ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用
阅读：293发布：2020-05-13
专利汇可以提供ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种ZEB1在人心脏 成 纤维 细胞 中的应用。本发明以ZEB1为研究对象，合成ZEB1干扰小 片段 ， 转染 心脏成纤维细胞，发现ZEB1促进心脏成纤维 细胞增殖 、迁移、分化与胶原合成，还通过控制其表达的miR-590-3p在心脏成纤维细胞中的功能来进行研究；本发明干扰ZEB1后，验证能够回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型，表明ZEB1在心脏成纤维细胞中是miR-590-3p的一个重要功能靶标，miR-590-3p可通过ZEB1来调节成纤维细胞的功能。本发明通过ZEB1和其靶向的miRNA在心脏成纤维细胞的应用，对于研究心肌梗死后的纤维化机制具有很好的应用价值。，下面是ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用专利的具体信息内容。
1.ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。
2.根据权利要求1中所述的ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用，其特征在于：
抑制ZEB1基因的siRNA，序列如下：
si-ZEB1-1：5'-GGCAAGUGUUGGAGAAUAA-3'。
3.根据权利要求1中所述的ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用，其特征在于：
抑制ZEB1基因的siRNA，序列如下：
si-ZEB1-2：5'-CCAGAAAUACACAGGGUUA-3'。
4.根据权利要求1中所述的ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用，其特征在于：
抑制ZEB1基因的siRNA，序列如下：
si-ZEB1-3：5'-GGACAGCACAGUAAAUCUA-3'。
5.根据权利要求1中所述的ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用，其特征在于：
靶向ZEB1基因的miRNA，序列如下：
miR-590-3p：5'-UAAUUUUAUGUAUAAGCUAGU-3'。
6.根据权利要求5中所述的ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用，其特征在于：
在心脏成纤维细胞中补充抑制ZEB1基因的小干扰RNA片段后，能回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型。
ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于细胞工程和基因工程技术领域，特别涉及一种ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。
背景技术
[0002] 心肌梗死状动脉的血液流动不畅，心肌长时间缺氧、缺血而导致的局部心肌坏死。在心肌梗死发生的早期，细胞外基质合成和沉积能加强心脏的收缩力，形成瘫痕防止心脏破裂，在一定程度上改善心脏功能；但是在疾病的后期，由于细胞外基质的合成过多，在心脏组织中大量积累，导致心肌纤维化的发生。心脏成纤维细胞在心肌纤维化过程中大量增殖，同时分化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞合成大量胶原等成分堆积于心肌间，致使心肌组织中胶原纤维降解异常、各种胶原比例失衡和间质与血管周围的蛋白积累过度。因此，心脏成纤维细胞是心肌纤维化过程的重要效应细胞，它的功能改变能影响心肌纤维化进程。
[0003] 锌指E盒结合的同源盒蛋白1(Zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)位于人染色体10p11.2上，是非常重要的一种细胞核转录因子。TGF-β是重要的致纤维化因子，ZEB1的基因结构上含有一个能与Smad蛋白结合的区域，可与磷酸化的Smad蛋白结合，从而促进TGF-β的活化转录。此结果说明，ZEB1可能参与调控器官的纤维化过程。研究发现在肝纤维化的大鼠模型中静脉注射重组ZEB1蛋白，HE和Masson染色结果显示，炎症与肝纤维化程度有所加重，纤维间距变宽，并且TGF-β表达水平上调，这些结果说明了ZEB1也许可以通过激活化某些途径促进TGF-β的转录进而促进大鼠肝纤维化进程。
[0004] 微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一类内源性非编码单链小分子RNA，长度约为22个核苷酸，可通过与信使核糖核酸(Messenger Ribonucleic Acid，mRNA)的3′非翻译区(untranslated region，UTR)不同程度的互补配对，诱导靶基因mRNA降解或抑制翻译，从而在转录后水平调控靶基因的表达。
发明内容
[0005] 为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。以确定ZEB1对人心脏成纤维细胞功能的调节作用。
[0006] 通过基因工程技术改变ZEB1基因在成纤维细胞的表达量，进而影响成纤维细胞增殖、迁移、胶原合成与分化；通过生物信息学软件预测该基因靶向的miRNA，研究该miRNA的功能，来达到ZEB1在人心脏成纤维细胞中应用的目的。
[0007] 本发明的另一目的在于提供抑制ZEB1基因的小干扰RNA片段(siRNA)。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0009] 本发明提供一种ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。
[0010] 本发明提供抑制ZEB1基因的siRNA，序列如下：
[0011] si-ZEB1-1：5'-GGCAAGUGUUGGAGAAUAA-3'；
[0012] si-ZEB1-2：5'-CCAGAAAUACACAGGGUUA-3'；
[0013] si-ZEB1-3：5'-GGACAGCACAGUAAAUCUA-3'；
[0014] 本发明提供靶向ZEB1基因的miRNA，序列如下：
[0015] miR-590-3p：5'-UAAUUUUAUGUAUAAGCUAGU-3'；
[0016] 在心脏成纤维细胞中补充抑制ZEB1基因的小干扰RNA片段后，能回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型。
[0017] 验证结果如下：
[0018] 1、合成3对干扰ZEB1基因的小片段/对照(si-ZEB1/si-ZEB1-NC)，转染干扰小片段到成纤维细胞中(转染浓度为50nM)，qRT-PCR检测其干扰效率，最终确定干扰效果较好的si-ZEB1-2小片段进行后续实验。
[0019] si-ZEB1-1：5'-GGCAAGUGUUGGAGAAUAA-3'；
[0020] si-ZEB1-2：5'-CCAGAAAUACACAGGGUUA-3'；
[0021] si-ZEB1-3：5'-GGACAGCACAGUAAAUCUA-3'；
[0022] 2、干扰ZEB1基因小片段(si-ZEB1-2)转染心脏成纤维细胞，研究其对人心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成的应用。通过EdU法、Transwell、qRT-PCR与Western blotting分别检测ZEB1受到si-ZEB1-2小片段干扰后心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成情况，发现ZEB1促进纤维细胞增殖与迁移，促进心脏成纤维细胞分化为肌成纤维细胞与合成Ⅰ型与Ⅲ型胶原。
[0023] 3、通过TargetScan、MiRanda、RNAhybrid 3个生物信息学软件预测调控ZEB1的miRNA，发现ZEB1的3'UTR区含有miR-590-3p结合位点，分别扩增ZEB1的野生型3'UTR区及与miR-590-3p种子区结合位点突变的突变型3'UTR区，并将其连接到pmirGLO真核表达载体中，通过双荧光素酶报告基因系统检测，发现ZEB1野生型(WT-ZEB1)3'UTR上游报告基因活性受到miR-590-3p调控而表达量下降，而ZEB1突变型(MUT-ZEB1)3'UTR上游报告基因活性不受miR-590-3p调控。通过qRT-PCR与Western blotting验证，ZEB1在蛋白水平受miR-590-3p调控(miR-590-3p mimic的转染浓度为25nM)。
[0024] 4、ZEB1回复miR-590-3p的功能验证。在心脏成纤维细胞中共转染miR-590-3p inhibitor与si-ZEB1-2后，检测能否回复由miR-590-3p引起的细胞迁移改变。通过Transwell检测结果显示，miR-590-3p inhibitor的促细胞迁移功能可以被si-ZEB1-2回复。
[0025] 本发明以ZEB1为研究对象，采用细胞生物学方法研究其在人心脏成纤维细胞中的应用。关键点和欲保护点：(1)ZEB1在人心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成中的应用；(2)通过靶基因回复验证，即在心脏成纤维细胞中补充抑制ZEB1基因的小干扰RNA片段(si-ZEB1-2)后，验证能否回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型。
[0026] 成纤维细胞的增殖、迁移、分化与合成胶原的能力是影响心肌纤维化的重要机制，本发明第一次证实ZEB1在人心脏成纤维细胞中的应用。本发明补充si-ZEB1-2能够回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型，进一步表明ZEB1在成纤维细胞中是miR-590-3p的一个重要功能靶标，miR-590-3p可以通过ZEB1来调节人心脏成纤维细胞的功能。
[0027] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0028] 本发明以ZEB1为研究对象，合成ZEB1干扰小片段，转染心脏成纤维细胞，发现ZEB1促进心脏成纤维细胞增殖、迁移、分化与胶原合成，还通过控制其表达的miR-590-3p在心脏成纤维细胞中的功能来进行研究；本发明干扰ZEB1后，验证能够回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型，表明ZEB1在心脏成纤维细胞中是miR-590-3p的一个重要功能靶标，miR-590-3p可通过ZEB1来调节成纤维细胞的功能。本发明通过ZEB1和其靶向的miRNA在心脏成纤维细胞的应用，对于研究心肌梗死后的纤维化机制具有很好的应用价值。
附图说明
附图说明
[0029] 图1是qRT-PCR检测3对ZEB1干扰小片段的干扰效率结果图。
[0030] 图2是ZEB1干扰小片段(si-ZEB1-2)调控心脏成纤维细胞增殖。
[0031] 图3是ZEB1干扰小片段(si-ZEB1-2)调控心脏成纤维细胞迁移。
[0032] 图4是ZEB1干扰小片段(si-ZEB1-2)调控心脏成纤维细胞分化标志基因α-SMA在心脏成纤维细胞中的表达；其中图4A是qRT-PCR结果；图4B是Western blotting结果。
[0033] 图5是ZEB1干扰小片段(si-ZEB1-2)调控心脏成纤维细胞胶原合成标志基因Col1A1、Col3A1在心脏成纤维细胞中的表达；其中图5A是qRT-PCR结果；图5B是Western blotting结果。
[0034] 图6是验证miR-590-3p靶向ZEB1；其中图6A、图6B、图6C分别表示双荧光报告基因验证、qRT-PCR和Western blotting验证。
[0035] 图7是ZEB1回复miR-590-3p抑制心脏成纤维细胞迁移的结果。
具体实施方式
[0036] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0037] 为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的实施例仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明，实施例的参数、比例等可因地制宜做出选择而对结果并无实质性影响。实施例中除特殊说明外，均为本领域常规试剂和方法步骤。
[0038] 实施例1人心脏成纤维细胞的培养
[0039] 本实验所用的细胞模型人心脏成纤维细胞来自来自美国ScienCell Research Laboratories。所用培养基为美国ScienCell Research Laboratories提供的心脏成纤维细胞培养基(Fibroblast Medium-2)。
[0041] (2)从液氮中取出冻存管，迅速浸入37℃水浴锅中，并不时摇动使其尽快融化。
[0042] (3)从37℃水浴锅中取出冻存管，外部喷洒75％酒精后转移到超净台，小心打开盖子，用移液枪吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀。
[0043] (4)1000rpm，离心5min。
[0044] (5)弃上清，加入完全培养基重悬细胞，接种细胞培养瓶，37℃ 5％CO2培养箱静置培养。
[0045] (6)24h后更换新的完全培养基，继续培养。
[0046] 实施例2人心脏成纤维细胞的接种和转染
[0048] (2)预热的0.25％胰酶加入培养瓶，放入培养箱中静置2min，显微镜下观察到细胞大部分细胞飘起时，加入终止液(10％FBS的DMEM)终止消化。
[0049] (3)用枪头轻轻吹打细胞，制成细胞悬液，转移至15mL离心管，1000rpm离心5min。
[0050] (4)适量PBS清洗细胞两次。
[0051] (5)适量完全培养基重悬细胞沉淀，细胞计数后，均匀分布到每一个孔中，补足完全培养基至推荐的体积，放入培养箱中继续培养。
[0052] (6)24h左右观察细胞形态及汇合度，细胞形态良好且汇合度达到70％～90％时，可以用于转染。本发明取第3或第四代传代的心脏成纤维细胞进行转染，转染步骤参照Invitrogen公司的 3000试剂盒说明书进行；每组设置3个重复；
[0053] (7)转染后，细胞在37℃，5％ CO2培养箱中继续培养；
[0054] (8)根据实验目的，在转染后的2～4d收集细胞。
[0055] 实施例3qRT-PCR
[0056] (1)冷PBS清洗贴壁细胞2～3次，倾斜细胞培养皿，吸净PBS，加入1mL的Trizol，静置5min，直至镜下观察到细胞全部裂解后，用枪头吹打均匀并转移到1.5mL RNase-free EP管。
[0057] (2)每管加入200μL预冷氯仿(Trizol组织液:氯仿为5：1)，剧烈震荡15～30s，冰上放置5min后，12000rpm，4℃，离心15min；液体分三层：上层为无色的RNA，中层为含有酚-氯仿的白色水相，下层为浅红色。小心吸取上层无色液相(避免触及中间相)。将上层液相(约300μL)移入新的1.5mL EP管中，加入等量异丙醇溶液(300μL)，轻轻上下颠倒摇匀10次，冰上静置10min。12000rpm，4℃，离心10min。
[0058] (3)弃上清、留沉淀，沿管壁加入预冷的1mL 75％乙醇-DEPC以洗涤RNA，12000rpm，4℃，离心5min后尽量去上清。
[0059] (4)将液体吸干，室温自然干燥5～10min，同时避免RNA沉淀干燥过度。
[0060] (5)根据沉淀量，加入30～50μL的DEPC水以溶解RNA沉淀。分光光度计测定RNA浓度和纯度。
[0061] 逆转录反应采用TAKARA公司的PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)Kit。qRT-PCR分别采用Thermo公司的SYBR Green qRT-PCR Master Mix(2X)，ROX Solution provided Mix。以2-△△Ct法计算mRNA与miRNA的相对表达量。
[0062] 本发明所用到的qRT-PCR引物为：
[0063] qRT-PCR-α-SMA Forward：5'-GACAATGGCTCTGGGCTCTGTAA-3'；
[0064] Reverse：5'-CTGTGCTTCGTCACCCACGTA-3'；
[0065] qRT-PCR-Col1A1Forward：5'-CCCGGGTTTCAGAGACAACTTC-3'；
[0066] Reverse：5'-TCCACATGCTTTATTCCAGCAATC-3'；
[0067] qRT-PCR-Col3A1Forward：5'-AATCAGGTAGACCCGGACGA-3'；
[0068] Reverse：5'-TCGAGCACCGTCATTACCC-3'。
[0069] qRT-PCR-GAPDH Forward：5'-GGATTTGGTCGTATTGGG-3'；
[0070] Reverse：5'-GGAAGATGGTGATGGGATT-3'；
[0071] qRT-PCR-ZEB1Forward：5'-AACGCTTTTCCCATTCTGGC-3'；
[0072] Reverse：5'-TTGCCGTATCTGTGGTCGTG-3'；
[0073] 实施例4Western Blotting
[0074] (1)人心脏成纤维细胞总蛋白的提取
[0075] 细胞转染后48h，用PBS清洗细胞3次，6孔板细胞每孔加入100～200μL蛋白裂解液进行蛋白质裂解，细胞裂解液转移到1.5mL EP管中。12000rpm，4℃离心15min，取上清至新的1.5mL EP管中，低温保存防止蛋白降解。
[0076] (2)SDS-PAGE电泳
[0077] BCA法蛋白样品初步定量后，每组取20μg总蛋白和5×上样缓冲液按5：1混合，煮沸5min。SDS-PAGE电泳至溴酚蓝刚出胶底部止。
[0078] (3)转膜
[0079] 甲醛浸泡聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)5min，清水冲洗后与吸附滤纸一起用转膜液浸泡。从正极开始依次按照吸附滤纸(4张)-凝胶-PVDF膜-吸附滤纸(4张)顺序叠放，合上负极。装入电泳槽中。转膜过程在冰上进行，恒流300mA，根据目的蛋白不同选择转膜时间。
[0080] (4)蛋白检测与结果分析
[0081] 转膜完成后，将膜放入1×TBST中漂洗，用5％脱脂奶粉室温下封闭2h。1×TBST洗膜，用抗体稀释液稀释所需抗体，4℃孵育过夜。回收一抗(ZEB1一抗；α-SMA一抗；Col1A1一抗；Col3A1一抗；上述4个一抗均为常规市售产品)，1×TBST洗膜。室温孵育二抗(二抗：辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG-HRP，购置美国SANTA CRUZ公司)2h。1×TBST洗膜。用ECL化学发光法进行检测，用Bio-Rad曝光系统曝光并采集图片。使用Image J进行电泳条带灰度值测定。
[0082] 实验例5心脏成纤维细胞增殖实验
[0083] 本发明中EdU细胞增殖实验参照广州市锐博生物科技有限公司的Cell-LightTM EdU Apollo 567In vitro Kit进行。具体步骤如下(以96孔板为例)：
[0084] (1)用细胞培养基按1000：1的比例稀释Edu溶液，制备适量浓度为50μM的Edu培养基；
[0085] (2)每孔加入100μL浓度为50μM的Edu培养基孵育2h，弃培养基；
[0086] (3)PBS清洗细胞1～2次，每次5min；
[0087] (4)每孔加入50μL细胞固定液(含4％多聚甲醛的PBS)室温孵育30min，弃固定液；
[0089] (6)每孔加入100μL的PBS，脱色摇床清洗5min，弃PBS；
[0090] (7)每孔加入100μL的1×Apollo染色反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；
[0091] (8)加入100μL渗透剂(0.5％Triton X的PBS)脱色摇床清洗2～3次，每次5min，弃渗透剂；
[0092] (9)用去离子水按100：1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechst3342反应液，避光保存；
[0093] (10)每孔加入100μL的1×Hoechst3342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；
[0094] (11)每孔加入150μL的PBS清洗1～3次；
[0095] (12)每孔加入100μL的PBS保存待用；
[0096] (13)染色完成后，用荧光显微镜进行照片采集。
[0097] 实验例6心脏成纤维细胞迁移实验
[0098] 本发明使用试剂耗材：Transwell细胞培养板(BD，REF353097)
[0099] (1)将细胞培养板放置于室温，PBS润洗培养板内细胞2次，去除培养板内PBS；
[0100] (2)加入不含EDTA的胰酶消化细胞，用100μL无血清细胞培养基重悬细胞，计数1×5
10个细胞，加入Transwell细胞培养板的小室上室，下室加入600μL完全培养基；
10个细胞，加入Transwell细胞培养板的小室上室，下室加入600μL完全培养基；
[0101] (3)在37℃，5％CO2孵育12～48h，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4％多聚甲醛固定细胞20min，PBS洗涤一次，结晶紫染色10min，PBS洗涤一次，显微镜下观察细胞是否穿过小孔，并拍照统计。
[0102] 实验例7荧光素酶报告基因活性检测
[0103] 按照Promega公司的Dual- Reporter Assay System(E1960)试剂盒说明书在荧光化学发光微孔板检测仪上操作，具体步骤如下：
[0104] (1)5×PLB室温解冻后，使用ddH2O按1：4的比例将其稀释成1×PLB；
[0105] (2)移液枪吸出培养基。沿孔壁慢慢地加入200μL的PBS，轻轻晃动培养板，吸除PBS，此PBS清洗步骤重复两遍，全程注意动作轻柔，防止将细胞吸走；
[0106] (3)每孔加入100μL的1×PLB；摇床上孵育10min，使细胞充分裂解；
[0107] (4)将裂解的细胞取75μL转移到96孔酶标板中，每孔加入75μL的LARⅡ溶液，混匀后，摇床孵育10min；检测Firefly luciferase荧光强度；
[0108] (5)再加入75μL的Stop&Glo溶液，混匀后，摇床孵育10min；检测Ranilla luciferase荧光强度；
[0109] (6)Firefly luciferase与Ranilla luciferase的比值即为萤火虫荧光素酶相对活性。(每个组4个重复)。
[0110] 结果分析：
[0111] 1、合成3对干扰ZEB1基因小片段/对照(si-ZEB1/si-ZEB1-NC)，利用qRT-PCR手段，检测上述片段转染到心脏成纤维细胞之后在细胞中的表达情况(转染浓度为50nM)。结果如图1所示，选择干扰效率最好的si-ZEB1-2进行后续实验。后续统一将si-ZEB1-2与si-ZEB1-NC书写成siZEB1与NC。
[0112] si-ZEB1-1：5'-GGCAAGUGUUGGAGAAUAA-3'；
[0113] si-ZEB1-2：5'-CCAGAAAUACACAGGGUUA-3'；
[0114] si-ZEB1-3：5'-GGACAGCACAGUAAAUCUA-3'；
[0115] 上述干扰小片段由广州市锐博生物科技有限公司合成。
[0116] 2、siZEB1转染到心脏成纤维细胞后，研究靶基因ZEB1对心脏成纤维细胞功能的应用。EdU结果如图2所示，siZEB1抑制心脏成纤维细胞增殖，即ZEB1能够促进心脏成纤维细胞增殖。Transwell结果如图3所示，siZEB1抑制心脏成纤维细胞迁移，即ZEB1能够促进心脏成纤维细胞迁移。
[0117] 3、siZEB1转染到心脏成纤维细胞后，qRT-PCR与Western blotting验证靶基因ZEB1对心脏成纤维细胞分化标志基因α-SMA的作用，结果如图4所示，与对照相比，siZEB1显著抑制α-SMA在mRNA与蛋白的表达，即ZEB1能够促进心脏成纤维细胞中α-SMA的mRNA与蛋白的表达。
[0118] 4、qRT-PCR与Western blotting验证靶基因ZEB1对心脏成纤维细胞胶原合成标志基因Col1A1与Col3A1的作用，结果如图5所示，与对照相比，siZEB1显著抑制Col1A1与Col3A1在mRNA与蛋白的表达，即ZEB1能够促进心脏成纤维细胞中Col1A1与Col3A1的mRNA与蛋白的表达。
[0119] 5、利用生物信息学软件预测调控ZEB1的miRNA，发现ZEB1的3'UTR中含有miR-590-3p结合位点，将ZEB1野生型3'UTR和含有种子序列突变的3'UTR构建到真核表达载体pmirGLO中，通过双荧光素酶报告系统分析，发现ZEB1野生型(WT-ZEB1)3'UTR上游报告基因活性受到miR-590-3p调控而表达量下降，而突变型(MUT-ZEB1)载体上报告基因活性则不受miR-590-3p调控(miR-590-3p mimic转染浓度为25nM)。通过qRT-PCR与Western blotting验证，ZEB1在翻译水平受miR-590-3p的调控(miR-590-3p mimic转染浓度为25nM，miR-590-
3p inhibitor转染浓度为50nM)，结果如图6所示。
3p inhibitor转染浓度为50nM)，结果如图6所示。
[0120] 6、ZEB1回复miR-590-3p的功能验证。在心脏成纤维细胞同时共转染miR-590-3p inhibitor和siZEB1后，检测能否回复由miR-590-3p引起的细胞功能表型变化。通过Transwell检测心脏成纤维细胞迁移情况，发现miR-590-3p inhibitor引起的促迁移功能可以被siZEB1回复，结果如图7所示。
[0121] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
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