一、技术领域
[0001] 本
发明属于谷物蛋白利用技术领域，具体涉及以谷物蛋白
水解液分离的巯基短肽制备金属螯合物的方法。二、背景技术
[0002] 在我国，谷物加工过程中产生的副产品含有丰富的
蛋白质。包括大米、小麦、玉米、大豆等谷物的加工副产物主要用作动物
饲料，造成了蛋白质极大的浪费。谷物蛋白中不溶于水及中性盐溶液，可溶于70～90％
乙醇溶液的蛋白质被称为醇溶蛋白。醇溶蛋白仅存在于谷物中，疏水性高，具有很强的耐热性和耐脂性。在医药领域，常用作为
控释制剂、微球等新剂型的药用辅料；在食品工业中，醇溶蛋白可以作为被膜剂，延长食品
货架期。但因其缺少赖
氨酸、
色氨酸等人体必需氨基酸，故而
生物学价值低，应用范围窄。因此有必要增强对醇溶蛋白的深加工和综合利用的研究与开发。
[0003] 醇溶蛋白水解所得的巯基短肽含有大量游离巯基，可与有空轨道的
金属离子形成配位键，即形成螯合物。短肽微量元素螯合物具有生物化学
稳定性好、易消化吸收、生物学价值高的优点。巯基作为自由基清除剂，清除自由基(·OH)的能
力约为超
氧化物歧化酶(SOD)的几千倍，抗氧化活性极强。将巯基短肽类螯合物用做保健品，既补充了人体所需微量金属元素，同时也补充了氨基酸营养。所以，利用谷物醇溶蛋白水解、分离获得的巯基短肽与人体必需金属元素螯合，制备出的巯基短肽-金属螯合物有着重要的科学价值和广阔的市场前景。
[0004] 现有制备巯基短肽的方法，如
申请号为201310216676.X、名称为“一种小分子水解玉米短肽和高巯基肽的制备方法”的发明
专利，该专利公开的方法是：用玉米蛋白粉为原料，制备出玉米蛋白粉胶体液，再经阴离子交换
树脂交换、酶水解反应，最终过滤、洗脱、浓缩和冻干，最终制得巯基短肽。该方法存在的主要问题是：1.在巯基交换时选用了阴离子交换树脂，羧基等其他阴离子同巯基进行竞争交换，巯基
吸附率低；2.阴离子交换树脂在洗脱与活化过程中，所产生的酸
碱废液多；3.本方法只阐述了巯基短肽的制备方法，缺乏巯基短肽的应用研究。
[0005] 现有制备金属螯合物的方法，如申请号为200610088997.6、名称为“氨基酸短肽螯合物及其制备方法”的发明专利，该专利公开的方法是：以天冬氨酸短肽和谷氨酸短肽为原料，与
金属化合物螯合，经过滤、重结晶进行提纯精制处理，最终制得氨基酸短肽螯合物。该方法存在的主要问题是：短肽螯合物中仅含天冬氨酸或谷氨酸，仅靠氨基酸的羰基氧
原子螯合配位金属离子，螯合作用力单一，全部解离的pH区间窄，瞬间即解离出高浓度的金属离子，引发金属中毒反应等安全问题；天冬氨酸和谷氨酸均为酸性氨基酸，可能形成偏离
机体所需的低pH环境，既不利于代谢的正常进行，还可能导致局部酸中毒；此外，天冬氨酸和谷氨酸均为非必需氨基酸，不能为机体提供氨基酸营养。因此，该短肽-金属螯合物的功能性差。三、发明内容
[0006] 本发明的目的是针对现有谷物蛋白粉利用率低的
缺陷，提供一种制备巯基短肽金属螯合物的方法。该方法具有充分利用资源，反应条件温和、操作步骤简单实用、产品应用广泛、环保无污染等特点。
[0007] 本发明的原理是：谷物蛋白粉中含有大量的醇溶蛋白，在酶的作用下可以水解成短肽。水解醇溶蛋白中的二硫键在弱酸性条件下还原生成游离巯基，该巯基与巯基树脂可形成二硫键，从而与其它短肽分离。经过纯化即获得巯基短肽。巯基硫原子的孤对
电子在适宜条件下与金属离子的外层空轨道配位，形成巯基短肽金属螯合物。
[0008] 实现本发明的技术方案是：一种制备巯基短肽金属螯合物的方法，该方法以谷物蛋白粉为原料，通过制备水解谷蛋白液、制备水解谷蛋白短肽溶液、制备ZnCl2水溶液、制备巯基短肽金属螯合物溶液、制备巯基短肽金属螯合物冻干粉共5个步骤制备出巯基短肽金属螯合物。所述方法具体步骤如下：
[0009] 1.制备水解谷蛋白液
[0010] 取麦蛋白粉或玉米蛋白粉或大米蛋白粉，用
粉碎机粉碎后过60～120目的
振动筛。分别收集过筛物和未过筛物，对收集的未过筛物，送入粉碎机中重新
破碎；对收集的过筛物，按照过筛物
质量(kg)与纯净
水体积(L)之比为1∶10～20的比例，在搅拌下分散至纯净水中，再用稀NaOH溶液调节pH值至8.5～10.5；接着在搅拌下升温至50～65℃，加入诺维信碱性蛋白酶Alcalase 3.0T进行一级酶水解1.5～2h，其中诺维信碱性蛋白酶Alcalase 3.0T与过筛物质量(kg)之比为1∶30～50。一级酶水解完成后，用稀HCl溶液调节pH值至5～6.5，维持
温度与一级酶水解反应温度相同，加入木瓜蛋白酶进行二级酶水解1.5～2h，其中木瓜蛋白酶与过筛物质量(kg)之比为1∶30～50的比例。水解反应完成后放料入碟式分离机中，在6000～8000r/min的转速下进行离心分离。分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心沉淀，干燥后粉碎，用做饲料蛋白添加剂；对收集的离心清液，即为水解谷蛋白液，用于下一步制备水解谷蛋白短肽溶液。
[0011] 2.制备水解谷蛋白短肽溶液
[0012] 第(1)步完成后，先将第(1)步收集的水解谷蛋白液
泵入截留分子量为1000～3000Da的纳滤器中，在表压为0.05～0.2MPa下进行第一次纳滤，直至第一次纳滤截留液体积降低至水解谷蛋白液体积的1/10～1/20时止。分别收集第一次纳滤截留液和第一次纳滤滤过液，对收集的第一次纳滤截留液，含溶解性
淀粉和蛋白质，与第(1)步收集的离心沉淀合并，干燥后用于饲料蛋白添加剂；对于收集的第一次纳滤滤过液，再次泵入截留分子量为100～500Da的纳滤器中，在表压为0.05～0.2MPa下进行第二次纳滤，直至第二次纳滤截留液体积降低至第一次纳滤滤过液体积的1/10～1/20时止。分别收集第二次纳滤截留液和第二次纳滤滤过液，对于收集的第二次纳滤滤过液，含无机盐离子和小分子肽，用于日用
化妆品中的营养成分；对收集的第二次纳滤截留液，即为水解谷蛋白短肽溶液。
[0013] 3.制备ZnCl2水溶液
[0014] 第(2)步完成后，按照锌粉质量(kg)与体积浓度为2～10％的HCl溶液体积(L)之比为1∶10～20的比例，将锌粉投入到体积浓度为2～10％的HCl溶液中，搅拌下溶解1～3h，再
真空过滤，收集滤液并用纯净水稀释至Zn浓度为0.1～0.5mol/L时止，就制备出ZnCl2水溶液，用于下一步制备巯基短肽金属螯合物溶液。
[0015] 4.制备巯基短肽金属螯合物溶液
[0016] 第(2)步和第(3)步完成后，先将第(2)步制备的水解谷蛋白短肽溶液泵入装有活化ZXC610硫脲树脂或申请号为201510044783.8、名称为“一种制备巯基修饰壳聚糖浅孔微球的方法”的发明专利所公开制备的浅孔微球状巯基乙胺改性壳聚糖微球的层析柱中，进行交换分离。其中ZXC610硫脲树脂和浅孔微球状巯基乙胺改性壳聚糖微球统称为巯基交换树脂，巯基交换树脂体积(L)与水解谷蛋白短肽溶液体积(L)之比为1∶20～40，水解谷蛋白短肽溶液的泵入流速为1～4倍层析柱体积(BV)/h。分别收集过柱液和交换有巯基短肽的层析柱，对收集的过柱液，进行减压浓缩，用于制备发用
植物水解蛋白浓缩液；对于收集的交换有巯基短肽的层析柱，先用1～2BV纯净水洗涤，分别收集洗涤液和经洗涤后的层析柱，对收集的纯净水洗涤液，与收集的过柱液合并后用于制备发用植物水解蛋白浓缩液；对于收集的经洗涤后的层析柱，用2～4BV、锌浓度为0.1～0.5mol/L的ZnCl2水溶液、以1～4BV/h的流速进行洗脱，分别收集洗脱液和经该ZnCl2水溶液洗脱的层析柱，对收集的洗脱液，即为巯基短肽金属螯合物溶液，用于下一步制备巯基短肽金属螯合物冻干粉；对于收集的经该ZnCl2水溶液洗脱的层析柱，再用2～5BV的、浓度为0.05～0.15mol/L的HCl溶液，以1～4BV/h的速度进行再生。分别收集再生过柱液和经再生后的层析柱，对收集的再生过柱液，用于再次溶解锌粒，制备浓度为0.1～0.5mol/L的ZnCl2水溶液；对于收集的经再生后的层析柱，用于下批次交换巯基短肽。
[0017] 5.制备巯基短肽金属螯合物冻干粉
[0018] 第(4)步完成后，将第(4)步制备的巯基短肽金属螯合物溶液置于恒温夹层反应器中，在温度为55～65℃，pH值为3～6的条件下，进行螯合反应6～8h。反应完成后，将该螯合液置于截留分子量为100～500Da的
透析机中，进行透析纯化3～8h，分别收集截留液与透过液；对收集的透过液，泵入
反渗透器中，在表压为0.2～0.4MPa条件下进行反渗透浓缩，直至透过液体积降低至原体积的1/10～1/20时止，即制备出稀ZnCl2溶液，用于制备下批次浓度为0.1～0.5mol/L的ZnCl2水溶液；对收集的截留液，置于温度为-45～-55℃，绝对真空度为35～45Pa的条件下
冷冻干燥36～48h，即制备出巯基短肽金属螯合物冻干粉，纯度达90％以上。
[0019] 采用上述技术方案后，主要有以下效果：
[0020] 1.本发明方法以谷物蛋白粉为原料制备出含八种必需氨基酸的巯基短肽，再通过螯合反应及透析机透析，制备出配体和中心离子配比恒定的巯基短肽金属螯合物；克服其它类似物配体和中心离子配比不恒定、氨基酸营养差的缺陷。该螯合物既可稳定提供微量金属离子，还可供给必需氨基酸营养，功能性强。
[0021] 2.本发明方法利用巯基树脂产生的HCl溶液溶解Zn粉，制备出ZnCl2溶液，同回收透析滤过液中的ZnCl2合并，重新用于巯基短肽金属螯合物的制备，不仅显著降低了原料消耗，还消除了废液对环境的污染，无“三废”排放，有利于生产持续发展，符合“节能减排”的绿色生产技术。
[0022] 3.本发明方法使用的原料谷物蛋白粉为市售产品，来源广泛，价格低廉，利用率低，而制备出的巯基短肽金属螯合物可广泛应用于
营养保健品与日用化妆品方面，附加值大大提高；本发明方法将分离巯基短肽剩余的过柱液进行浓缩，制备出附加值较高的发用植物水解蛋白浓缩液，同时将水解液与离心沉淀等烘干，制成饲料添加剂，实现了农副产品的综合利用和深度加工，生产综合成本降低。
[0023] 4.本发明方法的生产过程均在常温常压下进行，无危险，生产设备通用，操作简便，生产周期短，便于推广应用。
[0024] 四、具体实施方法
[0025] 结合具体实施方法，进一步说明本发明。
[0027] 一种制备巯基短肽金属螯合物的方法，其具体步骤如下：
[0028] 1.制备水解谷蛋白液
[0029] 取麦蛋白粉或玉米蛋白粉或大米蛋白粉，用粉碎机粉碎后过60目的振动筛。分别收集过筛物和未过筛物，对收集的未过筛物，送入粉碎机中重新破碎；对收集的过筛物，按照过筛物质量(kg)与纯净水体积(L)之比为1∶10的比例，在搅拌下分散至纯净水中，再用稀NaOH溶液调节pH值至8.5；接着在搅拌下升温至50℃，加入诺维信碱性蛋白酶Alcalase 3.0T进行一级酶水解1.5h，其中诺维信碱性蛋白酶Alcalase 3.0T与过筛物质量(kg)之比为1∶30。一级酶水解完成后，用稀HCl溶液调节pH值至5，维持温度与一级酶水解反应温度相同，加入木瓜蛋白酶进行二级酶水解1h，其中木瓜蛋白酶与过筛物质量(kg)之比为1∶30的比例。水解反应完成后放料入碟式分离机中，在6000r/min的转速下进行离心分离。分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心沉淀，干燥后粉碎，用做饲料蛋白添加剂；对收集的离心清液，即为水解谷蛋白液，用于下一步制备水解谷蛋白短肽溶液。
[0030] 2.制备水解谷蛋白短肽溶液
[0031] 第(1)步完成后，先将第(1)步收集的水解谷蛋白液泵入截留分子量为1000Da的纳滤器中，在表压为0.05MPa下进行第一次纳滤，直至第一次纳滤截留液体积降低至水解谷蛋白液体积的1/10时止。分别收集第一次纳滤截留液和第一次纳滤滤过液，对收集的第一次纳滤截留液，含溶解性淀粉和蛋白质，与第(1)步收集的离心沉淀合并，干燥后用于饲料蛋白添加剂；对于收集的第一次纳滤滤过液，再次泵入截留分子量为100Da的纳滤器中，在表压为0.05MPa下进行第二次纳滤，直至第二次纳滤截留液体积降低至第一次纳滤滤过液体积的1/10时止。分别收集第二次纳滤截留液和第二次纳滤滤过液，对于收集的第二次纳滤滤过液，含无机盐离子和小分子肽，用于日用化妆品中的营养成分；对收集的第二次纳滤截留液，即为水解谷蛋白短肽溶液。
[0032] 3.制备ZnCl2水溶液
[0033] 第(2)步完成后，按照锌粉质量(kg)与体积浓度为2％的HCl溶液体积(L)之比为1∶10的比例，将锌粉投入到体积浓度为2％的HCl溶液中，搅拌下溶解1h，再真空过滤，收集滤液并用纯净水稀释至Zn浓度为0.1mol/L时止，就制备出ZnCl2水溶液，用于下一步制备巯基短肽金属螯合物溶液。
[0034] 4.制备巯基短肽金属螯合物溶液
[0035] 第(2)步和第(3)步完成后，先将第(2)步制备的水解谷蛋白短肽溶液泵入装有活化ZXC610硫脲树脂或申请号为201510044783.8、名称为“一种制备巯基修饰壳聚糖浅孔微球的方法”的发明专利所公开制备的浅孔微球状巯基乙胺改性壳聚糖微球的层析柱中，进行交换分离。其中ZXC610硫脲树脂和浅孔微球状巯基乙胺改性壳聚糖微球统称为巯基交换树脂，巯基交换树脂体积(L)与水解谷蛋白短肽溶液体积(L)之比为1∶20，水解谷蛋白短肽溶液的泵入流速为1倍层析柱体积(BV)/h。分别收集过柱液和交换有巯基短肽的层析柱，对收集的过柱液，进行减压浓缩，用于制备发用植物水解蛋白浓缩液；对于收集的交换有巯基短肽的层析柱，先用1BV纯净水洗涤，分别收集洗涤液和经洗涤后的层析柱，对收集的纯净水洗涤液，与收集的过柱液合并后用于制备发用植物水解蛋白浓缩液；对于收集的经洗涤后的层析柱，用2BV、锌浓度为0.1mol/L的ZnCl2水溶液、以1BV/h的流速进行洗脱，分别收集洗脱液和经该ZnCl2水溶液洗脱的层析柱，对收集的洗脱液，即为巯基短肽金属螯合物溶液，用于下一步制备巯基短肽金属螯合物冻干粉；对于收集的经该ZnCl2水溶液洗脱的层析柱，再用2BV的、浓度为0.05mol/L的HCl溶液，以1BV/h的速度进行再生。分别收集再生过柱液和经再生后的层析柱，对收集的再生过柱液，用于再次溶解锌粒，制备浓度为0.1mol/L的ZnCl2水溶液；对于收集的经再生后的层析柱，用于下批次交换巯基短肽。
[0036] 5.制备巯基短肽金属螯合物冻干粉
[0037] 第(4)步完成后，将第(4)步制备的巯基短肽金属螯合物溶液置于恒温夹层反应器中，在温度为55℃，pH值为3的条件下，进行螯合反应6h。反应完成后，将该螯合液置于截留分子量为100Da的透析机中，进行透析纯化3h，分别收集截留液与透过液；对收集的透过液，泵入反渗透器中，在表压为0.2MPa条件下进行反渗透浓缩，直至透过液体积降低至原体积的1/10时止，即制备出稀ZnCl2溶液，用于制备下批次浓度为0.1mol/L的ZnCl2水溶液；对收集的截留液，置于温度为-45℃，绝对真空度为35Pa的条件下冷冻干燥36h，即制备出巯基短肽金属螯合物冻干粉，纯度达90％以上。
[0038] 实施例2
[0039] 一种制备巯基短肽金属螯合物的方法，其具体步骤如下：
[0040] 1.制备水解谷蛋白液
[0041] 取麦蛋白粉或玉米蛋白粉或大米蛋白粉，用粉碎机粉碎后过120目的振动筛。分别收集过筛物和未过筛物，对收集的未过筛物，送入粉碎机中重新破碎；对收集的过筛物，按照过筛物质量(kg)与纯净水体积(L)之比为1∶20的比例，在搅拌下分散至纯净水中，再用稀NaOH溶液调节pH值至10.5；接着在搅拌下升温至65℃，加入诺维信碱性蛋白酶Alcalase 3.0T进行一级酶水解2h，其中诺维信碱性蛋白酶Alcalase 3.0T与过筛物质量(kg)之比为1∶50。一级酶水解完成后，用稀HCl溶液调节pH值至6.5，维持温度与一级酶水解反应温度相同，加入木瓜蛋白酶进行二级酶水解2h，其中木瓜蛋白酶与过筛物质量(kg)之比为1∶50的比例。水解反应完成后放料入碟式分离机中，在8000r/min的转速下进行离心分离。分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心沉淀，干燥后粉碎，用做饲料蛋白添加剂；对收集的离心清液，即为水解谷蛋白液，用于下一步制备水解谷蛋白短肽溶液。
[0042] 2.制备水解谷蛋白短肽溶液
[0043] 第(1)步完成后，先将第(1)步收集的水解谷蛋白液泵入截留分子量为3000Da的纳滤器中，在表压为0.2MPa下进行第一次纳滤，直至第一次纳滤截留液体积降低至水解谷蛋白液体积的1/20时止。分别收集第一次纳滤截留液和第一次纳滤滤过液，对收集的第一次纳滤截留液，含溶解性淀粉和蛋白质，与第(1)步收集的离心沉淀合并，干燥后用于饲料蛋白添加剂；对于收集的第一次纳滤滤过液，再次泵入截留分子量为500Da的纳滤器中，在表压为0.2MPa下进行第二次纳滤，直至第二次纳滤截留液体积降低至第一次纳滤滤过液体积的1/20时止。分别收集第二次纳滤截留液和第二次纳滤滤过液，对于收集的第二次纳滤滤过液，含无机盐离子和小分子肽，用于日用化妆品中的营养成分；对收集的第二次纳滤截留液，即为水解谷蛋白短肽溶液。
[0044] 3.制备ZnCl2水溶液
[0045] 第(2)步完成后，按照锌粉质量(kg)与体积浓度为10％的HCl溶液体积(L)之比为1∶20的比例，将锌粉投入到体积浓度为10％的HCl溶液中，搅拌下溶解3h，再真空过滤，收集滤液并用纯净水稀释至Zn浓度为0.5mol/L时止，就制备出ZnCl2水溶液，用于下一步制备巯基短肽金属螯合物溶液。
[0046] 4.制备巯基短肽金属螯合物溶液
[0047] 第(2)步和第(3)步完成后，先将第(2)步制备的水解谷蛋白短肽溶液泵入装有活化ZXC610硫脲树脂或申请号为201510044783.8、名称为“一种制备巯基修饰壳聚糖浅孔微球的方法”的发明专利所公开制备的浅孔微球状巯基乙胺改性壳聚糖微球的层析柱中，进行交换分离。其中ZXC610硫脲树脂和浅孔微球状巯基乙胺改性壳聚糖微球统称为巯基交换树脂，巯基交换树脂体积(L)与水解谷蛋白短肽溶液体积(L)之比为1∶40，水解谷蛋白短肽溶液的泵入流速为4倍层析柱体积(BV)/h。分别收集过柱液和交换有巯基短肽的层析柱，对收集的过柱液，进行减压浓缩，用于制备发用植物水解蛋白浓缩液；对于收集的交换有巯基短肽的层析柱，先用2BV纯净水洗涤，分别收集洗涤液和经洗涤后的层析柱，对收集的纯净水洗涤液，与收集的过柱液合并后用于制备发用植物水解蛋白浓缩液；对于收集的经洗涤后的层析柱，用4BV、锌浓度为0.5mol/L的ZnCl2水溶液、以4BV/h的流速进行洗脱，分别收集洗脱液和经该ZnCl2水溶液洗脱的层析柱，对收集的洗脱液，即为巯基短肽金属螯合物溶液，用于下一步制备巯基短肽金属螯合物冻干粉；对于收集的经该ZnCT2水溶液洗脱的层析柱，再用5BV的、浓度为0.15mol/L的HCl溶液，以4BV/h的速度进行再生。分别收集再生过柱液和经再生后的层析柱，对收集的再生过柱液，用于再次溶解锌粒，制备浓度为0.5mol/L的ZnCl2水溶液；对于收集的经再生后的层析柱，用于下批次交换巯基短肽。
[0048] 5.制备巯基短肽金属螯合物冻干粉
[0049] 第(4)步完成后，将第(4)步制备的巯基短肽金属螯合物溶液置于恒温夹层反应器中，在温度为65℃，pH值为6的条件下，进行螯合反应8h。反应完成后，将该螯合液置于截留分子量为500Da的透析机中，进行透析纯化8h，分别收集截留液与透过液；对收集的透过液，泵入反渗透器中，在表压为0.4MPa条件下进行反渗透浓缩，直至透过液体积降低至原体积的1/20时止，即制备出稀ZnCl2溶液，用于制备下批次浓度为0.5mol/L的ZnCl2水溶液；对收集的截留液，置于温度为-55℃，绝对真空度为45Pa的条件下冷冻干燥48h，即制备出巯基短肽金属螯合物冻干粉，纯度达90％以上。
[0050] 实施例3
[0051] 一种制备巯基短肽金属螯合物的方法，其具体步骤如下：
[0052] 1.制备水解谷蛋白液
[0053] 取麦蛋白粉或玉米蛋白粉或大米蛋白粉，用粉碎机粉碎后过90目的振动筛。分别收集过筛物和未过筛物，对收集的未过筛物，送入粉碎机中重新破碎；对收集的过筛物，按照过筛物质量(kg)与纯净水体积(L)之比为1∶15的比例，在搅拌下分散至纯净水中，再用稀NaOH溶液调节pH值至9.5；接着在搅拌下升温至60℃，加入诺维信碱性蛋白酶Alcalase 3.0T进行一级酶水解1.5h，其中诺维信碱性蛋白酶Alcalase 3.0T与过筛物质量(kg)之比为1∶40。一级酶水解完成后，用稀HCl溶液调节pH值至5.5，维持温度与一级酶水解反应温度相同，加入木瓜蛋白酶进行二级酶水解1.5h，其中木瓜蛋白酶与过筛物质量(kg)之比为1∶40的比例。水解反应完成后放料入碟式分离机中，在7000r/min的转速下进行离心分离。分别收集离心清液和离心沉淀，对收集的离心沉淀，干燥后粉碎，用做饲料蛋白添加剂；对收集的离心清液，即为水解谷蛋白液，用于下一步制备水解谷蛋白短肽溶液。
[0054] 2.制备水解谷蛋白短肽溶液
[0055] 第(1)步完成后，先将第(1)步收集的水解谷蛋白液泵入截留分子量为2000Da的纳滤器中，在表压为0.1MPa下进行第一次纳滤，直至第一次纳滤截留液体积降低至水解谷蛋白液体积的1/15时止。分别收集第一次纳滤截留液和第一次纳滤滤过液，对收集的第一次纳滤截留液，含溶解性淀粉和蛋白质，与第(1)步收集的离心沉淀合并，干燥后用于饲料蛋白添加剂；对于收集的第一次纳滤滤过液，再次泵入截留分子量为300Da的纳滤器中，在表压为0.1MPa下进行第二次纳滤，直至第二次纳滤截留液体积降低至第一次纳滤滤过液体积的1/15时止。分别收集第二次纳滤截留液和第二次纳滤滤过液，对于收集的第二次纳滤滤过液，含无机盐离子和小分子肽，用于日用化妆品中的营养成分；对收集的第二次纳滤截留液，即为水解谷蛋白短肽溶液。
[0056] 3.制备ZnCl2水溶液
[0057] 第(2)步完成后，按照锌粉质量(kg)与体积浓度为8％的HCl溶液体积(L)之比为1∶15的比例，将锌粉投入到体积浓度为8％的HCl溶液中，搅拌下溶解2h，再真空过滤，收集滤液并用纯净水稀释至Zn浓度为0.3mol/L时止，就制备出ZnCl2水溶液，用于下一步制备巯基短肽金属螯合物溶液。
[0058] 4.制备巯基短肽金属螯合物溶液
[0059] 第(2)步和第(3)步完成后，先将第(2)步制备的水解谷蛋白短肽溶液泵入装有活化ZXC610硫脲树脂或申请号为201510044783.8、名称为“一种制备巯基修饰壳聚糖浅孔微球的方法”的发明专利所公开制备的浅孔微球状巯基乙胺改性壳聚糖微球的层析柱中，进行交换分离。其中ZXC610硫脲树脂和浅孔微球状巯基乙胺改性壳聚糖微球统称为巯基交换树脂，巯基交换树脂体积(L)与水解谷蛋白短肽溶液体积(L)之比为1∶30，水解谷蛋白短肽溶液的泵入流速为2倍层析柱体积(BV)/h。分别收集过柱液和交换有巯基短肽的层析柱，对收集的过柱液，进行减压浓缩，用于制备发用植物水解蛋白浓缩液；对于收集的交换有巯基短肽的层析柱，先用1.5BV纯净水洗涤，分别收集洗涤液和经洗涤后的层析柱，对收集的纯净水洗涤液，与收集的过柱液合并后用于制备发用植物水解蛋白浓缩液；对于收集的经洗涤后的层析柱，用3BV、锌浓度为0.3mol/L的ZnCl2水溶液、以2BV/h的流速进行洗脱，分别收集洗脱液和经该ZnCl2水溶液洗脱的层析柱，对收集的洗脱液，即为巯基短肽金属螯合物溶液，用于下一步制备巯基短肽金属螯合物冻干粉；对于收集的经该ZnCl2水溶液洗脱的层析柱，再用3.5BV的、浓度为0.1mol/L的HCl溶液，以2BV/h的速度进行再生。分别收集再生过柱液和经再生后的层析柱，对收集的再生过柱液，用于再次溶解锌粒，制备浓度为0.3mol/L的ZnCl2水溶液；对于收集的经再生后的层析柱，用于下批次交换巯基短
