嵌合和人源化抗组蛋白抗体
阅读：743发布：2022-08-02
专利汇可以提供嵌合和人源化抗组蛋白抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及包含本文所公开的特定CDR序列的嵌合或人源化 抗体 或其 抗原 结合 片段 。优选地，所述抗体或片段包含本文所公开的特定重链和轻链可变区序列。更优选地，所述抗体或片段还包含特定恒定区序列，如与nGlml，2或Km3同种异型有关的那些。所述抗体或片段可结合至人组蛋白，如H2B、H3或H4。所述抗体或片段适用于 治疗 可与组蛋白有关的多种 疾病 ，如自身免疫疾病(例如，SLE)、动脉粥样硬化、关节炎、类 风 湿性关节炎、 水 肿、脓毒病、脓毒性休克、高炎性病症、感染性疾病、炎性疾病、免疫失调病症、GVHD、移植排斥、动脉粥样硬化、哮喘、凝血病、心肌缺血、血栓形成、肾炎、炎性肝损伤、急性胰腺炎、 局部缺血 再灌注 损伤、中风、心 血管疾病 以及烧伤。，下面是嵌合和人源化抗组蛋白抗体专利的具体信息内容。
1.一种嵌合或人源化抗组蛋白H4抗体或其抗原结合片段，其包含重链互补决定区
(CDR)序列CDR1(DDYLH，SEQ ID NO：90)、CDR2(WIGWIDPENGDTEYASKFQG，SEQ ID NO：91)及CDR3(PLVHLRTFAY，SEQ ID NO：92)以及轻链CDR序列CDR1(RASESVDSYDNSLH，SEQ ID NO：
93)、CDR2(LASNLES，SEQ ID NO：94)及CDR3(QQNNEDPWT，SEQ ID NO：95)。
2.如权利要求1所述的嵌合抗体或其片段，其中所述重链可变区序列的氨基酸序列是SEQ ID NO：98且所述轻链可变区序列的氨基酸序列是SEQ ID NO：99。
3.如权利要求1所述的人源化抗体或其片段，其中所述重链可变区序列的氨基酸序列是SEQ ID NO：96且所述轻链可变区序列的氨基酸序列是SEQ ID NO：97。
4.一种嵌合或人源化抗组蛋白H3抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR序
列 CDR1(SYWMH，SEQ ID NO：100)、CDR2(NIDPS DSETHYNQKFKD，SEQ ID NO：101) 及CDR3(EKITDDYNYFDY，SEQ ID NO：102)以及轻链CDR序列CDR1(RASESVDSYGNSFMH，SEQ ID NO：103)、CDR2(HASNLES，SEQ ID NO：104)及CDR3(QQ NNEDPLT，SEQ ID NO：105)。
5.如权利要求4所述的嵌合抗体或其片段，其中所述重链可变区序列的氨基酸序列是SEQ ID NO：108且所述轻链可变区序列的氨基酸序列是SEQ ID NO：109。
6.如权利要求4所述的人源化抗体或其片段，其中所述重链可变区序列的氨基酸序列是SEQ ID NO：106且所述轻链可变区序列的氨基酸序列是SEQ ID NO：107。
7.一种嵌合或人源化抗组蛋白H2B抗体或其抗原结合片段，其包含重链CDR序
列 CDR1(SYVMY，SEQ ID NO：110)、CDR2(YINPYNDGTKYNEKFKG，SEQ ID NO：111) 及CDR3(PGDGYPFDY，SEQ ID NO：112)以及轻链CDR序列CDR1(RSSQSIVHSNGNTYLE，SEQ ID NO：
113)、CDR2(KVSNRFS，SEQ ID NO：114)及CDR3(FQGSHVPYT，SEQ ID NO：115)。
8.如权利要求7所述的嵌合抗体或其片段，其中所述重链可变区序列的氨基酸序列是SEQ ID NO：118且所述轻链可变区序列的氨基酸序列是SEQ ID NO：119。
9.如权利要求7所述的人源化抗体或其片段，其中所述重链可变区序列的氨基酸序列是SEQ ID NO：116且所述轻链可变区序列的氨基酸序列是SEQ ID NO：117。
10.如权利要求1-9中任一项所述的嵌合或人源化抗体或其片段，其中所述抗体或其片段不缀合至治疗剂。
11.如权利要求1-9中任一项所述的嵌合或人源化抗体或其片段，其中所述抗体或其片段缀合至至少一种治疗剂。
12.如权利要求11所述的嵌合或人源化抗体或其片段，其中所述治疗剂选自：第二抗体、第二抗体片段、放射性核素、免疫调节剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂、细胞因子、趋化因子、药物、毒素、激素、siRNA以及酶。
13.如权利要求11所述的嵌合或人源化抗体或其片段，其中所述药物选自：5-氟尿嘧啶、阿普立定、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、瘤可宁、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、依立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱衍生物、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯唑胺、多西他赛、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素(2P-DOX)、氰基-吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、雌氮芥、表鬼臼毒素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、来那度胺、甲酰四氢叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、氨甲蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、亚硝基脲、普卡霉素、甲基苄肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链脲霉素、他莫昔芬、紫杉酚、替莫唑胺(含水形式的DTIC)、反铂、沙利度胺、硫乌嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓扑替康、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、长春花碱、长春新碱、长春花生物碱、酪氨酸磷酸化抑制剂、卡奈替尼、达沙替尼、埃罗替尼、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、来氟米特、尼洛替尼、帕唑帕尼、semaxinib、索拉非尼、舒尼替尼、索坦、伐他拉尼、PCI-32765(依鲁替尼)、PCI-45292、GDC-0834、LFM-A13以及RN486。
14.如权利要求11所述的嵌合或人源化抗体或其片段，其中所述毒素选自：蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)例如豹蛙酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素以及假单胞菌内毒素。
15.如权利要求11所述的嵌合或人源化抗体或其片段，其中所述免疫调节剂选自：细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、白细胞介素(IL)、促红细胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-λ、TGF-α、TGF-β、白细胞介素-1(IL-1)、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-25、LIF、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素以及淋巴毒素。
16.如权利要求15所述的嵌合或人源化抗体或其片段，其中所述细胞因子选自：人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、肝脏生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒氏抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整联蛋白、促血小板生成素(TPO)、NGF-β、血小板生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导性因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子以及淋巴毒素。
17.如权利要求11所述的嵌合或人源化抗体或其片段，其中所述放射性核素选自：
111 111 177 211 212 213 211 62 67 90 125 131 133 32 33 47 111 67
In、 At、 Lu、 Bi、 Bi、 Bi、 At、Cu、Cu、Y、 I、 I、 I、P、P、Sc、 Ag、Ga、
153 161 152 166 161 166 186 188 189 211 212 223 225 77 89 99
Sm、 Tb、 Dy、 Dy、 Ho、 Ho、 Re、 Re、 Re、 Pb、 Pb、 Ra、 Ac、As、Sr、Mo、
105 149 169 194 58 80m 99m 103m 109 119 125 189m 192 219 215 221
Rh、 Pm、 Er、 Ir、Co、 Br、 Tc、 Rh、 Pt、Sb、 I、 Os、 Ir、 Rn、 Po、 Fr、
255 11 13 15 75 198 199 224 77 113m 95 97 103 105 107 203 121m
Fm、C、N、O、Br、 Au、 Au、 Ac、Br、 In、Ru、Ru、 Ru、 Ru、 Hg、 Hg、 Te、
122m 125m 165 167 168 197 109 142 143 161 57 58 51 59 75 201
Te、 Te、 Tm、 Tm、 Tm、 Pt、 Pd、 Pr、 Pr、 Tb、Co、Co、Cr、Fe、Se、 T1、
76 169 227
Br、Yb以及 Th。
18.如权利要求1-17中任一项所述的嵌合或人源化抗体片段，其中所述抗体片段选自：F(ab′)2、Fab′、Fab、Fv以及scFv。
19.如权利要求1-9中任一项所述的嵌合或人源化抗体或其片段，其中所述抗体或其片段缀合至至少一种诊断剂。
20.如权利要求19所述的嵌合或人源化抗体或其片段，其中所述诊断剂选自：放射性核素、放射性造影剂、顺磁性离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂以及光活化剂。
21.如权利要求20所述的嵌合或人源化抗体或其片段，其中所述放射性核素选自：
110 111 177 18 52 62 64 67 67 68 86 90 89 94m 94 99m 120 123
In、 In、 Lu、F、Fe、Cu、Cu、Cu、Ga、Ga、Y、Y、Zr、 Tc、Tc、 Tc、 I、 I、
124 125 131 154-158 32 11 13 15 186 188 51 52m 55 72 75 76 82m
I、 I、 I、 Gd、P、C、N、O、 Re、 Re、Mn、 Mn、Co、As、Br、Br、Rb 以 及
83
Sr。
22.如权利要求20所述的嵌合或人源化抗体或其片段，其中所述顺磁性离子选自：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)以及铒(III)。
23.如权利要求20所述的嵌合或人源化抗体或其片段，其中所述荧光标记选自：
Alexa 350、Alexa 430、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基荧光素、
5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基氨基、Cascade蓝、Cy2、Cy3、Cy5、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯-2-氧杂-1，3-二唑)、俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514、太平洋蓝、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、甲亚胺、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、铕三联吡啶二胺、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青、拉乔拉蓝染料、别藻蓝蛋白、别藻蓝素B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红蓝蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸盐、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明以及得克萨斯红。
24.如权利要求1-23中任一项所述的嵌合或人源化抗体或其片段，其中所述抗体具有nG1m1，2重链无效同种异型。
25.如权利要求1-24中任一项所述的嵌合或人源化抗体或其片段，其中所述抗体具有Km3轻链同种异型。
26.如权利要求1-25中任一项所述的嵌合或人源化抗体或其片段，其中所述抗体包含重链恒定区氨基酸残基精氨酸-214、谷氨酸-356、甲硫氨酸-358以及丙氨酸-431。
27.一种治疗组蛋白相关疾病的方法，其包括向患有所述疾病的受试者施用如权利要求1至18及24至26中任一项所述的嵌合或人源化抗体或其片段。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述疾病选自：全身性红斑狼疮(SLE)、非SLE的自身免疫疾病、动脉粥样硬化、关节炎、类风湿性关节炎、幼年型关节炎、水肿、脓毒病、脓毒性休克、非脓毒性高炎性病症、感染性疾病、炎性疾病、免疫失调病症、移植物抗宿主疾病(GVHD)、急性呼吸窘迫综合征、弥漫性血管内凝血(DIC)、移植排斥、动脉粥样硬化、哮喘、肉芽肿病、神经病、恶病质、凝血病、痤疮、巨细胞性动脉炎、心肌缺血、血栓形成、肾炎、炎性肝损伤、创伤性出血、急性胰腺炎、急性呼吸窘迫综合征、缺血性损伤、局部缺血-再灌注损伤、缺血性中风、心血管疾病、放射疗法毒性、细胞因子疗法毒性以及烧伤。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述自身免疫疾病选自：急性免疫性血小板减少症、慢性免疫性血小板减少症、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、寻常天疱疮、糖尿病(例如，幼年型糖尿病)、亨-舍二氏紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、ANCA相关的脉管炎、阿狄森氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、多发性结节性动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻氏综合征、血栓闭塞性脉管炎、干燥综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、快速进行性肾小球性肾炎、牛皮癣、纤维性肺泡炎、移植物抗宿主疾病(GVHD)、器官移植排斥、脓毒病、败血病以及炎症。
30.如权利要求27所述的方法，其进一步包括在所述嵌合或人源化抗体或其片段之前、同时或之后向所述受试者施用至少一种其它治疗剂。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述治疗剂选自：第二抗体、第二抗体片段、免疫缀合物、放射性核素、免疫调节剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂、细胞因子、趋化因子、药物、毒素、激素、siRNA、细胞因子、趋化因子、凝血抑制剂、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子、干扰素、促红细胞生成素、促血小板生成素、酶、重组人血栓调节蛋白以及活化的人蛋白C。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述第二抗体、第二抗体片段或免疫缀合物结合至选自以下的抗原：组蛋白H2B、组蛋白H3、组蛋白H4、先天性免疫系统的促炎效应子、促炎效应子细胞因子、促炎效应子趋化因子、特异性地与感染性疾病、急性呼吸窘迫综合征、败血病、脓毒性休克、GVHD、移植排斥、动脉粥样硬化、哮喘、肉芽肿病、神经病、恶病质、凝血病、痤疮、巨细胞性动脉炎或心肌缺血有关的靶标、TNF-α、MIF、CD74、HLA-DR、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、CD40L、CD44、CD46、CD55、CD59、CCL19、CCL21、mCRP、MCP-19、MIP-1A、MIP-1B、RANTES、ENA-78、IP-10、GRO-β、脂多糖、淋巴毒素、HMGB-1、组织因子、补体调节蛋白、凝血因子、凝血酶、补体因子、C3、C3a、C3b、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、Flt-1以及VEGF。
33.如权利要求31所述的方法，其中所述药物选自：5-氟尿嘧啶、阿普立定、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、瘤可宁、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、依立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱衍生物、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯唑胺、多西他赛、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素(2P-DOX)、氰基-吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、雌氮芥、表鬼臼毒素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3',5'-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、来那度胺、甲酰四氢叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、氨甲蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、亚硝基脲、普卡霉素、甲基苄肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链脲霉素、他莫昔芬、紫杉酚、替莫唑胺(含水形式的DTIC)、反铂、沙利度胺、硫乌嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓扑替康、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、长春花碱、长春新碱、长春花生物碱、酪氨酸磷酸化抑制剂、卡奈替尼、达沙替尼、埃罗替尼、吉非替尼、伊马替尼、拉帕替尼、来氟米特、尼洛替尼、帕唑帕尼、semaxinib、索拉非尼、舒尼替尼、索坦、伐他拉尼、PCI-32765(依鲁替尼)、PCI-45292、GDC-0834、LFM-A13以及RN486。
34.如权利要求31所述的方法，其中所述毒素选自：蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)例如豹蛙酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素以及假单胞菌内毒素。
35.如权利要求31所述的方法，其中所述免疫调节剂选自：细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、白细胞介素(IL)、促红细胞生成素、促血小板生成素、肿瘤坏死因子(TNF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、干扰素-λ、TGF-α、TGF-β、白细胞介素-1(IL-1)、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-25、LIF、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、重组人血栓调节蛋白、内皮抑素以及淋巴毒素。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述细胞因子选自：人生长激素、N-甲硫氨酰基人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、黄体生成素(LH)、肝脏生长因子、前列腺素、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、OB蛋白、肿瘤坏死因子-α、肿瘤坏死因子-β、苗勒氏抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、血管内皮生长因子、整联蛋白、促血小板生成素(TPO)、NGF-β、血小板生长因子、TGF-α、TGF-β、胰岛素样生长因子-I、胰岛素样生长因子-II、促红细胞生成素(EPO)、骨诱导性因子、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、巨噬细胞-CSF(M-CSF)、IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子以及淋巴毒素。
111 111 177 211
37.如权利要求31所述的方法，其中所述放射性核素选自： In、 At、Lu、 Bi、
212 213 211 62 67 90 125 131 133 32 33 47 111 67 153 161 152 166
Bi、 Bi、 At、Cu、Cu、Y、 I、 I、 I、P、P、Sc、 Ag、Ga、 Sm、 Tb、 Dy、 Dy、
161 166 186 188 189 211 212 223 225 77 89 99 105 149 169 194
Ho、 Ho、 Re、 Re、 Re、 Pb、 Pb、 Ra、 Ac、As、Sr、Mo、 Rh、 Pm、 Er、 Ir、
58 80m 99m 103m 109 119 125 189m 192 219 215 221 255 11 13 15 75
Co、 Br、 Tc、 Rh、 Pt、 Sb、 I、 Os、 Ir、 Rn、 Po、 Fr、 Fm、C、N、O、Br、
198 199 224 77 113m 95 97 103 105 107 203 121m 122m 125m 165 167
Au、 Au、 Ac、Br、 In、Ru、Ru、 Ru、 Ru、 Hg、 Hg、 Te、 Te、 Te、 Tm、Tm、
168 197 109 142 143 161 57 58 51 59 75 201 76 169 227
Tm、 Pt、Pd、 Pr、Pr、 Tb、Co、Co、Cr、Fe、Se、Tl、Br、 Yb以及 Th。
38.如权利要求27-37中任一项所述的方法，其中所述嵌合或人源化抗体或其片段是双特异性抗体或其片段。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述双特异性抗体结合至选自以下的抗原：组蛋白H1、组蛋白H2A、组蛋白H2B、组蛋白H3、组蛋白H4、半抗原、In-DTPA、HSG、先天性免疫系统的促炎效应子、促炎效应子细胞因子、促炎效应子趋化因子、特异性地与感染性疾病、急性呼吸窘迫综合征、败血病、脓毒性休克、GVHD、移植排斥、动脉粥样硬化、哮喘、肉芽肿病、神经病、恶病质、凝血病、痤疮、巨细胞性动脉炎或心肌缺血有关的靶标、TNF-α、MIF、CD74、HLA-DR、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、CD40L、CD44、CD46、CD55、CD59、CCL19、CCL21、mCRP、MCP-19、MIP-1A、MIP-1B、RANTES、ENA-78、IP-10、GRO-β、脂多糖、淋巴毒素、HMGB-1、组织因子、补体调节蛋白、凝血因子、凝血酶、补体因子、C3、C3a、C3b、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、Flt-1以及VEGF。
40.如权利要求38所述的方法，其中所述双特异性抗体结合至选自以下的两种抗原：
组蛋白H1、组蛋白H2A、组蛋白H2B、组蛋白H3、组蛋白H4、半抗原、In-DTPA、HSG、先天性免疫系统的促炎效应子、促炎效应子细胞因子、促炎效应子趋化因子、特异性地与感染性疾病、急性呼吸窘迫综合征、败血病、脓毒性休克、GVHD、移植排斥、动脉粥样硬化、哮喘、肉芽肿病、神经病、恶病质、凝血病、痤疮、巨细胞性动脉炎或心肌缺血有关的靶标、TNF-α、MIF、CD74、HLA-DR、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、CD40L、CD44、CD46、CD55、CD59、CCL19、CCL21、mCRP、MCP-19、MIP-1A、MIP-1B、RANTES、ENA-78、IP-10、GRO-β、脂多糖、淋巴毒素、HMGB-1、组织因子、补体调节蛋白、凝血因子、凝血酶、补体因子、C3、C3a、C3b、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、Flt-1以及VEGF。
41.一种融合蛋白，其包含如权利要求1-9及24-26中任一项所述的嵌合或人源化抗体或其片段。
42.一种治疗组合物，其包含如权利要求1-18及24-26中任一项所述的嵌合或人源化抗体或其片段。
嵌合和人源化抗组蛋白抗体
[0001] 相关申请
[0004] 本申请含有经由EFS-Web以ASCII格式提交并且在此以引用的方式整体并入的序列表。在2014年2月10日创建的所述ASCII副本的名称是IMM342WO1_SL.txt并且大小是71,290字节。
发明领域
发明领域
[0005] 本发明涉及使用抗组蛋白抗体或其抗原结合片段的组合物和方法。在具体实施方案中，抗体结合至人组蛋白H2B、H3或H4。抗组蛋白抗体适用于诊断和/或治疗多种的疾病状态，包括但不限于自身免疫疾病(如全身性红斑狼疮)、动脉粥样硬化、关节炎、类风湿性关节炎、幼年型关节炎；水肿；脓毒病；脓毒性休克；炎症；非脓毒性高炎性病症；感染性疾病；血栓形成；肾炎；炎性肝损伤；创伤性出血；急性胰腺炎；急性呼吸窘迫综合征；缺血性损伤；局部缺血-再灌注损伤；缺血性中风；心血管疾病；动脉粥样硬化；放射疗法毒性；细胞因子疗法毒性；肉芽肿病；哮喘；移植物抗宿主疾病、恶病质、凝血病；癌症或烧伤效应及其并发症。更具体的实施方案可涉及嵌合或更优选地人源化形式的抗组蛋白抗体。
[0006] 背景
[0007] 脓毒病是我们社会的主要医疗和经济负担，在美国每年影响约700,000人，每年导致超过200,000例死亡，并且每年耗费大约167亿美元(Angus等人，Crit Care Med2001；29：1303-1310；Martin等人，N Engl J Med 2003；348：1546-1554)。脓毒病的定义一直是困难的，且在历史上将其定义为针对感染的全身性宿主反应。涵盖全身性炎性反应综合征(SIRS)、脓毒病本身、严重脓毒病、脓毒性休克及多器官功能障碍综合征(MODS)的脓毒病的临床定义的讨论包含于Riedmann等人，J Clin Invest 2003；112：460-467中。因为普遍认同的是，脓毒病是由宿主对侵入微生物的压倒性反应引起，并且此反应对患者的危害比侵入微生物更大，所以抑制免疫和炎性反应是治疗的早期目标。
[0008] 免疫抑制或中和促炎细胞因子的许多和各种不同方法已在临床上在采用脓毒病和脓毒性休克抗炎策略的患者中被证明是不成功的。(J Clin Invest 2003；112：460-467；Van Amersfoort等人(Clin Microbiol Rev 2003；16：379-414)，如一般免疫抑制、使用非甾族抗炎药物、TNF-α抗体(英夫利昔单抗)或TNF-R：Fc融合蛋白(依那西普)、
IL-1(白细胞介素-1)受体拮抗剂或高剂量的皮质类固醇。然而，在治疗成人的脓毒病中的成功是PROWESS研究(Human Activated Protein C Worldwide Evaluation in Severe Sepsis(Bernard等人，N Engl J Med 2001；344：699-709))，显示比在安慰剂组(30.8％)中的降低的死亡率(24.7％)。此活化蛋白C(APC)试剂有可能抑制血栓形成和炎症，而促进了纤维蛋白溶解。Friggeri等人(2012，Mol Med 18：825-33)报道了APC降解组蛋白H3和H4，所述H3和H4阻断凋亡细胞被巨噬细胞摄取和清除且从而促使急性炎性状态下的器官系统功能障碍和死亡。Van Amersfoort等人在他们的综述(同上)中指出：“尽管阻断或调控包括补体和凝血因子、嗜中性粒细胞粘附及NO释放的许多其它靶标在动物中是有前景的，但还需确定这些治疗方法在人中是否是有效的”。这进一步在Abraham的综述中被强调，“免疫调节疗法在脓毒病中为什么不起作用”(Intensive Care Med 1999；25：556-566)。一般说来，尽管许多炎症和脓毒病的啮齿动物模型在过去的十年或更长时间里已在各种不同试剂下显示出令人鼓舞的结果，但大多数被转移到临床中的试剂未能在人中再现在这些动物模型中所观察到的，这样使得仍然需要提供可控制涉及脓毒病、凝血病的各种疾病及具有炎性或免疫失调组分的某些神经变性病状的复杂表现和多器官受累的新型试剂。
IL-1(白细胞介素-1)受体拮抗剂或高剂量的皮质类固醇。然而，在治疗成人的脓毒病中的成功是PROWESS研究(Human Activated Protein C Worldwide Evaluation in Severe Sepsis(Bernard等人，N Engl J Med 2001；344：699-709))，显示比在安慰剂组(30.8％)中的降低的死亡率(24.7％)。此活化蛋白C(APC)试剂有可能抑制血栓形成和炎症，而促进了纤维蛋白溶解。Friggeri等人(2012，Mol Med 18：825-33)报道了APC降解组蛋白H3和H4，所述H3和H4阻断凋亡细胞被巨噬细胞摄取和清除且从而促使急性炎性状态下的器官系统功能障碍和死亡。Van Amersfoort等人在他们的综述(同上)中指出：“尽管阻断或调控包括补体和凝血因子、嗜中性粒细胞粘附及NO释放的许多其它靶标在动物中是有前景的，但还需确定这些治疗方法在人中是否是有效的”。这进一步在Abraham的综述中被强调，“免疫调节疗法在脓毒病中为什么不起作用”(Intensive Care Med 1999；25：556-566)。一般说来，尽管许多炎症和脓毒病的啮齿动物模型在过去的十年或更长时间里已在各种不同试剂下显示出令人鼓舞的结果，但大多数被转移到临床中的试剂未能在人中再现在这些动物模型中所观察到的，这样使得仍然需要提供可控制涉及脓毒病、凝血病的各种疾病及具有炎性或免疫失调组分的某些神经变性病状的复杂表现和多器官受累的新型试剂。
[0009] 对于在脓毒病或脓毒性休克中的免疫球蛋白的最新工作已有报道。例如，Toussaint和Gerlach(2012，Curr Infect Dis Rep 14：522-29)概述了在脓毒病中使用ivIG作为辅助疗法。再分化未能显示一般免疫球蛋白疗法与结果之间的任何强相关性。
LaRosa和Opal(2012，Curr Infect Dis Rep 14：474-83)对新型治疗剂在脓毒病中的潜在用途进行了报道。在其他试剂中，抗TNF抗体尤其在当前的临床试验中用于脓毒病，而补体拮抗剂在临床前的脓毒病模型中显示有前景的结果。Nalesso等人(2012，Curr Infect Dis Rep 14：462-73)提出用多种试剂的组合疗法可证明对脓毒病治疗更有效。脓毒病的免疫发病机理已由Cohen(2002，Nature 420：885-91)概述。
LaRosa和Opal(2012，Curr Infect Dis Rep 14：474-83)对新型治疗剂在脓毒病中的潜在用途进行了报道。在其他试剂中，抗TNF抗体尤其在当前的临床试验中用于脓毒病，而补体拮抗剂在临床前的脓毒病模型中显示有前景的结果。Nalesso等人(2012，Curr Infect Dis Rep 14：462-73)提出用多种试剂的组合疗法可证明对脓毒病治疗更有效。脓毒病的免疫发病机理已由Cohen(2002，Nature 420：885-91)概述。
[0010] 脓毒病中的免疫系统被认为在感染或外伤之后具有早期强烈的促炎反应，导致器官损伤，而且还认为先天性免疫系统常常不能有效地杀死侵入微生物(Riedmann和Ward，Expert Opin Biol Ther 2003；3：339-350)。存在已显示一定前景的关于脓毒病的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的一些研究。例如，MIF的阻断或MIF基因的靶向破环显著地改善小鼠在脓毒性休克模型中的存活(Calandra等人，Nature Med2000；6：164-170)，并且一些品系的证据已指出MIF在脓毒病患者中作为治疗干预的潜在靶标(Riedmann等人，如上所引用)。Bucala等人(美国专利号6,645,493 B1)要求抗MIF抗体可在治疗上有效地用于治疗由细胞因子介导的毒性所引起的病状或疾病，包括不同形式的脓毒病、炎性疾病、急性呼吸疾病综合征、肉芽肿病、慢性感染、移植排斥、恶病质、哮喘、病毒感染、寄生虫感染、疟疾以及细菌传染，所述专利以引用的方式整体并入本文，包括参考文献。抗LPS(脂多糖)抗体单独的使用在治疗患有脓毒性休克的患者中类似地具有各式各样的结果(Astiz和
Rackow，Lancet 1998；351：1501-1505；Van Amersfoort等人，Clin Microbiol Rev 2003；
16：379-414。
Rackow，Lancet 1998；351：1501-1505；Van Amersfoort等人，Clin Microbiol Rev 2003；
16：379-414。
[0011] 虽然LPS和MIF两者已经成为治疗脓毒病和脓毒性休克中的靶标，但由抗体靶向单独LPS或MIF的方法不足以控制脓毒病的各种不同表现，特别是晚期和严重形式。类似地，使用细胞因子如IL-1、IL-6(白细胞介素-6)、IL-8(白细胞介素-8)等作为用于治疗脓毒病及其它细胞因子介导的毒性反应的抗体的靶标未被证明足以有意义地控制这种疾病。因此，除需要发现脓毒病的内源性反应中所涉及的细胞因子级联的另外靶标之外，现已发现靶向至少一种细胞因子或致病物如MIF或脂多糖(LPS)的二和多官能抗体是有
利的，尤其当与结合至参与炎性或免疫应答的宿主细胞(或其受体)如T细胞、巨噬细胞或树突状细胞组合时。针对MHC II类恒定链靶标如CD74的抗体已由Bucala等人(US
2003/0013122 A1)提出，用于治疗MIF调节的疾病，并且Hansen等人(US 2004/0115193 A1)提出至少一个CD74抗体用于治疗免疫失调疾病、自身免疫疾病、器官移植物排斥以及移植物抗宿主疾病。Hansen等人描述使用抗CD74与同宿主细胞如淋巴细胞和巨噬细胞上的抗原/受体反应的其它抗体的融合蛋白来治疗所述疾病。然而，未提出与非CD74的靶标的组合，并且本公开集中于不同的免疫治疗方法。类似的靶标还适用于治疗动脉粥样硬化斑块(Burger-Kentischer等人，Circulation 2002；105：1561-1566)。
利的，尤其当与结合至参与炎性或免疫应答的宿主细胞(或其受体)如T细胞、巨噬细胞或树突状细胞组合时。针对MHC II类恒定链靶标如CD74的抗体已由Bucala等人(US
2003/0013122 A1)提出，用于治疗MIF调节的疾病，并且Hansen等人(US 2004/0115193 A1)提出至少一个CD74抗体用于治疗免疫失调疾病、自身免疫疾病、器官移植物排斥以及移植物抗宿主疾病。Hansen等人描述使用抗CD74与同宿主细胞如淋巴细胞和巨噬细胞上的抗原/受体反应的其它抗体的融合蛋白来治疗所述疾病。然而，未提出与非CD74的靶标的组合，并且本公开集中于不同的免疫治疗方法。类似的靶标还适用于治疗动脉粥样硬化斑块(Burger-Kentischer等人，Circulation 2002；105：1561-1566)。
[0012] 在治疗感染性、自身免疫、器官移植、炎性以及移植物抗宿主(及其它免疫调节)疾病中，各种不同的且相对非特异性细胞毒性剂被用于杀死或清除有毒物(noxient)或微生物，或减弱对外来移植物或免疫原的宿主免疫应答，或宿主针对“自身”的抗体产生等等。然而，这些通常影响淋巴及造血系统的其它部分，导致对骨髓(造血)及其它正常宿主细胞的毒性作用。尤其在脓毒病中，当遇到免疫抑制状况时，使用免疫抑制疗法将是不达预期的，所以一个目标是实现靶向与抑制适应性免疫系统的关键细胞之间的仔细平衡，而不会耗尽维持活跃免疫系统的宿主所涉及的那些。
[0013] 存在对于癌症和包括以下的多种免疫疾病的改善的更具选择性的疗法的需要：脓毒病和脓毒性休克、炎症、动脉粥样硬化、恶病质、移植物抗宿主、及其它免疫失调病症。
[0014] 概述
[0015] 某些实施方案涉及针对组蛋白的嵌合或人源化形式的抗体，诸如IMMU-H4、IMMU-H3或IMMU-H2B。IMMU-H4、IMMU-H3及IMMU-H2B抗体的可变区结构域的氨基酸序列通过DNA测序来测定。嵌合抗体是通过用人抗体恒定区序列替换鼠恒定区序列来设计和构建。人源化抗体是通过将鉴定的CDR序列插入人抗体构架区(FR)序列中，连接至人抗体恒定区序列来设计和构建。在优选实施方案中，用来自亲本鼠抗体的相应鼠FR残基替换所选的人FR氨基酸残基，以便优化人源化抗体的结合或其它活性。
[0016] 嵌合和/或人源化抗组蛋白抗体或其抗原结合片段适用于诊断和/或治疗多种疾病状态，包括但不限于自身免疫疾病，如全身性红斑狼疮(SLE)、非SLE的自身免疫疾病、动脉粥样硬化、关节炎、类风湿性关节炎、幼年型关节炎；水肿；脓毒病；脓毒性休克；炎症；非脓毒性高炎性病症；感染性疾病；血栓形成；肾炎；炎性肝损伤；创伤性出血；急性胰腺炎；急性呼吸窘迫综合征；缺血性损伤；局部缺血-再灌注损伤；缺血性中风；心血管疾病；动脉粥样硬化；放射疗法毒性；细胞因子疗法毒性；肉芽肿病；哮喘；移植物抗宿主疾病、恶病质、凝血病；癌症或烧伤效应及并发症。
[0017] 在某些优选实施方案中，可使用抗组蛋白抗体的组合。针对人组蛋白H1、H2A、H2B、H3或H4的抗体可以任何组合形式使用。靶向组蛋白或组蛋白介导途径的下游效应子的其它非抗体治疗剂也可以与抗组蛋白抗体或其片段组合的形式来使用，在施用一种或多种抗组蛋白抗体或其片段之前、同时或之后施用。适用于治疗组蛋白相关疾病状态的各种治疗剂是本领域中已知的，如活化蛋白C(APC)、血栓调节蛋白、组蛋白H1、H2A、H2B、H3或H4的肽片段、粒酶A、粒酶B、纤溶酶、因子7-活化蛋白酶、肝素，并且任何这种已知试剂可以与本发明抗组蛋白抗体或抗体片段组合的形式来使用。人组蛋白H4肽可包含人H4的残基50-67或40-78(参见，例如，美国公布号20090117099)。
[0018] 在替代实施方案中，所公开的方法和/或组合物可利用一种或多种嵌合、人源化或人抗体或抗原结合抗体片段，其与IMMU-H4、IMMU-H3或IMMU-H2B抗体竞争结合或结合至相同的表位。它们可与影响或抑制先天性或适应性免疫系统的试剂(包括促炎效应子细胞因子或促炎效应子趋化因子、与疾病有牵连的调节性T细胞及其它造血细胞)；补体系统和/或凝血因子或促成疾病的病理学或发病机理的因子组合。这些组合或多特异性试剂(包括多特异性抗体)旨在增强抗组蛋白抗体在管理这些不同疾病中的作用。
[0019] 具体实施方案涉及特定同种异型的嵌合和人源化抗体。优选地，抗体恒定区序列被选出以对应于nG1m1，2重链无效同种异型，更优选地G1m3重链同种异型，更优选地Km3轻链同种异型。
[0020] 令人惊讶地发现，嵌合和人源化形式的抗组蛋白抗体可比亲本鼠抗体展现对靶组蛋白更高的亲和力。
[0022] 提供以下附图以说明本发明的优选实施方案。然而，要求保护的主题决不受附图中所公开的说明性实施方案的限制。
[0023] 图1.鼠IMMU-H4重链和轻链的可变区氨基酸序列与由Monestier等人(1993，Mol.Immunol 30：1069-75)公开的BWA-3抗体的相应序列的比较。加下划线的残基显示出差异。“X”表示在公开序列中缺少的残基。鼠IMMU-H4重链(SEQ ID NO：98)和轻链(SEQ ID NO：99)的正确氨基酸序列与鼠BWA-3重链(SEQ ID NO：120)和轻链(SEQ ID NO：121)的不正确的公开序列并排显示。
[0024] 图2.鼠IMMU-H3重链和轻链的可变区氨基酸序列与Monestier等人(1993，Mol.Immunol 30：1069-75)中公开的LG2-1抗体的相应序列的比较。加下划线的残基显示出差异。“X”表示在公开序列中缺少的残基。鼠IMMU-H3重链(SEQ ID NO：108)和轻链(SEQ ID NO：109)的正确氨基酸序列与鼠LG2-1重链(SEQ ID NO：122)和轻链(SEQ ID NO：123)的不正确的公开序列并排显示。
[0025] 图3.鼠IMMU-H2B重链和轻链的可变区氨基酸序列与Monestier等人(1993，Mol.Immunol 30：1069-75)中公开的LG2-2抗体的相应序列的比较。加下划线的残基显示出差异。“X”表示在公开序列中缺少的残基。鼠IMMU-H2B重链(SEQ ID NO：118)和轻链(SEQ ID NO：119)的正确氨基酸序列与鼠LG2-2重链(SEQ ID NO：124)和轻链(SEQ ID NO：125)的不正确的公开序列并排显示。
[0026] 图4.人源化IMMU-H4抗体的重链(SEQ ID NO：96)和轻链(SEQ ID NO：97)可变区的氨基酸序列。不同于鼠亲本抗体的残基以下划线标注。
[0027] 图5.人源化IMMU-H3抗体的重链(SEQ ID NO：106)和轻链(SEQ ID NO：107)可变区的氨基酸序列。不同于鼠亲本抗体的残基以下划线标注。
[0028] 图6.人源化IMMU-H2B抗体的重链(SEQ ID NO：116)和轻链(SEQ ID NO：117)可变区的氨基酸序列。不同于鼠亲本抗体的残基以下划线标注。
[0029] 图7.鼠(正方形)和嵌合(圆形)IMMU-H4抗组蛋白抗体的比较结合亲和力。
[0030] 定义
[0031] 除非另外指出，“一个(a)”或“一个(an)”是指“一个或多个”。
[0032] 如本文所用，术语“和”与“或”可用于指连接词或反意连接词。也就是说，除非另有说明，两个术语都应被理解为相当于“和/或”。
[0033] “治疗剂”是适用于治疗疾病的原子、分子或化合物。治疗剂的实例包括抗体、抗体片段、肽、药物、毒素、酶、核酸酶、激素、免疫调节剂、反义寡核苷酸、小的干扰RNA(siRNA)、螯合剂、硼化合物、光活化剂、染料以及放射性同位素。
[0034] “诊断剂”是适用于诊断疾病的原子、分子或化合物。有用的诊断剂包括但不限于放射性同位素、染料(如含有生物素-链霉亲和素复合物)、造影剂、荧光化合物或分子、以及用于磁共振成像(MRI)的增强剂(例如，顺磁性离子)。
[0035] 如本文所用的“抗体”是指全长(即，天然存在的或由正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)。“抗体”包括单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体及人抗体。
[0036] “裸抗体”是不连接至治疗剂或诊断剂的抗体或其抗原结合片段。完整裸抗体的Fc部分可提供效应子功能，如补体结合和ADCC(参见，例如Markrides，Pharmacol Rev 50：59-87，1998)。裸抗体诱导细胞死亡的其它机制可包括细胞凋亡(Vaswani和Hamilton，Ann Allergy Asthma Immunol 81：105-119，1998)。
[0037] “抗体片段”是完整抗体的一部分，如F(ab′)2、F(ab)2、Fab′、Fab、Fv、sFv、scFv、dAb等等。不考虑结构，抗体片段与由全长抗体识别的相同抗原结合。例如，抗体片段包括由可变区组成的分离片段，如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段或其中的轻链和重链可变区通过肽接头(“scFv蛋白”)连接的重组单链多肽分子。常缩写为“scFv”的“单链抗体”由包含VH和VL结构域的多肽链组成，所述结构域互相作用以形成抗原结合位点。VH和VL结构域通常通过1至25个氨基酸残基的肽连接。抗体片段还包括双抗体、三抗体及单结构域抗体(dAb)。不与完整抗体结合至相同抗原的抗体的片段如Fc片段不包括在如本文所用的“抗体片段”的范围内。
[0038] 如果所施用的量是生理学上显著的，则抗组蛋白抗体或抗体片段或本文所述的组合物被称为以“治疗有效量”进行施用。如果一种试剂的存在导致受体受试者生理学上可检测的变化，则该试剂是生理学上显著的。在具体实施方案中，如果抗体制剂的存在能引起抗肿瘤反应或减轻自身免疫疾病状态的体征和症状，则其就是生理学上显著的。生理学上的显著作用还可以是在受体受试者中引起体液和/或细胞免疫应答，从而导致靶细胞的生长抑制或死亡。
[0039] 抗组蛋白抗体
[0040] 本文公开各种人源化或嵌合抗组蛋白抗体和/或其抗原结合片段。当前所公开的嵌合和人源化IMMU-H4、IMMU-H3及IMMU-H2B抗体所来源的鼠BWA-3(抗H4)、LG2-1(抗H3)及LG2-2(抗H2B)杂交瘤是由Monestier等人(1993，Mol.Immunol 30：1069-75)报道。然而，鼠抗体通常不适于人治疗使用，这是由于形成可中和这些抗体且因此使其活性更小的人抗小鼠抗体(HAMA)。此外，由Monestier等人(1993)报道的鼠BWA-3、LG2-1及LG2-2的可变区序列是不正确和/或不完整的并且不能提供产生嵌合或人源化抗体的基础。
[0041] 在优选实施方案中，人源化或嵌合IMMU-H4抗体是包含重链互补决定区(CDR)序 列 CDR1(DDYLH，SEQ ID NO：90)、CDR2(WIG WIDPENGDTEYASKFQG，SEQ ID NO：91) 及CDR3(PLVHLRTFAY，SEQ ID NO：92)以及轻链CDR序列CDR1(RASESVDSYDNSLH，S EQ ID NO：
93)、CDR2(LASNLES，SEQ ID NO：94)及CDR3(QQNN EDPWT，SEQ ID NO：95)的抗体。在更优选实施方案中，人源化I MMU-H4抗体包含SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：97的重链和轻链可变区序列。在其它的优选实施方案中，嵌合IMMU-H4抗体包含S EQ ID NO：98和SEQ ID NO：99的重链和轻链可变区序列。
93)、CDR2(LASNLES，SEQ ID NO：94)及CDR3(QQNN EDPWT，SEQ ID NO：95)的抗体。在更优选实施方案中，人源化I MMU-H4抗体包含SEQ ID NO：96和SEQ ID NO：97的重链和轻链可变区序列。在其它的优选实施方案中，嵌合IMMU-H4抗体包含S EQ ID NO：98和SEQ ID NO：99的重链和轻链可变区序列。
[0042] 人源化IMMU-H4 VH序列(SEQ ID NO：96)
[0043] QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTDDYLHWVKQAPGQGLEWIGWIDPENGDTEYASKFQGKATLTADESTNTAYMELSSLRSEDTAFYYCARPLVHLRTFAYWGQGTTVTVSS
[0044] 人源化IMMU-H4 VK序列(SEQ ID NO：97)
[0045] DIQLTQSPSSLSASVGDRVTMTCRASESVDSYDNSLHWFQQKPGKAPKPWIYLASNLESGVPVRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQNNEDPWTFGGGTKLEIKR
[0046] 嵌合IMMU-H4 VH序列(SEQ ID NO：98)
[0047] QVQLQQSGAELVRPGASVKLSCTASGFNIKDDYLHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYASKFQGKATITADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCSSPLVHLRTFAYWGQGTLVTVS
[0048] 嵌合IMMU-H4 VK序列(SEQ ID NO：99)
[0049] DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDSYDNSLHWFQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPWTFGGGTKLEIKR
[0050] 在优选实施方案中，人源化或嵌合IMMU-H3抗体是包含重链C DR序列 CDR1(SYWMH，SEQ ID NO：100)、CDR2(NIDPSDSETHY NQKFKD，SEQ ID NO：101) 及CDR3(EKITDDYNYFDY，SEQ ID NO：102)以及轻链CDR序列CDR1(RASESVDSYGNSFMH，SEQ ID NO：103)、CDR2(HASNLES，SEQ ID NO：104)及CDR3(QQNNEDP LT，SEQ ID NO：105)的抗体。
在更优选实施方案中，人源化IMMU-H3抗体包含SEQ ID NO：106和SEQ ID NO：107的重链和轻链可变区序列。在其它的优选实施方案中，嵌合IMMU-H3抗体包含SEQ I D NO：108和SEQ ID NO：109的重链和轻链可变区序列。
在更优选实施方案中，人源化IMMU-H3抗体包含SEQ ID NO：106和SEQ ID NO：107的重链和轻链可变区序列。在其它的优选实施方案中，嵌合IMMU-H3抗体包含SEQ I D NO：108和SEQ ID NO：109的重链和轻链可变区序列。
[0051] 人源化IMMU-H3 VH序列(SEQ ID NO：106)
[0052] QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYWMHWVKQAPGQGLEWIGNIDPSDSETHYNQKFKDKATLTADESTNTAYMELSSLRSEDTAFYYCAREKITDDYNYFDYWGQGTTVTVSS
[0053] 人源化IMMU-H3 VK序列(SEQ ID NO：107)
[0054] DIQLTQSPSSLSASVGDRVTMTCRASESVDSYGNSFMHWFQQKPGKAPKPWIYHASNLESGVPVRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQNNEDPLTFGGGTKLEIKR
[0055] 嵌合IMMU-H3 VH序列(SEQ ID NO：108)
[0056] QVQLQESGAELVKPGASVKLSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGNIDPSDSETHYNQKFKDKATLTVDKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVFYCAREKITDDYNYFDYWGQGTTLTVS
[0057] 嵌合IMMU-H3 VK序列(SEQ ID NO：109)
[0058] DIQLTQSPASLALSLRQRATISCRASESVDSYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYHASNLESGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEADDAATYYCQQNNEDPLTFGAGTKLELKR
[0059] 在优选实施方案中，人源化或嵌合IMMU-H2B抗体是包含重链CDR序列 CDR1(SYVMY，SEQ ID NO：110)、CDR2(YINPYNDGTK YNEKFKG，SEQ ID NO：111) 及CDR3(PGDGYPFDY，SEQ ID NO：112)以及轻链CDR序列CDR1(RSSQSIVHSNGNTYLE，SEQ ID NO：
113)、CDR2(KVSNRFS，SEQ ID NO：114)及CDR3(FQGSHVPYT，SEQ ID NO：115)的抗体。在更优选实施方案中，人源化IMMU-H2B抗体包含SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：117的重链和轻链可变区序列。在其它的优选实施方案中，嵌合IMMU-H2B抗体包含SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：119的重链和轻链可变区序列。
113)、CDR2(KVSNRFS，SEQ ID NO：114)及CDR3(FQGSHVPYT，SEQ ID NO：115)的抗体。在更优选实施方案中，人源化IMMU-H2B抗体包含SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：117的重链和轻链可变区序列。在其它的优选实施方案中，嵌合IMMU-H2B抗体包含SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：119的重链和轻链可变区序列。
[0060] 人源化IMMU-H2B VH序列(SEQ ID NO：116)
[0061] QVQLQQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYTFTSYVMYWVKQAPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTADESTNTAYMELSSLRSEDTAFYYCARPGDGYPFDYWGQGTTVTVSS
[0062] 人源化IMMU-H2B VK序列(SEQ ID NO：117)
[0063] DIQLTQSPSSLSASVGDRVTMTCRSSQSIVHSNGNTYLEWFQQKPGKAPKPWIYKVSNRFSGVPVRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDLATYYCFQGSHVPYTFGGGTKLEIKR
[0064] 嵌合IMMU-H2B VH序列(SEQ ID NO：118)
[0065] QVKLQQSGPELVKPGASVKMSCRASGYTFTSYVMYWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCAGPGDGYPFDYWGQGTTLTVS
[0066] 嵌合IMMU-H2B VK序列(SEQ ID NO：119)
[0067] DVLMTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPYTFGSGTKLEIKR
[0068] 用于抗体及抗体片段的一般技术
[0069] 用于制备针对实际上任何靶抗原的单克隆抗体的技术在本领域中是众所周知的。参见，例如Kohler和Milstein，Nature 256：495(1975)以及Coligan等人(编著)，CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY，第1卷，第2.5.1-2.6.7页(John Wiley&Sons 1991)。简言之，单克隆抗体可通过以下方式获得：向小鼠注射包含抗原的组合物，除去脾以获得B-淋巴细胞，使B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生针对所述抗原的抗体的阳性克隆，培养产生针对所述抗原的抗体的克隆，以及从杂交瘤培养物中分离抗体。
[0070] MAb可通过多种广为接受的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化。这种分离技术包括用蛋白A琼脂糖凝胶(Protein-A Sepharose)的亲和色谱法、尺寸排阻色谱法以及离子交换色谱法。参见，例如Coligan在第2.7.1-2.7.12页及第2.9.1-2.9.3页。还参见Baines等人，″Purification of Immunoglobulin G(IgG)，″METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，第10卷，第79-104页(The Humana Press，Inc.1992)。
[0071] 在针对免疫原的抗体初始生成之后，可对抗体进行测序且随后通过重组技术来制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域技术人员所熟知的。源自人源化抗体、嵌合抗体或人抗体的抗体组分的应用避免了与鼠恒定区的免疫原性相关的潜在问题。
[0072] 嵌合抗体
[0073] 嵌合抗体是重组蛋白，其中人抗体的可变区已被例如小鼠抗体的可变区(包括小鼠抗体的互补决定区(CDR))替换。嵌合抗体当向受试者施用时展现降低的免疫原性及提高的稳定性。用于克隆鼠免疫球蛋白可变结构域的一般技术公开于例如Orlandi等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 86：3833(1989)中。用于构建嵌合抗体的技术是本领域技术人员所熟知的。举例来说，Leung等人，Hybridoma 13：469(1994)通过将编码鼠LL2(一种抗CD22单克隆抗体)的Vκ和VH结构域的DNA序列与各自的人κ和IgG1恒定区结构域合并来产生LL2嵌合体。
[0074] 人源化抗体
[0075] 用于产生人源化MAb的技术在本领域中是众所周知的(参见，例如Jones等人，Nature 321：522(1986)，Riechmann等人，Nature 332：323(1988)，Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)，Carter等人，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 89：4285(1992)，Sandhu，Crit.Rev.Biotech.12：437(1992)，以及Singer等人，J.Immun.150：2844(1993))。
嵌合或鼠单克隆抗体可通过将来自小鼠免疫球蛋白的可变重链和轻链的小鼠CDR转移至人抗体的相应可变结构域中来人源化。嵌合单克隆抗体中的小鼠构架区(FR)也被人FR序列替换。因为简单地将小鼠CDR转移至人FR中经常会导致抗体亲和力的降低或甚至丧失，故可能需要额外的修饰以便恢复鼠抗体的原始亲和力。这可以通过将FR区中的一个或多个人残基用它们的鼠对应物进行替换来实现，以便获得一种对其表位具有良好的结合亲和力的抗体。参见，例如Tempest等人，Biotechnology 9：266(1991)以及Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)。通常，那些不同于它们的鼠对应物且靠近或邻接一或多个CDR氨基酸残基定位的人FR氨基酸残基将是取代的候选者。
嵌合或鼠单克隆抗体可通过将来自小鼠免疫球蛋白的可变重链和轻链的小鼠CDR转移至人抗体的相应可变结构域中来人源化。嵌合单克隆抗体中的小鼠构架区(FR)也被人FR序列替换。因为简单地将小鼠CDR转移至人FR中经常会导致抗体亲和力的降低或甚至丧失，故可能需要额外的修饰以便恢复鼠抗体的原始亲和力。这可以通过将FR区中的一个或多个人残基用它们的鼠对应物进行替换来实现，以便获得一种对其表位具有良好的结合亲和力的抗体。参见，例如Tempest等人，Biotechnology 9：266(1991)以及Verhoeyen等人，Science 239：1534(1988)。通常，那些不同于它们的鼠对应物且靠近或邻接一或多个CDR氨基酸残基定位的人FR氨基酸残基将是取代的候选者。
[0076] 人抗体
[0077] 使用组合方法或用人免疫球蛋白基因座转化的转基因动物产生完全人抗体的方法在本领域中是已知的(例如，Mancini等人，2004，New Microbiol.27：315-28；Conrad和Scheller，2005，Comb.Chem.High Throughput Screen.8：117-26；Brekke和Loset，2003，Curr.Opin.Phamacol.3：544-50)。完全人抗体还可通过遗传或染色体转染方法以及噬菌体展示技术来构建，所有技术都是本领域中已知的。参见，例如McCafferty等人，Nature348：552-553(1990)。这种完全人抗体预期展现比嵌合或人源化抗体甚至更少的副作用并且在体内作为基本上内源性人抗体发挥作用。在某些实施方案中，要求保护的方法和程序可利用通过这种技术产生的人抗体。
[0078] 在一个替代方案中，噬菌体展示技术可用于生成人抗体(例如，Dantas-Barbosa等人，2005，Genet.Mol.Res.4：126-40)。人抗体可由正常人或由表现出特定疾病状态如癌症的人产生(Dantas-Barbosa等人，2005)。由患病个体构建人抗体的优点是在于，循环抗体库可偏向针对疾病相关抗原的抗体。
[0079] 在此方法的一个非限制性实例中，Dantas-Barbosa等人(2005)从骨肉瘤患者中构建了人Fab抗体片段的噬菌体展示文库。一般来说，总RNA是从循环血液淋巴细胞中获得(同上)。重组Fab是从μ、γ及κ链抗体库中克隆并且被插入噬菌体展示文库中
(同上)。RNA被转变为cDNA并且用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引
物来制备Fab cDNA文库(Marks等人，1991，J.Mol.Biol.222：581-97)。文库构建是根据Andris-Widhopf等人(2000，Phage Display Laboratory Manual，Barbas等人(编著)，第1版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY第9.1至9.22页)进行。最终Fab片段用限制性核酸内切酶消化并且被插入噬菌体基因组中以制得噬菌体展示文库。这类文库可通过标准噬菌体展示方法来筛选，如本领域中已知的(参见，例如Pasqualini和Ruoslahti，1996，Nature 380：364-366；Pasqualini，1999，The Quart.J.Nucl.Med.43：159-162)。
(同上)。RNA被转变为cDNA并且用于使用针对重链和轻链免疫球蛋白序列的特异性引
物来制备Fab cDNA文库(Marks等人，1991，J.Mol.Biol.222：581-97)。文库构建是根据Andris-Widhopf等人(2000，Phage Display Laboratory Manual，Barbas等人(编著)，第1版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY第9.1至9.22页)进行。最终Fab片段用限制性核酸内切酶消化并且被插入噬菌体基因组中以制得噬菌体展示文库。这类文库可通过标准噬菌体展示方法来筛选，如本领域中已知的(参见，例如Pasqualini和Ruoslahti，1996，Nature 380：364-366；Pasqualini，1999，The Quart.J.Nucl.Med.43：159-162)。
[0080] 可以多种形式进行噬菌体展示，对于它们的综述，参见，例如Johnson和Chiswell，Current Opinion in Structural Biology 3：5564-571(1993)。还可由体外激活的B细胞来生成人抗体。参见美国专利号5,567,610和5,229,275，它们以引用的方式整体并入本文。熟练的技术人员将认识到这些技术是示例性的并且可利用用于制备和筛选人抗体或抗体片段的任何已知方法。
[0081] 在另一替代方案中，已经被基因工程化以产生人抗体的转基因动物可用于使用标准免疫方案生成针对基本上任何免疫原性靶标的抗体。用于从转基因小鼠获得人抗体的方法是由Green等人，Nature Genet.7：13(1994)、Lonberg等人，Nature 368：856(1994)以及Taylor等人，Int.Immun.6：579(1994)公开。这类系统的一个非限制性实例是来自Abgenix(Fremont，CA)的 (例如，Green等人，1999，J.Immunol.Methods231：11-23)。在 和类似动物中，小鼠抗体基因已经失活并且被替换为功能
性人抗体基因，而小鼠免疫系统的其余部分保持完整。
性人抗体基因，而小鼠免疫系统的其余部分保持完整。
[0082] 将 用含有人IgH和Igκ基因座的部分，包括大部分可变区序列连同辅助基因和调控序列的种系构型YAC(酵母人工染色体)转化。人可变区库可
用来生成产生抗体的B细胞，所述B细胞可通过已知技术加工成杂交瘤。用靶抗原免
疫的 将通过正常免疫应答产生人抗体，其可通过以上所讨论的标准技术
收获和/或产生。可获得 的多种品系，其各自均能够产生不同类别的抗
体。已示出转基因产生的人抗体具有治疗潜能，同时保留正常人抗体的药物代谢动力学性质(Green等人，1999)。熟练技术人员将认识到，要求保护的组合物和方法不限于使用系统，但可利用已被基因工程化以产生人抗体的任何转基因动物。
用来生成产生抗体的B细胞，所述B细胞可通过已知技术加工成杂交瘤。用靶抗原免
疫的 将通过正常免疫应答产生人抗体，其可通过以上所讨论的标准技术
收获和/或产生。可获得 的多种品系，其各自均能够产生不同类别的抗
体。已示出转基因产生的人抗体具有治疗潜能，同时保留正常人抗体的药物代谢动力学性质(Green等人，1999)。熟练技术人员将认识到，要求保护的组合物和方法不限于使用系统，但可利用已被基因工程化以产生人抗体的任何转基因动物。
[0083] 抗体片段
[0084] 识别特定表位的抗体片段可通过已知技术产生。抗体片段是抗体的抗原结合部分，如F(ab′)2、Fab′、F(ab)2、Fab、Fv、sFv等等。F(ab′)2片段可通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生并且Fab′片段可通过还原F(ab′)2片段的二硫桥产生。或者，可构建Fab′表达文库(Huse等人，1989，Science，246：1274-1281)以允许快速且容易的识别具有所需特异性的单克隆Fab′片段。F(ab)2片段可通过抗体的木瓜蛋白酶消化产生。
[0085] 单链Fv分子(scFv)包含VL结构域和VH结构域。VL和VH结构域缔合以形成靶结合位点。这两个结构域进一步通过肽接头(L)共价连接。用于制造scFv分子和
设计适合的肽接头的方法描述于美国专利号4,704,692、美国专利号4,946,778、R.Raag和M.Whitlow， ″Single Chain Fvs. ″ FASEB第9 卷：73-80(1995) 以 及 R.E.Bird和B.W.Walker，″Single Chain Antibody Variable Regions，″TIBTECH，第9卷：
132-137(1991)中。
设计适合的肽接头的方法描述于美国专利号4,704,692、美国专利号4,946,778、R.Raag和M.Whitlow， ″Single Chain Fvs. ″ FASEB第9 卷：73-80(1995) 以 及 R.E.Bird和B.W.Walker，″Single Chain Antibody Variable Regions，″TIBTECH，第9卷：
132-137(1991)中。
[0086] 用于产生单结构域抗体的技术也是本领域中已知的，如公开在例如Cossins等人(2006，Prot Express Purif 51：253-259)中，该文献以引用的方式并入本文。单结构域抗体(VHH)可通过标准免疫技术从例如骆驼、羊驼或美洲驼获得。(参见，例如Muyldermans等人，TIBS26：230-235，2001；Yau等人，J Immunol Methods 281：161-75，2003；Maass等人，J Immunol Methods 324：13-25，2007)。VHH可具有有效的抗原结合能力且可与新型表位相互作用，所述表位对常规的VH-VL配对是隐蔽的。(Muyldermans等人，2001)。羊驼血清IgG含有约50％仅有骆驼重链的IgG抗体(HCAb)(Maass等人，2007)。可用已知抗原如TNF-α对羊驼进行免疫，并且VHH可被分离以结合至并中和靶抗原(Maass等人，2007)。扩增实际上全部羊驼VHH编码序列的PCR引物已经被鉴定并可用于构建羊驼VHH噬菌体展示文库，其可用于通过本领域中熟知的标准生物淘选技术进行抗体片段分离(Maass等人，
2007)。在某些实施方案中，抗胰腺癌VHH抗体片段可在要求保护的组合物和方法中使用。
2007)。在某些实施方案中，抗胰腺癌VHH抗体片段可在要求保护的组合物和方法中使用。
[0087] 抗体片段可通过蛋白水解全长抗体或通过在大肠杆菌或编码所述片段的DNA的另一宿主中表达来制备。抗体片段可通过借助于常规方法进行全长抗体的胃蛋白酶或木瓜蛋白酶消化而获得。这些方法是由例如Goldenberg，美国专利号4,036,945和4,331,647及其中所含的参考文献描述。还参见Nisonoff等人，Arch Biochem.Biophys.89：230(1960)；Porter，Biochem.J.73：119(1959)，Edelman等人，METHODS IN ENZYMOLOGY第1卷，第422页(Academic Press1967)，及Coligan在第2.8.1-2.8.10页和第2.10.-2.10.4页。
[0088] 已知抗体
[0089] 在各种实施方案中，要求保护的方法和组合物可利用本领域中已知的多种抗体中的任一种。使用的抗体可以从多种已知来源商购获得。例如，多种分泌抗体的杂交瘤系是从美国典型培养物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)获得。针对包括但不限于肿瘤相关抗原的各种疾病靶标的大量抗体已经在ATCC保藏和/或已经公开可变区序列并且可以获得以供在要求保护的方法和组合物中使用。参见，例如美国专利号7,312,318；7,282,567；7,151,164；7,074,403；7,060,802；7,056,509；7,049,060；7,045,132；7,041,803；
7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；7,001,598；6,998,468；
6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；6,964,854；6,962,981；
6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；6,943,020；6,939,547；
6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；6,916,475；6,905,681；
6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；6,881,405；6,878,812；
6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；6,861,227；6,861,226；
6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；6,812,206；6,793,924；
6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；6,764,679；6,743,898；
6,733,981；6,730,307；6,720,155；6,716,966；6,709,653；6,693,176；6,692,908；
6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；6,682,734；6,673,344；
6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；6,610,294；6,605,441；
6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572,856；6,566,076；6,562,618；
6,545,130；6,544,749；6,534,058；6,528,625；6,528,269；6,521,227；6,518,404；
6,511,665；6,491,915；6,488,930；6,482,598；6,482,408；6,479,247；6,468,531；
6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；6,455,040；6,451,310；
6,444,206 ′ 6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；6,413,726；6,406,694；
6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；6,383,759；6,383,484；
6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；6,355,245；6,355,244；
6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；6,306,393；6,254,868；
6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；6,077,499；5,922,302；
5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；5,736,119；5,716,595；
5,677,136；5,587,459；5,443,953，5,525,338，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文。这些仅仅是示例性的并且多种其它抗体及其杂交瘤在本领域中是已知的。熟练技术人员将认识到，针对几乎任何疾病相关抗原抗体序列或的分泌抗体的杂交瘤可以通过简单搜索ATCC、NCBI和/或USPTO数据库的针对目标所选疾病相关靶标的抗体而获得。克隆抗体的抗原结合结构域可以使用本领域中熟知的标准技术进行扩增、切除、连接到表达载体中、转染到适应的宿主细胞中并且被用于蛋白质生产(参见，例如美国专利号7,531,327；
7,537,930；7,608,425以及7,785,880，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。
7,041,802；7,041,293；7,038,018；7,037,498；7,012,133；7,001,598；6,998,468；
6,994,976；6,994,852；6,989,241；6,974,863；6,965,018；6,964,854；6,962,981；
6,962,813；6,956,107；6,951,924；6,949,244；6,946,129；6,943,020；6,939,547；
6,921,645；6,921,645；6,921,533；6,919,433；6,919,078；6,916,475；6,905,681；
6,899,879；6,893,625；6,887,468；6,887,466；6,884,594；6,881,405；6,878,812；
6,875,580；6,872,568；6,867,006；6,864,062；6,861,511；6,861,227；6,861,226；
6,838,282；6,835,549；6,835,370；6,824,780；6,824,778；6,812,206；6,793,924；
6,783,758；6,770,450；6,767,711；6,764,688；6,764,681；6,764,679；6,743,898；
6,733,981；6,730,307；6,720,155；6,716,966；6,709,653；6,693,176；6,692,908；
6,689,607；6,689,362；6,689,355；6,682,737；6,682,736；6,682,734；6,673,344；
6,653,104；6,652,852；6,635,482；6,630,144；6,610,833；6,610,294；6,605,441；
6,605,279；6,596,852；6,592,868；6,576,745；6,572,856；6,566,076；6,562,618；
6,545,130；6,544,749；6,534,058；6,528,625；6,528,269；6,521,227；6,518,404；
6,511,665；6,491,915；6,488,930；6,482,598；6,482,408；6,479,247；6,468,531；
6,468,529；6,465,173；6,461,823；6,458,356；6,455,044；6,455,040；6,451,310；
6,444,206 ′ 6,441,143；6,432,404；6,432,402；6,419,928；6,413,726；6,406,694；
6,403,770；6,403,091；6,395,276；6,395,274；6,387,350；6,383,759；6,383,484；
6,376,654；6,372,215；6,359,126；6,355,481；6,355,444；6,355,245；6,355,244；
6,346,246；6,344,198；6,340,571；6,340,459；6,331,175；6,306,393；6,254,868；
6,187,287；6,183,744；6,129,914；6,120,767；6,096,289；6,077,499；5,922,302；
5,874,540；5,814,440；5,798,229；5,789,554；5,776,456；5,736,119；5,716,595；
5,677,136；5,587,459；5,443,953，5,525,338，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文。这些仅仅是示例性的并且多种其它抗体及其杂交瘤在本领域中是已知的。熟练技术人员将认识到，针对几乎任何疾病相关抗原抗体序列或的分泌抗体的杂交瘤可以通过简单搜索ATCC、NCBI和/或USPTO数据库的针对目标所选疾病相关靶标的抗体而获得。克隆抗体的抗原结合结构域可以使用本领域中熟知的标准技术进行扩增、切除、连接到表达载体中、转染到适应的宿主细胞中并且被用于蛋白质生产(参见，例如美国专利号7,531,327；
7,537,930；7,608,425以及7,785,880，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。
[0090] 在要求保护的方法和组合物的范围内可用于治疗癌症的具体抗体包括但不限于LL1(抗CD74)、LL2和RFB4(抗CD22)、RS7(抗上皮糖蛋白-1(EGP-1))、PAM4和KC4(两者都是抗粘蛋白)、MN-14(抗癌胚抗原(CEA，又名CD66e)、Mu-9(抗结肠特异性抗原-p)、Immu31(抗甲胎蛋白)、TAG-72(例如，CC49)、Tn、J591或HuJ591(抗PSMA(前列腺特
异性膜抗原))、AB-PG1-XG1-026(抗PSMA二聚物)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗碳酸酐酶
IX)、hL243(抗HLA-DR)、阿来组单抗(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗
EGFR)、吉妥单抗(抗CD33)、替伊莫单抗(抗CD20)、帕尼单抗(抗EGFR)、利妥昔单抗(抗CD20)、托西莫单抗(抗CD20)、GA101(抗CD20)以及曲妥单抗(抗ErbB2)。这类抗体在
本领域中是已知的(例如，美国专利号5,686,072；5,874,540；6,107,090；6,183,744；
6,306,393；6,653,104；6,730.300；6,899,864；6,926,893；6,962,702；7,074,403；
7,230,084；7,238,785；7,238,786；7,256,004；7,282,567；7,300,655；7,312,318；
7,585,491；7,612,180；7,642,239；以及美国专利申请公布号20040202666(现已放弃)；
20050271671；及20060193865；每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。使用的具体已知抗体包括hPAM4(美国专利号7,282,567)、hA20(美国专利号7,251,164)、hA19(美国专利号7,109,304)、hIMMU-31(美国专利号7,300,655)、hLL1(美国专利号7,312,318)、hLL2(美国专利号7,074,403)、hMu-9(美国专利号7,387,773)、hL243(美国专利号
7,612,180)、hMN-14(美国专利号6,676,924)、hMN-15(美国专利号7,541,440)、hR1(美国专利申请12/772,645)、hRS7(美国专利号7,238,785)、hMN-3(美国专利号7,541,440)、AB-PG1-XG1-026(美国专利申请11/983,372，保藏为ATCC PTA-4405和PTA-4406)以及D2/B(WO 2009/130575)，每个列举的专利或申请的关于附图和实施例部分的文本以引用的方式并入本文。
异性膜抗原))、AB-PG1-XG1-026(抗PSMA二聚物)、D2/B(抗PSMA)、G250(抗碳酸酐酶
IX)、hL243(抗HLA-DR)、阿来组单抗(抗CD52)、贝伐单抗(抗VEGF)、西妥昔单抗(抗
EGFR)、吉妥单抗(抗CD33)、替伊莫单抗(抗CD20)、帕尼单抗(抗EGFR)、利妥昔单抗(抗CD20)、托西莫单抗(抗CD20)、GA101(抗CD20)以及曲妥单抗(抗ErbB2)。这类抗体在
本领域中是已知的(例如，美国专利号5,686,072；5,874,540；6,107,090；6,183,744；
6,306,393；6,653,104；6,730.300；6,899,864；6,926,893；6,962,702；7,074,403；
7,230,084；7,238,785；7,238,786；7,256,004；7,282,567；7,300,655；7,312,318；
7,585,491；7,612,180；7,642,239；以及美国专利申请公布号20040202666(现已放弃)；
20050271671；及20060193865；每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。使用的具体已知抗体包括hPAM4(美国专利号7,282,567)、hA20(美国专利号7,251,164)、hA19(美国专利号7,109,304)、hIMMU-31(美国专利号7,300,655)、hLL1(美国专利号7,312,318)、hLL2(美国专利号7,074,403)、hMu-9(美国专利号7,387,773)、hL243(美国专利号
7,612,180)、hMN-14(美国专利号6,676,924)、hMN-15(美国专利号7,541,440)、hR1(美国专利申请12/772,645)、hRS7(美国专利号7,238,785)、hMN-3(美国专利号7,541,440)、AB-PG1-XG1-026(美国专利申请11/983,372，保藏为ATCC PTA-4405和PTA-4406)以及D2/B(WO 2009/130575)，每个列举的专利或申请的关于附图和实施例部分的文本以引用的方式并入本文。
[0091] 抗TNF-α抗体为本领域中已知的，并且可用于治疗免疫疾病如自身免疫疾病、免疫功能障碍(例如，移植物抗宿主疾病、器官移植排斥)或糖尿病。已知的针对TNF-α的抗体包括人抗体CDP571(Ofei等人，2011，Diabetes 45：881-85)；鼠抗体MTNFAI、M2TNFAI、M3TNFAI、M3TNFABI、M302B以及M303(Thermo Scientific，Rockford，IL)；英利昔单抗(Centocor，Malvern，PA)；赛妥珠单抗(UCB，Brussels，Belgium)；以及阿达木单抗(Abbott，Abbott Park，IL)。这些和许多其它已知的抗TNF-α抗体可用于要求保护的方法和组合物中。用于治疗免疫失调或自身免疫疾病的其它抗体包括但不限于抗B细胞抗体，如维妥珠单抗、依帕珠单抗、米拉珠单抗或hL243；托珠单抗(抗IL-6受体)；巴利昔单抗(抗CD25)；达利珠单抗(抗CD25)；依法利珠单抗(抗CD11a)；莫罗单抗-CD3(抗CD3受体)；抗CD40L(UCB，Brussels，Belgium)；那他珠单抗(抗α4整联蛋白)以及奥马珠单抗(抗IgE)。
[0092] 1型和2型糖尿病可以使用针对以下B细胞抗原的已知抗体来治疗：如CD22(依帕珠单抗)、CD74(米拉珠单抗)、CD19(hA19)、CD20(维妥珠单抗)或HLA-DR(hL243)(参见，例如Winer等人，2011，Nature Med 17：610-18)。还建议将抗CD3抗体用于治疗1型糖尿病(Cernea等人，2010，Diabetes Metab Rev 26：602-05)。
[0093] 巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)是先天性和适应性免疫以及细胞凋亡的重要调节剂。据报道，CD74是MIF的内源性受体(Leng等人，2003，J Exp Med 197：1467-76)。拮抗性抗CD74抗体对MIF介导的细胞内途径的治疗作用可用于治疗多种疾病状态，如膀胱癌、前列腺癌、乳癌、肺癌、结肠癌以及慢性淋巴细胞性白血病(例如，Meyer-Siegler等人，2004，BMC Cancer 12：34；Shachar&Haran，2011，Leuk Lymphoma 52：1446-54)；自身免疫疾病如类风湿性关节炎和全身性红斑狼疮(Morand&Leech，2005，Front Biosci 10：12-22；
Shachar&Haran，2011，Leuk Lymphoma 52：1446-54)；肾疾病如肾脏同种异体移植物排斥(Lan，2008，Nephron Exp Nephrol.109：e79-83)；以及众多炎性疾病(Meyer-Siegler等人，2009，Mediators Inflamm epub 2009年3月22日；Takahashi等人，2009，Respir Res
10：33；米拉珠单抗(hLL1)为治疗性用于治疗MIF介导的疾病的示例性抗CD74抗体。
Shachar&Haran，2011，Leuk Lymphoma 52：1446-54)；肾疾病如肾脏同种异体移植物排斥(Lan，2008，Nephron Exp Nephrol.109：e79-83)；以及众多炎性疾病(Meyer-Siegler等人，2009，Mediators Inflamm epub 2009年3月22日；Takahashi等人，2009，Respir Res
10：33；米拉珠单抗(hLL1)为治疗性用于治疗MIF介导的疾病的示例性抗CD74抗体。
[0094] 本发明的药物组合物可用来治疗具有代谢性疾病(如淀粉样变性)或神经退化性疾病(如阿尔茨海默氏疾病)的受试者。巴匹珠单抗(Bapineuzumab)正处于阿尔
茨海默氏疾病疗法的临床试验中。其它提出用于治疗阿尔茨海默氏疾病的抗体包括Alz
50(Ksiezak-Reding等人，1987，J Biol Chem 263：7943-47)、罗氏单抗和苏兰珠单抗。已报道了抗TNF-α抗体英利昔单抗减少淀粉样蛋白斑并且改进认知。
茨海默氏疾病疗法的临床试验中。其它提出用于治疗阿尔茨海默氏疾病的抗体包括Alz
50(Ksiezak-Reding等人，1987，J Biol Chem 263：7943-47)、罗氏单抗和苏兰珠单抗。已报道了抗TNF-α抗体英利昔单抗减少淀粉样蛋白斑并且改进认知。
[0095] 在一个优选实施方案中，可使用要求保护的组合物和方法治疗的疾病包括心血管疾病，如纤维蛋白凝块、动脉粥样硬化、心肌缺血和梗塞。纤维蛋白的抗体(例如，scFv(59D8)；T2G1；MH1)为已知的并且正作为用于显露所述凝块和肺栓塞的成像剂处于临床试验中，而抗粒细胞抗体(如MN-3、MN--15、抗NCA95和抗CD15抗体)可靶向心肌梗塞和心肌缺血。(参见，例如美国专利号5,487,892；5,632,968；6,294,173；7,541,440，所述专利各自的实施例部分均以引用的方式并入本文)。可使用抗巨噬细胞、抗低密度脂蛋白(LDL)、抗MIF和抗CD74(例如，hLL1)抗体来靶向动脉粥样硬化斑块。阿昔单抗(抗糖蛋白IIb/IIIa)已批准在经皮冠状动脉介入治疗和不稳定心绞痛的治疗中辅助用于预防再狭窄(Waldmann等人，2000，Hematol 1：394-408)。已报道了抗CD3抗体降低动脉粥样硬化的发展和进展(Steffens等人，2006，Circulation 114：1977-84)。针对氧化的LDL的抗体在小鼠模型中诱导已建立的动脉粥样硬化的消退(Ginsberg，2007，J Am Coll Cardiol52：
2319-21)。示出抗ICAM-1抗体在大鼠中减少脑动脉闭塞后的缺血性细胞损伤(Zhang等
人，1994，Neurology 44：1747-51)。针对白细胞抗原的商业上可获得的单克隆抗体由以下代表：OKT抗T细胞单克隆抗体(可获自Ortho Pharmaceutical Company)，其结合正常T淋巴细胞；由具有ATCC登录号HB44、HB55、HB12、HB78和HB2的杂交瘤产生的单克隆抗体；G7E11、W8E7、NKP15和GO22(Becton Dickinson)；NEN9.4(New England Nuclear)；以及FMC11(Sera Labs)。针对纤维蛋白和血小板抗原的抗体的描述包含于Knight，Semin.Nucl.Med.，20：52-67(1990)中。
2319-21)。示出抗ICAM-1抗体在大鼠中减少脑动脉闭塞后的缺血性细胞损伤(Zhang等
人，1994，Neurology 44：1747-51)。针对白细胞抗原的商业上可获得的单克隆抗体由以下代表：OKT抗T细胞单克隆抗体(可获自Ortho Pharmaceutical Company)，其结合正常T淋巴细胞；由具有ATCC登录号HB44、HB55、HB12、HB78和HB2的杂交瘤产生的单克隆抗体；G7E11、W8E7、NKP15和GO22(Becton Dickinson)；NEN9.4(New England Nuclear)；以及FMC11(Sera Labs)。针对纤维蛋白和血小板抗原的抗体的描述包含于Knight，Semin.Nucl.Med.，20：52-67(1990)中。
[0096] 可使用的其它抗体包括针对感染性疾病因子如细菌、病毒、支原体或其它病原体的抗体。针对这种感染性因子的许多抗体在本领域中是已知的并且任何这种已知抗体可在要求保护的方法和组合物中使用。例如，针对人免疫缺陷病毒I(HIV-1)的gp120糖蛋白抗原的抗体是已知的，并且此类抗体中的某些可在人中具有免疫保护作用。参见，例如Rossi等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.86：8055-8058，1990。已知的抗HIV抗体包括由Johansson等人(AIDS.2006年10月3日；20(15)：1911-5)所述的抗包膜抗体、以及由Polymun(Vienna，Austria)描述和售出的抗HIV抗体，也描述在美国专利5,831,034、美国专利5,911,989以及Vcelar等人，AIDS 2007；21(16)：2161-2170及Joos等人，
Antimicrob.Agents Chemother.2006；50(5)：1773-9中，全部文献都以引用的方式并入本文。
Antimicrob.Agents Chemother.2006；50(5)：1773-9中，全部文献都以引用的方式并入本文。
[0097] 抗疟原虫的抗体可针对孢子体、裂殖子、裂殖体及配子体阶段。单克隆抗体已针对孢子体(环子孢子抗原)产生，并且已显示在体外及啮齿动物中中和孢子体(N.Yoshida等人，Science 207：71-73，1980)。几个小组已开发针对刚地弓形虫的抗体，刚地弓形虫是弓形体病中所涉及的原生动物寄生虫(Kasper等人，J.Immunol.129：1694-1699，1982；同上，30：2407-2412，1983)。已开发了针对童虫(schistosomular)表面抗原的抗体并且已发现其在体内或体外作用于童虫(Simpson等人，Parasitology，83：163-177，1981；Smith等人，Parasitology，84：83-91，1982；Gryzch等人，J.Immunol.，129：2739-2743，1982；Zodda等人，J.Immunol.129：2326-2328，1982；Dissous等人，J.immunol.，129：2232-2234，1982)。
[0098] 克氏锥虫是南美洲锥虫病的致病物，并且通过吸血猎蝽昆虫来传播。已产生在体外特异性地抑制一种形式的寄生虫分化为另一种(短膜型鞭毛虫至锥鞭体阶段)的抗体，并且所述抗体与细胞表面糖蛋白反应；然而，此抗原是哺乳动物(血流)形式的寄生虫所缺少的(Sher等人，Nature，300：639-640，1982)。
[0099] 抗真菌抗体是本领域中已知的，如抗核盘霉抗体(美国专利7,910,702)；抗葡萄糖醛酸木甘露聚糖抗体(Zhong和Priofski，1998，Clin Diag Lab Immunol 5：58-64)；抗念珠菌属抗体(Matthews和Burnie，2001，2：472-76)；以及抗鞘糖脂抗体(Toledo等人，2010，BMC Microbiol10：47)。
[0100] 已开发针对造成人中的大多数感染的大部分微生物(细菌、病毒、原生动物、真菌、其它寄生虫)的适合的抗体，并且许多先前已用于体外诊断目的。可通过常规方法产生的这些抗体及更新的抗体适用于本发明中。
[0101] 双特异性及多特异性抗体
[0102] 双特异性或多特异性抗体可通过多种程序来制备，所述工序包括在官能团之间的戊二醛连接直至更特别的连接。抗体和/或抗体片段优选彼此直接或经由接头部分，经由抗体或片段上的一个或多个官能团例如胺基、羧基、苯基、巯基或羟基而共价结合。可以使用除戊二醛以外的各种常规接头，例如二异氰酸酯、二异硫氰酸酯、二(羟基琥珀酰亚胺)酯、碳二亚胺、马来酰亚胺羟基-琥珀酰亚胺酯等。接头的最佳长度可根据靶细胞类型而变化。
[0103] 产生多价抗体的简单方法是在戊二醛存在下混合抗体或片段。初始希夫碱连接基团可通过例如硼氢化物还原成仲胺而被稳定。二异硫氰酸酯或碳二亚胺可用于代替戊二醛而作为非位点特异性接头。
[0104] 最简单形式的多价、多特异性抗体是双特异性抗体。双特异性抗体可通过多种常规方法制备，例如二硫化物裂解和完整IgG或优选F(ab′)2片段的混合物的重建，融合多于一个杂交瘤从而形成产生具有多于一种特异性的抗体的多瘤，和通过基因工程化。已经通过对由不同抗体的还原裂解产生的Fab′片段的氧化裂解而制备双特异性抗体。这方便地通过如下方式实施：混合用胃蛋白酶消化两种不同抗体而产生的两种不同的F(ab′)2片段，还原裂解以形成Fab′片段的混合物，然后氧化重建二硫键以产生包括含有特异性针对每个原始表位的Fab′部分的双特异性抗体的F(ab′)2片段的混合物。
[0105] 用于制备多价抗体的一般技术可见于例如Nisonhoff等人，Arch Biochem.Biophys.93：470(1961)，Hammerling等人，J.Exp.Med.128：1461(1968)，及美国专利号
4,331,647中。
4,331,647中。
[0106] 通过使用异双官能接头如马来酰亚胺-羟基琥珀酸亚胺酯可实现选择性更高的连接。酯与抗体或片段的反应将在抗体或片段上衍生胺基，然后可将所述衍生物与例如具有游离巯基的抗体Fab片段(或，其上通过例如Traut氏试剂而附接有巯基的较大片段或完整抗体)反应。所述接头不太可能在相同抗体内交联基团并改善了连接的选择性。
[0107] 将抗体或片段在远离抗原结合位点的位点处连接是有利的。这可通过例如如上所述连接于被裂解的链间巯基得以实现。另一方法包括将具有氧化碳水化合物部分的抗体与具有至少一个游离胺官能团的另一抗体反应。这产生了初始希夫碱(亚胺)连接，其优选通过还原成仲胺，例如通过硼氢化物还原以形成最终产物而稳定。对于小分子，所述位点特异性连接公开于美国专利号4,671,958中，而对于较大的附加物则公开于美国专利号4,699,784中。
[0108] 或者，所述双特异性抗体可通过融合产生适当的Mab的两个杂交瘤细胞系而产生。用于产生杂交的杂交瘤的技术是由例如Milstein等人，Nature 305：537(1983)及Pohl等人，Int.J.Cancer 54：418(1993)描述。
[0109] 或者，可设计编码两个结合结构域的嵌合基因。用于通过基因工程化产生双特异性抗体的一般技术是由例如Songsivilai等人，Biochem Biophys Res.Commun164：271(1989)；Traunecker等人，EMBOJ.10：3655(1991)；以及Weiner等人，J.Immunol.147：
4035(1991)描述。
4035(1991)描述。
[0110] 更高级的多价、多特异性分子可通过添加各种抗体组分至如上所产生的双特异性抗体中而获得。例如，双特异性抗体可与2-亚氨基硫烷盐酸盐反应以引入一个或多个巯基，从而供使用如上所述的双马来酰亚胺活化成簇将双特异性抗体与其它抗体衍生物偶联使用，所述抗体衍生物结合靶抗原的相同或不同表位。用于产生多价抗体的这些技术是本领域技术人员所熟知的。参见，例如美国专利号4,925,648及Goldenberg的国际公布号WO92/19273，其以引用的方式并入。
[0111] DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)
[0112] 在优选实施方案中，双特异性或多特异性抗体是作为DOCK-AND-LOCKTM(DNLTM)复合物形成(参见，例如美国专利号7,521,056；7,527,787；7,534,866；7,550,143及7,666,400，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文)。通常，技术利用了在cAMP-依赖型蛋白激酶(PKA)的调节(R)亚基的二聚化和对接结构域(DDD)序列与来源于任何多种AKAP蛋白的锚定结构域(AD)序列之间发生的特异性和高亲和力结合相互作用(Baillie等人，FEBS Letters.2005；579：3264。Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。
DDD肽和AD肽可附接至任何蛋白质、肽或其它分子。因为DDD序列自发地二聚化并且结合AD序列，所以技术允许在可附接至DDD序列或AD序列的任何选择的分子之间形成复合物。
DDD肽和AD肽可附接至任何蛋白质、肽或其它分子。因为DDD序列自发地二聚化并且结合AD序列，所以技术允许在可附接至DDD序列或AD序列的任何选择的分子之间形成复合物。
[0113] 虽然标准DNLTM复合物包含具有附接至一个AD连接的分子的两个DDD连接的分子的三聚体，但是复合物结构的变化允许形成二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体以及其TM它多聚体。在一些实施方案中，DNL 复合物可包含结合相同抗原决定簇或两种或更多种不TM
同抗原的两种或更多种抗体、抗体片段或融合蛋白。DNL 复合物还可包含一种或多种其它效应子，如蛋白质、肽、免疫调节剂、细胞因子、白细胞介素、干扰素、结合蛋白、肽配体、载体蛋白、毒素、核糖核酸酶如豹蛙酶(onconase)、抑制性寡核苷酸如siRNA、抗原或异种抗原、聚合物如PEG、酶、治疗剂、激素、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促凋亡剂或任何其它分子或聚集物。
同抗原的两种或更多种抗体、抗体片段或融合蛋白。DNL 复合物还可包含一种或多种其它效应子，如蛋白质、肽、免疫调节剂、细胞因子、白细胞介素、干扰素、结合蛋白、肽配体、载体蛋白、毒素、核糖核酸酶如豹蛙酶(onconase)、抑制性寡核苷酸如siRNA、抗原或异种抗原、聚合物如PEG、酶、治疗剂、激素、细胞毒性剂、抗血管生成剂、促凋亡剂或任何其它分子或聚集物。
[0114] 1968年，首次从兔骨骼肌中分离出PKA，其在由第二信使cAMP结合R亚基而触发的最彻底研究的信号转导途径之一中起关键作用(Walsh等人，J.Biol.Chem.1968；243：3763)。全酶的结构由通过R亚基保持为失活形式的两个催化亚基组成(Taylor，J.Biol.Chem.1989；264：8443)。发现PKA的同工酶具有两种类型的R亚基(RI和RII)，并且每种类型均具有α同种型和β同种型(Scott，Pharmacol.Ther.1991；50：123)。因此，PKA调节亚基的四种同种型为RIα、RIβ、RIIα和RIIβ。R亚基仅分离为稳定二聚体并且示出二聚化结构域由RIIα的前44个氨基末端残基组成(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；
6：222)。如下所讨论，其它调节亚基的氨基酸序列的类似部分涉及在二聚化和对接中，每个部分均位于调节亚基的N-末端附近。cAMP结合R亚基引起用于广谱丝氨酸/苏氨酸激酶
活性的活性催化亚基释放，所述活性催化亚基通过PKA的区室化经过其与AKAP对接而朝向选择的底物(Scott等人，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。
6：222)。如下所讨论，其它调节亚基的氨基酸序列的类似部分涉及在二聚化和对接中，每个部分均位于调节亚基的N-末端附近。cAMP结合R亚基引起用于广谱丝氨酸/苏氨酸激酶
活性的活性催化亚基释放，所述活性催化亚基通过PKA的区室化经过其与AKAP对接而朝向选择的底物(Scott等人，J.Biol.Chem.1990；265；21561)。
[0115] 自从1984年表征了第一种AKAP(微管相关蛋白-2)(Lohmann等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA.1984；81：6723)，已在酵母至人范围内的物种中鉴定出多于50种AKAP具有多种多样的结构，所述AKAP定位至各种亚细胞位点包括质膜、肌动蛋白细胞骨架、细胞核、线粒体以及内质网(Wong和Scott，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2004；5：959)。用于PKA的AKAP的AD为具有14-18个残基的两亲性螺旋(Carr等人，J.Biol.Chem.1991；266：14188)。
AD的氨基酸序列在各个AKAP之间十分不同，其中针对RII二聚体所报道的结合亲和力在
2nM至90nM范围内(Alto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003；100：4445)。AKAP将仅结合二聚R亚基。对于人RIIα，AD结合由23个氨基末端残基形成的疏水表面(Colledge和Scott，Trends Cell Biol.1999；6：216)。因此，人RIIα的二聚化结构域和AKAP结合结构域均位于相同N-末端的44个氨基酸的序列内(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6：
222；Newlon等人，EMBO J.2001；20：1651)，所述44个氨基酸的序列在本文中称为DDD。
AD的氨基酸序列在各个AKAP之间十分不同，其中针对RII二聚体所报道的结合亲和力在
2nM至90nM范围内(Alto等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2003；100：4445)。AKAP将仅结合二聚R亚基。对于人RIIα，AD结合由23个氨基末端残基形成的疏水表面(Colledge和Scott，Trends Cell Biol.1999；6：216)。因此，人RIIα的二聚化结构域和AKAP结合结构域均位于相同N-末端的44个氨基酸的序列内(Newlon等人，Nat.Struct.Biol.1999；6：
222；Newlon等人，EMBO J.2001；20：1651)，所述44个氨基酸的序列在本文中称为DDD。
[0116] 我们已开发了一种平台技术来利用人PKA调节亚基的DDD和AKAP的AD作为一对优良的接头模块用于将任何两个实体(在下文称为A和B)对接成非共价复合物，所述复合物可通过在DDD和AD的至关重要的位置中引入半胱氨酸残基以促进形成二硫键而进一步TM
锁定为DNL 复合物。所述途径的一般方法如下。通过将DDD序列连接至A的前体来构建
实体A，从而产生下文称为a的第一组分。因为DDD序列将实现二聚体的自发形成，因此A将主要由a2组成。通过将AD序列连接至B的前体来构建实体B，从而产生下文称为b的第二组分。a2中含有的DDD的二聚基序将产生用于结合b中含有的AD序列的对接位点，因此促进a2与b容易地缔合以形成由a2b组成的二元三聚复合物。此结合事件通过随后的反
应以经过二硫桥桥共价固定两个实体而不可逆，这基于有效局部浓度的原则非常有效地发生，因为初始结合相互作用会使置于DDD和AD上的反应性硫醇基靠近(Chmura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98：8480)以位点特异性地连接。使用接头、适配子模块和前体TM
的各种组合，可产生和使用广泛多种具有不同化学计量的DNL 构建体(参见，例如美国专利号7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和7,666,400)。
锁定为DNL 复合物。所述途径的一般方法如下。通过将DDD序列连接至A的前体来构建
实体A，从而产生下文称为a的第一组分。因为DDD序列将实现二聚体的自发形成，因此A将主要由a2组成。通过将AD序列连接至B的前体来构建实体B，从而产生下文称为b的第二组分。a2中含有的DDD的二聚基序将产生用于结合b中含有的AD序列的对接位点，因此促进a2与b容易地缔合以形成由a2b组成的二元三聚复合物。此结合事件通过随后的反
应以经过二硫桥桥共价固定两个实体而不可逆，这基于有效局部浓度的原则非常有效地发生，因为初始结合相互作用会使置于DDD和AD上的反应性硫醇基靠近(Chmura等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2001；98：8480)以位点特异性地连接。使用接头、适配子模块和前体TM
的各种组合，可产生和使用广泛多种具有不同化学计量的DNL 构建体(参见，例如美国专利号7,550,143；7,521,056；7,534,866；7,527,787和7,666,400)。
[0117] 通过远离两个前体的官能团附接DDD和AD，还预期此类位点特异性连接保留两个前体的原始活性。此方法在本质上为模块化的并且可潜在应用于位点特异性和共价连接广范围的物质，包括肽、蛋白质、抗体、抗体片段以及具有多种活性的其它效应子部分。利用描述于以下实施例中的构建AD和DDD缀合的效应子的融合蛋白方法，可将几乎任何蛋白质或TM肽并入到DNL 构建体中。然而，所述技术并非限制性的并且可利用其它缀合方法。
[0118] 已知用于制备融合蛋白的多种方法，包括核酸合成、杂交和/或扩增以产生编码目标融合蛋白的合成双链核酸。可通过标准分子生物学技术将此类双链核酸插入到用于融合蛋白产生的表达载体中(参见，例如Sambrook等人，Molecular Cloning，A laboratory manual，第2版，1989)。在此类优选的实施方案中，AD和/或DDD部分可附接至效应子蛋白或肽的N-末端或C-末端。然而，熟练的技术人员将认识到，AD或DDD部分附接至效应子部分的位点可取决于效应子部分的化学性质和效应子部分中涉及其生理活性的部分而改变。可使用本领域中已知的技术进行各种效应子部分的位点特异性附接，如使用二价交联试剂和/或其它化学缀合技术。
[0119] AD和DDD部分中的结构-功能关系
[0120] 对于不同类型的DNLTM构建体，可利用不同的AD序列或DDD序列。示例性DDD和AD序列提供于下文中。
[0121] DDD1
[0122] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：1)
[0123] DDD2
[0124] CGHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：2)
[0125] AD1
[0126] QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：3)
[0127] AD2
[0128] CGQIEYLAKQIVDNAIQQAGC(SEQ ID NO：4)
[0129] 熟练的技术人员将认识到，DDD1和DDD2是基于蛋白激酶A的人RIIα同种型的DDD序列。然而，在替代实施方案中，DDD部分和AD部分可基于蛋白激酶A的人RIα形式的DDD序列和相应的AKAP序列，如下以DDD3、DDD3C和AD3所例示。
[0130] DDD3
[0131] SLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO：5)
[0132] DDD3C
[0133] MSCGGSLRECELYVQKHNIQALLKDSIVQLCTARPERPMAFLREYFERLEKEEAK(SEQ ID NO：6)[0134] AD3
[0135] CGFEELAWKIAKMIWSDVFQQGC(SEQ ID NO：7)
[0136] 在其它的替代实施方案中，可在DNLTM复合物的构建中利用AD部分和/或DDD部分的其它序列变体。例如，仅存在对应于PKARIα、RIIα、RIβ和RIIβ的DDD部分的人PKADDD序列的4个变体。RIIαDDD序列为以上公开的DDD1和DDD2的基础。以下示出四种人PKADDD序列。DDD序列代表RIIα的残基1-44、RIIβ的残基1-44、RIo的残基12-61和RIβ的残基13-66。(应注意，DDD1的序列与人PKARIIαDDD部分相比稍有改变。)
[0137] PKA RIa
[0138] SLRECELYVQKHNIQALLKDVSIVQLCTARPERPMAFLREYFEKLEKEEAK(SEQ ID NO：8)
[0139] PKA RIβ
[0140] SLKGCELYVQLHGIQQVLKDCIVHLCISKPERPMKFLREHFEKLEKEENRQILA(SEQ ID NO：9)[0141] PKA RIIα
[0142] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVGQQPPDLVDFAVEYFTRLREARRQ(SEQ ID NO：10)
[0143] PKA RIIβ
[0144] SIEIPAGLTELLQGFTVEVLRHQPADLLEFALQHFTRLQQENER(SEQ ID NO：11)
[0145] 已对AD结构域和DDD结构域的结构-功能关系进行了调查研究。(参见，例如Burns-Hamuro等人，2005，Protein Sci 14：2982-92；Carr等人，2001，J Biol Chem 276：
17332-38；Alto等人，2003，Proc Natl Acad Sci USA 100：4445-50；Hundsrucker等人，
2006，Biochem J396：297-306；Stokka等人，2006，Biochem J 400：493-99；Gold等人，
2006，Mol Cell 24：383-95；Kinderman等人，2006，Mol Cell 24：397-408，所述参考文献各自的整个正文以引用的方式并入本文。)
17332-38；Alto等人，2003，Proc Natl Acad Sci USA 100：4445-50；Hundsrucker等人，
2006，Biochem J396：297-306；Stokka等人，2006，Biochem J 400：493-99；Gold等人，
2006，Mol Cell 24：383-95；Kinderman等人，2006，Mol Cell 24：397-408，所述参考文献各自的整个正文以引用的方式并入本文。)
[0146] 例如，Kinderman等人(2006，Mol Cell 24：397-408)检查了AD-DDD结合相互作用的晶体结构，并且得出结论人DDD序列含有以下在SEQ ID NO：1中加下划线的在二聚体形成或AKAP结合中重要的许多保守氨基酸残基。(参见Kinderman等人，2006的图1，其以引用的方式并入本文。)熟练的技术人员将认识到，在设计DDD序列的序列变体时，将希望避免改变任何加下划线的残基，而对于二聚化和AKAP结合不太关键的残基可进行保守氨基酸取代。
[0147] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：1)
[0148] 如下所更详细地讨论，已表征保守氨基酸取代的二十种常见L-氨基酸中的每一种。因此，基于Kinderman(2006)和保守氨基酸取代的数据，基于SEQ ID NO：1的潜在替代DDD序列在表1中示出。在设计表1中，仅考虑高度保守的氨基酸取代。例如，带电荷的残基仅取代具有相同电荷的残基，具有小侧链的残基被类似大小的残基取代，羟基侧链仅被其它羟基取代等。因为脯氨酸对氨基酸二级结构的独特作用，没有其它残基取代脯氨酸。有限数量的此类潜在替代DDD部分序列在以下SEQ ID NO：12至SEQ ID NO：31中示出。熟练的技术人员将认识到，DDD部分的属种内数目几乎不受限制的替代种类可通过标准技术，例如使用商业肽合成器或熟知的定点诱变技术来构建。氨基酸取代对AD部分结合的作用还可容易地通过例如在Alto等人(2003，Proc Natl Acad Sci USA 100：4445-50)中所公开的标准结合测定来确定。
[0149] 表1.DDD1(SEQ ID NO：1)中的保守氨基酸取代。共有序列公开为SEQ ID NO：87。
[0150]
[0151]
[0152] THIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：12)
[0153] SKIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：13)
[0154] SRIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：14)
[0155] SHINIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：15)
[0156] SHIQIPPALTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：16)
[0157] SHIQIPPGLSELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：17)
[0158] SHIQIPPGLTDLLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：18)
[0159] SHIQIPPGLTELLNGYTVEVLRQQPPDLYEFAVEYFTRLREARA(SEQ IDNO：19)
[0160] SHIQIPPGLTELLQAYTVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：20)
[0161] SHIQIPPGLTELLQGYSVEVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：21)
[0162] SHIQIPPGLTELLQGYTVDVLRQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：22)
[0163] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLKQQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：23)
[0164] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRNQPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：24)
[0165] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQNPPDLVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：25)
[0166] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPELVEFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：26)
[0167] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVDFAVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：27)
[0168] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFLVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：28)
[0169] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFIVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：29)
[0170] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFVVEYFTRLREARA(SEQ ID NO：30)
[0171] SHIQIPPGLTELLQGYTVEVLRQQPPDLVEFAVDYFTRLREARA(SEQ ID NO：31)
[0172] Alto等人(2003，Proc Natl Acad Sci USA 100：4445-50)对各种AKAP蛋白的AD序列进行生物信息学分析以设计称为AKAP-IS的RII选择性AD序列(SEQ ID NO：3)，其对DDD的结合常数为0.4nM。将AKAP-IS序列设计成AKAP与PKA结合的肽拮抗剂。AKAP-IS序列中取代倾向于使与DDD的结合减弱的残基在以下SEQ ID NO：3中已加下划线。熟练的技术人员将认识到，在设计AD序列的序列变体时，将希望避免改变任何加下划线的残基，而对于DDD结合不太关键的残基可进行保守氨基酸取代。表2示出AKAP-IS的序列(AD1，SEQ ID NO：3)中的潜在保守氨基酸取代，类似于在以上表1中对于DDD1(SEQ ID NO：1)所示出的保守氨基酸取代。
[0173] 有限数量的此类潜在替代AD部分序列在以下SEQ ID NO：32至SEQ ID NO：49中示出。此外，可能的AD部分序列的属种内的很多种类可通过熟练技术人员基于Alto等人(2003)的数据来制得、测试并且使用。应注意，Alto(2003)的图2示出基于真实结合实验制得并同时保持对DDD部分的结合活性的许多潜在氨基酸取代。
[0174] AKAP-LS
[0175] QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：3)
[0176] 表2.AD1(SEQ ID NO：3)中的保守氨基酸取代。共有序列公开为SEQ ID NO：88。
[0177]
[0178] NIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：32)
[0179] QLEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：33)
[0180] QVEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：34)
[0181] QIDYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：35)
[0182] QIEFLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：36)
[0183] QIETLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：37)
[0184] QIESLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：38)
[0185] QIEYIAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：39)
[0186] QIEYVAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：40)
[0187] QIEYLARQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：41)
[0188] QIEYLAKNIVDNAIQQA(SEQ ID NO：42)
[0189] QIEYLAKQIVENAIQQA(SEQ ID NO：43)
[0190] QIEYLAKQIVDQAIQQA(SEQ ID NO：44)
[0191] QIEYLAKQIVDNAINQA(SEQ ID NO：45)
[0192] QIEYLAKQIVDNAIQNA(SEQ ID NO：46)
[0193] QIEYLAKQIVDNAIQQL(SEQ ID NO：47)
[0194] QIEYLAKQIVDNAIQQI(SEQ ID NO：48)
[0195] QIEYLAKQIVDNAIQQV(SEQ ID NO：49)
[0196] Gold等人(2006，Mol Cell 24：383-95)利 用结 晶学 和肽 筛选 开发 出SuperAKAP-IS序列(SEQ ID NO：50)，其对PKA的RII同种型展现出与RI同种型相比高5个数量级的选择性。加下划线的残基指示相对于AKAP-IS序列的氨基酸取代的位置，所述氨基酸取代增加对RIIα的DDD部分的结合。在此序列中，N-末端Q残基编号为残基编号4
并且C-末端A残基为残基编号20。可进行取代以影响对RIIα的亲和力的残基为残基8、
11、15、16、18、19和20(Gold等人，2006)。预期在某些替代实施方案中，可用SuperAKAP-ISTM
序列取代AKAP-IS AD部分序列来制备DNL 构建体。可用来取代AKAP-IS AD序列的其它
替代序列于SEQ ID NO：51-53中示出。相对于AKAP-IS序列的取代已加下划线。预期如同SEQ ID NO：4中示出的AD2序列，AD部分还可包括额外的N-末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C-末端残基甘氨酸和半胱氨酸。
并且C-末端A残基为残基编号20。可进行取代以影响对RIIα的亲和力的残基为残基8、
11、15、16、18、19和20(Gold等人，2006)。预期在某些替代实施方案中，可用SuperAKAP-ISTM
序列取代AKAP-IS AD部分序列来制备DNL 构建体。可用来取代AKAP-IS AD序列的其它
替代序列于SEQ ID NO：51-53中示出。相对于AKAP-IS序列的取代已加下划线。预期如同SEQ ID NO：4中示出的AD2序列，AD部分还可包括额外的N-末端残基半胱氨酸和甘氨酸以及C-末端残基甘氨酸和半胱氨酸。
[0197] SuperAKAP-IS
[0198] QIEYVAKQIVDYAIHQA(SEQ ID NO：50)
[0199] 替代AKAP序列
[0200] QIEYKAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：51)
[0201] QIEYHAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：52)
[0202] QIEYVAKQIVDHAIHQA(SEQ ID NO：53)
[0203] Gold等人的图2公开了来自多种AKAP蛋白的另外DDD结合序列，如下所示。
[0204] RII-特异性AKAP
[0205] AKAP-KL
[0206] PLEYQAGLLVQNAIQQAI(SEQ ID NO：54)
[0207] AKAP79
[0208] LLIETASSLVKNAIQLSI(SEQ ID NO：55)
[0209] AKAP-Lbc
[0210] LIEAASRIVDAVIEQVK(SEQ ID NO：56)
[0211] RI-特异性AKAP
[0212] AKAPce
[0213] ALYQFADRFSELVISEAL(SEQ ID NO：57)
[0214] RIAD
[0215] LEQVANQLADQIIKEAT(SEQ ID NO：58)
[0216] PV38
[0217] FEELAWKIAKMIWSDVF(SEQ ID NO：59)
[0218] 双特异性AKAP
[0219] AKAP7
[0220] ELVRLSKRLVENAVLKAV(SEQ ID NO：60)
[0221] MAP2D
[0222] TAEEVSARIVQVVTAEAV(SEQ ID NO：61)
[0223] DAKAP1
[0224] QIKQAAFQLISQVILEAT(SEQ ID NO：62)
[0225] DAKAP2
[0226] LAWKIAKMIVSDVMQQ(SEQ ID NO：63)
[0227] Stokka等人(2006，Biochem J 400：493-99)还开发出AKAP与PKA结合的肽竞争剂，如在SEQ ID NO：64-66中示出。肽拮抗剂命名为Ht31(SEQ ID NO：64)、RIAD(SEQ ID NO：65)和PV-38(SEQ ID NO：66)。Ht-31肽对于PKA的RII同种型展现出较高的亲和力，而RIAD和PV-38对于RI示出较高的亲和力。
[0228] Ht31
[0229] DLIEEAASRIVDAVIEQVKAAGAY(SEQ ID NO：64)
[0230] RIAD
[0231] LEQYANQLADQIIKEATE(SEQ ID NO：65)
[0232] PV-38
[0233] FEELAWKIAKMIWSDVFQQC(SEQ ID NO：66)
[0234] Hundsrucker等人(2006，Biochem J 396：297-306)开发出AKAP与PKA的结合的其它肽竞争剂，与PKA的RII形式的DDD的结合常数低至0.4nM。各种AKAP拮抗性肽的序列提供于Hundsrucker等人的表1中，再现于以下表3中。AKAPIS代表一种合成的RII亚
基结合肽。所有其它肽均来源于所指示的AKAP的RII结合结构域。
基结合肽。所有其它肽均来源于所指示的AKAP的RII结合结构域。
[0235] 表3.AKAP肽序列
[0236]
[0237] 在不同AKAP蛋白的AD结构域中高度保守的残基在以下通过参考AKAP IS序列(SEQ ID NO：3)加下划线指示。残基与Alto等人(2003)所观察到的相同，其中添加了
C-末端丙氨酸残基。(参见Hundsrucker等人(2006)的图4，其以引用的方式并入本文。)对于RII DDD序列具有特别高的亲和力的肽拮抗剂的序列为AKAP-IS、AKAP7δ-wt-pep、AKAP7δ-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep的序列。
C-末端丙氨酸残基。(参见Hundsrucker等人(2006)的图4，其以引用的方式并入本文。)对于RII DDD序列具有特别高的亲和力的肽拮抗剂的序列为AKAP-IS、AKAP7δ-wt-pep、AKAP7δ-L304T-pep和AKAP7δ-L308D-pep的序列。
[0238] AKAP-IS
[0239] QIEYLAKQIVDNAIQQA(SEQ ID NO：3)
[0240] Carr等人(2001，J Biol Chem 276：17332-38)检查了来自人和非人蛋白的不同AKAP-结合DDD序列之间的序列同源性程度并且鉴定在不同DDD部分中看起来似乎为最高度保守的DDD序列中的残基。其在以下通过参考SEQ ID NO：1的人PKARIIαDDD序列加下划线指示。特别保守的残基进一步以斜体指示。残基与Kinderman等人(2006)所提出的对结合AKAP蛋白重要的那些残基重叠，但不与其相同。熟练的技术人员将认识到，在设计DDD的序列变体时，最优选的是避免改变最保守的残基(斜体)，并且优选还避免改变保守残基(加下划线)，而既未加下划线也不是斜体的残基可考虑进行保守氨基酸取代。
[0241] SHIQ P TE Q Y V Q P VE VE IR REA A(SEQ ID NO：1)
[0242] 基于Carr等人(2001)的数据，针对DDD1(SEQ ID NO：1)序列的一组修饰的保守氨基酸取代在表4中示出。甚至对于这个缩减组的取代序列，存在超过65,000个可通过熟练技术人员在无需过多实验的情况下产生、测试和使用的可能替代DDD部分序列。熟练的技术人员可容易地得到此类替代DDD氨基酸序列，如上表1和表2所公开。
[0243] 表4.DDD1(SEQ ID NO：1)中的保守氨基酸取代。共有序列公开为SEQ ID NO：89。
[0244]
[0245]
[0246] 熟练的技术人员将认识到，DDD或AD氨基酸序列中的这些和其它氨基酸取代可用来使用本领域中标准的技术和仅通过常规实验来产生AD或DDD部分的属种内的替代种类。
[0247] 替代的DNLTM结构
[0248] 在某些替代实施方案中，DNLTM构建体可使用替代地构建的抗体或抗体片段来形成，其中AD部分可在κ轻链(Ck)的C末端而非重链Fc的C末端处附接。替代地形成的TM
DNL 构建体可如以下文献中所公开来制备：2012年6月1日提交的临时美国专利申请序列号61/654,310、2012年6月20日提交的61/662,086、2012年7月19日提交的61/673,553、以及2012年8月13日提交的61/682,531，每个专利以引用的方式整体并入本文。轻链缀TM
合的DNL 构建体展现增强的体外Fc效应子功能活性以及改善的体内药物动力学、稳定性及抗淋巴瘤活性(Rossi等人，2013，Bioconjug Chem 24：63-71)。
DNL 构建体可如以下文献中所公开来制备：2012年6月1日提交的临时美国专利申请序列号61/654,310、2012年6月20日提交的61/662,086、2012年7月19日提交的61/673,553、以及2012年8月13日提交的61/682,531，每个专利以引用的方式整体并入本文。轻链缀TM
合的DNL 构建体展现增强的体外Fc效应子功能活性以及改善的体内药物动力学、稳定性及抗淋巴瘤活性(Rossi等人，2013，Bioconjug Chem 24：63-71)。
[0249] Ck缀合的DNLTM构建体可如临时美国专利申请序列号61/654,310、61/662,086、61/673,553以及61/682,531中所公开来制备。简言之，Ck-AD2-IgG是通过重组工程化
产生，借此AD2肽融合至κ轻链的C末端。因为Ck的天然C末端是半胱氨酸残基，其形
成与CH1的二硫桥，16个氨基酸残基的“铰链”接头用于将AD2与Ck-VH1二硫桥间隔开。
Ck-AD2-IgG-维妥珠单抗及Ck-AD2-IgG-依帕珠单抗的哺乳动物表达载体是使用pdHL2载体来构建，其先前被用于表达同源CH3-AD2-IgG模块。合成2208-bp核苷酸序列，其包含pdHL2载体序列，从VK/CK内含子内的Bam HI限制酶切位点到Ck内含子3′处的Xho I限制酶切位点，其中在Ck的编码序列的3′末端处同框插入铰链接头(EFPKPSTPPGSSGGAP，SEQ ID NO：
126)的编码序列及AD2。此合成序列经由Bam HI和Xho I限制酶切位点被插入维妥珠单抗和依帕珠单抗的IgG-pdHL2表达载体中。如针对CH3-AD2-IgG模块所述来进行SpESFX-10的克隆产生。Ck-AD2-IgG-维妥珠单抗和Ck-AD2-IgG-依帕珠单抗是通过在分批滚瓶培养物中稳定转染产生克隆来产生并且使用MabSelect(GE Healthcare)蛋白A亲和色谱法在单一步骤中从上清液中纯化。
产生，借此AD2肽融合至κ轻链的C末端。因为Ck的天然C末端是半胱氨酸残基，其形
成与CH1的二硫桥，16个氨基酸残基的“铰链”接头用于将AD2与Ck-VH1二硫桥间隔开。
Ck-AD2-IgG-维妥珠单抗及Ck-AD2-IgG-依帕珠单抗的哺乳动物表达载体是使用pdHL2载体来构建，其先前被用于表达同源CH3-AD2-IgG模块。合成2208-bp核苷酸序列，其包含pdHL2载体序列，从VK/CK内含子内的Bam HI限制酶切位点到Ck内含子3′处的Xho I限制酶切位点，其中在Ck的编码序列的3′末端处同框插入铰链接头(EFPKPSTPPGSSGGAP，SEQ ID NO：
126)的编码序列及AD2。此合成序列经由Bam HI和Xho I限制酶切位点被插入维妥珠单抗和依帕珠单抗的IgG-pdHL2表达载体中。如针对CH3-AD2-IgG模块所述来进行SpESFX-10的克隆产生。Ck-AD2-IgG-维妥珠单抗和Ck-AD2-IgG-依帕珠单抗是通过在分批滚瓶培养物中稳定转染产生克隆来产生并且使用MabSelect(GE Healthcare)蛋白A亲和色谱法在单一步骤中从上清液中纯化。
[0250] 按照先前对于22-(20)-(20)所述的相同DNL过程(Rossi等人，2009，Blood 113：6161-71)，Ck-AD2-IgG-依帕珠单抗与CH1-DDD2-Fab-维妥珠单抗(一种源自维妥珠单抗的基于Fab的模块)缀合，以产生bsHexAb 22*-(20)-(20)，其中22*表示依帕珠单抗的
Ck-AD2模块且每个(20)代表维妥珠单抗Fab的稳定二聚物。22*-(20)-(20)的性质与
22-(20)-(20)的相当，22-(20)-(20)是包含CH3-AD2-IgG-依帕珠单抗的同源Fc-bsHexAb，其具有类似的组成和分子大小，但不同的构造。
Ck-AD2模块且每个(20)代表维妥珠单抗Fab的稳定二聚物。22*-(20)-(20)的性质与
22-(20)-(20)的相当，22-(20)-(20)是包含CH3-AD2-IgG-依帕珠单抗的同源Fc-bsHexAb，其具有类似的组成和分子大小，但不同的构造。
[0251] 按照先前对于20-2b所述的相同DNL过程(Rossi等人，2009，Blood 114：3864-71)，Ck-AD2-IgG-维妥珠单抗与IFNα2b-DDD2(即在其C末端融合有DDD2肽的
IFNα2b模块)缀合，以产生20*-2b，其包含具有融合至每条轻链的二聚IFNα2b的维妥珠单抗。20*-2b的性质与20-2b的相当，20-2b是同源Fc-IgG-IFNα。
IFNα2b模块)缀合，以产生20*-2b，其包含具有融合至每条轻链的二聚IFNα2b的维妥珠单抗。20*-2b的性质与20-2b的相当，20-2b是同源Fc-IgG-IFNα。
[0252] bsHexAbs和IgG-IFNα各自通过MabSelect亲和色谱法与DNL反应混合物分离。两个源自Ck的原型，即包含依帕珠单抗(抗CD22)和维妥珠单抗(抗CD20)的四个Fab的抗CD22/CD20双特异性六价抗体，及包含维妥珠单抗和四个分子的干扰素-α2b的靶向CD20的免疫细胞因子，展示与其源自Fc的对应物相比增强的体外Fc效应子功能以及改善的体内药物动力学、稳定性及抗淋巴瘤活性。
[0253] 氨基酸取代
[0254] 在替代实施方案中，公开的方法和组合物可涉及具有一个或多个取代的氨基酸残TM基的蛋白质或肽的产生和使用。例如，用来制得DNL 构建体的DDD和/或AD序列可如上
所讨论进行修饰。
所讨论进行修饰。
[0255] 熟练技术人员将意识到，一般来说，氨基酸取代通常涉及一种氨基酸用具有相对类似性质的另一种氨基酸替代(即，保守氨基酸取代)。各种氨基酸的性质和氨基酸取代对蛋白质结构和功能的作用为广泛研究的主题和本领域中的知识。
[0256] 例如，可考虑氨基酸的亲水指数(Kyte和Doolittle，1982，J.Mol.Biol.，157：105-132)。氨基酸的相对亲水特征有助于所得到的蛋白质的二级结构，其反过来定义了蛋白质与其它分子的相互作用。每种氨基酸在其疏水性和电荷特征的基础上确定亲水指数(Kyte和Doolittle，1982)，这些为：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；
苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。在进行保守取代时，使用亲水指数在±2内的氨基酸为优选的，亲水指数在±1内的氨基酸为更优选的，并且亲水指数在±0.5内的氨基酸为甚至更优选的。
苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。在进行保守取代时，使用亲水指数在±2内的氨基酸为优选的，亲水指数在±1内的氨基酸为更优选的，并且亲水指数在±0.5内的氨基酸为甚至更优选的。
[0257] 氨基酸取代还可考虑氨基酸残基的亲水性(例如，美国专利号4,554,101)。已给氨基酸残基确定以下亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0)；谷氨酸(+3.0)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5.+-.1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；
缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。用具有类似亲水性的其它氨基酸替代氨基酸为优选的。
缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。用具有类似亲水性的其它氨基酸替代氨基酸为优选的。
[0258] 其它考虑包括氨基酸侧链的大小。例如，用具有松散侧链的氨基酸如色氨酸或酪氨酸替代具有紧凑侧链的氨基酸如甘氨酸或丝氨酸通常不是优选的。各种氨基酸残基对蛋白质二级结构的作用也是考虑因素。通过实证研究，已确定不同氨基酸残基对蛋白质结构域采用α-螺旋、β-折叠或回转二级结构趋势的作用并且为本领域中已知的(参见，例如Chou和Fasman，1974，Biochemistry，13：222-245；1978，Ann.Rev.Biochem.，47：251-276；1979，Biophys.J.，26：367-384)。
[0259] 基于此类考虑和广泛实证研究，已构建保守氨基酸取代的表格并且为本领域中已知的。例如：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。或者：Ala(A)leu、ile、val；Arg(R)gln、asn、lys；Asn(N)his、asp、lys、arg、gln；Asp(D)asn、glu；Cys(C)ala、ser；Gln(Q)glu、asn；Glu(E)gln、asp；
Gly(G)ala；His(H)asn、gln、lys、arg；Ile(I)val、met、ala、phe、leu；Leu(L)val、met、ala、phe、ile；Lys(K)gln、asn、arg；Met(M)phe、ile、leu；Phe(F)leu、val、ile、ala、tyr；Pro(P)ala；Ser(S)、thr；Thr(T)ser；Trp(W)phe、tyr；Tyr(Y)trp、phe、thr、ser；Val(V)ile、leu、met、phe、ala。
Gly(G)ala；His(H)asn、gln、lys、arg；Ile(I)val、met、ala、phe、leu；Leu(L)val、met、ala、phe、ile；Lys(K)gln、asn、arg；Met(M)phe、ile、leu；Phe(F)leu、val、ile、ala、tyr；Pro(P)ala；Ser(S)、thr；Thr(T)ser；Trp(W)phe、tyr；Tyr(Y)trp、phe、thr、ser；Val(V)ile、leu、met、phe、ala。
[0260] 氨基酸取代的其它考虑因素包括残基是否位于蛋白质的内部或为暴露于溶剂。对于内部残基，保守取代将包括：Asp和Asn；Ser和Thr；Ser和Ala；Thr和Ala；Ala和Gly；Ile和Val；Val和Leu；Leu和Ile；Leu和Met；Phe和Tyr；Tyr和Trp。(参见，例如rockefeller.edu上的PROWL网站)对于溶剂暴露的残基，保守取代将包括：Asp和Asn；
Asp和Glu；Glu和Gln；Glu和Ala；Gly和Asn；Ala和Pro；Ala和Gly；Ala和Ser；Ala和Lys；Ser和Thr；Lys和Arg；Val和Leu；Leu和Ile；Ile和Val；Phe和Tyr。(同上)已
构建各种矩阵来辅助选择氨基酸取代，如PAM250评分矩阵、Dayhoff矩阵、Grantham矩阵、McLachlan矩阵、Doolittle矩阵、Henikoff矩阵、Miyata矩阵、Fitch矩阵、Jones矩阵、Rao矩阵、Levin矩阵和Risler矩阵(同上)。
Asp和Glu；Glu和Gln；Glu和Ala；Gly和Asn；Ala和Pro；Ala和Gly；Ala和Ser；Ala和Lys；Ser和Thr；Lys和Arg；Val和Leu；Leu和Ile；Ile和Val；Phe和Tyr。(同上)已
构建各种矩阵来辅助选择氨基酸取代，如PAM250评分矩阵、Dayhoff矩阵、Grantham矩阵、McLachlan矩阵、Doolittle矩阵、Henikoff矩阵、Miyata矩阵、Fitch矩阵、Jones矩阵、Rao矩阵、Levin矩阵和Risler矩阵(同上)。
[0261] 在确定氨基酸取代时，还可考虑分子间或分子内键的存在，如在带正电荷残基(例如，His、Arg、Lys)与带负电荷残基(例如，Asp、Glu)之间形成离子键(盐桥)或在半胱氨酸残基附近之间形成二硫键。
[0262] 在编码的蛋白质序列中用任何氨基酸取代任何其它氨基酸的方法为熟知的，并且为熟练技术人员例如通过定点诱变技术或通过合成和组装编码氨基酸取代和剪接成表达载体构建体的寡核苷酸进行常规实验的事情。
[0263] 抗体同种异型
[0264] 治疗性抗体的免疫原性与输注反应风险增加和治疗性反应的持续时间减少相关(Baert等人，2003，N Engl J Med 348：602-08)。治疗性抗体在宿主中诱导免疫应答的程度可部分地通过抗体的同种异型来确定(Stickler等人，2011，Genes and Immunity 12：213-21)。抗体同种异型与抗体的恒定区序列中特定位置上的氨基酸序列变化相关。含有重链γ-型恒定区的IgG抗体的同种异型命名为Gm同种异型(1976，J Immunol 117：
1056-59)。
1056-59)。
[0265] 对于常见的IgG1人抗体而言，最普遍的同种异型为G1ml(Stickler等人，2011，Genes and Immunity 12：213-21)。然而，G1m3同种异型也频繁出现于白种人中(同上)。已报道了当向非G1m1(nG1m1)接受者(如G1m3患者)施用时，G1m1抗体含有倾向于诱导
免疫应答的同种异型序列(同上)。当向G1m1患者施用时，非G1m1同种异型抗体不作为免疫原性的(同上)。
免疫应答的同种异型序列(同上)。当向G1m1患者施用时，非G1m1同种异型抗体不作为免疫原性的(同上)。
[0266] 人G1m1同种异型包含重链IgG1的CH3序列中的Kabat位置356上的氨基酸天冬氨酸和Kabat位置358上的亮氨酸。nG1m1同种异型包含Kabat位置356上的氨基酸谷氨
酸和Kabat位置358上的甲硫氨酸。G1m1和nG1m1同种异型均包含Kabat位置357上的谷
氨酸残基，并且同种异型有时称为DEL同种异型和EEM同种异型。针对示例性抗体利妥昔单抗(SEQ ID NO：85)和维妥珠单抗(SEQ ID NO：86)示出G1m1和nG1m1同种异型抗体的重链恒定区序列的非限制性实例。
酸和Kabat位置358上的甲硫氨酸。G1m1和nG1m1同种异型均包含Kabat位置357上的谷
氨酸残基，并且同种异型有时称为DEL同种异型和EEM同种异型。针对示例性抗体利妥昔单抗(SEQ ID NO：85)和维妥珠单抗(SEQ ID NO：86)示出G1m1和nG1m1同种异型抗体的重链恒定区序列的非限制性实例。
[0267] 利妥昔单抗重链可变区序列(SEQ ID NO：85)
[0268] ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKAEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0269] 维妥珠单抗重链可变区(SEQ ID NO：86)
[0270] ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
[0271] Jefferis和Lefranc(2009，mAbs 1：1-7)综述了IgG同种异型特有的序列变化及其对免疫原性的影响。他们报道了与G1m17同种异型中的Kabat 214上的赖氨酸残基相比，G1m3同种异型的特征在于Kabat位置214上的精氨酸残基。nG1m1，2同种异型的特征在于Kabat位置356上的谷氨酸、Kabat位置358上的甲硫氨酸以及Kabat位置431上的丙氨酸。G1m1，2同种异型的特征在于Kabat位置356上的天冬氨酸、Kabat位置358上的亮氨酸以及Kabat位置431上的甘氨酸。除了重链恒定区序列变体之外，Jefferis和Lefranc(2009)报道了κ轻链恒定区中的同种异型变体，其中Km1同种异型的特征在于Kabat位置153上的缬氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，Km1，2同种异型的特征在于Kabat位置153上的
丙氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，并且Km3同种异型的特征在于Kabat位置153上的
丙氨酸和Kabat位置191上的缬氨酸。
丙氨酸和Kabat位置191上的亮氨酸，并且Km3同种异型的特征在于Kabat位置153上的
丙氨酸和Kabat位置191上的缬氨酸。
[0272] 关于治疗性抗体，维妥珠单抗和利妥昔单抗分别为用于治疗多种血液恶性肿瘤和/或自身免疫疾病的针对CD20的人源化抗体和嵌合IgG1抗体。表1比较了利妥昔单抗与维妥珠单抗的同种异型序列。如在表1中所示，利妥昔单抗(G1m17，1)为DEL同种异型IgG1，在利妥昔单抗中的赖氨酸与维妥珠单抗中的精氨酸的Kabat位置214(重链CH1)上具有额外序列变化。已报道了在受试者中维妥珠单抗比利妥昔单抗的免疫原性小(参见，例如Morchhauser等人，2009，J ClinOncol27：3346-53；Goldenberg等人，2009，Blood
113：1062-70；Robak和Robak，2011，BioDrugs 25：13-25)，这种作用已归因于人源化抗体与嵌合抗体之间的差异。然而，EEM同种异型与DEL同种异型之间的同种异型差异也可能解释维妥珠单抗的较低免疫原性。
113：1062-70；Robak和Robak，2011，BioDrugs 25：13-25)，这种作用已归因于人源化抗体与嵌合抗体之间的差异。然而，EEM同种异型与DEL同种异型之间的同种异型差异也可能解释维妥珠单抗的较低免疫原性。
[0273] 表1.利妥昔单抗与维妥珠单抗的同种异型
[0274]
[0275] 为了降低治疗性抗体在nG1m1基因型个体中的免疫原性，希望选择对应于G1m3同种异型的抗体的同种异型，其特征在于Kabat 214上的精氨酸；和nG1m1，2无效同种异型，其特征在于Kabat位置356上的谷氨酸、Kabat位置358上的甲硫氨酸以及Kabat位置431上的丙氨酸。出人意料地，发现重复皮下施用G1m3抗体经过很长一段时间并不会引起显著的免疫应答。在替代实施方案中，与G1m3同种异型一样的人IgG4重链具有Kabat 214上的精氨酸、Kabat 356上的谷氨酸、Kabat 359上的甲硫氨酸以及Kabat 431上的丙氨酸。
因为免疫原性看起来似乎至少部分地与那些位置上的残基相关，所以对于治疗性抗体的人IgG4重链恒定区序列的使用也是一个优选的实施方案。G1m3 IgG1抗体与IgG4抗体的组合也可用于治疗性施用。
因为免疫原性看起来似乎至少部分地与那些位置上的残基相关，所以对于治疗性抗体的人IgG4重链恒定区序列的使用也是一个优选的实施方案。G1m3 IgG1抗体与IgG4抗体的组合也可用于治疗性施用。
[0276] 在嵌合和人源化抗组蛋白抗体中使用的示例性抗体恒定区序列公开于以下SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：128中。
[0277] 示例性人重链恒定区
[0278] ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：127)
[0279] 示例性人羟链恒定区
[0280] TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：128)
[0281] 免疫缀合物
[0282] 在某些实施方案中，抗体或其片段可缀合至一种或多种治疗剂或诊断剂。治疗剂131
无需相同，但可以不同，例如药物和放射性同位素。例如， I可被掺至抗体或融合蛋白的酪氨酸和与赖氨酸残基的ε氨基连接的药物。治疗剂和诊断剂还可与还原的SH基团和/或碳水化合物侧链连接。用于制造治疗剂或诊断剂与抗体或融合蛋白的共价或非共价缀合物的许多方法在本领域中是已知的并且可使用任何所述已知方法。
无需相同，但可以不同，例如药物和放射性同位素。例如， I可被掺至抗体或融合蛋白的酪氨酸和与赖氨酸残基的ε氨基连接的药物。治疗剂和诊断剂还可与还原的SH基团和/或碳水化合物侧链连接。用于制造治疗剂或诊断剂与抗体或融合蛋白的共价或非共价缀合物的许多方法在本领域中是已知的并且可使用任何所述已知方法。
[0283] 治疗剂或诊断剂可通过二硫键的形成在还原抗体组分的铰链区连接。或者，可使用异双官能交联剂，如N-琥珀酰3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)将所述试剂连接。Yu等人，Int.J.Cancer 56：244(1994)。用于所述缀合的一般技术是本领域众所周知的。参见，例如Wong，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSS-LINKING(CRC Press 1991)；Upeslacis等人，″Modification of Anti bodies by Chemical Methods，″MONOCLONAL ANTIBODIES：PRI NCIPLES AND APPLICATIONS，Birch等人(编著)，第187-230页(W
iley-Liss，Inc.1995)；Price，″Production and Characterization of Syn thetic Peptide-DeriVed Antibodies，″MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter等人(编著)，第60-84页(Cambridge University Press
1995)。或者，治疗剂或诊断剂可在抗体的Fc区域中经由碳水化合物部分缀合。碳水化合物基团可用于增加结合至硫醇基的相同试剂的负载，或碳水化合物部分可用于结合不同的治疗剂或诊断剂。
iley-Liss，Inc.1995)；Price，″Production and Characterization of Syn thetic Peptide-DeriVed Antibodies，″MONOCLONAL ANTIBODIES：PRODUCTION，ENGINEERING AND CLINICAL APPLICATION，Ritter等人(编著)，第60-84页(Cambridge University Press
1995)。或者，治疗剂或诊断剂可在抗体的Fc区域中经由碳水化合物部分缀合。碳水化合物基团可用于增加结合至硫醇基的相同试剂的负载，或碳水化合物部分可用于结合不同的治疗剂或诊断剂。
[0284] 用于将肽经由抗体碳水化合物部分缀合至抗体组分的方法是本领域技术人员所熟知的。参见，例如Shih等人，Int.J.Cancer41：832(1988)；Shih等人，Int.J.Cancer 46：1101(1990)；以及Shih等人，美国专利号5,057,313，以引用的方式整体并入本文。一般方法涉及使具有氧化碳水化合物部分的抗体组分与具有至少一个游离胺官能团的载体聚合物反应。此反应产生了初始希夫碱(亚胺)连接，其可通过还原成仲胺以形成最终缀合物而稳定。
[0285] 如果用作免疫缀合物的抗体组分的抗体是抗体片段，那么Fc区可不存在。然而，有可能将碳水化合物部分引入全长抗体或抗体片段的轻链可变区中。参见，例如Leung等人，J.Immunol.154：5919(1995)；Hansen等人，美国专利号5,443,953(1995)；Leung等人，美国专利号6,254,868，以引用的方式整体并入本文。工程化的碳水化合物部分用于连接治疗剂或诊断剂。
[0286] 在一些实施方案中，螯合剂可连接至抗体、抗体片段或融合蛋白上并且用于螯合治疗剂或诊断剂，如放射性核素。示例性螯合剂包括但不限于DTPA(如Mx-DTPA)、DOTA、TETA、NETA或NOTA。缀合并使用螯合剂将金属或其它配体连接至蛋白质的方法在本领域中是众所周知的(参见，例如美国专利号7,563,433，其实施例部分以引用的方式并入本文)。
[0287] 在某些实施方案中，放射性金属或顺磁性离子可通过与具有长尾部的试剂反应而连接至蛋白质或肽上，所述试剂可连接至用于结合离子的多种螯合基团。所述尾部可以是聚合物，如聚赖氨酸、多糖、或具有侧基的其它衍生的或可衍生化的链，所述侧基上可结合有螯合基团，例如像乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、卟啉、多胺、冠醚、双缩氨基硫脲、聚肟以及已知适用于此目的的类似基团。
[0288] 螯合物可与抗体或肽直接相连，例如如美国专利4,824,659中所公开，其以引用的方式整体并入本文。尤其有用的金属-螯合物组合包括2-苄基-DTPA及其一甲基和环己基类似物，其与在60至4,000kev的一般能量范围内的诊断同位素一起用于放射成像，所
125 131 123 124 62 64 18 111 67 68 99m 94m 11 13 15 76
述诊断同位素如 I、I、 I、I、Cu、Cu、F、 In、Ga、Ga、Tc、 Tc、C、N、O、Br。
相同的螯合物当与非放射性金属如锰、铁和钆复合时适用于MRI。大环螯合物如NOTA、DOTA和TETA可与多种金属和放射性金属一起使用，最尤其是可分别与镓、钇和铜的放射性核素一起使用。通过根据目标金属定制环大小，可使得这种金属-螯合物复合物非常稳定。涵
223
盖适于稳定结合核素，如用于RAIT的 RA的其它环型螯合物如大环聚醚。
125 131 123 124 62 64 18 111 67 68 99m 94m 11 13 15 76
述诊断同位素如 I、I、 I、I、Cu、Cu、F、 In、Ga、Ga、Tc、 Tc、C、N、O、Br。
相同的螯合物当与非放射性金属如锰、铁和钆复合时适用于MRI。大环螯合物如NOTA、DOTA和TETA可与多种金属和放射性金属一起使用，最尤其是可分别与镓、钇和铜的放射性核素一起使用。通过根据目标金属定制环大小，可使得这种金属-螯合物复合物非常稳定。涵
223
盖适于稳定结合核素，如用于RAIT的 RA的其它环型螯合物如大环聚醚。
[0289] 最近，已经例如通过F-18与金属或其它原子如铝的反应公开在PET扫描技术中使18 18
用 F-标记的方法。 F-A1缀合物可与螯合基团如DOTA、NOTA或NETA复合，所述螯合基团直接连接至抗体或用于在预靶向方法中标记可靶向的构建体。所述F-18标记技术公开于美国专利号7,563,433中，其实施例部分以引用的方式并入本文。
用 F-标记的方法。 F-A1缀合物可与螯合基团如DOTA、NOTA或NETA复合，所述螯合基团直接连接至抗体或用于在预靶向方法中标记可靶向的构建体。所述F-18标记技术公开于美国专利号7,563,433中，其实施例部分以引用的方式并入本文。
[0290] 治疗剂
[0291] 在替代实施方案中，可使用缀合至本发明抗组蛋白抗体的治疗剂，如细胞毒性剂、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、趋化因子、药物、前药、毒素、酶或其它试剂，或在所述抗组蛋白抗体之前、与其同时或之后单独施用所述治疗剂。使用的药物可具有选自由以下组成的组的药物性质：抗有丝分裂剂、抗激酶(例如，抗酪氨酸激酶)剂、烷基化剂、抗代谢物剂、抗生素、生物碱、抗血管生成剂、促细胞凋亡剂、免疫调节剂及其组合。
[0292] 使用的示例性药物包括5-氟尿嘧啶、阿普立定(aplidin)、阿扎立平、阿那曲唑、蒽环类、苯达莫司汀、博来霉素、硼替佐米、苔藓抑素-1、白消安、刺孢霉素、喜树碱、卡铂、10-羟基喜树碱、卡莫司汀、西乐葆、瘤可宁、顺铂(CDDP)、Cox-2抑制剂、依立替康(CPT-11)、SN-38、卡铂、克拉屈滨、喜树碱衍生物(camptothecans)、环磷酰胺、阿糖胞苷、氮烯唑胺、多西他赛、放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、2-吡咯啉并阿霉素(2P-DOX)、氰基-吗啉代阿霉素、阿霉素葡糖苷酸、表柔比星葡糖苷酸、雌氮芥、表鬼臼毒素、雌激素受体结合剂、依托泊苷(VP16)、依托泊苷葡糖苷酸、磷酸依托泊苷、氟尿苷(FUdR)、3′，5′-O-二油酰基-FudR(FUdR-dO)、氟达拉滨、氟他胺、法呢基-蛋白转移酶抑制剂、吉西他滨、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、L-天冬酰胺酶、来那度胺、甲酰四氢叶酸、洛莫司汀、氮芥、美法仑、巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、氨甲蝶呤、米托蒽醌、光神霉素、丝裂霉素、米托坦、诺维本、亚硝基脲、普卡霉素、甲基苄肼、紫杉醇、喷司他丁、PSI-341、雷洛昔芬、司莫司汀、链脲霉素、他莫昔芬、紫杉酚、替莫唑胺(temazolomide)(含水形式的DTIC)、反铂、沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、替尼泊苷、拓扑替康、尿嘧啶氮芥、长春瑞滨、长春花碱、长春新碱以及长春花生物碱。
[0293] 使用的毒素可包括蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、皂草素、核糖核酸酶(RNA酶)例如豹蛙酶、DNA酶I、葡萄球菌肠毒素-A、美洲商陆抗病毒蛋白、白树毒素、白喉毒素、假单胞菌外毒素以及假单胞菌内毒素。。
[0294] 使用的趋化因子可包括RANTES、MCAF、MIP1-α、MIP1-β以及IP-10。
[0295] 在某些实施方案中，可使用抗血管生成剂，如血管抑素、baculostatin、血管能抑素、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制剂、抗VEGF抗体、抗PlGF肽和抗体、抗血管生长因子抗体、抗Flk-1抗体、抗Flt-1抗体和肽、抗Kras抗体、抗cMET抗体、抗MIF(巨噬细胞迁移抑制因子)抗体、层粘连蛋白肽、纤连蛋白肽、纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂、干扰素、白细胞介素-12、IP-10、Gro-β、血小板反应蛋白、2-甲氧基雌二醇、增殖蛋白-相关蛋白、羧酰胺基三唑、CM101、马立马司他、戊聚糖聚硫酸酯、血管生成素-2、干扰素-α、除莠霉素A、PNU145156E、16K催乳素片段、Linomide(罗喹美克)、沙利度胺、己酮可可碱、染料木黄酮、TNP-470、内皮抑素、紫杉醇、accutin、血管抑素、西多福韦、长春新碱、博来霉素、AGM-1470、血小板因子4或二甲胺四环素。
[0296] 使用的免疫调节剂可选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子(CSF)、干扰素(IFN)、红细胞生成素、血小板生成素及其组合。特别有用的是淋巴毒素如肿瘤坏死因子(TNF)；造血因子，如白介素(IL)；集落刺激因子，如粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；干扰素，如干扰素-α、-β或-γ；以及干细胞生长因子，如命名为“S1因子”的干细胞生长因子。细胞因子中包括生长激素如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如滤泡刺激激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；前列腺素、成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳素、OB蛋白；肿瘤坏死因子-α和-β；苗勒氏抑制物质(mullerian-inhibiting substance)；小鼠促性腺素相关肽；抑制素；活化素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；白介素(IL)如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-25、LIF、kit-配体或FLT-3、血管抑素、血小板反应蛋白、内皮抑素、肿瘤坏死因子以及LT。来那度胺是在控制某些癌症如多发性骨髓瘤和造血肿瘤中显示活性的又一个免疫调节剂。
[0297] 使用的放射性核素包括但不限于：111In、177Lu、212Bi、213Bi、211At、62Cu、67Cu、90Y、125I、131 32 33 47 111 67 142 153 161 166 166 186 188 189 212 223 225
I、p、p、Sc、 Ag、Ga、 pr、 Sm、 Tb、 Dy、 Ho、 Re、 Re、 Re、 pb、 Ra、 Ac、
59 75 77 89 99 105 109 143 149 169 194 198 199 211 227
Fe、Se、As、Sr、Mo、Rh、 pd、pr、 pm、Er、 Ir、Au、 Au、Pb以 及 Th。 治
疗性放射性核素优选地具有范围为20至6,000keV的衰变能量，优选地对于俄歇粒子
(Auger)发射体范围为60至200keV，对于β粒子发射体范围为100-2,500keV，并且对于α粒子发射体范围为4,000-6,000keV。有用的发射β粒子的核素的最大衰变能量优选
地是20-5,000keV，更优选地是100-4,000keV，并且最优选地是500-2,500keV。实质上随着发射俄歇粒子而衰变的放射性核素也是优选的。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m以及Ir-192。有用的发射β粒子的核素的衰变能量优选地为＜1,000keV，更优选地为＜100keV，并且最优选地为＜70keV。实质上随着α粒子的产生而衰变的放射性核素也是优选的。这类放射性核素包括但不限于：Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213、Th-227以及Fm-255。有用的发射α粒子的放射性核素的衰变能量优选地为2,000-10,000keV，更优选地为3,000-8,000keV，并且最优选地为4,000-7,000keV。使
11 13 15 75 198 224 126 133 77 113m 95
用的另外潜在的放射性同位素包括：C、N、O、Br、Au、 Ac、I、 I、Br、 In、Ru、
97 103 105 107 203 121m 122m 125m 165 167 168 197 109 105 142 143
Ru、Ru、 Ru、 Hg、Hg、 Te、 Te、 Te、Tm、 Tm、Tm、 pt、 pd、Rh、 pr、 pr、
161 166 199 57 58 51 59 75 201 225 76 169
Tb、 Ho、Au、Co、Co、Cr、Fe、Se、 T1、Ac、Br、 Yb等。一些有用的诊断核素可
18 52 62 64 67 67 68 86 89 94 94m 99m 111
包括 F、Fe、Cu、Cu、Cu、Ga、Ga、Y、Zr、Tc、Tc、 Tc或 In。
I、p、p、Sc、 Ag、Ga、 pr、 Sm、 Tb、 Dy、 Ho、 Re、 Re、 Re、 pb、 Ra、 Ac、
59 75 77 89 99 105 109 143 149 169 194 198 199 211 227
Fe、Se、As、Sr、Mo、Rh、 pd、pr、 pm、Er、 Ir、Au、 Au、Pb以 及 Th。 治
疗性放射性核素优选地具有范围为20至6,000keV的衰变能量，优选地对于俄歇粒子
(Auger)发射体范围为60至200keV，对于β粒子发射体范围为100-2,500keV，并且对于α粒子发射体范围为4,000-6,000keV。有用的发射β粒子的核素的最大衰变能量优选
地是20-5,000keV，更优选地是100-4,000keV，并且最优选地是500-2,500keV。实质上随着发射俄歇粒子而衰变的放射性核素也是优选的。例如，Co-58、Ga-67、Br-80m、Tc-99m、Rh-103m、Pt-109、In-111、Sb-119、I-125、Ho-161、Os-189m以及Ir-192。有用的发射β粒子的核素的衰变能量优选地为＜1,000keV，更优选地为＜100keV，并且最优选地为＜70keV。实质上随着α粒子的产生而衰变的放射性核素也是优选的。这类放射性核素包括但不限于：Dy-152、At-211、Bi-212、Ra-223、Rn-219、Po-215、Bi-211、Ac-225、Fr-221、At-217、Bi-213、Th-227以及Fm-255。有用的发射α粒子的放射性核素的衰变能量优选地为2,000-10,000keV，更优选地为3,000-8,000keV，并且最优选地为4,000-7,000keV。使
11 13 15 75 198 224 126 133 77 113m 95
用的另外潜在的放射性同位素包括：C、N、O、Br、Au、 Ac、I、 I、Br、 In、Ru、
97 103 105 107 203 121m 122m 125m 165 167 168 197 109 105 142 143
Ru、Ru、 Ru、 Hg、Hg、 Te、 Te、 Te、Tm、 Tm、Tm、 pt、 pd、Rh、 pr、 pr、
161 166 199 57 58 51 59 75 201 225 76 169
Tb、 Ho、Au、Co、Co、Cr、Fe、Se、 T1、Ac、Br、 Yb等。一些有用的诊断核素可
18 52 62 64 67 67 68 86 89 94 94m 99m 111
包括 F、Fe、Cu、Cu、Cu、Ga、Ga、Y、Zr、Tc、Tc、 Tc或 In。
[0298] 治疗剂可包括光活化剂或染料。荧光组合物如荧光染料及其它色原，或染料，如对可见光敏感的卟啉已通过将适合的光对准损害处而用于检测和治疗所述损害。在治疗中，其被称为光辐射、光照疗法或光动力疗法。参见Jori等人(编著)，PHOTODYNAMIC THERAPY OF TUMORS AND OTHER DISEASES(Libreria Progetto 1985)；van den Bergh，Chem.Britain(1986)，22：430。此外，单克隆抗体已经与光活化染料偶联以实现光照疗法。参见Mew等人，J.Immunol.(1983)，130：1473；同上，Cancer Res.(1985)，45：4380；Oseroff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)，83：8744；同上，Photochem.Photobiol.(1987)，46：
83；Hasan等人，Prog.Clin.Biol.Res.(1989)，288：471；Tatsuta等人，Lasers Surg.Med.(1989)，9：422；Pelegrin等人，Cancer(1991)，67：2529。
83；Hasan等人，Prog.Clin.Biol.Res.(1989)，288：471；Tatsuta等人，Lasers Surg.Med.(1989)，9：422；Pelegrin等人，Cancer(1991)，67：2529。
[0299] 其它有用的治疗剂可包括寡核苷酸，尤其是反义寡核苷酸，其优选地针对致癌基因和致癌基因产物，如bcl-2。优选形式的治疗寡核苷酸是siRNA。
[0300] 诊断剂
[0301] 诊断剂优选地选自由以下组成的组：放射性核素、放射性造影剂、顺磁性离子、金属、荧光标记、化学发光标记、超声造影剂以及光活化剂。所述诊断剂是众所周知的并且110 111
可使用任何所述已知诊断剂。诊断剂的非限制性实例可包括放射性核素，如 In、 In、
177 18 52 62 64 67 67 68 86 90 89 94m 94 99m 120 123 124 125 131
Lu、F、Fe、Cu、Cu、Cu、Ga、Ga、Y、Y、Zr、 Tc、Tc、 Tc、I、I、I、I、I、
154-158 32 11 13 15 186 188 51 52m 55 72 75 76 82m 83
Gd、p、C、N、O、 Re、Re、Mn、 Mn、Co、As、Br、Br、Rb、Sr、或其它γ、β或
正电子发射体。使用的顺磁性离子可包括：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。金属造影剂可包括镧(III)、金(III)、铅(II)或铋(III)。超声造影剂可包括脂质体，如充气脂质体。不透射线的诊断剂可选自化合物、钡化合物、镓化合物及铊化合物。多种荧光标记在本领域中是已知的，包括但不限于异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛及荧光胺。使用的化学发光标记可包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐或草酸酯。
可使用任何所述已知诊断剂。诊断剂的非限制性实例可包括放射性核素，如 In、 In、
177 18 52 62 64 67 67 68 86 90 89 94m 94 99m 120 123 124 125 131
Lu、F、Fe、Cu、Cu、Cu、Ga、Ga、Y、Y、Zr、 Tc、Tc、 Tc、I、I、I、I、I、
154-158 32 11 13 15 186 188 51 52m 55 72 75 76 82m 83
Gd、p、C、N、O、 Re、Re、Mn、 Mn、Co、As、Br、Br、Rb、Sr、或其它γ、β或
正电子发射体。使用的顺磁性离子可包括：铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、钒(II)、铽(III)、镝(III)、钬(III)或铒(III)。金属造影剂可包括镧(III)、金(III)、铅(II)或铋(III)。超声造影剂可包括脂质体，如充气脂质体。不透射线的诊断剂可选自化合物、钡化合物、镓化合物及铊化合物。多种荧光标记在本领域中是已知的，包括但不限于异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白、邻苯二甲醛及荧光胺。使用的化学发光标记可包括鲁米诺、异鲁米诺、芳族吖啶酯、咪唑、吖啶盐或草酸酯。
[0302] 免疫失调疾病、感染性疾病及炎性疾病
[0303] 在各种实施方案中，抗组蛋白抗体或其片段适用于治疗炎性或免疫失调疾病，如脓毒病、脓毒性休克、败血病、急性呼吸窘迫综合征、移植物抗宿主疾病(GVHD)、移植排斥、动脉粥样硬化、哮喘、肉芽肿病、神经病、恶病质、凝血病、痤疮、巨细胞性动脉炎或心肌缺血以及典型的自身免疫疾病(如先前所列)。在某些优选实施方案中，疗法可利用两种或更多种单独的抗体或其片段的组合，一起或分开施用；或者双特异性或多特异性抗体或抗体片段，其中第一结合位点用于组蛋白且第二结合位点用于不同的靶抗原。更优选地，靶抗原可选自由以下组成的组：组蛋白H3、组蛋白H4、组蛋白H2B、先天性免疫系统的促炎效应子、适应性免疫系统的组分或细胞、促炎效应子细胞因子或趋化因子、或与以下疾病特别相关的靶标：感染性疾病、急性呼吸窘迫综合征、败血病、脓毒性休克、GVHD、移植排斥、动脉粥样硬化、哮喘、肉芽肿病、神经病、恶病质、凝血病、痤疮、巨细胞性动脉炎或心肌缺血。在一些情况下，CD74可特异性地作为潜在靶抗原被排除，当抗CD74抗体或抑制剂与抗组蛋白抗体组合时除外。使用的具体靶抗原可包括但不限于TNF-α、MIF、CD74、HLA-DR、IL-1、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-23、IL-4R、IL-6R、IL-13R、IL-15R、IL-17R、IL-18R、CD40L、CD44、CD46、CD55、CD59、CCL19、CCL21、mCRP、MCP-19、MIP-1A、MIP-1B、RANTES、ENA-78、IP-10、GRO-β、脂多糖、淋巴毒素、HMGB-1、组织因子、补体调节蛋白、凝血因子、凝血酶、补体因子、C3、C3a、C3b、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、Flt-1以及VEGF。血栓调节蛋白和/或活化的蛋白C也可与同任何以上所指定的抗体一起使用的抗组蛋白抗体组合。
[0304] 可以组合形式添加的另外的治疗剂包括细胞因子、趋化因子、凝血抑制剂、抗T细胞或抗B细胞抗体或抗体片段、免疫调节剂、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因子、干扰素、促红细胞生成素或促血小板生成素。任选的治疗剂可包括如上所述的活化蛋白C或血栓调节蛋白。
[0305] 本发明的实施方案通常涉及使用靶向至少两种不同标记物的多特异性抗体对炎性和免疫失调疾病进行免疫治疗的方法和组合物。标记物可以是淋巴细胞、巨噬细胞、单核细胞或树突状细胞(DC)上的抗原和/或受体。具体的实施方案涉及使用结合至细胞及其受体的特异性抗体和抗体异缀合物调节免疫靶向和免疫加工细胞上的受体以实现治疗各种疾病的方法和组合物，所述疾病是因这些细胞及其受体或另外涉及这些细胞及其受体而产生或恶化。所述疾病更具体地包括急性和慢性炎性病症、自身免疫疾病、败血病和脓毒性休克、神经病、移植物抗宿主病、急性呼吸窘迫综合征、肉芽肿病、巨细胞性动脉炎、痤疮、弥漫性血管内凝血(DIC)、移植排斥、哮喘、恶病质、心肌缺血以及动脉粥样硬化。所述方法和组合物还适用于治疗病理性血管生成和癌症。所述方法和组合物可包括第二治疗剂，其是针对癌症受体、癌症致癌基因或癌症相关抗原。还就疾病的改善的诊断/检测来描述方法和组合物。
[0306] 背景
[0307] 免疫系统包含先天性免疫系统和适应性或获得性免疫系统。许多宿主细胞参与先天性和适应性免疫过程，如嗜中性粒细胞、T和B淋巴细胞、巨噬细胞和单核细胞、树突状细胞及浆细胞。它们通常协调地起作用，彼此相互影响，尤其在调控有助于识别和加工先天和外部有毒物的某些因子和细胞因子中，并且这些系统在脊椎动物、哺乳动物及人有机体的几百万年的发展期间已得到进化。
[0308] 免疫疗法的一个主要目标是开拓或增强患者针对先天或外来有毒物(如恶性细胞或侵入的微生物)的免疫系统。相比免疫系统与固有机能障碍如癌症及某些自身免疫和免疫失调疾病(尤其是因为后者可具有遗传以及环境组分两者)的关系，已更多地关于识别和对外源性有毒物如微生物有机体做出应答对免疫系统进行了研究。针对微生物有机体如细菌、真菌、寄生虫及病毒的防御对特定有机体是先天的，其中免疫系统被编程来识别这些微生物的生化模式并且做出应答以攻击所述微生物，而无需先前暴露于所述微生物。此先天性免疫系统包括例如嗜中性粒细胞、天然杀伤细胞及单核细胞/巨噬细胞，其可通过引导内吞和破坏来消灭侵入的微生物。
[0309] 先天性免疫应答经常被称为非特异性应答，其控制侵入的外部有毒物直到更特异性的适应性免疫系统可以集结(marshal)特异性抗体和T细胞为止(参见Modlin等人，N Engl J Med 1999，340：1834-1835；Das，Crit.Care 2000；4：290-296)。非特异性免疫应答涉及淋巴系统和吞噬细胞。淋巴系统包括淋巴细胞和巨噬细胞。巨噬细胞可吞噬、杀伤并除去外来颗粒。吞噬细胞包括嗜中性粒细胞和巨噬细胞，其也摄取、降解和除去碎片，并且具有用于补体和抗体的受体。概括地说，先天性免疫系统因为遗传特征的缘故提供对抗某些抗原的抵御防线。
[0310] 相比之下，适应性或获得性免疫系统是高度进化的且在其应答中具有极高的特异性。其被称作适应性系统，因为是在个体生存期间发生作为对病原体感染的适应。适应性免疫可响应于疫苗(抗原)或通过施用抗体人工地获得，或可通过感染天然地获得。如果产生抗体的话，那么获得性免疫可以是主动的，或如果注射由另一来源制成的外源性抗体，那么其可以是被动的。
[0311] 适应性免疫系统产生对给定抗原有特异性的抗体。其中抗体提供保护的最简单和最直接的方式是通过结合至抗原并且借此阻断其到达所述抗原可感染或破坏的细胞。这被称为中和作用。然而，通过抗体的结合不足以阻止在细胞外繁殖的细菌的复制。在这种情况下，抗体的一个作用是使得吞噬细胞能够摄取并破坏细菌。这被称为调理作用。抗体的第三功能是激活被称为补体的血浆蛋白系统。在很多情况下，适应性免疫系统针对再感染同一病原体赋予终身保护性免疫，因为适应性免疫系统对呈递至其的抗原具有‘记忆’。
[0312] 抗体介导免疫被称为体液免疫并且由B细胞和其产生的抗体来调节。细胞介导免疫是由T细胞控制。体液和细胞介导免疫两者都参与保护宿主对抗侵入的生物体。此相互作用可有效杀伤或控制外来生物体。然而，有时，所述相互作用可变得不稳定。在这些情形中，存在可引起疾病的调节异常。有时，疾病是危急生命的，如脓毒性休克和某些自身免疫病症。
[0313] B和T淋巴细胞是特异性免疫应答的关键组分。B细胞是由抗原活化以产生介导适应性免疫的抗原特异性细胞的克隆。大多数克隆分化成分泌抗体的浆细胞，而少量克隆形成恢复成浆细胞的记忆细胞。一旦后续再感染，记忆细胞便在较短的时间内产生比初次应答更高水平的抗体。由浆细胞分泌的抗体可在免疫中发挥多重作用，如结合并中和外来因子，充当调理素(IgG)以促进吞噬作用，直接影响一些有机体的代谢和生长，参与激活补体的抗原抗体反应，引起吞噬和膜攻击复合物，和/或参与激活T细胞及其它杀伤细胞的抗原抗体反应。
[0314] T淋巴细胞用作辅助细胞和抑制细胞。辅助T细胞诱导抗原特异性B细胞和效应子T细胞增殖和分化。抑制T细胞与辅助T细胞相互作用以防止免疫应答或抑制进行中的免疫应答，或调节效应子T细胞。细胞毒性T细胞通过结合至靶细胞破坏抗原。在迟发型过敏性反应中，T细胞不破坏抗原，但吸引巨噬细胞、嗜中性粒细胞及其它细胞以破坏和除去抗原。
[0315] T细胞可检测细胞内病原体的存在，因为受感染细胞在源自病原体蛋白的其表面肽片段上呈现。这些外来肽是由特化的宿主细胞糖蛋白(称为主要组织相容性复合物(MHC)分子)递送至细胞表面。结合至MHC分子并且在细胞表面处呈现的抗原作为小肽片段的识别是T细胞的一个最具区别性的特征。存在两种不同类别的MHC分子，被称为MHC I类和MHC II类，其将来自不同细胞区室的肽递送到受感染细胞的表面。来自胞液的肽结合至在大多数有核细胞上表达并且由CD8+T细胞识别的MHC I类分子。相比之下，MHC II类分子运输至溶酶体以便为呈递至CD4+T细胞的内吞蛋白抗原取样(Bryant和Ploegh，Curr Opin Immunol 2004；16：96-102)。
[0316] CD8+T细胞分化成细胞毒性T细胞，并杀死细胞。CD4+T细胞分化成两种类型的效应子T细胞。在巨噬细胞胞囊内部大量积聚的病原体倾向于刺激TH1细胞的分化，TH1细胞激活巨噬细胞并诱导B细胞制造IgG抗体，IgG抗体在调理细胞外病原体被吞噬细胞摄取中是有效的。细胞外抗原倾向于刺激TH2细胞的产生，TH2细胞通过激活原初抗原特异性B细胞尤其产生IgM抗体来起始体液免疫应答。
[0317] 先天性和适应性免疫系统互相作用，因为先天性免疫系统的细胞可表达各种分子，这些分子可以与适应性免疫系统相互作用或通过激活某些能产生免疫因子的细胞，如通过激活白细胞的淋巴系列的T和B细胞来触发适应性免疫系统。早期诱导但非适应性的应答因为两个主要原因而是重要的。首先，其可抗御病原体或更多地控制其直到适应性免疫应答可出现为止。其次，这些早期应答以若干方式影响适应性应答。例如，先天性免疫应答产生细胞因子及其它炎性介体，其对后续事件具有极深的影响，包括新的吞噬细胞向局部感染部位的募集。这些介体的另一个作用是诱导粘附分子在局部血管的内皮细胞上的表达，其结合至循环单核细胞和嗜中性粒细胞的表面且极大地提高这些细胞从血液中出来并进入组织中的迁移速度。在术语炎症下包括所有这些事件，炎症是先天性免疫系统形成局部化部位处的保护性应答的部分以分离、破坏和除去外来物质的特征。其后是修复。炎症被分为急性和慢性形式。
[0318] 免疫系统经由非特异性组织抗性因子来通信。这些因子包括干扰素，其是响应于病毒、内毒素和某些细菌而产生的蛋白质。干扰素抑制病毒复制并且激活某些宿主防御反应。受感染细胞产生干扰素，其将受感染细胞结合至其它相邻细胞，使其产生干扰病毒基因转录和蛋白质合成的抗病毒蛋白和酶。干扰素还可以影响正常细胞生长并抑制细胞介导的免疫。
[0319] 补体是另一个非特异性组织抗性因子，并且包括介导特异性和非特异性防御的血浆蛋白和膜蛋白。补体具有两种途径，与特异性防御有关的经典途径，和在特异性抗体不存在下激活且因此是非特异性的替代途径。在经典途径中，抗原抗体复合物当C1与抗体的Fc相互作用时被识别，如IgM且在某种程度上是IgG，最终致使肥大细胞释放趋化因子、血管介体以及在吞噬细胞中的呼吸爆发，作为许多机制中的一种。关键补体因子包括C3a和C5a，其引起肥大细胞释放趋化因子如组胺和血清素，趋化因子吸引吞噬细胞、抗体及补体等。其它关键补体因子是C3b和C5b，其增强外来细胞的吞噬作用；以及C8和C9，其诱导外来细胞的溶解(膜攻击复合物)。
[0320] 癌细胞可通过避免补体激活，尤其通过表达以下膜相关补体调节蛋白来逃避免疫监视，如CD55(衰变加速因子)、CD46(膜辅因子蛋白)和CD59(保护素)，且据信在癌细胞膜上这些蛋白质的过度表达保护这些癌症免于补体激活的破坏(Brasoveanu等人，Lab Invest 1996；74：33-42；Jarvis等人，Int J Cancer 1997；71：1049-1055；Yu等人，Clin Exp Immunol 1999；115：13-18；Murray等人，Gynecol Oncol 2000；76：176-182；Donin等人，Clin Exp Immunol 2003；131：254-263)。通过利用针对CD46、CD55和CD59的中和抗体提高对补体介导的溶解的敏感性的尝试已经失败(Varsano等人，Clin Exp Immunol
1998；113：173-182；Junnikkala等人，J Immunol 2000；164：6075-6081；Maenpaa等人，Am J Pathol 1996；148：1139-1162；Goiter，Lab Invest1996；74：1039-1049)。在后一研究中，CD46和CD55抗体与CD59抗体相反是无效的。这表明可能需要其它靶标或使用针对多个补体调节蛋白或针对两个补体调节蛋白的抗体及免疫性的其它介体。这种整体失效与Fishelson等人(Mol Immunol 2003：40：109-123)的推测相矛盾并且由其它研究的提示来看，用对膜补体调节蛋白的抗体与抗癌补体结合抗体组合治疗癌症患者将改善治疗功效。
1998；113：173-182；Junnikkala等人，J Immunol 2000；164：6075-6081；Maenpaa等人，Am J Pathol 1996；148：1139-1162；Goiter，Lab Invest1996；74：1039-1049)。在后一研究中，CD46和CD55抗体与CD59抗体相反是无效的。这表明可能需要其它靶标或使用针对多个补体调节蛋白或针对两个补体调节蛋白的抗体及免疫性的其它介体。这种整体失效与Fishelson等人(Mol Immunol 2003：40：109-123)的推测相矛盾并且由其它研究的提示来看，用对膜补体调节蛋白的抗体与抗癌补体结合抗体组合治疗癌症患者将改善治疗功效。
[0321] Gelderman等人(Mol Immunol 2003；40：13-23)报道了膜结合补体调节蛋白(mCRP)在同基因大鼠结肠直肠癌模型中通过免疫治疗性mAb抑制补体激活。虽然使用
针对肿瘤抗原和mCRP的mAb克服了肿瘤细胞上所观察到的mCRP作用，但一直没有支持
此方法的直接证据。使用针对CD55和针对肿瘤抗原(G250或EpCAM)的双特异性抗体
的其它尝试已由Gelderman等人(Lab Invest 2002；82：483-493；Eur JImmunol 2002；
32：128-135)提出，这是基于体外研究，该研究显示与亲本抗肿瘤抗体的使用相比在
C3沉积中的2-13倍增加。然而，没有报道涉及增强的细胞杀伤的结果。Jurianz等人
(Immunopharmacology1999；42：209-218)也提出，抗HER2抗体对肿瘤的体外组合治疗可通过膜补体调节蛋白的抗体中和的先前治疗得到增强，但也没有提供体内结果。Sier等人(Int J Cancer 2004；109：900-908)最近报道双特异性抗体是针对在肾细胞癌瘤上表达的抗原而产生(Mab G250)并且当添加β-葡聚糖时CD55增强肾癌细胞在球状体中的杀伤，表明CR3-激发的β-葡聚糖的存在是必须的。
针对肿瘤抗原和mCRP的mAb克服了肿瘤细胞上所观察到的mCRP作用，但一直没有支持
此方法的直接证据。使用针对CD55和针对肿瘤抗原(G250或EpCAM)的双特异性抗体
的其它尝试已由Gelderman等人(Lab Invest 2002；82：483-493；Eur JImmunol 2002；
32：128-135)提出，这是基于体外研究，该研究显示与亲本抗肿瘤抗体的使用相比在
C3沉积中的2-13倍增加。然而，没有报道涉及增强的细胞杀伤的结果。Jurianz等人
(Immunopharmacology1999；42：209-218)也提出，抗HER2抗体对肿瘤的体外组合治疗可通过膜补体调节蛋白的抗体中和的先前治疗得到增强，但也没有提供体内结果。Sier等人(Int J Cancer 2004；109：900-908)最近报道双特异性抗体是针对在肾细胞癌瘤上表达的抗原而产生(Mab G250)并且当添加β-葡聚糖时CD55增强肾癌细胞在球状体中的杀伤，表明CR3-激发的β-葡聚糖的存在是必须的。
[0322] 嗜中性粒细胞(先天性免疫应答中涉及的另一种细胞)也摄取、降解和除去碎片。嗜中性粒细胞具有用于补体和抗体的受体。借助于补体-受体桥和抗体，外来有毒物可被捕获并且呈递给吞噬细胞以便内吞和杀伤。
[0323] 巨噬细胞是作为先天性系统的一部分的白细胞，先天性系统不断地搜索外来抗原物质。作为先天性免疫应答的一部分，巨噬细胞吞噬、杀伤并除去外来颗粒。然而，其还处理用于呈递至B和T细胞从而引起体液或细胞介导的免疫应答的抗原。
[0324] 树突状细胞是先天性和适应性免疫系统借此来通信的一种主要手段(Reis eSousa，Curr Opin Immunol 2004；16：21-25)。据信这些细胞通过对微生物分子或信号的反应形成适应性免疫应答。树突状细胞捕获、加工并呈递抗原，由此激活CD4+和CD8+原初T淋巴细胞，导致初次免疫应答的诱导，并从MHC I类、MHC II类以及辅助分子如CD40、CD54、CD80、CD86及激活T细胞的细胞因子的表达中获取其刺激性效力(Steinman，JExp Hematol
1996；24：859-862；Banchereau和Steinman，Nature 1998；392：245-252)。这些性质使得树突状细胞成为用于癌症和感染性疾病的免疫治疗的候选者(Nestle，Oncogene2000；19：
673-679；Fong和Engleman，Annu Rev Immunol 2000；18：245-273；Lindquist和Pisa，Med Oncol 2002；19：197-211)，并且已显示诱导抗原特异性细胞毒性T细胞，其产生对病毒和肿瘤的强大免疫力(Kono等人，Clin Cancer Res 2002；8：394-40)。
1996；24：859-862；Banchereau和Steinman，Nature 1998；392：245-252)。这些性质使得树突状细胞成为用于癌症和感染性疾病的免疫治疗的候选者(Nestle，Oncogene2000；19：
673-679；Fong和Engleman，Annu Rev Immunol 2000；18：245-273；Lindquist和Pisa，Med Oncol 2002；19：197-211)，并且已显示诱导抗原特异性细胞毒性T细胞，其产生对病毒和肿瘤的强大免疫力(Kono等人，Clin Cancer Res 2002；8：394-40)。
[0325] 对于先天性和适应性免疫系统的相互作用来说同样重要的是NK细胞，其呈现为淋巴细胞，但表现一部分先天性免疫系统的性质。NK细胞已被牵连在肿瘤细胞的杀伤中并且在对病毒感染的应答中也是必需的(Lanier，Curr Opin Immunol 2003；15：308-314；Carayannop oulos和Yokoyama，Curr Opin Immunol 2004；16：26-33)。先天性免疫系统的又一个重要机制是活化细胞因子介体，所述介体提醒哺乳动物宿主的其它细胞存在感染，其中的关键组分是转录因子NF-κB(Li和Verna，Nat Rev Immunol 2002；2：725-734)。
[0326] 如上所述，免疫系统可过度反应，导致过敏反应或自身免疫疾病。其还可被抑制、缺乏或破坏，导致疾病和死亡。当免疫系统不能区分“自身”与“非自身”时，其可连接并破坏身体的细胞和组织，引起自身免疫疾病，例如幼年型糖尿病、多发性硬化症、重症肌无力、全身性红斑狼疮、类风湿性关节炎以及免疫性血小板减少性紫癜。免疫缺陷病是由免疫系统的一个或多个部分的缺乏或破坏引起，并且使得个体容易患上通常不影响具有正常免疫系统的个体的疾病。免疫缺陷病的实例是严重联合免疫缺陷病(SCID)及获得性免疫缺陷病(AIDS)。后者是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起且前者是由酶或其它遗传缺陷如腺苷脱氨酶缺乏症引起。
[0327] 免疫疗法对癌症的施用涉及参与或利用免疫系统的许多方式，如抗肿瘤反应性T细胞的过继性转移和疫苗的使用，以及通过抑制调节细胞破坏对肿瘤自身抗原的耐受性，和通过利用各种细胞因子及所谓的免疫增强分子提高T细胞免疫(Antonia等人，CurrOpin Immunol2004；16：130-136)。也已经描述树枝状细胞疫苗。向患者施用的抗体通过靶向肿瘤细胞抗原/受体的直接和间接(由宿主效应子细胞介导)作用现已进入癌症疗法医疗体系中，如由以下抗体所例示：在淋巴瘤和白血病的疗法中针对CD20和CD52的抗体；
在各种不同实体肿瘤的疗法中的抗表皮生长因子受体(EGFR)、抗HER2/neu变体；以及用于治疗某些实体肿瘤的抗血管内皮生长因子(VEGF)。尽管当单独给予时具有活性，但大多数这些抗体当与其它治疗形式如药物和放射组合时显示增强的抗肿瘤作用。使用这些靶向肿瘤的抗体来递送细胞毒性药物或同位素也是已进入临床的另一种免疫治疗方法。这些及其它癌症免疫治疗方法已在Huber和Wolfel，J Cancer Res Clin Oncol 2004；130：367-374中进行了综述。然而，至少这些方法在一定比例的患者中显示肿瘤的减小和存活的改善，大多数人最终复发，因此需要其它治疗干预和不同的策略来控制他们的疾病。
在各种不同实体肿瘤的疗法中的抗表皮生长因子受体(EGFR)、抗HER2/neu变体；以及用于治疗某些实体肿瘤的抗血管内皮生长因子(VEGF)。尽管当单独给予时具有活性，但大多数这些抗体当与其它治疗形式如药物和放射组合时显示增强的抗肿瘤作用。使用这些靶向肿瘤的抗体来递送细胞毒性药物或同位素也是已进入临床的另一种免疫治疗方法。这些及其它癌症免疫治疗方法已在Huber和Wolfel，J Cancer Res Clin Oncol 2004；130：367-374中进行了综述。然而，至少这些方法在一定比例的患者中显示肿瘤的减小和存活的改善，大多数人最终复发，因此需要其它治疗干预和不同的策略来控制他们的疾病。
[0328] 脓毒病是我们社会的主要医疗和经济负担，在美国每年影响约700,000人，每年导致超过200,000例死亡，并且每年耗费大约167亿美元(Angus等人，Crit Care Med2001；29：1303-1310；Martin等人，N Engl J Med 2003；348：1546-1554)。脓毒病的定义一直是困难的，且在历史上将其定义为针对感染的全身性宿主反应。涵盖全身性炎性反应综合征(SIRS)、脓毒病本身、严重脓毒病、脓毒性休克及多器官功能障碍综合征(MODS)的脓毒病的临床定义的讨论包含于Riedmann等人，J Clin Invest 2003；112：460-467中。因为普遍认同的是，脓毒病是由宿主对侵入微生物的压倒性反应引起，并且此反应对患者的危害比侵入微生物更大，所以抑制免疫和炎性反应是治疗的早期目标。
[0329] 免疫抑制或中和促炎细胞因子的许多和各种不同方法已在临床上在采用脓毒病和脓毒性休克抗炎策略的患者中被证明是不成功的。(Riedmann，等人，以上所引用；
Van Amersfoort等人(Clin Microbiol Rev 2003；16：379-414)，如一般免疫抑制、使用非甾族抗炎药物、TNF-α抗体(英夫利昔单抗)或TNF-R：Fc融合蛋白(依那西普)、
IL-1(白细胞介素-1)受体拮抗剂或高剂量的皮质类固醇。然而，在治疗成人的脓毒病中的成功是PROWESS研究(Human Activated Protein C Worldwide Evaluation in Severe Sepsis(Bernard等人，N Engl J Med 2001；344：699-709))，显示比在安慰剂组(30.8％)中的降低的死亡率(24.7％)。此活化蛋白C(APC)试剂有可能抑制血栓形成和炎症，而促进了纤维蛋白溶解。Friggeri等人(2012，Mol Med 18：825-33)报道了APC降解组蛋白H3和H4，所述组蛋白H3和H4阻断凋亡细胞被巨噬细胞摄取和清除且从而促使急性炎性
状态下的器官系统功能障碍和死亡。Van Amersfoort等人在他们的综述(同上)中指出：
“尽管阻断或调控包括补体和凝血因子、嗜中性粒细胞粘附及NO释放的许多其它靶标在动物中是有前景的，但还需确定这些治疗方法在人中是否是有效的”。这进一步在Abraham的综述中被强调，“免疫调节疗法在脓毒病中为什么不起作用”(Intensive Care Med 1999；
25：556-566)。一般说来，尽管许多炎症和脓毒病的啮齿动物模型在过去的十年或更长时间里已在用各种不同试剂的情况下显示出令人鼓舞的结果，但大多数被转移到临床中的试剂未能在人中再现在这些动物模型中所观察到的，这样使得仍然需要提供可控制涉及脓毒病、凝血病的各种疾病及具有炎性或免疫失调组分的某些神经变性病状的复杂表现和多器官受累的新型试剂。
Van Amersfoort等人(Clin Microbiol Rev 2003；16：379-414)，如一般免疫抑制、使用非甾族抗炎药物、TNF-α抗体(英夫利昔单抗)或TNF-R：Fc融合蛋白(依那西普)、
IL-1(白细胞介素-1)受体拮抗剂或高剂量的皮质类固醇。然而，在治疗成人的脓毒病中的成功是PROWESS研究(Human Activated Protein C Worldwide Evaluation in Severe Sepsis(Bernard等人，N Engl J Med 2001；344：699-709))，显示比在安慰剂组(30.8％)中的降低的死亡率(24.7％)。此活化蛋白C(APC)试剂有可能抑制血栓形成和炎症，而促进了纤维蛋白溶解。Friggeri等人(2012，Mol Med 18：825-33)报道了APC降解组蛋白H3和H4，所述组蛋白H3和H4阻断凋亡细胞被巨噬细胞摄取和清除且从而促使急性炎性
状态下的器官系统功能障碍和死亡。Van Amersfoort等人在他们的综述(同上)中指出：
“尽管阻断或调控包括补体和凝血因子、嗜中性粒细胞粘附及NO释放的许多其它靶标在动物中是有前景的，但还需确定这些治疗方法在人中是否是有效的”。这进一步在Abraham的综述中被强调，“免疫调节疗法在脓毒病中为什么不起作用”(Intensive Care Med 1999；
25：556-566)。一般说来，尽管许多炎症和脓毒病的啮齿动物模型在过去的十年或更长时间里已在用各种不同试剂的情况下显示出令人鼓舞的结果，但大多数被转移到临床中的试剂未能在人中再现在这些动物模型中所观察到的，这样使得仍然需要提供可控制涉及脓毒病、凝血病的各种疾病及具有炎性或免疫失调组分的某些神经变性病状的复杂表现和多器官受累的新型试剂。
[0330] 对于在脓毒病或脓毒性休克中的免疫球蛋白的最新工作已有报道。例如，Toussaint和Gerlach(2012，Curr Infect Dis Rep 14：522-29)概述了在脓毒病中使用ivIG作为辅助疗法。再分化未能显示一般免疫球蛋白疗法与结果之间的任何强相关性。
LaRosa和Opal(2012，Curr Infect Dis Rep 14：474-83)对新型治疗剂在脓毒病中的潜在用途进行了报道。在其他试剂中，抗TNF抗体尤其在当前的临床试验中用于脓毒病，而补体拮抗剂在临床前的脓毒病模型中显示有前景的结果。Nalesso等人(2012，Curr Infect Dis Rep 14：462-73)提出用多种试剂的组合疗法可证明对脓毒病治疗更有效。脓毒病的免疫发病机理已由Cohen(2002，Nature 420：885-91)概述。
LaRosa和Opal(2012，Curr Infect Dis Rep 14：474-83)对新型治疗剂在脓毒病中的潜在用途进行了报道。在其他试剂中，抗TNF抗体尤其在当前的临床试验中用于脓毒病，而补体拮抗剂在临床前的脓毒病模型中显示有前景的结果。Nalesso等人(2012，Curr Infect Dis Rep 14：462-73)提出用多种试剂的组合疗法可证明对脓毒病治疗更有效。脓毒病的免疫发病机理已由Cohen(2002，Nature 420：885-91)概述。
[0331] 脓毒病中的免疫系统被认为在感染或外伤之后具有早期强烈的促炎反应，导致器官损伤，而且还认为先天性免疫系统常常不能有效地杀死侵入微生物(Riedmann和Ward，Expert Opin Biol Ther 2003；3：339-350)。存在已显示一定前景的关于脓毒病的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的一些研究。例如，MIF的阻断或MIF基因的靶向破环显著地改善小鼠在脓毒性休克模型中的存活(Calandra等人，Nature Med2000；6：164-170)，并且一些品系的证据已指出MIF在脓毒病患者中作为治疗干预的潜在靶标(Riedmann等人，如上所引用)。Bucala等人(美国专利号6,645,493B1)要求抗MIF抗体可在治疗上有效地用于治疗由细胞因子介导的毒性所引起的病状或疾病，包括不同形式的脓毒病、炎性疾病、急性呼吸疾病综合征、肉芽肿病、慢性感染、移植排斥、恶病质、哮喘、病毒感染、寄生虫感染、疟疾以及细菌传染，所述专利以引用的方式整体并入本文，包括参考文献。抗LPS(脂多糖)抗体单独的使用在治疗患有脓毒性休克的患者中类似地具有各式各样的结果(Astiz和
Rackow，Lancet 1998；351：1501-1505；Van Amersfoort等人，Clin Microbiol Rev 2003；
16：379-414。
Rackow，Lancet 1998；351：1501-1505；Van Amersfoort等人，Clin Microbiol Rev 2003；
16：379-414。
[0332] 虽然LPS和MIF两者已经成为治疗脓毒病和脓毒性休克中的靶标，但由抗体靶向单独LPS或MIF的方法不足以控制脓毒病的各种不同表现，特别是晚期和严重形式。类似地，使用细胞因子如IL-1、IL-6(白细胞介素-6)、IL-8(白细胞介素-8)等作为用于治疗脓毒病及其它细胞因子介导的毒性反应的抗体的靶标未被证明足以有意义地控制这种疾病。因此，除需要发现脓毒病的内源性反应中所涉及的细胞因子级联的另外靶标之外，现已发现靶向至少一种细胞因子或致病物如MIF或脂多糖(LPS)的二和多官能抗体是有
利的，尤其当与结合至参与炎性或免疫应答的宿主细胞(或其受体)如T细胞、巨噬细胞或树突状细胞组合时。针对MHC II类恒定链靶标如CD74的抗体已由Bucala等人(US
2003/0013122 A1)提出，用于治疗MIF调节的疾病，并且Hansen等人(US 2004/0115193 A1)提出至少一个CD74抗体用于治疗免疫失调疾病、自身免疫疾病、器官移植物排斥以及移植物抗宿主疾病。Hansen等人描述使用抗CD74与同宿主细胞如淋巴细胞和巨噬细胞上的抗原/受体反应的其它抗体的融合蛋白来治疗所述疾病。然而，未提出与非CD74的靶标的组合，并且本公开集中于不同的免疫治疗方法。类似的靶标还适用于治疗动脉粥样硬化斑块(Burger-Kentischer等人，Circulation 2002；105：1561-1566)。
利的，尤其当与结合至参与炎性或免疫应答的宿主细胞(或其受体)如T细胞、巨噬细胞或树突状细胞组合时。针对MHC II类恒定链靶标如CD74的抗体已由Bucala等人(US
2003/0013122 A1)提出，用于治疗MIF调节的疾病，并且Hansen等人(US 2004/0115193 A1)提出至少一个CD74抗体用于治疗免疫失调疾病、自身免疫疾病、器官移植物排斥以及移植物抗宿主疾病。Hansen等人描述使用抗CD74与同宿主细胞如淋巴细胞和巨噬细胞上的抗原/受体反应的其它抗体的融合蛋白来治疗所述疾病。然而，未提出与非CD74的靶标的组合，并且本公开集中于不同的免疫治疗方法。类似的靶标还适用于治疗动脉粥样硬化斑块(Burger-Kentischer等人，Circulation 2002；105：1561-1566)。
[0333] 在治疗感染性、自身免疫、器官移植、炎性以及移植物抗宿主(及其它免疫调节)疾病中，各种不同的且相对非特异性细胞毒性剂被用于杀死或清除有毒物(noxient)或微生物，或减弱对外来移植物或免疫原的宿主免疫应答，或宿主针对“自身”的抗体产生等等。然而，这些通常影响淋巴及造血系统的其它部分，导致对骨髓(造血)及其它正常宿主细胞的毒性作用。尤其在脓毒病中，当遇到免疫抑制状况时，使用免疫抑制疗法将是不达预期的，所以一个目标是实现靶向与抑制适应性免疫系统的关键细胞之间的仔细平衡，而不会耗尽维持活跃免疫系统的宿主所涉及的那些。
[0334] 存在对于癌症和包括以下的多种免疫疾病的改善的更具选择性的疗法的需要：脓毒病和脓毒性休克、炎症、动脉粥样硬化、恶病质、移植物抗宿主、及其它免疫失调病症。
[0335] 概述
[0336] 各种实施方案涉及耐受良好的方法，其在各种炎性和免疫失调疾病、感染性疾病、病理性血管生成及癌症中使用包含多特异性抗体或单独的抗体组合的组合物。多特异性抗体或抗体的组合比仅与同这些病状有关的一个靶标特异性地反应的试剂更有效。抗体与一个或多个选自由以下组成的组的靶标反应：(A)组蛋白，(B)先天性免疫系统的促炎效应子，(C)凝血因子，(D)补体因子和补体调节蛋白，以及(E)与炎性或免疫失调病症或与病理性血管生成或癌症特异性地相关的靶标，其中后一靶标不是(A)、(B)、(C)或(D)。至少一个靶标是(A)、(B)、(C)或(D)。也可选择适应性免疫系统的靶标，如特异性树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞、T细胞、B细胞及其特化群体。当组合物包含单一多特异性抗体时，可排除CD74作为靶标，除非与抗组蛋白抗体组合。此外，当组合物包含单独的抗体的组合时，排除其中一种抗体靶向B细胞抗原且其它抗体靶向T细胞、浆细胞、巨噬细胞或炎性细胞因子的组合，除非与抗组蛋白抗体组合使用。也排除其中一种抗体靶向CD20且其它抗体靶向C3b或CD40或CD40L的单独的抗体组合，当与本发明的抗组蛋白抗体组合时除外。
[0337] 当组合物包含单独的抗体组合时，排除其中一种抗体靶向CD19、CD20、CD21、CD22、CD23或CD80且其它抗体靶向补体因子的组合。更具体地说，排除其中一种抗体靶向CD19、CD20、CD21、CD22、CD23或CD80且其它抗体靶向C3b或CD40的组合。然而，它们中的任一种可与本发明的抗组蛋白抗体组合。
[0338] 用于治疗免疫失调疾病、感染性疾病和炎性疾病的靶标
[0339] 先天性免疫系统的促炎效应子可以是促炎效应子细胞因子、促炎效应子趋化因子或促炎效应子受体。适合的促炎效应子细胞因子包括MIF、HMGB-1(高流动组盒蛋白1)、TNF-α、IL-1、IL-4(白细胞介素-4)、IL-5(白细胞介素-5)、IL-6、IL-8、IL-12(白细胞介素-12)、IL-15(白细胞介素-15)、IL-17(白细胞介素-17)、IL-18(白细胞介素-18)以及IL-23(白细胞介素-23)。促炎效应子趋化因子的实例包括CCL19、CCL21、IL-8、MCP-1、RANTES、MIP-1A、MIP-1B、ENA-78、MCP-1、IP-10、GRO-β以及Eotaxin。促炎效应子受体包括IL-4R(白细胞介素-4受体)、IL-6R(白细胞介素-6受体)、IL-13R(白细胞介素-13受体)、IL-15R(白细胞介素-15受体)、IL-17R(白细胞介素-17受体)以及IL-18R(白细胞
介素-18受体)。
介素-18受体)。
[0340] 多特异性抗体或抗体的组合还可与至少一种凝血因子，尤其是组织因子(TF)、血栓调节蛋白或凝血酶特异性地反应。在其它实施方案中，多特异性抗体或抗体的组合与至少一种补体因子或补体调节蛋白特异性地反应。在优选实施方案中，补体因子选自由以下组成的组：C3、C5、C3a、C3b及C5a。在这些实施方案中，靶组合优选地不包括其中当组合物包含单独的抗体组合时其它抗体靶向CD19、CD20、CD21、CD22、CD23或CD80的那些组合。当抗体与补体调节蛋白特异性地反应时，所述补体调节蛋白优选地选自由以下组成的组：
CD46、CD55、CD59及mCRP。
CD46、CD55、CD59及mCRP。
[0341] 在一个实施方案中，组合物包含两种或更多种在特异性方面不同的抗体，其各自与先天性免疫系统的不同促炎效应子特异性地反应。或者，组合物包含两种或更多种在特异性方面不同的抗体，其各自与不同的凝血因子特异性地反应。在另一实施方案中，组合物包含两种或更多种在特异性方面不同的抗体，其各自与不同的补体因子或补体调节蛋白特异性地反应。在其它实施方案中，两种或更多种抗体分别与以下特异性地反应：先天性免疫系统的至少一个促炎效应子和至少一个凝血因子、或先天性免疫系统的至少一个促炎效应子和至少一个补体因子或补体调节蛋白、或至少一个补体因子或补体调节蛋白和至少一个凝血因子。或者，多特异性抗体可与先天性免疫系统的一个以上促炎效应子或与一个以上凝血因子或与一个以上补体因子或补体调节蛋白特异性地反应。优选的是包括本发明的抗组蛋白抗体的上述抗体的组合。
[0342] 两种或更多种抗体可与以下特异性地反应：先天性免疫系统的相同促炎效应子的一个以上表位或相同凝血因子的一个以上表位或相同补体因子或补体调节蛋白的一个以上表位或组蛋白的一个以上表位。在任何这些实施方案中，多特异性抗体另外可与同炎性或免疫失调病症或与病理性血管生成或癌症特异性地相关的靶标反应，所述靶标不是如上所定义的(A)、(B)、(C)或(D)靶标。在其它实施方案中，多特异性抗体与同炎性或免疫失调病症或同病理性血管生成或癌症特异性地相关的靶标并且与如上所定义的一个或多个(A)、(B)、(C)或(D)靶标反应。病理性血管生成的有用的靶标的一个实例是Flt-1。
[0343] 或者，组合物可包含至少一种可溶性受体或至少一种促炎效应子受体的至少一个细胞外结构域。在一个实施方案中，组合物包含至少一种可溶性受体或融合至至少一种抗体的促炎效应子受体的至少一个细胞外结构域。
[0344] 组合物可包含与促炎效应子受体起反应的至少一种分子。此分子优选地是促炎效应子受体的天然拮抗剂、或特异性地与所述受体互相作用的拮抗剂的片段或突变体。在一个实施方案中，天然拮抗剂是天然的IL-1受体拮抗剂、或此拮抗剂的片段或突变体。
[0345] 多特异性抗体另外可靶向树突状细胞、粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、NK-细胞、血小板或内皮细胞。在一些实施方案中，多特异性抗体特异性地与适应性免疫系统的至少一种抗原或受体反应。在其它实施方案中，多特异性抗体与以下特异性地反应：癌细胞受体、癌症致癌基因、或癌症相关抗原，如B细胞谱系抗原(CD19、CD20、CD21、CD22、CD23等)、VEGFR、EGFR、癌胚抗原(CEA)、胎盘生长因子(PLGF)、腱生蛋白、HER-2/neu、EGP-1、EGP-2、CD25、CD30、CD33、CD38、CD40、CD45、CD52、CD74、CD80、CD138、NCA66、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5ac、MUC16、IL-6、α-甲胎蛋白(AFP)、A33CA125、结肠特异性抗原-p(CSAp)、叶酸受体、HLA-DR、人绒毛膜促性腺激素(HCG)、Ia、EL-2、胰岛素样生长因子(ILGF)和ILGF受体、KS-1、Le(y)、MAGE、坏死抗原、PAM-4粘蛋白、MUC5ac、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、Pr1、前列腺特异性抗原(PSA)、PSMA、S100、T101、TAC、TAG72、TRAIL受体或碳酸酐酶IX。靶向增殖的髓样骨髓细胞的Flt-3也适用于鉴定和治疗某些癌症。或者，多特异性抗体可与以下特异性地反应：如C5a、因子H、FHL-1、LPS、IFNγ或B7的靶标，或如CD2、CD4、CD14、CD18、CD11a、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD29、CD38、CD40L、CD52、CD64、CD83、CD147或CD154的靶标。
[0346] 当靶向促炎效应子受体时，在一个优选实施方案中，实际靶标可以是促炎效应子受体的细胞外结构域。促炎效应子受体的此细胞外结构域可融合至抗体。更具体地说，促炎效应子可以是融合至抗体的可溶性受体或受体配体。在一个替代实施方案中，组合物可包含与促炎效应子受体起反应的至少一种分子。此分子可以是所述促炎效应子受体的天然拮抗剂、或特异性地与所述受体互相作用的此拮抗剂的片段或突变体。在一个优选实施方案中，天然拮抗剂是天然的IL-1受体拮抗剂、或此拮抗剂的片段或突变体。
[0347] 多特异性抗体特异性地结合的至少两种不同靶标中的一种可以是并非免疫系统的促炎效应子或凝血因子的靶标。在这种情况下，多特异性抗体还特异性地与免疫系统的至少一个促炎效应子或至少一个凝血因子结合。在一个实施方案中，这至少一个其它靶标是适应性免疫系统的抗原或受体。在其它实施方案中，多特异性抗体的至少一个其它靶标靶向先天性免疫系统的细胞，如粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞及NK细胞。其它靶标包括血小板和内皮细胞。又一组靶标是由以下组成的组：C5a、LPS、IFN-γ及B7。另一组适合的靶标包括CD2、CD4、CD14、CD18、CD11a、CD20、CD22、CD23、CD25、CD29、CD38、CD40L、CD52、CD64、CD83、CD147及CD154。CD是免疫细胞上的靶标，其可由抗体阻断以防止免疫细胞应答。CD83尤其适用作活化的树突状细胞的标记物(Cao等人，Biochem J.，2004年8月23日(在付印之前以电子文档公开)；Zinser等人，J.Exp Med.200(3)：345-51(2004))。
[0348] 特别关注的是某些靶标，如MIF、HMGB-1、TNF-α、补体因子和补体调节蛋白、以及凝血因子。MIF是先天性免疫系统中的关键细胞因子并且在控制炎性反应中起重要作用。被称为巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)的蛋白质最初被描述为抑制巨噬细胞的随机迁移的源自T淋巴细胞的因子，它在近30年来是令人费解的细胞因子。近年来，对MIF作为垂体前叶的产物以及生物活性的重组MIF蛋白的克隆和表达的发现已产生其重要的体内生物作用的定义。MIF具有从已被糖皮质激素刺激的巨噬细胞和T淋巴细胞释放的独特性质。
一旦释放，MIF便克服糖皮质激素对由LPS刺激的单核细胞体外产生TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8的抑制作用并且抑制类固醇针对致命内毒素血症的体内保护作用。MIF还通过恢复IL-2和IFN-γ产生来拮抗T细胞增殖的体外糖皮质激素抑制。MIF是可反调节糖皮质
激素的抑制作用的有待鉴定的第一介体且由此在宿主控制炎症和免疫力中发挥关键作用。
MIF尤其适用于治疗癌症、病理性血管生成、以及脓毒病或脓毒性休克，且因此是与本发明的抗组蛋白抗体组合的有用的靶标。
一旦释放，MIF便克服糖皮质激素对由LPS刺激的单核细胞体外产生TNF-α、IL-1β、IL-6及IL-8的抑制作用并且抑制类固醇针对致命内毒素血症的体内保护作用。MIF还通过恢复IL-2和IFN-γ产生来拮抗T细胞增殖的体外糖皮质激素抑制。MIF是可反调节糖皮质
激素的抑制作用的有待鉴定的第一介体且由此在宿主控制炎症和免疫力中发挥关键作用。
MIF尤其适用于治疗癌症、病理性血管生成、以及脓毒病或脓毒性休克，且因此是与本发明的抗组蛋白抗体组合的有用的靶标。
[0349] HMGB-1(一种DNA结合核及胞质蛋白)是由已被IL-1β、TNF或LPS激活的单核细胞和巨噬细胞释放的促炎细胞因子。经由它的B盒结构域，其诱导DC的表型成熟。其还造成促炎细胞因子IL-1α、IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α以及RANTES的分泌增加。由坏死细胞释放的HMGB-1可以是组织或细胞损伤的信号，其当由DC感测时，诱导和或增强免疫反应。Palumbo等人报道HMGB-1诱导中胚层成血管细胞(mesoangioblast)迁移和增殖(J Cell Biol，164：441-449(2004))。
[0350] HMGB-1是展现有关TNF和IL-1β的显著延迟动力学的内毒素诱发的致命性的晚期介体。单独靶向特异性早期炎性介体如TNF和IL-1β的实验性治疗剂在临床上并未证明有效，而根据本发明的多特异性抗体可通过靶向早期和晚期炎性介体改善应答，尤其当与本发明的抗组蛋白抗体组合时。
[0351] 靶向HMBG-1的多特异性抗体尤其适用于治疗关节炎，尤其是胶原诱导的关节炎。包含HMGB-1的多特异性抗体还适用于治疗脓毒病和/或脓毒性休克。Yang等人，
PNAS USA 101：296-301(2004)；Kokkola等人，Arthritis Rheum，48：2052-8(2003)；Czura等人，J Infect Dis，187增刊2：S391-6(2003)；Treutiger等人，J Intern Med，254：
375-85(2003)。
PNAS USA 101：296-301(2004)；Kokkola等人，Arthritis Rheum，48：2052-8(2003)；Czura等人，J Infect Dis，187增刊2：S391-6(2003)；Treutiger等人，J Intern Med，254：
375-85(2003)。
[0352] TNF-α是全身性炎症和急性期反应中涉及的重要细胞因子。TNF-α由刺激的单核细胞、成纤维细胞及内皮细胞释放。巨噬细胞、T细胞和B淋巴细胞、粒细胞、平滑肌细胞、嗜酸性粒细胞、软骨细胞、成骨细胞、肥大细胞、胶质细胞及角化细胞在刺激之后也产生TNF-α。其释放是在例如由于感染而损伤的过程中由几个其它介体如白细胞介素-1和细菌内毒素而刺激。它通常和白细胞介素-1和-6一起对各种器官系统具有许多作用。TNF-α的作用之一是食欲抑制；因此用于治疗恶病质的多特异性抗体优选地靶向TNF-α。它还刺激肝脏的急性期反应，导致C反应蛋白和许多其它介体的增加。它还是当治疗脓毒病或脓毒性休克时的有用靶标，这是其在所述疾病、尤其是脓毒病和自身免疫疾病中与抗组蛋白抗体和/或血栓调节蛋白组合的基础。
[0353] 补体系统是涉及经常由细胞受体激活的血清糖蛋白的蛋白水解裂解的复杂级联。“补体级联”是组成性和非特异性的，但其必须被激活以便发挥作用。补体激活导致酶促和生化反应的单向顺序。在此级联中，特异性补体蛋白C5形成两种高活性的炎性副产物C5a和C5b，其共同地激活白细胞。这又激发了许多其它炎性副产物，包括有害的细胞因子、炎性酶和细胞粘附分子。共同地，这些副产物可导致见于许多炎性疾病中的组织破坏。此级联最终导致诱导炎性反应、吞噬细胞化学趋化性和调理作用、以及细胞裂解。
[0354] 补体系统可经由两个不同的途径被激活，即经典途径和替代途径。对大多数补体组分进行编号(例如，C1、C2、C3等)，但一些被称为“因子”。一些组分必须被酶促裂解以激活它们的功能；其它简单组合以形成具有活性的复合物。经典途径的活性组分包括C1q、C1r、C1s、C2a、C2b、C3a、C3b、C4a以及C4b。替代途径的活性组分包括C3a、C3b、因子B、因子Ba、因子Bb、因子D以及备解素。每个途径的最后阶段是相同的，并且涉及组分装配成膜攻击复合物。膜攻击复合物的活性组分包括C5a、C5b、C6、C7、C8以及C9n。与本发明的抗组蛋白抗体组合的抗C5a尤其有效用于治疗凝血病和脓毒病。
[0355] 虽然补体系统的任何这些组分都可由多特异性抗体来靶向，但某些补体组分是优选的。C3a、C4a和C5a引起肥大细胞释放趋化因子如组胺和血清素，趋化因子吸引吞噬细胞、抗体及补体等。这些形成根据本发明的一组优选靶标。另一组优选靶标包括C3b、C4b和C5b，其增强外来细胞的吞噬作用。另一组优选靶标是这两组的前身组分，即C3、C4和C5。C5b、C6、C7、C8和C9诱导外来细胞(膜攻击复合物)的溶解且形成又一组优选靶标。
[0356] 补体C5a像C3a一样是过敏毒素。其介导炎症并且是用于诱导抗微生物蛋白酶和氧自由基的嗜中性释放的趋化性引诱剂。因此，C5a和其前身C5是尤其优选的靶标。通过靶向C5，不仅C5a受影响，而且C5b也受影响，其引发膜攻击复合物的组装。因此，C5是另一优选靶标。C3b和其前身C3也是优选靶标，因为经典和替代补体途径依赖于C3b。三种蛋白质影响此因子、C1抑制剂、蛋白质H和因子I的水平，并且这些也是根据本发明的优选靶标。补体调节蛋白如CD46、CD55及CD59可以是多特异性抗体所结合的靶标。
[0357] 凝血因子也是根据本发明的优选靶标，尤其是组织因子(TF)、血栓调节蛋白和凝血酶。TF也称为组织凝血激酶、CD142、凝血因子III或因子III。TF是整合膜受体糖蛋白和细胞因子受体超家族的一个成员。TF的配体结合细胞外结构域由两种结构模块组成，所述模块具有与TF作为2型细胞因子受体成员的类别一致的特征。TF牵涉于血液凝固蛋白酶级联中并通过在TF的细胞外结构域与循环血液凝固因子、丝氨酸蛋白酶因子VII或因子VIIa之间形成高亲和力复合物而引发外在和内在血液凝固级联。这些酶促活性复合物随后激活因子IX和因子X，导致凝血酶产生和凝块形成。
[0358] TF由包括单核细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞的各种细胞类型来表达并且由IL-1、TNF-α或细菌脂多糖来诱导。蛋白激酶C牵涉于内皮细胞TF表达的细胞因子活化中。通过内毒素和细胞因子诱导TF是引发患有革兰氏阴性脓毒病的患者中所见的弥漫性血管内凝血的一个重要机制。TF还似乎牵涉于多种非止血功能中，包括炎症、癌症、脑功能、免疫应答以及肿瘤相关血管生成。因此，靶向TF的多特异性抗体不仅适用于治疗凝血病，而且适用于治疗根据本发明的脓毒病、癌症、病理性血管生成及其它免疫和炎性失调疾病。
凝血途径与细胞因子网络之间的复杂相互作用是通过几个细胞因子影响多种细胞中的TF表达的能力和通过配体结合至受体的效果来提出。已报道配体结合(因子VIIa)发出细胞内钙信号，由此表明TF是真正的受体。
凝血途径与细胞因子网络之间的复杂相互作用是通过几个细胞因子影响多种细胞中的TF表达的能力和通过配体结合至受体的效果来提出。已报道配体结合(因子VIIa)发出细胞内钙信号，由此表明TF是真正的受体。
[0359] 凝血酶是活化形式的凝血因子II(凝血酶原)；其将纤维蛋白原转化为纤维蛋白。凝血酶是巨噬细胞的有效趋化因子，且可改变细胞因子和花生四烯酸代谢物的产生。这在伴随脓毒病的凝血病中特别重要。大量的研究已经证明凝血系统在脓毒症患者中或在动物模型中施用LPS之后的激活。尽管有三十多年的研究，但对LPS诱导的肝毒性的机制仍然知之甚少。现在清楚的是，它们涉及细胞与体液介体之间的复合和连续的相互作用系列。在相同时段中，革兰氏阴性全身性脓毒病及其后遗症已变为主要的健康问题，试图使用针对LPS或各种炎性介体的单克隆抗体仅造成治疗失败，如本文别处所指出。靶向凝血酶和至少一个其它靶标的本发明的多特异性抗体解决脓毒病治疗中的临床失败。
[0360] 重组形式的血栓调节蛋白已被批准用于治疗弥漫性血管内凝血(DIC)并且在II期临床试验中用于与脓毒病有关的DIC(Okamoto等人，2012，Crit Care Res Pract，Epub2012年2月28日)。血栓调节蛋白在蛋白C系统中具有关键作用，蛋白C系统在脓毒病的发病机制中很重要(Levi和Van der Poll，Minerva Anestesiol Epub 2012年12月17日)。
血栓调节蛋白在脓毒病中的下调造成蛋白C的激活削弱，蛋白C在凝血和炎症的调节中是主要的(Levi和Van der Poll，Minerva Anestesiol Epub 2012年12月17日)。据报道
施用重组血栓调节蛋白对凝血的恢复和器官衰竭的改善具有有益的作用(Levi和Van der Poll，Minerva Anestesiol Epub 2012年12月17日)。近来的回顾性研究证实用重组血栓调节蛋白的治疗与患有脓毒病诱导的DIC的就医患者中的降低的死亡率有关(Yamakawa等人，2013，Intensive Care Med，Epub 2013年1月30日)。
血栓调节蛋白在脓毒病中的下调造成蛋白C的激活削弱，蛋白C在凝血和炎症的调节中是主要的(Levi和Van der Poll，Minerva Anestesiol Epub 2012年12月17日)。据报道
施用重组血栓调节蛋白对凝血的恢复和器官衰竭的改善具有有益的作用(Levi和Van der Poll，Minerva Anestesiol Epub 2012年12月17日)。近来的回顾性研究证实用重组血栓调节蛋白的治疗与患有脓毒病诱导的DIC的就医患者中的降低的死亡率有关(Yamakawa等人，2013，Intensive Care Med，Epub 2013年1月30日)。
[0361] 在其它实施方案中，多特异性抗体结合至MHC I类、MHC II类或辅助分子，如CD40、CD54、CD80或CD86。多特异性抗体还可结合至T细胞活化细胞因子或细胞因子介体，如NF-κB。
[0362] 与脓毒病和免疫失调及其它免疫病症有关的靶标包括MIF、IL-1、IL-6、IL-8、CD74、CD83以及C5aR。已发现针对C5aR的抗体和抑制剂改善患有脓毒病的啮齿动物的存活(Huber-Lang等人，FASEB J 2002；16：1567-1574；Riedemann等人，J Clin Invest 2002；110：101-108)以及猴子中的脓毒性休克和成年呼吸窘迫综合征(Hangen等人，J Surg Res
1989；46：195-199；Stevens等人，J Clin Invest1986；77：1812-1816)。因此，对于脓毒病，至少两种不同靶标中的一个优选地是与感染有关的靶标，如LPS/C5a。其它优选靶标包括HMGB-1、TF、CD14、VEGF以及IL-6，其各自与败血病或脓毒性休克有关。优选的多特异性抗体是靶向两个或更多个来自以下的靶标的那些抗体：HMGB-1、TF和MIF，如MIF/TF和HMGB-1/TF、以及HMGB-1和组蛋白、及MIF和组蛋白。
1989；46：195-199；Stevens等人，J Clin Invest1986；77：1812-1816)。因此，对于脓毒病，至少两种不同靶标中的一个优选地是与感染有关的靶标，如LPS/C5a。其它优选靶标包括HMGB-1、TF、CD14、VEGF以及IL-6，其各自与败血病或脓毒性休克有关。优选的多特异性抗体是靶向两个或更多个来自以下的靶标的那些抗体：HMGB-1、TF和MIF，如MIF/TF和HMGB-1/TF、以及HMGB-1和组蛋白、及MIF和组蛋白。
[0363] 在其它实施方案中，至少两种不同靶标中的一种可以是与移植物抗宿主疾病或移植排斥有关的靶标，如MIF(Lo等人，Bone Marrow Transplant，30(6)：375-80(2002))。至少两种不同靶标中的一种也可以是与以下疾病相关的靶标：急性呼吸窘迫综合征，如IL-8(Bouros等人，PMC Pulm Med，4(1)：6(2004))；动脉粥样硬化或再狭窄，如MIF(Chen等人，Arterioscler Thromb Vasc Biol，24(4)：709-14(2004))；哮喘，如IL-18(Hata等人，Int Immunol，2004年10月11日，在付印之前以电子文档公开)；肉芽肿病，如
TNF-α(Ulbricht等人，Arthritis Rheum，50(8)：2717-8(2004))；神经病，如氨基甲酰化EPO(促红细胞生成素)(Leist等人，Science 305(5681)：164-5(2004))；或恶病质，如IL-6和TNF-α。
TNF-α(Ulbricht等人，Arthritis Rheum，50(8)：2717-8(2004))；神经病，如氨基甲酰化EPO(促红细胞生成素)(Leist等人，Science 305(5681)：164-5(2004))；或恶病质，如IL-6和TNF-α。
[0364] 其它靶标包括C5a、LPS、IFN-γ、B7、CD2、CD4、CD14、CD18、CD11a、CD11b、CD11c、CD14、CD18、CD27、CD29、CD38、CD40L、CD52、CD64、CD83、CD147、CD154。通过某些微生物抗原(包括LPS)激活单核细胞可由针对CD18、CD11b或CD11c的抗体在某种程度上得到抑制，这由此牵涉β.sub.2-整联蛋白(Cuzzola等人，J Immunol2000；164：5871-5876；Medvedev等人，J Immunol 1998；160：4535-4542)。已发现CD83在巨细胞性动脉炎(GCA)中起作用，GCA是累及中等和大动脉的全身性血管炎，主要为主动脉弓及主动脉本身的颅外分支，导致血管狭窄和随后的组织缺血，以及失明、中风和主动脉弓综合征的严重并发症(Weyand和Goronzy，N Engl J Med 2003；349：160-169；Hunder和Valente，Inflammatory Diseases of Blood Vessels.G S.Hoffman和C.M.Weyand，编著，Marcel Dekker，New York，2002；255-265)。发现针对CD83的抗体消除人GCA的SCID小鼠模型中的血管炎(Ma-Krupa等
人，JExp Med 2004；199：173-183)，从而向研究者表明，当激活时表达CD83的树突状细胞是GCA中的关键抗原加工细胞。在这些研究中，他们使用小鼠抗CD83Mab(来自Research Diagnostics的IgG1克隆HB15e)。CD154(TNF家族的一个成员)在CD4阳性T-淋巴细
胞的表面上表达，并且据报道针对CD 154的人源化单克隆抗体在患有活动性全身性红
斑狼疮(SLE)的患者中产生显著的临床益处(Grammar等人，J Clin Invest 2003；112：
1506-1520)。还提示此抗体可能适用于其它自身免疫疾病(Kelsoe，J Clin Invest 2003；
112：1480-1482)。实际上，还报道此抗体在患有难治性免疫性血小板减少性紫癜的患者中是有效的(Kuwana等人，Blood 2004；103：1229-1236)。
人，JExp Med 2004；199：173-183)，从而向研究者表明，当激活时表达CD83的树突状细胞是GCA中的关键抗原加工细胞。在这些研究中，他们使用小鼠抗CD83Mab(来自Research Diagnostics的IgG1克隆HB15e)。CD154(TNF家族的一个成员)在CD4阳性T-淋巴细
胞的表面上表达，并且据报道针对CD 154的人源化单克隆抗体在患有活动性全身性红
斑狼疮(SLE)的患者中产生显著的临床益处(Grammar等人，J Clin Invest 2003；112：
1506-1520)。还提示此抗体可能适用于其它自身免疫疾病(Kelsoe，J Clin Invest 2003；
112：1480-1482)。实际上，还报道此抗体在患有难治性免疫性血小板减少性紫癜的患者中是有效的(Kuwana等人，Blood 2004；103：1229-1236)。
[0365] 在类风湿性关节炎中，重组白细胞介素-1受体拮抗剂、IL-1Ra或阿那白滞素(Kineret.RTM.)已显示活性(Cohen等人，Ann Rheum Dis2004；63：1062-8；Cohen，Rheum Dis Clin North Am2004；30：365-80)。在治疗这些患者(至今需要用氨甲蝶呤的伴随治疗)中的一个改善是阿那白滞素与一种或多种抗促炎效应子细胞因子或抗促炎效应
子趋化因子(如上所列)的组合。实际上，在对类风湿性关节炎的抗体疗法的评价中，
Taylor(Curr Opin Pharmacol 2003；3：323-328)提出，除TNF之外，针对如IL-1、IL-6、IL-8、IL-15、IL-17及IL-18的细胞因子的其它抗体也是适用的。
子趋化因子(如上所列)的组合。实际上，在对类风湿性关节炎的抗体疗法的评价中，
Taylor(Curr Opin Pharmacol 2003；3：323-328)提出，除TNF之外，针对如IL-1、IL-6、IL-8、IL-15、IL-17及IL-18的细胞因子的其它抗体也是适用的。
[0366] 当多特异性抗体是至少双特异性的抗体时，存在某些优势，包括从血液中的快速清除。例如，双特异性抗体可结合至受体或其靶分子，例如针对LPS、IL-1、IL-10、IL-6、MIF、HMGB1、TNF、IFN、组织因子、凝血酶、CD14、CD27以及CD134。这些中有许多以两种受体形式且在血液中以可溶性形式存在。由双特异性抗体的结合造成从血液中快速清除，接着由融合蛋白的第二臂靶向另一细胞如巨噬细胞，用于由细胞、尤其是溶酶体的转运和降解。当第二靶向臂是针对内化抗原、如由巨噬细胞和树突状细胞表达的CD74时，这尤其有效。这与Hansen的美国专利号6,458,933的发明是一致的，但在本文中集中于炎性细胞因子及其它免疫调节分子和免疫失调疾病的受体、以及用于免疫治疗这些癌症的癌症抗原。
[0367] 用于治疗癌症的优选多特异性抗体包括针对CD55和以上所鉴定的任何癌症抗原的抗体、针对CD46和任何以上癌症抗原的抗体、针对CD59和任何以上癌症抗原的抗体、针对MIF和任何以上癌症抗原的抗体、针对NF-κB和任何以上癌症抗原的抗体、以及针对IL-6和任何以上并非IL-6的癌症抗原的抗体。用于治疗癌症的这些多特异性抗体可以是共同或单独给予的抗体组合或融合蛋白。
[0368] 多特异性抗体或抗体组合可结合一种或多种第二治疗剂使用。此第二治疗剂可以是影响先天性免疫系统的组分的试剂。或者，其可影响适应性免疫系统的组分。第二治疗剂也可以是影响凝血、癌症或自身免疫疾病的组分，如细胞毒类药物。
[0369] 多特异性抗体可与同特定疾病和病状有关的靶标或标记物特异性地反应，如感染性疾病、急性呼吸窘迫综合征、败血病或脓毒性休克、移植物抗宿主疾病或移植排斥、动脉粥样硬化、哮喘、痤疮、巨细胞性动脉炎、肉芽肿病、神经病、恶病质、凝血病如弥漫性血管内凝血(DIC)或心肌缺血。
[0370] 多特异性抗体或抗体组合适用于治疗如炎性或免疫失调病症、病理性血管生成或癌症及感染性疾病的病状。组合物可用于治疗败血病或脓毒性休克、感染性疾病(细菌、病毒、真菌或寄生虫)、神经病、移植物抗宿主疾病或移植排斥、急性呼吸窘迫综合征、肉芽肿病、哮喘、动脉粥样硬化、痤疮、巨细胞性动脉炎、凝血病如弥漫性血管内凝血(DIC)或恶病质。在其它实施方案中，所述病状是自身免疫疾病，尤其是III类自身免疫疾病。
[0371] 所述组合物还可用于治疗病理性血管生成或癌症。癌症可以是造血系统癌症，如白血病、淋巴瘤或骨髓瘤等。或者，癌症可以是实体肿瘤，如癌瘤、黑素瘤、肉瘤、神经胶质瘤等。
[0372] 本发明抗体可以是一种免疫缀合物，其包含治疗剂，如放射性核素、免疫调节剂、激素、激素拮抗剂、酶、酶抑制剂、寡核苷酸、光活化治疗剂、细胞毒性剂、抗体、血管生成抑制剂、免疫调节剂及其组合。当治疗剂是寡核苷酸时，其可以是反义寡核苷酸。治疗剂在上文中更详细地论述。
[0373] 本发明还提供一种治疗选自炎性或免疫失调病症、病理性血管生成或癌症、以及感染性疾病的病状的方法，其包括向疑似患有所述病状的患者施用治疗有效量的包括半抗原结合位点的多特异性抗体；容许多特异性抗体附着在靶位点处；等待循环多特异性抗体从血流中清除；向所述受试者施用包含治疗剂的半抗原；并且允许含有治疗剂的半抗原结合至所述多特异性抗体的结合位点。优选地，多特异性抗体具有如本发明中所述的抗组蛋白抗体作为所包括的抗体中的一个。
[0374] 本文所述的多特异性抗体适用于治疗自身免疫疾病，尤其用于治疗III类自身免疫疾病，包括免疫介导的血小板减少症，如急性特发性血小板减少性紫癜和慢性特发性血小板减少性紫癜、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、糖尿病、亨-舍二氏紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎(Takayasu’s arteritis)、阿狄森氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、多发性结节性动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻氏综合征、血栓闭塞性脉管炎、干燥综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳肉芽肿病(Wegener’s granulomatosis)、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、快速进行性肾小球性肾炎以及纤维性肺泡炎。
[0375] 多特异性抗体还适用于治疗除自身免疫疾病之外的炎性或免疫失调病症。可用根据本发明的组合物治疗的这些其它炎性或免疫失调病症的实例包括败血病或脓毒性休克、感染、神经病、移植物抗宿主病、移植排斥、急性呼吸窘迫综合征、肉芽肿病、哮喘、痤疮、弥漫性血管内凝血(DIC)以及动脉粥样硬化。
[0376] 多特异性抗体还可用于治疗与感染性疾病有关的炎症，包括病毒感染、细菌感染、寄生虫感染和真菌感染。示例性病毒包括以下物种：人免疫缺陷病毒(HIV)、疱疹病毒、巨细胞病毒、狂犬病病毒、流感病毒、乙型肝炎病毒、仙台病毒、猫白血病病毒、Reo病毒、脊髓灰质炎病毒、人血清细小样病毒、猿猴病毒40、呼吸道合胞病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒、登革热病毒、风疹病毒、麻疹病毒、腺病毒、人T细胞白血病病毒、埃-巴二氏病毒、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水泡性口膜炎病毒、辛德毕斯病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、疣病毒以及蓝舌病病毒。示例性细菌包括炭疽杆菌、无乳链球菌、嗜肺性军团病菌、酿脓链球菌、大肠杆菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、肺炎球菌、流感嗜血杆菌B、苍白密螺旋体、莱姆病螺旋体、绿脓假单胞菌、麻风分枝杆菌、流产布鲁氏菌、结核分枝杆菌以及破伤风杆菌。示例性原生动物是恶性疟原虫、间日疟原虫、鼠弓形体、让氏锥虫、克氏锥虫、罗德西亚锥虫、布氏锥虫、曼氏血吸虫、日本血吸虫、牛巴贝西虫、柔嫩艾美球虫、盘尾丝虫、热带利什曼原虫、旋毛线虫、盘尾丝虫、小泰累尔梨浆虫、水泡带绦虫、绵羊绦虫、牛肉绦虫、细粒棘球绦虫或科尔蒂中殖孔绦虫。示例性支原体是关节炎支原体、猪鼻支原体、口腔支原体、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体、唾液支原体以及肺炎支原体。真菌可来自以下物种：小孢子菌属、发癣菌属、表皮癣菌属、申氏孢子丝菌、新型隐球菌、皮炎芽生菌或白色念珠菌。示例性寄生虫包括疟原虫、螺旋体等等，包括蠕虫。代表性致病感染性生物体(可针对所述生物体开发用于本发明中的抗体)的列表包含在Davis等人，MICROBIOLOGY(Harper&Row，New York，1973以及后面的)的第二版和后续版本中，并且为本领域技术人员所熟知。在这些实施方案中，多特异性抗体优选地靶向与微生物或寄生虫有关的抗原。
[0377] 脓毒病和脓毒性休克的特征为压倒性的炎性和免疫应答，这使得其尤其适用于根据本发明的多特异性抗体的治疗。根据本发明的这些病状的治疗必须将经由不同机制起作用的试剂相组合，且优选地通过施用针对一个以上此免疫失调炎性疾病的发病机制中所涉及的靶分子起作用的拮抗剂或激动剂介体或抗体的融合蛋白。如由Van Amersfoort等人(同上)所提出，“应努力恢复促炎应答和抗炎应答之间的平衡”。本发明恢复所述平衡并且通过使用对至少两种不同靶标有特异性的多特异性抗体提供优于在患有脓毒病的患者中使用中和促炎细胞因子如TNF或IL-1的单一试剂的明显改进的技术，其中所述靶标选自由以下组成的组：先天性免疫系统的促炎效应子、凝血因子、以及与脓毒病或脓毒性休克特异性地有关的靶标。更优选地，多特异性构建体含有如本发明中所提供的抗组蛋白抗体(或片段)。
[0378] 在用于治疗脓毒病或脓毒性休克的一个实施方案中，不同的抗炎剂与活化的蛋白C以及抗凝血剂如血栓调节蛋白组合，并且此多重试剂疗法的至少一个组分是炎症或凝血的至少一个靶受体或介体的激动剂或拮抗剂抗体，包括补体途径拮抗剂，且更优选地，如本发明中所提供的抗组蛋白抗体。用于治疗患有严重脓毒病和脓毒性休克的患者的选出的抗炎和免疫调节剂的列表见于Bochud和Calandra(Brit Med J 2003；326：262-266)中，并且严重脓毒病和脓毒性休克的大多数这些免疫调节疗法的临床试验在Vincent等人，Clin Infect Dis 2002；34：1084-93中综述。
[0379] 适用于治疗脓毒病及脓毒性休克的特别优选的试剂是靶向作为靶标之一的MIF、LPS、TNF-α、C5a、C5a受体(C5aR)、TLR2或HMGB-1的多特异性抗体。其它靶标也可选自这些以及其它促炎细胞因子受体，如白细胞介素IL-1、TSST-1(中毒性休克综合征毒素1)、NCA-90、NCA-95以及HLA-DR。用于治疗严重脓毒病或脓毒性休克的试剂或融合蛋白的优选组合包括靶向MIF和C5a受体(C5aR)、MIF和IL-6、LPS和MIF、TNF-α和HMGB-1、TLR2(toll样受体2)和LPS、TLR2和IL-6、TLR2和C5aR的那些。抗MIF/抗NCA-90或抗
MIF/抗HLA-DR多特异性抗体可用于靶向血液/感染性沉积物中的粒细胞以中和具有中毒性休克的早期迹象的患者中的MIF。这些组合还可包括如本文所述的抗组蛋白抗体，以不同组合形式，如与针对MIF、IL-6、C5a、TNF-α、LPS或HMGB-1的抗体组合。针对CD74的抗体如米拉珠单抗也可与如本文所述的抗组蛋白抗体组合，用于改善各种炎性、免疫失调或恶性(癌性)疾病的治疗。更优选地，对于脓毒病和脓毒性休克疗法(及诱导的弥漫性血管内凝血)，是添加血栓调节蛋白[rhTM](如重组人可溶性血栓调节蛋白(Yamakawa，Intensive Care Med2013；2013年1月30日在线发表；DO1 10.1007/s00134-013-2822-2)。抗体结构优选地是人源化或人抗体构建体。其可容易地由本领域技术人员从可获得的抗体来组合或构建。例如，T2.5Mab已通过用TLR2细胞外结构域使TLR2-阴性小鼠免疫而作为TLR-2的拮抗剂被开发，且此抗体抑制炎性介体如TNF-α的释放并预防小鼠中的致命性休克样综合征(Meng等人，J Clin Invest 2004；113：1473-1481)。在优选实施方案中，重组活化蛋白C与抗体混合物和融合蛋白组合用作第二治疗剂。同样地，如所论述，重组血栓调节蛋白也与抗体混合物和融合蛋白组合用作第二治疗剂。
MIF/抗HLA-DR多特异性抗体可用于靶向血液/感染性沉积物中的粒细胞以中和具有中毒性休克的早期迹象的患者中的MIF。这些组合还可包括如本文所述的抗组蛋白抗体，以不同组合形式，如与针对MIF、IL-6、C5a、TNF-α、LPS或HMGB-1的抗体组合。针对CD74的抗体如米拉珠单抗也可与如本文所述的抗组蛋白抗体组合，用于改善各种炎性、免疫失调或恶性(癌性)疾病的治疗。更优选地，对于脓毒病和脓毒性休克疗法(及诱导的弥漫性血管内凝血)，是添加血栓调节蛋白[rhTM](如重组人可溶性血栓调节蛋白(Yamakawa，Intensive Care Med2013；2013年1月30日在线发表；DO1 10.1007/s00134-013-2822-2)。抗体结构优选地是人源化或人抗体构建体。其可容易地由本领域技术人员从可获得的抗体来组合或构建。例如，T2.5Mab已通过用TLR2细胞外结构域使TLR2-阴性小鼠免疫而作为TLR-2的拮抗剂被开发，且此抗体抑制炎性介体如TNF-α的释放并预防小鼠中的致命性休克样综合征(Meng等人，J Clin Invest 2004；113：1473-1481)。在优选实施方案中，重组活化蛋白C与抗体混合物和融合蛋白组合用作第二治疗剂。同样地，如所论述，重组血栓调节蛋白也与抗体混合物和融合蛋白组合用作第二治疗剂。
[0380] 还已发现，靶向补体调节因子如CD46、CD55和/或CD59和肿瘤相关抗原两者的多特异性抗体，并且更具体地至少其中一个臂靶向补体调节因子且第二臂靶向肿瘤相关抗原的双特异性抗体在治疗癌症中比仅靶向这些抗原中的一个的抗体更有效。此外，与上述Sier等人的教义相反，已发现使用β-葡聚糖对于体内用于与单独使用抗癌抗体相比改善所述多特异性抗体的功效来说不是必须的，且靶向癌症和补体调节蛋白(例如，CD55)的双特异性抗体与特异性地针对具有高表达的补体调节蛋白的肿瘤的本身所用的抗体相比增强癌细胞杀伤(由此通过抗体阻断补体介导的细胞毒性)。
[0381] 用于中和抗体的另一优选的补体相关靶标是补体替代途径中所涉及的补体因子H(及其变体FHL-1)，尤其是因为因子H可由一些癌症过度表达(Ajona等人，Cancer Res2004；64：6310-6318，及其中所引用的参考文献)。因此，使用多特异性抗体且尤其是针对补体因子H及因子FHL-1的多特异性抗体特别重要。针对补体因子H及其变体FHL-1的多
特异性抗体可另外靶向CD55、CD46和/或CD59以及其它补体因子。已发现这些多特异性抗体对肿瘤相关抗原及受体的靶向增强补体抗体对肿瘤细胞的特异性靶向，并且提供优于使用靶向单个抗原或表位的抗体的优势。这克服了迄今为止发表的文献中的不一致性。
特异性抗体可另外靶向CD55、CD46和/或CD59以及其它补体因子。已发现这些多特异性抗体对肿瘤相关抗原及受体的靶向增强补体抗体对肿瘤细胞的特异性靶向，并且提供优于使用靶向单个抗原或表位的抗体的优势。这克服了迄今为止发表的文献中的不一致性。
[0382] 在非恶性病状中，存在一种不同的方法。这包括用其它补体受体或因子进行中和和干扰，包括源自补体的过敏毒素C5a或补体受体3(CR3、CD18/11b)，其可介导炎性细胞向血管内皮的粘附。在所述情况中，需要CD46、CD55和/或CD59的增加的表达以便减轻补体介导的免疫性并且还减少超急性排斥，如在器官移植排斥中。因此，使用所述补体调节因子的激动剂将是有利的。
[0383] 适用于治疗动脉粥样硬化的尤其优选试剂是靶向MIF、低密度脂蛋白(LDL)及CEACAM6(例如，NCA-90)的多特异性抗体。其它靶标也可选自这些物质以及其它促炎细胞因子。用于治疗动脉粥样硬化的试剂或融合蛋白的优选组合靶向MIF和低密度脂蛋白修饰的表位、NCA-90和MIF、NCA-90和低密度脂蛋白(LDL)表位、或LDL和CD83。这些可容易地由本领域技术人员从可商购获得的抗体来组合或构建。例如，Mab MDA2(一种原型Mab)识别富氧动脉粥样硬化损害内的丙二醛-赖氨酸表位(例如，在丙二醛修饰的LDL中)(如由Tsimikas等人，J Nucl Cardiol 1999；6：81-90所述)。
[0384] 已报道，除脓毒病和动脉粥样硬化之外，MIF还在患有动脉粥样化形成的兔中表达(Lin等人，Circulation Res 2000；87：1202-1208)，表明其是此病状的一个关键细胞因子。其中已涉及MIF的其它疾病包括肾小球性肾炎、关节炎、迟发型超敏反应、胃炎以及急性心肌缺血(由Yu等人，J Histochem Cytochem 2003；625-631综述)。靶向MIF的多特异性抗体因此适用于治疗任何这些病状。
[0385] 在美国每年有多达500,000个体患上脓毒病，这是一个随着群体老龄化而上升的数目。尽管在抗生素疗法和心肺支持中是最佳的且对在脓毒病中的炎症和凝血的认识有进步，但多达一半这些病例都是致命的。在感染期间，促炎细胞因子被释放和激活。这些包括TNF-α、IL-1和IL-6。抗炎介体(包括IL-4和IL-10)似乎不足以调节严重脓毒病中的促炎细胞因子。
[0386] 脓毒症应答的突出特征包括不受控制的炎症和凝血。血管内皮损伤是触发事件，不管是由内毒素、组织因子、坏死细胞还是羊水引起，都会变成触发事件。此内皮损伤导致组织因子的释放，这激活了凝血系统，从而引起过量凝血酶产生。随后的凝块形成加速微血管内皮功能障碍，并且如果不加以抑止的话，接着将发生低氧血症、器官功能障碍和器官衰竭。
[0387] 内皮损伤和向促血栓形成环境的变换导致用于凝血酶、即血栓调节蛋白的内皮受体以及蛋白C、即内皮蛋白C受体(EPCR)的表达减少和功能削弱。血栓调节蛋白和EPCR两者都是将蛋白C转化为其活性形式APC所必需的。因此，失去了用于调控凝血酶形成、凝块增长和蛋白C激活的主要系统。
[0388] 患有严重脓毒病的几乎所有患者都缺乏蛋白C。低蛋白C水平与休克和不良后果有关，包括ICU停留、呼吸机依赖和死亡。在严重脓毒病中外源地供应活化的蛋白C有助于在一些患者中恢复炎性和凝血反应的调节，产生有利的存活益处。然而，明显需要新的治疗方式以减轻促凝血反应并预防脓毒性器官损伤。优选的第二疗法是重组人血栓调节蛋白(Yamakawa，2013)。
[0389] 已经确定，在脓毒病之前阻断促凝血反应的开始降低非人灵长类动物的死亡率。阻断外源性凝血开始的有效策略包括使用针对TF的单克隆抗体、天然TF途径抑制剂以及FVIIa的无活性类似物。在狒狒的近期研究中，据证实在脓毒病发作时用FVIIai进行的TF-VIIa复合物的阻断减轻脓毒病诱导的多器官损伤且显著地保护肺和肾。抑制补体激活产物、尤其是过敏毒素的拮抗剂也提供降低脓毒病死亡率的希望。C3a、C4a和C5a在脓毒病期间出现，且升高的过敏毒素血浆水平与多器官功能衰竭的发展高度相关。在脓毒病中，补体可直接促进促凝血活性或间接诱导细胞因子产生。体外C5a和补体C5b-9的终末复合物诱导组织因子在内皮细胞和单核细胞上的表达，并且C5b-9在血小板表面上的装配已显示刺激凝血酶原酶活性。本发明提供用于通过提供靶向凝血因子、促炎细胞因子及补体激活产物中的两种或更多种的多特异性抗体来治疗脓毒病的改善的治疗剂。
[0390] 根据本发明的多特异性抗体结合至炎症及其它免疫失调疾病(包括血管内凝血和心肌缺血)的发生中所涉及的各种免疫或其它宿主细胞。其还可用于增强宿主对癌症的免疫应答以用于癌症治疗或预防。另外，提供组合物和治疗方法用于中和微生物毒素如LPS，中和促炎性细胞因子以及用于克服凝血异常。所述方法使用针对在级联中导致严重脓毒病、脓毒性休克及各种其它免疫失调疾病的不同参与因子的适当抗体组合和融合蛋白。
[0391] 尽管非缀合多特异性抗体和抗体片段及非缀合抗体与抗体片段的混合物是优选的，但用于根据本发明的疗法的主要治疗组合物、所述疗法的功效可通过补充多特异性抗体及本文所述的其它疗法得以增强。在所述多模式方案中，补充的治疗组合物可在多特异性抗体施用之前、同时或之后施用。例如，M类自身免疫疾病的多模式疗法可包括共同施用靶向T细胞、浆细胞或巨噬细胞的治疗剂，如针对T细胞表位、更具体地针对CD4和CD5表位的抗体。也可共同施用γ球蛋白。在一些情况下，可能需要共同施用免疫抑制药物，如皮质类固醇且还可能是细胞毒类药物。在这种情况下，可使用与传统疗法中所用的剂量相比降低剂量的皮质类固醇和细胞毒类药物，借此减少这些治疗剂的消极副作用。当有待治疗的疾病是癌症时，各种化学治疗药物、在免疫疗法中所用的裸抗体以及放射疗法(外部或内部)可与本发明的疗法组合使用。同样地，当感染和/或败血病或脓毒性休克正在治疗时，抗微生物药物可与多特异性抗体组合使用。
[0392] 治疗性处理的方法
[0393] 在各种实施方案中，可单独或与一种或多种其它治疗剂组合使用抗体或抗原结合抗体片段。在某些实施方案中，抗体或其片段可以是裸抗体或片段，其不缀合至任何其它治疗剂。在替代实施方案中，抗体或片段可以是免疫缀合物，其共价地连接至一种或多种治疗剂和/或诊断剂。
[0394] 各种实施方案涉及治疗受试者如哺乳动物(包括人、家庭或伴侣宠物，如狗和猫)的癌症的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的细胞毒性免疫缀合物。
[0395] 在一个实施方案中，可用本发明抗组蛋白抗体治疗的免疫学疾病包括例如关节疾病，如强直性脊柱炎、青年类风湿性关节炎、类风湿性关节炎；神经病，如多发性硬化症和重症肌无力；胰腺疾病，如糖尿病，特别是幼年发作的糖尿病；胃肠道疾病，如慢性活动性肝炎、乳糜泻、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、恶性贫血；皮肤疾病，如牛皮癣或硬皮病；过敏疾病，如哮喘以及移植相关病状，如移植物抗宿主疾病和同种异体移植排斥。
[0396] 细胞毒性免疫缀合物的施用可通过同时或依次地施用治疗有效量的结合至或与靶细胞表面上的另一抗原反应的另一抗体来补充。优选的另外MAb包括选自由以下组成的组的至少一种人源化、嵌合或人MAb：与CD4、CD5、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、IGF-1R、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD30、CD32b、CD33、CD37、CD38、CD40、CD40L、CD45、CD46、CD52、CD54、CD70、CD74、CD79a、CD80、CD95、CD126、CD133、CD138、CD154、CEACAM5、CEACAM6、B7、AFP、PSMA、EGP-1、EGP-2、碳酸酐酶IX、PAM4抗原、MUC1、MUC2、MUC3、MUC4、MUC5AC、Ia、MIF、HM1.24、HLA-DR、腱生蛋白、Flt-3、VEGFR、PlGF、ILGF、IL-6、IL-25、腱生蛋白、TRAIL-R1、TRAIL-R2、补体因子C5、致癌基因产物或其组合反应的MAb。使用的各种抗体如抗CD19、抗CD20和抗CD22抗体是本领域技术人员已知的。参见，例如Ghetie等人，Cancer Res.48：2610(1988)；Hekman等人，Cancer Immunol.Immunother.32：364(1991)；
Longo，Curr.Opin.Oncol.8：353(1996)，美国专利号5,798,554；6,187,287；6,306,393；
6,676,924；7,109,304；7,151,164；7,230,084；7,230,085；7,238,785；7,238,786；
7,282,567；7,300,655；7,312,318；7,501,498；7,612,180；7,670,804；以及美国专利公布号20080131363；20070172920；20060193865；及20080138333，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文
Longo，Curr.Opin.Oncol.8：353(1996)，美国专利号5,798,554；6,187,287；6,306,393；
6,676,924；7,109,304；7,151,164；7,230,084；7,230,085；7,238,785；7,238,786；
7,282,567；7,300,655；7,312,318；7,501,498；7,612,180；7,670,804；以及美国专利公布号20080131363；20070172920；20060193865；及20080138333，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文
[0397] 抗组蛋白抗体疗法可进一步用同时或依次地施用至少一种治疗剂来补充。例如，2 2 2
“CVB”(1.5g/m环磷酰胺、200-400mg/m 依托泊苷和150-200mg/m 卡莫司汀)是用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的方案。Patti等人，Eur.J.Haematol.51：18(1993)。其它适合的组合化疗方案是本领域技术人员熟知的。参见，例如Freedman等人，″Non-Hodgkin′s Lymphomas，″CANCER MEDICINE，第2卷，第3版，Holland等人(编著)，第2028-2068页(Lea和Febiger 1993)。作为示例，用于治疗中级非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的第一代化疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、甲基苄肼及强的松)和CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱及强的松)。有用的第二代化疗方案是m-BACOD(氨甲蝶呤、博来霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松及甲酰四氢叶酸)，而适合的第三代方案是MACOP-B(氨甲蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、强的松、博来霉素及甲酰四氢叶酸)。另外有用的药物包括丁酸苯酯、苯达莫司汀、来那度胺及苔藓抑素-1。
“CVB”(1.5g/m环磷酰胺、200-400mg/m 依托泊苷和150-200mg/m 卡莫司汀)是用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤的方案。Patti等人，Eur.J.Haematol.51：18(1993)。其它适合的组合化疗方案是本领域技术人员熟知的。参见，例如Freedman等人，″Non-Hodgkin′s Lymphomas，″CANCER MEDICINE，第2卷，第3版，Holland等人(编著)，第2028-2068页(Lea和Febiger 1993)。作为示例，用于治疗中级非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的第一代化疗方案包括C-MOPP(环磷酰胺、长春新碱、甲基苄肼及强的松)和CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱及强的松)。有用的第二代化疗方案是m-BACOD(氨甲蝶呤、博来霉素、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、地塞米松及甲酰四氢叶酸)，而适合的第三代方案是MACOP-B(氨甲蝶呤、阿霉素、环磷酰胺、长春新碱、强的松、博来霉素及甲酰四氢叶酸)。另外有用的药物包括丁酸苯酯、苯达莫司汀、来那度胺及苔藓抑素-1。
[0398] 本发明的抗组蛋白抗体可根据制备药学上有用的组合物的已知方法配制，由此所述抗组蛋白抗体在混合物中与药学上合适的赋形剂合并。无菌磷酸盐缓冲盐水是药学上合适的赋形剂的一个实例。其它合适的赋形剂为本领域技术人员所熟知。参见，例如Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea和Febiger 1990)和Gennaro(编著)，REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)，以及它们的修订版。
[0399] 本发明的抗组蛋白抗体可被配制以便经由例如弹丸注射或连续输注来静脉内施用。优选地，抗组蛋白抗体在小于约4小时的时间内、且更优选在小于约3小时的时间内输注。例如，首个25-50mg可以在30分钟之内、优选地甚至在15分钟内输注，并且其余的在接下来的2-3小时内输注。用于注射的制剂可以单位剂型，例如在安瓿中或在多剂量容器中存在，其中添加有防腐剂。组合物可以采取如在油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳液的形式，并且可以含有如混悬剂、稳定剂和/或分散剂的配制剂。或者，活性成分可以呈粉末形式以供在使用之前用适合的媒介物例如无菌无热原水复原。
[0400] 可采用另外的药学方法控制抗组蛋白抗体的作用持续时间。控制释放制剂可以通过使用聚合物复合或吸附抗组蛋白抗体来制备。例如，生物相容性聚合物包括乙烯-醋酸乙烯共聚物基质和硬脂酸二聚体与癸二酸的聚酐共聚物基质。Sherwood等人，Bio/Technology 10：1446(1992)。从这样一种基质释放的速率取决于抗组蛋白抗体的分子量、基质内的抗组蛋白抗体的量以及被分散的颗粒的大小。Saltzman等人，Biophys.J.55：
163(1989)；Sherwood等人，同上。其它固体剂型描述在Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea和Febiger 1990)和Gennaro(编著)，REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)，以及它们的修订版中。
163(1989)；Sherwood等人，同上。其它固体剂型描述在Ansel等人，PHARMACEUTICAL DOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，第5版(Lea和Febiger 1990)和Gennaro(编著)，REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES，第18版(Mack Publishing Company 1990)，以及它们的修订版中。
[0401] 抗组蛋白抗体还可向哺乳动物皮下施用或甚至通过其它肠胃外途径来施用。此外，施用可通过连续输注或通过单次或多次弹丸注射来进行。优选地，抗组蛋白抗体在小于约4小时的时间内、且更优选在小于约3小时的时间内输注。
[0402] 更一般地，对于人施用的抗组蛋白抗体的剂量将取决于如患者年龄、体重、身高、性别、一般医学状况和以往病史等因素而变化。期望为接受者提供在约0，1mg/kg至25mg/kg范围内的剂量的作为单次静脉内输注的抗组蛋白抗体，虽然如情况需要也可施用较低或较高的剂量。对于70kg患者0.1-20mg/kg的剂量例如为7-1,400mg，或对于1.7-m患者为2
4-824mg/m。需要时可重复剂量，例如每周一次或两次持续4-10周，每周一次持续8周，或每周一次持续4周。在维持疗法中需要时，其还可以较低频率给予，如每隔一周一次持续若干个月，或每月或每季度一次持续许多个月。
4-824mg/m。需要时可重复剂量，例如每周一次或两次持续4-10周，每周一次持续8周，或每周一次持续4周。在维持疗法中需要时，其还可以较低频率给予，如每隔一周一次持续若干个月，或每月或每季度一次持续许多个月。
[0403] 或者，抗组蛋白抗体可以每2或3周一个剂量进行施用，重复总共至少3个剂量。2
或者，构建体可每周两次施用，持续4-6周。如果使剂量降至约200-300mg/m(对于1.7-m患者为每剂340mg，或者对于70kg患者为4.9mg/kg)，那么其可每周施用一次或甚至两次持续4至10周。或者，剂量方案可减少，即每2或3周一次持续2-3个月。然而，已确定可通过缓慢静脉内输注施用甚至更高的剂量，如每周一次或每2-3周一次10mg/kg，持续重复的给药周期。给药方案可任选地以其它时间间隔重复，并且剂量可在对剂量和方案适当调整下通过各种肠胃外途径给予。
或者，构建体可每周两次施用，持续4-6周。如果使剂量降至约200-300mg/m(对于1.7-m患者为每剂340mg，或者对于70kg患者为4.9mg/kg)，那么其可每周施用一次或甚至两次持续4至10周。或者，剂量方案可减少，即每2或3周一次持续2-3个月。然而，已确定可通过缓慢静脉内输注施用甚至更高的剂量，如每周一次或每2-3周一次10mg/kg，持续重复的给药周期。给药方案可任选地以其它时间间隔重复，并且剂量可在对剂量和方案适当调整下通过各种肠胃外途径给予。
[0404] 在优选实施方案中，抗组蛋白抗体用于治疗癌症。癌症的实例包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、成胶质细胞瘤、黑素瘤、肉瘤以及白血病、骨髓瘤或淋巴恶性肿瘤。此类癌症的更具体的实例如下所述并且包括：鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、尤因氏肉瘤(Ewing sarcoma)、韦尔姆斯氏瘤(Wilms tumor)、星形细胞瘤、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃部癌或胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、肝细胞癌瘤、神经内分泌肿瘤、甲状腺髓样癌、甲状腺分化癌、乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾脏癌或肾癌、前列腺癌、外阴癌、肛门癌、阴茎癌以及头颈部癌。术语“癌症”包括原发性恶性细胞或肿瘤(例如，其细胞未迁移至受试者体内原始恶性疾病或肿瘤部位以外的部位的肿瘤)和继发性恶性细胞或肿瘤(例如，由转移产生的肿瘤，恶性细胞或肿瘤细胞迁移至与原始肿瘤部位不同的次级部位)。适合于本发明的治疗方法的癌症涉及表达、过度表达或异常表达IGF-1R的细胞。
[0405] 癌症或恶性肿瘤的其它实例包括但不限于：急性儿童成淋巴细胞性白血病、急性成淋巴细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、肾上腺皮质癌、成人(原发性)肝细胞癌、成人(原发性)肝癌、成人急性淋巴细胞性白血病、成人急性骨髓性白血病、成人霍奇金氏淋巴瘤、成人淋巴细胞性淋巴瘤、成人非霍奇金氏淋巴瘤、成人原发性肝癌、成人软组织肉瘤、AIDS相关的淋巴瘤、AIDS相关的恶性肿瘤、肛门癌、星形细胞瘤、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干神经胶质瘤、脑瘤、乳癌、肾盂和输尿管癌、中枢神经系统(原发性)淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤、子宫颈癌、儿童(原发性)肝细胞癌、儿童(原发性)肝癌、儿童急性成淋巴细胞性白血病、儿童急性骨髓性白血病、儿童脑干神经胶质瘤、儿童小脑星形细胞瘤、儿童大脑星形细胞瘤、儿童颅外胚细胞瘤、儿童霍奇金氏病、儿童霍奇金氏淋巴瘤、儿童下丘脑和视通路神经胶质瘤、儿童成淋巴细胞性白血病、儿童成神经管细胞瘤、儿童非霍奇金氏淋巴瘤、儿童松果体和幕上原始神经外胚层瘤、儿童原发性肝癌、儿童横纹肌肉瘤、儿童软组织肉瘤、儿童视通路和下丘脑神经胶质瘤、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性白血病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、内分泌胰岛细胞癌、子宫内膜癌、室管膜瘤、上皮癌、食道癌、尤因氏肉瘤和相关肿瘤、外分泌胰腺癌、颅外胚细胞瘤、性腺外胚细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌、女性乳癌、戈谢氏病(Gaucher′s Disease)、胆囊癌、胃部癌、胃肠良性肿瘤、胃肠肿瘤、胚细胞瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、霍奇金氏淋巴瘤、高丙种球蛋白血症、下咽癌、肠癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞癌、胰岛细胞胰腺癌、卡波济氏肉瘤(Kaposi′s Sarcoma)、肾癌、喉癌、唇口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴增生性病症、巨球蛋白血症、男性乳癌、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、黑素瘤、间皮瘤、原发灶隐匿的转移性鳞状颈癌、转移性原发性鳞状颈癌、转移性鳞状颈癌、多发性骨髓瘤、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、骨髓发育不良综合症、髓细胞性白血病、骨髓性白血病、骨髓增生性病症、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、非黑素瘤皮肤癌、非小细胞肺癌、原发灶隐匿性转移性鳞状颈癌、口咽癌、骨肉瘤/恶性纤维肉瘤、骨肉瘤/恶性纤维组织细胞瘤、骨肉瘤/骨骼的恶性纤维组织细胞瘤、卵巢上皮癌、卵巢胚细胞瘤、卵巢低恶性潜能肿瘤、胰腺癌、病变蛋白血症、真性红细胞增多症、副甲状腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、原发性肝癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、肾盂和输尿管癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉状瘤病肉瘤、塞扎里综合症(Sezary Syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层和松果体瘤、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、胸腺瘤、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、移行肾盂和输尿管癌、滋养层细胞瘤、输尿管和肾盂细胞癌、输尿管癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、视通路和下丘脑神经胶质瘤、阴门癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、韦尔姆斯氏瘤，和除赘瘤以外位于上列器官系统中的任何其它过度增生性疾病。
[0406] 本文描述和要求保护的方法和组合物可用来治疗恶性或恶变前病状并且用来预防发展成赘生性或恶性病况，包括但不限于以上所述的那些病症。此类用途表明在已知的或怀疑先前进展至瘤形成或癌症的病状中，具体来说，其中非赘生性细胞生长由过度增生、化生组成，或最具体地，出现发育异常(针对此类异常生长病状的综述，参见Robbins和Angell，Basic Pathology，第2版，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，第68-79页(1976))。
[0407] 发育异常常为癌症的前兆，并且主要见于上皮中。其为非赘生性细胞生长的最无序形式，涉及个别细胞一致性和细胞结构定向的失去。在存在慢性刺激或炎症的情况下，发育异常特征性地发生。可治疗的发育异常病症包括但不限于无汗性外胚层发育不良、前面部发育不良、窒息性胸廓发育不良、心房-手指发育不良、支气管肺发育不良、大脑发育不良、子宫颈非典型增生、软骨外胚层发育不良、锁骨颅骨发育不良、先天性外胚层发育不良、颅骨干发育不良、颅腕跗发育不良、颅骨干骺端发育不良、牙本质发育异常、骨干结构不良、外胚层发育不良、牙釉质发育不良、脑性眼球发育不全、偏侧骨骺发育不良、多发性骨骺发育不良、点状骨骺发育不良、上皮异常增生、面指生殖器发育异常、家族性颌骨纤维性发育异常、家族性白色皱褶性发育异常、纤维肌肉发育异常、骨纤维性结构不良、旺盛骨性发育不良、遗传性肾视网膜发育不良、有汗性外胚层发育不良、少汗性外胚层发育不良、淋巴细胞减少性胸腺发育不良、乳腺发育不良、下颌骨颜面发育不良、干骺端发育不良、蒙蒂尼氏发育异常(Mondini dysplasia)、单骨纤维性骨发育不良、粘液上皮发育异常、多发性骨骺发育不良、眼耳脊椎发育不良、眼齿指发育不良、眼椎骨发育不全、牙原性发育不良、眼下颌骨发育不良、根尖周牙骨质异常增生、多骨纤维性结构不良、假性软骨发育不全性脊椎骨骺发育不良、视网膜发育不良、中隔-眼发育不良、脊椎骨骺发育不良以及脑室径向发育不良。
[0408] 可治疗的另外赘生前病症包括但不限于良性异常增生性病症(例如，良性肿瘤、纤维囊性病状、组织肥大、肠息肉或腺瘤以及食道发育异常)、粘膜白斑病、角化病、博文氏病(Bowen′s disease)、农夫皮肤(Farmer′s Skin)、日光性唇炎以及日光性角化病。
[0409] 在优选的实施方案中，使用本发明的方法来抑制癌症，具体为上文所列的那些癌症的生长、进展和/或转移。
[0410] 另外的过度增生性疾病、病症和/或病状包括但不限于恶性疾病和相关病症的进展和/或转移，如白血病(包括急性白血病(例如急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓细胞性白血病(包括成骨髓细胞性、早幼粒细胞性、骨髓单核细胞性、单核细胞性和红白血病))和慢性白血病(例如，慢性骨髓细胞性(粒细胞性)白血病和慢性淋巴细胞性白血病))、真性红细胞增多症、淋巴瘤(例如，霍奇金氏病和非霍奇金氏病)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、重链病和实体肿瘤，包括但不限于肉瘤和癌瘤，如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、韦尔姆斯氏瘤、子宫颈癌、睾丸癌、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤以及成视网膜细胞瘤。
[0411] 表达载体
[0412] 其它实施方案可涉及包含编码抗组蛋白抗体的抗体、抗体片段、毒素或成分融合TM蛋白的核酸的DNA序列，如DNL 构建体。融合蛋白可包含连接至例如AD或DDD部分上的
抗体或片段或毒素。
抗体或片段或毒素。
[0413] 各种实施方案涉及包含编码DNA序列的表达载体。载体可含有编码人免疫球蛋白的轻链和重链恒定区及绞链区的序列，嵌合、人源化或人可变区序列可连接至所述人免疫球蛋白。载体可另外含有在所选的宿主细胞中表达编码蛋白的启动子、增强子及信号或前导序列。尤其有用的载体是pdHL2或GS。更优选地，轻链和重链恒定区及绞链区可来自人EU骨髓瘤免疫球蛋白，其中在同种异型位置中的任选至少一个氨基酸被转变为在不同的IgG1同种异型中所见的，并且其中基于EU编号系统的EU的重链的任选氨基酸253可用丙氨酸替代。参见Edelman等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 63：78-85(1969)。在其它实施方案中，IgG1序列可转化为IgG4序列。
[0414] 熟练的技术人员将认识到，将表达构建体遗传工程化并插入宿主细胞中以表达工程化蛋白的方法在本领域中是众所周知的并且是常规实验的内容。宿主细胞及表达克隆抗体或片段的方法已在例如美国专利号7,531,327和7,537,930中描述，每个专利的实施例部分以引用的方式并入本文。
[0415] 自身免疫疾病
[0416] 示例性自身免疫或免疫功能障碍疾病包括急性免疫性血小板减少症、慢性免疫性血小板减少症、皮肌炎、西登哈姆氏舞蹈病、重症肌无力、全身性红斑狼疮、狼疮肾炎、风湿热、多腺性综合征、大疱性类天疱疮、寻常天疱疮、糖尿病(例如，幼年型糖尿病)、亨-舍二氏紫癜、链球菌感染后肾炎、结节性红斑、高安氏动脉炎、ANCA相关的脉管炎、阿狄森氏病、类风湿性关节炎、多发性硬化、结节病、溃疡性结肠炎、多形性红斑、IgA肾病、多发性结节性动脉炎、强直性脊柱炎、古德帕斯彻氏综合征、血栓闭塞性脉管炎、干燥综合征、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、甲状腺毒症、硬皮病、慢性活动性肝炎、多肌炎/皮肌炎、多软骨炎、寻常天疱疮、韦格纳肉芽肿病、膜性肾病、肌萎缩性侧索硬化、脊髓痨、巨细胞性动脉炎/多肌痛、恶性贫血、快速进行性肾小球性肾炎、牛皮癣、纤维性肺泡炎、移植物抗宿主疾病(GVHD)、器官移植排斥、脓毒病、败血病以及炎症。
[0417] 试剂盒
[0418] 各种实施方案可涉及含有适用于治疗或诊断患者的患病组织的组分的试剂盒。示例性试剂盒可含有一种或多种如本文所述的抗组蛋白抗体。如果含有用于施用的组分的组合物未配制用于通过消化道递送，如通过口服递送，那么可包括能够通过一些其它途径递送试剂盒组分的装置。用于如肠胃外递送等应用的一种类型装置为注射器，其用来将组合物注射到受试者体内。还可使用吸入装置。在某些实施方案中，治疗剂可以含有无菌液体制剂或冻干制剂的预填充注射器或自动注射笔形式提供。
[0419] 试剂盒组分可包装在一起或分装到两个或更多个容器中。在一些实施方案中，容器可为含有适用于重构的组合物的无菌冻干制剂的小瓶。试剂盒还可含有一种或多种适用于重构和/或稀释其它试剂的缓冲液。可使用的其它容器包括但不限于袋、盘、盒、管等。试剂盒组分可无菌包装和保持在容器内。可包括的另一个组件为提供给试剂盒使用者的说明书。实施例
[0420] 实施例1.用于构建抗组蛋白抗体的一般技术
[0421] 抗组蛋白抗体的Vκ(可变轻链)和VH(可变重链)序列可通过多种分子克隆程序如RT-PCR、5′-RACE及cDNA文库筛选而获得。具体地说，来自表达鼠抗组蛋白MAb的细胞的抗组蛋白MAb的V基因可通过PCR扩增和测序来克隆。为了证实其真实性，克隆的VL和VH基因可在细胞培养中作为嵌合Ab表达，如Orlandi等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，
86：3833(1989))所述。基于V基因序列，人源化抗组蛋白MAb然后可如Leung等人(Mol.Immunol.，32：1413(1995))所述被设计和构建。
86：3833(1989))所述。基于V基因序列，人源化抗组蛋白MAb然后可如Leung等人(Mol.Immunol.，32：1413(1995))所述被设计和构建。
[0422] cDNA可通过一般分子扩增技术由产生鼠抗组蛋白MAb的任何已知的杂交瘤系或转染的细胞系来制备(Sambrook等人，Molecular Cloning，A laboratory manual，第2版(1989))。MAb的Vκ序列可使用引物VK1BACK和VK1FOR(Orlandi等人，1989)或由Leung等人(BioTechniques，15：286(1993))所述的延伸的引物组来扩增。VH序列可使用引物对VH1BACK/VH1FOR(Orlandi等人，1989)或由Leung等人(Hybridoma，13：469(1994))所述与鼠IgG的恒定区退火的引物来扩增。
[0423] 含有10μl cDNA产物的第一链、10μl 10X PCR缓冲液[500mM KCl、100mMTris-HCl(pH 8.3)、15mM MgCl2以及0.01％(w/v)明胶](Perkin Elmer Cetus，Norwalk，CT)、250μM每种dNTP、200nM引物以及5单位的Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer Cetus)的PCR反应混合物可经受30次PCR循环。每个PCR循环优选地由以下组成：在94℃下变性
1min，在50℃下退火1.5min，以及在72℃下聚合1.5min。扩增的Vκ和VH片段可在2％琼脂糖(BioRad，Richmond，CA)上纯化。人源化V基因可如Leung等人(Mol.Immunol.，32：
1413(1995))所述通过长寡核苷酸模板合成与PCR扩增的组合来构建。
1min，在50℃下退火1.5min，以及在72℃下聚合1.5min。扩增的Vκ和VH片段可在2％琼脂糖(BioRad，Richmond，CA)上纯化。人源化V基因可如Leung等人(Mol.Immunol.，32：
1413(1995))所述通过长寡核苷酸模板合成与PCR扩增的组合来构建。
[0424] Vκ的PCR产物可被亚克隆至阶段载体如基于pBR327的阶段载体VKpBR中，所述载体含有Ig启动子、信号肽序列及便利的限制酶切位点以便于Vκ PCR产物的同框连接。VH的PCR产物可被亚克隆至类似的阶段载体如基于pBluescript的VHpBS中。含有相应的PCR产物的单个克隆可通过例如Sanger等人(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，74：5463(1977))的方法来测序。
[0425] 含有Vκ和VH序列连同启动子和信号肽序列一起的表达盒可通过双限制消化如HindIII-BamHI片段分别从VKpBR和VHpBS上切除。Vκ和VH表达盒可分别连接至适当的表达载体，如pKh和pG1g(Leung等人，Hybridoma，13：469(1994))。表达载体可共转染至适当的细胞、例如骨髓瘤Sp2/0-Ag14(ATCC VA)中，选择潮霉素抗性的集落，并且通过例如ELISA测定监测上清液中嵌合、人源化或人抗组蛋白MAb的产生。或者，Vκ和VH表达盒可装配在修饰的阶段载体VKpBR2和VHpBS2中，分别作为XbaI/BamHI和XhoI/BamHI片段
被切除，并如Gilles等人(J.Immunol.Methods 125：191(1989)所述且还如Losman等人，Cancer，80：2660(1997))所示被亚克隆至单一表达载体如pdHL2中。有用的另一载体是GS载体，如Barnes等人，Cytotechnology 32：109-123(2000)中所述。其它适当的哺乳动物表达系统在Werner等人，Arzneim.-Forsch./Drug Res.48(II)，Nr.8，870-880(1998)中描述。
被切除，并如Gilles等人(J.Immunol.Methods 125：191(1989)所述且还如Losman等人，Cancer，80：2660(1997))所示被亚克隆至单一表达载体如pdHL2中。有用的另一载体是GS载体，如Barnes等人，Cytotechnology 32：109-123(2000)中所述。其它适当的哺乳动物表达系统在Werner等人，Arzneim.-Forsch./Drug Res.48(II)，Nr.8，870-880(1998)中描述。
[0426] 如下实施共转染和用ELISA检测分泌抗体的克隆。根据Co等人，J.Immunol.，148：1149(1992)，可将约10μg VKpKh(轻链表达载体)和20μg VHpG1g(重链表达载体)
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通过电穿孔(BioRad，Richmond，CA)而用于转染5×10 SP2/0骨髓瘤细胞。转染之后，细胞可在96孔微量滴定板中在完全HSFM培养基(Life Technologies，Inc.，Grand Island，NY)中在37℃、5％CO2下生长。可在加入终浓度500单位/ml潮霉素的潮霉素选择培养基(Calbiochem，San Diego，CA)2日开始选择步骤。集落通常在电穿孔后2-3周出现。然后可将培养物扩展以用于进一步的分析。可通过ELISA测定鉴别分泌嵌合、人源化或人重链的转染瘤克隆。
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通过电穿孔(BioRad，Richmond，CA)而用于转染5×10 SP2/0骨髓瘤细胞。转染之后，细胞可在96孔微量滴定板中在完全HSFM培养基(Life Technologies，Inc.，Grand Island，NY)中在37℃、5％CO2下生长。可在加入终浓度500单位/ml潮霉素的潮霉素选择培养基(Calbiochem，San Diego，CA)2日开始选择步骤。集落通常在电穿孔后2-3周出现。然后可将培养物扩展以用于进一步的分析。可通过ELISA测定鉴别分泌嵌合、人源化或人重链的转染瘤克隆。
[0427] 可如下从细胞培养物分离抗体。转染瘤培养物适于不含血清的培养基。对于嵌合抗体的产生，使用HSFM使细胞在滚瓶中作为500ml培养物生长。对培养物进行离心并且经由0.2μ膜过滤上清液。过滤培养基以1ml/min的流速穿过蛋白A柱(1×3cm)。随后用约10柱体积的PBS洗涤树脂且将蛋白A结合抗体从具有含10mM EDTA的0.1M甘氨酸缓冲
液(pH 3.5)的柱中洗脱。将1.0ml级分收集在含有10μl的3M Tris(pH 8.6)的试管中，且蛋白质浓度是在280/260nm下由吸光率决定。将峰值级分集中，对PBS透析，且用例如Centricon 30(Amicon，Beverly，MA)浓缩抗体。抗体浓度通过ELISA来测定且使用PBS将其浓度调节至约1mg/ml。宜添加0.01％(w/v)的叠氮化钠到样品中作为防腐剂。
液(pH 3.5)的柱中洗脱。将1.0ml级分收集在含有10μl的3M Tris(pH 8.6)的试管中，且蛋白质浓度是在280/260nm下由吸光率决定。将峰值级分集中，对PBS透析，且用例如Centricon 30(Amicon，Beverly，MA)浓缩抗体。抗体浓度通过ELISA来测定且使用PBS将其浓度调节至约1mg/ml。宜添加0.01％(w/v)的叠氮化钠到样品中作为防腐剂。
[0428] 实施例2.嵌合IMMU-H4(cIMMU-H4)抗体的产生
[0429] 嵌合形式的抗H4IMMU-H4抗体如以上实施例1中所论述而产生。所用的可变区序列如在SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：99中所公开。所用的人重链恒定区序列如在SEQ ID NO：86中所公开。人轻链κ恒定区序列如在美国专利号7,151,164(以引用的方式并入本文)的图7B中所公开。cIMMU-H4抗体的纯度是通过SE-HPLC色谱法(未示出)来证实。
[0430] 显示由选择的克隆(4C3)产生的cIMMU-H4的结合亲和力的代表性数据提供于图7中。令人惊讶地，cIMMU-H4(4C3)基于ELISA与其鼠对应物(KD＝6.6nM)相比对组蛋白
具有更高的结合亲和力(KD＝0.96nM)。这些惊人和意外的结果说明，嵌合及人源化抗组蛋白抗体与亲本鼠抗体相比的优越性。
具有更高的结合亲和力(KD＝0.96nM)。这些惊人和意外的结果说明，嵌合及人源化抗组蛋白抗体与亲本鼠抗体相比的优越性。
[0431] 实施例3.人源化IMMU-H4抗体的产生
[0432] 人源化形式的抗H4IMMU-H4抗体是根据Leung等人，(1995，Molec Immunol 32：1413-27)产生的。所用的可变区序列如在SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：97中所公开。所用的人重链恒定区序列如在SEQ ID NO：86中所公开。人轻链κ恒定区序列如在美国专利号7,151,164(以引用的方式并入本文)的图7B中所公开。
[0433] 人源化IMMU-H4抗体的结合特征与嵌合IMMU-H4抗体的那些特征相同。
[0434] 实施例4.嵌合IMMU-H3抗体的产生
[0435] 嵌合形式的抗H3IMMU-H3抗体如以上实施例1中所论述而产生。所用的可变区序列如在SEQ ID NO：108和SEQ ID NO：109中所公开。所用的人重链恒定区序列如在SEQ ID NO：86中所公开。人轻链κ恒定区序列如在美国专利号7,151,164(以引用的方式并入本文)的图7B中所公开。嵌合IMMU-H3抗体与亲本鼠抗体竞争结合至H3且结合至H3的同一表位。
[0436] 实施例5.人源化IMMU-H3抗体的产生
[0437] 人源化形式的抗H3IMMU-H3抗体是根据Leung等人，(1995，Molec Immunol 32：1413-27)产生的。所用的可变区序列如在SEQ ID NO：106和SEQ ID NO：107中所公开。所用的人重链恒定区序列如在SEQ ID NO：86中所公开。人轻链κ恒定区序列如在美国专利号7,151,164(以引用的方式并入本文)的图7B中所公开。
[0438] 人源化IMMU-H3抗体的结合特征与嵌合IMMU-H3抗体的那些特征相同。
[0439] 实施例6.嵌合IMMU-H2B抗体的产生
[0440] 嵌合形式的抗H2B IMMU-H2B抗体如以上实施例1中所论述而产生。所用的可变区序列如在SEQ ID NO：118和SEQ ID NO：119中所公开。所用的人重链恒定区序列如在SEQ ID NO：86中所公开。人轻链κ恒定区序列如在美国专利号7,151,164(以引用的方式并入本文)的图7B中所公开。嵌合IMMU-H2B抗体与亲本鼠抗体竞争结合至H2B且结合至H2B的同一表位。
[0441] 实施例7.人源化IMMU-H2B抗体的产生
[0442] 人源化形式的抗H2B IMMU-H2B抗体是根据Leung等人，(1995，Molec Immunol32：1413-27)产生的。所用的可变区序列如在SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：117中所公开。所用的人重链恒定区序列如在SEQ ID NO：86中所公开。人轻链κ恒定区序列如在美国专利号7,151,164(以引用的方式并入本文)的图7B中所公开。
[0443] 人源化IMMU-H2B抗体的结合特征与嵌合IMMU-H2B抗体的那些特征相同。
[0444] 实施例8.脓毒性休克的治疗
[0445] M.N.是一位具有慢性淋巴细胞性白血病病史的62岁白人男性，他具有各种细胞毒类药物、皮质类固醇以及利妥昔单抗和苯达莫司汀的治疗史，且表现出稳定的疾病及需要长时间的抗生素疗法的几次感染病史。在由他的家庭医师评估之后因具有脓毒病症状、高温(40.7℃)、寒战、呼吸困难、心悸、躁动、有些精神混乱、恶心和四肢发凉而许可他进入急诊部。检查显示有心动过速(＞100/min)、低血压(95/55mm Hg)，特别是站立后低血压、以及尿量减少(800mL/d)和肺炎体征。测试显示低氧张力和酸中毒、血细胞计数未检测到感染，但代之以中性白细胞减少(2,500WBC/mL，具有10％带)、血小板38,000、Hg 6g/dL，胸部x光显示一般性肺炎，血液化验指示削弱的肾功能，伴有异常血清肌酸酐(3mg/dL)和升高的BUN水平，且升高的血清乳酸表明组织灌注不足。血培养显示金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性细菌的存在，支持败血病的诊断。患者还具有凝血病的实验室证据，所述凝血病表现为脓毒病诱导的弥漫性血管内凝血(DIC)，尤其累及四肢和肺。在重病监护室治疗患者的严重脓毒病和脓毒性休克，这包括一般性支持治疗(氧气)、通过补液恢复循环血量(500mL0.9％氯化钠和乳酸盐林格氏溶液，其中在最初的几个小时给予多达2.5L)的血液动力学的支持、用多巴胺(Intropin，3mcg/kg/min静脉内)的血管加压支持疗法、以及每12小时静脉内用400mg环丙沙星(Cipro)的抗生素疗法。还给予患者每天0.06mg/kg的重组人
血栓调节蛋白 ，持续6天时间。在入院后的五天，患者是稳定的，但未表
现出体征或症状的任何显著改善，仅排尿稍好一点、血压有点升高、温度微降至39.3℃且他的国际血栓形成和止血学会(International Society of Thrombosis and Hemostasis，ISTH)DIC评分有所改善，包括血小板计数、凝血酶原时间及纤维蛋白原水平的改善。呼吸道出血的证据也似乎稍微改善，同样他的呼吸困难也有所减轻。然后给予患者两种人源化单克隆抗体的组合，每周两次，依次给予，持续3周，由300mg人源化抗MIF和400mg嵌合抗组蛋白(IMMU-H4)组成，两者都经4小时通过缓慢输注进行。在此后的第5周，患者显示出精神混乱减轻、进一步的体温降低、心动过速和呼吸困难减轻、DIC体征的进一步改善、以及通过物理检查和胸部x光所示的肺炎减轻。第6周结束时，他的肾机能测试也显示一定的改善(BUN和血清肌酸酐值)，且将他从重病监护室移到感染性疾病病床，调整支持性治疗。两个月之后，该患者接受血栓调节蛋白和人源化抗MIF与嵌合抗组蛋白抗体的重复周期，以及广谱抗生素的重复疗程，且随后显示进一步的改善，这样使得他不用卧床且具有实际上正常的心理机能和总体上70+％的肺炎减轻及38℃的发热，和约85％的正常尿量。
血栓调节蛋白 ，持续6天时间。在入院后的五天，患者是稳定的，但未表
现出体征或症状的任何显著改善，仅排尿稍好一点、血压有点升高、温度微降至39.3℃且他的国际血栓形成和止血学会(International Society of Thrombosis and Hemostasis，ISTH)DIC评分有所改善，包括血小板计数、凝血酶原时间及纤维蛋白原水平的改善。呼吸道出血的证据也似乎稍微改善，同样他的呼吸困难也有所减轻。然后给予患者两种人源化单克隆抗体的组合，每周两次，依次给予，持续3周，由300mg人源化抗MIF和400mg嵌合抗组蛋白(IMMU-H4)组成，两者都经4小时通过缓慢输注进行。在此后的第5周，患者显示出精神混乱减轻、进一步的体温降低、心动过速和呼吸困难减轻、DIC体征的进一步改善、以及通过物理检查和胸部x光所示的肺炎减轻。第6周结束时，他的肾机能测试也显示一定的改善(BUN和血清肌酸酐值)，且将他从重病监护室移到感染性疾病病床，调整支持性治疗。两个月之后，该患者接受血栓调节蛋白和人源化抗MIF与嵌合抗组蛋白抗体的重复周期，以及广谱抗生素的重复疗程，且随后显示进一步的改善，这样使得他不用卧床且具有实际上正常的心理机能和总体上70+％的肺炎减轻及38℃的发热，和约85％的正常尿量。
[0446] 实施例9.全身性红斑狼疮(SLE)的疗法
[0447] B.S.是一位35岁非洲裔美国女性，2年前被诊断为SLE，当时她表现出肾小球肾炎(WHO3级)、浆膜炎、多发性关节炎和血管炎皮疹。她具有皮质类固醇(每天范围在15-60mg内的强的松)与羟化氯喹(200mg/天)的治疗史，且随后还用咪唑硫嘌呤(100mg/天)及氨甲蝶呤的疗程(由于迁延性疾病的缘故)。多年来，她经受了SLE斑，表现出多发性关节炎、嗜睡症、皮疹和浆膜炎。她现在表现出持续的活动性疾病(对于肌骨胳系统是BILAG A且对于心肺系统是BILAG B，并且对于其它系统是BILAG C)且对传统疗法无反应，但维持每天40mg强的松。经1小时静脉内给予她600mg人源化抗CD22单克隆抗体依帕珠单抗，
每隔四周重复一次。第三次输注之后4周，她的循环B-淋巴细胞相比治疗之前的基线减少了40％，但她的Hg水平从8g/dL升到10g/dL。她的皮疹和多发性关节炎显示一些改善，且她的肌骨胳系统BILAG A水平减至BILAG B，她仍需要另外的疗法。她的抗CD22抗体疗法之后8周，给予她双特异性抗体融合蛋白疗程，该治疗是由以下组成：抗CD74和抗组蛋白(IMMU-H4)抗体的重组异缀合物，每周静脉内500mg剂量，持续4周。在2个月之后的评价中，她在所有器官系统中具有明显改善，在大多数时候达到BILAG C和D状态，并且能够具有每天逐渐减少至6.5mg的强的松剂量。在3个月的随访中，她的大多数器官症状保持稳定，并且她维持此低剂量的强的松而没有任何斑。
每隔四周重复一次。第三次输注之后4周，她的循环B-淋巴细胞相比治疗之前的基线减少了40％，但她的Hg水平从8g/dL升到10g/dL。她的皮疹和多发性关节炎显示一些改善，且她的肌骨胳系统BILAG A水平减至BILAG B，她仍需要另外的疗法。她的抗CD22抗体疗法之后8周，给予她双特异性抗体融合蛋白疗程，该治疗是由以下组成：抗CD74和抗组蛋白(IMMU-H4)抗体的重组异缀合物，每周静脉内500mg剂量，持续4周。在2个月之后的评价中，她在所有器官系统中具有明显改善，在大多数时候达到BILAG C和D状态，并且能够具有每天逐渐减少至6.5mg的强的松剂量。在3个月的随访中，她的大多数器官症状保持稳定，并且她维持此低剂量的强的松而没有任何斑。
[0448] 实施例10.非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的疗法
[0449] TM是一位具有弥漫性大B细胞NHL病史的68岁白人男性，他在用CHOP化疗和利妥昔单抗的标准周期的疗法之后复发，并且现在表现出发热、肺和纵隔浸润、肿大的颈部和腋淋巴结、脾脏、以及基于抽吸和细胞学的骨髓累及证据。他接受两种人源化抗体的6周输注，一种是针对组蛋白(IMMU-H4)且另一种是针对CD20(维妥珠单抗)，每种在同一天依次地给予，经3-4小时输注每种抗体，在每种200mg的剂量下。在最后一次输注之后四天，他的检查显示疗法没有严重毒性，且他的颈部和腋淋巴结有一些可触及的软化，且由触诊可知他的脾脏尺寸减小。在接下来的8周随访检查中，几乎所有的颈部淋巴结和大约一半的这些腋窝淋巴结消失，包括脾脏尺寸的归一化，并且他的胸部x光和CT扫描显示他的肺和纵隔浸润缩小约50％的证据。大约4个月之后，他的检查揭示尽管淋巴结和肺累及是稳定的，但表明骨髓累及有增加且他的Hg降至7g/dL且血小板降至55,000/μL。然后他接受了由针对MIF的融合人源化抗体和针对组蛋白的人源化抗体(IMMU-H4抗体)组成的双特
异性抗体，每周两次以200mg的剂量缓慢的静脉内输注给予，持续3周。在他的3个月评价中，他的Hg显示升至11g/dL且他的血小板升至120,000/μL，在骨髓抽吸物中NHL细胞有明显减少，并且没有可触及的淋巴结或通过放射检查没有在胸部发现可见的疾病。患者的反应在另外的4个月中保持稳定。
异性抗体，每周两次以200mg的剂量缓慢的静脉内输注给予，持续3周。在他的3个月评价中，他的Hg显示升至11g/dL且他的血小板升至120,000/μL，在骨髓抽吸物中NHL细胞有明显减少，并且没有可触及的淋巴结或通过放射检查没有在胸部发现可见的疾病。患者的反应在另外的4个月中保持稳定。
[0450] 实施例11.癌症相关恶病质的疗法
[0451] J.M.是一位具有重度吸烟史和不宜手术的小细胞肺癌病史的68岁高加索男性，肺癌累及他的右肺及双侧腹主动脉旁和支气管旁淋巴结。他已经接受组合化疗，这显示出骨髓中毒性和一些小肿瘤缩减的证据，小于所有可测量体积的30％。他表现出相当多的重量减轻，差不多2米高而现在的体重是58kg，患有癌症相关的恶病质。每周向他输注靶向IL-6和组蛋白两者的人源化双特异性融合抗体构建体(IMMU-H4抗体)，每周120mg的剂量，持续8周。在最后2周期间，他的食欲改善，且显示在治疗后第7周体重增加至65kg，有更强的肌力和整体提高的活力，然后在接下来的2周内保持稳定在70-75kg，就在此时他开始显示出恶性疾病的进展。除了他的周期性化疗，在抗体疗法期间没有给予皮质类固醇且认为他已对此恶病质治疗做出反应。
[0452] 实施例12.免疫性血小板减少症(ITP)的疗法
[0453] S.R.是一位具有自发性病史2年且对用以高剂量给予强的松几个疗程的皮质类固醇疗法有反应的32岁女性。她现在表现出严重的ITP、瘀伤和瘀点，及12,000/μL的血小板计数。她还抱怨频繁的牙龈和鼻出血。在两周内向她给予四个剂量的地塞米松(40mg)，TM与由来自人源化抗CD20(维妥珠单抗)和人源化抗组蛋白(IMMU-H4)抗体的DNL 制成的
人源化双特异性抗体构建体组合，每周皮下200mg的剂量，持续三周。2周以后的血细胞计数检查显示B细胞减少了80％且血小板升至38,000/μL，伴随瘀伤、瘀点和出血表现减少。
2周后，她的血小板进一步升高至55,000/μL。她2个月后返回重复此疗法周期，并且显示血小板升高至100,000/μL，被认为是完全反应。此水平在当化验持续时维持了3个月。
人源化双特异性抗体构建体组合，每周皮下200mg的剂量，持续三周。2周以后的血细胞计数检查显示B细胞减少了80％且血小板升至38,000/μL，伴随瘀伤、瘀点和出血表现减少。
2周后，她的血小板进一步升高至55,000/μL。她2个月后返回重复此疗法周期，并且显示血小板升高至100,000/μL，被认为是完全反应。此水平在当化验持续时维持了3个月。
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