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固定化 铁 螯合物酶的制备方法及应用

阅读：678发布：2020-05-13

专利汇可以提供固定化铁螯合物酶的制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明第一方面提供了固定化铁螯合物酶的制备方法，其包括以下步骤：链霉菌ATCC700974培养得到培养液；培养液离心得到菌体；用pH值为6～8的磷酸缓冲液将菌体混匀，细胞破碎得到破碎液；将破碎液离心，收集上清液得到酶液；将海藻酸钠溶解于酶液中，海藻酸钠与酶液的质量体积比为1％～4％；将含有海藻酸钠的酶液滴入质量体积比为3％～6％的氯化钙溶液中；用去离子水洗涤得到固定化小球；将固定化小球置于质量体积比为0.05％～2％的戊二醛溶液中；微波 3分钟后洗涤，得到固定化铁螯合物酶。本发明第二方面提供了固定化铁螯合物酶在铁螯合物制备中的应用。，下面是固定化铁螯合物酶的制备方法及应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.固定化铁螯合物酶的制备方法，其包括以下步骤：
(1)链霉菌ATCC700974培养得到培养液；培养液离心得到菌体；
(2)用pH值为6～8的磷酸缓冲液将所述菌体混匀，细胞破碎得到破碎液；将所述破碎液离心，收集上清液得到酶液；
(3)将海藻酸钠溶解于所述酶液中，海藻酸钠与酶液的质量体积比为1％～4％；将含有海藻酸钠的酶液滴入质量体积比为3％～6％的氯化钙溶液中；用去离子水洗涤得到固定化小球；
(4)将所述固定化小球置于质量体积比为0.05％～2％的戊二醛溶液中；微波3分钟后洗涤，得到固定化铁螯合物酶。
2.权利要求1所述的固定化铁螯合物酶的制备方法，其特征在于，所述链霉菌ATCC700974培养的培养基为：15～30g 淀粉、1～2g KH2PO4、8～12g Na2HPO4·H2O、1～5g NaCl、1～5g(NH4)2SO4、0.1～0.2g MgSO4·7H2O、0.5～1g CaCl2·2H2O、0.01～0.02g ZnSO4·7H2O，溶于1000ml去离子水中，pH值调至6.8；所述链霉菌ATCC700974培养的培养温度为28℃。
3.权利要求1所述的固定化铁螯合物酶的制备方法，其特征在于，所述链霉菌ATCC700974培养包括：在培养开始时，向每1000ml培养基中加入0.3～0.6g FeCl3·6H2O和1～10gL-鸟氨酸盐酸盐。
4.权利要求4所述的固定化铁螯合物酶的制备方法，其特征在于，所述链霉素ATCC700974培养包括：在培养72h后，向每1000ml培养液中加入0.3～0.6g FeCl3·6H2O并将培养液的pH值调至7.0。
5.权利要求1所述的固定化铁螯合物酶的制备方法，其特征在于，在氯化钙溶液中含有质量体积比为0.1～0.5％的壳聚糖。
6.用权利要求1-5任一项所述的固定化铁螯合物酶在铁螯合物制备中的应用，其特征在于，所述固定化铁螯合物酶的底物溶液是N5-乙酰基-N5-羟基鸟氨酸溶液。
7.权利要求6所述的固定化铁螯合物酶在铁螯合物制备中的应用，其特征在于，所述底物溶液的pH值为7.0。
8.权利要求6所述的固定化铁螯合物酶在铁螯合物制备中的应用，其特征在于，所述底物溶液中含有三磷酸腺苷二钠盐，所述三磷酸腺苷二钠盐与N5-乙酰基-N5-羟基鸟氨酸的摩尔比为1∶1～3∶1。
9.权利要求6所述的固定化铁螯合物酶在铁螯合物制备中的应用，其特征在于，所述底物溶液中含有FeCl3，所述FeCl3与N5-乙酰基-N5-羟基鸟氨酸的摩尔比为1∶1～1∶3。
10.权利要求6所述的固定化铁螯合物酶在铁螯合物制备中的应用，其特征在于，所述固定化铁螯合物酶在25～30℃下与底物溶液接触。

说明书全文

固定化铁 螯合物酶的制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物合成领域，具体涉及固定化铁螯合物酶的制备方法及应用。

背景技术

[0002] 铁对于几乎所有微生物都是必须的，细菌以铁鳌合物形式溶解铁离子并将其转运到胞浆而吸收利用。无论在革兰氏阳性或阴性菌，铁螯合物均是在三磷酸腺苷(ATP)依赖的转运系统下被主动摄取。由于细菌的生存对铁离子存在依赖，因此摄取铁离子存在一定的必要性，若将抗生素与铁螯合物偶联，则抗生素可利用铁螯合物而被细菌主动内吞，提高抗生素的作用效率。Albomycin则是一个利用该原理的天然抗生素，其是一个含羟基氧肟酸型铁螯合物的天然抗生素，在进入细菌菌体后，Albomycin中铁螯合物部分和硫代呋喃糖苷胞嘧啶部分分离，由硫代呋喃糖苷胞嘧啶部分发挥抗菌作用。

[0003] 利用铁螯合物将天然抗生素或合成抗生素导入细菌菌体可以避免大多数抗生素依赖被动渗透的缺陷，绕开部分耐药机理的同时可以降低抗生素的用量。铁螯合物与喹诺酮类药物的偶合物对耐药的金黄色葡萄球菌发挥了良好的抗菌作用，其MIC可低至1.0μM(Timothy AW等Bioconjug.Chem 2013，20：24(3)：473-486)。因此，制备和提取铁螯合物的研究受到越来越多的重视。我们在申请号为201410352810.3的中国发明专利中公开了铁螯合物的分离纯化方法，提出了从链霉菌的发酵液中获得铁螯合物的方法，以此为基础分析和制备铁螯合物。

发明内容

[0004] 本发明第一方面提供了固定化铁螯合物酶的制备方法，其包括以下步骤：链霉菌ATCC700974培养得到培养液；培养液离心得到菌体；用pH值为6～8的磷酸缓冲液将菌体混匀，细胞破碎得到破碎液；将破碎液离心，收集上清液得到酶液；将海藻酸钠溶解于酶液中，海藻酸钠与酶液的质量体积比为1％～4％；将含有海藻酸钠的酶液滴入质量体积比为3％～6％的氯化钙溶液中；用去离子水洗涤得到固定化小球；将固定化小球置于质量体积比为0.05％～2％的戊二醛溶液中；微波3分钟后洗涤，得到固定化铁螯合物酶。

[0005] 进一步的，链霉菌ATCC700974培养的培养基为：15～30g 淀粉、1～2g KH2PO4、8～12g Na2HPO4·H2O、1～5g NaCl、1～5g(NH4)2SO4、0.1～0.2g MgSO4·7H2O、0.5～1g CaCl2·
2H2O、0.01～0.02g ZnSO4·7H2O，溶于1000ml去离子水中，pH值调至6.8；所述链霉菌ATCC700974培养的培养温度为28℃。

[0006] 进一步的，链霉菌ATCC 700974培养包括：在培养开始时，向每1000ml培养基中加入0.3～0.6g FeCl3·6H2O和1～10g L-鸟氨酸盐酸盐。

[0007] 进一步的，链霉素ATCC 700974培养包括：在培养72h后，向每1000ml培养液中加入0.3～0.6g FeCl3·6H2O并将培养液的pH值调至7.0。

[0008] 进一步的，氯化钙溶液中含有质量体积比为0.1～0.5％的壳聚糖。

[0009] 本发明第二方面提供了固定化铁螯合物酶在铁螯合物制备中的应用，其特征在于，固定化铁螯合物酶的底物溶液是N5-乙酰基-N5-羟基鸟氨酸溶液。

[0010] 进一步的，底物溶液的pH值为7.0。

[0011] 进一步的，底物溶液中含有三磷酸腺苷二钠盐，三磷酸腺苷二钠盐与N5-乙酰基-N5-羟基鸟氨酸的摩尔比为1∶1～3∶1。

[0012] 进一步的，底物溶液中含有FeCl3，FeCl3与N5-乙酰基-N5-羟基鸟氨酸的摩尔比为1∶1～1∶3。

[0013] 进一步的，固定化铁螯合物酶在25～30℃下与底物溶液接触。

具体实施方式

[0014] 以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限定本发明的保护范围。

[0015] 实施例1

[0016] 链霉菌ATCC700974的种子培养

[0017] 培养基(ISP2)：0.4g 酵母粉、0.4g 葡萄糖、1g麦芽糖，溶于100ml，pH值调至7.3。

[0018] 培养温度：28℃

[0019] 培养时间：72h。

[0020] 链霉菌ATCC700974的菌体培养

[0021] 培养基：20g淀粉、1.5g KH2PO4、10g Na2HPO4·H2O、2g NaCl、2g(NH4)2SO4、0.2g MgSO4·7H2O、0.6g CaCl2·2H2O、0.02g ZnSO4·7H2O、0.3g FeCl3·6H2O和1～10g L-鸟氨酸盐酸盐，溶于1000ml去离子水中，pH值调至6.8；

[0022] 接种量：5％。

[0023] 培养温度：28℃。

[0024] 培养时间：72h。

[0025] 培养液补铁

[0026] 菌体培养72h后，向每1000ml培养液中加入0.3g FeCl3·6H2O，并将培养液的pH值调至7.0，继续培养72h。

[0027] 实施例2

[0028] 酶液的制备

[0029] 将培养液在5000r/min离心15分钟，弃去上清液，将菌体转移至大烧杯中；用pH值为7.0的磷酸缓冲液洗涤，5000r/min离心5分钟，弃去上清，重复两次；用pH值为7.0的磷酸缓冲液将菌体混匀，固体含量为约25％，利用高压均质机进行细胞破碎3次，得到破碎液；将破碎液在10000r/min离心20min，收集上清液得到酶液。

[0030] 酶的固定化

[0031] 将海藻酸钠溶解于酶液中，海藻酸钠与酶液的质量体积比为2％，在4℃静置至无气泡；将含有海藻酸钠的酶液用注射器逐滴地滴入氯化钙溶液中，氯化钙溶液的质量体积比为4％；氯化钙溶液中含有质量体积比为0.25％的壳聚糖；用去离子水洗涤，除去多余的壳聚糖和氯化钙后沥干，得到固定化小球；将固定化小球置于质量体积比为0.1％的戊二醛溶液中；微波3分钟后用去离子水洗涤，除去多余的戊二醛后沥干，得到固定化铁螯合物酶。

[0032] 实施例3

[0033] 底物溶液的配置

[0034] 称取：0.19g N5-乙酰基-N5-羟基鸟氨酸、0.55g三磷酸腺苷二钠盐、0.09g FeCl3·6H2O，溶于100ml pH值为7.0的磷酸缓冲液中。

[0035] 催化反应

[0036] 固定化铁螯合物酶在28℃下与底物溶液接触，反应12h。

[0037] 产物检测

[0038] 用移液枪吸取反应后的溶液1ml，加入少量草酸铵溶液混匀后过滤，在Thermo LTQ XL上对铁螯合物产物进行质谱分析，结果显示存在m/z＝548[M+NH4]，与预测理论值相符。

[0039] 实施例4

[0040] 底物溶液的配置

[0041] 称取：0.19g N5-乙酰基-N5-羟基鸟氨酸、1.10g三磷酸腺苷二钠盐、0.27g FeCl3·6H2O，溶于100ml pH值为7.0的磷酸缓冲液中。

[0042] 催化反应

[0043] 固定化铁螯合物酶在28℃下与底物溶液接触，反应24h。

[0044] 产物检测

[0045] 用移液枪吸取反应后的溶液1ml，加入少量草酸铵溶液混匀后过滤，在Thermo LTQ XL上对铁螯合物产物进行质谱分析，结果显示存在m/z＝548[M+NH4]，与预测理论值相符。

[0046] 实施例5

[0047] 底物溶液的配置

[0048] 称取：0.19g N5-乙酰基-N5-羟基鸟氨酸、1.65g三磷酸腺苷二钠盐、0.27g FeCl3·6H2O，溶于100ml pH值为7.0的磷酸缓冲液中。

[0049] 催化反应

[0050] 固定化铁螯合物酶在28℃下与底物溶液接触，反应8h。

[0051] 产物检测

[0052] 用移液枪吸取反应后的溶液1ml，加入少量草酸铵溶液混匀后过滤，在Thermo LTQ XL上对铁螯合物产物进行质谱分析，结果显示存在m/z＝548[M+NH4]，与预测理论值相符。

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