根据国家健康研究院提供的资助No.GM26453，27681和47530，美 国政府在本发明中享有一定的权利。

相关申请

本申请是1997年4月21日递交的申请号08/837,524的继续部分申 请，后者是1996年2月26日递交的，1997年2月20日提交为PCT申 请US97/03332，的申请号08/607,078，和1996年7月31日递交的临时 申请60/023,309，1996年8月1日递交的60/024,374，1996年9月25 日递交的60/026,713，和1997年2月14日递交的60/038,384的部分继 续申请。

背景

随着核酸的合成，分析和操作技术的发展，已经产生了许多诊断和 治疗的新技术。在研究工作中，对能够鉴定与特定的生物体，等位基因， 突变体相关的DNA序列一直是人们关注的问题，以便理解特定的遗传 过程，疾病鉴定，法医鉴定等。同样，对于许多应用来说，为了鉴定特 定基因的功能，基因产物的细胞浓度的各种变化对细胞的功能或其它细 胞特征的影响，人们希望能够调节特定基因的活性。在治疗中，人们希 望能够抑制一些细胞的增殖，如细菌，真菌和衣原体细胞，这些细胞具 有致病原的作用。人们也希望抑制病毒的增殖，哺乳动物的增殖，它们 的增殖可导致对寄主或其它情况的不利影响。在体内，人们可以提供可 逆的或不可逆的失效，从而可从胎儿的发育过程中，收集一个或多个基 因产物的水平的降低对生物体的影响这类信息。

在一些胚胎学文献中，Peter Dervan的研究小组已经证实氮杂环的低 聚物可以用于结合双链DNA。已经证实，在G/C与N-甲基咪唑(Im)/N- 甲基吡咯(Py)互补，C/G与Py/Im互补，A/T与T/A与Py/Py冗余性互 补中存在特异性。事实上，N-甲基咪唑趋向于结合鸟苷，而N-甲基吡咯 结合胞苷，腺苷和胸苷。提供两条链的杂环，作为1个或2个分子，与 双链DNA形成2∶1复合物，而低聚物的两条链反平行，其中G/C具有 并列的Im/Py，C/G对具有Py/Im，T/A对具有并列的Py/Py。杂环低聚 物由酰胺氨甲酰基团连接，其中NH可以参与小沟中的腺苷和胸苷(图1) 特别是腺苷中的氮和氧未配对电子的氢键。虽然这种复合物非常令人感 兴趣，大部分的结合亲和力小于约106M-1。另外，靶DNA序列和参与 错配的序列之间的区别常常不高于二倍。所以，对于许多目的，这些复 合物的用途是有限的。

环二聚体显示出亲和力得到改善，其中两个寡聚体在它们的末端通 过γ-氨基丁酸相接，这时亲和力被增强至约109M-1。但是，在靶序列之 间亲和力的不同对于三个不同的单碱基错配序列小于3倍。在存在大量 天然的双链DNA时，这一低的序列选择性将严重地限制该化合物的应 用。

同样，对于许多应用，人们希望能够将该序列应用于活细胞。没有 实验证明这些低聚物能够跨过细胞膜运输到核，并且在成功地运输到核 中时，它们能够结合染色体DNA，其中染色体DNA以核小体存在。

相关文献

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本发明提供了用于在双链DNA和有机环基团的低聚物之间在小于等 于1纳摩尔的浓度下选择性生成复合物的方法和组合物，其中至少60％ 的环基团是杂环，至少60％的杂环至少具有一个氮环成员。杂环形成互 补对，其中至少两个核苷酸对优先地与特定的杂环对配对。作为单个低 聚物的发夹回转，或两个低聚物分子的有机环基团之间的互补的结果， 在复合物中至少存在三个有机环基团的互补对。通常，一种小脂肪族氨 基酸将分散于或分开6个或更多个连续的有机环基团的链。为了进一步 增强结合，一个末端可以具有至少一个2到6个碳原子的脂肪族氨基酸 和/或一个具有靠近烷基链的键的极性基团的烷基链。通过适当选择靶序 列、互补对、未配对的有机环基团、脂肪族氨基酸、和极性取代的烷基 链，可形成高亲和性、低解离常数、和在靶序列和单碱基错配之间的亲 和性显著不同的复合物。将低聚物进行修饰，以提供特异的特性并且允 许存在于没有明显干扰低聚物在小沟中的定位的位点。发现该组合物能 够进入活细胞并且抑制包括靶序列的基因的转录，在特定的位点裂解， 在特异的位点变成共价结合，指导选择的分子到靶位点以及进行其它需 要的活动。

在复合物形成条件下该低聚物可以与双链DNA结合形成复合物。该 复合物的形成可以用于诊断，以便检测特定的双链DNA序列，其中可 使用可检测标记对该低聚物进行标记，以便在体外或体内的细胞组织学 检测中可逆地或不可逆地“失效”基因，从而抑制原核细胞或真核细胞 等的细胞的增殖。

附图的简要说明

图1(a)识别DNA小沟的模型。DNA双螺旋由A，T和G，C碱基对 组成，好像在旋转的梯上的横档。通过在碱基对边缘上展示的氢键供体 和受体的类型可以区别个别序列。A，T碱基对在小沟中提供两个对称 放置的氢键受体，由环内的点表示的嘌呤N3和嘧啶O2。G，C碱基对 提供这两个受体，但另外还提供一个氢键供体，由含有H的环表示的鸟 苷的2-氨基基团。因为氢键载体靠近含鸟苷的链，GC和CG碱基对可 以在小沟中区别。(b)  在DNA小沟中侧对侧复合物Py/Im聚酰胺的吡 咯-咪唑识别DNA的配对规律，DNA结合序列特异性依赖于侧对侧的 氨基酸对的序列。Im对Py的配对靶击GC碱基对，而Py对Im配对靶 击CG碱基对。Py/Py组合简并靶击AT和TA碱基对。G，C碱基对的 特异性产生于咪唑N3和鸟苷的环外氨基基团之间的推断的氢键的形 成。推断的氢键由虚线表示。

图2描述了(a)在与ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Dp1(匹配)和 ImPyPyPy-γ-PyPyPyPy-β-Dp2(错配)形成的复合物中的5’-AGTACT-3’， 和(b)在与ImPyPyPy-γ-PyPyPyPy-β-Dp2(匹配)和ImPyPyPy-γ- ImPyPyPy-β-Dp1(错配)形成的复合物中的5’-AGTATT-3’的结合模型。含 有点的环代表嘌呤的N3和嘧啶的O2上的单配对，含有H的环代表鸟 苷的N2氢。推断的氢键由虚线表示。黑和白的园分别代表咪唑和吡咯 环，曲线代表γ氨基丁酸，菱形代表β丙氨酸。标明了单个氢键错配。

图3(a)(左)5S RNA基因内部控制区(ICR)和九个锌指蛋白质TFIIIA 的模型。(中间)在小沟中的锌指4识别的ICR序列。(右)靶位点，5’- AGTACT-3’和发夹聚酰胺ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Dp1的复合物。含有 点的园代表嘌呤的N3和嘧啶O2上的单配对。含有H的园代表鸟苷的 N2氢。(b)聚酰胺ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Dp(1)，ImPyPyPyPy-γ- PyPyPyPy-β-Dp(2)，和ImPyImPy-γ-PyPyPyPy-β-Dp(3)的结构。(Dp＝二 甲基氨基丙酰胺)。(c)  结合模型，实心的和空心的园分别代表咪唑和吡 咯环，曲线代表γ氨基丁酸(γ)，菱形代表β-丙氨酸(β)。标明了氢键错配。

特定实施方案描述

本发明提供了新低聚物，用于与双链DNA形成高亲和力的复合物。 该低聚物含有由短接头连接的有机环基团，这些低聚物与双链DNA的 小沟配合，并且在双链DNA靶序列中与特定的核苷酸碱基对形成互补 对。与该有机环化合物相连的是脂肪族氨基酸，特别是具有末端氨基的 脂肪族氨基酸。另外，末端最好具有一个极性基团，它可方便地在烷基 取代基上进行取代。具有至少三个有机杂环的互补对的连续系列通过互 补优先与核苷酸的互补对并列。通过适当选择互补对、与碱基对的特定 核苷酸并列的非配对有机环化合物、脂肪族氨基酸、和极性基团取代基， 可以获得与单个碱基错配相比的高亲和力和高特异性。本发明的组合物 已显示能够跨膜运输到核，结合染色体DNA，完成各种细胞内功能， 包括抑制转录。通过提供可检测标记，本发明的组合物可被修饰以便用 于诊断，或可以用于研究或治疗，以抑制靶基因的转录。另外，可以以 其它方式修饰该组合物以便增强特定应用中的性能，如跨细胞壁运输， 结合特异细胞类型，在特定位点裂解核酸，改变化学和物理特征等。

本发明的低聚物将具有至少6个有机杂环基团，通常至少7个，并 且可以有8个或更多，通常不超过30个，优选不超过20个，更优选不 超过18个有机环基团，其中至少60％，优选地至少80％，和更优选地 至少100％是杂环。杂环通常具有一个到3个，更通常一个到两个杂原 子，其中杂原子是氮，氧和硫，特别是氮。根据氮原子是指向沟的底或 表面或指向远离沟的方向，可以对氮原子进行取代。当氮原子的指向远 离沟的底部时取代基的性质可允许具有较大的自由度。该低聚物的取向 相对于它所并列的链的5’至3’方向优选为N至C方向。

不论为了何种目的，杂环可在取向远离沟的底部的杂环的位置上进 行取代。所以，利用需要的取代基可以取代氢原子，其中该取代基不会 导致空间干扰小沟的壁，或产生排斥。当取代时，可使用多种取代基， 可以是杂原子，1到30，通常1到20个碳原子，特别是1到10个，更 优选地1到6个碳原子的烃基，包括脂肪族，脂环的，芳香的，和它们 的组合，包括脂肪族饱和和不饱和的，具有不超过10％的碳原子参与脂 肪不饱和键，杂原子取代的烃基(如前面的定义)，具有1到10，通常1 到8个，优选1到6个杂原子，包括脂肪族，脂环的，芳香的，杂环的 和它们的组合，其中杂原子的例子有卤素，氮，氧，硫，磷，金属原子， 硼，砷，硒，稀土，等等，其中功能基团的例子有氨基，包括单和二取 代氨基，氧，包括羟基和氧醚，硫，包括巯基和硫酯，氧基，包括氧羰 基(醛和酮)和非氧基羰基(羧基，包括酰卤，酐，酯和酰胺)，磷，包括膦， 磷脂，磷酸酯，亚磷酰胺，等等，硼，包括硼酸酯，硼酸(borinic acid) 和硼酸(borinate)，硝基，氰基，偶氮基，氧化偶氮基，肼基，等等。

功能基团可以结合环成员或结合环成员的取代基，例如，羧烷基， 甲氧基乙基，甲氧基甲基，氨乙基，二烷基氨丙基，聚氧乙烯，聚氨基 乙烯，等等。在许多情况中，对于环氮取代基，通常利用1到3个碳原 子的烷基特别是甲基取代它们，并且至少一个相邻环碳原子未取代。通 常，单个取代基为600道尔顿以下，通常约300道尔顿以下，优选地是 约150道尔顿以下，结合环成员的总取代基将是约5千道尔顿以下，通 常约2千道尔顿以下，优选是1千道尔顿以下，通常约为0到5，优选 约为0到3个不同于1到3个碳原子的与环氮结合的烷基的取代基。通 常，取代基的总碳原子将不大于约100个，通常不大于约60个，优选 不大于约30个，没有超过30个的杂原子，通常没有超过20个的杂原 子，通常没有超过10个的杂原子。

通常杂环在2位置和4或5位置，特别是5环成员环的2和4位置 连接。

杂环是5到6员环，特别是5个环成员，具有1到3个通常1到2 个杂原子，其中两个杂原子通常是由至少一个插入的碳原子隔开。有机 环基团是完全不饱和的。并且将被称为芳香的，因为该术语将被理解为 5到6个环成员的有机环化合物。

环成员的例子包括吡咯，咪唑，三唑，呋喃，噻吩，恶唑，噻唑， 吡唑，环戊二烯，吡啶，嘧啶，三嗪，等等，其中，如上所述，环中的 NH基团当被取代时，优选是利用一个1到3个碳原子的烷基基团，特 别是甲基进行烷基化。优选的有机环化合物是具有1个到2个氮原子的 5元环，其中氮原子中的一个是甲基化的。

在有机环基团之间的连接基团通常具有两个原子的长度，其中至少 一些连接基团具有NH，其中NH可以与核苷酸的非共用电子对氢键合。 连接链可以是亚甲氨基，氨甲酰基(-CONH-)，乙烯，硫代氨甲酰基， imidinyl等等，特别是氨甲酰基和它的杂类似物例如，硫基和亚氨基。

除了有机环化合物，还使用了脂肪族氨基酸，特别是ω-氨基脂肪族 氨基酸，提供发夹回转以便提供两个杂环的序列之间的互补，形成环化 合物，其中低聚物在两个末端连接，或提供该有机环化合物相对于靶双 链DNA的空间的相对位移。通常，脂肪族氨基酸将具有一个作为核心 的2个到6个碳原子，通常2个到4个碳原子，优选具有末端氨基基团， 特别是甘氨酸，β-丙氨酸和γ氨基丁酸的链，在碳和氮特别是碳上未取代 或取代，通常，该脂肪族氨基酸是未取代。取代基已经在前面叙述。当 脂肪氨基酸是C末端时，羧基基团通常被功能化为酯或酰胺，其中可以 选用醇或氨基酸来提供特异的特性或用于减少羧基基团的电荷。对于后 者，醇和氨基基团通常是0到6个碳原子，通常0到3个碳原子。

如上所述，这些氨基酸将起特定的作用。较长的脂肪族氨基酸链将 起到提供分子内的回转的作用，并且关闭分子形成环。利用较短的脂肪 族氨基酸链提供相对于靶双链DNA位移，并且通过存在于末端有机环 基团的近端而提供增强的结合。脂肪族氨基酸可以存在于低聚物的一个 或两个末端。对于位移来说，优选甘氨酸和丙氨酸，β-丙氨酸是优选的。 通常，避免6个杂环的连续序列。通常，一个氨基酸特别是β-丙氨酸被 导入6个低聚物单元的连续系列，通常由至少一个优选地至少两个有机 环基团特别是杂环界接。下面的表表明没有在链中导入氨基酸的低聚物 杂环的伸展的效应。

                                 表1*   聚酰胺 亚单位   结合位点   大小bp     匹配     错配   特异性     ~ Im-(Py)2-Dp     3     5  1.3×105(0.3) ＜2×104’     ＞6.5     & Im-(Py)3-Dp     4     6  8.5×106(1.3) 1.6×106(0.2)     5.3     (0.5) Im-(Py)4-Dp     5     7  4.5×107(1.1) 7.9×106(1.8)     5.7     (0.8) Im-(Py)5-DP     6     8  5.3×107(0.5) ＜2×107’     ＞2.7     & Im-(Py)6-Dp     7     9  4.7×107(0.4) 1.7×107(0.7)     2.8     (0.7) Im-(Py)7-Dp     8     10 ＜2×107 ＜2×106’     ~1

*报告的值是来自至少三个步迹滴定实验的平均值。在圆括号中的数字表示每个 数据系列的标准偏差。该测试在22℃，pH7.0，在存在10毫摩尔/升TrisHCl，10毫摩 尔/升KCl，10毫摩尔/升MgCl2和5毫摩尔/升CaCl2时进行的。

~被定义为匹配位点亲和力与单个碱基对错配位点的亲和力的比。在圆括号中的 数字表示利用测量的结合亲和力的标准偏差计算的不确定性。

&代表特异性的下限。

代表结合亲和力的上限。

脂肪族氨基酸的脂肪链可以作为取代的位点，提供核心结构的脂肪 族氨基酸，通常没有超过2，优选没有超过1个取代基。这里也可以利 用已经在杂环中叙述的同样类型的取代基。通常，可以用取代的脂肪族 氨基酸进行低聚物的合成，而不是在形成低聚物后修饰氨基酸。或者， 在取代基的链上可存在一种功能团，如果需要，在合成过程中可适当保 护，然后，该功能基团可以用于随后的修饰。最好选择性地利用这样的 功能基团，将其用于合成不同的低聚物，以在该位点提供一种取代基，生 成具有与特定的应用相关的独特特性的产物。在不显著干扰在沟中的结 合的位点进行取代，例如利用单个空间异构体，可给予本发明的化合物 一些特性，如水可溶性，亲脂性，非共价结合受体，放射活性，荧光性， 等等。

一个或两个末端，优选地是一个末端，具有在烷基基团上取代的极 性基团，其中该极性基团和与分子的其余部分相连的连键之间具有2到 6个，优选2到4个碳原子。该极性基团可以带电或不带电，其中的带 电可以是在使用状态下质子化的结果。特别优选能够结合氢的基团，如 氨基，特别是叔氨基，羟基，巯基等。特别优选的是氨基，最优选的是 烷基化氨基，其中该烷基基团具有1到6，通常1到3，更优选1的碳 原子，并且在pH小于约8时，氨基基团带正电，并且可以与双链DNA 氢键合。优选在低聚物中不使用两个带正电的极性基团，当与双链DNA 复合时，该两个带正电的极性基团将相互并列。

对于多种用途来说，人们希望具有同位素低聚物，其中可以利用放 射性元素的闪烁计数，对于具有磁拒的元素的nmr等，分析它的存在。 对于放射性低聚物，可以利用放射性标记，如氚，14C，125I等。根据方 便的原则，放射性标记可以是杂环的环成员的取代基或杂环的环成员， 或者是碳或者是杂原子，或低聚物的C或N末端的取代基。通过利用 放射性标记作为低聚物的部分，人们可以在低聚物的空间构型中避免任 何明显的变化。放射性标记可用于诊断，细胞组织学，放射性治疗等多 种应用中。

除了在低聚物上存在的其它位点，根据低聚物的用途，低聚物的每 个末端可以用于特定的目的。例如，在诊断中，人们可能希望具有除放 射性标记以外的可检测标记，其中也可以发现得到的化合物的其它用 途。低聚物可以连接的标记，如荧光素，例如丹酰，荧光素，Texas红， 异硫蓝，醚红，孔雀石绿，等等，化学荧光颗粒，例如磁性颗粒，胶质 颗粒，例如金颗粒，光敏感键形成化合物，例如补骨脂素，邻氨基苯甲 酸，芘，蒽，和吖啶，螯合化合物，如EDTA，NTA，酒石酸，抗坏血 酸，2到8个组氨酸的聚组氨酸，亚烷基聚胺等等，螯合抗生素，如博 莱霉素，其中螯合化合物可以螯合金属原子，如铁，钴，镍，锝等等， 其中金属原子可以在存在过氧化物时起裂解DNA的作用，嵌入染料， 如溴化乙锭，噻唑橙，噻唑蓝，TOTO，4’，6-联脒-2-苯吲哚(DAPI)，等 等，酶，如β-半乳糖苷酶，NADH或NADHP脱氢酶，苹果酸脱氢酶， 溶菌酶，过氧化物酶，荧光素酶等等，烷基化试剂如卤化乙酰胺，N乙 基nitrosourea，氮和硫芥末，磺酸酯等等，和其它化合物，如烷基硼酸， 生育酚，硫辛酸，captothesin等等，胶质颗粒，例如金颗粒，荧光素颗 粒，过氧化物，DNA裂解试剂，低聚核苷酸，低聚肽，nmr试剂，稳定 的游离自由基，金属原子等等。低聚物可以结合其它标记，如存在方便 的受体的半抗原，例如生物素，可以与抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋 白和地高辛复合，地高辛可以与抗地高辛等等复合。其中受体可与上述 各种标记偶联。低聚物可以与磺化或磷化芳香基团，例如奈酚结合，以 便增强对转录，特别是病毒的转录的抑制(Clanton等人，Antiviral Res(1995)27：335-354)。在某些情况下，可以将本发明的低聚物的多个拷 贝与聚合物结合，其中本发明的低聚物悬挂于该聚合物。有用的聚合物， 特别是水可溶聚合物是纤维素，聚(乙烯醇)，聚(乙烯乙酸酯-乙烯醇)， 聚丙烯酸酯等。低聚物的数目可以是1到约1∶5聚合物单体单元。

人们可能希望提高该分子的亲脂性，提供各种亲脂基团，例如胆固 醇，脂肪酸，脂肪醇，鞘磷脂，脑苷脂，其它甘油脂等，其中脂肪基团 通常是约8到30个碳原子。或者，人们可能希望提供结合植物凝集素， 粘连分子，细菌等的多糖，其中多糖的作用是引导本发明的低聚物到特 异的细胞靶。或者，在某些情况下，人们可能希望具有一个或更多的核 苷酸，通常是1到30个，更通常是约3到20个，特定地是3到12个，该 核苷酸正常情况下与靶序列的邻近或边界核酸序列相关，从而附着的核 苷酸序列将在大沟中复合核苷酸。

根据末端存在的可利用的功能团，例如伸出的极性取代的烷基基团， 例如具有超过6个碳原子的链，不同分子可以各种不同的方式与末端结 合，从而在末端提供一种与加入的半分子反应的取代基，其中这样的取 代基常规地是氨基，羟基，巯基，羧基，磷酸等等，从而形成酰胺，有 机的和无机的，取代的胺(还原胺化)，醚，硫醚，二硫化物，酯，有机 的和无机的，焦磷酯，等等。该分子可以作为合成方案中的一部分导入， 从合成低聚物的固体支持物上取代低聚物。因为本发明的化合物可以用 于各种不同的用途，没有一种简单的叙述方式适合于本发明的低聚物结 合的各种半分子，也无法描述得到的产物的特定的分子量。

本发明的低聚物可以在支持物上例如芯片上合成，其中通过自动合 成技术，在各个位置可以合成不同的低聚物。以这样的方式，可以合成 不同低聚物的排列，然后可以用于鉴定样品中多种不同的序列的存在。 通过了解各个位点低聚物的组成，可以通过各种技术如标记的抗DNA 抗体，具有互补限制突出的接头，其中利用限制酶等等已经消化样品 DNA，在那个位点可以鉴定特异序列的结合。用于制备本发明的排列的 技术类似于用于制备低聚肽排列的技术，如Cho等人，科学，1993，261， 1303-1305所述。

该复合物通常含有一个或两个低聚物或一个或两个低聚物的联合， 其中单个的或成对的低聚物特异地与至少6，通常7和优选的8或更多 bp，优选没有超过40bp，更优选没有超过30bp，优选地没有超过20bp 的双链DNA序列相互作用。

因为这一工作的绝大部分是利用N-甲基吡咯和N-甲基咪唑，利用甲 酰胺基团作为连接链，利用脂肪族氨基酸甘氨酸，β-丙氨酸，γ-氨基丁 酸，以及二甲基氨基丙基作为极性取代的烷基基团进行的，现在将这些 化合物作为可以用于本发明的化合物类别的例子进行说明。可以理解的 是一个或几个氮杂环可以用一种不同的有机环基团取代，以及一个或其 它的脂肪族氨基酸可以用一种不同的氨基酸取代。另外，如上所述，为 了特定的用途核心低聚物可以进一步取代。事实上，存在确定至少杂环 的互补对的核心分子，并且包括脂肪族氨基酸和极性基团取代的烷基中 的至少一种。这一核心分子是本发明的中心部分，可以作为不干扰核心 分子的基本功能的许多取代基的结合物，虽然结合亲和力大于功能所需 要的，结合亲和力的一些减弱是允许的。所以，在定义本发明的化合物 中，应该理解的是允许许多变化，其中保留了基本核心或单位结构，同 时利用一个或更多取代基修饰该核心或单位结构以便给予分子需要的特 性来发挥所需的功能。

在本发明的化合物中特别重要的是具有至少一个有机环基团，特别 是N-甲基咪唑的化合物，它与一个核苷酸具有特异性，它以一个互补对 存在。通常，本发明的化合物具有这些互补对中的至少一个，通常具有 至少两个这样的互补对，并且通常少于75％的互补对具有对单个核苷酸 具有特异性的有机环基团。在N-甲基咪唑的情况中，通常将至少有一个 Im/Py对，最好不具有超过3个，通常没有超过2个这样的连续对，因 而通常在一排中没有超过3个连续的Im。通常存在至少一个脂肪族氨基 酸，通常两个脂肪族氨基酸，并且通常没有超过8个脂肪族氨基酸，通 常没有超过6个脂肪族氨基酸，更优选没有超过约4个脂肪族氨基酸。 优选地，在低聚物的至少一个末端的临近存在一个氨基酸。Im/Py对提 供了较大的特异性，并且当被适当放置时，至少以与Py/Py相似的方式 对与双链DNA的结合亲和力起一份作用。所以，通过适当选择靶序列， 可以优化结合亲和力和特异性。

发现使用β-丙氨酸，β-丙氨酸结合T-A对并且通常与其自身形成互 补对。所以β-丙氨酸可以用于与T或A的并列中，并且作为含有T-A对， 含有它本身的互补对。

正如在实验部分确定的，结合亲和力Ka将大于5×108M-1，通常大 于109M-1，优选地大于约1010M-1，从而使它们能够在它们被使用的环 境中在亚纳摩尔浓度下能够结合靶序列。含有单个错配的亲和力的差异 将至少是3倍，通常至少5倍，优选地至少10倍，并且通常大于20倍， 并且可以是100倍或更多。

当本发明的低聚物被用于细胞时，特别是活细胞时，该低聚物的分 子量通常低于约5千道尔顿，优选地小于3.5千道尔顿，通常具有的分 子量至少约0.6千道尔顿，更通常至少约0.8千道尔顿。

根据是否在低聚物中存在发夹回转，这时仅需要一个低聚物，或者 没有发夹回转，这时为了互补人们需要两个低聚物，与双链DNA进行 复合的本发明的组合物具有一个或两个低聚物，或它们的联合。可以利 用更多低聚物，这时人们希望靶击一个以上的双链DNA，例如邻接或 邻近序列，以便增强总的特异性，或远侧的序列，其中该序列与同一个 功能单位相关，例如基因，或不同的功能单位例如同源区。该组合物， 不管是单个低聚物或低聚物的联合将在单个低聚物或低聚物对中提供至 少三个互补对。

在许多情况中，为了获得需要的结合常数，可以提高互补对的数目， 和/或具有未配对的有机环基团的区域。通常，我们具有至少一个或两个 第四个互补对，或至少两个未配对有机环基团，从而具有参与配对形成 的四个有机环基团和/或至少两个未参与配对形成的有机环基团的链。发 现当我们延长低聚物的长度时，我们没有以与每个有机环单元的加入相 同程度地提高结合亲和力，并且，事实上如上所述，我们可能通过不断 地延长逆转了结合亲和性。所以通过适当选择，正如上面指出，可以限 制组合物和单个低聚物的大小以便使结合亲和力以及与该低聚物的组合 物相关的其它特性的最佳化。

由于N-甲基吡咯和N-甲基咪唑的广泛的用途，利用这些N-杂环的 下面的化合物是本发明的化合物的种类的例子。可根据本文叙述的方法 制备这些化合物。在使用中，Py指N-甲基吡咯，Im指N-甲基咪唑。

ImPyPyPy-γ-PyPyPyPy，PyPyImPy-γ-PyPyPyPy，ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy， PyImPyPy-γ-PyImPyPy，ImPyImPy-γ-PyPyPyPy，ImImPyPy-γ-PyPyPyPy，ImImImPy- γ-PyPyPyPy，ImImPyPy-γ-ImPyPyPy，ImPyPyPy-γ-ImImPyPy，ImImPyPy-γ- ImImPyPy，ImPyImPy-γ-ImPyImPy，ImImImPy-γ-ImPyPyPyPy，ImImImIm-γ- PyPyPyPy，Im-β-PyPy-γ-Im-β-PyPy，Im-β-ImIm-γ-Py-β-PyPy，Im-β-ImPy-γ-Im-β- ImPy，ImPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy，ImImPyPyPy-γ-ImPyPyPyPy，ImPyImPyPy-γ- ImPyPyPyPy，ImImPyImIm-γ-PyPyPyPyPy，ImPyPyImPy-γ-ImPyPyImPy，ImPy-β- PyPy-γ-ImPy-β-PyPy，ImIm-β-ImIm-γ-PyPy-β-PyPy，ImPy-β-ImPy-γ-ImPy-β-ImPy ImPy-β-PyPyPy-γ-ImPyPy-β-PyPy，ImIm-β-PyPyPy-γ-PyPyPy-β-PyPy，ImPy-β- ImPyPy-γ-ImPyPy-β-PyPy，ImIm-β-PyPyPy-γ-ImImPy-β-PyPy，ImPy-β-PyPyPy-γ- PyPyPy-β-ImPy，ImPyPyPyPyPy-γ-ImPyPyPyPyPy，ImPyPy-β-PyPy-γ-ImPyPy-β-PyPy， ImPyPyPy-β-Py-γ-Im-β-PyPyPyPy，ImImPyPyPyPy-γ-ImImPyPyPyPy，Im-β- PyPyPyPy-γ-Im-β-PyPyPyPy，ImPyPyPy-β-Py-γ-ImPyPyPy-β-Py，ImPyImPyPyPy-γ- ImPyPyPyPyPy，ImPyPy-β-PyPy-γ-ImPy-β-PyPyPy，ImPyPyPyPy-β-γ-ImPyPyPyPy-β， ImPy-β-ImPyPy-γ-ImPy-β-ImPyPy，Im-β-PyPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Py，Im-β- ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Py，ImPyPy-β-PyPyPy，ImImPy-β-PyPyPy，ImImIm-β- PyPyPy，ImPyPyPyPy-β-PyPyPy，ImPyPyPy-β-PyPyPy，ImPyPy-β-PyPyPyPy， ImPyPyPy-β-PyPyPyPy，ImImPyPy-β-PyPyPyPy，ImImPyPy-β-PyPyPyPy，ImPyPyPy-β- ImPyPyPy，ImImPyPy-β-ImPyPyPy，ImImPyPyPy-β-PyPyPyPyPy，ImImImPyPy-β- PyPyPyPyPy，ImIm-β-PyPy-β-PyPy-β-PyPy，ImImPy-β-PyPyPy-β-PyPyPy，ImImPyPy- β-Py-β-PyPyPy，ImPyPy-γ-ImPyPy-β-PyPyPy，ImPyPy-γ-PyPyPy-β-PyPyPy， PyImPy-γ-ImPyPy-β-PyyPy，PyImPy-γ-ImPyPy-β-PyPyPy-β-PyPyPy，ImImPy-γ- ImPyPy-β-PyPyPy，ImPyPy-γ-ImPyPy-G-PyPyPy，ImPyPyPy-γ-ImImImPy-β-PyPyPyPy， ImImPyPy-γ-ImImPyPy-β-PyPyPyPy，and ImImPyPy-γ-PyPyPyPy-β-PyPyPyPy， PyPyImIm，ImPy-β-ImPy-β-ImPy，ImPy-β-ImPy-β-ImPy-β-PyPy，ImPy-β-ImPy-β-ImPy- γ-ImPy-β-ImPy-β-ImPy，ImPy-β-PyPy-β-PyPy，ImPy-β-PyPy-β-PyPy-γ-ImPy-β-PyPy- β-PyPy，Im-β-ImImImIm-γ-PyPyPyPy-β-Py，Im-β-ImImImIm-β-Im-γ-Py-β-PyPyPyPy-β- Py，ImIm-β-Im-γ-Py-β-PyPyPyPy-β-Py， Im-β-ImPyPy-γ-ImImPy-β-Py，ImImPy-β-Py-γ- Im-β-ImPyPy，ImIm-β-Im-γ-PyImPyPy.

图1说明了吡咯和小沟中核苷酸的关系。

当利用两个低聚物时，低聚物可以完全交迭，或只有部分交迭，即 跳格或具有突出。如前文所述，将至少有3个互补吡咯(N-甲基吡咯和 咪唑)对。在交迭的构型中，所有吡咯以及任何间隔氨基酸是在互补对中 的。在跳格的构型中，至少有一个吡咯环，在至少一个低聚物中是未配 对的，通常将有至少两个吡咯环在两个低聚物中是未配对的。通常，未 配对的吡咯环的数目的范围是2到30，优选是2到20，更优选是2到12。 通常，未配对的吡咯将参与2或更多吡咯环的链，优选3或更多吡咯环， 如果适当，包括链中的脂肪族氨基酸。

可以利用低聚物的各种排列和联合。可以具有至少3个互补对和未 配对吡咯的延伸和突出的单个低聚物，它可以与第二个低聚物整个或部 分互补，它与第一个低聚物的未配对成员形成互补对。或者，可以具有 两个“糖果罐”低聚物，它们具有互补对和未配对成员的突出，由γ氨 基丁酸将互补对的成员分开。但是，一个低聚物的这些未配对成员的定 位可以与其它低聚物的未配对成员的延伸部分或突出形成互补对。可以 具有延伸的线性低聚物，其中两个或更多低聚物与延伸的线性低聚物的 吡咯互补。如果需要，可通过使用多个具有不同的互补程度的低聚物将 非配对区域和配对的吡咯进行间隔排列。在每种情况下，选择与需要的 亲和力，靶的特性，形成复合物的目的等等相关。

本发明的组合物与双链DNA可在各种条件下被放置在一起。该条件 可以是在体外，在细胞培养物中，来自体内或体内。为了检测靶序列的 存在，双链DNA可以是细胞外或细胞内的。当在细胞外，双链DNA可 在溶液中，在凝胶中，在载玻片上等。双链DNA可以作为整个染色体 的一部分，或一个或更多分摩(centiMorgans)的整个染色体的片断存 在。双链DNA可以是附加体元件的部分。双链DNA可以约20，通常 至少约50，到百万碱基对或更多范围的较小的片断存在。双链DNA可 以是细胞内的，染色体的，线粒体的，质体，动质体，等，凝胶电泳中 分离的溶菌体的部分，染色体电泳物，质粒等等，它们是完整或片断化 的半分子。双链DNA和本发明的化合物之间的复合物的形成可以用于 诊断，治疗，纯化和研究等的目的。因为本发明的化合物的特异性，本 发明的化合物可以用于检测样品中特异的双链DNA序列而没有将双链 DNA熔化。形成复合物的诊断目的可以是等位基因的检测，突变的鉴 定，特定的寄主，例如细菌菌株或病毒的鉴定，特定的DNA重排的存 在的鉴定，特定的基因例如多重抗性基因的存在和法医等的鉴定。对于 致病原，致病原可以是病毒，细菌，真菌，原生动物，衣原体等。对于 高等动物，寄主可以是脊椎动物或无脊椎动物，包括昆虫，鱼，鸟，哺 乳动物等或植物。

当涉及在体外或来自体内时，双链DNA可以在适当的缓冲介质中与 本发明的组合物组合，通常浓度范围是约0.1纳摩尔/升到1毫摩尔/升。 可以利用各种缓冲液，如TRIS，HEPES，磷酸盐，碳酸盐等，特定的 缓冲液不是本发明的关键。通常，可使用常规浓度的缓冲液，通常的范 围是约10-200毫摩尔/升。可以常规量存在的其它添加剂包括氯化钠， 通常是约1到250毫摩尔/升，二硫苏糖醇等等，盐的量不是本发明的关 键。pH通常是6.5到9的范围，特定的pH不是本发明的关键。温度的 范围通常是4℃到45℃，特定的的温度不是本发明的关键。靶双链DNA 可以低聚物的摩尔数的0.001到100倍存在。

当用于诊断时，本发明的化合物可以具有如前文所述的各种标记， 并且可以利用已用于半抗原和受体(免疫测试)的检测的许多方案或利用 杂交(DNA互补)。因为本发明的化合物不是核酸，它们应用比利用DNA 互补的情况更为灵活。如下面所述进行测试，然后根据标记和方案的特 性进行序列的存在量的确定。该方案可以在溶液中或与固体相结合的情 况下来进行。固体相可以是容器壁，颗粒，纤维，薄膜，纸片等，其中 该固体相可以由各种材料组成，包括凝胶，纸，玻璃，塑料，金属，陶 瓷等等。可根据已知的技术，将样品或本发明的化合物固定在固体相上。 通过将本发明的化合物和固体相的进行适当功能化，本发明的化合物可 以共价地结合固体相。根据固体相的特性，样品可以共价地或非共价地 结合固体相。固体相允许分离步骤，从而允许在缺乏未结合标记时检测 来自标记的信号。

这些方案的例子包括将细胞裂解物与结合在固体相表面的DNA与酶 标记的低聚物组合，在复合物形成条件下温浴适当长的时间，使低聚物 与存在于固体相上的任何靶序列结合，分离液体介质并洗涤，然后利用 可检测底物检测固体相上酶的存在。

许多方案是基于具有不能直接给出可检测信号的标记的，但依赖于 与受体的非共价结合，该受体结合于一个表面或结合于可直接检测的标 记。在一个测试中，可以具有一个结合于低聚物的半抗原，例如，地高 辛。样品DNA将结合在一个表面上，并在测试过程中保持与表面的结 合。加入低聚物并且与任何存在的靶序列结合。在洗涤除去低聚物后， 加入酶或荧光标记抗地高辛单克隆抗体，洗涤表面并检测标记。或者， 可以具有与低聚物的一个末端结合的荧光素和生物素或与低聚物的其它 的末端或互补的低聚物结合的其它的适当的半抗原。将低聚物在液体相 中与DNA组合并温育。在温育完成后，将样品与结合在一个固体表面 上的生物素或半抗原的受体，例如抗生蛋白链菌素或抗体进行组合。在 第二次温育后，洗涤表面并且确定荧光素的水平。

如果希望避免分离步骤，可以利用通道(channeling)或荧光淬灭。 通过安排两个相互作用的标记，例如两个酶，其中一个酶的产物是另一 个酶的底物，或两个荧光物质，其中可以在两个荧光物质之间进行能量 转移，可以确定什么时候发生复合物的形成，因为两个标记通过在小沟 中形成2∶1复合物而产生并列。使用两个酶，可以检测第二个酶的产 物，使用两个荧光物质，可以确定在Stokes转变的波长的荧光或在较低 波长处吸收光的荧光物质的荧光的降低。另一个方案将本发明的组合物 结合于固体相，并且将结合的低聚物与溶液中的DNA结合。在必要的 温育和洗涤后，在固体相中可以加入标记的抗DNA，并且确定结合于 固体相的标记的量。

为了同时确定许多不同的序列或只是单个序列，可以提供结合于表 面的本发明的组合物的排列。以这样的方式，在排列中的特异位点将结 合特异的DNA序列。在该排列中加入含有DNA的样品并温浴。含有在 特定位点与低聚物互补的序列的DNA将在那个位点结合低聚物。在洗 涤后，检测特定位点DNA的存在，例如利用抗DNA抗体，表明靶序列 的存在。通过在存在大量标记接头时用限制酶裂解DNA，接着失活酶， 可以将接头与DNA片断的末端连接，并且如上所述进行操作。在排列 中特定位点上标记的存在将表明那个位点存在靶序列。

可以利用的方案的数目有许多。在WO95/20591；EPA393,743； WO86/05519；和EPA278,220中有许多这种方案的例子，而在 WO96/20218；WO95/06115；WO94/04538；WO92/14490；WO94/01776， EPA537830；WO91/09141；WO91/06857和WO91/05257中可以发现可以 从免疫测试中进行修改用于本发明的组合物并用于DNA检测的方案和 标记。

在诊断过程中，如涉及细胞，可能需要除去非特异结合的低聚物。 这可以通过将细胞与大量过量的很方便地附着于颗粒上的靶序列进行组 合来完成。通过允许非特异结合低聚物移动到细胞外介质中，低聚物将 结合于颗粒，然后可以容易地除去。如果需要，可以在按时取细胞样品 并且划出标记的丢失的变化率相对于时间的曲线。一旦标记的量变得稳 定，可以将这一值与靶序列的存在相联系。其它技术也可以用于减少假 阳性结果。

本发明的组合物也可以用于滴定重复，其中与特定的标示相关的重 复的数目存在显著的变化，增加或减少。重复的数目应该至少增加50％， 优选至少2倍，更优选至少3倍。通过确定与双链DNA结合的低聚物 的数目，可以确定特定的重复序列的扩增或丢失。

本发明的组合物可以用于分离和/纯化含有靶序列的靶DNA。通过利 用本发明的低聚物，其中该低聚物结合于固体相，具有靶序列的那些DNA 样品的部分将结合本发明的低聚物，并且从其余的DNA中分离出来。 可以制备低聚物附着的颗粒的柱，并且将样品通过柱。在洗涤柱后，利 用溶剂或高盐溶液可以释放特异地结合柱的DNA。或者，可以将结合 低聚物的颗粒与样品混合，然后分离颗粒，例如对磁性颗粒利用磁场， 对非磁颗粒利用离心。以这种方式，可以快速分离需要的靶DNA序列， 例如含有表达序列标记(EST)的基因，转录因子结合的转录调节序列， 已知一个片断的基因等等。由于部分序列是由各种不同的技术确定的， 本发明的低聚物允许分离限制片断，这些片断可以在凝胶上分离，然后 测序。以这种方式，可以快速分离基因，确定它的序列。正如下面将讨 论的，本发明的低聚物可以用于确定基因的功能。

在研究中可以各种方式利用本发明的低聚物。因为可以利用本发明 的低聚物抑制转录，可以研究抑制转录对细胞、细胞组装部分和整个生 物体的影响。例如，本发明的组合物可以与卵细胞，受精卵细胞或胚泡 结合使用，以便抑制与胚胎的发育相关的特定基因的转录和表达，从而 可以鉴定在特定基因的表达降低的影响。当一种基因可以参与许多其它 基因的调节时，可以确定这样的基因的缺乏对胚胎的发育的各种方面的 影响。可以将本发明的低聚物设计成与同源区结合，从而可以抑制一个 或更多基因的转录。另外，可以在在胎盘发育的过程中的各个期间利用 本发明的组合物，以便鉴定该基因是否被表达和基因在发育的特定时期 有何作用。

使用单细胞生物体，可以确定缺乏特定表达产物对生物体的毒力， 生物体的发育，生物体的增殖等的影响。以这种方式，可以确定药物的 靶以便抑制生物体的生长和感染。

在动物模型中，可以通过以各种方式，口服或肠胃外，通过在希望 影响转录的特定位点，微管内，皮下等注射给药本发明的组合物，可逆 地或不可逆地提供特定基因的表达的抑制。通过抑制转录，可以提供可 逆的“失效”，其中通过连续的静脉内给药，可以大大延长抑制基因转 录的时期。或者，可以利用本发明的低聚物的药丸，并且观察当药丸分 散时对各种生理参数的影响。可以检测抑制的效果的破坏，获得效果持 续时间的长度，观察与抑制相关的生理过程和正常生理应答发生的速 度。或者，可利用烷基化试剂，光活化结合基团，插入基团等将低聚物 与靶位点共价结合。

通过下调其它基因，上调基因也是可能的。在一个产物的表达抑制 另一个产物表达的情况下，通过抑制第一个产物的表达可以增强第二个 产物的表达。同样，转录因子涉及多个协同因子形成复合体，通过抑制 其它转录因子的表达，可以相对于另一个转录因子提高一个转录因子的 复合物形成。以这种方式，通过改变细胞调节环境，可以改变表达的蛋 白质的特性。

靶序列可以与5’非翻译区，即转录起始区，可以在5’非翻译区的增 强子，编码序列或内含子，编码区，包括内含子和外显子，3’非翻译区， 或基因的远端相关。

本发明的组合物可以作为脂质体存在，存在于脂质体的腔中，其中 脂质体可以与针对表面膜蛋白或基准膜蛋白质的抗体，细胞受体的配 体，或其它的位点指向化合物相组合，以便将本发明的组合物固定于特 定的的靶。参见，例如，Theresa和Mouse，Adv.Drug Delivery Rev.1993，21，117-133；Huwyler和Partridge，美国科学院院刊，1996，93， 11421-11425；Dzau等人，美国科学院院刊，1996，93，11421-11425； 和Zhu等人，科学，1993，261，209-211。本发明的组合物可通过导管 施用，以便将本发明的组合物固定到寄主中特定的器官或靶位点。通常， 在需要的位点的浓度例如在细胞内或在细胞外介质中应该至少是0.1纳 摩尔/升，优选至少约1纳摩尔/升，通常不超过1毫摩尔/升，更优选不 超过约100纳摩尔/升。为了获得需要的细胞内浓度，细胞外低聚物的浓 度通常将大于需要的细胞内浓度，范围是约比细胞内浓度高2到1000 倍或更高。当然，其中毒性曲线允许比所示的细胞内或细胞外浓度更高， 可以利用更高的浓度，同样，当亲和力是足够高时，较低的浓度也可以 获得效果，可以利用较低的浓度。

由于各种原因，可利用本发明的组合物调节体内的生理过程。在非 灵长类动物中，特别是家养动物，在动物畜牧业和育种中，通过控制特 定的基因的表达，改变生理过程如脂肪积累，生长，对刺激的应答等来 影响动物的发育。同样可以将本发明的组合物在哺乳动物中用于治疗目 的。家养动物包括猫，小鼠，犬，兔，小牛，绵羊，犬，猪等等。

可以将本发明的组合物用于治疗，抑制特定的靶细胞的增殖，抑制 与一种指标相关的一个或多个基因的表达，改变寄主内源或外源的细胞 的表现型，其中天然表现型对寄主是有害的。所以，通过结合寄主或细 菌或其它致病原的管家基因或其它基因，特别是特异于致病原的基因， 可以抑制特定的致病原的增殖。可以利用各种技术增强跨细菌壁的运输 如各种载体或序列，例如聚赖氨酸，聚(E-K)，核定位信号，胆固醇和胆 固醇衍生物，脂质体，鱼精蛋白，固定于脂的聚乙二醇，磷脂，如二油 磷脂乙醇胺(dioleoxyphosphatidylethanolamine)，磷脂酰胆碱，磷脂酰甘 油，α-生育酚，环孢菌素等等。在许多情况中，本发明的组合物可以与 载体混合以便形成分散的组合物并且以分散的组合物使用。同样，当一 个基因对于增殖或保护细胞不发生程序死亡是重要的，同时这种细胞发 生不期望的增殖，本发明的组合物可以通过抑制该重要的基因的转录来 抑制增殖。这可应用于如癌症，如肉瘤，癌和白血病，再狭窄，牛皮藓， 淋巴组织生成，粥样硬化，肺纤维质生成，神经纤维瘤，声带神经瘤， 结节性硬化，瘢痕疙瘩，成纤维瘤，多轮式卵巢和肾，硬皮病，类风湿 关节炎，长合spondilitis，脊髓相位异常，硬变，食管缩紧，slerosing chaolangitis，腹膜后纤维等等的情况中。抑制可以与一个或多个特定的 生长因子相关，如血小板起源的生长因子，附加体生长因子，转化生长 因子，神经生长因子，成纤维生长因子，例如碱性和酸性的，角质细胞 成纤维生长因子，肿瘤坏死因子，白细胞介素，特别是白细胞介素1， 干扰素等等的家族。在其它情况中，人们期望抑制特定的与疾病状态相 关，如与癌症相关的突变受体相关的基因，抑制花生四烯酸梯级反应， 抑制各种癌症基因包括转录因子，如ras，myb，myc，sis，src，yes，fps/fes， erbA，erbB，ski，jun，crk，sea，rel，fms，abl，met，trk，mos，Rb-1，等的表达。可 用本发明的组合物治疗的其它疾病包括炎症应答，皮肤移植排斥，过敏 应答，精神病，睡眠调节，免疫应答，粘膜溃疡，与终止药物使用相关 的停止服药的症状，肝损伤的病理，心血管过程和神经过程。特别是当 特定的T细胞受体与自我免疫疾病相关时，如多发性硬化，糖尿病，红 斑狼疮，重症肌无力，Hashimoto疾病，血细胞减少症，风湿性关节炎 等等，可以消除不需要的T细胞受体的表达，从而抑制T细胞的活性。 在重新输血损伤或其它炎症导致的疾病中，可以抑制与各种炎症状态和/ 或败血性休克相关的因子如TNF的生成相关的酶，生成单体氧的酶， 如过氧化物酶和超氧化物歧化酶，蛋白酶，如弹性蛋白酶，INFγ，IL-2， 诱导肥大细胞\嗜酸性粒细胞、IgG1、IgE、调节T细胞等增殖的因子， 或调节白细胞和内皮细胞的粘连分子的表达的因子。

其它利用本发明的组合物的机会包括调节受体的水平，配体的产生， 酶的产生，因子的产生，减少特定的细胞群体，改变细胞的表现型和基 因型，特别是与特定的器官和组织相关时，改变细胞对药物或其它刺激 的应答，例如增强或去除应答，抑制两个或更多等位基因，抑制靶基因 的表达，特别是与临床研究相关时，改变行为，改变疾病的敏感性，对 刺激的应答，对致病原的应答，对药物，治疗剂或滥用物质等等的应答。

可以利用单个组合物或特异于同样的双链DNA区，但不同靶序列， 邻近的或远侧的，或不同DNA区的组合物的联合。根据希望靶击的基 因的数目，该组合物可以具有一个或特异于不同靶位点的多个低聚物或 低聚物对。

本发明的组合物可以用作唯一的治疗剂或与其它治疗剂组合。根据 特定的指征，也可以使用其它药物，如抗体，抗血清，单克隆抗体，细 胞因子，抗炎症药物等等。本发明的组合物可以用于急性或慢性疾病， 其中为治疗的病人设计了特定的方案。本发明的组合物可以制备成生理 可接受的介质，并且在适于他们的稳定性的条件下储藏。它们可以被制 备成粉末，悬浮液，在液体介质，烷醇，例如乙醇和丙二醇中与各种赋 形剂组合。特定的配方将依赖于给药的方式，需要的浓度，给药的容易 程度，储藏的稳定性等等。在配方中的浓度将依赖于给药的剂量的数目， 低聚物的活性，作为治疗剂量需要的浓度等等。本发明的组合物可以口 服，肠胃外，例如，静脉内，皮下，腹膜内，经皮的等等给药。本发明 的组合物可根据常规方法结合治疗方式进行配制。配制之后，本发明的 组合物可通过直接导入特定的细胞靶或随机导入许多不同的细胞类型导 入细胞。但是，本发明的组合物将只有在其中转录了靶双链DNA，或 存在一种机制，同时本发明的组合物的结合可以影响该机制的这些细胞 中具有效果。以这样的方式，可以获得选择性，因为唯一的有成效的结 果将发生在其中靶双链DNA发生效应的细胞中，本发明的组合物与双 链DNA的结合改变了该效果。

通常可利用一种固体支持物来制备，参见，例如Baird和Dervan，美 国化学学会杂志1996，118，6141；PCT申请，US97/03332。为了固相合成， 该低聚物在通过一种连接附着于固体相上的固相上生长，这一连接可通 过一种单一步骤的方法切除。在低聚物的C-末端的脂肪族氨基酸的加入 允许使用可通过商业途径获得的适当取代水平的Boc-β-丙氨酸-Pam-树 脂(0.2毫摩尔/克)。可以利用氨解从支持物裂解聚酰胺。在N-甲基4-氨 基-2-羧基吡咯和N-甲基4-氨基-2-羧基咪唑的情况中，可以利用活化的 酯如N-羟基琥铂酰，1，2，3-羟基苯并三唑，等，其中的氨基受到Boc或Fmoc 的保护，随后根据常规技术逐个加入单体。对于进一步的细节，参见相 关文献，其内容引入本文作为参考，乙基实施例部分。

下文中的实施例只是为了进一步说明，不限定本发明的范围。 实验

实施例1：含有咪唑和吡咯氨基酸的聚酰胺的固体相合成(Baird & Dervan，美国化学学会杂志，1996，118，6141)

Boc-β-丙氨酸-(4-酰胺基(carboxamido)甲基)-苄基-酯-共聚(苯乙烯-二 乙烯苯)树脂(Boc-β-丙氨酸-Pam-树脂)，二环己基碳化二亚胺(DCC)，羟 基苯并三唑(HOBt)，2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲阳离子六氟 磷酸盐(HBTU)，Boc-甘氨酸，和Boc-β-丙氨酸是从肽国际公司购买的。 N，N-二异丙基乙胺(DIEA)，N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，N-甲基吡咯烷 (NMP)，DMSO/NMP是从应用生物系统公司购买的。Boc-γ-氨基丁酸来 自NOVA Biochem，二氯甲烷(DCM)和三乙胺(TEA)是来自EM的试剂 级，硫苯(PhSH)，二甲基氨基丙胺，三氯乙酰氯，N-甲基吡咯，和N-甲 基咪唑来自Aldrich和三氟乙酸(TFA)来自Halocarbon。所有试剂在使用 时不需要进一步纯化。 单体合成 4-硝基-2-三氯乙酰-1-甲基吡咯

在12升烧瓶中，在1.5升乙醚中的充分搅拌的三氯乙酰氯(1公斤，5.5 摩尔)溶液中，在3小时的时期内，逐滴加入1.5升无水乙醚中的N-甲 基吡咯(0.45公斤，5.5摩尔)的溶液。将反应混合物再搅拌3小时，通过 逐滴加入1.5升水中的400克碳酸钾的溶液淬灭。分离各层，并且在真 空中浓缩醚层产生不需要进一步纯化的待使用的黄色结晶固体2-(三氯 乙酰)吡咯(1.2公斤，5.1摩尔)。在1小时的时期，维持温度-40℃，在12 升装备机械搅拌的烧瓶中的醋酐(6升)中的2-(三氯乙酰)吡咯(1.2公斤， 5.1摩尔)的冷却溶液(-40℃)中，加入440毫升浓硝酸。小心地使反应加 热到室温并且再搅拌4小时。将混合物冷却到-30℃，加入异丙醇(6升)。 在-20℃搅拌溶液30分钟，在这过程中形成了白色沉淀。将溶液静置15 分钟，并通过真空过滤收集得到沉淀。 甲基4-硝基吡咯-2-羧酸酯

在装备机械搅拌器的4升Erlenmeyer烧瓶中的2.5升甲醇中的4硝 基-2-三氯乙酰1-甲基吡咯(800克，2.9摩尔)的溶液中，逐滴加入500毫 升甲醇中的NaH(60％油中的分散体系(10克，0.25摩尔)的溶液。在室温 下，将反应物搅拌2小时，通过加入浓缩的硫酸(25毫升)淬灭。然后， 将反应物加热以便回流，慢慢冷却到室温。产物结晶成白色针，通过真 空过滤收集。 甲基4-氨基-1-甲基-吡咯-2-羧酸酯盐酸盐

在乙酸乙酯(8升)中溶解甲基-4-硝基吡咯-2-羧酸酯4(450克，2.8摩 尔)。然后加入800毫升乙酸乙酯中的40克10％Pd/C的浆液，在氢的轻 微正压(大约1.1大气压)下搅拌混合物48小时。通过硅藻土过滤除去 Pd/C，利用1×50毫升乙酸乙酯洗涤，混合物的体积减少到大约500毫 升。加入7升冷乙醚，轻轻吹入HCl气体。通过真空过滤收集沉淀的胺 盐酸盐，产生一种白色粉末(380克，81.6％)。 4-[(叔-丁氧基羰基)氨基]-1-甲基吡咯-2-羧酸

在装备机械搅拌器的3升的烧瓶中的1升10％碳酸钠水溶液中溶解 甲基4-氨基-1-甲基-吡咯-2-羧酸酯盐酸盐(340克，1.8摩尔)，在30分钟 所时期，维持温度20℃，加入500毫升二恶烷中成浆的二-叔丁基二碳 酸酯(400克，2.0毫摩尔)。反应进行3小时，并通过TLC确定反应完全， 冷却到5℃2小时，并通过真空过滤收集得到的白色沉淀。在700毫升 MeOH中溶解Boc-酸酐污染的Boc-吡咯酯，加入700毫升2摩尔/升的 NaOH，在60℃加热溶液6小时。将反应物冷却到室温，利用乙醚(4×1000 毫升)洗涤，利用10％(v/v)硫酸调节水层的pH，使其降低到约3，利用 乙酸乙酯(4×2000毫升)萃取。干燥(硫酸钠)合并的乙酸乙酯提取物，并 在真空中浓缩得到一种棕褐色的泡沫。在500毫升DCM中溶解泡沫， 加入2升石油醚，在真空中浓缩得到的浆液。将反应物进行再溶解和浓 缩3次，得到一种细微的白色粉末(320克，78％产量)。 1，2，3-苯并三唑-1-基4-[(叔丁氧碳酰)-氨基]-1-甲基吡咯-2-羧酸酯

在500毫升DMF中溶解Boc-Py-酸(31克，129毫摩尔)，加入HOBt(17.4 克，129毫摩尔)，接着加入DCC(34克，129毫摩尔)。搅拌反应物24 小时，然后逐滴过滤进入充分搅拌的5升冰水中。将沉淀在0℃静置15 分钟，然后通过过滤收集。将得到的湿饼溶解在500毫升DCM中，将 该有机层缓慢加入冷石油醚(4℃)的搅拌溶液中。混合物在-20℃静置4 小时，然后通过真空过滤收集，在真空中干燥，得到精细分裂的白色粉 末(39克，85％产率)。 乙基1-甲基咪唑-2-羧酸酯

在12升的装备机械搅拌器的烧瓶中将N-甲基咪唑(320克，3.9摩尔) 与2升乙腈和1升三乙胺合并，将溶液冷却到-20℃。搅拌加入氯甲酸乙 酯(1000克，9.2摩尔)，维持温度-20℃和-25℃之间。使反应物慢慢变热 到室温，并搅拌36小时。通过过滤除去沉淀的三乙胺盐酸，并在真空 中在65℃浓缩溶液。在低压(2torr，102℃)下，通过蒸馏纯化得到的油，产 生一种白色固体(360克，82％产率)。 乙基1-甲基-4-硝基咪唑-2-羧酸酯

在1000毫升冷却到0℃的浓缩硫酸中小心溶解乙基1-甲基咪唑-2-羧 酸酯。慢慢加入90％硝酸(1升)，维持0℃的温度。然后在通风良好的 防护罩中用有效浓缩器(-20℃)回流反应物50分钟。利用冰浴冷却反应 物，通过注入10升冰淬灭。然后，利用20升DCM提取得到的蓝色溶 液，将合并的抽提物干燥(硫酸钠)并在真空中浓缩，产生一种棕褐色的 固体，并将其从22升，21∶1四氯化碳/乙醇中再结晶。通过真空过滤收 集白色结晶。 乙基4-氨基-1-甲基咪唑-2-羧酸酯盐酸盐

在5升1∶1乙醇/7酸乙酯中溶解乙基1-甲基-4-硝基咪唑-2-羧酸酯 (103克，520毫摩尔)。加入在500毫升乙酸乙酯中浆化的20克10％ Pd/C，并且在氢的轻微正压(约1.1atm)下搅拌混合物48小时。过滤反应 混合物，在真空中浓缩到500毫升体积，加入5升冷无水乙醚。加入HCl气产生白色沉淀。在-20℃冷却溶液4小时，通过真空过滤收集沉淀，在 真空中干燥，得到一种细微的白色粉末(75克，78％产量)。 4-[(叔-丁氧羰基)氨基]-1-甲基咪唑-2-羧酸

在200毫升DMF中溶解乙基4-氨基-1-甲基咪唑-2-羧酸酯盐酸盐(75 克，395毫摩尔)。在加入DIEA(45毫升，491毫摩尔)后，加入二-叔丁 基二碳酸酯(99克，491毫摩尔)。在60℃振摇混合物18小时，使其达 到室温，并且在500毫升盐水，500毫升乙醚之间分配。利用(每次2×200 毫升)10％柠檬酸，盐水，饱和碳酸二氢钠和盐水提取醚层，在硫酸钠中 干燥，在真空中浓缩，被20％Boc-酸酐污染的Boc-酯，如1H NMR所示。 将没有进一步纯化的Boc-酯溶解于200毫升1摩尔/升的NaOH。将反应 混合物在60℃静置3小时，并偶尔搅动。将反应混合物冷却到0℃，并 且小心利用1摩尔/升HCl中和到pH2，这时形成了白色凝胶。通过真 空过滤收集凝胶，在干燥之前冷冻，并且保持冷冻干燥，产生一种白色 粉末。 4-[(叔-丁氧羰基)氨基]-1-甲基吡咯-2-(4-酰胺基-甲基咪唑)-2-羧酸

如下所述制备化合物(-[(叔-丁氧羰基)氨基]-丁酸-(4-酰胺基-1-甲基- 咪唑)-2-羧酸，利用Boc-吡咯酸替代Boc-γ-氨基丁酸(4.1克，91％产率)。 (γ-[(叔丁氧碳酰)氨基]-丁酸-(4-酰胺基(carboxamido)-1-甲基咪唑)-2-羧酸

在40毫升DMF中的Boc-(-氨基丁酸(10克，49毫摩尔)的溶液中加 入1.2当量的HOBt(7.9克，59毫摩尔)，接着加入1.2当量的DCC(11.9 克，59毫摩尔)。搅拌溶液24小时，通过过滤除去DCU。另外，在20 毫升DMF中的乙基4-硝基-1-甲基咪唑-2-羧酸酯(9.8克，49毫摩尔)的 溶液中加入Pd/C催化剂(10％，1克)，并且在Parr弹仪器中(bomb apparatus)(500psi H2)氢化混合物2小时。通过硅藻土过滤除去催化剂， 并将过滤物立即加入HOBt酯溶液中。然后加入过量的DIEA(15毫升)， 在37℃搅拌反应物48小时。然后在搅拌的冰水溶液中逐滴加入反应混 合物，并且通过真空过滤收集沉淀，得到粗的乙基4-[[[3-[(叔-丁氧羰基] 氨基]丙基]羰氨基]-1-甲基咪唑-2-羧酸酯(5克，14.1毫摩尔)。在溶解于 50毫升甲醇中的这种粗酯中加入50毫升1摩尔/升KOH，并且在37℃ 搅拌得到的混合物6小时。在真空中除去过量的甲醇，通过加入1摩尔/ 升HCl酸化得到的溶液。通过真空过滤收集产生的沉淀，并且在真空中 干燥，产生一种棕色粉末(4.4克，89％产率)。 固体相合成

咪唑-2-羧酸，(γ-氨基丁酸，Boc-甘氨酸，和Boc-β-丙氨酸)的活化。 将适当的氨基酸或酸(2毫摩尔)溶解于2毫升DMF。加入HBTU(720毫 克，1.9毫摩尔)，接着加入DIEA(1毫升)，轻微振摇溶液至少5分钟。 Boc-咪唑酸的活化

在2毫升DMF中溶解Boc-咪唑酸(257毫克，1毫摩尔)和HOBt(135 毫克，1毫摩尔)，然后加入DCC(202毫克，1毫摩尔)，并将溶液静置 至少5分钟。 Boc-γ-咪唑酸和Boc-吡咯-咪唑酸的活化

在2毫升DMF中合并适当的二聚体(1毫摩尔)和HBTU(378毫克，1 毫摩尔)。然后加入DIEA(1毫升)，并将反应混合物静置5分钟。 Boc-吡咯酸的活化(用于与咪唑胺的偶联)

在2毫升二氯甲烷中溶解Boc-吡咯酸(514毫克，2毫摩尔)，加入DCC (420毫克，2毫摩尔)，并将溶液静置10分钟，加入DMAP(101毫克， 1毫摩尔)，并将溶液静置1分钟。 乙酰化混合

在使用之前立即合并2毫升DMF，DIEA(710微升，4.0毫摩尔)，和 乙酸酐(380微升，4.0毫摩尔)。 手工合成方案

在20毫升玻璃反应容器中放置Boc-β-丙氨酸-Pam-树脂(1.25克，0.25 毫摩尔)，在DMF中振摇5分钟，并流出反应容器。用DCM(2×30秒 钟)洗涤树脂，并用80％TFA/DCM/0.5摩尔/升PhSH，1×30秒钟，1×20 分钟，除去Boc基团。用DCM(2×30秒钟)接着DMF(1×30秒钟)洗涤 树脂。取树脂样品(5-10毫克)用于分析。完全流干容器，并且加入活化 的单体，如果需要接着加入DIEA。剧烈振摇反应容器以制成浆液。使 偶联反应进行45分钟，取树脂样品。然后用DCM，接着DMF洗涤反 应容器。 机械辅助方案

在一个ABI 430A合成仪上，以0.18毫摩尔的规模(900毫克树脂；0.2 毫摩尔/克)上进行机械辅助合成。氨基酸加入的每个循环包括：用大约80 ％TFA/DCM/0.4摩尔/升PhSH去保护3分钟，流干反应容器，然后去保 护17分钟；2次二氯甲烷流洗涤；1次NMP流洗涤；流干反应容器； 利用原位中和偶联1小时；加入二甲基亚砜(DMSO)/NMP，偶联30分 钟，加入DIEA，偶联30分钟；流干反应容器；利用DCM洗涤，取树 脂样品通过HPLC分析评估合成的进程；在DCM中利用乙酸酐/DIEA 加帽6分钟；利用DCM洗涤。当将脂肪族氨基酸与咪唑偶联时使用双 偶联循环，其它的偶联是使用单偶联循环进行的。

对于NMP-HOBt方案，ABI430A合成仪被置于标准硬件配置。试剂 位置1和7是DIEA，试剂位置2是TFA/0.5摩尔/升噻吩，试剂位置3 是70％乙醇胺/甲醇，试剂位置4是乙酸酐，试剂位置5是DMSO/NMP， 试剂位置6是甲醇，试剂位置8是DMF。写了新的活化剂功能，一个 用于直接转移药筒内容物到浓缩器(开关21，25，26，35，37，44)，第 二个用于直接转移试剂位置8到药筒(开关37，39，45，46)。

在2毫升DMF中溶解Boc-Py-OBt酯(357毫克，1毫摩尔)，过滤进 入合成药筒。活化Boc-Im酸单体(DCC/HOBt)，过滤，和放置于合成药 筒。手动加入咪唑-2-羧酸。在偶联循环启动时，合成中断，打开反应容 器的开口，通过树脂样品环用注射器将活化的单体直接加入反应容器。 当需要手动加入时使用空的合成药筒。在合成药筒中放置了脂肪族氨基 酸(2毫摩尔)和HBTU(1.9毫摩尔)。使用试剂瓶8的刻度投送环加入3 毫升DMF，接着刻度投送来自试剂瓶7的1毫升DIEA，混合药筒3分 钟。

活化剂循环被写成通过活化剂容器将活化的单体直接从药筒转移到 浓缩器容器。在转移后，利用刻度投送环向药筒中量入1毫升DIEA， 在浓缩器容器中将DIEA溶液与活化单体溶液合并。然后，将在2： 1DMF/DIEA中的活化的酯转移到反应容器中。在溶液转移之前和之后 所有管道是空的，充满氩。 ImPyPy-γ-PyPyPy-β-丙氨酸-Dp

通过机械辅助合成方案制备ImPyPy-γ-PyPyPy-β-丙氨酸-Pam-树脂。 在20毫升玻璃闪烁瓶中放置树脂样品(1克，0.17毫摩尔)，加入4毫升 二甲基氨基丙胺，在55℃加入溶液18小时。通过一个一次性使用的丙 烯过滤器过滤除去树脂，并加入16毫升水。通过制备性HPLC纯化聚 酰胺/胺混合物，并冷冻干燥适当的级分，产生一种白色粉末。 逐步HPLC分析

在4毫升玻璃测试管中放置树脂样品(约4毫克)，加入200微升N， N-二甲基氨基丙胺，在100℃加热混合物5分钟。过滤裂解混合物，通 过分析性HPLC在254纳米分析25微升样品。 实施例2：β-丙氨酸和γ-氨基丁酸是回转和交迭的特异性“引导”氨基酸， 它们可在同一个分子中进行可预测的结合(Tranger等，化学和生物学， 1996，3，369-377)。 聚酰胺ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-Dp和ImPyPy-γ-氨基丁酸- ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp的合成

使用如上所述的固相合成方法制备所有的高纯度聚酰胺。以逐步的 方法分别将聚酰胺制备在Boc-β-丙氨酸-Pam树脂和Boc-甘氨酸-Pam-树 脂上。从支持物上利用适当的伯胺裂解聚酰胺ImPyPy-γ-氨基丁酸- ImPyPy-β-丙氨酸-Dp，ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G- Dp和ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp-NH2并且通过 逆相HPLC纯化，得到10-30毫克聚酰胺。可以提供适于合成后修饰的 伯胺基团。利用过量的EDTA二酸酐处理胺修饰的聚酰胺，水解未反应 的酸酐，通过逆相HPLC分离EDTA修饰的聚酰胺ImPyPy-γ-氨基丁酸- ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp-EDTA。 ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp-NH2

通过机械辅助固相方法制备聚酰胺，一种白色粉末(29毫克，59％回 收率)。 ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp-EDTA

通过在55℃加热5分钟在1毫升DMSO/NMP溶液和1毫升DIEA 中溶解EDTA-二酸酐(50毫克)。在溶解于750微升DMSO中的ImPyPy- γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp-NH2(9.0毫克，5微摩尔)中 加入二酸酐溶液。在55℃加热混合物25分钟，利用3毫升0.1摩尔/升 NaOH处理，在55℃加热10分钟。加入0.1％TFA调节总体积至8毫升， 通过逆相HPLC直接纯化溶液，得到白色粉末ImPyPy-γ-氨基丁酸- ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp-EDTA(3毫克，在HPLC纯化后30％回 收率)。 制备32P标记DNA

通过杂交两套5’磷酸化的互补低聚核苷酸，5’- CCGGGAACGTAGCGTACCGGTCGCAAAAAGACAGGCTCGA-3’和5’- GGCGTCGAGCCTGTCTTITTGCGACCGGTACGCTACGTTC-3’和5’- CGCCGCATATAGACAGGCCCAGCTGCGTCCTAGCTAGCGTCGTAGC GTCTTAAGAG-3’和5’- TCGACTCTTAAGACGCTACGACGCTAGCTAGGACGCAGCTGGGCCT GTCTATATGC-3’制备质粒pJT8，并将得到的双螺旋与大的pUC19 AvaI/SalI限制片断连接。利用AflII消化质粒制备3’-32P末端标记的 AflII/FspI片断，并且同时使用测序酶填平[’‘α-32P]-脱氧腺苷-5’-三磷 酸，和[’‘α-32P]-胸苷-5’-三磷酸，用FspI消化，通过非变性凝胶电泳分 离247bp的片断。利用标准方法制备5’-32P末端标记的AflII/FspI片断。 如所述(Maxam和Gilbert，酶学方法，1980，65，499-560；Iverson和Dervan， 酶学方法，1987，15，7823-7830；Sambrook等人，1989，分子克隆， 第二版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约)进行A和G的测序。使用 标准方法进行所有的DNA操作(Sambrook等人，1989，分子克隆，第二 版，冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约)。 亲和裂解反应

在总体积400毫升中进行所有反应。在含有标记(15,000cpm)的限制 片断的溶液中加入EDTA修饰的聚酰胺的储备溶液或H2O，使最终的溶 液条件为20毫摩尔/升HEPES，200毫摩尔/升NaCl，50微克/毫升糖元， 和pH7.3。随后加入20微升新鲜制备的20毫摩尔/升Fe(NH4)2(SO4)2， 使溶液平衡20分钟。加入40微升50毫摩尔/升二硫苏糖醇启动裂解反 应，在22C进行12分钟，然后加入1毫升乙醇终止。沉淀反应物，利 用标准方法分离裂解产物。然后，加入10微升含有小牛胸腺DNA的溶 液(140微摩尔/升碱基对)(Pharmacia)和糖原(2.8毫克/毫升)，沉淀DNA。 在1×TBE/80％甲酰胺加载缓冲液中再悬浮反应物，在85℃加热变性10 分钟，放置于冰上。通过在8％聚丙烯酰胺凝胶(5％交联，7摩尔/升脲) 在1×TBE在2000伏下电泳分离反应产物。干燥凝胶并且暴露于储藏 的磷筛。利用ImageQuant软件通过单个裂解带的体积整合确定相对的 裂解强度。 定量DNase I步迹滴定实验

在总体积400微升中进行所有反应。在含有放射性标记的限制片断 (15,000cpm)的测试缓冲液中加入聚酰胺储备液或H2O(用作对照带)，使 最终溶液条件是10毫摩尔/升TrisHCl，10毫摩尔/升KCl，10毫摩尔/升 MgCl2，5毫摩尔/升CaCl2，pH7.0，和(i)1 pM-10纳摩尔/升聚酰胺或(ii)无 聚酰胺(用作对照带)。在22℃平衡溶液(i)12小时对于聚酰胺1或(ii)36 小时对于聚酰胺2。通过加入10毫升含有1毫摩尔/升二硫苏糖醇的 DNaseI储备液(适当浓度给出约55％完整DNA)启动步迹反应，并在22 ℃进行反应7分钟。加入含有2.25摩尔/升NaCl，150毫摩尔/升EDTA， 0.6毫克/毫升糖原，和30微摩尔/升碱基对小牛胸腺DNA的50微升溶 液终止反应，乙醇沉淀。在1×TBE/80％甲酰胺加载缓冲液中再悬浮反 应物，在85℃加热变性10分钟，放置于冰上。通过在8％聚丙烯酰胺 凝胶(5％交联，7摩尔/升脲)，在1×TBE在2000伏电泳分离反应产物。 干燥凝胶，暴露于储藏的磷酸筛(Molecular Dynamics)。 定量和数据分析

利用Molecular Dynamic 400S PhosphorImager接着利用ImageQuant 软件定量(Molecular Dynamic)获得来自步迹滴定凝胶的数据。包括步迹 位点和Dnase I反应性在滴定过程中为常量的对照点的矩形的背景校正 的体积整合产生了位点强度(I位点)和参考强度(I参考)的值。利用方程(1)计 算这些点的表观部分占有率(2表观)：

其中I0位点和I0参考分别是来自没有聚酰胺加入的对照道的位点和参考 强度。通过使Q表观和Q适合之间的差异最小化将([L]总，Q表观)数据点代入 一般的Hill方程(方程2)： 其中[L]总是总的聚酰胺浓度，Ka是平衡结合常数，和Q最小和Q最大分别 是当位点未占有和饱和时实验确定的位点饱和值。利用非线性最少平方 代入过程，Ka，Q最大和Q最小作为可调节参数代入数据。对于聚酰胺 ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-Dp，5’-AGACA-3’靶位点的结合 等温线充分适合Langmuir等温线(方程2，n＝1)，与1∶1聚酰胺-DNA复 合物的形成一致。对于Im-PyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy- G-Dp，在靶位点5’-AAAAAGACA-3’和5’-ATATAGACA-3’观察到较陡的 结合等温线(方程2，n＝1.8-2.2)。这些等温线的陡度可能是由于这些位点 的非常高的平衡结合常数。以这种方式的处理的数据不表示对结合机制 的模型的尝试。这些数据是表观一级结合常数的值的比较，该值代表了 位点半饱和的配体的浓度。利用下面方程标准化结合等温线： 在确定每个结合常数时利用了四套数据。本文利用的确定结合常数的方 法包括设定[L]总.[L]游离，其中[L]游离是溶液中游离的聚酰胺(未结合)的浓 度。对于非常高的结合常数，这一设定值无效，导致低估结合常数。在 本文叙述的实验中，估计DNA浓度是约5皮摩尔。结果，大于约1010 摩尔-1的表观结合常数应被当作低限。 DNA结合定向

利用在5’-或3’-32P末端标记的247bp pJT4AflII/FspI限制片断上的 ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp-DETAFe(II)(2-Fe(II)) 进行的亲和力裂解(Wade等人，美国化学学会杂志，1992，114，8783- 8794；Schultz等人，美国化学学会杂志，1982，104，6861-6863.)实验表明这 一聚酰胺在亚纳摩尔浓度选择性地结合5’-AAAAAGACA-3’和5’- ATATAGACA-3’靶序列。在每个9bp位点观察到单个3’-漂移的裂解图 谱，表明聚酰胺在一个定向上用C末端结合5’-AAAAAGACA-3’和5’- ATATAGACA-3’序列的5’末端。 DNA结合亲和力和特异性

首先通过初步的MPEFe(II)步迹实验(Hertzberg和Dervan，美国化学学 会杂志，1982，104，313-315)确定所有结合位点的正确定位和大小。在3’-32P 标记的247bp限制片断(10毫摩尔/升TrosHCl，10毫摩尔/升KCl，10毫摩 尔/升MgCl2，5毫摩尔/升CaCl2，pH7.0，22℃)上的定量DNaseI步迹滴定实 验(Fox和Waring，核酸研究，1984，12，9271-9285；Brenowitz等人，酶 学方法，1986，130，132-181；Brenowitz，等人，美国科学院院刊，1986， 83，8462-8466)表明ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp 特异地结合5’-AAAAAGACA-3’和5’-ATATAGACA-3’，平衡结合常数 Ka＝2×1010摩尔/升-1和Ka＝8×109摩尔/升-1。限制片断上的其它位点在低 亲和力结合。为了比较，六环发夹聚酰胺ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β- 丙氨酸-Dp结合5’-aaaaAGACA-3’和5’-atatAGACA-3’，结合常数分别为 Ka＝5×107M-1和Ka＝9×107M-1。

相对于六环聚酰胺ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-Dp，九环聚 酰胺ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp结合5’- AAAAAGACA-3’和5’-ATATAGACA-3’，分别具有400倍和100倍更高 的亲和力。最近已有报道不同的系统中同样的结合增强(Trauger等人， 自然，1996，382，559-561)。利用β-丙氨酸接头的C末端PyPyPy亚基 的加入是增强结合邻近(A，T)4序列的发夹聚酰胺的DNA结合亲和力的有 效策略。

聚酰胺ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-PyPyPy-G-Dp以高亲和 力结合存在于247bp限制片断上的几个错配位点。以相对于最佳匹配位 点5’-AAAAAGACA-3’(标明了形式上错配的碱基对)至少减少5倍的亲 和力与两个最高亲和力错配位点，5’-GAATTCACT-3’(Ka＝4.5×109M-1) 和5’-GTTTTCCCA-3’(Ka＝2.5×109M-1)结合，虽然由于最佳匹配位点的 非常高的平衡结合常数是不确定的，这一值可能是低限。相比之下，相 对于单个碱基对错配位点5’-ATTCA-3’和5’-TTACA-3’，六环聚酰胺 ImPyPy-γ-氨基丁酸-ImPyPy-β-丙氨酸-Dp与匹配位点5’-AGACA-3’的结 合强10倍。 实施例3：具有单个错配差异的亚纳摩尔配体结合

评估两个八环发夹聚酰胺ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Dp(1)和 ImPyPyPy-γ-PyPyPyPy-β-Dp(2)的DNA结合亲和力，它们的区别是单个 的氨基酸，对两个6碱基对(bp)靶位点，5’-AGTACT-3’和5’-AGTATT-3’， 它们的区别在于单个碱基对。根据聚酰胺DNA复合物的配对规律，位 点5’-AGTACA-3’和5’-AGTATT-3’分别是聚酰胺1“配对”和“单个碱 基对错配”位点，和聚酰胺2分别是“单个碱基对错配”和“匹配”位 点(图2)。

通过固体相方法合成聚酰胺1和2，通过逆相HPLC纯化(Baird和 Dervan，美国化学学会杂志，1996，118，6141-6146)。通过1H NMR， MALDI-TOF MS，和分析HPLC证实聚酰胺的身份和纯度。MALDI-TOF MS：1，1223.4(计算M+H，1223.3)；2，12223(计算M+H为1222.3)。通 过定量DNaseI步迹滴定实验(Galas和Schmits，核酸研究，1978，5 3157- 3170；Fox和Waring，相同杂志，1984，12，9271-9285；Brenowitz等，酶学 方法，1986，130，132-181)(表1)确定在3’-32P标记的229bp限制片断上含 有匹配和错配的六碱基对结合位点的1和2的复合物的平衡结合常数。

                   表1平衡结合常数(M-1)

          结合位点               1                  2

      5’-ttAGTACTtg-3’    3.7×1010(0.8)    5.0×108(0.5)

      5’-ttAGTATTtg-3’    4.1×108(0.5)     3.5×109(0.8) 报道的结合常数是从三个DNaseI步迹滴定实验获得的平均值。在圆括 号中标明了每个数据组的标准偏差。在存在10毫摩尔/升Tris-HCl，10 毫摩尔/升KCl，10毫摩尔/升MgCl2，和5毫摩尔/升CaCl2，在pH7.0和 22℃时进行测试。六个碱基对结合位点是大写的字母，侧接的序列是小 写的字母。

聚酰胺1在0.03纳摩尔/升的浓度结合它的匹配位点5’-AGTACT-3’， 以接近100倍低的亲和力结合它的单个碱基对错配位点5’-AGTATT-3’。 聚酰胺2在0.3纳摩尔/升浓度结合它的指定的匹配位点5’-AGTATT-3’， 以接近10倍低的亲和力结合它的单个碱基对错配位点5’-AGTACT-3’。 1和2对它们各自的匹配位点的特异性来自非常小的结构变化。在1中 用C-H(如2中)替代单个氮原子降低聚酰胺●5’-AGTACT-3’复合物的亲 和力约75倍，表示自由能的差异是约2.5千卡(kcal)/摩尔。同样，在2 中利用N替代C-H(正如在1中)降低聚酰胺●5’-AGTATT-3’复合物的亲 和力约10倍，失去了结合能约13千卡/摩尔。

利用聚酰胺1和2在3’-32P标记的229bp pJT8 AflII/FspI限制片断上 进行定量DNaseI步迹滴定实验。比较道是A和G序列道；在缺乏聚酰 胺时获得的DNaseI消化产物；分别在存在1皮摩尔/升，2皮摩尔/升，5 皮摩尔/升，10皮摩尔/升，15皮摩尔/升，25皮摩尔/升，40皮摩尔/升， 65皮摩尔/升，0.1纳摩尔/升，0.15纳摩尔/升，0.25纳摩尔/升，0.4纳摩 尔/升，0.65纳摩尔/升，1纳摩尔/升，2纳摩尔/升，5纳摩尔/升，和10 纳摩尔/升聚酰胺时得到的消化产物；和完整的DNA。对5’-AGTACT-3’ 和5’-AGTATT-3’确定聚酰胺结合位点的结合常数。没有分析的其它位 点是5’-TGTAAA-3’，5’-TGTGCT-3’和5’-TAAGTT-3’。在总体积400 微升中进行所有反应。在含有放射性限制片断的测试缓冲液中加入聚酰 胺储备液或H2O，使溶液最终条件是10毫摩尔/升Tris-HCl，10毫摩尔/升 KCl，10毫摩尔/升MgCl2，5毫摩尔/升CaCl2，和pH7.0。在步迹反应启动之 前在22℃平衡溶液12-15小时。如其它文献所述(11 Mrkisch等人，美国 化学学会杂志，1994，116，7983-7988)进行步迹反应，裂解产物的分离，和 数据分析。通过杂交两个5’磷酸互补低聚核苷酸，5’- CCGGTTAGTATTTGGATGGGCCTGGTTAGTACTTGGATGGGAGACCG CCTGGGAATACCAGGTGTCGTATCTTAAGAG-3’和5’- TCGACTCTTAAGATACGACACCTGGTATTCCCAGGCGGTCTCCCATC CAAGTACTAACCAGGCCCATCCAAATACTAA-3’制备质粒pJT8，将得 到的双螺旋连接到大pUC19 AvalI/SalI限制片断。 实施例4：细胞内结合和转录抑制 方法

聚酰胺：通过固体相方法(Baird，E.E.，和Dervan，P.B.，美国化学学会杂 志118，6141-6146(1996))合成聚酰胺。通过1H NMR，基质辅助激光吸收/ 飞行质量光谱(flight mass spectrometry)的离子化时间(MALEI-TOF-MS)和 分析的HPLC证实聚酰胺的身份和纯度。MALEI-TOF-MS：1，1223.4(计 算M+H为1223.3)，2，1222.3(计算M+H为1222.3)；3，1223.1(计算 M+H为1223.3)。 体外转录抑制。如文献所述(Hartl，P.等人，细胞生物学杂志，120，613- 624(1993))制备从未受精的非洲爪蟾卵提取高速细胞质提取物。用于转 录的DNA模板包含在质粒pX1s11(Peterson，R.C.等人，细胞20，131- 144(1980))(每反应50纳克)的体细胞类型5S RNA基因和包含在质粒 pTyrD(Stutz，F.等人，Genes Dev.3，1190-1198(1989))中的tyrD tRNA(每个 反应100纳克质粒DNA)，两个都来自X.laevis。转录反应物(20微升最 终体积)含有下面的成分：2.5微升提取物，9纳克(12纳摩尔/升)从成熟 卵母细胞(Smith，D.R.等人，细胞37，645-652(1984))分离的TFIIIA，0.6 毫摩尔/升ATP，UTP，CTP，0.02毫摩尔/升GTP和10微居里[α-32P]GTP 和最后缓冲液成分12毫摩尔/升HEPES(pH7.5)，60毫摩尔/升KCl，6毫 摩尔/升MgCl2，25微摩尔/升ZnCl2，和8％(v/v)甘油。在TFIIIA和其它 反应成分加入之前，在同样的缓冲液中将聚酰胺预与质粒DNA进行温 浴。在变性的6％聚丙烯酰胺凝胶上纯化和分析RNA。将装备ImageQuant 软件的Molecular Dynamics PhosphorImager用于定量聚酰胺对5S和tRNA 基因转录的影响。 体内转录抑制：在25cm2的培养烧瓶中，在含有10％(v/v)小牛血清的 Dulbecco改良的Eagle培养基中，在环境温度下生长来自非洲爪蟾肾起 源的细胞系的成纤维细胞(P.Labhart，Scripps提供)。在培养基中加入聚酰 胺之前将细胞最少传代3天。在连续温育不同的时间，通过低渗裂解制 备核，并且如文献所述(Schlissel，M.S.和Brown，D.D.，细胞，37，903- 913(1984))将其用作转录的模板。通过测量1％(w/v)十二烷基硫酸钠中 分离的核的等分试样的吸光值确定DNA含量(利用1AU＝50微克/毫升 DNA，在260纳米的消光系数)。缓冲液成分和标记和未标记的核苷三 磷酸与质粒转录反应相同。在反应物中添加了从非洲爪蟾卵母细胞 (Roeder，R.G.，生物化学杂志，258，1932-1941(1983))中分离的2微升RNA 聚合酶III(大约50微克/毫升)。 结果

检测了聚酰胺1(ImPyPyPy-γ-ImPyPyPy-β-Dp)对TFIIIA与从含有5S RNA基因的质粒分离的限制片断结合的影响。Zf1-3，一种缺乏指结构 的重组TFIIIA类似物，在C-模块启动子元件的大沟中结合(参见图1)。 DNaseI步迹证明zf1-3和聚酰胺1可以共同占据同样的DNA分子。当5 纳米/升聚酰胺1与同样的DNA靶预温育，9个指结构的TFIIIA的结合 抑制了＞90％。zf1-3和全长TFIIIA的不同的抑制提供了指结构4与小沟 相互作用或定位在小沟中的证据。聚酰胺1没有抑制TFIIIA与5S RNA 的结合。

在存在逐渐增高浓度的聚酰胺1(10-60纳摩尔/升)时检测体外系统中 5S RNA基因的转录。在这些实验中，在加入外源TFIIIA(12纳摩尔/升) 和起源于未受精非洲爪蟾卵的粗提取物之前，在含有5S RNA基因的质 粒中加入聚酰胺1。作为对照，在这些反应中在另一个质粒上包括了酪 氨酸tRNA基因。tRNA基因具有1的上游结合位点，但缺乏预测的蛋 白质-聚酰胺相互作用。两个基因在这一系统中单独地或在混合的模板反 应物中都进行活跃的转录。加入60纳摩尔/升聚酰胺1抑制了＞80％的5S 基因转录。在有效抑制5S RNA所需要的聚酰胺1的浓度时观察到只有 小程度的tRNA转录的非特异抑制。对靶5S RNA抑制的有效性比对照 tRNA基因抑制高约10倍。错配聚酰胺2(ImPyPyPy-γ-PyPyPyPy-β-Dp) 和3(ImPyImPy-γ-PyPyPyPy-β-Dp)在直至达到60纳摩尔/升的浓度时还没 有抑制5S RNA的转录。如果TFIIIA-DNA复合物首先形成，加入30纳 摩尔/升聚酰胺1，在加入卵提取物之前温育混合物90分钟，也观察到5S RNA转录的有效抑制(80％)。较短的温育时间导致较低的抑制。所需要 的90秒温育时间相似于测量的TFIIIA-DNA复合物的半衰期，并且表 明聚酰胺1比TFIIIA与DNA形成更稳定的复合物。

检测聚酰胺在体内对5S基因转录的影响。将非洲爪蟾肾起源的成纤 维细胞在培养基中存在逐步提高的浓度的聚酰胺1时生长不同的时间。 如果生长被限定在72小时之内，通过细胞密度进行测量的，我们发现 聚酰胺的浓度直至达到1微摩尔/升时是没有毒性的。通过低渗裂解从细 胞制备核，将等当量的从对照分离的核和处理细胞分离的核用作利用外 源RNA聚合酶III和标记的和未标记的核苷酸三磷酸转录的模板。这一 实验检测具有活跃转录复合物的III类基因的占据率(Schlissel，M.S.，细胞， 同上文献)。因为重复5S基因在变性聚丙烯酰胺凝胶上产生一个明显的 带，可以容易地评估5SRNA的转录。在凝胶上进行放射自显影，从观 察到的放射自显影得到如下的结果。

低至100纳摩尔/升的聚酰胺1的浓度对5S转录具有显著的和选择性 的效果。在较高的聚酰胺浓度时，观察到在核转录活性的总的下降；但 是，在测试的每个浓度中，该聚酰胺的影响对5S RNA转录比对tRNA 转录更大。由于已经观察到用1微摩尔/升聚酰胺1可以获得接近最大的 5S转录的抑制，我们检测了在存在聚酰胺下细胞生长了不同时间后的核 转录。在与聚酰胺1在1微摩尔/升浓度下温浴0时间时没有观察到抑制， 表明转录复合物的离散不是发生在细胞核的分离或操作的过程中或之 后。当细胞与聚酰胺1接触24，48或72小时时，观察到了统计学上相 同水平的5S转录。

这些观察结果支持了聚酰胺1能够进入细胞，转移到核并且裂解染 色体5S RNA基因上的转录复合物这样的结论。为了排除观察到的抑制 是由于聚酰胺的一些非特异性毒性而不是与5SRNA基因的直接结合这 样一种可能性，检测了错配聚酰胺2和3在核转录测试中的作用。用1 微摩尔/升的培养基中的错配聚酰胺2或3，24小时时观察到相对于tRNA 合成对5S RNA合成仅具有很小的影响。这一结果表明利用高浓度的聚 酰胺1观察到的总的转录的抑制可能是体内5S RNA合成抑制的次级效 应，而不是非特异性聚酰胺相互作用的结果。聚酰胺2可以使体外和体 内的5SRNA转录有很小的上升，表明聚酰胺可在某些情况下能够上调 转录。

正如上面的结果表明，本发明提供了新化合物，该化合物是有机环 基团特别是吡咯的低聚物，其中该化合物在小沟中与双链DNA配合， 并且提供氢键结合，极性相互作用，和范德瓦氏相互作用，产生高的亲和 力和高的结合常数。

本发明的组合物提供了在靶序列和单个错配序列之间的显著的差 异。通常，在两个序列之间至少有两倍的差异，优选至少5倍的差异， 和更优选至少10倍或更大的差异。以这样的方式，可以保证靶序列将 受到最大的影响，而对其它序列的影响较小。通常，靶序列将至少为5 个核苷酸，通常至少6个核苷酸，优选至少8个核苷酸，不超过约20 个核苷酸。通过利用组合物的联合，其中该联合物与不同的序列序列结 合，这些不同的序列可以是相互邻近，可以进一步增强特定的基因的抑 制。

本发明的组合物显示以高亲和力结合特异的双链DNA序列，和以显 著低的亲和力结合单个碱基错配序列。以这样的方式，甚至在双链DNA 的复杂组合物中，正如在细胞组合物中可以遇到的的那样，基本可以保 证靶序列将受到影响，而其它序列将受到较小的影响。另外，本发明的 组合物能够跨膜运输，通过胞质到核。本发明的组合物能够结合参与核 小体的染色体双链DNA，并且抑制与本发明的组合物形成复合物的基 因的转录。可以利用单个低聚物或低聚物的联合以便形成所需的复合 物。如果在诊断中利用本发明的组合物，不需要熔化DNA得到单链 DNA。而且，本发明的组合物可以准确地靶击双链DNA，并避免了现 在常规应用中的天然链和标记互补链之间的熔化和竞争。本发明的组合 物可以用于在特定的位点裂解双链DNA，从而分离靶DNA，然后可以 利用PCR容易地扩增。通过进一步修饰本发明的组合物，可以进一步 扩展它们在鉴定序列，裂解特异序列，研究基因的作用，筛选细胞中序 列的存在和抑制细胞的增殖中的应用。

本说明书中叙述的参考文献全部引入本文作为参考。

现在已经完全叙述了本发明，对本领域的一个技术人员来说，可以 对本发明进行很多的变化和改进而不脱离本发明的精神和范围。