够成像。这一点通过收集产生高于背景的BLI信号区域并进行相关的组织学分析而被证实。具体地讲，对于来自有代表性的Mel模型即Mel-2的组织切片进行的组织学分析证实，Luc表达与在下述部位中形成的转移性位点有关：肺、肾上腺、邻接于胸骨胸腔、和毗连膀胱的腹部的腹股沟脂肪组织。类似地，在肺、胰周区域、邻接于胸骨的胸壁、位于围绕膀胱的脂肪的结缔组织的淋巴结、和呈薄排的微转移沉积形式的肋骨架内侧的有代表性的BCa模型即BCa-3中，观察到在转移性位点和PEG-Prom活性之间的相关性。
[0117] 通过体内放射性核素成像检测受PEG-Prom调节的癌症
[0118] 虽然用BLI能够检测恶性的肺损害和胸腔外的微转移，但是该技术被限于临床前研究。这是由于数种因素，包括需要给药荧光素酶底物、不足的BLI出射光穿透深度、以及难以产生定量的断层成像的基于BLI的成像。
[0119] 因此，我们产生了临床上更相关的受PEG-Prom驱动的基因表达成像系统pPEG-HSVltk（图1B），其一旦给药被适当地进行放射性标记的核苷类似物就能够通过使用基于放射性核素的技术，即单光子发射计算机化断层显像（SPECT）或者正电子发射成像术（PET），进行检测。我们使用Mel实验性转移模型来用SPECT-CT显示靶向肿瘤成像。在按上述方法接受MeWo细胞之后大约7周，Mel组和对应的对照组通过IV注射接受pPEG-HSVltk/
125
PEI复合物。在pDNA释药后46时，动物被注射2'-氟-2'-脱氧-β-D-5-[ ]碘尿嘧啶-阿
125
拉伯呋喃糖苷（[ I]FIAU），并且在接受放射性示踪剂之后24h和48h处成像（图6A和图
125
6C）。放射性的定量显示，在Mel模型的肺中[ I]FIAU的累积比在对照中高31倍，表明受控于PEG-Prom下的HSV1-tk的肿瘤特异性表达（图6B）。我们通过在成像开始后48h的大体组织学分析，进一步证实了在假定的胸腔外转移性位点中的肿瘤存在。在全身SPECT-CT成像（图7A）上检测出在对应于完整组织学样本的Mel-2的背部颈中多个转移性病变。转移性位点，比如一个在脊髓左方，另一个立刻在隔膜上面，而另一个在左侧腹股沟淋巴结上，它们类似地在Mel-3中相关联（图7B-图7D）。为了评估检测的精确度和受PEG-Prom调节
18
的成像的翻译潜力，我们将PEG-Prom系统检测病变的能力与临床标准[ F]氟去氧葡萄糖（FDG）进行了比较。使用每个方法使相同的动物显像。在大多数情况中，被检测的转移性瘤在两个基于放射性核素的技术之间较好地相关联。然而，基于PEG-Prom的系统较好地能够
17,18
检测邻接于心脏和作为已知汇集FDG 的区域的褐色脂肪组织的瘤。这种发现特别有意义，这是由于如下事实：SPECT固有地比PET少至少一个数量级的灵敏度。
125
PEI复合物。在pDNA释药后46时，动物被注射2'-氟-2'-脱氧-β-D-5-[ ]碘尿嘧啶-阿
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拉伯呋喃糖苷（[ I]FIAU），并且在接受放射性示踪剂之后24h和48h处成像（图6A和图
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6C）。放射性的定量显示，在Mel模型的肺中[ I]FIAU的累积比在对照中高31倍，表明受控于PEG-Prom下的HSV1-tk的肿瘤特异性表达（图6B）。我们通过在成像开始后48h的大体组织学分析，进一步证实了在假定的胸腔外转移性位点中的肿瘤存在。在全身SPECT-CT成像（图7A）上检测出在对应于完整组织学样本的Mel-2的背部颈中多个转移性病变。转移性位点，比如一个在脊髓左方，另一个立刻在隔膜上面，而另一个在左侧腹股沟淋巴结上，它们类似地在Mel-3中相关联（图7B-图7D）。为了评估检测的精确度和受PEG-Prom调节
18
的成像的翻译潜力，我们将PEG-Prom系统检测病变的能力与临床标准[ F]氟去氧葡萄糖（FDG）进行了比较。使用每个方法使相同的动物显像。在大多数情况中，被检测的转移性瘤在两个基于放射性核素的技术之间较好地相关联。然而，基于PEG-Prom的系统较好地能够
17,18
检测邻接于心脏和作为已知汇集FDG 的区域的褐色脂肪组织的瘤。这种发现特别有意义，这是由于如下事实：SPECT固有地比PET少至少一个数量级的灵敏度。
[0120] 讨论
[0121] 我们的目标是开发一种可系统地释药的构建体，其能够使癌症进行分子基因成像。提供这样一种构建体所必需的元件包括足够地强力的具有癌症特异性的启动子，有可4
能用于临床翻译并且能与基因治疗相关连。来源于人类端粒酶逆转录酶（hTERT）、存活蛋
19 20
白 和癌胚抗原（CEA） 启动子的启动子和增强子元件已经在分子基因成像中使用，以便提供肿瘤特异性报告分子表达。然而，因为那些研究使用腺病毒载体，所以释药被限制在局部给药，系统给药导致仅在肝脏内部表达。在此通过对比，在使用非病毒载体进行系统的释药之后，我们能够用PEG-Prom描绘转移。通常，为了成像或者治疗目的，启动子活性必须被放大以便驱动下游基因。用于这样做的一个策略涉及使用GAL4-VP16融合蛋白和GAL4反
19,20,23-25 21,22
应元件 的两步转录扩增（TSTA）系统 。然而，PEG-Prom不需要扩增以便取得高
灵敏度的成像。SPECT-CT成像显示了在pPEG-HSVltk给药后4天之外的转移至正常肺部的信号比31（图6B）。PEG-Prom活性与SV40启动子的组成性活性（数据未显示）相似。与
9
此前报告的体外结果 保持一致地，我们在这里显示，在体内使用成像形态、并且在两个测试的肿瘤模型中都证明PEG-Prom是肿瘤特异性的，有可能进一步一般化至其他的形态和肿瘤。我们进一步选择pPEG-HSV1tk，因为其被临床翻译的能力。通过分别地使用HSVltk
7,26 6,27-29
和放射性标记的核苷类似物 以及鸟嘌呤 ，已经完成了临床分子基因成像和基因治疗。通过通过使用1-PEI复合物释药媒介物，我们避免了在基因释药中病毒载体伴随的问
30
题，包括免疫反应 和肿瘤发生。通过使用pDNA载体，在体内染色体外基因整合进入寄主
31-34
基因组的速度可以被忽略 。我们同时估计了体内jetPEITM作为pPEG-HSVltk释药媒介物用于检测骨和脑转移的潜力，人们可能认为纳米颗粒释药系统难以通过系统给药来达到该潜力。尽管比在肺内部低，但qRT-PCR显示出显著量的pDNA释药至那些组织中的每一个（图8）。而且，难以到达的是在肿瘤内部的坏死区，该坏死区几乎没有被血管化。分子基因成像技术一般来讲将被期望，具有更有效的pDNA至肿瘤存活部分的释药，建议更精确的较好地血管化的检测，与主要坏死病变相反。
能用于临床翻译并且能与基因治疗相关连。来源于人类端粒酶逆转录酶（hTERT）、存活蛋
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白 和癌胚抗原（CEA） 启动子的启动子和增强子元件已经在分子基因成像中使用，以便提供肿瘤特异性报告分子表达。然而，因为那些研究使用腺病毒载体，所以释药被限制在局部给药，系统给药导致仅在肝脏内部表达。在此通过对比，在使用非病毒载体进行系统的释药之后，我们能够用PEG-Prom描绘转移。通常，为了成像或者治疗目的，启动子活性必须被放大以便驱动下游基因。用于这样做的一个策略涉及使用GAL4-VP16融合蛋白和GAL4反
19,20,23-25 21,22
应元件 的两步转录扩增（TSTA）系统 。然而，PEG-Prom不需要扩增以便取得高
灵敏度的成像。SPECT-CT成像显示了在pPEG-HSVltk给药后4天之外的转移至正常肺部的信号比31（图6B）。PEG-Prom活性与SV40启动子的组成性活性（数据未显示）相似。与
9
此前报告的体外结果 保持一致地，我们在这里显示，在体内使用成像形态、并且在两个测试的肿瘤模型中都证明PEG-Prom是肿瘤特异性的，有可能进一步一般化至其他的形态和肿瘤。我们进一步选择pPEG-HSV1tk，因为其被临床翻译的能力。通过分别地使用HSVltk
7,26 6,27-29
和放射性标记的核苷类似物 以及鸟嘌呤 ，已经完成了临床分子基因成像和基因治疗。通过通过使用1-PEI复合物释药媒介物，我们避免了在基因释药中病毒载体伴随的问
30
题，包括免疫反应 和肿瘤发生。通过使用pDNA载体，在体内染色体外基因整合进入寄主
31-34
基因组的速度可以被忽略 。我们同时估计了体内jetPEITM作为pPEG-HSVltk释药媒介物用于检测骨和脑转移的潜力，人们可能认为纳米颗粒释药系统难以通过系统给药来达到该潜力。尽管比在肺内部低，但qRT-PCR显示出显著量的pDNA释药至那些组织中的每一个（图8）。而且，难以到达的是在肿瘤内部的坏死区，该坏死区几乎没有被血管化。分子基因成像技术一般来讲将被期望，具有更有效的pDNA至肿瘤存活部分的释药，建议更精确的较好地血管化的检测，与主要坏死病变相反。
[0122] 在这里，我们显示了PEG-Prom如何可以用作在体内用于黑素瘤和乳腺癌转移的显像剂，并且建议该启动子用于该目的可能通用性。在它们的来源组织或者亚型被鉴别之前，这样的试剂能够被用于检测肿瘤，无关在正常组织中的非特异性表达。如同其他的显像剂那样，PEG-Prom不仅能够被用于肿瘤检测，而且能够用于外科手术前的计划、手术中的安排和治疗监控。通过使用内部的核糖体进入位点、或者其他使基因表达能够串联的策略，PEG-Prom成像系统还可以被做成治疗诊断试剂。启动子比如用于前列腺癌的PSA（前23,24 25,35
列腺特异性的抗原）启动子 、用于乳腺癌的粘蛋白-1启动子 、以及用于卵巢癌的间
36
皮素（mesothelin）启动子 已通过分子基因成像被用于描绘原发瘤和淋巴结转移。类似地，虽然hTERT、存活蛋白和CEA启动子被报道了较少组织以及更多的癌症特异性的本质，但它们的活性依赖于标志基因的转录水平。更精确地讲，PEG-Prom是直接地应答于对肿瘤
34
细胞独特的转录因子。PEG-3基因是大鼠生长阻止和DNA损伤可诱导的基因GADD 的截断
37
突变体形式，其唯一地出现在鼠科肿瘤发生期间，并且可以作为促进恶性表现型 的主要
34
阴性的GADD 。在包括人类GADD同系物的启动子/增强子区域在内的人类基因组中没有发现PEG-Prom的同系物，这使得在人类个体中可利用PEG-Prom并可能产生最小的背景信
19,37
号 。
列腺特异性的抗原）启动子 、用于乳腺癌的粘蛋白-1启动子 、以及用于卵巢癌的间
36
皮素（mesothelin）启动子 已通过分子基因成像被用于描绘原发瘤和淋巴结转移。类似地，虽然hTERT、存活蛋白和CEA启动子被报道了较少组织以及更多的癌症特异性的本质，但它们的活性依赖于标志基因的转录水平。更精确地讲，PEG-Prom是直接地应答于对肿瘤
34
细胞独特的转录因子。PEG-3基因是大鼠生长阻止和DNA损伤可诱导的基因GADD 的截断
37
突变体形式，其唯一地出现在鼠科肿瘤发生期间，并且可以作为促进恶性表现型 的主要
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阴性的GADD 。在包括人类GADD同系物的启动子/增强子区域在内的人类基因组中没有发现PEG-Prom的同系物，这使得在人类个体中可利用PEG-Prom并可能产生最小的背景信
19,37
号 。
[0123] 这些研究证明，PEG-Prom可以具有所有的必需的元件来提供一种用于成像、以及可能地由图像引导的多种癌症的实用策略。
[0124] 实施例1中的参考文献
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[0163] 实施例2
[0164] 概要：
[0165] 癌症的目标图像保留了有意义的、但是易忘的目标。这样的图像能够提供早期诊3
断，有助于治疗计划，并且深深地有益于治疗监控。我们通过减法杂交 鉴别了由啮齿动物
1,2
PEG-3基因衍生的进展升级基因-3（PEG-Prom）最小的启动子区域 ，啮齿动物PEG-3基因
3,4
的表达直接地与啮齿动物肿瘤中、以及人类肿瘤中的恶性转化和肿瘤进展相关联 ，所述
5-9
人类肿瘤包括由脑、前列腺、乳房、黑素瘤、以及胰腺 中的肿瘤衍生的癌细胞系。基于这些发现，我们假设、并且随后证实，与图像构建体相关、并且调控图像构建体的PEG-Prom的
10
系统释药将能够以可广泛适用于不同组织来源的肿瘤或者亚型的方式 导致报告基因不仅在原发肿瘤内部、而且在相关转移中的肿瘤特异性表达。PEG-Prom是直接地应答于对肿
6-9
瘤细胞 、AP-1和PEA-3独特的升级转录因子。并且在人类基因组中没有发现同系物，这
1,5
使得在人类个体中可利用PEG-Prom并可能仅产生最小背景信号 。因此，PEG-Prom不仅能够被用于肿瘤检测，而且能够用于外科手术前的计划、在操作中的安排和治疗监控。
断，有助于治疗计划，并且深深地有益于治疗监控。我们通过减法杂交 鉴别了由啮齿动物
1,2
PEG-3基因衍生的进展升级基因-3（PEG-Prom）最小的启动子区域 ，啮齿动物PEG-3基因
3,4
的表达直接地与啮齿动物肿瘤中、以及人类肿瘤中的恶性转化和肿瘤进展相关联 ，所述
5-9
人类肿瘤包括由脑、前列腺、乳房、黑素瘤、以及胰腺 中的肿瘤衍生的癌细胞系。基于这些发现，我们假设、并且随后证实，与图像构建体相关、并且调控图像构建体的PEG-Prom的
10
系统释药将能够以可广泛适用于不同组织来源的肿瘤或者亚型的方式 导致报告基因不仅在原发肿瘤内部、而且在相关转移中的肿瘤特异性表达。PEG-Prom是直接地应答于对肿
6-9
瘤细胞 、AP-1和PEA-3独特的升级转录因子。并且在人类基因组中没有发现同系物，这
1,5
使得在人类个体中可利用PEG-Prom并可能仅产生最小背景信号 。因此，PEG-Prom不仅能够被用于肿瘤检测，而且能够用于外科手术前的计划、在操作中的安排和治疗监控。
[0166] PEG-3-Luc小鼠的构建：以PEG-Prom的转化特异性为基础，我们开发了PEG-Luc转基因小鼠。为了产生PEG-3/luc2转基因构建体，一个446bp的大鼠PEG-3启动子（从-252到+194）被插入pBS/pKCR3中兔的β-球蛋白区域的上游。pBS/pKCR3载体含有β-球蛋11
白内含子2及其侧翼外显子，用于有效的转基因表达 。来自第一构建体的PEG-3/β-球蛋白复合物片段然后被插入pgl4.10[luc2]载体（Promega公司）中合成荧光虫荧光素酶基因（luc2）的上游。为了产生PEG-3/luc2转基因小鼠，一个3.4kb的Spel/BamHI片段被从PEG-3/luc2构建体上切除，并且评估该片段的转基因表达。来自第一构建体的PEG-3/β-球蛋白复合物片段然后被插入pGL4.10[luc2]载体（Promega公司）中合成荧光虫荧光素酶基因（luc2）的上游。为了产生PEG-3/luc2转基因小鼠，一个3.4kb的Spel/BamHI片段被从PEG-3/luc2构建体上切除，并且被微注射（microinjected）进入通过CB6F1（C57BL/6x Balb/C）雄性和雌性小鼠交配获得的受精单细胞小鼠胚胎的雄原核。该注射后的胚胎然后被再植入进入伪怀孕（pseudopregnant）的CD-1雌性小鼠的输卵管。通过基因组尾部DNA的PCR分析，筛选后代的PEG-3/luc2转基因存在，该PCR分析使用兔β-球蛋白内含子2正义引物（5'-CCCTCTGCTAACCATGTTCATGC-3'，SEQIDNO:3）和luc2反义引物（5'-TCTTGCTCACGAATACGACGGTG-3'，SEQIDNO:4）。已经确立4个载有PEG-3/luc2转基因的潜在建立者，并且已经发展了PEG-Luc小鼠的克隆。
白内含子2及其侧翼外显子，用于有效的转基因表达 。来自第一构建体的PEG-3/β-球蛋白复合物片段然后被插入pgl4.10[luc2]载体（Promega公司）中合成荧光虫荧光素酶基因（luc2）的上游。为了产生PEG-3/luc2转基因小鼠，一个3.4kb的Spel/BamHI片段被从PEG-3/luc2构建体上切除，并且评估该片段的转基因表达。来自第一构建体的PEG-3/β-球蛋白复合物片段然后被插入pGL4.10[luc2]载体（Promega公司）中合成荧光虫荧光素酶基因（luc2）的上游。为了产生PEG-3/luc2转基因小鼠，一个3.4kb的Spel/BamHI片段被从PEG-3/luc2构建体上切除，并且被微注射（microinjected）进入通过CB6F1（C57BL/6x Balb/C）雄性和雌性小鼠交配获得的受精单细胞小鼠胚胎的雄原核。该注射后的胚胎然后被再植入进入伪怀孕（pseudopregnant）的CD-1雌性小鼠的输卵管。通过基因组尾部DNA的PCR分析，筛选后代的PEG-3/luc2转基因存在，该PCR分析使用兔β-球蛋白内含子2正义引物（5'-CCCTCTGCTAACCATGTTCATGC-3'，SEQIDNO:3）和luc2反义引物（5'-TCTTGCTCACGAATACGACGGTG-3'，SEQIDNO:4）。已经确立4个载有PEG-3/luc2转基因的潜在建立者，并且已经发展了PEG-Luc小鼠的克隆。
[0167] 小鼠乳腺瘤病毒（MMTV）-neu转基因小鼠：小鼠乳腺瘤病毒（MMTV）-neu转基因小12
鼠过表达NEU蛋白质，其为人类her2基因的小鼠同系物 。该模型携带有未激活的在MMTV启动子/增强子的转录控制下的neu基因。因此，该模型可通过过量表达、而不是neu的点突变来模拟受人类her2驱动的乳腺癌；导致病灶的（focal）乳腺肿瘤，并允许形成逼真的治疗性研究平台。MMTV-neu转基因小鼠在哺乳期间发展病灶乳腺肿瘤，并且具有7-8个月的潜伏期。
鼠过表达NEU蛋白质，其为人类her2基因的小鼠同系物 。该模型携带有未激活的在MMTV启动子/增强子的转录控制下的neu基因。因此，该模型可通过过量表达、而不是neu的点突变来模拟受人类her2驱动的乳腺癌；导致病灶的（focal）乳腺肿瘤，并允许形成逼真的治疗性研究平台。MMTV-neu转基因小鼠在哺乳期间发展病灶乳腺肿瘤，并且具有7-8个月的潜伏期。
[0168] 双重转基因小鼠（MMTV-neu/PEG-Prom-Luc；MnPp-Luc）的发展用于体内成像：以PEG-PROM在人类乳腺癌细胞系中的癌症特异性表达为基础，我们假设PEG-Prom的活性将增强，因为乳腺细胞变得转化进入肿瘤并转移。为了确立原理论证（proof-of-principal），通过在MMTV-neu雌性和来自多个PEG-Luc细胞系的PEG-Luc转基因雄性之间交配，从而发展双重的（MMTV-neu/PEG-Prom-Luc；MnPp-Luc）转基因小鼠，我们已经产生了MMTV-neu PEG-Prom-Luc（MnPp-Luc）小鼠。如预期的那样，携带乳腺肿瘤的小鼠（图9，上面的画面）在已被证实的肿瘤（通过在小鼠身上触诊及其他区域证实）中表达荧光素酶，反之肿瘤阴性小鼠在触摸得到的肿瘤中没有显著的荧光素酶表达（图9，较低的画面）。基于这些激发的发现，通过使用非侵袭性的生物发光（BLI）方法，该双重转基因动物模型将可用于测定在疾病的不同阶段治疗性方法和化学预防方法的效力，包括在早期和进展成转移。我们已经收集了不同的器官，并且正在研究与BLI的组织病理学相关性。
[0169] 有意义的是，该研究突出显示了PEG-Prom-Luc动物模型在产生双重转基因肿瘤动物模型中的关联性，该双重转基因肿瘤动物模型能够使用BLI用于监控肿瘤发展、进展成转移、并且监控和评估各种模式的治疗性介入（包括用细胞毒的、程序性细胞死亡诱导的、毒性自噬诱导试剂和坏死引导试剂的治疗；病毒治疗方法；免疫治疗等）。另外，PEG-Prom-Luc动物可以用作单一的转基因动物来考察一些过程，比如皮肤致癌、由暴露于特定的毒性剂而引起的器官致癌、以及化学预防在预防或者限制癌症诱导和进展的严重程度中的作用。
[0170] 总之，这些研究的模式可以变化，提供用于发展癌症诊断小鼠（OncoView小鼠）的原理论证（proof-of principle）。它们进一步提供了利用PEG-Prom-Luc/双重转基因小鼠方法用于生产OncoView小鼠的证据，所述OncoView小鼠中癌症发展和进展能够通过使用BLI而被成像。另外，该方法不仅仅限于乳腺癌，因为其原则上能够被应用于任何癌症转基因动物模型包括，但不限于：胰腺、前列腺、肺、结肠直肠、脑、卵巢、食管、胃、皮肤（黑素瘤）及其他。
[0171] 实施例2中的参考文献
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[0179] 8.Sarkar D,Lebedeva IV,Su ZZ,Park ES,Chatman L,Vozhilla N,Dent P,Curiel,DT,Fisher PB.Eradication of therapy-resistant human prostate tumors using a cancer terminator virus.Cancer Res2007;67(ll):5434-5442.
[0180] 9.Sarkar D,Su ZZ,Park ES,Vozhilla N,Dent P,Curie!DT,Fisher PB.A cancer terminator virus eradicates both primary and distant human melanomas.Cancer Gene Therapy 2008;15(5):293-302.
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[0184] 在此使用的所有术语和用语（例如核酸、蛋白质、多肽等）具有本技术领域通常理解的意义，除非另有陈述。
[0186] 在此引用的所有专利、专利申请和公开，不论前后，都通过引用将它们的整体内容并入本文中。
[0187] 虽然本发明已经描述了其优选的实施方式，但本领域的技术人员应理解，在不违背本发明精神和附后的权利要求的范围的情况下，本发明能够具有各种变型。因此，本发明将不会限于如上所述实施方式，而是应该不违背在此提供的精神和描述的范围的情况下进一步包括所有的变型和其等效形式。
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