背景技术

人肿瘤依赖于基于有缺陷蛋白质的细胞信号转导过程来生长、存活 和转移，所述细胞信号转导过程由翻译后修饰(例如蛋白质磷酸化)驱 动。这些信号转导网络也是大多数现有及计划中的分子靶向抑制剂的靶 标。一个例子是HERCEPTIN——一种可以阻断乳腺癌中超活性表皮生 长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)信号转导系统的药物。只有 此信号转导途径过表达且活化的患者对该治疗有反应。病人护理中一个 迫切的重要需求是鉴别将会对标准治疗有反应的患者以及鉴定将需要 更具攻击性的治疗措施的患者。这些更具攻击性的措施几乎总是伴随着 发病率的提高，因此不会在未确证时先验性地选择使用。例如，患有淋 巴结阴性乳腺癌并且其肿瘤上具有雌激素受体的女性适合进行他莫昔 芬治疗。但是，有约30-40％的女性对他莫昔芬治疗无反应，她们需要 更具攻击性的治疗(例如芳香酶抑制剂(aromatase inhibitor，AI))。 但是，芳香酶抑制剂与中度至重度的骨损失有关，因此给予所有女性 AI治疗是不可接受的。可以对治疗的结局和反应进行区分的生物标记 对于这类例子将非常有益。这一难题对于几乎所有其它的人类癌症均普 遍存在：将对标准护理会产生反应的人群和预后较差的人群区分开来。

基因表达分析已经显示出了产生针对结局的预后特征的能力；但 是，这些终点仅限于简单的分类。所述特征无法告诉医师如何治疗无反 应者组；它仅能用于判断谁将会有反应而谁将不会有反应。相反，蛋白 质-信号转导谱分析可提供预后特征，并且重要的是，可提供有关采用 何种疗法来治疗无反应者组的信息。这是因为蛋白质组图是基于药物靶 标本身构建的。另外，基因表达分析中对许多基因进行分析是很复杂的， 通常包括使用算法和广泛的计算机分析，并且不反映蛋白质药物靶标的 活化状态或功能状态。基因表达与信号途径蛋白质的磷酸化无关。

附图说明

图1显示了横纹肌肉瘤样品组的特征。(图1A)通过反相蛋白质微 阵列评价两个独立的研究组(1A组和1B组)，以得到细胞信号转导蛋 白质状态的谱图。(图1B)横纹肌肉瘤研究组1A和1B的存活分析。通 过Kaplan-Meier存活估计显示，来自两个不同类研究组的总存活 (Overall survival，OAS)和无复发存活(recurrence free survival， RFS)均无显著差异(OAS对数秩(log-rank)p＝0.2111，RFS p＝0.5824)。 (图1C)组织学分型未显示研究组之间的显著差异(Kaplan-Meier OAS 对数秩p＝0.4103，RFS p＝0.4312)。

图2显示了横纹肌肉瘤研究组1A的探索性数据分析。(图2A)归 一化蛋白质终点的无参照(unsupervised)Bayesian聚类分析(列)表 明有两个主要的肿瘤聚类(行)。在(图2B)中，这些聚类显示出与临 床参数无关。通过Fisher精确检验对所述两个聚类进行比较，p>0.05。

图3显示了横纹肌肉瘤样品组1A的反相蛋白质微阵列激酶途径谱 分析结果。(图3A)4EBP1和4EBP1 Thr37/46证明了研究组1A中非 存活者与存活者状态的分离的统计学显著相关性。(4EBP1威尔科克森 单因素卡方0.0064，df＝1，n＝32)，非存活者平均值4EBP1＝82.4，平均值标 准误＝11.48；存活者平均值4EBP1＝145.61，平均值标准误＝14.89；(4EBP1 Thr37/46卡方0.0135，df＝1，n＝33))。(图3B)决策树分析表明4EBP1是 研究组1A中存活的鉴别物，因此，计算了对于4EBP1的Kaplan-Meier 存活估计。Kaplan-Meier曲线表明，相比于4EBP1水平相对低的样品 (黑线)，相对高水平的4EBP1(灰线)与总存活(对数秩p<0.0177， n＝32[一个样品的数据不可用])和无复发存活(p＝0.0370)具有显著的 统计相关性。

图4显示了横纹肌肉瘤样品组1B的反相蛋白质微阵列激酶途径谱 分析结果。(图4A)在1B组中通过对数秩分析对Akt Ser473(OAS p<0.001，RFS p<0.0009)、(图4B)eIF4G Ser1108(OAS p<0.0017，RFS p<0.0072)、(图4C)4EBP1 Thr37/46(OAS p<0.0110，RFS p<0.0106) 以及(图4D)p70S6 Thr389(OAS p<0.0085，RFS p<0.0296)进行的 Kaplan-Meier存活分析显示了总存活和无复发存活均具有统计学显著 的相关性。灰线表示所示蛋白质终点相对高的水平，黑线表示相对低的 水平。(图4E)通过反相蛋白微阵列对横纹肌肉瘤样品组1B评价的蛋 白质终点(□存活者状态，■非存活者状态)。通过威尔科克森单因素分 析发现4EBP1 Thr37/46(p<0.0348)、GSK3α/β Tyr279/216(p<0.0348)、 eIF4G Ser1108(p<0.0196)、Akt Ser473(p<0.0227)、Bak(p<0.0321) 以及p70S6 Thr389(p<0.0373)与总存活具有统计学显著的相关性(平 均值±SEM)。

图5显示横纹肌肉瘤样品组1B中的IRS-1细胞信号转导途径。(图 5A)IRS-1反馈回路图。通过Akt的正反馈回路以及通过mTOR和p70S6 的负反馈回路均通过IRS-1 ser612调控IRS-1。(图5B)样品组1B中 IRS-1/Akt/mTOR途径蛋白质的非参数分析(表1B)。对于样品组1B所评 价的所选促存活和凋亡信号转导蛋白的Spearman Rho表。(图5C)相比 于来自非存活者状态的患者的肿瘤(p＝0.7358)，Spearman Rho非参数分 析显示了来自存活者状态患者的肿瘤中IRS-1Ser612与mTOR Ser2448之 间的相关性(p＝0.0027)。(图5D)相比于来自非存活者状态患者的肿瘤样 品(p＝0.1827)，在来自存活者状态患者的肿瘤样品中发现了IRS-1 Ser612 与p70S6 Thr389之间类似的相关性(p＝0.00004)。

图6显示小鼠异种移植物模型中人横纹肌肉瘤肿瘤生长的CCI-779 抑制。(图6A)异种移植物处理模型的肿瘤组织中mTOR途径下游底物 磷酸化的时间依赖性CCI-779抑制。与肌动蛋白相比，CCI-779在无关肌 肉和肿瘤组织中均抑制mTOR途径底物pS6 Ser235/236和4EBP1 Thr70 的磷酸化。(图6B)CCI-779在Rh30和RD小鼠异种移植物模型中抑制 肿瘤生长。将来自Rh30腺泡状细胞系或RD胚胎型细胞系的0.2ml总体 积中2×106个细胞/小鼠原位(orthotopically)注射到SCID褐色小鼠模型 的左后肢腓肠肌内。一周后，将小鼠分配至对照(n＝8)或CCI-779处理 组(n＝8)。对于Rh30和RD异种移植物而言，CCI-779处理组中游标卡 尺所测量的肿瘤体积均小于仅使用载体的组，--▲--RD对照，-■-Rh30加 CCI-779，--◆--Rh30对照，--X--RD加CCI-779，(RDp＝0.00008；Rh30 p＝0.0002，Student’s t检验)。(图6C)在30天中每三天以20mg/kg/IP施 用CCI-779。将来自Rh30和RD小鼠异种移植物肿瘤或无关肌肉的蛋白 质提取物用CCI-779或载体处理30天，通过Western印迹分析S6和4EBP1 磷酸化。CCI-779在Rh30和RD的肌肉和肿瘤细胞中均抑制4EBP1的磷 酸化。

图7显示肺腺癌肿瘤样品的划分分析(partition analysis)。

图8显示对肺癌进行的通过p4EBP1切点(cutpoint)进行分组的分析 物关联存活拟合。

图9显示对肺癌进行的通过p4EBP1 pAKTser473切点进行分组的分 析物关联存活拟合。

图10显示对乳腺癌进行的通过p4EB-P1切点进行分组的分析物关联 存活拟合；存活者仅来自LN-亚组。

图11显示对乳腺癌进行的LN+人群的划分分析，表面以p70S6作为 主要的分离组分。

图12显示对乳腺癌进行的来自所有病例(LN-和LN+)的存活曲线。

发明内容

本发明提供例如用于治疗癌症的组合和方法，其基于评估一个或多 个mTOR信号转导途径成员的活化状态以及与此途径互联 (interconnect)的基因及其编码产物的活化状态。因为本发明的诊断 测定仅需要测定少数蛋白质的磷酸化状态，所以该测定易于实施，不需 要复杂的基于计算机的分析。

本发明涉及例如预测受试者对化疗剂的反应和/或受试者预后的方 法，和/或用于在有此需要的受试者中治疗癌症的方法，其包括：

在来自该受试者的癌组织或癌细胞样品中测量至少一个mTOR途 径成员和/或至少一个互联多肽途径成员相比于基线值的磷酸化状态，

其中所述磷酸化状态水平相比于基线值的升高表明该受试者是所 述化疗剂的无反应者和/或预后差。

本文所使用的“对化疗剂的反应”指对常规化疗剂(例如本文其它 地方所列举的)的反应。此术语不包括对本文所述新类型癌症抑制剂 (mTOR途径或本文所述的互联途径之一的抑制剂)的反应。

本文所使用的“受试者”包括任何患有癌症的动物。合适的受试者 (患者)包括实验动物(例如小鼠、大鼠、兔或豚鼠)、农场动物和家 养动物或宠物(例如猫或狗)。非人灵长类以及优选地人患者也包括在 内。

蛋白质的“磷酸化状态”指所述蛋白质的磷酸化程度(总量)。这 包括蛋白质中发生磷酸化的位点(例如合适的Ser、Thr或Tyr氨基酸 残基)数以及在氨基酸链上任意给定受体位点的磷酸化水平。

本文所使用的“基线值”指同一蛋白质在正常的非癌症或未刺激受 试者中的磷酸化水平。蛋白质磷酸化量的增加可反映该蛋白质中发生磷 酸化的合适氨基酸残基(例如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸)数量的增加或 者特定氨基酸残基磷酸化频率的提高。例如，基线值包括参照标准，其 中预定的阈值(或阈值范围)确定所测量的磷蛋白(phosphoprotein) 量或该蛋白质的磷酸化状态是否高于“正常”值。在本文中，术语阈值 水平和基线值可互换使用。对于每个已测定磷酸化水平的蛋白质，该值 可对细胞中的总蛋白进行归一化；或者对组成型表达的蛋白质(来自看 家基因)例如肌动蛋白的量进行归一化；或者可将磷蛋白的量与其非磷 酸化对应物的量进行比较。

“互联”多肽途径可以来自Akt途径、IRS途径，或者它可以是另 一个互联多肽，例如pRb，Akt的底物(例如GSK3)，或者凋亡调节物 (例如Bak)。可以测量所述途径之一的任何个体成员或者其组合的磷 酸化状态。例如，如果至少一个mTOR途径成员代码为“A”，至少一 个Akt途径成员代码为“B”，至少一个IRS途径成员代码为“C”，那 么所测定的磷酸化状态可以是A；B；C；A+B；A+C；B+C；或A+B+C。

所述途径成员可以为如Akt激酶、mTOR、4E-BP1/PHAS-1、p70s6k、 eIF-4E或eIF-4G、PTEN、PDK1、GSK3β、TSC1/2、ILK、Gab1/2、p27Kip1、 FKHR、FKHRL、eNOS、ASK1、BAD、pRAS40、14-3-3或者CHK1。 本文的其它地方标出了具体的磷酸化残基。在另一个实施方案中，所述抑 制剂结合FKB12。

本发明的另一个方面是如上所述的方法，其是一种治疗方法，其中进 一步地，如果未观察到该途径成员的磷酸化状态相对于其基线值显著提 高，则用常规化疗方法治疗该受试者。

本发明的另一个方面是如上所述的方法，其是一种治疗方法，其中进 一步地，其中如果观察到该途径成员的磷酸化量相对于其基线值显著提 高，则对该受试者施用mTOR途径或互联多肽途径的抑制剂。

本文所使用的“显著”提高意为使用本领域公知的适当统计学方法获 得的统计学显著变化，通常其概率值小于由随机变异导致的变化的小于 5％。本文所使用的单数形式包括复数形式，除非另外明确指出。例如，如 上文所使用的“所测试途径的成员”包括该途径的2个、3个、4个、5个 或更多成员。类似地，“所述途径的抑制剂”包括多个抑制剂。

在本发明的一些实施方案中，常规化疗剂可与所述抑制剂组合施用于 受试者。常规化疗剂可以与mTOR成员或互联途径成员的抑制剂一起(同 时)施用；或者在mTOR/互联途径成员的抑制剂施用后的适当时间施用(例 如在磷酸化水平降低到“正常”水平之后)。

在本发明的一些方面中，在施用抑制剂之后测量所述途径成员的磷酸 化状态；和/或所施用抑制剂的量有效降低所述途径成员的磷酸化量。

本发明的另一个方面是使用化疗剂在有此需要的受试者中治疗癌症的 方法，其改进包括，如果在来自受治受试者的癌组织或癌细胞样品中测量 到mTOR途径或互联多肽途径的成员磷酸化提高，则施用mTOR途径或 互联多肽途径的抑制剂。

本发明的另一个方面是治疗化疗剂抗性或难治性癌症的方法，其包括 如果在来自受治受试者的癌组织或癌细胞样品中测量到mTOR途径或互 联多肽途径的成员磷酸化提高，则施用mTOR途径或互联多肽途径的抑制 剂。

在本发明的一个治疗方法中，可在化疗之前测量磷酸化，当在来自受 治受试者的癌组织或癌细胞样品中测量到所述途径的成员的磷酸化提高 时，则将该抑制剂与治疗剂组合施用以治疗癌症。在本发明的治疗方法中， 可使用针对选自以下的至少一个成员中磷酸化位点的抗体来测量该途径 成员的磷酸化：例如PI3激酶、Akt激酶、mTOR、4E-BP1/PHAS-1、p70s6k、 eIF-4E和eIF-4G。所述癌症可以是例如乳腺癌、横纹肌肉瘤或者肺癌(例 如非小细胞肺癌)。在本发明的一些实施方案中，所述样品包括转移的 细胞；和/或它与PTEN功能的丧失和/或突变和活化的Akt无关。

本发明的另一个方面是预测受试者对化疗剂反应和/或该受试者预 后的方法，其包括在来自受治受试者的癌组织或癌细胞样品中测量 Akt/mTOR途径(或互联基因以及它们编码的多肽)中至少一个成员的量 或磷酸化状态的变化，其中水平的升高表明该受试者是对该化疗剂的无反 应者和/或预后差。

本发明的另一个方面是在有此需要的受试者中使用化疗剂治疗横纹 肌肉瘤的方法，其改进包括当在来自所治疗受试者的癌组织或癌细胞样 品中测量到4EBP1 Thr37/46、eIF-4G ser1108和/或p70S6 Thr389处磷酸 化提高时施用CCI-779。

本发明的另一个方面是用于预测受试者对化疗剂反应和/或该受试者 预后的试剂盒，其包含一种或多种用于检测mTOR途径至少一个成员、 Akt途径至少一个成员和/或IRS途径至少一个成员或者其组合的磷酸化状 态的试剂。所述试剂可以是例如所述蛋白质的磷酸化形式的特异性抗体。 所述试剂盒可包含适用于本领域已知的有标签方法或无标签方法的试剂， 以使用质谱或电泳迁移来测量磷酸化位点。

本发明的另一个方面是用于治疗有此需要的受试者的药物组合物或试 剂盒，其包含mTOR途径至少一个成员的抑制剂和/或Akt途径至少一个 成员的抑制剂和/或IRS途径至少一个成员的抑制剂或其组合。药物组合物 包含可药用载体。所述药剂或试剂盒还可包含可与本发明抑制剂联合施用 的化疗剂。

本发明的另一个方面是用于治疗患有化疗剂抗性或难治性癌症的受试 者的药物组合物或试剂盒，其包含mTOR途径至少一个成员的抑制剂和/ 或Akt途径至少一个成员的抑制剂和/或IRS途径至少一个成员的抑制剂 或其组合。所述药物组合物或试剂盒还可包含可与所述抑制剂联合施用或 依次施用的化疗剂。

mTOR信号转导途径包括任何参与其信号转导级联的成员或组分。它 们包括但不仅限于mTOR(雷帕霉素的哺乳动物靶标；也称为FRAP、 RAFT1或RAPT1)、RAPTOR(mTOR的调节相关蛋白)、 4E-BP1/PHAS-1、p70s6k、TSC(结节性硬化复合体)、4E-BP1/PHAS-1、 p70s6k、eIF-4E、eIF-4G和/或eIF4E复合体。与mTOR途径互联(相互 作用)的基因(或其编码产物)包括但不仅限于Akt途径的成员[例如Akt、 PI3激酶、PTEN(磷酸酶和张力蛋白同系物)和FKBP12]；IRS途径的 成员[例如IRS-1和胰岛素生长因子(insulin growth factor，IGF)受体， 包括IGF-R1、IGF-Rβ和IGF-Rα]；以及其它相关途径的成员[例如pRb (肿瘤抑制基因，视网膜母细胞瘤蛋白)；Akt的底物例如GSK3；以及凋 亡调节物，例如Bak]。本文中这些途径(包括与mTOR途径的成员相互 作用多肽)有时总称为“mTOR或互联多肽途径。”

优选的超磷酸化(例如超过正常)的活化成员及其发生磷酸化的位点 包括如4E-BP1Thr37/46；eIF-4E ser1108；AKT ser473；p70s6k Thr389等 等。可根据本发明使用它们中的一个或多个。

上述基因的核苷酸和氨基酸序列是公知的，并且可常规地测定和从多 种已知数据库中下载。参见例如www.ncbi.nlm.nih.gov。

mTOR或互联信号转导途径的活化可使用任何已知方法测量，例如能 够测量总磷酸化蛋白质或蛋白质磷酸化程度的方法。合适的测定有比色测 定、免疫测定(例如免疫组织化学、ELISA等)、基于荧光读数的测定、 悬浮珠测定等许多类型。例如，可使用反相蛋白质微阵列(reverse phase protein microarray，RPMA)进行蛋白质测量(例如测量磷酸化蛋白质)。 参阅如Nishizuka等(2003)Proc.Natl Acad.Sci 100，14229-14239。适用 于这些测定的抗体是市售的，或者可常规地制备，包括针对该多肽的磷酸 化和非磷酸化形式的抗体。(特别有用的是已经开发成特异性识别激酶底 物的磷酸化亚型的抗体。)另外，可使用Western印迹、ELISA测定、免 疫沉淀和质谱以及其它一些常规测定来评估(例如mTOR信号转导途径成 员的)磷酸化水平和/或程度。合适的方法包括可在非常小的样品中(例如 约200个细胞)监测磷酸化蛋白质的方法。或者，可使用适于大样品(例 如约20000-25000个细胞)的方法。

当在得自受试者的癌症样品中观察到mTOR途径(或互联途径)中至 少一个成员的磷蛋白总量或磷酸化程度提高时，可以施用mTOR抑制剂 (或互联途径的抑制剂)。

可常规地测定总蛋白量或磷酸化蛋白量的增加。例如，可使用参照标 准，此时预定的阈值(或阈值范围)确定所测蛋白质的量是否高于“正 常”值。本文中这样的阈值有时称为基线值。另外，可通过强度来确定 该量，此时使用评分强度来确定受试者的Akt/mTOR途径是否被活化。 (例如，使用1至5评分系统，其中5是最高，高于3的强度表示途径 活化)。

本发明的一些方面可用作预后和/或诊断，以预测受试者对化疗剂的 反应和/或预后。这样的方法可包括在来自所治疗受试者的癌组织或自 细胞样品中测定mTOR和/或互联途径中至少一个成员的量和/或磷酸化 状态的改变，其中水平的升高表明所述受试者对通常用于治疗该癌症的 化疗剂是无反应者和/或预后差。

Akt/mTOR抑制剂包括但不限于以下各项：

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-激酶)抑制剂的实例包括但不限于例如

塞来考昔及其类似物，例如OSU-03012和OSU-03013(例如Zhu 等(2004)Cancer Res.64(12)：4309-18)；

3-脱氧-D-肌醇类似物(例如美国专利申请号20040192770；Meuillet 等(2004)Oncol.Res.14，513-27，2004)，例如PX-316；

2’-取代，3’-脱氧-磷脂酰-肌醇类似物(例如Tabellini等(2004)Br.J. Haematol.126(4)，574-82)；

稠合的杂芳基衍生物(美国专利号6,608,056)；

3-(咪唑并[1，2-a]吡啶-3-基)衍生物(例如美国专利号6,403,588和 6,653,320)；

Ly294002(例如Vlahos等(1994)J.Biol.，Chem.269(7)，5241-5248)；

喹唑啉-4-酮衍生物，例如IC486068(例如美国专利申请号 20020161014；Geng等(2004)Cancer Res.64，4893-99)；

3-(异)芳氧基取代苯并(b)噻吩衍生物(例如WO 04 108715；以及 WO 04 108713)；

绿色木霉素(viridin)，包括半合成绿色木霉素，例如PX-866(乙 酸(1S，4E，10R，11R，13S，14R)-[4-二烯丙基氨基亚甲基-6-羟基-1-甲氧基甲 基-10，13-二甲基-3，7，17-三氧代-1，3，4，7，10，11，12，13，14，15，16，17-十二氢-2- 氧杂-环戊[a]菲-11-基酯)(例如Ihle等(2004)Mol Cancer Ther.3(7)， 763-72；美国专利申请号20020037276；美国专利5,726,167)；和

渥曼青霉素及其衍生物(例如美国专利号5,504,103；5,480,906， 5,468,773；5,441,947；5,378,725；3,668,222)。

Akt激酶(也已知为蛋白激酶B)抑制剂的例子包括但不限于例如

Akt-1-1(抑制Akt1)(Barnett等(2005)Biochem.J.，385(Pt.2)， 399-408)；

Akt-1-1，2(抑制Ak1和2)(Barnett等(2005)Biochem.J.385(Pt.2)， 399-408)；

API-59CJ-Ome(例如Jin等(2004)Br.J.Cancer 91，1808-12)；

1-H-咪唑并[4，5-c]吡啶基化合物(例如WO05011700)；

吲哚-3-甲醇及其衍生物(例如美国专利号6,656,963；Sarkar和Li (2004)J Nutr.134(12 Suppl)，3493S-3498S)；

哌立福辛(perifosine)(例如干扰Akt膜定位；Dasmahapatra等 (2004)Clin.Cancer Res.10(15)，5242-52，2004)；

磷脂酰肌醇醚脂质类似物(例如Gills和Dennis(2004)Expert.Opin. In vestig.Drugs，13，787-97)；

曲西立滨(TCN或API-2或NCI标识符：NSC 154020；Yang等 (2004)Cancer Res.64，4394-9)。

mTOR抑制剂的例子包括但不限于例如

FKBP12增强剂；

雷帕霉素及其衍生物，包括：CCI-779(坦西莫司(temsirolimus))， RAD001(依维莫司(Everolimus)；WO 9409010)和AP23573；雷帕 霉素类似物(rapalog)，例如WO 98/02441和WO 01/14387中公开的， 例如AP23573、AP23464或AP23841；40-(2-羟乙基)雷帕霉素；40-[3- 羟基(羟甲基)甲基丙酸酯]-雷帕霉素(也称为CC1779)、40-表-(四唑基)- 雷帕霉素(也称为ABT578)、32-脱氧雷帕霉素、16-戊炔基氧基-32(S)- 二氢雷帕霉素以及WO 05005434公开的其它衍生物；在USP 5,258,389、WO 94/090101、WO 92/05179、USP 5,118,677、USP 5,118,678、 USP 5,100,883、USP 5,151,413、USP 5,120,842、WO 93/111130、WO 94/02136、WO 94/02485、WO 95/14023、WO 94/02136、WO 95/16691、 WO 96/41807、WO 96/41807和USP 5,256,790中公开的衍生物；

含有磷的雷帕霉素衍生物(例如WO 05016252)；

4H-1-苯并吡喃-4-酮衍生物(例如美国临时申请号60/528,340)。

IRS途径抑制剂的例子包括但不限于以下：使用中和抗体、拮抗肽 或者选择性激酶抑制剂NVP-ADW742对IGF-1R的特异性抑制已被证 明对多种肿瘤细胞类型具有活性。蛋白酶体抑制剂、MG132和乳胞素 (lactacystin)抑制IRS-1的磷酸化。蛋白酶体抑制剂可调控IRS-1的 酪氨酸磷酸化以及下游的胰岛素信号转导途径，引起葡萄糖转运。诱导 型一氧化氮合酶、iNOS和NO供体诱导IRS降解。IRS-1的丝氨酸磷 酸化受κB激酶复合体抑制剂的调控。毒胡萝卜素(Thapsingargin)下 调IRS-1。PKC途径和Akt抑制剂包括卡弗他丁C(calphostin C)、星 形孢菌素(Staurosporine)和LY294002。STI571是与本发明途径相关 的cKit途径的另一抑制剂。

临床前或临床应用的化合物实例包括如AP23573、AP23841、 CCI-779和RAD001。

无论其机制如何，任何肿瘤或癌症均可根据本发明进行治疗。这包 括任何器官的肿瘤或癌症，所述器官包括但不限于例如结肠、胰腺、乳 腺、前列腺、骨、肝、肾、肺、睾丸、皮肤、胰腺、胃、前列腺、卵巢、 子宫、头颈、血细胞、淋巴等。

可根据本发明治疗的癌症包括但不限于脑瘤、乳腺癌、骨肉瘤(例 如骨肉瘤和尤因肉瘤)、支气管癌前病变、子宫内膜癌、成胶质细胞瘤、 恶性血液病、肝细胞癌、何杰金病、肾瘤、白血病、平滑肌瘤、脂肪肉 瘤、淋巴瘤、Lhermitte-Duclose病、恶性神经胶质瘤、黑色素瘤、恶性 黑色素瘤、转移癌、多发性骨髓瘤、髓样化生、骨髓白细胞综合征、非 小细胞肺癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌(例如晚期、晚期难治性)、 横纹肌肉瘤、软组织肉瘤、皮肤扁平上皮癌。

乳腺癌的例子包括但不限于侵袭性导管癌、侵袭性小叶癌、原位导 管癌以及原位小叶癌。

呼吸道癌症的例子包括但不限于小细胞癌、非小细胞肺癌、支气管 腺癌和胸膜肺母细胞瘤。

脑癌的例子包括但不限于脑干和下丘脑(hypophtalmic)神经胶质 瘤、小脑和大脑星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤以及神经外胚层和 松果体肿瘤。

雄性生殖器官肿瘤包括但不限于前列腺和睾丸的癌症。雌性生殖器 官癌症包括但不限于，子宫内膜、宫颈、卵巢、阴道和外阴的癌症以及 子宫肉瘤。

消化道肿瘤包括但不限于肛门、结肠、结肠直肠、食管、胆囊、胃、 胰腺、直肠、小肠和唾液腺的癌症。

尿道肿瘤包括但不限于膀胱、阴茎、肾、肾盂、输尿管和尿道癌症。

眼癌包括但不限于眼内黑色素瘤和视网膜母细胞瘤。

肝癌的例子包括但不限于肝细胞癌(带有或不带纤维板层变异的肝 细胞癌)、胆管癌(肝内胆管癌)以及混合型肝细胞胆管癌。

皮肤癌包括但不限于扁平细胞癌、卡波西肉瘤、恶性黑色素瘤、默 克细胞皮肤癌和非黑色素瘤皮肤癌。

头颈癌包括但不限于喉、下咽、鼻咽和/或口咽癌，以及唇和口腔癌。

淋巴瘤包括但不限于AIDS相关淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、皮肤T 细胞淋巴瘤、何杰金病和中枢神经系统淋巴瘤。

肉瘤包括但不限于软组织肉瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋 巴肉瘤和横纹肌肉瘤。

白血病包括但不限于急性髓性白血病、急性淋巴母细胞性白血病、 慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病以及毛细胞白血病。

还可从本发明中排除一些癌症，例如与以下相关的癌症：PTEN功 能丧失；突变和活化的Akt(例如无PTEN的肿瘤和具有ras突变的肿 瘤)；或者已鉴定为导致癌症的主要致病基因或多肽的mTOR或互联抑 制途径中的其它突变。

治疗方法可包括：

A：测量肿瘤样品中mTOR信号途径和/或互联的其它信号途径的活 化状态。可通过调节上游和下游信号正调控和负调控的途径成员的磷酸 化(和/或总量)来评估活化。B：基于信号途径活化模式，施用阻断所 述途径活化的治疗以作为独立疗法或者作为新辅助疗法或组合疗法方 案中的疗法。

本发明的一个方面是利用mTOR途径磷酸化蛋白质成员的癌症诊 断或预后检测。分析物实例在本文其它部分讨论。已经发现，如实施例 中所示，mTOR途径或互联途径的活化可预测接受过当前标准处置的肺 癌、乳腺癌和横纹肌肉瘤患者的结局。例如，磷酸化状态的蛋白质 mTOR、4EBP1、E1F4G、E1F4E和p70S6可与结局相关。未观察到其 它途径的活化也这样相关。简单地说，相比于无mTOR活化的患者， mTOR途径活化(证据为mTOR下游底物的磷酸化水平)的患者具有 较短的存活期、无疾病间隔或者其它治疗成功的度量。这种标准处置将 包括手术、化疗和雌激素受体疗法(乳腺)。因为这些肿瘤类型代表了 来自于不同微环境的完全不同的病理谱系(pathological lineage)，因此 预计此发现将可用于其它肿瘤类型或由其产生的肿瘤干细胞，包括癌 症：结肠直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、脑癌、 甲状腺癌、肾癌以及肉瘤：纤维肉瘤、血管肉瘤和黑色素瘤等。

本发明的一些方面还包括治疗患有癌症的受试者，所述受试者已变 成化疗抗性或难治性。后者意为之前对至少一种化疗有反应，接触到该 药剂之后，在使用这些药剂进行后续治疗后显示没有或仅有弱抗癌(例 如抗增殖反应，例如没有或仅很弱地抑制肿瘤生长)效果的患者。因此， 在成功使用化疗剂治疗患者之后，后续治疗却显示没有或几乎没有效 果，则所述癌症可描述为该药剂难治性或抗性。所述方法包括鉴别这样 的患者，然后确定其mTOR途径活化是否升高。这一群体可通过mTOR 抑制剂(或者下游、上游、或上下游互联途径的抑制剂)进行治疗。

在本发明的一个实施方案中，使用靶向mTOR或互联途径中特定节 点的一种或多种抑制剂(例如mTOR或AKT特异性抑制剂)治疗受试 者。在另一个实施方案中，可使用抑制剂组合来抑制所述途径中的多个 节点。这有时使得可以施用毒性较低的较低剂量抑制剂，并破坏途径中 的多个点。这样的方法是有用的，例如在若干蛋白质显示出磷酸化提高 时。

患者可变为难治性或获得抗性的化疗剂实例包括如(但不限于此) 烷化剂(例如环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、氮丙啶、 环氧化物、烷基磺酸酯)、顺铂及其类似物(例如卡铂、奥沙利铂)、抗 代谢物(例如氨甲蝶呤、5-氟尿嘧啶、卡培他滨、阿糖胞苷、吉西他滨、 氟达拉滨)、拓扑异构酶相互作用剂(例如喜树碱、伊立替康、拓扑替 康、依托泊苷、替尼泊苷、多柔比星、柔红霉素)、抗微管剂(例如长 春花生物碱类，例如长春新碱、长春碱和长春瑞滨；紫杉烷类例如紫杉 醇和多烯紫杉醇)、干扰素、白介素-2、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、单 克隆抗体、雌激素调节剂(例如他莫昔芬、托瑞米芬、雷洛昔芬)、甲 地孕酮、芳香酶抑制剂(例如来曲唑、阿那曲唑、依西美坦、奥曲肽)、 奥曲肽、抗雄激素(例如氟他胺、康士得)、激酶和酪氨酸抑制剂(例 如伊马替尼(STI571或Gleevac)；吉非替尼(易瑞沙)；和埃罗替尼(特 罗凯)等。参阅如Cancer：Principles and Practice of Oncology，第七版， Devita等，Lippincott Williams & Wilkins，2005，15、16、17和63章。

本发明人发现，对具有不同作用机制的多种化疗剂具有抗性(难治 性)的受试者均显示mTOR或互联途径的活化。因此可以预计，一个 或多个这些途径的活化将适用于对除本文示例之外的多种化疗剂具有 抗性的癌症。

实施例显示，在动物异种移植物模型中，施用mTOR抑制剂抑制了 mTOR途径中蛋白质的下游磷酸化，与对照相比大幅降低了两种不同 RMS细胞系的生长速率。这支持了mTOR抑制剂和互联基因/蛋白质抑 制剂的治疗有用性。

因此，本发明既是预后特征也是新的药物靶标。这当前被称之为“治 疗诊断(theranostic)”，其中所测量的分析物同时作为诊断和治疗的靶 标。目前一个这样的例子是e-erbB2。在乳腺癌患者中测量此蛋白质 (EGF受体家族的一个成员)作为预后差患者的诊断终点，其本身也 是药物靶标-用于HERCEPTIN。因此它可用于分类和靶向治疗。

可对活检或者其它组织或细胞样品(包括血样和来自转移部位的样 品)分析下列特异性涉及mTOR(或互联)途径活化的终点：

总mTOR

总4EBP1

总EIF4G

总E1F4E

总p70S6

磷酸化pAKT

磷酸化mTOR

磷酸化4EBP1

磷酸化EIF4G

磷酸化E1F4E

磷酸化p70S6

这些特定终点或其它途径成员的强度值的组合可用于将患者分类 为接受标准处置或接受mTOR抑制剂(和/或互联途径抑制剂)方案， 例如但不限于CCI-779，雷帕霉素抑制剂。

无论其作用机制如何，所述非磷酸化状态和磷酸化状态的蛋白质 均可根据本发明使用。因此，尽管相信所述机制是通过mTOR途径， 但是本发明不受任何使诊断治疗、治疗和/或预后方法获得成功的机制 限制。

本文所述抑制剂可制成多种组合物，例如药物组合物，以用于治 疗方法。所述药物组合物可组装成试剂盒。一般地，本发明的药物组合 物包含抗癌有效量的所述抑制剂。本文所使用的“抗癌有效量”是在合 理的时间范围内足以在个体中至少产生治疗反应的量。例如，它可至少 在可检测程度上减轻癌症的症状，或者可抑制肿瘤生长，等等。

所述组合物可包含载体，例如可药用载体。“可药用”指不在生物 学或其它方面不理想的材料，即该材料可施用于受试者，而不造成任何 不期望的生物学效应或者以有害方式与包含它的药物组合物中任何其 它成分相互作用。自然，如本领域技术人员所公知，将选择载体以使得 活性成分的任何降解最小化，并使得受试者中的任何有害副作用最小 化。对可药用载体及药物组合物中其它成分的讨论可参阅如 Remington’s Pharmaceutical Sciences，第十八版，Mack Publishing Company，1990。

除了mTOR或互联途径成员的抑制剂之外，本发明的药物组合物 或试剂盒还可含有其它药物(例如化疗剂)。所述其它化疗剂可在患者 治疗过程中的任意合适时间同时或依次施用。例如，在一个实施方案中， 所述其它化疗剂可在用本发明抑制剂的治疗已显著降低受试者中 mTOR途径的活化之后施用。在另一个实施方案中，所述其它化疗剂与 mTOR等的抑制剂同时(共同)施用。在一个实施方案中，所述其它化 疗剂是上文所提到的受试者可变为难治性或获得抗性的一种化疗剂。在 另一个实施方案中，可使用其它化疗剂，其代表性实例列于表2。

本领域技术人员应理解，具体的剂型将部分取决于所使用的具体 的本发明抑制剂或者其它化疗剂以及所选的给药途径。因此，本发明组 合物有多种合适的剂型。

表2

作用机制                                类别(药物名)

烷化剂                                  氮芥类：(苯丁酸氮芥、氮芥

                                        (Chlormethine)、环磷酰胺、异环

                                        磷酰胺、美法仑)。亚硝基脲类：(卡

                                        莫司汀、福莫司汀、洛莫司汀、链

                                        佐星)。铂：(卡铂、顺铂、奥沙利

                                        铂、BBR3464)。白消安、达卡巴嗪、

                                        氮芥(Mechlorethamine)、丙卡巴

                                        肼、替莫唑胺、塞替派、乌拉莫司

                                        汀

抗代谢物：                              叶酸：(氨甲喋呤、培美曲塞、雷替

                                        曲塞)。嘌呤：(克拉屈滨、克罗拉

                                        滨、氟达拉滨、巯嘌呤、硫鸟嘌吟)。

                                        嘧啶：(卡培他滨)。阿糖胞苷、氟

                                        尿嘧啶、吉西他滨

植物碱：                                紫杉烷：(多烯紫杉醇、紫杉醇)。

                                        长春花：(长春碱、长春新碱、长春

                                        地辛和长春瑞滨)。

细胞毒性/抗肿瘤抗生素：                 蒽环族：(柔红霉素、多柔比星、表

                                        柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊

                                        柔比星)。博来霉素、羟基脲、丝裂

                                        霉素

拓扑异构酶抑制剂：                      拓扑替康、伊立替康、鬼臼属

                                        (Podophyllum)(依托泊苷、替尼

                                        泊苷)。

单克隆抗体：                            阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、

                                        吉姆单抗、帕尼单抗、利妥昔单抗、

                                        曲妥珠单抗

光敏剂：                       氨基乙酰丙酸、氨基乙酰丙酸甲酯、

                               卟吩姆钠、维替泊芬

其它：                         阿利维A酸、六甲蜜胺、安吖啶、

                               阿那格雷、三氧化二砷、天冬酰胺

                               酶、蓓萨罗丁、硼替佐米、塞来考

                               昔、地尼白介素、埃罗替尼、雌莫

                               司汀、吉非替尼、羟基脲、伊马替

                               尼、喷司他丁、马索罗酚、米托坦、

                               培门冬酶、维甲酸

激素                           他莫昔芬、孕酮类

适于经口给药的剂型可包括液体溶液，例如溶于稀释剂(例如水、 盐水或果汁)中的有效量药剂；胶囊剂、囊剂或片剂，其各包含预定量 的活性成分作为固体、颗粒或冻干单元；水性液体中的溶液或悬液；以 及水包油乳剂或油包水乳剂。片剂形式可包括以下的一种或多种：乳糖、 甘露醇、玉米淀粉、土豆淀粉、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶体二 氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸以及其它赋形 剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、芳香剂以及可药用载 体。还可将适于经口给药的剂型掺入合成及天然聚合物微球或者其它保 护本发明药物以防止在胃肠道中降解的材料中。

适于胃肠外给药(例如静脉内)的剂型包括水性和非水性等渗无 菌注射液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使该制剂与预期受体 的血液等渗的溶质，还包括可含有助悬剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和 防腐剂的水性和非水性无菌悬液。所述剂型可存在于单位剂量或多剂量 密封容器中(例如安瓿和管)，并可在冻干(低温干燥)条件下保存， 仅需在临用前加入无菌液体载体(例如水)以用于注射。可由上述类型 的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备即用型注射溶液和混悬液。

本发明的抑制剂(单独或者与其它化疗剂组合)可制成气雾剂以 通过吸入给药。这些气雾剂可置于加压的可接受推进剂(例如二氯二氟 甲烷、丙烷、氮气等)中。

本发明的抑制剂(单独或者与其它化疗剂组合)可制成用于透皮 给药和吸收的适当剂型(Wallace等，1993，如上文)。还可使用透皮电 穿孔或离子电渗来促进和/或控制本发明药剂和/或药物组合物透过皮肤 的全身递送(例如，参阅Theiss等(1991)，Meth.Find.Exp.Clin. Pharmacol.13，353-359)。

适于局部施用的剂型包括在芳香剂(通常是蔗糖和阿拉伯胶或黄 芪胶)中包含活性成分的糖锭剂；在惰性基质(例如明胶和甘油，或者 蔗糖和阿拉伯胶)中包含活性成分的锭剂；在适当液体载体中包含活性 成分的漱口剂；或者霜剂、乳剂、混悬剂、溶液剂、凝胶剂、霜剂、膏 剂、泡沫剂、润滑剂、喷雾剂、栓剂等。

本领域技术人员会理解，可基于将要进行的具体应用来选择、改 造或开发合适或适宜的剂型。

本发明抑制剂的剂量可以是单位剂型，例如片剂或胶囊剂。本文 所使用的术语“单位剂型”指适于作为人和动物受试者单位剂量的物理 分离的单元，每个单元含有与可药用稀释剂、载体或赋形剂相关联的预 定量的本发明抑制剂(单独的或与其它化疗剂组合)，经计算其量足以 产生期望的效果。

本领域技术人员可容易地对待使用组合物的确切剂型确定合适的 剂量、时间表和给药方法，以在个体患者中实现期望的该药剂抗癌有效 量或有效浓度。本领域技术人员还可通过直接或间接分析合适的患者样 品(例如血液和/或组织)而容易地确定和使用本发明化合物“有效浓 度”的合适指标。

在本发明的上下文中，对动物(特别是人)施用的本发明抑制剂 或其组合物的剂量应在合理的时间范围内足以在个体中至少实现治疗 性反应(抗癌有效量)。剂量的确切量在受试者之间将有所不同，这取 决于受试者的物种、年龄、体重和一般状况、受治疾病的严重程度或机 制、所使用的具体药剂或载体、其给药模式等等。用于在体内实现期望 的抗癌浓度的剂量将由以下因素决定：所使用的具体抑制剂的效力、宿 主中与该药剂相关的药效学性质、所感染个体的疾病状态的严重程度以 及(全身给药时)个体的体重和年龄。剂量的大小还将决定于使用的具 体抑制剂或其组合物所伴随的任何有害副作用的存在情况。一般只要有 可能，就期望将有害副作用保持在最小。

当给予组合治疗时，所述其它化疗剂例如可与抑制剂同时施用， 或者按照需要交替施用。所述两种药物也可组合在组合物中。当用于组 合时，每种的剂量可小于它们单独使用时的剂量。

本发明的另一个实施方案是可用于本文所公开的任何方法的试剂 盒；这样的试剂盒包含一种或多种本文所述抑制剂(例如用于诊断或治 疗方法)。例如，适用于在受试者中治疗癌症的试剂盒可另外包含可药 用载体以及任选的容器或包装材料。本发明的试剂盒还可用于实验应用 等用途。本领域技术人员将会认识到适于实施任何本发明方法的试剂盒 组分。

任选地，所述试剂盒包含实施所述方法的说明。本发明试剂盒任 选的要素包括合适的缓冲剂、可药用载体等、容器或包装材料。试剂盒 中的试剂可以在容器中，在其中所述试剂是稳定的，例如是冻干形式或 稳定的液体。所述试剂还可以是单次应用形式，例如单剂量形式。

在前述和下述实施例中，所有温度以未校正的摄氏温度表示，除 非另外指明，所有份数和百分比均以重量计。

实施例

实施例I.磷蛋白途径作图：Akt/mTOR活化与儿童横纹肌肉瘤存活负 相关

A.引言

横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma，RMS)由具有骨骼肌特征的未 分化间充质细胞引起。RMS是儿童中最常见的软组织肉瘤，其包括三 个组织学亚型-腺泡状、胚胎型和葡萄状。尽管最近在组合化疗上以及 腺泡状RMS中t(2；13)(q35；q14)和t(1；13)(p36；q14)易位的分 子认识上有所进展，但是患儿童横纹肌肉瘤的所有患者的总存活仍停留 在60-70％。

在几个发表的RMS治疗方案研究中，总体无疾病存活率只有 67％。不幸的是，无论疾病分期或组织学亚型如何，都没有方法鉴别出 33％的最初治疗将注定失败的儿童。另一方面，对标准治疗有反应的 60-70％儿童进行得非常好，这些患者中的绝大多数目前均无疾病存活。 因此，一个迫切的临床目标是鉴定与30-40％无反应者RMS受试者相关 的功能重要的分子网络，以开发对于这一组受试者的新治疗策略。

B.材料与方法

1.样品和患者数据。所有样品(n＝59)及相关临床数据获得自具 有适当IRB许可的儿童癌症组织(Children’s Oncology Group，COG) 的组间横纹肌肉瘤研究(Intergroup Rhabdomyosarcoma Study，IRS) IV，D9502和D9803研究。

所有样品在液氮中速冻并保存至治疗前。样品集分为两组，1A和 1B(图1A)。图1B显示两个研究组的存活特征。在最终数据分析之前， 样品就临床存活结局而言是匿名且盲的。代表研究组1A的样品(图1A) 由9个速冻手术样品和来自病理学诊断为横纹肌肉瘤的33个不同患者 的290个冷冻切片组成。此处所用的所有患者在研究开始前均患有3期 (肿瘤<5cm或区域性淋巴结累及)疾病及第III组肿瘤(治疗后明显 疾病残留)。另一组46个冷冻切片样品及临床数据由COG提供(图1A， 表1B)，其患者来自相同方案。在治疗前进行病理诊断。在激光捕捉显 微切割之前，由独立的合格病理学家确认所述诊断。组织学亚型代表腺 泡状、胚胎型、葡萄状和混合多态型。用PixCell II(Molecular Devices， Sunnyvale，CA)从组织切片中显微切割纯肿瘤细胞群。

2.反相蛋白质微阵列。对通过之前发表的方法(例如Petricoin 等(2005)，J.Clin Oncol 23，3614-3621；Liotta等(2003)Cancer Cell 3，317-325；Sheehan等(2005)Mol Cell Proteomics 4，346-365)所产 生的显微切割细胞进行裂解，并使用全细胞蛋白质裂解液如上文 Sheehan等(2005)所述一式二份印制反相蛋白质微阵列。简言之，使 用装备有500μm针的GMS 417阵列仪(Affymetrix，Santa Clara，CA) 将所述裂解液印在背面为玻璃的硝酸纤维素阵列载玻片上(FAST Slides Whatman，Florham Park，NJ)。将每种裂解液以代表原液、1:2、1:4、 1:8、1:16和阴性对照稀释液的稀释曲线印在载玻片上。在免疫染色之 前，使用干燥剂(Drierite，W.A.Hammond，Xenia，OH)将所述载 玻片保存在-20℃。

3.蛋白质微阵列免疫染色。在自动化载玻片染色仪上按照制造商 的说明(Autostainer CSA kit，DAKO，Carpinteria，CA)实施免疫染 色。将每个载玻片与单种第一抗体在室温下孵育30分钟。多克隆第一 抗体为：GSK3α/β Tyr279/216(Invitrogen-Biosource，Carlsbad，CA)、 BCL-2、HIF-1α(BD，Franklin Lakes，NJ)、4EBP1、FKHR ser256、eIF4E、 eIF4E ser209、eIF4G、eIF4G ser1108、IGFR-β、IRS-1、IRS-2、IRS-1 ser612、 SGK、Bak、Bax、BAD、BAD ser112、BAD ser136、BAD ser155、B-Raf， mTOR、mTOR ser2448、p70S6 Thr389、p70S6激酶、p70S6 ser371、S6激 酶ser240/244、Akt、Akt ser473、Akt Thr308、4EBP1 ser65、4EBP1 ser70、 和4EBP1 Thr37/46(Cell Signaling Technology，Danvers，MA)。将阴性对 照载玻片与抗体稀释液孵育。第二抗体是山羊抗兔IgG H+L(1:5000) (Vector Labs，Burlingame，CA)。

4.用于微阵列分析的生物信息学方法。扫描每个阵列，分析点强 度，对数据进行归一化，对阵列上的每个样品产生标准化的单一数值 (Image Quant v5.2，GE Healthcare，Piscataway，NJ)。在固定区域 上求点强度的积分。用未印点的邻近载玻片背景对每个点计算局部区域 背景强度。这对每个样品得到单个数据点，用于与阵列上每一其它点进 行比较。使用JMP v5.0(SAS Institute，Cary NC)进行用于双因素分 级聚类的Ward法。使用威尔科克森双样品秩和检验来比较两组之间的数 值。小于0.05的P值被认为是显著的。当我们不能推测变量的正态分布时， 我们使用非参数方法。我们使用Kaplan-Meier(对数秩)存活估计进行单 变量存活分析。

5.体内异种移植物肿瘤模型。根据国家卫生研究院动物管理及 使用委员会的指导进行动物研究。雌性4-6周龄褐色-SCID小鼠购自 Charles River Laboratories(Wilmington，MA)。将0.2ml稀释剂(5％ 吐温80，5％聚乙二醇400(Sigma，St.Louis，MO))中收获自Rh30 腺泡状或RD胚胎型细胞的中等汇合培养物中的两百万活细胞原位注射 到左后肢的腓肠肌中，1周后将小鼠随机分配至对照组(n＝8)或CCI-779 治疗组(n＝8)。在连续30天中每3天使用20mg/kg/IP的CCI-779 (Developmental Therapeutics Program，National Cancer Institute and Wyeth，Madison，NJ)或仅使用载体腹膜内处理小鼠。每3天使用游标 卡尺测量肿瘤生长，通过式V(mm3)＝a×b2计算肿瘤体积，其中a是 最长的肿瘤轴，b是最短的肿瘤轴。通过CO2窒息处死所有小鼠，进行 尸检以确认肿瘤生长。将肿瘤切下并速冻在-80℃直至分析。

C.鉴定mTOR途径的有用成员

将来自34名患者的肿瘤研究组用于鉴定mTOR途径中能够用于 以近乎完美的准确性区分这34个样品组的成员。为了验证这些发现， 通过反相蛋白质微阵列技术分析了来自(结局和对治疗的反应不同的) 26个患者的独立且盲的肿瘤组，所述技术一次分析多个信号转导事件。 能够基于结局区分第一组中患者的特定蛋白质也能够区分第二个独立 组，示于下文表3：

表3.来自对非转移性3期横纹肌肉瘤样品(n＝26) 的反相蛋白质微阵列的个体蛋白质终点的统计数据

                 非转移性3期横纹肌肉瘤样本

                        n＝26，df＝1

                         结局的单因素分析                           Kaplan-Meier

                             (总存活)                                 存活分析

                                                                   卡方      卡方

蛋白质终点                 终点类型          卡方     概率>卡方     FFS        OAS

4EBP1                      总蛋白           2.0864     0.1486      0.5080     0.7319

4EBP1 Thr 37/46            磷酸化蛋白       4.4568     0.0348      0.0106     0.0110

4EBP1Thr37/46：4EBP        比值

                                            1.6327     0.2013      0.9603     0.7887

1

4EBP1 ser65                磷酸化蛋白       1.7778     0.1824      0.0785     0.1590

4EBP1 ser65：4EBP1         比值             0.3735     0.5411      ND         ND

4EBP1 Thr70                磷酸化蛋白       3.1538     0.0758      0.6454     0.9806

4EBP1 Thr70：4EBP1         比值             0.0031     0.9557      ND         ND

eIF4E                      总蛋白           2.7778     0.0956      0.0086     0.0070

eIF4E ser209               磷酸化蛋白       2.5361     0.1113      0.6033     0.2294

eIF4E ser209：eIF4E        比值             1.6383     0.2006      0.4556     0.2224

mTOR                       总蛋白           2.94       0.0864      0.2023     0.0568

mTOR ser2448               磷酸化蛋白       1.5        0.2207      0.0079     0.0037

mTOR ser2448：mTOR         比值             0.0337     0.8542      0.5545     0.4884

p70S6                      总蛋白           3.1538     0.0758      0.8363     0.6118

p70S6 Thr389               磷酸化蛋白       4.335      0.0373      0.0296     0.0085

p70S6 Thr389：p70S6        比值             0.0167     0.8973      0.3809     0.3862

p70S6 ser371               磷酸化蛋白       2.535      0.1113      ND         ND

p70S6 ser371：p70S6        比值             0          1.0000      ND         ND

GSK3β                      总蛋白           4.0000     0.0455      0.0827     0.0496

GSK3α/β Tyr279/216         磷酸化蛋白       4.4568     0.0348      0.0827     0.0496

GSK3α/β Tyr279/216：       比值             3.1605     0.0754      0.2120     0.0629

GSK3β

Akt                      总蛋白        4.0000        0.0455       0.0316    0.0212

Aktser473                磷酸化蛋白    5.1883        0.0227       0.0009    0.001

Akt ser473：Akt          比值          2.4198        0.1198       0.3845    0.1774

Akt Thr308               磷酸化蛋白    2.0864        0.1486       0.1459    0.0773

Akt Thr308：Akt          比值          0.0494        0.8241       ND        ND

eIF4G                    总蛋白        0.3059        0.5802       0.0155    0.0711

eIF4G ser1108            磷酸化蛋白    5.4444        0.0196       0.0072    0.0017

eIF4G ser1108：eIF4G     比值          0.5400        0.4624       0.9942    0.9403

S6 ser240/244            磷酸化蛋白    1.1166        0.2907       0.0171    0.0144

Bak                      总蛋白        4.5938        0.0321       0.2763    0.0771

Bax                      总蛋白        2.3438        0.1258       ND        ND

SGK                      总蛋白        1.3538        0.2446       ND        ND

BCL-2                    总蛋白        3.3611        0.0668       ND        ND

BAD                      总蛋白        3.2613        0.0709       0.0103    0.0525

BAD ser112               磷酸化蛋白    0.8438        0.3583       0.6013    0.3275

BAD ser112：BAD          比值          0.0338        0.8541       0.4356    0.1696

BAD ser136               磷酸化蛋白    0.0037        0.9512       0.7995    0.7251

BAD ser136：BAD          比值          0.0338        0.8541       ND        ND

BAD ser155               磷酸化蛋白    3.375         0.0662       0.5808    0.1999

BAD ser155：BAD          比值          0.0600        0.8065       ND        ND

B-Raf                    总蛋白        0.135         0.7133       0.6458    0.2437

FKHR ser256              磷酸化蛋白    1.7778        0.1824       0.1839    0.0113

IRS-1                    总蛋白        4.8640        0.0274       0.0015    0.0202

IRS-1 ser612             磷酸化蛋白    2.7338        0.0982       0.3225    0.0991

IRS-1 ser612：IRS-1      比值          0.3564        0.5505       0.2950    0.5065

IRS-2                    总蛋白        5.6049        0.0179       0.0544    0.1843

IRS-1 ser612：IRS-2      比值          0.0858        0.7696       0.5402    0.7813

IGFR-β                   总蛋白        4.1572        0.0415       0.0302    0.0917

IRS-1 ser612：IGFR-β     比值          0.2173        0.6411       0.0578    0.1192

性能最佳的预测物均属于mTOR途径。

D.RMS肿瘤组1A的探索性数据分析

分析前通过激光捕捉显微切割(LCM)来富集肿瘤细胞，以确保 用于分析的细胞来自癌细胞群内，而不被非癌细胞污染(Petricoin等 (2005)，如上文；Emmert-Buck等(1996)Science 274，998-1001)。对于研 究组1A(n＝33)首先选出15个特异性信号转导蛋白(图2A)用于反 相蛋白质微阵列分析。15个蛋白质终点的无参照分级聚类分析显示了两 个主要的肿瘤类别：一个聚类具有Akt/mTOR活化/磷酸化，另一个聚 类具有相对低水平的信号(图2A)。从COG获得临床结局数据之后， 根据患者年龄、性别、原发部位、组织学、侵袭和淋巴结累及特征通过 Fisher精确检验来比较这两个聚类(图2B)。尽管没有任何特征达到 p<0.05的统计学显著性，但是患有脑膜旁(parameningeal，PM)头颈 原发部位肿瘤的患者包含62％的聚类1，而聚类2具有27％的PM原发 肿瘤患者(Fisher精确检验p＝0.06)。另外，聚类2含有73％的腺泡状 肿瘤，而聚类1具有62％的胚胎型肿瘤(Fisher精确检验p＝0.06)。通 常，患有眼眶或非脑膜旁部位的胚胎型RMS肿瘤的患者具有最佳的预 后。这两个聚类与通常公认的RMS相关的预后/临床因素无统计学差异。

我们接着将蛋白质分析物值与COG提供的研究组1A的无疾病存 活和总存活临床结局数据进行关联分析。在从COG获得临床结局数据 之后，出现了明确的肿瘤划分。对三种蛋白质4EBP1、磷酸化4EBP1 Thr37/46和eIF4E(均为Akt/mTOR途径的组分)的决策树分析将用 标准疗法治疗后持续完全好转的患者从复发和死亡的患者中划分出来。 在这些终点中，通过威尔科克森单因素分析发现4EBP1和4EBP1 Thr37/46各自与存活显著相关，4EBP1(p<0.0064)和4EBP1(p<0.0135) (图3A)。对数秩单变量存活分析(Kaplan-Meier)支持了研究组1A 中4EBP1与总存活及无复发存活结局的关联(图3B)(OASp＝0.018， RFSp＝0.0370)。

对于研究组1A中的无复发存活，4EBP1水平(P2＝0.0074； HR＝7.44；CI：1.71-32.36)显示出作为重要的预后因素。因此，对于研 究组1A(图1-3)，Akt/mTOR途径中的个体成员看来与存活相关。

E.横纹肌肉瘤患者的无疾病存活和总存活与Akt和mTOR途径的磷酸 化组分相关。

基于研究组1A中的发现，从COG获得一组独立的样品(n＝26) (1B组，图1A)，用于分析与Akt/mTOR途径相关的扩展蛋白质集合。 两个不同类样品组(1A组和1B组)的单变量对数秩分析显示，样品组 (OAS p＝0.2111，RFS p＝0.5824)或组织学(OAS p＝0.4103，RFS p＝0.4312) 在总存活或无复发存活上均未显示显著差异(图1B和C)。我们像1A 组中那样通过LCM和反相蛋白质微阵列分析了1B组。我们将终点数 扩展到27个，以将Akt和mTOR上游和下游的其他信号转导蛋白包括 在内用于独立评价途径活化。

在数据解盲之后，研究组1B的结果(图4)证明，无疾病存活和 总存活与Akt-mTOR途径的磷酸化组分显著相关。高水平的Akt Ser473、4EBP1 Thr37/46、eIF4G Ser1108和p70S6 Thr389都与总存活差 及无疾病存活差显著相关(Akt Ser473(OAS p<0.001，RFS p<0.0009)， 4EBP1 Thr37/46(OAS p<0.0110，RFS p<0.0106)，eIF4G Ser1108(OAS p<0.0017，RFS p<0.0072)，p70S6 Thr389(OAS p<0.0085，RFS p<0.0296) (图4A-D)。还对27种组分中的每一个单独评价了存活与非存活状态的 统计学相关性。6个终点(仍均为Akt/mTOR网络的成员)(4EBP1 Thr37、 Akt Ser473、eIF4G Ser1108、p70S6 Thr389、Bak和GSK3α/β Tyr279/216) 独立地与存活相关(威尔科克森单因素分析4EBP1 Thr37/46(p<0.0348)， GSK3α/β Tyr279/216(p<0.0348)，eIF4G Ser1108(p<0.0196)，Akt Ser473 (p<0.0227)，Bak(p<0.0321)，p70S6 Thr389(p<0.0373))(图4E)。

F.IRS-1/Akt/mTOR反馈回路在非存活者组中失调

酪氨酸磷酸化的胰岛素受体底物-1(Insulin Receptor Substrate-1， IRS-1)通过PI3K活化Akt/mTOR信号转导，而mTOR和p70S6对IRS-1 612位丝氨酸的丝氨酸磷酸化下调IRS-1酪氨酸活化。因此，IRS-1应 答于Akt/mTOR活化而受到负反馈调控(图5A)。我们通过反相蛋白 质微阵列对研究组1B(n＝26)中的肿瘤检测了IRS-1/Akt/mTOR反馈 回路的磷酸化成员的水平。尽管IRS-1 Ser612的水平在存活者和非存活 者之间没有差异，但是在存活者组中IRS-1 Ser612的磷酸化与mTOR 在Ser2448处的磷酸化强相关(Spearman’s Rho非参数p<0.0027)，提 示了这两个信号转导事件之间的联系(图5B)。相反，在非存活者组中 相同的这两个信号转导蛋白的磷酸化不相关(Spearman’s Rho非参数 p＝0.7358)(图5B-C)。这种与IRS-1 Ser612磷酸化相关性的缺乏也存 在于mTOR下游组分eIF4E Ser209(存活者p＝0.0006，非存活者 p＝0.1017)和p70S6 Thr389(存活者p＝0.00004，非存活者p＝0.1827) 中(图5B和D)。因此，在存活差的患者肿瘤中，mTOR途径的蛋白 质对IRS-1活性的负反馈调控可能是断开的(disconnected)。相反，在 长期存活患者的肿瘤中IRS-1信号转导似乎表现出完好的负反馈调控 (图5A-D)。

G.蛋白质磷酸化与非磷酸化状态的研究

磷酸化是一种重要的翻译后修饰，其作为途径活化状态的读出物 和激酶抑制剂靶标而具有潜在的重要性。为了进一步研究 IRS-1/Akt/mTOR途径中潜在的重要细胞信号转导蛋白质，我们将我们 的分析扩展至包括以下其他终点：BAD、eIF4G、IRS-1、IRS-2、IGFR-β 和S6 ser240/244。我们对关键蛋白质终点的磷酸化蛋白质、总蛋白质形 式以及磷酸化形式与总形式的比值进行了威尔科克森单因素分析和 Kaplan-Meier存活分析(图5B)。结果清楚地证明，相比于分析物蛋白的 非磷酸化总形式，Akt-mTOR和相关途径中蛋白质终点的特定磷酸化形式 与存活相关(p<0.05)(4EBP1 Thr37/46p<0.03，p70S6 Thr389 p<0.0373， GSK3αβ Y279/216 p<0.348，Akt ser473 p<0.0227，eIF4G ser1108 p<0.0196)。这是一个重要的区别，因为信号途径节点的总蛋白质群很可能 与磷酸化形式相比是过量的。磷酸化形式构成了总蛋白质中活跃参与信号 转导的一个亚群。

H.在小鼠异种移植模型中mTOR途径的抑制降低肿瘤生长

为了验证我们的IRS-1/Akt/mTOR网络分析在功能上的重要性， 我们使用了雷帕霉素类似物(已充分表征的mTOR蛋白激酶途径抑制 剂)，其中采用小鼠异种移植物处理模型。将RD胚胎型细胞或Rh30 腺泡状细胞原位注射进褐色SCID小鼠的后肢。将这两种不同的细胞系 用于确定mTOR抑制在不同组织学肿瘤分类中的作用。雷帕霉素类似 物CCI-779(Wyeth，Madison，NJ)剂量是20mg/kg，这对应于目前 在I期和II期临床试验中施用于人的剂量(Raymond等(2004)，J Clin Oncol 22，2336-2347；Smolewski等(2006)Anticancer Drugs 17，487-494)。 施用经证实抑制mTOR下游靶标磷酸化的CCI-779剂量极大程度地降 低了横纹肌肉瘤异种移植物的生长，如在SCID-褐色小鼠模型中所测量 的(Rh30异种移植组p＝0.0002；RD异种移植组p＝0.00008，两组均为 n＝8)(图6A-C)。通过测量4EBP1和S6核糖体蛋白(已确定的mTOR 下游靶标)的磷酸化来监测mTOR途径的抑制。在来源于Rh30腺泡状 和RD胚胎型异种移植物的肿瘤中，CCI-779均抑制这些下游靶标的磷 酸化，相应地阻断mTOR信号转导。

I.讨论

在本实施例中，使用两个十二年随访数据可用的独立RMS肿瘤 研究组，对治疗或存活采取盲法进行蛋白质信号转导途径的分析。接着 根据最近完成的IRS IV研究、COG D9502或进行中的COG D9803研 究治疗患者。从冷冻样品库中随机获得两个独立的研究组(图1A，表 1A和1B)。每个研究组代表多种治疗方式、组织亚型和肿瘤部位。这 两个组中腺泡状与胚胎型组织学形态样品的比例不同(图1)(3，4)。 尽管所述样品组是异质的，但两个样品组之间在总存活或无复发存活上 无统计学显著差异(总存活p＝0.2111，无复发存活p＝0.5824)(图1B)。

目前用于诊断为横纹肌肉瘤患者的预后指标是：年龄、分期、分 组、组织学和原发部位，患有来自眼眶或非脑膜旁头颈部位的胚胎型 RMS的1-8岁患者具有最佳的预后(15)。使用无参照聚类分析，我们 试图确定是否有蛋白质信号转导特征与组织学亚型相关。对于第一研究 组，首先选择十五种特异性信号转导蛋白(图2A和3A)，因为它们构 成了多种促存活相关事件的广泛研究。对所选磷酸化状态进行的多重测 量提供了选定的驱动细胞生长或存活的网络中正在进行的激酶活性事 件的平均模式。

最初的无参照聚类分析不与组织学显著相关，但是所述样品清楚 地划分为两个聚类，其中一个聚类显示Akt/mTOR蛋白质的活化(图 2A)。因此，从COG获得临床结局数据，以进一步研究所述蛋白质终 点与临床数据之间的相关性。1A组的结果显示了存活与Akt/mTOR(雷 帕霉素的哺乳动物靶标)信号转导途径相关蛋白质的活化/抑制之间统 计学显著的相关性(图3A)。

基于1A组的结果，我们将此探索性分析扩展到第二独立样品组 的27个终点(图1A，表1B)。将第二研究组中看来与存活或死亡相关 的蛋白质与Akt/mTOR激酶途径连接在一起(13、27、28)。发现IRS-1 (胰岛素受体底物)、Akt、mTOR、4EBP1(延伸结合因子))、GSK3α/β (糖原合酶激酶-3)和p70S6的磷酸化组分与结局相关(图4)。IRS-1、 Akt和GSK3β与细胞生长、存活、胰岛素应答和葡萄糖代谢相关。mTOR、 4EBP1和p70S6是蛋白质翻译的必要组分，其中4EBP1的磷酸化将4EBP1 从eIF4E上释放，激活帽依赖性翻译。已知这些途径参与促存活调控和一 组对细胞周期和凋亡具有重要性的蛋白质的翻译，所述重要蛋白质包括数 个已知的癌基因，例如细胞周期蛋白D、c-myc和Hif-1α。

Akt/PKB(蛋白激酶B)在多种细胞功能中起中心作用，所述细 胞功能包括糖原合成、细胞周期调控以及细胞维持存活和凋亡。尽管对 于研究组1B，Akt Ser473与存活(p<0.02)相关，但是在1A组中它不 与存活相关(p＝0.2460)。这可能是由于两个组中肿瘤组织学相对组成 和原发部位的差异造成的(图1A)。

多种自分泌和旁分泌刺激(包括激素、生长因子、丝裂原、细胞 因子和G蛋白偶联受体激动剂)引发4EBP1的超磷酸化以及伴随的 mTOR途径中eIF4E结合活性的丧失。磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)或 者下游效应物激酶Akt的活化导致4EBP1的超磷酸化，影响它从eIF4E 上的释放。4EBP1在多个位点上的磷酸化与胰岛素受体途径和PI3K途 径的连接相关。4EBP1上已鉴定出六个磷酸化位点。在胰岛素刺激后， Thr37、Thr46、Ser65和Thr70变为磷酸化，这样的磷酸化可被雷帕霉 素(mTOR抑制剂)和渥曼青霉素(PI3K抑制剂)阻断。已经显示， mTOR自身以及mTOR相关激酶直接磷酸化4EBP1上的位点。Gingras 等确定了磷酸基首先加到Thr37和Thr46上。这种引发磷酸化是结合 所需其它位点的磷酸化所必需的。因此，由多种激酶触发的由Thr37/46 引发的多重磷酸化事件参与了4E-BP1从eIF4E上的释放。

酪氨酸磷酸化的胰岛素受体底物-1(IRS-1)通过PI3K活化 Akt/mTOR信号转导，mTOR和p70S6对IRS-1(612位丝氨酸)的丝 氨酸磷酸化下调IRS-1酪氨酸活化。因此，已经提出，IRS-1应答于通 过p70S6进行的Akt/mTOR活化而受到负反馈调控(图5A)。我们通 过非参数相关性研究了IRS-1反馈回路与Akt和mTOR途径的相互关 系(图5B-D)。对IRS-1丝氨酸612和多个可能的相互作用蛋白的研究 提供了评估与参与IRS-1负反馈调控的实际磷酸化位点的蛋白质相互作 用的方法。好结局和差结局患者的肿瘤IRS-1 ser612的平均水平无统计 学差异(图4E)，提示IRS-1的上游活性水平类似。尽管好结局和差结 局病例中IRS-1磷酸化平均水平相似，但是在这两种表型中每个肿瘤的 个体IRS-1磷酸化水平与Akt和mTOR途径蛋白质磷酸化水平之间的 相关性极为不同。另一方面，在两组中Bax、FKHR ser256和4EBP1 Thr70都显著相关(图5B)。如图5所示，在好结局的肿瘤中IRS-1ser612 与mTOR ser2448(p＝0.00269)以及与p70S6 Thr289(p＝0.00004)强 正相关(图5B-D)。这提示了与mTOR与IRS-1之间反馈回路一致的 关联性，并且它可能在体内状态下存在于具有好结局的肿瘤中。这些数 据支持了在差结局的肿瘤中所述反馈回路的选择性断开。

存活者与非存活者中IRS-Akt-mTOR互联性的这些差异的意义 是双重的。首先，IRS-1和mTOR之间表面上缺乏互联可破坏正常的负 反馈调控。这可导致如我们在差结局的患者肿瘤中所注意到的Akt磷酸 化提高，如图5A所示。其次，用于攻击性肿瘤(其中所述负反馈回路 不起作用)的mTOR抑制剂疗法将无法引起Akt磷酸化提高。在攻击 性肿瘤中(其中mTOR通过IRS-1的负反馈调控被破坏)磷酸化Akt 和mTOR的基线水平可升高，导致肿瘤的持续生长和存活。

已鉴定的4E-BP1磷酸化位点已知被雷帕霉素处理特异性抑制。 为了验证我们揭示好治疗结局患者中所观察到的mTOR途径抑制的网 络分析的功能重要性，我们利用了已有的雷帕霉素类似物，它们是已良 好表征的mTOR蛋白激酶途径抑制剂。这些类似物中的一些目前处于 成人癌症患者的I期和II期临床试验(Raymond等(2004)，如上文； Smolewski等(2006)如上文)。通过测量4EBP1和S6激酶的磷酸化状态 来监测mTOR途径的抑制，所述激酶是已良好确立的mTOR下游底物 (13、27、28、30、31)。在来源于Rh30腺泡状或RD胚胎型细胞的异 种移植物肿瘤中，CCI-779抑制下游靶标的预计磷酸化，相应地阻断 mTOR信号转导(图6)。

总之，对治疗前获得的显微切割人RMS临床样品进行的蛋白质 途径分析显示，在此初步探索性分析中Akt/mTOR途径的活化与差结 局强相关。发现这一观察在两个独立分析的临床研究组之间一致。另外， 使用特异性靶向抑制剂CCI-779在SCID-褐色RMS异种移植物模型中 抑制肿瘤生长，验证了IRS-1/Akt/mTOR途径活化在RMS中的功能重 要性。这些数据支持了这一推论，即在这一肿瘤类型中使用雷帕霉素类 似物作为将差预后患者调控为较长存活结局患者的潜在方法。组合治疗 策略可以着眼于同时阻断上游信号转导因子活化和下游mTOR信号转 导，作为增强标准细胞毒性RMS治疗的方法。

实施例II.使用反相蛋白质微阵列进行的肺癌磷蛋白组分析；mTOR途 径在决定非小细胞肺癌(最常见的肺癌类型)结局中的重要性

A.材料与方法

1.样品。二十个早期肺腺癌手术样品。肺手术切除物收集自患者， 并且在手术时冷冻。(根据国家死亡指数(National Death Index)确认 患者存活)

2.冷冻切片。在硅烷化载玻片上制备8μm冷冻组织切片。

3.激光捕捉显微切割(LCM)。使用Molecular Devices’Pixcell 或Veritas设备获得纯肿瘤细胞群。

4.反相蛋白质微阵列被印在Whatman Schleicher和Schuell FAST载玻片上，其中使用Affymetrix GMS 417针和环型阵列仪(一式 二份印制样品，每个点印10下)

5.免疫染色。在Dako自动染色仪上，使用Dako催化信号扩增 化学(辣根过氧化物酶介导的生物素化酪胺沉积)通过发色检测(DAB) 来检测微阵列上的特定蛋白。

B.划分分析

用Image Quant ver5.2实施微阵列点强度分析。

将JMP软件用于双因素分级聚类(Ward法)和划分分析。结果示于下 文表4和图7。

表4.用于将反相蛋白质微阵列免疫染色的抗体探针

  抗体 供应商 稀释度 AKT(ser 473) Cell Signaling 1:100 AKT(thr 308) Cell Signaling 1:100 ERK1/2(thr 202/tyr204) Cell Signaling 1:2000 BCL2(ser 70) Cell Signaling 1:200 RS(ser 612) Cell Signaling 1:50 EGFR(tyr 1045) Cell Signaling 1:100 EGFR(tyr 845) Cell Signaling 1∶100 EGFR(tyr 992) Cell Signaling 1:100 EGFR(tyr 1148) BioSource 1:200 EGFR(tyr 1068) Cell Signaling 1:100 EGFR(tyr 1173) BioSource 1:100 Her2(tyr 1248) Cell Signaling 1:100 14-3-3ζ，γ，η Upstate 1:20,000 Cox2 Upstate 1:500 4EBP1(thr 37) Cell Signaling 1:200 APC2 Lab Vision 1:100 BUB3 BD Transduction 1:250 细胞周期蛋白D1 BD Transduction 1:200 细胞周期蛋白E BD Transduction 1:100 SMAD2(ser 465) Cell Signaling 1:250

C.根据Kaplan-Mier存活曲线的RPMA分析

在这个组中，基于主成分分析，通过反相阵列分析对10名长期存 活患者和10名短期存活患者进行分析。表示为Kaplan-Mier存活曲线 (图8和9)的结果再次显示，AKT/mTOR途径的组分被发现是结局 的主要驱动者。同样地，p4EBP1和pAKT升高的患者具有显著更短的 总存活时间。

实施例III.使用反相蛋白质微阵列进行的乳腺癌磷蛋白组分析

在此实施例中，通过使用反相蛋白质微阵列的分子网络分析来分 析取自ER+淋巴结阴性和淋巴结阳性乳腺癌患者的肿瘤研究组，所示患 者至少随访10年，并且均使用他莫西芬单一疗法进行治疗。在所分析 的55个磷酸化终点中，结局区分的大部分主成分属于mTOR途径。重 要的是，不论淋巴结状态怎样，mTOR途径组分(主要是pEBP1，还 有p70S6)均可区分结局。

图10显示根据p4EB-P1分组的乘积相关存活拟合；存活仅来自 LN-亚组。图11显示LN+群的划分分析，其显示p70S6为区分的主成 分。图12显示了来自所有病例(LN-和LN+)的存活曲线。

结论：数据明确支持以下结论，即患有ER+乳腺癌(无论淋巴结 状态如何)并使用他莫西芬单一疗法的女性的复发时间与mTOR途径 特定组分的磷酸化状态强相关。这一信息可以是以下决定的基础：a) 决定谁应该接受他莫西芬疗法和/或b)给预测为差存活的患者亚组施用 第二疗法。合适的这些第二治疗剂在本文别处有讨论。

从上述描述中，本领域技术人员能够容易地确定本发明的必要特征， 并可在不脱离其构思和范围的情况下对本发明作出改变和修改，以使之适 应多种应用和条件，以及以最完整的范围应用本发明。上述优选的具体实 施方案应理解为仅用于说明，而不以任何方式限制本发明的范围。上文和 附图中引用的所有申请、专利以及出版物(包括2005年10月18日提交的 美国临时申请号60/727,510)的全部公开内容均通过参考整体并入本文。

本申请要求2005年10月18日提交的美国临时申请No.60/727,510 的权益，其公开内容通过参考整体并入本文。