肌腱是连接骨骼肌肌腹与骨之间的致密胶原纤维结缔组织束，是骨骼肌 的组成部分。肌腱的结构可以看成是肌肉的延续、退化部分。新鲜标本的肌 腱呈银白色、索带状，质地坚韧。在松弛状态下表面有波纹，如果牵拉超过 松弛状态的4％时，这波纹便消失，张力取消后波纹再现。在形态、结构和功 能上，肌腱和肌肉有显著的差异。肌肉是高度特化，有收缩力，血供丰富， 代谢旺盛，抗感染能力强的组织；而肌腱则是肌肉的附属部分，是非特化、 弹性小、寡血管、代谢极低的组织，但具有很强的耐压抗张力和抗摩擦的能 力。在肌-腱联接处，胶原纤维进入肌内膜，附着在肌纤维的肌膜上。在腱- 骨连接处，腱束直接连续到骨和骨膜上，其中绝大部分胶原纤维进入骨，形 成Sharpey穿纤维。肌腱传导肌腹收缩所产生的力，牵引骨骼，使之产生运 动。肌腱本身不具有收缩能力，但能抵抗很大的张力。
胶原原纤维(Collagenous fiber)是构成肌腱组织的主要成分，呈束状 排列，新鲜状态下，大体观呈银白色。光镜观察，在组织中呈平行波浪状。 长度难以准确测定，横断面近似椭圆形。胶原纤维束的粗细不等(1-20μm)， 由直径约20-200nm的胶原原纤维借少量粘合质联接成小束，再集合而成。 胶原纤维的粗细以其中的所含胶原原纤维多少而定。粘合质主要是蛋白多糖 或(和)糖蛋白。
肌腱缺损是目前临床工作中经常遇到的问题，对于肌腱缺损的治疗方法 主要是：1、自体肌腱移植。2、同种异体肌腱移植。3、肌腱假体替代物。但 以上方法均存在着某些弊端，自体肌腱移植存在肌腱供区缺乏的问题，而且 供区肌腱多为无滑膜的肌腱，肌腱缺损严重影响功能的多为有滑膜肌腱。异 体肌腱移植若为新鲜的即会引起严重的免疫排斥反应，经过冻干处理后的同 种异体肌腱保存的仅仅是胶原纤维，将来仍需要自体肌腱细胞进行替代。人 工腱假体虽然近期生物力学强度较好，但远期终会发生降解，而且还会引起 感染致假体排出体外。
80年代末期，组织工程学的兴起和蓬勃发展为解决这一难题提供了可 能。曹谊林首先在裸鼠皮下构建组织工程化肌腱，获得了在大体和组织学结 构与正常肌腱相似的组织。但是曹谊林的工作是在裸鼠体内完成的，裸鼠没 有完善的免疫功能，所以不能观察机体对细胞和生物材料的反应，而且皮下 构建的组织工程化肌腱没有受到应力的作用，也不符合人体的生理特点。
刘永涛等人在有完善免疫功能的鸡趾指屈肌腱原位应用自体肌腱细胞 构建组织工程化肌腱成功，但是应用自体肌腱细胞作为组织工程化肌腱的种 子细胞仍需切取较大的肌腱组织，造成新的损伤。
采用组织工程技术构建肌腱组织并修复肌腱组织缺损，关键是获取大量 有正常功能的肌腱细胞。但是肌腱细胞经多次传代后丧失分泌基质的能力， 难以获得大量有功能活性的肌腱细胞来修复大块缺损组织。因此探索更广泛 的种子细胞来源已成为组织工程研究的焦点。
近年来，许多学者作了研究大量工作，试图拓展肌腱组织工程种子细胞 来源，并促进其增殖。
第一，寻找可替代细胞，例如骨髓基质干细胞(MSC)。骨髓中除了造血 干细胞外还有另一类干细胞——间充质干细胞(Mesenchymal stem cell MSC)， 是一群具有多相分化潜能的细胞，在特定的诱导条件下可分化为多种间充质 组织细胞，Awad等分离、培养MSC后与胶原复合形成细胞胶原复合物植 入人工缺损髌韧带处，与对照组(单纯应用胶原)进行比较，发现实验组组织 的弹性模量、最大张力、硬度等较对照组大，而在组织学和形态学方面两者 并没有很大差别。然而，骨髓基质干细胞的来源有限、分离较为复杂。
第二，促进种子细胞增殖与基质合成。生长因子是通过细胞间信号传递 影响细胞活动的一类多肽因子，在体内或体外可促进或抑制细胞增殖。许多 学者直接使用生长因子研究并证实其在体内体外对肌腱损伤修复的促进作 用。此外，还有人利用转基因技术，将基因材料和信息传递给细胞以此来改 变细胞功能。利用此种技术使靶细胞增加或抑制合成和分泌蛋白质(如生长因 子)，调控细胞的生长，参与组织修复过程。成功应用这一方法可使细胞、组 织按要求合成分泌细胞因子以调控其生长。已有学者成功地用不同方法将基 因转入肌腱中，LacZ标记基因被应用于髌韧带后持续表达了6周，在鸡趾屈 肌腱的实验中，Lou等运用转基因技术将LacZ标记基因转入肌腱中，75天 后还可以检测到该基因，并提出了减少和阻止肌腱损伤后的粘连形成的一些 方法。
虽然经过上述各种研究，仍然没有彻底解决肌腱种子细胞来源缺乏的难 题。
综上所述，组织工程化肌腱形成的重要条件之一是必须获得大量有功能 和活力的肌腱细胞。研究表明，肌腱细胞接种于可生物降解材料须达到一定 的细胞量，但是肌腱细胞是肌腱的基本功能单位，分化程度高，增殖相对缓 慢，经多次传代后甚至丧失进入增殖期的能力，种子细胞的缺乏成为肌腱组 织工程的难题之一，也限制了其临床应用。因此，本领域迫切需要开发可用 于组织工程化肌腱的新的种子细胞及相关的肌腱移植物。

本发明的目的就是提供一种新的用于组织工程化肌腱的新的种子细胞。
本发明的另一目的就是提供含有所述新种子细胞的组织工程化肌腱、及 其制法和和用途。
在本发明的第一方面，提供了一种组织工程化肌腱移植物，它包括：
(a)药学上可接受的生物可降解材料；
(b)种子细胞，所述的种子细胞接种于所述的生物可降解材料，且种子 细胞选自下组：(i)成纤维细胞，(ii)1∶10～10000∶1的成纤维细胞与肌腱 细胞和/或骨髓基质干细胞的混合物；
(c)生物膜，所述的生物膜包被在生物可降解材料的外部。
在本发明的一个优选例中，所述的种子细胞是成纤维细胞。
在另一优选例中，种子细胞的含量为1×105个细胞/ml-5×108个细 胞/ml。
在另一优选例中，所述的生物膜的厚度为5-200微米。
在另一优选例中，所述的生物可降解材料为条索状。
在另一优选例中，所述成纤维细胞来源于自体成纤维细胞、同种异体成 纤维细胞、衍生自骨髓基质干细胞的成纤维细胞，或其混合物。
在另一优选例中，所述的药学上可接受的生物可降解材料选自下组：聚 乳酸、聚羟基乙酸、聚羟基丁酸、聚酸酐、聚偶磷氮、聚氨基酸、假聚氨基 酸、聚原酸酯、聚酯尿烷、聚碳酸酯、聚乙二醇、聚环氧乙烷、聚对二氧六 环酮、胶原、明胶、糖氨聚糖、壳聚糖、甲壳素、海藻酸盐、藻酸钙凝胶、 脱细胞基质，及其混合物。
在本发明的第二方面，提供了一种制备组织工程化肌腱移植物的方法， 包括步骤：
(a)将种子细胞与药学上可接受的生物可降解材料混合，其中所述的种 子细胞接种于所述的生物可降解材料，且种子细胞选自下组：(i)成纤维细 胞，(ii)1∶10～10000∶1的成纤维细胞与肌腱细胞和/或骨髓基质干细胞的 混合物；
(b)将生物膜包被在生物可降解材料的外部；
其中，步骤(a)和(b)的次序可颠倒。
在一优选例中，移植物中种子细胞的含量为1×105个细胞/ml-5×108 个细胞/ml。
在另一优选例中，所述的生物膜的厚度为5-200微米，且所述的生物可 降解材料为条索状。
在本发明的第三方面，提供了一种成纤维细胞的用途，它被用于制备肌 腱移植物。
附图说明
图1显示了用本发明的组织工程化肌腱修复的肌腱的力学强度。
图2显示体外培养第2代肌腱细胞，倒置相差显微镜观察(40×)。
图3显示体外培养第二代成纤维细胞，倒置相差显微镜观察(40×)。
图4显示成纤维细胞-PGA复合物体外培养7天，倒置显微镜观察细胞生 长良好(40×)。
图5显示肌腱细胞-PGA复合物体外培养7天，倒置显微镜观察细胞生长 良好(40×)。
图6显示正常肌腱组织的大体观察。
图7显示第26周，试验组新生组织呈圆条束状，色白，质地坚韧，与 周围组织稍有粘连，易分离，与正常肌腱组织交界处连接良好且难以分辨。
图8显示对照组1新生组织大体形态与实验组相似，色白，质地坚韧。
图9显示对照组2，26周，新生组织外观与实验组无明显区别，但与 周围粘连较实验组重且质地硬。
图10显示正常肌腱组织组织学观察(H&E，100×)。
图11显示成纤维细胞组织工程化肌腱26周，细胞与胶原纤维束的排列 方向与正常肌腱相同，细胞密度较低，新生组织与正常肌腱组织间的界面已 难以分辨(H&E，100×)。
图12显示肌腱细胞组织工程化肌腱26周，细胞与胶原纤维束的排列方 向与正常肌腱相同，新生组织与正常肌腱组织间的界面已难以分辨(H&E，100 ×)。
图13显示对照组2细胞与胶原排列较紊乱，组织内仍有血管长入，且 与正常肌腱的界面清晰。

本发明人经过广泛而深入的研究，发现自体或异体来源的的成纤维细胞 可以作为组织工程化肌腱组织的种子细胞来源。将成纤维细胞(或成纤维细 胞与其他细胞的混合细胞)与药学上可接受的降解材料和生物膜一起构成组 织工程化肌腱移植物，可有效地用于修复肌腱缺损。在此基础上完成了本发 明。
术语
术语“纯化的或分离的”指纯化的或分离的物质基本上不含有其他细胞、 蛋白质或多肽。
术语“异种移植”指将所需生物材料(如肌腱)从某一物种中取出并再施 用于另一物种对象的方法。
术语“自体移植”指将所需生物材料(如肌腱)从某病人中取出并再施用 于同一病人的方法。
术语“异体移植”指将所需生物材料(如肌腱)从同一物种的某个体中取 出并再施用于另一不同病人的方法。
种子细胞
可用于本发明肌腱移植物的种子细胞是成纤维细胞，或成纤维细胞与其 他细胞(如肌腱细胞和/或骨髓基质干细胞等)的混合物。在成纤维细胞与其 他的混合物中，成纤维细胞与肌腱细胞和/骨髓基质干细胞的数量之比为 1∶10-10000∶1，较佳地为1∶5-100∶1，更佳地为1∶2-10∶1。
本发明人研究发现，肌腱细胞是特殊的成纤维细胞，两者形态相似，都能 分泌I型胶原，在肌腱损伤修复过程中成纤维细胞起重要作用。更出乎意料的是， 在应力作用下，成纤维细胞会转化为肌腱细胞。
本发明的成纤维细胞的来源没有特别限制，可以是任何来源的成纤维细 胞，通常，本发明的成纤维细胞是自体的(如真皮、皮下组织以及其他组织 中的成纤维细胞)、或同种异体的成纤维细胞(如人胎儿来源的成纤维细胞)。 成纤维细胞还可以是衍生自骨髓基质干细胞、或其他干细胞的成纤维细胞。
可用于本发明的成纤维细胞可以来自任何脊椎动物，较佳地是哺乳动 物，更佳地是灵长类动物，尤其是人。
尽管自体的成纤维细胞是优选的，但异体的成纤维细胞的来源也可使 用。
分离和获得成纤维细胞的方法是本领域中已知的。常用的分离方案包 括：
(a)胶原酶消化、分离法。在全麻无菌条件下取皮肤组织，切成2×2× 2mm3大小组织块，磷酸缓冲液(PBS，含青，链霉素各100U/ml)冲洗2遍， 加入二倍体积的1mg/mlII型胶原酶(Worthington，Freehold，NJ，USA)，置于37 ℃恒温摇床消化4h后用150目尼龙网筛过滤离心，沉淀细胞用PBS洗2次， 计数，台盼蓝染色检查成纤维细胞活力，以1×106/盘密度(培养皿直径100mm) 培养细胞。
(b)组织块培养法。在全麻无菌条件下取皮肤组织，切成2×2×2mm3大小 组织块，磷酸缓冲液(PBS，含青，链霉素各100U/ml)冲洗2遍。将组织块在培 养皿表面均匀摆置，将培养皿放置于培养箱中放置2-4小时，轻轻加入培养液， 让液体缓慢覆盖组织小块，等待细胞游出。
成纤维细胞的培养方法和培养液是本领域中熟知的。一种优选的方法是 将成纤维细胞在饱和湿度、5％CO2培养箱内培养。合适的培养液包括(但并 不限于)：1)DMEM培养基((Gibco公司)+10％胎牛血清；2)DMEM培养基+20％ 小牛血清；3)DMEM培养基+10-20％自体(异体)人血清。此外，上述培养液中 添加各种生长因子(例如促进成纤维细胞生长的细胞因子等)、各种转基因成 分、各种细胞成分。
适用于本发明的成纤维细胞应能在体内或体外增殖。一种优选的成纤维 细胞是体外培养的原代至第五十代细胞，且免疫组织化学染色证明I型胶原 表达，原位杂交检测证明I型胶原mRNA表达成纤维细胞。
如果必要，可以在种子细胞中加入一些肌腱细胞和/或骨髓基质干细胞。 分离和获得肌腱细胞的方法是本领域中已知的。一种优选的方法是通过胰 酶、胶原酶消化进行分离，即用无血清DMEM培养基(GIBCO公司)将胰酶或 胶原酶浓度调整至0.1-5mg/ml(较佳地约为1mg/ml)，37℃±2℃恒温振荡器 内消化约4-20h。
肌腱细胞的培养方法和培养液也是本领域中熟知的。一种优选的方法是 将肌腱细胞在饱和湿度、5％CO2培养箱内培养。合适的培养液包括(但并不 限于)：1)DMEM培养基((Gibco公司)+10％胎牛血清；2)DMEM培养基+20％小 牛血清；3)DMEM培养基+10-20％自体(异体)人血清。此外，上述培养液中添 加各种生长因子(例如促进肌腱细胞生长的细胞因子等)、各种转基因成分、 各种细胞成分。
本发明中骨髓基质干细胞(BMSCs)的来源没有特别限制，一种优选的来 源是来自自体的骨髓。分离获得骨髓基质干细胞的方法是本领域中已知的。 一种优选的方法是全麻下骨髓穿刺抽取自体骨髓，以密度梯度离心法分离出其 中的有核细胞，加入适合的培养液(如含有10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml， 维生素C50ug/ml，青、链霉素各100U/ml，地塞米松5nM(Sigma)的DMEM(Gibco， Gland Island，NY，USA)条件培养液)，制成细胞悬液，以约1×105/cm2的密度接 种于培养皿，于37℃、5％CO2、100％饱和湿度的条件下培养。48小时后首次换液， 加入条件培养液继续培养隔日换液。待细胞生长近汇合后，以0.25％胰蛋白酶 +0.02％EDTA消化，以1×104/cm2的密度接种进行细胞传代。
生物可降解材料
可用于本发明的组织工程化肌腱的材料是医学上可接受的生物可降解 材料，包括(但并不限于)：
(a)可降解性合成高分子材料，例如聚α-羟基酸(如聚乳酸PLA、聚羟 基乙酸PGA、聚羟基丁酸PHB等)、聚酸酐(polyanhydrides)、聚偶磷氮 (polyphosphazenes)、聚氨基酸(polyamino acid)、假聚氨基酸(pesudo- polyamino acid)、聚原酸酯(polyorthoesters)、聚酯尿烷 (polyesterurethane)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇、聚环氧乙烷、 聚对二氧六环酮(polydioxanone)等；
(b)天然可降解材料，例如胶原(collagen)、明胶(gelatin)、糖氨聚糖 (glycosaminoglycan，GAGs)、壳聚糖(chitosan)、甲壳素(chitin)、海藻酸 盐、藻酸钙凝胶等；各种脱细胞基质；
(c)上述材料的混合物或复合材料，尤其是高分子材料与天然材料的复 合材料。
生物膜
适用于本发明的生物膜没有特别限制，可以使用本发明常用的各种生物 膜。优选的生物膜具有以下特征：1、生物相容性好，不引起异物反应。2、 孔隙率合适，利于细胞营养物质的获取和代谢废物的排出。3、生物力学性能 好，可抗一定应力，以满足肌腱修复后早期功能锻炼的要求。4、可降解。
至于生物膜的厚度，没有特别限制，通常为5-200微米，较佳地为10- 50微米，更佳地为10-25微米。
组织工程化肌腱
体外培养扩增的种子细胞(如成纤维细胞)接种到生物相容性良好并可 被机体吸收的可降解生物材料上形成种子细胞—生物材料复合物，将这一“种 子细胞—生物材料”复合物植入到缺损部位，随着生物材料的逐渐降解吸收， 种子细胞继续增殖并分泌基质，最终替代生物材料而形成相应的肌腱组织， 达到修复肌腱缺损的目的。
本发明的组织工程化肌腱的制备方法简便，将一定数量的种子细胞与药 学上可接受的生物可降解材料混合，然后包被生物膜即可，或者种子细胞接 种于被生物膜包被的生物可降解材料中。
本发明的组织工程化肌腱移植物的形状没有特别限制，可以按照组织缺 损的形状任意塑形。通常，移植物为长条形。以类似于圆柱体的移植物为例， 其侧面为膜状覆盖物，其两端可以是覆盖有膜状覆盖物，也可以不覆盖膜状 覆盖物。
生物膜通常覆盖至少60％，较佳地至少70％，更佳地至少80％，最佳地 至少90％的生物可降解材料的外表面积。
本发明组织工程化肌腱中的种子细胞浓度通常约为1×105/ml至5× 108/ml或更高，较佳地为1×106/ml至1×108/ml，更佳地为5×106/ml至5 ×107/ml。通常，以培养液调整种子细胞浓度，然后与可降解材料混合。混 合时，培养液与可降解材料的比例没有特别限制，但是以该材料能够吸附的 培养液最大量为宜。
此外，在本发明的组织工程化肌腱移植物中，还可添加或复合其他各种 细胞、生长因子、各种转基因成分，从而保持肌腱细胞表型、促进肌腱细胞 生长，以及促进组织工程化肌腱在体内的血管神经化。
除了将组织工程化肌腱移植物植入体内之外，还将其置于体外生物反应 器内培养，从而进行组织工程化肌腱的构建，在体外形成具有一定组织学结 构、生化组成与生物力学强度的组织工程化肌腱。例如，将肌腱移植物的长 度、直径依照肌腱缺损长度与直径确定，然后在应力条件(1-200牛顿)下体 外培养一周，每一至二天换液一次，以保证细胞营养，从而形成供移植的肌 腱。
用本发明方法形成的组织工程化肌腱移植物或肌腱，可直接植入体内皮 下、肌腱缺损处。
本发明的主要优点在于：
(1)成纤维细胞分布广泛，取材容易，解决了肌腱组织工程化构建种子 细胞来源不足的问题；
(2)可以按照组织缺损的形状任意塑形，形成的组织可以在生物体内终 生存活。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于 说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册 (New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
成纤维细胞的分离与培养
幼年家猪5头，体重约10kg，由川沙养殖厂提供。
在全麻无菌条件下取猪侧腹部皮肤组织，切成2×2×2mm3大小组织块，磷 酸缓冲液(PBS，含青，链霉素各100U/ml)冲洗2遍，加入二倍体积的1mg/mlII 型胶原酶(Worthington，Freehold，NJ，USA)，置于37℃恒温摇床消化4h后用150 目尼龙网筛过滤离心沉淀细胞用PBS洗2次，计数，台盼蓝染色检查成纤维细 胞活力，以1×106/盘密度(培养皿直径100mm)培养细胞，培养液为Ham′F-12 (Gibco，Gland，Island，NY，USA)含10％胎牛血清，L-谷氨酰胺300ug/ml，维生素C 50ug/ml，青，链霉素各100U/ml，成纤维细胞传至第二代，经0.25％胰酶消化收 集细胞，用于实验(图3)。
实施例2
肌腱细胞的分离及体外培养扩增
本实施例中应用酶消化技术分离肌腱组织内的肌腱细胞，并在体外进行 扩增培养。
(1)肌腱细胞的分离
无菌状态下切取切取猪左侧趾浅屈肌腱3cm，将肌腱组织剪成1×2×2mm3 的组织块，置入离心管中PBS洗三遍，加入0.25％的II型胶原酶，置37℃摇 床震荡消化，分别于4、5、7小时收取肌腱细胞。通过以下收取步骤获得分 离的肌腱细胞：
1、消化液通过150目的过滤器去除组织碎块，过滤液在离心机中以1500 转/分离心5分钟，弃上清液。
2、加入PBS 5ml，震荡混匀后离心弃上清液，重复3次。
3、加入含10％胎牛血清的DMEM培养液10ml，细胞悬液(3×105个细胞 /ml)接种于直径100mm的培养皿中。
(2)肌腱细胞的原代培养
1、将获取的肌腱细胞置入饱和湿度，5％二氧化碳，37℃二氧化碳培养 箱中进行体外培养。
2、每2-3天更换培养液一次，每次更换培养液时更换50-80％。
3、倒置显微镜见肌腱细胞达80-90％融合时，进行细胞的传代培养。
(3)肌腱细胞的传代培养
1、吸除培养皿中的全部培养液，PBS洗3遍。
2、加入0.25％的胰蛋白酶3ml，置入37℃孵箱中消化2分钟。
3、倒置显微镜下观察见肌腱细胞由梭型变成透亮圆球型，加入含10％ 胎牛血清的DMEM培养液终止消化。
4、用带橡胶管的弯头吸管搔刮、吹打使培养皿中的肌腱细胞呈单个悬 浮状态。
5、细胞计数，按2×106个细胞/ml进行传代培养。
体外培养第2代肌腱细胞的倒置相差显微镜观察照片见图2。
实施例3
生物材料支架的制备及“细胞—生物材料”复合物的形成
本实施例采用聚羟基乙酸作为生物材料支架，接种实施例1中制备的成 纤维细胞形成“细胞-生物材料”复合物。同时以肌腱细胞-PGA复合物为对 照。
(1)实验材料
1、聚羟基乙酸(Polyglycolic acid PGA)(Dexon，Davies&Geck)，
2、生物膜(上海金环医疗用品有限公司)，厚度：13μm-20μm。纵 向拉伸强度：约33.3MPa；横向拉伸强度：约9.6MPa
(2)生物材料支架的制备
1、取未编织PGA20mg(直径100μm)制成条索状，外面包裹以生物膜， 使之成为圆柱状结构。长度50mm，直径与所修复的肌腱直径相当。复合物体 积约0.2ml。
2、将其放入75％酒精中浸泡消毒1小时。
3、生物材料支架用PBS洗涤3遍，含10％胎牛血清DMEM培养液洗涤三 遍，吸干。
4、紫外线下消毒30分钟。自然干燥。
(3)“细胞—生物材料”复合物形成
1.体外培养的成纤维细胞，制成浓度50×106个细胞/ml的细胞悬液。
2.生物材料预置在直径100mm的培养皿中，成纤维细胞接种于生物材料 支架上，以使成纤维细胞与生物材料粘附牢固，接种量50×106个细胞。置 饱和湿度，5％二氧化碳，37℃二氧化碳培养箱中孵育4小时。
3.加入含10％胎牛血清的DMEM培养液中，在饱和湿度，5％二氧化碳，37 ℃二氧化碳培养箱中继续培养7天，每2天换液1次。
4.倒置显微镜下拍照观察成纤维细胞与PGA粘附情况。
5.扫描电镜下观察：电镜标本经过前固定，漂洗，后固定，漂洗，脱水， 在经再经HCP-2临界点干燥、BAL-TEC离子溅射后，用PHILIPS公司XL30- 环境扫描电镜观察。
结果
倒置显微镜下观察显示：接种后4小时成纤维细胞与聚羟基乙酸开始粘 附，12小时成纤维细胞可牢固的贴附于PGA纤维上，并在体外培养过程中分 泌大量的细胞外基质。PGA纤维基本呈纵向排列，但不规则。
扫描电镜观察显示：成纤维细胞-PGA复合物体外培养7天可观察到成纤 维细胞与PGA纤维粘附牢固，成纤维细胞呈伸展状态贴附在PGA纤维上，并 分泌大量细胞外基质(图4)。对照组的肌腱细胞-PGA复合物体外培养7天， 倒置显微镜观察细胞生长良好(40×)(图5)。
实施例4
肌腱移植物(成纤维细胞——生物材料复合物)回植
全麻无菌条件下切断猪后肢趾浅屈肌腱，造成缺损长度3cm，将实施例3 中制备的复合物移植于缺损处，以改良kessler法行端端吻合，未作外固定。其 中，实验组为移植了本发明的肌腱移植物，对照组1为肌腱细胞-生物材料复 合物，对照组2为单纯生物材料。
6周取材，4％多聚甲醛固定24h，分别行大体观察，HE，Massom′s三色染 色和电镜检查评价再生组织。Instron生物力学测定仪测定生物力学强度。
结果
术后猪可正常行走，伤口愈合良好，6周取材
1、大体观察试验组6周再生组织与周围组织稍有粘连，可分离，色白， 柔软，有韧性，与正常肌腱组织相似(图6-9)。
2、组织学观察
1)HE染色  再生组织内细胞分布均匀，但细胞量较正常肌腱多，胶原 束基本呈平行排列，与正常肌腱组织相似。(图10-13)。
2)Masson′s三色染色在Masson′s三色染色下胶原呈绿色，可显示再生 组织内胶原含量丰富，排列平行，整齐，与正常肌腱组织相似。
3)超微结构观察：透射电镜下观察再生组织胶原束纵切面胶原排列较 一致，横纹清晰，在其横切面上其单根胶原纤维粗细不一，但是比正常肌腱 的胶原纤维粗且致密。
4)生物力学测定：
采用INSTRON生物力学测定仪(Instron公司，英国)测定新生组织 的抗拉力。新鲜获取6小时以内的肌腱组织进行生物力学测试。自行设计剖 面为锯齿状夹具。测定肌腱的最大单轴纵向抗拉伸力。室温下，拉伸速度2mm/ 秒，每标本测试前均以1N反复牵拉10次，使标本较原来长度延长0.5mm左 右以预调。
随体内植入时间延长，实验组的肌腱生物力学特性逐渐增加，第26周 实验组为438.0±49.5牛顿。组织工程化肌腱生物力学强度可达正常肌腱组 织的70％(见图1)。
实施例5
制备肌腱移植物
在本实施例中，重复实施例3和4的过程，不同之处在于，用成纤维细 胞和肌腱细胞混合物(成纤维细胞与肌腱细胞数量之比为1∶1)替换成纤维细 胞，接种量为5×106个细胞/ml、和50×106个细胞/ml。
结果，同样形成了生物力学强度可达正常肌腱组织的70％的肌腱组织。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文 献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容 之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样 落于本申请所附权利要求书所限定的范围。