[0001] 本发明涉及纳米技术的领域，特别涉及含有至少两种染料的二氧化硅纳米颗粒。更特别地，本发明涉及二氧化硅纳米颗粒，其中所述染料提供了有效的能量传递过程。本发明还提供了所述纳米颗粒在医药领域中，特别是治疗和诊断中，更特别是在治疗诊断中，以及在分析化学领域中的用途。

[0002] 荧光染料是在如环境和食品分析、安全性和医疗诊断等高影响力的领域中的许多应用中被广泛使用的标记物。荧光测量通常灵敏性高、成本低、容易进行、且通用、提供亚微米级可视化和亚毫秒级时间分辨率(L.Prodi,New J.of Chem.2005,29,20-31)。

[0003] 特别是，由于早期诊断与治疗的成功性和病人的生活质量密切相关，医疗诊断需要具有特定的（光）化学和光物理性质的发光标记和传感器，这些性质包括水溶性、耐光性、非常低的毒性和高亮度(L.Prodi,New J.of Chem.2005,29,20-31；Wolfbeis,O.S.Analytical Chemistry2006,78,3859)。

[0004] 光致发光光谱的通用性也源于可以进行调节以优化方便信号的众多的参数。即使是非常复杂的分析问题也可以通过控制激发和发射波长、信号采集的时间窗口，以及激发光或所发射的光的偏振来确实地克服。

[0005] 有价值的基于荧光的标记必须表现出不同的特征(O.S.Wolfbeis,Anal.Chem.2006,78,3859-3873)。作为所有生物标记，要求存在与生物分子共价偶联的反应性基团，这些基团具有水溶性和非毒性。考虑到荧光性质，第一个依赖的事实在于荧光单元应该给出尽可能高的发光信号。提醒的是，因为光致发光通过吸收光子以及随后的辐射失活，从而涉及激发态的形成，所以光致发光是两步骤的过程，通过摩尔吸光系数（ε）和发光量子产率（Φ），信号强度与所述两个过程的效率有直接关系。实际上，在非常稀释的溶液中发光强度与乘积ε×Φ直接成比例，该乘积定义为染料的亮度（L.Prodi,同上）。耐光性也尤为重要，特别是在成像应用中。此外，为了增加性噪比，要避免自体荧光和光散射、源的相关干扰，尤其是当涉及生物样品的时候。这通常可以通过使用三种不同的方法来做到。第一种是基于使用和开发红色和近红外（NIR）染料，这些染料显示了在700-900nm区域的吸收和发光带。作为减少散射的结果这些染料提供最小化背景（由于逆第四功率依赖于波长），且在该频谱范围内不存在生物分子的自然荧光。第二种方法是基于在室温下具有长寿命的磷光发光性染料的使用。在这种情况下，背景光通过使用时间分辨光谱被排除，由于来自自然荧光团的散射光和荧光衰减比磷光快得多，因此可以通过测量安排以消除。最后，大的斯托克斯位移（Stokes-shift）也可以是有价值的，因为它有助于减少来自Rayleigh-Thyndall和拉曼谱带的干扰。

[0006] 由于发光光谱的广泛应用，已进行了许多的科研致力于荧光标记的优化设计，这也获利于纳米技术领域的进步(Bruchez,M.；Moronne,M.；Gin,P.；Weiss,S.；Alivisatos,A.P.Science1998,281,2013；Riehemann,K.；Schneider,S.W.；Luger,T.A.；Godin,B.；Ferrari,M.；Fuchs,H.Angew.Chem.Int.Edit.2009,48,872；Shi,D.L.Adv.Funct.Mater.2009,19,3356；Gunasekera,U.A.；Pankhurst,Q.A.；Douek,M.Targeted Oncology2009,4,169；Strassert,C.A.；Otter,M.；Albuquerque,R.Q.；Hone,A.；Vida,Y.；
Maier,B.；De Cola,L.Angew Chem Int Edit2009,48,7928,Doshi,N.；Mitragotri,S.Adv.Funct.Mater.2009,19,3843；Medintz,I.L.；Uyeda,H.T.；Goldman,E.R.；Mattoussi,H.Nature Materials2005,4,435)。在这一领域的研究提供的所有不同的潜力中，基于二氧化硅的发光纳米颗粒（又称染料掺杂的氧化硅纳米颗粒-DDSNs）可以提供对于重要的分析问题的有趣的解决方案，特别是对于那些涉及医疗诊断和成像的问题(D.Shi,Adv.Funct.Mat.2009,19,3356-3373)，以及对于纳米治疗诊断学设备的发展的问题(Shi,D.L.Adv.Funct.Mater.2009,19,3356；Gunasekera,U.A.；Pankhurst,Q.A.；Douek,M.Targeted Oncology2009,4,169；Yong,K.T.；Roy,I.；Swihart,M.T.；Prasad,P.N.Journal of Materials Chemistry2009,19,4655；Kim,D.K.；Dobson,J.Journal of Materials Chemistry2009,19,6294；Liu,Y.Y.；Miyoshi,H.；Nakamura,M.International Journal of Cancer2007,120,2527；Liu,Y.；Lou,C.；Yang,H.；Shi,M.；Miyoshi,H.Curr.Cancer Drug Targets2011,11,156)。二氧化硅实际上不存在固有的毒性，但更深层次的调查正在进行中，以完全排除涉及纳米颗粒的小尺寸可能产生的危害(Gunasekera,U.A.；Pankhurst,Q.A.；Douek,M.Targeted Oncology2009,4,169；Wang,L.；Wang,K.M.；Santra,S.；Zhao,X.J.；Hilliard,L.R.；Smith,J.E.；Wu,J.R.；Tan,W.H.Analytical Chemistry2006,78,646；
Yong,K.T.；Roy,I.；Swihart,M.T. ；Prasad,P.N.Journal of Materials
Chemistry2009,19,4655；Burns,A.A.；Vider,J.；Ow,H.；Herz,E.；Penate-Medina,O.；
Baumgart,M.；Larson,S.M.；Wiesner,U.；Bradbury,M.Nano Letters2009,9,442)。此外，它们相当简单和可承受的合成方法很容易造出用于生物共轭准备的水溶性系统。此外，每
6 -1 -1
个DDSN可以包含许多荧光基团并达到很容易超过10M cm 的摩尔吸光系数。二氧化硅基质也可以保护纳米颗粒内隔离的染料免受外部化学品侵袭，从而增加它们的（光）稳定性，并在许多情况下，增加它们的发光量子产率，因而DDSN通常显示令人印象深刻的高亮度。

[0007] 然而，除了亮度之外，DDSN还可呈现上面所讨论的其它特征。

[0008] 例如，它们可以很容易地设计成呈现大的斯托克斯位移，并且在更苛刻的条件下，呈现合适的条码和多路复用分析的属性。到目前为止为获得较大的激发和发射波长之间的分离的最简单的建议的方案是Wiesner和他的同事所提出的方案(E.Herz,A.Burns,D.Bonner,U.Wiesner,Macromol.Rapid Commun.2009,30,1907-1910)，他们合成了DDSN，其含有以固有的大的斯托克斯位移为特征的商用荧光（通常随着电荷转移特性具有最低激发态）并由烷氧基硅烷基衍生。这种方案很简单，但该性质可能会受到相对少量的染料的限制。

[0009] 另外，最有趣的和富有成效的方法是利用限制于二氧化硅纳米颗粒内的两种或更多种物质（金属配合物或有机染料）之间的有效的能量传递过程。Zhao和他的同事(C.Wu,J.Hong,X.Guo,C.Huang,J.Lai,J.Zheng,J.Chen,X.Mu,Y.Zhao,Chem.Commun.2008,750-752)开发了一种基于掺杂Ru（II）和Tb（Ⅲ）配合物的二氧化硅系统，而Konovalov和他的 同 事 (S.V.Fedorenko,O.D.Bochkova,A.R.Mustafina,V.A.Burilov,M.K.Kadirov,C.V.Holin,I.R.Nizameev,V.V.Skripacheva,A.Yu.Menshikova,I.S.Antipin,A.I.Konovalov,J.Phys.Chem.C2010,114,6350–6355)提出了类似的系统，基于含Ru（II）和Yb（Ⅲ）的物质，但更红移。

[0010] 这种方案也可允许获得呈现不同颜色的发射光的成组的纳米颗粒，但可在相同的波长有效地激发(L.Wang,W.H.Tan,Nano Lett.2006,6,84-88；L.Wang,C.Y.Yang,W.H.Tan,Nano Lett.2005,5,37-43；X.L.Chen,M.C.Estevez,Z.Zhu,Y.F.Huang,Y.Chen,L.Wang,W.H.Tan,Anal.Chem.2009,81,7009-7014)，这是仅使用量子点（QD）可实现的特征。重要的是要注意，取决于染料的数量和性质及它们之间的能量传递过程的效率，可以构思出两种不同的应用。

[0011] 第一种应用是根据条形码NP的发展。在这种情况下，使用成组的n个染料作为掺杂材料制备了成族的不同的纳米颗粒，每一染料给出不同的发光带。各种纳米颗粒的特征在于在二氧化硅基质内不同浓度的各种染料。如果选择合适的染料，以便有部分的但不完整的能量传递，所有的纳米颗粒可以表现出在一个波长的激发下的多频带发射，它们可以通过由n个不同染料在n个频带（颜色）的不同强度构成的识别标记区分。使用在4个4
发射带中的每一个上呈现5个不同的强度的具有四种染料掺杂的NP，可以设想1024（4）个不同的纳米颗粒。这种方法是有帮助的，只要可以识别单个的纳米颗粒，例如，在荧光显微镜或流式细胞仪检测中：如果衍生每一种纳米颗粒，以便识别不同的生物分子或生物结构（细胞），那么NP的荧光识别标志便会毫不含糊地显示出研究中的分析物的性质，从而允许广泛的多路复用。重要提醒的是，在医疗诊断和成像中，在单次的实验中能够同时测量很多分析物越来越重要(Wolfbeis,O.S.Analytical Chemistry2006,78,3859；Yao,G.；
Wang,L.；Wu,Y.R.；Smith,J.；Xu,J.S.；Zhao,W.J.；Lee,E.J.；Tan,W.H.Analytical and Bioanalytical Chemistry2006,385,518；Sukhanova,A.；Nabiev,I.Critical Reviews in Oncology Hematology2008,68,39)。对于二氧化硅纳米颗粒，也报道了这种方法的很多例子。

[0012] 仅当纳米颗粒内存在的不同的染料之间发生（几乎）完全的能量传递时，第二种方法才是可能的。如果使用成组的四种不同的染料：A、B、C和D（以波长增加的顺序），可以得到含有（ⅰ）A，（ⅱ）A和B，（iii）A、B、C和（iv）A、B、C和D的成组的四种纳米颗粒。所一的纳米颗粒可以在A的吸收处（单波长激发）被激发，但是，在这种情况下，即使在短波激发时也只有最长波长的染料可以表现出显著的荧光(Wang,L.；Tan,W.H.Nano Letters2006,6,84)。虽然在这种情况下，在同一时间可进行研究的可能的分析物的数量显著降低，但是仍然可以通过例如，在许多DNA分析、细胞荧光测定法和组织化学中感兴趣的特征来区分不同的信号而无需分离不同的纳米颗粒，。在这方面，DDSN可以是商业串联染料的有价值的替代物，商业串联染料是两种荧光染料的组合，如藻红蛋白等能量给体和能量受体（通常Cyanine5或7）(Roederer,M.；Kantor,A.B.；Parks,D.R.；Herzenberg,L.A.Cytometry1996,24,191)。

[0013] 串联染料在提供高亮度和较大的斯托克斯位移的同时，呈现出许多缺点，如不稳定和多变性 (Hulspas,R.；Dombkowski,D.；Preffer,F.；Douglas,D.；Kildew-Shah,B.；Gilbert,J.Cytom.Part A2009,75A,966)。

[0014] 基于（至少）两种不同的染料掺杂的二氧化硅也需要提供高重现性和稳定的标记，在这（至少）两种不同的染料之间，非常有效的能量传递过程能确保给体的几乎定量的猝灭和受体的敏化。

[0015] 也应当注意的是，有效的颗粒内能量传递的适当的设计会使得DDSN适合于执行其他非常有价值的功能，如光收集、信号处理和能量转换(Bonacchi,S.；Genovese,D.；Juris,R.；Montalti,M.；Prodi,L.；Rampazzo,E.；Zaccheroni,N.Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,4056)。据我们所知，在氧化硅纳米颗粒领域中，这种方法仍是未开发的。

[0016] 纳米颗粒用于生物分析领域，特别是用于生物分子的检测、标记和成像，也可以用于治疗，特别是作为药物载体（例如，请参见，Q.Huo,J.Liu,L.Q.Wang,Y.Jiang,T.N.Lambert,E.Fang,J.Am.Chem.Soc.2006,128,6447-6453）。

[0017] Tan和其同事（L.Wang,W.Tan,Nano Lett.2006,6,84-88and in WO2007044711）公开了用于检测微生物和生物材料的双染料和三染料的纳米颗粒。根据这些参考文献，荧光能量传递过程（FRET）的其他潜在的优势在于，通过优化NP中的染料分子的数量，可以调整发射光谱，以便在短波长激发时只有最长波长的染料表现出显著的荧光。这种特征将克服许多有机染料的小斯托克斯位移的挑战，使样品中被检测到的NP具有大的瑞利/拉曼散射或内源性荧光。然而，没有如何找到解决这个问题的方案或提供任何改善的迹象。此外，能量传递的效率较低，且不同于主要信道的信道的“噪声”是高的。由于这个原因，作者建议在条码中应用，在该应用中对于每个信道（颜色）有不同的强度（例如4，其具有5个信道会4
给出5（1024）种不同类型的纳米颗粒，每一个都可以与给定的生物标志物相关联）。这种应用不适合于本发明的目的。

[0018] L.Wang,W.Zhao,W.Tan,Nano Res.2008,1,99-115综述了在治疗和诊断中使用的生物结合的二氧化硅纳米颗粒。在这篇综述中，作者提出了双染料和三染料掺杂的二氧化硅纳米颗粒用于多路复用细菌检测。描述了三染料的纳米颗粒，选择三种染料以允许高效率的荧光能量传递，这三种染料是异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明6G（R6G）和6-羧基-X-罗丹明（ROX），因为其有效的光谱重叠。

[0019] 使用能量传递过程（或荧光能量传递过程-FRET）的一些诊断技术要求具有与大的斯托克斯位移相关的高亮度。

[0020] 这意味着能量传递过程的效率越尽可能高，越可能呈现单一波长的激发和大的斯托克斯位移。

[0021] 然而，给体染料的寄生自猝灭问题仍然存在。

[0022] 此外，为了寻求可能的最高亮度，应尽量使自猝灭过程最小化，因为它们降低平均荧光量子产率，从而限制了通过增加标记的程度来增加分子的亮度的直接方法的有效性(Lakowicz,J.R.Principles of Fluorescence Spectroscopy；3rd Ed.ed.；Springer:New York,2006；Montalti,M.；Prodi,L.；Zaccheroni,N.；Zattoni,A.；Reschiglian,P.；Falini,G.Langmuir2004,20,2989)。

[0023] 在这种背景下，要强调的是，尽管由于在纳米颗粒的核中包括大数量的染料，因而观测到的量子产率的减少往往超过增加吸收所能抵消的，但是也会发生DDSN内部自猝灭过程。DDSN内的有效的能量传递在这方面会有所帮助。

[0024] 特别是，如荧光素等香豆素染料或呫吨染料是能量传递过程中的良好的给体，但是当以特定的浓度装载入纳米颗粒中时，会遭受寄生自猝灭（例如，参见：M.Montalti,L Prodi,N.Zaccheroni,A.Zattoni,P.Reschiglian,G.Falini,Langmuir,2008,20,2989-2991）。

[0025] 就本发明人所知，本发明在多路复用分析和诊断技术中解决自猝灭问题并同时确保有效的能量传递过程和大的斯托克斯位移（Stokes shift）的方案，尚未在文献中得到过报道。

[0026] 已经令人惊奇地发现，使用在WO2010013136、WO2010013137中公开的特定的二氧化硅纳米颗粒与选择的具有特定的光谱特性的染料进行组合，可意外地避免或至少基本上减少自猝灭的问题，并且即使使用单一的激发波长也能获得大的斯托克斯位移。同时，即使在较短的激发波长，也只有最长波长的染料表现出显著的荧光。

[0027] 除了其他优点，本发明的优点之一是提供单发色团、双发色团、三发色团和四发色团的纳米颗粒，观察纳米结构内部的不同的染料之间的能量传递过程的前所未有的效率。一方面，这些过程导致非常高的整体增感，且另一方面，导致不同给体的非常低的残余发射，允许用单个波长的激发获得至少四种不同的颜色，而几乎无交叉干扰。

[0028] 因此，本发明的一个目的是二氧化硅纳米颗粒，其包括：a．胶束，所述胶束具有基本上亲水的壳和基本上疏水的中央部；
b.核，其位于所述胶束的所述中央部的区域，并包括硅酸盐网状物；
c.至少一种表面活性剂的多个分子，这些分子至少包括具有以下结构的官能化的表面活性剂的分子：
1 1 2 2
M-Hydro-Lipo-Hydro-M
其中
Lipo代表基本上疏水的链，
1 2
Hydro 和Hydro 彼此独立地代表相应的基本上亲水的链；
1
M 是识别性官能团；
2
M 选自：-H、-OH、识别性官能团和杂基；
d．第一和至少第二染料；其中，所述第一和所述至少第二染料在能量传递过程中有相-1 -1
应的给体-受体偶对关系，并对于考虑的光谱区域具有摩尔吸光系数ε≥10,000M cm ，荧光量子产率Φ≥0.01，根据福斯特理论，在所述给体染料和所述受体染料之间有良好的重叠积分；所述染料可以是亲脂性的（不溶于水）或可能存在用于引入三烷氧基甲硅烷基团的官能团（例如胺、-COOH、-N3、炔烃、烯烃、丙烯、-SH、马来酰亚胺、醛、-OH、异硫氰酸酯、磺酰氯、碘乙酰基、TCT（2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪）或如NHS和NHS-磺基酯（N-羟基琥珀酰亚胺和磺基N-羟基琥珀酰亚胺）等活化的羧酸基团、TFP酯（2,3,5,6四氟苯酚）、PFP酯（五氟苯酚）和HOBt酯（1-羟基苯并三唑）、N-酰基咪唑）。

[0029] 本发明的另一个目的是上述的纳米颗粒在治疗、诊断和治疗诊断中的用途。根据本技术领域中通用的定义和根据上述WO2010013136和WO2010013137中提供的定义，本发明的纳米颗粒的特别优选的用途是探针。

[0030] 本发明的另一个目的是上述纳米颗粒在分析化学中的用途，特别是作为如本技术领域中通用的探针。

[0031] 本发明的另一个目的是诊断或治疗诊断组合物，其包括适量的上述纳米颗粒。

[0032] 本发明的纳米颗粒呈现了优点：每对给体/受体和整体系列染料的能量传递效率是≥85％。

[0033] 本发明提供了如下进一步的优点：-当纳米颗粒包含两种以上的染料时，非常高的总增感和不同给体的非常低的残余发射；
-非常大的斯托克斯位移，可达700-800纳米；
-非常高的亮度,甚至用最高能量激发给体（最蓝的给体）时；
-除了最后的受体，所有染料的残余强度几乎可以忽略不计。

[0034] 本发明发现在核酸分析、组织化学、细胞荧光测定法、病理细菌检测中的有利的应用。

[0035] 通过附图和实施例将详细公开这些目的和其它的目的。

[0036] 在附图中：

[0037] 图1显示了含有D（x 圈）、偶对DX-B0.（1 三角形）、偶对DxB10.（1 正方形）和偶对DxB10.2（菱形）的纳米颗粒的亮度水平作为每个纳米颗粒中增加的D的分子数量的函数（见表5，λex=400纳米）。这里x=（染料的摩尔数/TEOS的摩尔数）*100。

[0038] 图2显示了核-壳型二氧化硅-PEG纳米颗粒的典型的TEM图像，和二氧化硅核尺寸分布，d=（11±3）纳米，（比例尺100纳米和200纳米）。

[0039] 图3示出了核-壳型二氧化硅-PEG纳米颗粒在水中的典型的动态光散射粒径分布（d=23纳米，Pdi=0.09）。

[0040] 图4代表成组的四个NP在405nm（在细胞荧光测定法中通常采用的激光源的发光波长）处呈现出非常高的吸收系数，四个不同的发射带有高亮度和几乎没有交叉干扰。

[0041] 图5示出用四串联系统获得的结果，在所有的可见范围内,其发射与用单个染料掺杂的纳米颗粒中的一个相比几乎可以忽略不计。

[0042] 图6显示了四组玻璃纤维的共聚焦发射光谱，其中本发明的代表性纳米颗粒已经被吸收。该纤维在相同的波长（405nm）被激发，并且是清晰可辨的。

[0043] 在这些图中，a.u.指任意单位。

[0044] 本发明的二氧化硅纳米微粒在WO2010/013136和WO2010/013137中公开，并可以通过所述公开中描述的工艺制备。上述参考文献中公开的所有实施方式、条件、和教导也可以适用于本发明。

[0045] 为了对本发明的总体理解，提供了一种二氧化硅纳米颗粒的制备方案。

[0046] 荧光基团（染料）与表面活性剂混合以形成胶束，胶束随后与烷氧基硅烷反应，以形成二氧化硅纳米颗粒，最后是纳米颗粒被分离。应注意的是，该染料被限制在纳米颗粒的二氧化硅核内。

[0047] 在本发明的第一优选实施方式中，可采用先前报道的过程（E.Rampazzo,S.Bonacchi,R.Juris,M.Montalti,D.Genovese,N.Zaccheroni,L.Prodi,D.C.Rambaldi,A.Zattoni,P.Reschiglian J.Phys.Chem.B,2010,114(45),14605–14613）制备核-壳的二氧化硅-PEG（聚乙二醇）纳米颗粒。为了将染料限制在二氧化硅纳米颗粒的核内，对以前的Rampazzo等的工艺进行修改是必要的。在典型的制备方法中，将合适量的表面活性剂（例如Pluronic F127）和所需量的烷氧基硅烷衍生的或不溶于水的染料溶解在适当的溶剂中，如卤化烃或具有相似的溶剂性能的有机溶剂，例如二氯甲烷。得到均匀的溶液后，将溶剂去除，例如通过惰性气体流和/或在不影响产品的稳定性的温度（如室温）下在真空蒸发。将惰性离子盐（例如NaCl）添加到固体残余物，以增加溶液的离子强度，并在室温下用稀释的酸性水溶液溶解该混合物。该溶液可以包含一种弱酸（例如乙酸）或较强酸（例如HCl）。然后将例如TEOS等二氧化硅前体加入到所得的均匀的水溶液，足够量的时间后（例如3小时）添加硅烷化化合物（例如TMSCl）。

[0048] 反应完成后，在20-72小时之内（例如48小时），从反应混合物中分离纳米颗粒。分离的方法是公知的，在一种优选实施方式中，使用对水透析。

[0049] 此外，可以使用替代的合成方案，特别是对于在酸性环境中不稳定的染料。在典型的制备方法中，将表面活性剂（例如Pluronic F127）和所需量的烷氧基硅烷衍生的或不溶于水的染料溶解在二氯甲烷中。去除溶剂后，将惰性盐（如NaCl）加入到固体残余物，随后，在室温用水溶解该混合物。然后加入四甲氧基硅烷（TMOS）到所得的均匀的水溶液，合适量的时间（例如15分钟）后添加三甲基氯硅烷（例如TMSCl）。进行该反应足够长的时间，例如24-72小时，优选48小时，然后分离最终产品。分离方法的例子是透析。

[0050] 根据上面提到的参考文献，下列术语旨在按照本文所规定的定义。

[0051] 根据本发明，提供了一种包含有胶束的二氧化硅纳米颗粒，胶束反过来又具有基本上亲水的壳（即朝向外部的部分）和基本上疏水的内部，而后者又包含位于胶束的内部的区域中的核，并包括硅酸盐网状物；以及第一和至少第二染料。

[0052] 所用的术语“胶束”是指胶束的团聚体（包括只有一种表面活性剂的分子）或胶束的共团聚体（包括多种表面活性剂的分子）。根据某些实施方式，胶束是胶束的团聚体。特别是，颗粒的形状基本上为球形。

[0053] 所用的术语“基本上亲水的”旨在指纳米颗粒、分子或分子的一部分的区域，如具有在水中的溶解度大于基本上疏水链在水中的溶解度的链。优选地，所述基本上亲水性部分比乙醇在水中的溶解度更高。术语“基本上疏水的”旨在指纳米颗粒、分子或分子的一部分的区域，如具有在水中的溶解度低于基本上亲水链在水中的溶解度的链。优选地，基本上疏水的部分基本上是亲脂性的。纳米颗粒、分子部分（或链或化合物）的基本上亲脂性区域是指具有在乙醇中的溶解度比在水中更高的区域、分子部分（或链或化合物）。

[0054] 所用的术语“识别性官能团”旨在指用于能够结合特定的底物或分析物的官能团。优选地，所述底物和/或分析物是生物分子。

[0055] 所用的术语“杂基”旨在指不同于Hydro1和Hydro2的组成部分并表现出至少一个杂原子和/或至少一个不饱和键的取代基。杂基可以用作中间基团，其通过反应被识别性官能团取代或结合识别性官能团。

[0056] 有利的是，杂基选自：-OCO(CH2)2COOH、-SH、-N3、-C≡CH、-SO3Na、-(CH2)3-SO3Na、-SO3CH3、-OPO3H2、-COOH、-OCH2COOH。

[0057] 所用的术语“好的重叠”旨在指根据福斯特理论定义的重叠积分 ，其大于1×1012M-1cm-1nm4，优选大于1×1014M-1cm-1nm4。

[0058] 这些参考文献也公开了通常的活性化合物意在作为有发光性和/或电活性和/或造影剂和/或能够发射正电子的有机化合物或金属有机化合物。该发光性化合物被定义为能够散发能量，优选为可检测到的电磁辐射（发光化合物），或热量。发光化合物可以通过其本身和/或与至少第二发光性化合物组合的形式发光，甚至通过在发光物质之间能量传递的适当的过程，且发射可以通过荧光、磷光或通过化学反应发光。发光化合物可以是荧光的或发光的，特别地后者是磷光发光或电化学发光。

[0059] 本发明特别是指从上述WO2010/013136和WO2010/013137所包含的染料中选择的染料，该染料具有以下属性：

[0060] 第一和至少第二染料都包含在上述二氧化硅纳米颗粒的核内；其中，所述第一和所述至少第二染料是在能量传递过程中具有各自的给体-受体耦对的关系的染料，并对于所考虑的光谱区域，具有摩尔吸收ε≥10,000M-1cm-1，优选≥30000M-1cm-1，更优选≥100000M-1cm-1，荧光量子产率Φ≥0.01，优选≥0.04，更优选≥0.30，官能团（诸如，例如，胺、-COOH、-N3、炔烃、烯烃、丙烯酰基、-SH、马来酰亚胺、醛、-OH、异硫氰酸酯、磺酰氯、碘乙酰基、TCT（2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪）或活化的羧酸基团，如NHS和NHS-磺基酯（N-羟基琥珀酰亚胺和磺基N-羟基琥珀酰亚胺）酯、TFP酯（2,3,5,6-四氟苯酚）、PFP酯（五氟苯酚）、HOBt酯（1-羟基苯并三唑）、N-酰基咪唑）适用于三烷氧基甲硅烷部分的引入，和根据福斯特理论，在所述的给体和所述受体染料之间具有好的重叠积分。

[0061] 根据本发明，所选择的染料是衍生的，以共价链接到所述二氧化硅纳米颗粒的核的硅酸盐网状物，或者它是亲脂性的（不溶于水），以便限定于胶束的中央部分，并因此限定在所述二氧化硅纳米微粒的核中。

[0062] 在本发明的一种优选实施方式中，染料链接到C1-C4三烷氧基硅烷，更优选链接到C2或C1三烷氧基硅烷。

[0063] 给体染料是相对于受体染料在更短的波长发射的染料。

[0064] 在第一优选实施方式中，给体染料是一种香豆素染料，或氧杂蒽衍生物染料，如荧光素或其衍生物。

[0065] 在更优选的实施方案中，已经链接到三烷氧基硅烷的给体香豆素染料选自：7-（二乙基氨基）-N-（3-（三乙氧基硅烷基）丙基）-2-氧代-2H-色烯-3-甲酰胺也命名为（7-（二乙基氨基）-N-（3-（三乙氧基硅烷基）丙基）香豆素-3-甲酰胺）（DEAC三乙氧基硅烷；在下面的说明中也指定为D）和11-氧代-N-（3-（三乙氧基硅烷基）丙基）-2,3,5,6,7,11-六氢-1H-吡喃[2,3-f]吡啶[3,2,1-ij]喹啉-10-酰胺（香豆素343三乙氧基硅烷；在下面的说明书中也被指定为D2）。

[0066] 待与给体染料结合的优选的受体染料选自：2,6-二乙基-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-8-（4-（（3-（三乙氧基硅烷基）丙基）氨甲酰基）苯基）-3a,4a-二氮杂-4-硼-s-苯并二茚（Bodipy TMDE Ph三乙氧基硅烷；在以下的说明书也被指定为B）、Bodipy三乙氧基硅烷衍生的4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-8-（4-（（3-（三乙氧基硅烷基）丙基）氨甲酰基）苯基）-3a,4a-二氮杂-4-硼-s-苯并二茚]（Bodipy TM-Ph三乙氧基硅烷，在以下的说明中也被标识为B2）、Bodipy TM-Et三乙氧基硅烷（4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-8-（3-氧代-3-（（3-（三乙氧基硅烷基）-丙基）氨基）丙基）-3a,4a-二氮杂-4-硼-s-苯并二茚）在下面的描述也被标识为B1，若丹明B三乙氧基硅烷衍生物（在下面的说明中被标识为R）、花菁2-（（1E,3E,5E）-5-(1-(6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-氧)-6-氧代己基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯基)-1-乙基-3,3-二甲基-3H-吲哚碘化物的三乙氧基硅烷衍生物（Chromis645C NHS，在下面的说明中标识为C5）、2-((E)-2-((E)-2-(4-(5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-氧)-5-氧代戊酰胺基)苯氧基)-3-((Z)-2-(3-乙基-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)乙烯基)环己-1-烯基)乙烯基)-3-乙基-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚碘化物的三乙氧基硅烷衍生物（Chromis800C NHS）在以下说明中标识为C7、和钠2-((E)-2-((E)-2-(4-(5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-氧)-5-氧代戊酰胺基)苯硫
基)-3-((Z)-2-(3-乙基-1,1-二甲基-6-磺酸-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)乙烯
基)环己-1-烯基)乙烯基)-3-乙基-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-6-磺酸盐的三
乙氧基硅烷衍生物（Chromis830A NHS），在下面的本说明中也被标识为C2。

[0067] 根据本发明的优选的组合是：DB、DR、DC5、DBR、DBC5、DRC5、DBRC5、DBRC5C7；D2B2、D2R、D2C5、D2C5C2、D2B2C5、D2B2C2、D2B2C5C2；D2B2RC5。

[0068] 在如DNA分析、细胞荧光测定法和组织化学等一些应用中，激发源的数量由实验硬件设置限制。对于许多应用，405nm的激光是激发源，这变得越来越重要；因此，在此波长吸收的化合物可用性是特别有用的。

[0069] 在本发明的一种优选实施方式中，提供了一种包含两种类型的染料的染料掺杂的成族的二氧化硅纳米颗粒（DDN）。本实施方式也被称为纳米串联染料（N-TD）并基于掺杂有两种不同类型的染料的二氧化硅纳米颗粒，在两种不同类型的染料之间有非常有效的能量传输过程，确保给体几乎定量猝灭和受体的敏化。其结果是，在这些纳米系统中，只最长波长的染料可以在很短的波长激发表现出显著的荧光。虽然已经报道了具有能量传递过程特征的多发色的二氧化硅纳米颗粒的许多例子，此特征尚未达到令人满意的水 平（Wang,L.;Tan,W.H.Nano Letters2006,6,84;Wang,L.;Zhao,W.J.;O'Donoghue,M.B.;Tan,W.H.Bioconjugate Chemistry2007,18,297）。

[0070] 在有关纳米串联染料的本发明的实施方式的上下文中，这类例子是DEAC作为给体（D），和Bodipy作为受体，在一种情况下，TMDE-Ph-COOH（B），在第二种情况TM-Ph-COOH-1 -1（B2）。选择染料以满足以下要求：（i）高（>40,000M cm ）的摩尔吸光系数；（ii）非常高（>0.50）的荧光量子产率Φ，（iii）用于容易引入三烷氧基硅烷基团的官能团，以及（iv）给体和受体之间好的重叠积分，根据福斯特理论（ T.Discuss.Faraday Soc.1959,27,7）。

[0071] 在本发明的另一优选实施方案中，提供了成族的染料掺杂的二氧化硅纳米颗粒（DDSNs），其包含四种不同的染料：DEAC三乙氧基硅烷（D）、Bodipy TMDE-Ph-COOH的三乙氧基硅烷衍生物（B）、罗丹明B衍生物（R）、花菁Chromis645C衍生物（C5），在所有可能的组合物中，在所有情况下使用掺杂度为0.01-1.0％，优选为0.05-0.5％，例如对于B、R、和C5相对于TEOS的摩尔为0.1％和0.01-1.0％，优选为0.05-0.5％，例如对于D，相对于TEOS的摩尔为0.2％。制备包含五种不同的染料D（0.2％）、B、R、C5、C7（0.1％）的染料掺杂的二氧化硅的纳米颗粒的样品作为近红外发光系统的例子。在单独用D或用偶对D和B掺杂的纳米颗粒的情况下，对于D也使用0.05，0.1和0.4％的掺杂度来制备纳米颗粒。还制备了含有四种不同的染料D2（0.2％）、B2、C5、C2（0.1％）的染料掺杂二氧化硅纳米颗粒的样品以显示本发明的通用性。

[0072] 选择染料以满足以下要求：（i）至少对于所考虑的光谱区域，荧光团的最强吸收-1 -1 -1 -1 -1 -1周围，高（≥10,000M cm ，优选≥30,000M cm ，更优选≥100,000M cm ）的摩尔吸收系数ε；（ⅱ）高（≥0.01，优选≥0.04，更优选≥0.30）的荧光量子产率Φ，（ⅲ）用于容易引入三烷氧基甲硅烷基的官能团（或作为一种替代整体不溶于水），和（iv）根据福斯特理论，以级联的方式在作为受体的染料D和作为给体的B之间，作为给体的B和作为受体的R之间，以及作为给体的R和作为受体的C之间好的重叠积分。
为了评估最后的要求的有效度，我们计算了相对于属于同一系列的每对染料的福斯特
0
半径R。这些值报告于表1中；可以看出，几乎所有的染料的组合提供了较好的给体-受体偶对。此外，每种染料对其自身的发光是好的受体，从而同-ET过程也积极地贡献于纳米颗粒的整体的光物理性质。
表1
0 0
第一系列的所有给体-受体偶对的福斯特半径R（ ）。同-ET R 用黑体字符标记，而最近的偶对用斜体字符。
表2
0 0
第二系列的所有给体-受体偶对的福斯特半径R（ ）。同-ET R 用黑体字符标记，而最近的偶对用斜体字符。
仅掺杂有一种染料的纳米颗粒（参考）

[0073] 为了更好地理解本发明，仅掺杂有一种染料的纳米颗粒的最重要的参数如表3所示。

[0074] 需要注意的是，在纳米颗粒中始终观察到更高的亮度，这主要是由于每个纳米结构体中包含了几种染料导致的较高的吸收系数。另一方面，荧光量子产率不是那么显著地受到影响。在相同的情况下，观察到该参数增加（B1、C1和R），这很可能是因为周边环境的较高的刚性，而在其他情况下，观察到包含染料的纳米颗粒的荧光量子产率的减少归因于寄生自猝灭过程（Montalti,M.;Prodi,L.;Zaccheroni,N.;Zattoni,A.;Reschiglian,P.;Falini,G.Langmuir2004,20,2989）。虽然进一步的研究努力应该致力于尽量减少这样的效果，重要的是要再次强调，在所有情况下，这种减小比吸收造成的增加所抵消的要多。表3
在乙醇和水分散体中的二氧化硅纳米颗粒的内部中的不同的染料的主要光物理数据。
NP：在水中的纳米颗粒
EtOH：乙醇中指示的染料
S-S：斯托克斯位移
（*）不适合在近红外光谱范围中寿命测定的实验设置

[0075] 在B、R、C5和C7的情况中，纳米颗粒中的不同的染料的光物理数据与由在无水乙醇中单个染料所示的非常相似，按预期的方式由于过渡的π-π*性质，其涉及在吸收和发射光谱中具有非常小的红移（<10nm）和一些激发态的寿命的延长。这种效果最有可能是由于刚性的二氧化硅基质所提供的保护，这种效果在C5的情况下更加明显，这种效果的非辐射失活主要是由于反式-顺式光异构化。有趣地注意到，在B和C5的情况下，纳米颗粒的掺杂度的变化不引起激发态寿命和荧光量子产率的显著变化，这表示自猝灭机制对于这些染料几乎无效。与此相反，在R的情况下，这些过程不应被排除，因为可以观察到增加掺杂度时荧光量子产率的不可忽略的降低。在D的情况下，如所预期的，在二氧化硅基质中的包含物引起更为明显的红移，这是因为其最低激发态具有电荷转移特性。由于激发态的性质，该染料也显示大的斯托克斯位移。从表4中报告的数据，很明显，当每个纳米颗粒染料超过5个分子，即，当染料的平均距离小于6.5纳米时，在香豆素染料的情况下，自猝灭过程是相当有效的。一般情况下，这种纳米颗粒的亮度相对于单个染料的纳米颗粒较高，并且当自猝灭过程不是很有效（如在R的情况下）或者，更好的是，当它们是忽略不计的（在B和C5的情况下）时候，增加掺杂度可以进一步增加亮度。
表4
掺杂不同量的D、B和B2的DDSN的光物理性质
（a）下标对应于纳米颗粒掺杂浓度（摩尔染料与摩尔TEOS）
多载色纳米颗粒。

[0076] 在本发明的一种实施方式中，纳米颗粒包括两种染料的耦对。

[0077] 在本发明的另一种实施方式中，纳米颗粒包括三种染料。

[0078] 在本发明的又一实施方式中，纳米颗粒包括四种染料。

[0079] 在本发明的另一种实施方式中，纳米颗粒包括五种染料。

[0080] 根据式1的给体的荧光猝灭，对纳米颗粒的每个集合中的给体和受体之间的能量传递（ET）过程的效率ηET进行了评估。ID和I°D分别是纳米颗粒中存在受体和不存在受体情况下的给体的荧光强度。　ηET=（1-ID/I°D）（式1）

[0081] 根据式1得到的数据总是与检查荧光受体的敏化得到的估值在实验误差范围内重合，表明其他从给体到受体的失活过程是可以忽略不计的。因为ET过程的高效率，对于研究的所有的纳米颗粒，激发光谱非常相似于吸收光谱。在含有D、B和B1的纳米颗粒的示例性情况下，我们特别研究每个纳米颗粒的给体分子的数量对光物理性质的影响。这种方法在乍看之下，似乎不是很恰当，因为它没有被构思来获得作为能量传递过程的唯一有趣的特征的尽可能高的效率。实际上，增加纳米颗粒内的受体浓度可以用更有效的方法达到这一目标，因为只有当受体单元的浓度改变时，激发态的给体和受体的平均距离才会发生变化。作为结果，在没有其他过程的情况下，只有受体的浓度对杂能量传递的效率产生影响。然而，为了具有较大的斯托克斯位移以及单一波长激发的可能性，将对给体进行激发，并且，从分析的角度来看，受体分子的数量增加不会导致亮度的显著增加，而给体分子的数量增加会导致亮度的显著增加。

[0082] 从表5中可以看出，根据式2计算，当改变给体的浓度时，能量传递过程的速率常数（其中τ°是不存在受体的给体的激发态寿命）不显著改变。KET=1/[τ°（1/ηET-1）]（式2）

[0083] 然而，需要注意的是，对于D,能量传递过程的引入对观察到的寄生自猝灭过程提供了非常有竞争力的途径，其结果是能量传递效率保持相对高（>85％），对于高掺杂度也是如此。从分析的角度看，这个结果导致重要的优点:由于将D的掺杂度从0.05增至0.4％,在bodipy B或B1的发射但激发香豆素D处（考虑的这些纳米颗粒的实验条件）所观察的系统的亮度经历了五倍增加，从而可以实现使信号并行增加，这是只有当D存在的时候无法观察到的结果（也见图1），这一结果，就我们所知到目前为止还没有在文献中有所报道，它对于新的纳米颗粒的设计是很重要的，由此提供了一种使用染料的可能的方式，这些染料作为荧光素会经历自猝灭现象。

[0084] 由本发明提供的串联染料纳米颗粒，在这里示为DxBy@NP，或DxB1y@NP的示例性实施方式，其中X和Y分别表示染料D、B和B1的摩尔与TEOS的摩尔，这两者代表可以在405nm（在细胞荧光测定法中通常采用的激光源的发光波长）有效地激发的成族的两个荧光标记，其有两个明显区分的发射带的高亮度和几乎无交叉干扰。所有这些结果使这些类型的核-壳纳米颗粒因为作为荧光基分析技术的标记而引人注目。

[0085] 发生在此限制的媒介中的其他有趣的现象是同源的能量传递过程，其允许纳米颗粒内部的能量迁移。这些过程的发生通过增加掺杂的NP观察到的各向异性的较低值得到确认。当嵌入二氧化硅基质，染料旋转自由度大大减少，从而使荧光去极化的唯一可能的机制是同源的能量传递，这越接近染料越可能发生，即在高掺杂比更可能发生。如所预期的，对于B、B1、R和C5这种效果是较高的，因为斯托克斯位移更小，所以重叠积分更高。然而，对于D这种影响是不可忽略的，特别是当分子的数目高的时候：尽管激发态寿命缩短，但测量的各向异性值减少（通常引起相反的效果）是此过程发生的明确的指示（表7）。从表6可以看出，当三种或四种染料插入纳米颗粒的核中时，不同给体的淬灭效率和受体的敏化更加明显。特别是，不同给体的残余强度很少超过5％的值。尤其需要强调的是，这个族的纳米颗粒的效率出乎意料的高于迄今报道的其他多色二氧化硅纳米颗粒的效率。尽管本发明人不希望受任何理论的约束，但是对这个出乎意料的增加的可能的解释依赖于纳米颗粒的不同的结构。在一般情况下，前面的例子是基于如由van Blaaderen改性的根据 方法制备的纳米颗粒，其具有通常超过50纳米的直径。我们已经证明（E.Rampazzo,S.Bonacchi,M.Montalti,L.Prodi,N.Zaccheroni,J.Am.Chem.Soc.,2009,129,14251-14256），此合成方案自发产生核/壳结构，其中染料浓度在核中高，但在外壳要低得多。低密度（暗示较大的发色团间距离）可能限制包埋在这些外层中的染料间的能量传递的效率。与此相反，我们的合成方法导致更均匀的NP，这是因为NP是更小的纳米颗粒，并因为NP的形成发生在受限的纳米反应器中，这可以解释我们已经观察到的前所未有的效率。

[0086] 从表6可以看出，当三种或四种染料插入纳米颗粒的核内时，不同给体的淬灭的效率和受体的敏化更加明显。表5
掺杂D、B和B1的DDNS样品的光物理性质。
（a）下标对应于纳米颗粒掺杂浓度（摩尔染料与摩尔TEOS）；（b）纳米颗粒样品中的受体B、B1和给体D的量子产率。
表6
掺杂有不同染料的DDSN的结构和光物理性质
表7
DB纳米颗粒的各向异性数据和能量传递效率
（a）下标对应于纳米颗粒掺杂浓度（摩尔染料与摩尔TEOS）
（b）染料D的直接激发（λEX=400纳米）。
（c）染料B的直接激发（λEX=500纳米），Anis B0.1@NP=0.07。

[0087] 双发色团、三发色团或四发色团的纳米颗粒的不同ET过程的前所未有的效率，一方面，导致非常高的整体敏化，并且，另一方面导致不同给体非常低的残余发射。

[0088] 最终，此材料表现出非常大的斯托克斯位移（高达440nm，使用NIR染料作为最终的受体时可以达到该值），非常高的亮度，甚至激发“最蓝的”给体，和除了最后受体的所有的染料的几乎可以忽略不计的残余强度。所有这样的特征加在一起，使这些系统非常有前途用于多路复用，而无需分离，这是因为只要适当选择掺杂染料就有可能通过单激发获得最终受体的发光颜色。此外，对于所有要求与大斯托克斯位移相关的高亮度诊断技术,这些纳米颗粒都是有价值的解决方案。

[0089] 这里强调本发明所提供的进一步的重要的优势，其由这些纳米颗粒的斯托克斯位移表示，在这里所描述的系统中，斯托克斯位移大于80nm，该值可有效地减少来自瑞利（Rayleigh-Thyndall）和拉曼谱带的干扰。

[0090] 从应用的角度来看，由于所观察到ET的高效率，这些纳米颗粒可以被看作是一种非常有效的和可重复的复杂串联染料。可以从图4中观察到，D@NP、（D+B）@NP、（D+B+R）@NP和（D+B+R+C5）@NP4代表成组的四个NP在405nm（在细胞荧光测定法中通常采用的激光源的发光波长）处呈现出非常高的吸收系数，四个不同的发射带有高亮度带和几乎没有交叉干扰。

[0091] 类似地，如果不是更好，能用（D2B2C5C2）@NP获得结果，其与掺杂有单个染料的纳米颗粒相比在所有的可见范围内的发生几乎可以忽略不计（图5）。值得注意的是，在本系统435nm（表6）中较低的能量受体的发射波长和吸收波长（伪斯托克斯移）之间的差异是迄今在文献中报道的最大中的一个。

[0092] 为了证明几乎没有交叉干扰，玻璃纤维的四个样品分别吸附D@NP、（DB）@NP、（DBR）@NP和（DBRC5）@NP。

[0093] 从图6可以看出都在相同的波长（405纳米）激发的四组纤维具有清晰可辨的共聚焦发射光谱，证明了这种方案能导致高发光标记的制备，高发光标记在效率和通用性方面可以超越商业串联染料，后者在任何情况下，限定于仅两个荧光染料的结合。

[0094] 下列实施方式进一步说明本发明。化学物：所有的试剂和溶剂均直接使用，无需进一步纯化：购自Aldrich公司的非离子型表面活性剂 F127、原硅酸四乙酯（TEOS，99.99％）、四甲基原硅酸酯（TMOS，>99％）、三甲基氯硅烷（TMSCl，≥98％），盐酸（发烟，≥37％）、3-乙基-2,4-二甲基吡咯（97％）、4-（氯羰基）苯甲酸甲酯（≥95％）、三氟化硼乙醚（BF3·Et2O中）、N,N-二异丙基乙胺（DIPEA，≥99％）和乙酸（≥99.7％）。购自Fluka的三乙胺（≥99.5％）、1-羟基苯并三唑水合物（HOBt≥99.0％）、N-（3-二甲基氨基丙基）-N-乙基碳化二亚胺盐酸盐（EDC·HCl≥98.0％）、（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷（APTES，≥98.0％）、LiOH·H2O（≥99％）、试剂级二氯甲烷、环己烷、乙酸乙酯和NaCl。购自Sigma公司的7-（二乙基氨基）香豆素-3-羧酸铝（DEAC，≥98.0％）。购自Cyanagen s.r.l.（博洛尼亚-意大利）的Chromis645C NHS((2-((1E,3E,5E)-5-(1-(6-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基氧)-6-氧代己基)-3,3-二甲基吲哚啉-2-亚基)戊-1,3-二烯基)-1-乙基-3,3-二甲基-3H-吲哚碘
化物))、Chromis800C NHS（2-((E)-2-((E)-2-(4-(5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-氧)-5-氧代戊酰胺基)苯氧基)-3-((Z)-2-(3-乙基-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚
基)乙烯基)环己-1-烯基)乙烯基)-3-乙基-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚碘化物、和Chromis830A NHS（钠2-((E)-2-((E)-2-(4-(5-(2,5-二氧代吡咯烷-1-氧)-5-氧代戊酰胺基)苯硫基)-3-((Z)-2-(3-乙基-1,1-二甲基-6-磺酸-1H-苯并[e]吲哚-2(3H)-亚基)乙烯基)环己-1-烯基)乙烯基)-3-乙基-1,1-二甲基-1H-苯并[e]吲哚鎓-6-磺
酸盐）。

[0095] Milli-Q Millipore系统用于净化水（电阻率≥18MΩ）。

[0096] 超滤和透析实验：在购自Millipore公司（47毫米过滤器）的75毫升不锈钢玻璃耐溶剂性的搅拌单元中，在氮气压强下进行纳米颗粒的超滤。超滤实验装置包括Amicon再生纤维素膜（10kDa截止）和配备有浓度切换阀的辅助容器（800毫升）。

[0097] 在温和搅拌下用再生纤维素透析管（Sigma公司，分子质量截留>12000Da，平均直径33毫米）在室温下与水进行透析。必要时使用Millipore Durapore过滤器（0.22，0.45微米），进行颗粒溶液过滤。实施例1
Chromis645C NHS，C5的三乙氧基硅烷衍生物：
方案1：APTES，二氯甲烷
在玻璃小瓶中，将0.57毫克的Chromis645C NHS（0.0008毫摩尔，1当量）用245微升的无水二氯甲烷溶解。向此溶液中加入3.8微升的1:10（体积/体积）的APTES在二氯甲烷（0.0016毫摩尔，2当量）中的溶液。将混合物搅拌过夜，然后不经进一步纯化使用。
实施例2
Bodipy TM-Ph-COOMe（4,4-二氟-8-（4-（甲氧基羰基）苯基）-1,3,5,7-四甲
基-3a,4a-二氮杂-4-硼-s-苯并二茚）：
方案2：（a）回流；（b）DIPEA，BF3·Et2O，回流；（c）通过硅胶快速色谱法纯化（环己烷/二乙醚梯度95:5-9:1-8:2，体积/体积）
在氮气气氛下，在配备有冷凝器和滴液漏斗的三颈烧瓶中，将460微升（4.33毫摩尔，2当量）的2,4-二甲基吡咯和579毫克（4.76毫摩尔，2.2当量）的硫酸镁溶解于6毫升的二氯甲烷中。用30分钟向此溶液滴加溶解于4毫升的二氯甲烷中的498毫克（2.38毫摩尔，
1.1当量）的4-（氯羰基）苯甲酸酯。将反应混合物加热回流3小时，在此期间它呈现了深紫色，然后将其在室温下冷却。然后加入1.69毫升（9.53毫摩尔，4.4当量）的N,N-二异丙基乙胺，且15分钟后加入1.76毫升（14.3毫摩尔，6.6当量）的三氟化硼乙醚。再次将反应混合物加热回流3小时，在此期间，出现荧光。
最后，将溶液用水稀释，并用二氯甲烷萃取两次；混合的有机相用硫酸钠干燥，并在减压下蒸发。用环己烷/乙醚梯度（95:5-9:1-8:2，体积/体积）作为洗脱剂将得到的混合物在硅胶上通过闪式层析纯化，得到215毫克的橙色固体（产率26％）。
1H NMR(CDCl3,200MHz,25°C)δ:8.19(d,J=8Hz,2H),7.41(d,J=8Hz,2H),6.00(s,2H),
3.98(s,3H),2.57(s,6H),1.37(s,6H).
实施例3
Bodipy TM-Ph-COOH（8-(4-羧基苯基）-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-3a,4a-二氮
杂-4-硼-s-苯并二茚）：
方案3：（a）LiOH·H2O；（b）通过硅胶快速色谱法纯化（二乙醚/乙酸乙酯/丙酮
4.5:4.5:1，体积/体积）
在二颈烧瓶中，将80毫克（0.21毫摩尔，1当量）的TM-Ph-COOMe溶解于2.5毫升的THF。将溶解于1毫升的水中的44.4毫克（1.05毫摩尔，5当量）的氢氧化锂一水合物迅速滴加到该溶液中。将反应混合物保持在室温下搅拌3小时。然后，用0.1M的盐酸溶液稀释，并用二氯甲烷萃取三次；混合的有机相用硫酸钠干燥，过滤，减压蒸发。用乙醚/乙酸乙酯/丙酮（4.5:4.5:1，体积/体积）混合物将得到的混合物在硅胶上通过闪式层析纯化，得到
17毫克的橙色固体（产率22％）。
1
H NMR(CDCl3,200MHz,25°C)δ:8.28(d,J=8.4Hz,2H),7.62(d,J=8.4Hz,2H),6.17(s,
2H),2.54(s,6H),1.44(s,6H)。
实施例4
Bodipy TM-Ph三乙氧基硅烷（4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-8-（4-（（3-（三乙氧基硅烷基）丙基）氨甲酰基）苯基）-3a,4a-二氮杂-4-硼-s-苯并二茚），B2：
方案4：（a）APTES，TEA，EDC和HOBt，二氯甲烷；（b）通过硅胶快速色谱法纯化（环己烷/乙酸乙酯8:2，体积/体积）
在氮气气氛下，将19微升的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，0.079毫摩尔，2当量）、
14.5毫克的TM-Ph-COOH（0.039毫摩尔，1当量）、11微升的三乙胺（TEA，0.079毫摩尔，2当量）、14.4微升的N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺（EDC，0.079毫摩尔，2当量）和11毫克的1-羟基苯并三唑水合物（HOBt，0.079毫摩尔，2当量）溶于二氯甲烷中，并在室温下搅拌过夜。
然后将反应混合物在减压下浓缩，并使用环己烷/乙酸乙酯混合物（8:2，体积/体积）作为洗脱剂在硅胶上通过快速色谱法纯化，得到13.1毫克的橙-金色固体产物（产率
58％）。
1
H NMR(CDCl3,200MHz,25 ° C)δ:7.94(d,J=8.2Hz,2H),7.39(d,J=8.2Hz,2H),6.7
0(bs,1H),5.99(s,2H),3.85(q,J=7.0Hz,6H),3.57–3.48(m,2H),2.56(s,6H),1.89–
1.74(m,2H),1.37(s,6H),1.24(t,J=7.0Hz,9H),0.76(t,J=7.9Hz,2H).
实施例5
Bodipy TM-Et-COOMe（4,4-二氟-8-（3-甲氧基-3-氧代丙基）-1,3,5,7-四甲
基-3a,4a-二氮杂-4-硼-s-苯并二茚）：
方案5：（a）回流；（b）DIPEA，BF3·Et2O,回流；（c）通过硅胶快速色谱法纯化（环己烷/乙醚梯度9:1-8:2，体积/体积）。
在氮气气氛下，在配备有冷凝器和滴液漏斗的三颈烧瓶中，将1000微升（9.42毫摩尔，
2当量）的2,4-二甲基吡咯溶解于12毫升的二氯甲烷中。用30分钟向此溶液中滴加溶解于6毫升二氯甲烷中的1.20毫升（9.42毫摩尔，2当量）的甲基4-氯-4-氧代丁酸。将反应混合物加热回流过夜，在此期间它呈现深紫色，然后将其在室温下冷却。然后加入3.68毫升（20.7毫摩尔，4.4当量）的N,N-二异丙基乙胺，且15分钟后加入3.84毫升（31.1毫摩尔，6.6当量）的三氟化硼乙醚。再次将反应混合物加热回流3小时，在此期间，出现荧光。
最后，将溶液用水稀释，并用二氯甲烷萃取两次，混合的有机相用硫酸钠干燥，减压蒸发。用环己烷/乙醚梯度（9:1-8:2，体积/体积）作为洗脱剂将得到的混合物在硅胶上通过快速色谱法纯化，得到471毫克的橙色固体（产率30％）。
1
H NMR(CDCl3,400MHz,25°C)δ:6.05(s,2H),3.72(s,3H),3.31–3.27(m,2H),2.61–
2.57(m,2H),2.50(s,6H),2.42(s,6H).
实施例6
Bodipy TM-Et-COOH（8-(2-羧基乙基）-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-3a,4a-二氮
杂-4-硼-s-苯并二茚）：
方案6：（a）LiOH；（b）通过硅胶快速色谱法（环己烷/乙酸乙酯3：7，体积/体积）纯化在2颈烧瓶中，将100毫克（0.30毫摩尔，1当量）的TM-Et-COOMe溶解于10毫升的THF中。将溶解于4毫升水中的36.6毫克（1.5毫摩尔，5当量）氢氧化锂迅速逐滴加入到该溶液中。将反应混合物在室温下搅拌3小时。然后，用0.1M的盐酸溶液稀释，并用二氯甲烷萃取三次，混合的有机相用硫酸钠干燥，过滤，减压下蒸发。用环己烷/乙酸乙酯混合物（3:7，体积/体积）将得到的混合物在硅胶上通过快速色谱法纯化，得到73毫克的橙色固体（产率
76％）。
1
H NMR(CDCl3,400MHz,25 ° C)δ:6.06(s,2H),3.33–3.29(m,2H),2.67–
2.63(m,2H),2.51(s,6H),2.43(s,6H)。
实施例7
Bodipy TM-Et三乙氧基硅烷（4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-8-（3-氧代-3-（（3-（三乙氧基硅-烷基）丙基）氨基）丙基）-3a,4a-二氮杂-4-硼-s-苯并二茚），B1：
方案7：（a）APTES，TEA，EDC，HOBt，二氯甲烷；（b）通过硅胶快速色谱法纯化（环己烷/乙酸乙酯梯度9:1-1:1，体积/体积）。
在氮气气氛下，将102微升的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，0.43毫摩尔，2当量）、
68.6毫克的TM-Et-COOH（0.21毫摩尔，1当量）、59.9微升的三乙胺（TEA，0.43毫摩尔，2当量）、117微升的N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺（EDC，0.43毫摩尔，2当量）和
89.5毫克的1-羟基苯并三唑水合物（HOBt，0.43毫摩尔，2当量）溶解于二氯甲烷中，并在室温下搅拌4小时。
然后将反应混合物在减压下浓缩，并用环己烷/乙酸乙酯梯度（9:1-1:1，体积/体积）作洗脱剂在硅胶上通过快速色谱法纯化，得到75.7毫克的橙金色固体的产物（产率68％）。
1
H NMR(CDCl3,400MHz,25 ° C)δ:6.03(s,2H),5.82(bs,1H),3.79(q,J=7.1H
z,6H),3.33–3.29(m,2H),3.27–3.22(m,2H),2.49(s,6H),2.42(s,6H),2.41–
2.38(m,2H),1.65–1.57(m,2H),1.20(t,J=7.1Hz,9H),0.60(t,J=8.0,2H)。
实施例8
香 豆 素 343-三 乙 氧 基 硅 烷（11-氧 代-N-（3-（三 乙 氧 基 硅 烷 基）丙基）-2,3,5,6,7,11-六氢-1H-吡喃[2,3-f]吡啶[3,2,1-ij]喹啉-10-羧胺），D2：
方案8：（a）APTES，TEA，EDC，HOBt，二氯甲烷；（b）通过硅胶快速色谱法纯化（环己烷/乙酸乙酯梯度6:4-1:1，体积/体积）。
在氮气气氛下，将32.5微升的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，0.136毫摩尔，2当量）、20毫克的香豆素343（0.068毫摩尔，1当量）、19.1微升的三乙胺（TEA，0.136毫摩尔，
2当量）、24.8微升的N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺（EDC，0.136毫摩尔，2当量）和18.9毫克的1-羟基苯并三唑水合物（HOBt，0.136毫摩尔，2当量）溶解于二氯甲烷中，并在室温下搅拌过夜。然后将反应混合物在减压下浓缩，并用环己烷/乙酸乙酯梯度（6:4-1:1，体积/体积）作为洗脱剂在硅胶上通过快速色谱法纯化，得到22.8毫克浅橙色固体的产物（产率69％）。
1
H NMR(CDCl3,200MHz,25 ° C)δ8.9(bs,1H),8.63(s,1H),7.02(s,1H),3.84(q
,J=7.0Hz,6H),3.50–3.40(m,2H),3.38–3.23(m,4H),2.91–2.76(m,4H),2.05–
2.00(m,4H),1.79–1.67(m,2H),1.24(t,J=7.0Hz,9H),0.72(t,J=8.4Hz,2H)。
实施例9
Bodipy TMDE-Ph-COOMe（2,6-二 乙 基-4,4-二 氟-8-（4-（甲氧 基 羰基）-苯
基）-1,3,5,7-四甲基-3a,4a-二氮杂-4-硼-s-苯并二茚）：
方案9：（a）回流；（b）DIPEA，BF3·Et2O，回流；（c）通过硅胶快速色谱法纯化（环己烷/二乙醚梯度98:2-95:5-9:1，体积/体积）
在氮气气氛下，在配备有冷凝器和滴液漏斗的3颈烧瓶中，在6毫升的二氯甲烷中溶解
602微升（4.33毫摩尔，2当量）的3-乙基-2,4-二甲基吡咯和579毫克（4.76毫摩尔，2.2当量）的硫酸镁。用30分钟向此溶液中滴加溶解于4毫升二氯甲烷的498毫克（2.38毫摩尔，1.1当量）的4-（氯羰基）苯甲酸甲酯。将反应混合物加热回流3小时，在此期间它呈现了深紫色，然后将其在室温下冷却。然后加入1.69毫升（9.53毫摩尔，4.4当量）的N,N-二异丙基乙胺，且15分钟后加入1.76毫升（14.3毫摩尔，6.6当量）的三氟化硼乙醚。再次将反应混合物加热回流3小时，在此期间，出现荧光。
最后，将溶液用水稀释，并用二氯甲烷萃取两次，混合的有机相用硫酸钠干燥，减压蒸发。用环己烷/乙醚梯度（98:2-95:5-9:1，体积/体积）作为洗脱剂将得到的混合物在硅胶上通过快速色谱法纯化，得到411毫克的深橙色固体（产率44％）。
1
H NMR(CDCl3,200MHz,25°C)δ8.18(d,J=8.6Hz,2H),7.42(d,J=8.6Hz,2H),3.99(s,3H),2.54(s,6H),2.30(q,J=7.5Hz,4H),1.26(s,6H),0.96(t,J=7.5Hz,6H)。
实施例10
Bodipy TMDE-Ph-COOH（8-(4-羧基苯基）-2,6-二乙基-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲
基-3a,4a-二氮杂-4-硼-s-苯并二茚）：
方案10：（a）LiOH·H2O；（b）通过硅胶快速色谱法纯化（二乙醚/乙酸乙酯/丙酮
4.5:4.5:1，体积/体积）。
在2-颈烧瓶中，将100毫克（0.23，1当量）Bodipy TMDE-Ph-COOMe溶解于2.5毫升的THF。在该溶液中迅速滴加1毫升的含有48.3毫克（1.14，5当量）的氢氧化锂一水合物的水溶液。将反应混合物在室温下搅拌5小时。然后，将其用水稀释，用乙酸乙酯萃取三次，混合的有机相用硫酸钠干燥，过滤，减压蒸发。用乙醚/乙酸乙酯/丙酮混合物（4.5:4.5:1，体积/体积）将得到的混合物在硅胶上通过快速色谱法纯化，得到41毫克橙色固体（产率
42％）。
1
H NMR(CDCl3,200MHz,25°C)δ8.26(d,J=8.4Hz,2H),7.46(d,J=8.4Hz,2H),2.55(s,6H),2.31(q,J=7.5Hz,4H),1.28(s,6H),0.99(t,J=7.5Hz,6H)。
实施例11
Bodipy TMDE-Ph三 乙 氧 基 硅 烷（2,6-二 乙 基-4,4- 二 氟 -1,3,5,7-四 甲基-8-（4-（（3-三乙氧基硅烷基）丙基）氨甲酰基）苯基）-3a,4a-二氮杂-4-硼-s-苯并二茚），B：
方案11：（a）APTES，TEA，EDC，HOBt，二氯甲烷；（b）通过硅胶快速色谱法纯化（环己烷/乙醚1:1，体积/体积）
在氮气气氛下，将17微升的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，0.07毫摩尔，2当量）、
15毫克的Bodipy TMDE-Ph-COOH（0.035毫摩尔，1当量）、10微升的三乙胺（TEA，0.07毫摩尔Bodipy，2当量）、13毫克N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺（EDC，0.07毫摩尔，2当量）和10毫克1-羟基苯并三唑水合物（HOBt，0.07毫摩尔，2当量）溶于二氯甲烷，在室温下搅拌过夜。
然后将反应混合物在减压下浓缩，并使用环己烷/乙醚的混合物（1:1，体积/体积）作为洗脱剂通过快速色谱法在硅胶上进行纯化，得到15.1毫克的橙金色固体的产物（产率
68％）。
1
H NMR(CDCl3,200MHz,25 ° C)δ7.94(d,J=8.2Hz,2H),7.39(d,J=8.2Hz,2H),6,70
(bs,1H),3.86(q,J=7.1Hz,6H),3.53(q,J=6.3Hz,2H),2.54(s,6H),2.31(q,J=7.6Hz,4H),1.89–1.75(m,2H),1.28–1.21(m,15H),0.99(t,J=7.6Hz,6H),0.77(t,J=7.9Hz,2H)。
实施例12
合成罗丹明B三乙氧基硅烷衍生物，R：
使 用 报 告 的 过 程 合 成 罗 丹 明 B 衍 生 物 R。[J.Phys.Chem.
B,2010,114(45),14606-14613.]
方案12：罗丹明B三乙氧基硅烷衍生物，R
实施例13
DEAC三乙氧基硅烷。合成7-（二乙基氨基）-N-（3-（三乙氧基硅烷基）丙基）-2-氧代-2H-色烯-3-甲酰胺（7-（二乙基氨基）-N-（3-（三乙氧基硅烷基）-丙基）香豆素-3-甲酰胺），D：
在氮气气氛下，将34微升的3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES，0.14毫摩尔，2当量）、
19毫克的7-（二乙基氨基）香豆素-3-羧酸（DEAC，0.07毫摩尔，1当量）、20微升的三乙胺（TEA，0.14毫摩尔，2当量）、26毫克的N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺（EDC，
0.14毫摩尔，2当量）和20毫克的1-羟基苯并三唑水合物（HOBt，0.14毫摩尔，2当量）溶解于二氯甲烷，在室温下搅拌过夜。
方案13：（a）APTES，TEA，EDC，HOBt，二氯甲烷；（b）通过硅胶快速色谱法纯化（环己烷/乙酸乙酯1:1，体积/体积）
然后将反应混合物在减压下浓缩，并用环己烷/乙酸乙酯混合物（1:1，体积/体积）作为洗脱剂在硅胶上通过快速色谱法纯化，得到15.7毫克黄色固体的产物（产率48％）。
1
H NMR(CDCl3,200MHz,25 ° C)δ8.81–8.85(m,1H),8.71(s,1H),7.43(d,J=8.8Hz,1H),6.65(dd,J=2.5Hz,J=8.8Hz,1H),6.51(d,J=2.5Hz,1H),3.83(q,J=6.9Hz,6H),3.40–
3.51(m,6H),1.66–1.82(m,2H),1.20–1.28(m,15H),0.67–0.76(m,2H).
+
ESI-MS(M+H)=465.
实施例14
Chromis800C NHS的三乙氧基硅烷衍生物，C7：
方案14：APTES，二氯甲烷。
在玻璃小瓶中，将0.82毫克的Chromis800C NHS（0.0008毫摩尔，1当量）溶解于245微升的无水二氯甲烷。向此溶液中加入3.8微升的1:10（体积/体积）的APTES在二氯甲烷（0.0016毫摩尔，2当量）中的溶液。将混合物搅拌过夜，然后不经进一步纯化使用。
实施例15
Chromis830A NHS的三乙氧基硅烷衍生物，C2：
方案15：APTES，二氯甲烷。
在玻璃小瓶中，将0.88毫克的Chromis800C NHS（0.0008毫摩尔，1当量）溶解于245微升的无水二氯甲烷。向此溶液中加入3.8微升的1:10（体积/体积）的APTES在二氯甲烷（0.0016毫摩尔，2当量）中的溶液。将混合物搅拌过夜，然后不经进一步纯化使用。
实施例16
纳米颗粒的合成：
采用先前报道的过程[J.Phys.Chem.B,2010,114(45),14605-14613]合成了核-壳结构二氧化硅-PEG（聚乙二醇）的纳米颗粒。在典型制备中，在20毫升的玻璃闪烁瓶中将100毫克的Pluronic F127和所需量的硅烷化的或不溶于水的染料仔细地用1.0-2.0毫升二氯甲烷溶解。通过温和的氮气流，并随后在室温用真空将溶剂从均匀的溶液蒸发。将NaCl（68.6毫克）加入固体残余物中，并在25℃在磁力搅拌下将该混合物用1565微升1M的乙酸溶解。然后将TEOS（179微升，0.80毫摩尔）加入所得的均匀的水溶液中，180分钟后，加入TMSCl（10微升，0.08毫摩尔）。
在透析治疗前在25℃将混合物保持搅拌48小时。将用水最后稀释至总体积为5毫升的精确量的纳米颗粒的溶液（1500微升）相对于水进行透析纯化步骤。
实施例17
可使用的替代的合成方案，特别是对于在酸性环境中不稳定的染料：
在典型的制备中，在20mL的玻璃闪烁瓶中将100毫克的Pluronic F127，和所需量的硅烷化或不溶于水的染料仔细地用1.0-2.0毫升二氯甲烷溶解。通过温和的氮气流，并随后在室温用真空将溶剂从均匀的溶液蒸发。将NaCl（68.6毫克）加入固体残余物中，并在
25℃在磁力搅拌下将该混合物用1565微升的水溶解。然后加入TMOS（119微升，0.8毫摩尔）至所得的均匀的水溶液，15分钟后，加入TMSCl（10微升，0.08毫摩尔）。
在透析治疗前在25℃将混合物保持搅拌48小时。将用水最后稀释至总体积为5毫升的精确量的纳米颗粒的溶液（1500微升）相对于水进行透析纯化步骤。
DLS：通过采用配备有633纳米激光二极管的Malvern Nano ZS仪器的动态光散射测量，对纳米颗粒的流体力学直径分布进行了测定。使用水作为溶剂，将样品安置在具有1厘米光程长度的一次性聚苯乙烯比色皿中。DLS流体力学直径分布的宽度由Pdl（分散指数）
2
表示。通过累积量分析计算出的单峰分布（高斯分布）的情况下，PDI=(σ/Zavg)，式中σ表示分布的宽度,Zavg表示颗粒群的平均直径。
TEM实验：使用在80千伏工作的Philips CM100透射电子显微镜。对于TEM研究，在用水稀释（50:1）纳米颗粒的一滴溶液沉积之后，将由Formvar支持膜覆盖的3.05毫米的铜网（400目）在真空下干燥。
NP的TEM照片表明，只有表现足够的对比度的二氧化硅核出现在图像中。如图2（左），分析几百个纳米颗粒的框图得到粒度分布。将得到的直方图按照高斯分布拟合，获得氧化硅纳米颗粒的核的平均直径为（11±3）nm。
光物理测量：所有NP溶液显示非常微弱的光散射，且从光物理的观点来说，可看作任何分子物质的溶液。DLS测量显示，即使几个月后，纳米颗粒也不团聚。
通过Perkin-Elmer Lambda45分光光度计在25℃记录UV-VIS吸收光谱。使用具有光程为1厘米的石英比色皿。用装配有光电倍增管Hamamatsu R928P的Edinburgh FLS920记录荧光光谱。对于时间相关的单光子计数（TCSPC）实验，使用连接到PCS900PC卡的同一台仪器。使用在乙醇中的若丹明6G的溶液作为参考（Φ=0.94），确定发光量子产率（不确定度，±15％），且按照标准方法对内部过滤器的效果进行荧光强度校正。[Montalti,M.；
Credi,C.；Prodi,L.；Gandolfi,M.T.Handbook of Photochemistry,CRC Press Boca Raton(FL),2006.]。
在配备有Glan-Thompson偏光片的Edinburgh FLS920上进行所有荧光各向异性测量。
使用L格式的配置收集各向异性的测量值，且对于极化偏置所有数据使用G因子校正。
结合激发和发射偏振的不同的方向对每个样品获得四种不同的光谱：IVV，IVH，IHH，IHV（其中V代表垂直和H为水平，第一下标是指激发且第二下标是指发射）。该光谱用于计算G因子和各向异性
G=IHV/IHH,r=(IVV-GIVH)/IVV+2GIVH
[Lakowicz,J.R.,Principles of Fluorescence Spectroscopy,Third
Edition,Lakowicz,J.R.,Springer2006.]