膜囊的生产方法
阅读：937发布：2022-01-30
专利汇可以提供膜囊的生产方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及制备用于各种实验、诊断或 治疗 用途 包括免疫治疗处理或 肿瘤 预防 的 生物 物质的方法。更具体而言，本发明涉及制备由各种类型的 哺乳动物 细胞释放的膜囊(特别是外来体)的方法，其包括渗滤和/或 密度 垫离心。本发明亦提供 鉴别 和分析外来体制品的新型方法，为了药物产品生产的目的，其可用于 质量 控制的测定中。本发明适用于生产这类膜囊的药物级的制品，并为了用于人类充分鉴别了该制品特征。，下面是膜囊的生产方法专利的具体信息内容。
1.一种制备免疫原性膜囊的方法，该方法包括从生物样品中分 离或纯化膜囊，并使所述纯化的膜囊与肽或脂质在允许该肽或脂质与 在该膜囊表面上的抗原呈递分子结合的条件下接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述膜囊分离自包括抗原呈 递细胞的生物样品。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述膜囊分离自包括人类树 突细胞的生物样品。
4.如权利要求1所述的方法，其包括在所述膜囊与所述肽或脂 质接触之前、期间或之后使该分离或纯化的膜囊暴露在选择的酸性培 养基之下。
5.如权利要求1所述的方法，其中在接触之后，使该囊接受密 度离心或渗滤以便去除未结合的肽或脂质。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述肽为第I类限制肽。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述肽为第II类限制肽。
8.如权利要求1所述的方法，其中使所述囊与肽的混合物接触。
9.如权利要求8所述的方法，其中使所述囊与肿瘤细胞的肽洗 脱物接触。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述抗原呈递分子为CD1分 子，并且所述脂质选自微生物脂质、微生物糖脂和脂质或糖脂肿瘤抗 原。
11.如权利要求1所述的方法，为了制备包括外源第I类肽与HLA 第I类分子结合的复合体的免疫原性膜囊，该方法包括(i)让分离或 纯化的膜囊暴露在选择的酸性培养基下，(ii)使所述分离或纯化的 膜囊与第I类限制肽在β2-微球蛋白的存在下以及在允许该肽与在膜囊 表面上的HLA第I类分子复合的条件下接触，和(iii)收集装载的膜 囊。
12.如权利要求11所述的方法，其中步骤(i)包括使分离或纯 化的膜囊在pH为大约3到5.5之间的培养基下暴露15分钟以内。
13.如权利要求11所述的方法，其中步骤(ii)包括使分离或纯 化的膜囊在β2-微球蛋白的存在下与0.005至50微克/毫升的第I类限 制肽接触。
14.如权利要求1所述的方法，为了制备包括外源第I类肽与HLA 第I类分子结合的复合体的免疫原性膜囊，该方法包括(i)使分离或 纯化的膜囊与第I类限制肽在缺乏β2-微球蛋白之下接触，(ii)使(i) 的混合物在允许该肽与任何与在该囊膜表面上的HLA第I类分子结合 的内源肽交换的条件下，暴露在选择的酸性培养基中，(iii)中和培 养基终止该交换，并使在(ii)中形成的复合体稳定，和(iv)收集装 载的膜囊。
15.如权利要求14所述的方法，其中步骤(ii)包括使该混合物 在pH为大约4到5.5的选择的酸性培养基中暴露2小时以内。
16.如权利要求14所述的方法，其中步骤(i)包括使分离或纯 化的膜囊在缺乏β2-微球蛋白下与5至500微克/毫升的第I类限制肽 接触。
17.如权利要求11所述的方法，其中所述肽选自肿瘤抗原、病 毒抗原、寄生虫抗原和细菌抗原。
18.如权利要求14所述的方法，其中该肽选自肿瘤抗原、病毒 抗原、寄生虫抗原和细菌抗原。
19.一种制备装载肽的膜囊的方法，其包括：
a)在允许由抗原呈递细胞特别是树突细胞释放膜囊的条件下， 培养抗原呈递细胞特别是树突细胞的群，
b)膜囊富集或纯化步骤，以及
c)使该膜囊与肽在允许该肽与膜囊表面上的MHC分子结合的条 件下接触，以便产生装载肽的膜囊。
20.一种制备装载肽的膜囊的方法，包括：
a)获得不成熟树突细胞的群，
b)在允许由不成熟的树突细胞释放膜囊的条件下，培养该不成 熟树突细胞的群，
c)膜囊富集或纯化步骤，以及
d)使该膜囊与肽在允许该肽与膜囊表面上的MHC分子结合的条 件下接触，以便产生装载肽的膜囊。
21.如权利要求19所述的方法，其中在步骤c)之前或之后使该 膜囊暴露在选择的酸性培养基下。
22.如权利要求20所述的方法，其中在步骤D)之前或之后使该 膜囊暴露在选择的酸性培养基下。
23.一种在受试对象中产生免疫反应的方法，该方法包括(i)获 得含有树突细胞的生物样品，(ii)从所述生物样品中分离或纯化膜 囊，(iii)使所述纯化的膜囊与肽或脂质在允许该肽或脂质与在膜囊 表面上的MHC或CD1分子结合的条件下接触，和(iv)将(iii)的 膜囊施用给受试对象，以便在所述受试对象中产生免疫反应。
24.如权利要求23所述的方法，其中在步骤(i)中，该含有树 突细胞的生物样品获自待处理的受试对象。
25.如权利要求23所述的方法，其中在步骤(iii)之前或之后使 该膜囊接受弱酸处理。
26.如权利要求23所述的方法，其中所述肽为第I类限制肽。
27.如权利要求23所述的方法，其中所述抗原呈递分子为CD1 分子，而所述脂质选自微生物脂质、微生物糖脂和脂质或糖脂肿瘤抗 原。
28.一种药物组合物，其包括免疫原性膜囊和可药用的稀释剂或 载体，其中通过从含有抗原呈递细胞的生物样品中分离膜囊并利用免 疫原性肽或脂质装载所述分离的膜囊，而获得该免疫原性膜囊。
29.如权利要求28所述的药物组合物，其中通过从含有抗原呈 递细胞的生物样品中分离膜囊，利用免疫原性肽或脂质装载所述分离 的膜囊，并且由密度离心或渗滤去除未结合的肽或脂质，而获得该免 疫原性膜囊。
30.如权利要求28所述的药物组合物，其中通过从含有树突细 胞的生物样品中分离膜囊，而获得该免疫原性膜囊。
31.如权利要求30所述的药物组合物，其中所述免疫原性肽为 第I类限制肽。
32.如权利要求28所述的药物组合物，其中利用所述肽装载至 少15％优选至少40％在该囊表面上的HLA分子。
33.一种制备包括免疫原性膜囊和可药用稀释剂或载体的药物产 品的方法，其中该方法包括(i)从生物样品中分离膜囊，(ii)利用 免疫原性肽或脂质装载所述分离的膜囊，以产生免疫原性膜囊，(iii) 优选去除未结合的免疫原性肽或脂质，和(iv)使该免疫原性膜囊与 可药用稀释剂或载体接触。
34.一种人生物样品中制备膜囊的方法，其包括采用密度垫离心 处理所述生物样品。
35.如权利要求34所述的方法，其进一步包括在该密度垫离心 之前和/或之后渗滤该生物样品。
36.如权利要求34或35所述的方法，其中所述生物样品是生物 流体、培养物上清液、细胞的溶胞产物或纯化前溶液。
37.如权利要求36所述的方法，其中处理所述生物样品使其富 含膜囊。
38.一种从生物样品中制备膜囊的方法，其包括：
a.在允许释放该囊的条件下，培养产生膜囊的细胞群，
b.膜囊的富集步骤，和
c.通过在密度垫上离心处理所述富集的生物样品。
39.如权利要求37或38所述的方法，其中所述富集步骤包括澄 清。
40.如权利要求37或38所述的方法，其中所述富集步骤包括超 滤浓缩。
41.如权利要求37或38所述的方法，其中所述富集步骤包括澄 清和超滤浓缩。
42.如权利要求37或38所述的方法，其中所述富集步骤包括通 过超滤的渗滤。
43.如权利要求38所述的方法，其进一步包括无菌过滤来自步 骤c的制品。
44.如权利要求38所述的方法，其中在具有降低的颗粒体含量 的培养基中培养所述细胞。
45.如权利要求38所述的方法，其中所述产生膜囊的细胞为抗 原呈递细胞或肿瘤细胞。
46.如权利要求44所述的方法，其中使所述抗原呈递细胞对一 种或数种抗原致敏。
47.如权利要求44或45所述的方法，其中所述抗原呈递细胞包 括树突细胞，优选不成熟的树突细胞。
48.一种制备膜囊的方法，其包括：
a.在允许由抗原呈递细胞释放膜囊的条件下，培养抗原呈递细胞 的群，
b.膜囊的富集步骤，以及
c.使用密度垫离心分离该膜囊。
49.一种制备膜囊的方法，其包括：
a.获得不成熟树突细胞的群，
b.在允许由不成熟的树突细胞释放膜囊的条件下，培养该不成 熟的树突细胞群，
c.膜囊的富集步骤，以及
d.使用密度垫离心分离该膜囊。
50.一种制备膜囊的方法，其包括：
a.获得抗原呈递细胞的群，
b.视需要，使该抗原呈递细胞对一种或数种抗原致敏，
c.在允许由抗原呈递细胞释放膜囊的条件下，培养该抗原呈递细 胞的群，
d.澄清培养物上清液，
e.浓缩澄清的上清液，
f.渗滤浓缩的上清液，
g.使用密度垫离心分离该膜囊，
h.视需要使该膜囊与肽接触，以产生装载肽的膜囊，以及
i.无菌过滤在g中获得的膜囊。
51.一种产生树突细胞的方法，其包括在包含生长因子和/或细胞 因子的培养基中培养树突细胞前体，从而影响或刺激所述前体分化成 树突细胞，其中该培养基具有降低的颗粒体含量。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述培养基基本上不含凝 集的结合珠蛋白。
53.一种组合物，其包括在具有降低的颗粒体含量的培养基中的 树突细胞。
54.一种组合物，其包括在培养基中的树突细胞，其中所述培养 基基本上不含凝集的结合珠蛋白。
55.一种组合物，其包括(i)膜囊，(ii)缓冲剂和(iii)冷冻 保护剂或稳定化合物。
56.如权利要求55所述的方法，其进一步包括(iv)盐类和/或 填充剂和/或抗氧化剂和/或维生素。
57.一种鉴别膜囊特征的方法，其包括使所述膜囊平行地与两种 或多种对膜囊标记特异的抗体接触，并确定抗原-抗体免疫复合体的形 成。
58.如权利要求57所述的方法，其中将所述膜囊装载于固相支 持物上，如小珠。
59.如权利要求57或58所述的方法，其中使用两种或多种下列 抗体：抗CD11c、抗CD11b、抗HLAabc、抗CD81、抗CD63、抗CD58、 抗CD1a、抗CD1b、抗CD9、抗CD86、抗CD82、抗CD83和抗乳粘 附素。
60.一种鉴别膜囊制品活性特征的方法，其包括使超-抗原-装载 的膜囊在辅助细胞的存在下与T细胞接触，并确定该T细胞的活化。
61.如权利要求60所述的方法，其中利用超抗原装载该膜囊。
62.如权利要求60所述的方法，其中从以超抗原装载的生产细 胞中产生该膜囊。
63.一种对样品中膜囊确定剂量的方法，其包括(i)将样品装载 于固相支持物上，使该支持物与抗第II类抗体接触，并确定抗体-抗 原免疫复合体的存在。
64.一种哺乳动物细胞培养基，其中所述培养基基本上不含结合 珠蛋白凝集物。
65.一种热灭活的哺乳动物细胞培养基，其中所述培养基含有低 于大约10纳克/毫升的结合珠蛋白凝集物。
66.一种组合物，其包括生物多肽或其衍生物，其中所述组合物 基本上丧失了结合珠蛋白凝集物。
67.一种组合物，其包括热灭活的生物多肽或其衍生物，其中所 述组合物基本上丧失了结合珠蛋白凝集物。
68.如权利要求66或67所述的组合物，其中所述生物多肽是分 离自哺乳动物生物流体的多肽、蛋白质或肽。
69.如权利要求68所述的组合物，其中所述生物多肽选自血清 白蛋白、γ免疫球蛋白和凝固因子。
70.如权利要求66至69中任一项所述的组合物，其中所述组合 物包含低于大约0.01％，特别是低于大约0.001％的结合珠蛋白凝集物。
71.一种热灭活的人类血清白蛋白的组合物，其中所述组合物基 本上不含凝集的结合珠蛋白。
72.一种热灭活的人类血清白蛋白的组合物，其中所述组合物包 括按重量计低于大约0.001％凝集的结合珠蛋白。
73.一种处理生物产品降低其中所含的结合珠蛋白凝集物的含量 的方法，优选的是热灭活的生物产品，该方法包括使该产物接受过滤， 更优选的是超滤。
74.一种制备生物产品的方法，其包括(i)生物产品的热灭活， 和(ii)热灭活的生物产品的过滤。
75.如权利要求74所述的方法，其进一步包括(iii)浓缩经过过 滤的热灭活的生物产品，和/或(iv)其调整。
76.如权利要求74或75所述的方法，其中所述过滤步骤优选包 括超滤，更优选的是在多孔的装置上，该装置的平均孔径在大约100 kDa到大约1000kDa之间，通常是在200kDa到750kDa之间。
77.一种处理人类血清白蛋白制品降低其中所含有的颗粒体的方 法，其包括使该制品在热灭活之后接受超滤。
78.一种制备血浆蛋白质制品的方法，其包括使该制品在热灭活 之后接受超滤。
79.一种包括膜囊的组合物，其中所述组合物基本上不含结合珠 蛋白凝集物。
发明领域
本发明涉及制备用于各种实验、诊断或治疗用途，包括免疫治疗 处理或肿瘤预防的生物物质的方法。更具体而言，本发明涉及制备由 各种类型的哺乳动物细胞释放的膜囊(特别是外来体)的方法，包括 渗滤和/或密度垫离心。本发明亦提供鉴别外来体制品特征和分析它的 新型方法，其可为了药物生产的目的，用于质量控制的测定中，以及 提供将免疫原性化合物装载于膜囊内的方法。本发明适用于生产这类 膜囊的药物级的制品，并为了用于人类上，充分鉴别该制品特征。
发明背景
膜囊本质上是球状的囊，通常直径小于130纳米，由含有胞质部 分的脂双层所组成。特殊的膜囊通过与细胞的原生质膜融合更独特地 由细胞从胞内区室产生，导致它们在生物流体或在培养细胞的上清液 中释放。这类膜囊通常被称为外来体。外来体较特别的是直径在大约 30到大约120纳米之间，优选在50至90纳米，更优选的是在大约60 到80纳米之间，并且有利的是其携带膜蛋白(特别是主要组织相容 性复合体蛋白质或其他直接或间接参与抗原呈递的蛋白质)。此外， 依据其来源，外来体包括诸如MHC I、MHC II、CD63、CD81和/或 HSP70的膜蛋白，且没有内质网或高尔基体。此外，外来体基本上不 含核酸(例如DNA或RNA)。
在种种不同的生理环境中，已经证实从不同的细胞类型中释放外 来体。特别是已经证实B淋巴细胞释放带有第II类主要组织相容性复 合体分子的外来体，其在抗原呈递上扮演某种角色(Raposo等，J.Exp. MeD.183(1996)1161)。同样，亦已经证实树突细胞产生外来体(即 帝萨体(Dexosomes)，Dex)，具有独特的结构和功能特征，并在免疫 反应的介导上扮演某种角色，特别是在胞毒性T淋巴细胞的刺激上 (Zitvogel等，Nature Medicine 4(1998)594)。亦已经证实肿瘤细胞 以调节方式分泌特定的外来体(即特赛体(texosomes)，Tex)，其带 有肿瘤抗原，并能够呈递这些抗原，或将其转送给呈递抗原细胞(专 利申请第WO99/03499号)。亦知道肥大细胞在胞内囊状区室中积累 分子，其可在信号的影响下进行分泌(Smith和Weis，Immunology ToDay 17(1996)60)。因此，原则上细胞似乎通过其释放的膜囊发出信号并 彼此联络，该膜囊可携带抗原性蛋白质(或多肽或肽)、MHC分子 或任何其他信号(细胞因子、生长因子等)，具有独特的结构和功能 特征，在不同生理状态下产生。因此这些囊，尤其是外来体，代表特 别的目的产物用于诊断、接种疫苗或治疗应用，或用来递送目的分子。 因此，对于可用来以工业规模制备适宜生物用途特别是药物用途的膜 囊的有效方法，亦将特别感兴趣。
传统上制备膜囊(例如外来体)的方法涉及一系列不同的离心步 骤，以便从出现在培养基中的细胞或细胞碎屑中分离囊。关于这一点， 上文提及的文件基本上描述利用一系列300g、10,000g和70,000g或 100,000g的离心作用来制备囊，将在离心管底部所得的沉淀以其原始 体积的千分之一再悬浮盐溶液中，从而组成浓缩的外来体溶液。然而， 因为许多理由使这些方法基本上不适用于临床应用：1)时间的长度，2) 在GMP环境中的放大和有效性，3)被细胞碎屑污染的显著风险，4)因 为操作者的变化再现性差，5)起因于形成沉淀时的外来体聚集(在沉 淀中局部有高外来体浓度)，以及6)在最后加工结束时的低回收。因 此，需要制备膜囊的改良方法，其适合工业限制并允许生产具有治疗 品质的囊制品。
国际申请第PCT/FR00/00105号公开了通过层析技术制备膜囊的 方法，如阴离子析法和/或凝胶渗透层析法。
发明概述
本发明现在提供以高产量、高纯度和相对较短的时间来制备膜囊 的新型方法。本发明亦公开鉴别膜囊制品特征(分析或确定剂量)的 方法，其可用于药物生产中以确定囊的活性、表型和/或量。本发明现 在允许生产并鉴别很多在临床上可接受的膜囊的特征，具有再现性、 不同操作者的有限变化和增加产物质量。本发明进一步涉及从各种培 养基或组合物中去除诸如结合珠蛋白的颗粒体(particulate body)的 方法、所得组合物和培养基及其用途。本发明亦涉及将免疫原性化合 物装入膜囊中的新型方法及其用途。
更具体而言，本发明一方面在于使用密度垫离心来制备膜囊的方 法。
本发明另一方面在于使用一系列超滤步骤和/或澄清步骤来制备 膜囊的方法，更具体而言，是通过超滤的浓缩和渗滤组合，优选先澄 清。
本发明另一方面在于使用密度垫离心和超滤和/或澄清步骤来制 备膜囊的方法，更具体而言，是通过超滤的浓缩和渗滤组合，优选先 澄清，接着再是密度垫离心。
在特殊方面，本发明方法包括在渗滤之前或之后的密度垫离心。
本发明的方法可应用于各种含有膜囊的生物样品，包括生物流 体、培养物上清液、细胞裂解液或纯化前的溶液。在特定的具体实施 方案中，使用该方法从富含膜囊的生物样品中制备膜囊(例如纯化、 分开或分离)。
本发明的特殊方面在于从生物样品中制备膜囊的方法，包括：
a.在允许释放囊的条件下，培养生产膜囊的细胞群，
b.膜囊富集步骤，和
c.通过密度垫离心处理该富集的生物样品。
在进一步优选的具体实施方案中，在降低颗粒体含量的培养基 中，优选是丧失了结合珠蛋白凝集物的培养基，培养生产膜囊的细胞。 在本申请中，将证实使用这类培养基允许增加产量和/或达到较高的纯 度和质量水平。
富集步骤可包括一个或多个离心、澄清、超滤、纳米过滤 (nanofiltration)、亲和层析和/或渗滤步骤。
从步骤c)中通过任何适当的方法包括吸移或利用针头可收集外来 体的制品。
在优选的具体实施方案中，该方法尚包括得自步骤c的制品的灭 菌过滤d)步骤。
可使用本发明来制备来自各种来源的膜囊，包括由抗原呈递细胞 (如巨噬细胞、树突细胞、B淋巴细胞)、肿瘤细胞或产生囊的任何 其他细胞或细胞系所生产的膜囊，优选是转导抗原的膜囊。特别适合 制备由树突细胞产生的膜囊，优选是不成熟的树突细胞(即帝萨体)。 此外，在制备之前、期间或之后，膜囊或相对应的生产细胞可被一种 或多种抗原致敏。
本发明更优选的具体实施方案包括：
·制备膜囊的方法，包括：
b.在允许由抗原呈递细胞特别是树突细胞释放膜囊的条件下， 培养该抗原呈递细胞群，特别是树突细胞，
c.膜囊富集步骤，和
d.使用密度垫离心分离膜囊。
·制备膜囊的方法，包括：
a.获得不成熟的树突细胞群，
b.在允许由不成熟的树突细胞释放膜囊的条件下，培养该不成 熟的树突细胞群，
c.膜囊富集步骤，并
d.使用密度垫离心分离膜囊。
如上所述，可在该方法中引入以一种或多种特定抗原致敏囊(或 产生细胞)的额外步骤，可在步骤b)之前致敏产生细胞，或在步骤b) 之后直接致敏膜囊。
关于这一点，本发明公开直接装载外来体的程序，特别是在从抗 原呈递细胞培养物中预制备和纯化的外来体上直接将免疫原性化合物 (如肽或脂)掺入到MHC复合体内。根据本发明的方法，对于在从 不成熟的树突细胞培养物中预先纯化的帝萨体上直接将肽装入到MHC (第I类)复合体内，是特别有利的。
如上所述，将与第I或第II类HLA结合的肽装入衍生自树突细 胞的外来体(帝萨体)内，到目前为止通过间接装载已经接近，即在 产生囊的细胞的培养物中(例如在GM-CSF和IL-4存在下，从富含 单核细胞的粘着细胞中分化出的树突细胞(DC))，加入治疗性(抗原性) 肽(例如第I类限制的肿瘤肽)(例如在第6天，以10微克/毫升) (参见例如美国专利第5,846,827号及其引用的参考文献)。假定DC 吸收外源肽，并由此产生在外来体表面上藏匿有这些第I类肽的帝萨 体。利用鼠科动物P1A肥大细胞瘤肿瘤模型的体内实验显示以此方式 产生的帝萨体诱发抗-肿瘤的免疫学反应，其导致肿瘤退化。将Mart-1 肽间接装入帝萨体内，亦可刺激从Mart-1特异的CTL纯种系LT11中 IFN-γ的少量分泌，这暗示确实发生了某种程度的肽装载。然而，即使 使用一种与放射线检测灵敏度相似的生化方法时间分辨萤光分析 (fluorometry)(TRF)，仍不易检测到这些帝萨体上的第I类肽的 结合。
为了改善方法的效率和工业上实施，发明人目前已惊人地发现有 可能直接进行装载步骤，其中在从DC培养物中纯化出帝萨体之后， 再将肽加至其上，以代替将肽加至DC培养物中的步骤。特别是发明 人目前已经发现，可开发并限定选择的酸性培养基或缓冲液，以便保 护膜囊并允许将免疫原性化合物在该膜囊的表面处直接装入抗原呈递 分子，特别是MHC分子，如第I类、第II类或CD1分子。
因此，本发明的特定目的亦在于制备免疫原性膜囊的方法，所述 方法包括从生物样品中分离或纯化膜囊，并使所述分离或纯化的膜囊 在允许免疫原性化合物与抗原呈递分子(例如，对肽而言为MHC第I 类或第II类，对脂质抗原而言为CD1)结合的条件下，在所述膜囊的 表面上与免疫原性化合物(例如肽或脂质)接触。
在优选的具体实施方案中，该方法包括在使该膜囊与免疫原性化 合物接触之前、期间或之后使分离或纯化的膜囊暴露在选择的酸性培 养基下进行处理的步骤，以便能够或促进其装载。关于这一点，按照 在本申请中的公开，使用选择的酸性培养基或处理允许至少部分地去 除结合在该囊表面上的内源肽或脂质，和/或有助于免疫原性化合物的 交换。
在更优选的具体实施方案中，在该囊与免疫原性化合物接触之后 接受离心或渗滤，优选是密度离心，以便去除未结合的免疫原性化合 物。
免疫原性化合物可以是例如任何肽或脂质，其存在于与抗原呈递 分子相连的免疫系统中。肽可以是第I类限制肽、第II类限制肽，单 独或带有其他肽的混合物或组合，或甚至是肿瘤细胞的肽洗脱物。本 发明特别适合装载有第I类限制肽。脂质可以是微生物脂质、微生物 糖脂，或脂质或糖脂的肿瘤抗原，采用分离形式或各种组合或混合物 形式。
直接装载方法提供胜过现有技术的显著优点。具体而言，如实施 例中所说的，直接肽装载比现有的间接装载更有效，使用较少量的肽 便可获得表面HLA受体的较高占有率。这明显增加了膜囊的免疫原 性潜力。此外，可更精确地控制被装载肽的结构，因为被装载的肽并 未由完整细胞加工处理过，因此在装载时仍维持完整且未被修改。本 发明现在首次显示使用纯化膜囊如帝萨体可进行直接的肽装载。关于 这一点，本发明显示将膜囊放在低pH的条件下，不会丧失其活性和 功能性。本发明亦描述允许改善直接装载的特殊条件。本发明特别显 示用于间接装载(即整个细胞装载)的传统缓冲液培养基可被不同缓 冲液培养基有利地取代以便增加直接装载效率并获得较高占有率，这 说明囊的行为并不像整个细胞一样。
在优选的具体实施方案中，本发明针对制备包括与HLA第I类 分子结合的外源第I类肽的免疫原性膜囊的方法，该方法包括(i)使 分离或纯化的膜囊暴露在选择的酸性培养基下，(ii)使所述分离或 纯化的膜囊与第I类限制肽在允许该肽与在所述膜囊表面上的HLA第 I类分子复合的条件下接触，和(iii)收集被装载的膜囊。述语“外源 的”一词意指被加至组合物中的肽。
在特定的变体中，该方法包括下列步骤：(i)使分离或纯化的 膜囊暴露在选择的酸性培养基下，(ii)使所述分离或纯化的膜囊与 第I类限制肽，在β2-微球蛋白的存在下，在允许该肽与在所述膜囊表 面上的HLA第I类分子复合的条件下接触，和(iii)收集被装载的膜 囊。更优选的是，步骤(i)包括使分离或纯化的膜囊暴露在pH大约 3到5.5之间的酸性培养基下，更优选的是在大约3.2到4.2之间，历 时少于5分钟。因为允许有效率的装载，即使是在仅使用很少量的免 疫原性化合物情况下，在β2-微球蛋白存在下进行直接装载的步骤是有 利的。确实，在使用β2-微球蛋白时，发明人已经显示有可能使用限定 的酸性培养基，其基本上从膜囊中去除所有内源肽，并因此有利于功 能性MHC复合体的复溶，即使是利用低水平的免疫原性化合物(例 如从0.005至50微克/毫升)。因此，这个步骤特别适合肿瘤洗脱物、 脂质、天然抗原或其他不能以高产经济(例如通过合成)产生的免疫 原性化合物的直接装置。
在可获得较高量的免疫原性化合物的情况下，发明人已经限定第 二个共同直接装载的步骤，其中不需要β2-微球蛋白。该具体实施方案 是有利的，因为需要较少的处理(而得以不改变外来体)，且不需要 外源β2-m，这可降低该方法的成本和加入外源物质的潜在缺陷。在这 方面，在另一个特定的变体中，该方法包括下列步骤：(i)使分离或 纯化的膜囊在缺乏β2-微球蛋白下与第I类限制的免疫原性化合物(如 肽或脂质)接触，(ii)使(i)的混合物在允许该免疫原性化合物与 任何内源化合物交换的条件下，暴露在选择的酸性培养基下或进行处 理，所述内源化合物与在该膜囊表面上的HLA第I类分子结合。(iii) 中和该培养基，终止交换和/或使在(ii)中形成的复合体稳定，和(iv) 收集被装载的膜囊。更优选的是，步骤(ii)包括使混合物暴露在pH 大约4到5.5之间的酸性培养基中一段时间，足以在任何内源分子和 免疫原性化合物之间产生交换用于结合MHC复合体。确实，发明人 现在已经显示，与整个细胞形成对照，膜囊可抵抗延长暴露在酸性培 养基或条件下，因此允许通过任何所需的免疫原性化合物来置换内源 分子，而不改变或使MHC分子失去稳定性，且基本上不会降解或去 除内源β2-m。发明人亦已经限定特定的酸性培养基和条件，允许进行 该交换作用，而不改变膜囊的功能性。这些选择的培养基最特别的特 征在于pH在大约4至5.5之间，更优选在4.2到5.2之间。将膜囊优 选与上文选择的酸性培养基接触15分钟以上的时间，但通常2小时 以下，更优选1小时以下。根据此变体，该方法不包括使用β2-微球蛋 白，通过所需肽与内源肽之间的交换而发生装载，不释放内源β2-m。 在不含β2-微球蛋白的具体实施方案中，分离或纯化的膜囊通常是与过 量的外源免疫原性化合物，例如5至500微克/毫升的第I类限制肽或 脂质，在缺乏β2-微球蛋白下接触。该具体实施方案特别适合可大量获 得的免疫原性化合物的装载，如通过合成产生的肽。
如上所述，可使用各种免疫原性分子来实施该方法。肽优选是由 第I类或第II类分子提供的肽，即起因于由抗原呈递细胞如树突细胞、 巨噬细胞和B淋巴细胞加工处理抗原而产生的肽。优选类型的肽的代 表是第I类限制肽，更优选的是第I类限制的肿瘤肽，也就是衍生自 肿瘤抗原的肽，其由树突细胞或巨噬细胞提供给免疫系统。特定的肽 包括例如HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-B35或其他 单元型限制的肿瘤肽，得自各种肿瘤细胞或抗原，如Mage、Bage、Mart、 CEA、PSA等。当然可使用分离的肽或其混合物实施该方法，如肿瘤 细胞的肽洗脱物或其他肽组合。亦可根据本发明装载衍生自其他病原 体(病毒、细胞、寄生虫等)的抗原肽，而得以产生适合用来治疗各 种疾病状况的免疫原性膜囊，例如癌症、感染或免疫疾病。
脂质可以是任何在抗原呈递细胞表面上由CD1分子提供给免疫 系统的脂质、糖脂或脂蛋白。CD1分子是类似MHC的分子，负责将 脂质或糖脂抗原呈递给T细胞。已经描述了CD1的数种同型物，包 括CD1a、CD1b、CD1c、CD1d和CD1e，其涉及提供脂质抗原。在 特定的具体实施方案中，使用该方法将脂质抗原装载到膜囊表面上的 CD1分子处，特别是装载到CD1b和CD1d处。脂质可以是任何微生 物脂质、微生物糖脂、脂质或糖脂肿瘤抗原等。脂质的更优选例子包 括分枝杆菌脂质，如分枝菌酸、葡萄糖单分枝菌酸酯、己糖-1-磷酸类 异戊二烯和脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan)(LAM)的衍生 物，如磷脂酰肌醇甘露糖苷。其他例子包括神经酰胺本身，如神经节 苷脂、糖脂肿瘤抗原等。
本发明的特定具体实施方案包括：
-制备免疫原性膜囊的方法，包括：
b)在允许由抗原呈递细胞特别是树突细胞释放膜囊的条件下， 培养该抗原呈递细胞群特别是树突细胞，
c)膜囊富集或纯化步骤，和
d)使该膜囊与免疫原性化合物在允许该免疫原性化合物与在膜 囊表面上的MHC分子结合的条件下接触，以产生免疫原性膜囊。
-制备免疫原性膜囊的方法，包括：
a.获得不成熟的树突细胞群，
b.在允许由该不成熟的树突细胞释放膜囊的条件下，培养不成 熟的树突细胞群，
c.膜囊富集或纯化步骤，和
d.使该膜囊与免疫原性化合物在允许该免疫原性化合物与在膜 囊表面上的MHC分子结合的条件下接触，以产生免疫原性膜囊。
-制备免疫原性膜囊的方法，包括：
a.获得不成熟的树突细胞群，
b.在允许由该不成熟的树突细胞释放膜囊的条件下，培养不成 熟的树突细胞群，
c.膜囊富集或纯化步骤，和
d.使该膜囊与脂质抗原在允许该脂质抗原与在膜囊表面上的 CD1分子结合的条件下接触，以产生免疫原性膜囊。
如上所述，优选进行富集或纯化以及直接装载。
本发明的特定具体实施方案在于制备膜囊的方法，包括：
a.获得抗原呈递细胞群，更优选的是不成熟的树突细胞，
b.视需要用一种或多种抗原致敏该抗原呈递细胞，更优选的是 不成熟的树突细胞，
c.在允许由该抗原呈递细胞释放膜囊的条件下，更优选的是不成 熟的树突细胞，培养抗原呈递细胞群，更优选不成熟的树突细胞，
d.培养物上清液的澄清，
e.经过澄清的上清液的浓缩，
f.经过浓缩的上清液的渗滤，
g.使用密度垫离心，分离膜囊，
h.视需要使该膜囊与肽接触，以产生装载肽的膜囊，和
i.减菌过滤在步骤g中获得的膜囊。
减菌过滤步骤i)之前可以有缓冲液交换步骤，例如通过渗滤。 图1描述典型的方法计划。在上文方法中，可进行步骤b)或步骤h)。
此外，本发明亦提供从各种培养基或组合物中去除颗粒体的方 法。更具体而言，本发明证实传统的培养基含有颗粒体，如结合珠蛋 白和相关聚合物(例如结合珠蛋白凝集物)，并公开去除相同物的方 法。更广泛而言，该方法允许生产培养基或任何其他生物产品，如血 液蛋白质或多肽(或其衍生物)、制配溶液、胎牛血清等，其基本上 丧失了结合珠蛋白凝集物。
结合珠蛋白凝集物可显示出免疫抑制活性，并因此影响膜囊或其 他生物产品的生物特性、安全性和纯度，在下文中进一步证明。然而， 在本领域中并未提出颗粒体的问题，也未确定它们出现在各种生物产 品中，而且未获得有效去除它们的方法。现在，本发明提供制备高质 量的生物产品的有效方法，所得产物亦代表本发明的目的。
关于这一点，本发明通常在于包括基本上不含颗粒体的哺乳动物 细胞培养基的组合物，更优选的是不含结合珠蛋白凝集物。
本发明亦在于丧失了结合珠蛋白凝集物的细胞培养基。
本发明更在于在具有降低颗粒体含量的培养基中包括抗原呈递细 胞(或任何其他生产膜囊的细胞，特别是树突细胞)的物质的组合物， 更具体而言，其基本上不含结合珠蛋白凝集物。更优选的是，该培养 基是经过处理去除颗粒或凝集化合物的培养基，更具体而言，是通过 超滤处理的培养基。
本发明另一方面在于使用具有降低颗粒体含量的培养物或生产培 养基来生产或培养抗原呈递细胞(或任何生产膜囊的细胞)特别是树 突细胞的方法。更优选的是，该培养基是基本上不含结合珠蛋白凝集 物的培养基，更具体而言，是通过超滤处理的培养基。
本发明亦适用于血液产品的组合物的生产，所述血液产品基本上 不含凝集的结合珠蛋白，并在将药物用途的产品制配之前，先以各种 缓冲液处理。
关于这一点，本发明亦涉及包括血液多肽或其衍生物的组合物， 其基本上丧失了结合珠蛋白凝集物。更具体而言，本发明在于包括热 灭活的血液产品的组合物，其基本上丧失了结合珠蛋白凝集物。更优 选的是，本发明涉及(热灭活的)血清-白蛋白的组合物，更优选的是 人类的血清-白蛋白，基本上不含凝集的结合珠蛋白。
本发明亦在于处理生物产品的方法，更优选的是热灭活的生物产 品，以便降低其中所含有的结合珠蛋白凝集物的含量，该方法包括使 该产品接受过滤，更优选的是超滤。
本发明的特定目的亦在于制备生物产品的方法，包括(i)生物 产品的热灭活和(ii)该热灭活的生物产品的过滤。更优选的是，该 方法尚包括下列步骤(iii)浓缩该经过过滤、热灭活的生物产品，和/ 或(iv)其调整。该方法可用于各种生物产品中，包括从诸如人类血 液或血浆或血清的哺乳动物生物流体中分离出(或萃取出)的任何蛋 白质或多肽(或其衍生物)。如同将在本申请中进一步证明，该方法 首次允许生产具有降低结合珠蛋白凝集物含量的热灭活的生物产品， 更优选的是基本上不含结合珠蛋白凝集物，并因此将增加安全性。该 方法特别适合制备从血液或血浆中萃取出的药物蛋白质，如血清-白蛋 白，更优选的是人类血清-白蛋白，γ免疫球蛋白、凝固因子等。
本发明亦在于处理血清制品的方法，更优选的是胎牛血清制品， 以便降低其中所含有的结合珠蛋白凝集物的含量，所述方法包括使该 制品接受过滤，更优选的是超滤。
如同将在下文中进一步证明，术语“基本上不含”表示组合物或 培养基含有低于大约1ppm的结合珠蛋白凝集物，更优选的是低于大 约0.5ppm，甚至更优选的是SDS PAGE分析和定量ELISA无法检测 的结合珠蛋白凝集物。
本发明另一方面在于分析或鉴别在制品中的膜囊特征(或确定剂 量)的方法，以便确定其表型和/或活性和/或含量。
更具体而言，本发明一方面在于鉴别膜囊特征的方法，其包括使 膜囊平行地与两种或多种对该膜囊的标记成分特异的抗体接触，并确 定抗原-抗体免疫复合体的形成。
另一特定的方面包括鉴别膜囊制品的活性特征，包括在辅助细胞 存在下使超-抗原-装载的囊与T细胞接触，并确定T细胞的活化作用。
本发明亦提供在样品中确定膜囊剂量的方法，包括(i)将样品 装载在固相支撑物上，(ii)使该支撑物与抗-第II类抗体(或其他相 关抗体)接触，和(iii)确定抗体-抗原免疫复合体的存在。
本发明亦包括组合物，所述组合物包含(i)膜囊，(ii)缓冲剂 和(iii)冷冻保护剂(cryoprotectant)或稳定化合物。
本发明亦包括药物组合物，所述药物组合物包含免疫原性膜囊和 可药用的稀释剂或载剂，其中通过直接装载，例如通过从含有抗原呈 递细胞(例如树突细胞)的生物样品中分离膜囊，并将免疫原性化合 物装入该分离的膜囊中，并且优选去除未结合的免疫原性化合物(有 利地通过密度离心或渗滤)，从而获得该免疫原性膜囊。优选的组合 物包括免疫原性膜囊，其中在该囊表面上的HLA分子至少有15％， 优选有至少30％，更优选有至少40％已经装载了外源肽或脂质。
本发明亦包括制备药物产品的方法，所述药物产品包含免疫原性 膜囊和可药用的稀释剂或载体，其中该方法包括(i)从生物样品(例 如含有抗原呈递细胞(例如树突细胞))中分离膜囊，(ii)以免疫 原性化合物装载分离的膜囊，产生免疫原性膜囊，(iii)优选去除未 结合的免疫原性化合物(有利地通过密度离心或渗滤)，和(iv)使 该免疫原性膜囊与可药用的稀释剂或载体接触。
本发明另一方面包括试剂盒、诊断测定、膜囊的组合物、制备膜 囊的装置或装载抗原的抗原呈递细胞(如树突细胞)或膜囊。
这包括在受试对象中产生免疫反应的方法，包括(i)获得含有 树突细胞的生物样品，(ii)从该生物样品中分离或纯化膜囊，(iii) 使该纯化的膜囊与免疫原性化合物在允许该免疫原性化合物与在膜囊 表面上的MHC分子结合的条件下接触，和(iv)给受试对象施用(iii) 的膜囊，以便在该受试对象中产生免疫反应。该受试对象优选是人类， 虽然亦可考虑兽医用途。
本发明特别适合制备帝萨体(即由树突细胞产生的膜囊)或特萨 体(即由肿瘤细胞产生的膜囊)，更具体而言是人类来源的。这些膜 囊用于各种实验、生物、治疗、诊断或预防的应用中。具体而言，膜 囊可用来调节受试对象中的免疫反应，尤其是在如癌症、自身免疫疾 病、过敏、气喘、炎症反应等的病理症状中。
图1自身帝萨体分离和纯化的特定方法的综述。
图2在第5天时，在CMV pp65 HLA-A2限制肽的存在下培养 DC。在第7天时收集帝萨体并纯化。然后在HLA-A2阳性或HLA-A2 阴性DC的存在下，将经过纯化的CMV肽-脉冲的帝萨体加至CMV pp65HLA-A2限制的T细胞系中。以ELISPOT形式进行细胞培养，其 中以对IFN-γ特异的抗体包被培养孔，并以T细胞活化的测量值列举 特异性地分泌该细胞因子的细胞存在。
样品如下：
1.T+A2+DC+外源的/A2+DC/无肽
2.T+A2+DC+外源的/A2+DC/CMV肽
3.T+A2-DC+外源的/A2+DC/无肽
4.T+A2-DC+外源的/A2+DC/CMV肽
通过比较样品2与样品1，可看出T细胞对帝萨体的特定肽反应， 并证明刺激是由于肽被掺入到帝萨体中，并且通过比较样品4与样品 3，说明并非由于游离肽直接刺激DC。
图3在通过500kDa(MWCO)中空纤维膜超滤处理之前和之后， AIM V培养基的SDS-PAGE。以100,000xg超速离心1小时，使AIM V 和UF-处理的AIM V形成沉淀。抛弃上清液，并将沉淀区重悬浮于PBS 中，第2次以100,000xg重超速离心1小时。将沉淀再悬浮于千分之 一原始体积的PBS中。在8-16％丙烯酰胺凝胶上进行20微升沉淀(还 原条件)的电泳，随后以胶状的考马斯蓝染色。
图4在通过500kDa(MWCO)中空纤维膜的超滤处理之后3个 月，AIM V培养基的SDS-PAGE。以100,000xg超速离心1小时，使 UF-处理的AIM V形成沉淀。抛弃上清液，并将沉淀区重悬浮于PBS 中，第2次以100,000xg重超速离心1小时。将沉淀再悬浮于千分之 一原始体积的PBS中。在8-16％丙烯酰胺凝胶上进行20微升沉淀(还 原条件)的电泳，随后以胶状的考马斯蓝染色。
图5利用3/0.8微米胶囊滤纸的微滤系统的图解。
图6图解：使用中空滤芯系统超滤澄清的组织培养上清液。
图7在利用500kDa中空纤维膜以PBS渗滤之前和之后，含有 帝萨体的浓缩组织培养上清液的SDS-PAGE。样品以5倍体积的PBS 渗滤。在由30％蔗糖/Tris D2O缓冲液组成的密度垫上，通过超速离心 进一步纯化渗滤之前和之后的帝萨体。描述每个被分析样品的倍比浓 度。在8-16％丙烯酰胺凝胶上，进行20微升沉淀(还原条件)的电泳， 随后以胶状考马斯蓝染色。
图8a浓缩帝萨体在30％蔗糖/Tris D2O密度垫(密度＝1.190-1.210 克/毫升)内的超速离心-样品制备。
图8b从由30％蔗糖/Tris D2O缓冲液组成的密度垫上超速离心帝 萨体中收集样品。以制配缓冲液将沉淀重悬浮成其千分之一的原始体 积。
图9a在由30％蔗糖/Tris D2O缓冲液组成的密度垫上超速离心之 后收集到的帝萨体部分的SDS-PAGE。所有样品均标准化成其二十一 分之一的原始体积。部分如下：泳道1-超滤之后/超速离心之前，泳道 2-UC密度垫部分，泳道3-在垫底部的UC沉淀/复溶成其千分之一的 原始体积，泳道4-典型沉降法获得的UC沉淀/复溶成其千分之一的原 始体积，以及泳道5-在垫上方的UC。
图9b在以100,000xg超速离心1小时之后，蔗糖/D2O密度垫的 不同部分的HLA/DR ELISA。在垫以上未观察到HLA/DR，大约10％ 的信号在复溶的沉淀中(千分之一)，而90％在垫中。
图10帝萨体的SDS-PAGE和在PBS制配缓冲液中的渗滤。通 过以100,000xg超速离心1小时沉降，进一步浓缩帝萨体。以PBS复 溶沉淀至二千八百分之一的起始上清液体积。将3.3微升的帝萨体(还 原条件)装载到8-16％丙烯酰胺凝胶上，接着以胶状考马斯蓝染色。
图11外来体的ELISA。通过超速离心形成沉淀或通过在密度垫 溶液(30％蔗糖/20mM Tris在D2O中)上超速离心，纯化外来体。至 于比较，在相等的细胞培养相等物处使用DC溶胞产物。以无脂干奶 粉阻断非特异性结合位置，并通过特异的mAb检测CD81(图11a) 和HLA-DR(图11b)，接着利用与辣根过氧化酶结合的二级抗体检 测。采用化学发光检测将样品定量，并以细胞培养相等物的函数作图。
图12帝萨体制品的HLA/DR(图12a，b)和MHC I(图12c，D) ELISA。采用前述方法制备帝萨体制品。通过过滤使细胞培养物上清 液(3.7升)澄清，超滤浓缩，在蔗糖/D2O密度垫上超速离心浓缩， 并通过超滤/渗滤利用缓冲液交换浓缩。将体积标准化，表示100×原 始上清液体积的浓缩(1微升相等物＝1毫升上清液)。
图12a以过量外来体滴定抗-HLA/DR。图12b以过量抗-HLA/DR 滴定在垫(UC-垫)中超速离心之后以及在制配缓冲液(第2次UF) 渗滤之后的帝萨体。图12c以过量帝萨体滴定抗-MHC(HC-10杂交 瘤)。图12D以过量抗-MHC I滴定帝萨体A和B。
图13图13a：帝萨体对于特异表面受体的流式细胞仪分析。有 阴影的柱形图解释以萤光标记的抗体识别提及的受体的结合的特异强 度，而空心的柱形图显示无关的背景结合。图13b：如同图13a，除 了使用未标记的一级抗体并随后以萤光标记的二级抗体进行染色之 外，因为未获得作为直接萤光结合物的乳粘附素(lactadherin)抗体。
图14使用SEE-脉冲的帝萨体的超抗原测定。按照在实例中的描 述以SEE纯化和脉冲帝萨体，然后与Jurkat T细胞和Raji细胞一起温 育。用ELISA测量IL-2的产生，并以由HLA-DR ELISA测定确定的 每孔HLA-DR分子数的函数作图。采用S形曲线使数据合格，并根据 帝萨体制品的效力的测量，衍生计算的半数最大有效剂量(ED50)。
图15帝萨体的稀释量(在附图说明中出示)以SEE脉冲，并与 Jurkat和Raji细胞一起培养，来测试Dex制品的效力。在从Optiprep 垫中回收之后，使每个样品接受连续滴定，并在细胞测定中测试。数 据显示在每个帝萨体制品的稀释度修正之后，记录相同程度的活性， 如果看到曲线对于0.7微升至50微升的外来体范围记录到接近半数最 大活性(接近350皮克/毫升IL-2)，这代表在接近100倍的范围内测 定是线性的。测定结果令人意外，使得该测定在测量大范围浓度的未 知帝萨体制品时是极为有用的。
图16通过形成沉淀和区带超速离心纯化的外来体/SEE复合体的 HLA/DR ELISA比较。
图17与HLA-A2+(上方)和HLA-A2-(下方)帝萨体结合的 肽。以由装载帝萨体的说明所指示的浓度，使用生物素酰化的参考肽。 在y-轴上，以Eu萤光(每秒计数)来表示肽结合的含量，作为帝萨 体溶胞产物测定量的函数(在x-轴上，以微升体积表示。)
图18利用不同的缓冲液和pH值的肽装载。使用pH3.2-5.2的醋 酸或柠檬酸缓冲液，装载生物素酰化的参考肽。在y-轴上，以Eu萤 光计数来表示肽装载的量。
图19以pH4.2醋酸钠缓冲液的弱酸处理的帝萨体比pH4.2柠檬 酸处理的帝萨体保留了更佳的功能活性。
以柠檬酸(缓冲液A)或醋酸钠(缓冲液B)处理Dex，以‘SEE’ 超抗原脉冲，并在功能测定中测试，通过测量其诱发效应细胞分泌IL-2 的能力，从而评估对帝萨体生物活性的影响。在y-轴上，以帝萨体体 积为函数表示IL-2分泌。
图20β2-微球蛋白可促进直接的肽装载。利用浓度从0至80微 克/毫升的β2-微球蛋白，装载生物素酰化的参考肽。在y-轴上，以Eu 萤光(每秒计数)来表示肽结合的含量作为β2-微球蛋白浓度的函数。
图21参考肽与帝萨体结合的饱和度。以0-20微克/毫升的浓度 装载生物素酰化的参考肽。在y-轴上，以Eu萤光(每秒计数)来表 示肽结合的含量作为参考肽含量的函数。
图22与帝萨体结合的参考肽的动力学。在室温下，装载生物素 酰化的参考肽0.5至4小时。在y-轴上，以Eu萤光(每秒计数)来 表示肽结合的含量作为参考肽与帝萨体的温育时间的函数。
图23未标记的参考肽、MAGE3、4和10与生物素酰化的参考 肽对帝萨体的结合竞争。将1-100倍未标记的参考肽、MAGE-3、4和 10与生物素酰化的参考肽(5微克/毫升)一起温育，以便竞争对帝萨 体的结合。在y-轴上表示的抑制百分比作为竞争肽的数量的函数。
图24使用装载Mart-1的帝萨体的T细胞纯种系测定。
图25使用装载P1A的帝萨体的T细胞纯种系测定。R&D为100 单位的IL-2标准测定。
图26在缺乏β2微球蛋白的情况下，比较在pH4.8和5.2的醋酸 缓冲液中以生物素标记的参考肽与帝萨体的结合。在y-轴上，以Eu 萤光计数来表示肽装载的含量。
图27以pH4.8和5.2的醋酸钠缓冲液弱酸处理的帝萨体象未处 理的帝萨体一样保留了相同的功能活性。以pH4.8或5.2的醋酸钠(缓 冲液A)处理Dex，以‘SEE’超抗原脉冲，并在功能测定中测试， 通过测量其从效应细胞中诱发IL-2分泌的能力，来评估对帝萨体生物 活性的影响。在y-轴上以帝萨体体积为函数来表示IL-2的分泌。
图28 MAGE 4和10与生物素酰化的参考肽对帝萨体的结合的竞 争。将5-20倍的MAGE-4和10与100微克/毫升的生物素酰化的参考 肽一起温育，以便在pH4.8时缺乏β2微球蛋白的情况下竞争对帝萨体 的结合。在每栏的上方，以竞争肽含量为函数来表示抑制百分比。
图29 MAGE 3与生物素酰化的参考肽对帝萨体的结合的竞争。 将5-20倍的MAGE-3与100微克/毫升的生物素酰化的参考肽一起温 育，以便在pH4.8时缺乏β2微球蛋白的情况下竞争对帝萨体的结合。 在每栏的上方，以竞争肽含量为函数来表示抑制百分比。
图30在β2微球蛋白缺乏之下，通过装载Mart-1肽的帝萨体刺 激LT 11而分泌IFN-γ。通过装载Mart-1肽的帝萨体，在作为辅助细 胞的DC的存在下，刺激LT 11细胞，并在y-轴上以帝萨体为函数来 表示从LT 11中分泌的IFN-γ。以在β2微球蛋白的存在下pH4.2时亦 装载的Exo447作为对照。
图31在β2微球蛋白的存在下，HLA-A1限制肽的结合(上方方 格)和抑制(下方方格)。上方方格：HLA-A1限制、生物素标记的 肽MAGE-3C5特异性地与HLA-A1+帝萨体结合。下方方格：通过未 标记的MAGE-3A1肽抑制结合。
图32在缺乏β2微球蛋白的情况下，在HLA-A1/B35限制、生物 素标记的MAGE-3C5和未标记的MAGE-3A1/B35肽之间对HLA-B35+ 帝萨体(Exo 426)的竞争。
发明详述
如上所述，本发明提供制备和/或鉴别膜囊特征的新型方法和组 合物，其适用于药物领域，如各种病理学状况的免疫治疗。本发明亦 公开从组合物中去除结合珠蛋白凝集物的方法，如培养基、生物产品 及其类似物，其可用在各种药物或实验的范围中。
现在将提供各种步骤的详细说明，所述步骤根据本发明优选的特 定具体实施方案可被实施制备膜囊。应了解本发明并不限于包括所有 这些步骤的方法，还包括如同上文提及的单个步骤本身。
在图1中描述制备膜囊的完整方法的图解示意图。该通用方法包 含数个主要阶段，包括(i)生产含有膜囊的(生物)样品，(ii)富 集阶段，(iii)密度垫分离阶段，(iv)制配和调整阶段以及(v)质 量控制或鉴别特征的阶段。此外，本发明亦描述从诸如培养基的生物 物质中去除结合珠蛋白的方法。 结合珠蛋白凝集物的去除
本发明的特殊且重要的方面在于提供基本上不含诸如结合珠蛋白 (及相关聚合物)的颗粒体的组合物，更具体而言，为基本上不含结 合珠蛋白凝集物的组合物。本发明特别在于提供细胞培养基或生物产 品，如分离自生物流体的蛋白质或多肽(或其衍生物)(例如hSA组 合物、γ免疫球蛋白、凝固因子、血清等)或缓冲液制配，其基本上不 含凝集的结合珠蛋白。
结合珠蛋白是复合的(α-β)2四聚体蛋白质，以各种组合掺入两 种类型的α链、α-1(8.86kDa)和α-2(17.3kDa)。已经报告了在热 灭活血清产物后，结合珠蛋白可形成大的蛋白质凝集物(“Biological Functions of Haptoglobin-New Pieces to an OlD Puzzle”.W. Dobryszycka，Eur.J.Clin.Chem.Biochem.1997，35(9)，第647-654页； “Immunosuppressive Effect of Accute-Phase Reactant Proteins in vitro and its Relevance to Cancer”，R.Samak等，Cancer Immunol Immunother 1982，13，第38-43页)。此外，已知结合珠蛋白可显示出免疫原性活 性(Dobryszycka，同上，Oh等，J.National Cancer Institute 1990，82(11)， 第934-940页)。本发明现在认识到存在于许多生物产品中的结合珠 蛋白凝集物是非常重要的，并提出允许去除它的新型方法。
更具体而言，在本发明的上下文中，结合珠蛋白凝集物是指任何 包括结合珠蛋白多肽或链的颗粒体，更优选的是通过S-S结合与任何 其他多肽或蛋白质交联的颗粒体，例如，特别是结合珠蛋白多肽和白 蛋白的任何混合凝集物。这类结合珠蛋白凝集物亦可包括额外的组 份，如血红素结合蛋白、转铁蛋白(transferring)、Gc-球蛋白和/或β2- 糖蛋白，如同Jensen等(Vox Sang 67，1994，125)所描述。
虽然在研究和临床应用中常规使用培养基，但在本领域中未曾提 及大的可溶性蛋白质凝集物(或颗粒)的问题，亦未建议去除它们。 本发明现在显示，当通过超速离心形成沉淀时，得自AIM V的蛋白质 凝集物与帝萨体共同-纯化。此外，本申请亦显示在AIM V中通过超 滤产生的帝萨体的浓缩导致AIM V蛋白质的浓缩。再者，经过浓缩的 帝萨体的SDS-PAGE(图3)在42kDa和64kDa处显示2个主要的 条带，相当于结合珠蛋白的β-链和白蛋白。
因此，本发明证实在传统的哺乳动物细胞培养基中发现结合珠蛋 白凝集物(包括亚基、交联链、凝集形式等)。本发明进一步显示不 能借助传统的外来体纯化方法来去除结合珠蛋白凝集物。本发明现在 提供去除颗粒体的方法，更优选的是从诸如培养基、生物组合物、缓 冲制配等的生物物质中去除结合珠蛋白凝集物。本发明亦公开基本上 丧失了结合珠蛋白的物质的新型组合物及其用途。诸如结合珠蛋白凝 集物的大蛋白质凝集物的去除(或降低浓度)提供数个显著的优势， 如增加纯度、增加安全性、降低非特异的免疫抑制活性等。此外，本 发明亦公开不含凝集的结合珠蛋白的培养基仍允许有效的细胞培养和 外来体的生产，同时大大地促进了外来体的纯化。从培养基中去除蛋 白质凝集物，提供免于对血清组份如结合珠蛋白诱导不想要的免疫反 应的额外保护(Dobryszycka，同上)。关于这一点，人们认为结合珠 蛋白凝集物比已知是免疫抑制性的非凝集结合珠蛋白可引起更多的不 想要的免疫反应(Se-Kyung Oh等，J.Natl Cancer Inst.1990，82，934- 940，Interference with immune response at the level of generating effector cells by tumorassociated haptoglobin)。已知蛋白质凝集物具有比可溶 形式高出10,000(一万)倍的免疫原性，因为它们优先被抗原呈递细 胞捕捉(M.Kovacsovics-Bankowski等Proc Natl Acad Sci USA 1993，90， 4942-4946，Efficient major histocompatibility complex class I Presentation of exogenous antigen upon phagocytosis by macrophage)。所以，即使 以极低剂量存在，结合珠蛋白凝集物仍可能是有害的。
此外，本发明的方法亦允许去除其他颗粒体，如外来体，其可存 在于含有血清的培养基中。去除先存的外来体进一步增加了产物的纯 化，并避免被其他的免疫-刺激剂污染。 去除方法
根据本发明，可使用各种方法去除颗粒体(例如蛋白质凝集物， 更具体而言为结合珠蛋白凝集物)，如(超)过滤、微滤、尺寸排阻 层析法(SEC)、亲和层析法、离子交换层析法和超速离心。亦可能 通过这些方法，在利用培养基制配之前，先去除在人类血清组份中的 蛋白质凝集物(也就是部分V)。
在优选的具体实施方案中，通过超滤处理培养基或组合物，以便 去除蛋白质凝集物或其他颗粒体，更具体而言，为凝集的结合珠蛋白。
在特定的具体实施方案中，使用500kDa中空纤维膜进行超滤。 对该应用而言，这是优选的截留分子量(MWCO)，因为需要使诸如 转铁蛋白(大约75-80kDa)的蛋白质通过该膜。由ELISA测量转铁 蛋白的浓度显示它定量地通过了该大小的孔。该膜的尺寸将蛋白质凝 集物保留在存留物(retentate)中，而允许未凝集的蛋白质与滤液 (permeate)一起通过。收集滤液，通过0.22微米的滤纸灭菌过滤至 瓶中，并储存在4℃下至使用为止。
虽然500kDa MWCO的中空纤维膜对培养基的超滤是优选的， 但亦可使用其他尺寸的膜，如750kDa、300kDa、100kDa等。优选 直径在100kDa至1000kDa之间的膜来超过滤培养基，更优选的是在 200kDa到750kDa之间。关于这一点，申请人通过动态光散射测定， 现在已确定存在于培养基或其他生物产品如加热过的血清白蛋白中的 结合珠蛋白凝集物，90％直径在大约40纳米到大约200纳米之间。因 此，任何孔径低于大约40纳米的膜(或其他分离装置，如滤纸、中 空纤维等)都将是适合和优选地进行本发明。举例来说，500kDa的 MWCO代表孔径在大约20-25纳米之间。
同样，虽然中空纤维膜形式是超滤的优选具体实施方案，但亦可 以卡匣形式使用其他类型的超滤装置(也就是平板或框架的卡匣)， 如Millipore Pelicon和相关产品，以及得自Sartorius Inc或Filtronics Inc 的卡匣。膜的材料通常是由聚醚碸(PES)所组成，然而亦可使用其 他的材料，如聚丙烯。
此外，在培养基超滤中可使用大范围的操作参数。最佳处理的操 作参数通常是进口和出口压力维持在5-15psi之间。在处理过程中可 使用较低或较高的压力。
在另一特定的具体实施方案中，通过微滤(0.05微米、0.1微米、 0.2微米等)处理培养基以去除颗粒体(例如蛋白质凝集物)。优选 纤维的孔直径为0.5毫米，然而，亦可使用其他直径，如0.25毫米、 0.75毫米和1毫米。
这些各式各样的处理允许生产具有降低颗粒体含量的培养基或生 物产品，现在已经显示其可显著促进外来体的纯化以及所得制品的质 量。 不含凝集的结合珠蛋白的培养基
因此，在特定方面，本发明在于使用预处理的具有降低的颗粒体 含量的培养基，以及包括这类预处理的培养基的物质的组合物。确实， 目前已显示经预处理降低颗粒蛋白质(或蛋白质凝集物)含量的培养 基，显著降低了在该方法中出现的污染，增加该方法的效率，允许以 较高的纯度和安全性来生产外来体制品，而且不影响培养效力或细胞 的存活力。
因此，在本发明特定的具体实施方案中，通过培养在具有降低颗 粒体(或蛋白质凝集物)含量的培养基中的细胞所生产的生物样品来 制备膜囊。
此外，本发明的另一目的在于生产树突细胞的方法，包括在含有 生长因子和/或细胞因子的培养基中培养树突细胞前体，从而影响或刺 激该前体分化成树突细胞，特别是分化成不成熟的树突细胞，其中该 培养基具有降低的颗粒体含量，更优选是基本上不含结合珠蛋白凝集 物。
本发明亦在于包括在具有降低颗粒体含量，如结合珠蛋白凝集物 含量的培养基中树突细胞的组合物(或任何其他产生膜囊的细胞)， 更具体而言，是在基本上不含凝集的结合珠蛋白的培养基中。
培养或生产培养基可以是任何适合培养哺乳动物细胞的培养基， 特别是人类细胞的培养基。这类培养基的例子包括AIM V、RPMI、 DMEM及其类似物，更广泛而言，为任何包括蛋白质(或其血清或取 代物)的哺乳动物细胞培养基。优选的培养基包括不含血清的培养基， 其适合临床用途。
术语“基本上不含”、“丧失了”或“降低结合珠蛋白凝集物的 含量”表示该培养基或产物按凝集的结合珠蛋白的重量计优选含有低 于1ppm的结合珠蛋白凝集物，更优选的是低于0.5ppm。更具体而言， 通过SDS PAGE和ELISA，目前申请人已确定可从生物产物如AIM V 培养基中去除99％以上的结合珠蛋白凝集物。更具体而言，培养基基 本上缺乏具有直径超过100纳米的颗粒体(包括蛋白质凝集物、沉淀 物及其类似物)。在进一步优选的具体实施方案中，培养基基本上缺 乏不能通过500kDa膜的颗粒体(包括蛋白质凝集物、沉淀物及其类 似物)。本发明更优选的培养基是由ELISA确定(使用例如Sigma的 单克隆抗体H6395)的含有低于大约20纳克/毫升，更优选的是低于 大约10纳克/毫升的凝集的结合珠蛋白的培养基。此外，应注意的是 结合珠蛋白凝集物的存在通常不显著，直到培养基被浓缩时(通过超 速离心或超滤)才会显著。因此，本发明的优选培养基不含有如被SDS PAGE分析和ELISA测量到的结合珠蛋白凝集物。 不含凝集的结合珠蛋白的生物产品
本发明亦适用于生产基本上不含凝集的结合珠蛋白的生物产品 (例如血液产品)的组合物，以及在将产品制配用于药物用途之前， 先用来处理各种缓冲液。
关于这一点，本发明涉及包括生物多肽或其衍生物的组合物，其 基本上丧失了结合珠蛋白凝集物。更具体而言，本发明在于包括热灭 活的生物多肽的组合物，其基本上丧失了结合珠蛋白凝集物。该生物 多肽可以是任何从哺乳动物生物流体中，特别是从血液、血清或血浆 中分离(或萃取)出的多肽、蛋白质或肽。生物多肽的优选例子包括 血清-白蛋白、γ免疫球蛋白、凝固因子(例如因子VIII、因子IX)， 更优选是它们来源于人类。本发明的组合物更优选其特征在于含有低 于大约0.01％的结合珠蛋白凝集物，特别是低于大约0.001％。
在特定的例子中，本发明涉及热灭活的血清-白蛋白的组合物， 更优选的是人类血清-白蛋白，所述组合物基本上不含凝集的结合珠蛋 白。纯化的hSA被广泛用于药物工业上(血浆补体、蛋白质稳定剂等)。 经证实存在于hSA溶液中的结合珠蛋白是造成热处理期间形成凝集物 的原因。而且，凝集的蛋白质似乎比其未凝集的形式具有高出至少一 万倍的免疫原性，使得它们的存在可能对于该制品的活性和安全性是 有害的。现在，本发明允许从hSA制品中去除任何这类的结合珠蛋白 凝集物，更具体而言，经过如上所述的超滤，由此为药物用途提供具 有高纯度和质量的新型hSA组合物。更具体而言，本发明现在提供按 重量(wt)计含有低于大约0.01％凝集的结合珠蛋白的hSA制品，更 优选的是低于大约0.001％wt。本申请中所述的特定例子证实利用本发 明可获得含有大约0.00025％wt或更少的凝集的结合珠蛋白的白蛋白 制品。更优选的是，本发明的白蛋白制品(或组合物)为经过加热的 hSA制品(或组合物)，特别适合药物用途。
本发明亦在于处理生物产品，更优选的是热灭活的生物产品，以 降低其中所含有的结合珠蛋白凝集物的方法，该方法包括使该产品接 受过滤，更优选的是超滤。
本发明的特定目的亦在于制备生物产品的方法，包括(i)生物产品 的热灭活，以及(ii)热灭活的生物产品的过滤。更优选的是，该方法尚 包括(iii)浓缩该经过过滤、热灭活的生物产品，和/或(iv)及调整的步骤。 该方法可用于各种生物产品，所述生物产品包括任何分离(或萃取) 自哺乳动物生物流体如人类血液或血浆或血清的蛋白质或多肽(或其 衍生物)。如同在本申请中将进一步证明，该方法首次允许生产具有 降低结合珠蛋白凝集物含量的热灭活的生物产品，更优选生物产品基 本上不含结合珠蛋白凝集物，并因此增加安全性。该方法特别适用于 制备从血液或血浆中萃取的药物蛋白质，如血清-白蛋白，更优选的是 人类血清-白蛋白、γ免疫球蛋白、凝固因子等。过滤步骤优选包括超 滤，更优选的MWCO是在大约100kDa到大约1000kDa之间，通常 是在200kDa到750kDa之间。可以上文公开的任何装置和条件进行 该过滤。此外，亦可使用上述的其他方法。
关于这一点，本发明亦涉及处理白蛋白制品的方法，包括使白蛋 白制品接受过滤，优选的是超滤。更优选的方法在于在平均孔径为200 kDa到750kDa之间的多孔装置上通过超滤处理加热的hSA组合物(或 制品)。因为在药物领域中使用大量的hSA，申请人的方法和高质量 的组合物代表在安全性上的显著优势。 样品的生产
如同上文指出，本发明涉及膜囊的生产，并适合从各种来源来制 备膜囊，包括由抗原呈递细胞(如巨噬细胞、树突细胞、B淋巴细胞)、 肿瘤细胞或任何产生膜囊的其他细胞或细胞系生产的膜囊。其特别适 合制备由树突细胞生产的膜囊，优选由不成熟的树突细胞(即帝萨体) 生产。此外，可在制备之前、期间或之后使膜囊或对应的生产细胞对 一种或数种抗原致敏。 单核细胞的细胞培养
WO99/03499已公开生产含有帝萨体或其他膜囊的生物样品的各 种方法，在此引作参考。
在本发明范围内的优选方法学是基于从单核细胞前体或骨髓中生 产树突细胞(“DC”)，更优选的是不成熟的DC。确实，发明人已 经显示不成熟的DC具有产生外来体的能力，而成熟的DC基本上无 法这样做。更具体而言，在本发明的范围内，优选使用在细胞因子组 合的存在下，更优选的是在缺乏DC成熟因子或条件之下，处理单核 细胞前体(包含在血液或骨髓中)和/或一段不允许DC成熟的期间而 获得的不成熟树突细胞的组合物。
不成熟树突细胞的组合物优选基本上包括(即至少60％，优选 70％)不成熟的树突细胞。
因此，树突细胞的制备步骤有利地包括制备不成熟树突细胞的组 合物，特别是人类来源的不成熟树突细胞，尤其是得自单核细胞前体， 更具体而言，是以诸如GM-CSF+IL-4或GM-CSF+IL-13的细胞因子 的组合在成熟因子缺乏之下和/或在不含血清的培养基中进行处理，以 避免其成熟。
此外，在本发明的范围内，亦可能使用无限增殖化的树突细胞群。 这些群可由无限增殖化的树突细胞系(例如D1系或任何其他通过在 树突细胞中导入例如myc致癌基因而产生的系)所组成。它们亦可由 体外制备并无限增殖化的树突细胞所组成。无限增殖化的树突细胞的 目的在于组成对给定抗原组致敏细胞库，其可在工业上用来制备适宜 给整个患者家族施用的帝萨体。
为了生产膜囊(帝萨体)，在本领域技术人员已知的传统条件下 可简单培养不成熟的树突细胞群。然而，优选是在刺激帝萨体产生的 条件下培养这些细胞，特别是在能够刺激帝萨体产生的因子存在下， 尤其是诸如γ干扰素、介白素10或介白素12的细胞因子(例如参见申 请WO99/03499)。在根据本发明方法的优选具体实施方案中，在刺 激膜囊产生的条件下培养不成熟的树突细胞群。预备实验显示在临床 前的小鼠肿瘤模型中加入干扰素γ促进了体内帝萨体的效力。在第7 天，收集培养基，进行后续的帝萨体分离。
在本发明特定的具体实施方案中，在一种不含血清的细胞培养基 的临床级AIM V(Life Technologies，Inc.)中培养患者的外周血液样 品。在使用之前，使培养基接受超滤，去除凝集的蛋白质(例如结合 珠蛋白)，申请人显示该凝集蛋白质的去除不影响细胞的生长，还很 有助于后续分离纯的帝萨体。
当然，可通过任何其他的方法制备膜囊并用于本发明中。具体而 言，膜囊可以人工产生，或利用无限增殖化的细胞系产生或从先前建 立的集合或库中获得。 细胞或囊的致敏：抗原装载
在膜囊产生之前(或期间)，可使产生膜囊的细胞对抗原致敏。 或者，可致敏膜囊本身。本具体实施方案允许产生具有给定免疫原性 的囊。可使用不同已熟知的技术进行致敏，包括例如使细胞与抗原性 肽、抗原、蛋白质复合体、表达抗原的细胞或细胞膜、细胞凋零体、 膜囊、脂质体、肿瘤RNA或编码一种或多种抗原、抗原决定簇或表 位的任何核酸(可能由病毒或非-病毒载体携带)等接触(例如参见申 请WO99/03499)。或者，可通过囊的直接肽装载，也就是通过使囊 与抗原性肽接触，来进行致敏。确实，本申请显示囊的直接肽装载是 可能的，并给该囊提供改良的免疫原性。在优选的方法中，通过将产 生细胞与肽、抗原、RNA或核酸一起温育，或通过囊的直接肽装载， 来进行致敏。当然本申请不限于致敏或生产技术。
通过使细胞(或囊)暴露在该抗原、对应的蛋白质、肽、核酸及 其类似物之下，可使用许多抗原致敏树突细胞(或膜囊)。优选的抗 原为肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原及其类似物。代表性的肿瘤抗原 包括黑色素瘤抗原(MAGE、MART、BAGE等)、前列腺特异的抗 原(例如PSMA)、CEA、ras、p53、Rb、肝脏肿瘤抗原等。
蛋白质抗原在树突细胞(“DC”)内部加工成特定的肽，然后 由MHC分子捕捉并呈递至细胞表面。对于给定的蛋白质，人类DC 的不同HLA单元型呈递不同的肽(表位)。通过在适当的条件下将 DC与肽一起温育，可将相关肽装载至MHC第I类的DC上。亦可能 体外直接将抗原装载在分离的帝萨体上。在特定的实施例中，为了用 于装载患者的帝萨体，合成包括HLA-A2的已知表位的MAGE-A3和- A4肽。在该实验中，患者的内含物标准包括HLA-A2单元型的表达。 HLA A2+单元型相对较频繁，大约有50％的人群存在。
此外，亦可加入对照抗原，如TT(破伤风毒素)和CMV肽，特 别是TT P2肽。对照抗原的目的是作为内在对照，以便利用已知抗原 测试帝萨体在抗原呈递上的功能。因此，作为阳性对照，亦利用例如 CMV肽(第I类)和TT P2肽(第II类)装载帝萨体。这些对照的 阳性反应显示帝萨体具有活性。CMV具有提供测试最初和回忆的抗 原反应两者的优点，因为大约50％的一般群体是对CMV具有免疫力 的(回忆的)，而剩下的则是幼稚的(最初的)。
其他的抗原是脂质抗原，如由CD1分子呈递给免疫系统的任何 脂质、糖脂或脂蛋白。脂质可以是任何微生物脂质、微生物糖脂、脂 质或糖脂的肿瘤抗原等。脂质的特定例子包括分枝杆菌脂质，如分枝 菌酸、葡萄糖单分枝菌酸酯、己糖-1-磷酸类异戊二烯和脂阿拉伯甘露 聚糖(LAM)的衍生物，如磷脂酰肌醇甘露糖苷。其他的例子包括神 经酰胺本身，如神经节苷脂、糖脂肿瘤抗原等。
下文的实施例3描述在树突细胞和帝萨体上装载和测定CMV肽 (抗原)的模型系统中获得的初步结果。结果证实经过装载的囊具有 刺激抗原特异的CTL的能力(图2)。
应了解在本发明中，可使用任何其他的致敏方法和抗原，以便鉴 别膜囊所需的免疫原性特性。
关于这一点，本发明也描述直接装载膜囊例如帝萨体的方法。可 使用第I类或第II类肽或脂质进行该方法，并提供胜过现有技术的显 著优点。特别如实施例中所说明，直接装载比现有的间接装载更有效 在于使用较低量的肽便可获得表面HLA受体的较高占有率。这明显 增加了膜囊的免疫原性潜力。此外，可更精确地控制已装载肽的结构， 因为被装载的肽并未由整个细胞加工处理，因此在装载后仍保持完整 和未经修饰。本发明现在首次提出并显示使用经过纯化的膜囊如帝萨 体可进行直接装载。关于这一点，本发明显示将膜囊置于低pH条件 下不会丧失其活性和功能性。本发明亦描述允许改善直接装载的特定 条件。本发明尤其显示利用不同缓冲液培养基可有利地代替间接装载 (即整个细胞的装载)所使用的传统缓冲液培养基，从而增加直接装 载的效率并获得较高占有率，这显示囊的行为并不像整个细胞一样。 本发明亦首次显示，与整个细胞对照，膜囊可抵抗延长的酸处理或培 养基，由此允许通过替换直接装载，即使是在缺乏加入β2-m的情况下。
在第一个变体中，直接肽装载的方法包括下列步骤：(i)使分离或 纯化的膜囊置于选择的酸性培养基下，和(ii)使(i)的膜囊优选在中和期 间或之后与选择的肽在β2-微球蛋白的存在下接触，以便将该肽装载到 该膜囊上。在进一步优选的具体实施方案中，选择的肽是由第I类分 子呈递的肿瘤抗原肽，也就是第I类限制的肿瘤肽。
在该第一个变体中，首先使膜囊(例如帝萨体)置于选择的酸性 培养基中。该酸性洗脱去除至少一部分内源以及在囊表面处与HLA 第I类或第II类分子结合的β2-微球蛋白(β2-m)，但不改变外来体 的生物和免疫特性。这步处理是有利的，因为它避免或降低了针对内 源肽的二级免疫反应。如同申请人确定，选择的酸性培养基或处理优 选包括使囊置于pH值在2至6之间的培养基下，更优选的是在3到 5.5之间。本申请确实显示可在如此酸性的pH值下处理外来体而仍保 留其生物特性。具体而言，本申请惊人地显示可使外来体接受弱酸的 处理、中和并装载所需的肽，而仍显示出刺激对所需肽的有效免疫反 应的能力。该培养基尚可包括任何适当的缓冲液，如柠檬酸盐、醋酸 盐等。关于这一点，本发明人已经显示更优选的培养基，包括醋酸钠， 与传统的柠檬酸盐缓冲液比较，其提供增加的装载性能。从任何传统 的培养基或生长培养基中可衍生选择的培养基，并通过在其中加入缓 冲条件来制备，以便达到所描述的pH值。培养基亦可以是人造的或 合成的，根据本领域已知的方法，使用各种缓冲液的营养物。基本上， 根据本发明选择的酸性培养基意指任何允许维持膜囊的培养基、生 长、调整或其他液态溶液或缓冲液，具有如上所述pH的溶液，并且 优选包括醋酸盐例如醋酸钠的溶液。
在低温下进行弱酸处理，通常低于8℃，优选大约4℃，基本上 持续15分钟或更短，优选10分钟或更短，更优选5分钟或更短。应 了解使用本申请和实施例的教导，专业技术人员可调整处理的条件(培 养基、pH值、温度、持续时间等)，而不背离本发明。
根据传统方法，通过增加该溶液的pH值可进行中和作用。中和 作用优选导致pH值在5.5以上的培养基，通常在大约6到大约9之 间。通常通过在培养基中加入pH值为大约10或11的中和培养基， 例如Tris缓冲的溶液，来进行中和作用。
肽与外来体接触应该在足以允许该肽与在外来体表面上的MHC 分子结合的条件下进行。通常在中和作用过程中或之后加入外源(第 I类)肽和β2-m，优选是过量的，以便在与该肽和β2-m形成复合体之 后促进HLA第I类的复溶，而得以装载该肽。不一定要在中和作用之 前消除分离的内源肽，或在接触之后去除未结合的肽。通常可使用从 0.005到50微克/毫升的β2-m。可通过各种技术生产肽和β2-m，如重 组生产、合成等。应了解β2-m优选是人类来源的(人类β2-m有市售 (Sigma)，并可通过传统技术生产)。例如在室温下可进行接触多 达大约2小时。实施例显示早在接触后30分钟便达到饱和。使用TRF 和生物素酰化的参考肽，我们可确定直接装载于帝萨体上肽的含量， 并证实在标记的参考肽和未标记的靶肽之间有结合竞争，这说明靶肽 直接装载于帝萨体上是成功的。以此方式，利用Mart-1肽在低至0.1 微克/毫升的浓度下装载帝萨体一致且再现地刺激Mart-1特异的CTL 纯种系LT11以产生IL-2(实施例12)。
在另一个变体中，该方法不需要使用β2-微球蛋白。确实，发明 人已经显示，有可能限定去除内源肽的适当条件，而不会彻底去除或 使内源β2-m丧失稳定性，以致于即使不使用外源β2-m也有可能直接 装载。在此优选的变体中，该方法包括下列步骤：(i)在缺乏β2-微球 蛋白的情况下，使分离或纯化的膜囊与第I类限制肽或脂质接触，(ii) 使(i)的混合物在允许肽或脂质与在该膜囊表面上的HLA第I类分子形 成复合体的条件下置于选择的酸处理，以及(iii)收集已经装载的膜囊。 更优选的是，步骤(ii)包括使该混合物在pH大约4到5.5之间接受弱 酸处理2小时以下，更优选在pH大约4.2到5.2之间处理1小时以下。 该具体实施方案是有利的，因为需要较少的处理，且不需要外源β2-m， 其降低了成本、操作和与人类-衍生产物有关的潜在问题。在此不含β2- 微球蛋白的具体实施方案中，分离或纯化的膜囊通常在缺乏β2-微球蛋 白的情况下与过量的外源肽接触，例如与5至500微克/毫升第I类限 制肽接触。当在如上限定的适当条件下接触后，通过以目的肽或脂质 替换与抗原呈递分子结合的内源化合物(例如对肽而言为MHC第I 或II类，且对脂质而言为CD1)(交换过程)而发生装载。由于存在 发明人限定的选择的酸性条件，使该交换成为可能或足以发生。亦通 过申请人证实诸如外来体的膜囊与整个细胞对照，可抵抗延长的酸性 暴露，并因此可接受限定的酸处理，足以使替换步骤更容易，而无需 加入外源β2-m，从而使该交换成为可能。一旦进行交换或替换，通常 在15至30分钟之后(若需要或更长或更短，依据其条件)，便可通 过升高溶液的pH值使装载的膜囊稳定，由此阻断该交换。可按照如 上所述进行中和作用。
如上所指出，可使用各种免疫原性化合物实施该方法，如肽或脂 质。该肽优选是由第I类或第II类分子提供的肽，即由抗原呈递细胞 如树突细胞和巨噬细胞和B淋巴细胞加工处理抗原而产生的肽。优选 类型的肽由第I类限制肽代表，更优选由第I类限制的肿瘤肽代表， 也就是衍生自肿瘤抗原的肽，其由树突细胞或巨噬细胞提供给免疫系 统。应了解可使用分离的肽或其混合物如肿瘤细胞的肽洗脱物或其他 肽的组合，来实施该方法。如上所述，脂质的特定例子包括细菌脂质 和糖脂肿瘤抗原。
下文的实施例12描述帝萨体直接装载的结果。该结果证实已装 载的囊刺激抗原特异的CTLs的能力。 样品的富集
如上所示，可使样品(例如上清液、溶胞产物、生物流体等)经 过富集步骤，其可包括一次或多次离心、澄清、超滤、纳米过滤、亲 和层析和/或渗滤步骤。在特定的具体实施方案中，富集步骤包括(i)细 胞和/或细胞碎屑的排除(澄清)，可能接着(ii)浓缩和/或渗滤步骤。 根据本发明，优选的富集步骤包括(i)细胞和/或细胞碎屑的排除(澄 清)，(ii)浓缩和(iii)渗滤。 样品的澄清
通过离心样品，例如以低速优选低于1000g，例如在100至700g 之间，排除细胞和/或细胞碎屑。在该步骤中，优选的离心条件是例如 以大约300g或600g离心1到15分钟。
优选的是，通过过滤样品来去除细胞和/或细胞碎屑，所述过滤 可能与上述离心组合进行。特别是可以使用具有递减孔隙度的滤纸进 行连续过滤。为了该目的，优选使用具有0.2微米以上例如在0.2到10 微米之间孔隙度的滤纸。使用具有10微米、1微米、0.5微米，接着 是0.22微米孔隙度的滤纸连续过滤是特别有可能的。
通过一次性的由醋酸纤维素组成的0.8微米胶囊滤纸进行微过滤 细胞培养基，以便去除细胞和碎屑。微过滤胶囊单次使用。图5表示 该方法的计划。最低限度的10个实验显示微滤纸的容量，例如500 平方厘米的表面积足以过滤2.5升至4升以上的树突细胞培养物上清 液。若需要可使用更大的表面积(例如1000平方厘米)，这取决于 悬浮液中碎屑的含量。
亦可使用其他孔径2微米、1微米、0.65微米、0.45微米等从帝 萨体中澄清细胞和细胞碎屑。微滤纸可含有前滤纸，即0.8微米的 Sartoclean CA(Sartorius Inc.)含有3.0微米的醋酸纤维素前滤纸。此外， 滤纸可由醋酸纤维素以外的其他材料所组成，如聚丙烯或聚醚碸 (PES)。
其他可用来从帝萨体中去除细胞和碎屑的方法为低速离心、通过 中空纤维的连续流动微过滤以及层析法。 浓缩
可进行浓缩步骤，以便降低在密度垫阶段待处理样品的体积。以 此方式，通过高速离心样品，例如在10,000到100,000g之间，引起 膜囊的沉降，可获得浓缩。这可包括一系列的差速离心，而以大约 70,000g进行最后的离心。可将在沉淀中获得的膜囊溶解于较少的体 积中，并在适当的缓冲液中进行后续的加工步骤。
优先通过超滤进行浓缩步骤。根据优选的具体实施方案，使(澄 清的)生物样品(例如上清液)接受超滤，优选的是切向超滤。切向 超滤由在两个分隔容器(滤液和留存物)之间用来浓缩和分级分离的 溶液所组成，其由具有确定的截留阈值的膜隔开。通过留存物分隔容 器中的流动，并在该分隔容器和滤液分隔容器之间应用膜压力，来进 行分离作用。可使用不同的系统来进行超滤，如螺旋形膜(Millipore， Amicon)、扁平膜或中空纤维(Amicon，Millipore，Sartorius，Pall，GF， Sepracor)。在本发明的范围内，有利的是使用具有低于1000kDa截 留阈值的膜，优选在300kDa到1000kDa之间，或更优选在300kDa 到500kDa之间。
在特定的具体实施方案中，通过孔径为0.5毫米截留值分子量 (MWCO)500kDa的中空纤维(A/G Technology Inc.)进行超滤，浓 缩澄清的组织培养上清液(例如在通过0.8微米滤纸的澄清之后获得 的)。该滤芯的孔径将帝萨体保留在留存物中，同时允许比该孔径更 小的蛋白质通过该膜。中空纤维的滤芯含有足够的表面积，允许迅速 地进行浓缩，但对帝萨体没有过量的剪切力。经受超滤的起始上清液 的体积通常为2-4升，然后将其降低至大约100毫升(20-至40-倍减 少)。图6描述了该操作设置。
亦可使用其他孔径如30kDa、100kDa、300kDa和750kDa来浓 缩帝萨体的体积。然而有可能会降低处理的效率和回收百分比。此外， 亦可使用得自诸如Millipore、Sartorius和Filtronics公司的其他超滤形 式，如“平板和框架”卡匣。亦可使用如由Amicon Inc提供的搅拌格 子来降低帝萨体的体积。
通过超滤浓缩帝萨体，在低剪切力之下采用中空纤维进行。进料 流的剪切力(例如对于0.7平方英尺表面积，流速＜300毫升/分钟)为 2000秒-1以下。在操作期间，系统的进口和出口压力在3-8psi(磅/平 方英寸)之间。可使用与目前所用参数相比较更严格的条件来浓缩帝 萨体。
在本发明的制备方法中，亦可使用其他技术，如离子交换和亲和 层析法以及流场-流动分级分离，来浓缩帝萨体。 渗滤
可对浓缩的帝萨体制品使用渗滤来降低污染培养基和细胞蛋白质 的浓度。根据数种允许以制配缓冲液交换样品缓冲液的技术进行渗 滤，包括超滤、层析法、超速离心以及通过透析袋。
在优选的具体实施方案中，利用超滤系统进行渗滤。如实验章节 证实，该具体实施方案是有效的。此外，如果通过超滤已经浓缩囊制 品，使用相同的方法学可轻易地组合渗滤步骤。
关于这一点，在特定的具体实施方案中，使用如浓缩步骤中所用 的相同的超滤膜(即500kDa MWCO中空纤维膜)，通过超滤渗滤外 来体。该具体实施方案是有利的，因为基本上可在相同的装置中进行 这两个步骤，对外来体具有有限的干预和处理，也就是仅通过修饰 导入中空纤维中的产物。
除了500kDa中空纤维之外，可利用其他孔径如30kDa、100kDa、 300kDa和750kDa，优选包括30到1000kDa之间，更优选在200到 750kDa之间。渗滤缓冲液可由除了在PBS中找到的那些赋形剂所组 成。渗滤中所用缓冲液的体积无论何处均可以为帝萨体浓缩物体积的 1至10倍。
渗滤所用的操作参数与先前对从澄清的组织培养基中浓缩帝萨体 所描述的那些参数类似。 外来体的密度垫分离和纯化
正如所示，本发明公开生物样品的处理，包括在密度垫上离心膜 囊，并从该垫中回收纯化的囊。密度垫离心提供胜过现有技术使用连 续离心或梯度密度离心的数个优点。这些优点包括缺乏囊的凝集，因 此使其接受减少的物理损伤；进一步纯化该膜，因为可去除额外的污 染物，如在下文将讨论；缺乏在垫中所用组份的毒性；降低蔗糖浓度 等。具体而言，密度垫允许在超速离心样品时，防止外来体形成沉淀。 在可溶性蛋白质(大约0.73)、外来体(大约0.88)和蛋白质凝集物 的偏微分比容上的差异使其成为分离和纯化的理想方法。预计蛋白质 凝集物(密度约为1.35)通过密度垫形成沉淀，而外来体仍保留在密 度垫中。简而言之，如下描述该方法(图8a和8b描述了该方法的计 划)。
在离心管的底部加入比浓缩的帝萨体溶液更高密度的溶液(即 垫)，结果形成不连续或台阶梯度(即密度上的急剧变化)。该垫导 致排除较低沉降系数的分子。此外，在执行终了时，垫使得重悬浮任 何沉降的物质变得更为容易，并防止损害可能无法抵抗形成沉淀的颗 粒。
此外，作为其他优点，相信密度垫允许进一步从组合物中排除任 何潜在污染的蛋白质凝集物，特别是结合珠蛋白凝集物。
已经显示膜囊尤其是帝萨体具有1.100至1.140克/毫升的密度。 因此，密度垫应该具有在大约1.10至大约1.15的终密度。
可由专业技术人员修改垫的组合物，以便达到上文优选的终密 度。垫溶液优选是轻微高渗的，渗透性在700-800mOs之间。在优选 的具体实施方案中，密度垫由在Tris缓冲液中的蔗糖/D2O所组成。在 每个离心管底部加入浓密的蔗糖/Tris D2O缓冲液，置换上方的浓缩帝 萨体溶液，形成可见的界面。以100,000xg超速离心大约1个半小时， 使帝萨体沉降至更浓密的蔗糖/Tris D2O垫内。浓密的垫含有富集和更 纯化的帝萨体群。极少量的帝萨体在垫上方或有时可在离心管底部可 见的沉淀内。此外，D2O先前已经用于临床环境中，并且未曾在所用 浓度下显示出任何的毒性影响。关于这一点，氘在人类中的天然多度 为15毫克/千克(0.15％wt)。
优选的是，如果使用D2O/蔗糖垫，最初垫溶液的密度应该在大 约1.175-1.210克/毫升的范围内(另外亦可使用这些特定限制的偏差)。 确实，申请人现已证实离心期间在垫中发生D2O/蔗糖的扩散，导致形 成微型-梯度以及在大约1.1到大约1.15克/毫升之间的终密度(即测 量出集中垫的密度在1.100到1.150克/毫升之间)。这不是预料中的， 但对纯化步骤提供了更多的优点，因为借着形成微型梯度，垫允许进 一步纯化外来体。
在其他例子中，可制备除蔗糖/D2O以外的其他溶液，其中该溶 液密度比外来体更高。关于这一点，可使用双重-标记的水(也就是D217O 或D218O)，即使这将允许进一步降低在垫中的蔗糖含量。可利用的 D218O(纯度97％)密度为1.22。可使用D2O和D217O或D218O的混合 物来分离囊和各种密度的细胞部分，而无需加入组份。
亦可制备在H2O(非-氘化)中较高浓度的蔗糖来产生具有可比 密度的溶液，虽然这类溶液将具有显著较高的高渗性并可诱导帝萨体 的溶解。可使用由磺克沙醇(iodixanol)(也就是OptiPrep)、普克 (Percoll)和发克(Ficoll)组成的商用密度培养基，以类似的方式捕 捉帝萨体，以供实验室处理和分析目的使用。
通过任何适当的方法，可从垫中收集纯化的外来体，包括以针头 刺穿离心管、吸取等。 制配和调整 通过渗滤制配外来体
可在适合临床使用或进一步储存的各种缓冲液或悬浮液中制配经 过纯化的外来体。
为了那个目的，通过渗滤采用500kDa超滤中空纤维滤芯，以与 先前在浓缩和/或渗滤中所用的相同形式(参见上文讨论)，可使纯化 的外来体经受缓冲液交换。在渗滤之前，优选用含有hSA(例如100微 克/毫升)并缺乏结合珠蛋白污染的缓冲液预调整该滤芯最少15分钟。 似乎hSA的存在防止由于与中空纤维基底膜结合而导致的帝萨体的非 特异性损失。使含有纯化(抗原脉冲)的外来体的超速离心垫部分(大 约16毫升)进行最少5倍体积的缓冲液交换，以便去除垫的组份(也 就是98％缓冲液交换)。使用与图5所述相同的设置，然而，将中空 纤维滤芯的尺寸缩小至容纳较小的体积。如前所述，可能不需要以低 剪切力(即2000秒-1)进行渗滤。
图10描述帝萨体样品原始体积二千八百分之一的典型SDS- PAGE。
可使用数种制配缓冲液来配制帝萨体。典型的缓冲液包含USP/NF 赋形剂。制配溶液可含有下列组份：1)缓冲剂，如Tris，2)冷冻保 护剂，如蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘油等，3)盐类，如NaCl、KCl、 MgCl2、CaCl2等，4)填充剂，如甘露糖醇、甘氨酸、淀粉等，5)抗 氧化剂，6)维生素，7)稳定蛋白质和肽，如hSA，以及8)其他广 泛接受用于制配的赋形剂。
关于这一点，本发明的目的在于组合物，其包括(i)膜囊，(ii)缓冲 剂，和(iii)冷冻保护剂或稳定化合物。该组合物优选进一步包括(iv)盐 类和/或填充剂和/或抗氧化剂和/或维生素。
典型的缓冲液包括PBS、20mM Tris/5％蔗糖/1mM MgCl2 pH7.4 或20mM Tris/5％蔗糖/1mM MgCl2 100微克/毫升hSA pH7.4，并使其 接受超滤以去除结合珠蛋白。
优选的是，上述的制配溶液基本上不含结合珠蛋白(或相关聚合 物以及颗粒体)。关于这一点，如前所公开，可使该制配溶液(或其 特定的个别组份，如白蛋白溶液)接受超滤以排除结合珠蛋白。最终 的处理进一步提供产物的较高的保证。 外来体的无菌过滤和冷冻
最后，可使收集(或制配)的物质接受进一步的处理和/或过滤 阶段，特别是为了灭菌目的。关于这一点，通过直径小于或等于0.3 微米的滤纸可无菌过滤外来体。典型的灭菌包括通过0.22微米的注射 滤器(25毫米)过滤，具有最低的损失(参见HLA/DR测定结果)。 在无菌过滤中，可使用由Millipore的“Durapore”材料所组成的滤器。 亦可使用由醋酸纤维素或聚醚砜所组成的其他滤器材料。在过滤外来 体之前，优选用含有100微克/毫升hSA(无结合珠蛋白)的制配缓冲 液预先使该注射滤器湿润。在受控的参数下用注射泵或由手引起的压 力无菌过滤外来体样品(约16毫升)。
亦可冷冻纯化的外来体(任选制成的和/或无菌的)，并储存在-80 ℃或-20℃或4℃的其他储存温度下。优选以1°/分钟的控制速度利用 “Mr.Forsty”低温-1℃冷冻容器(Nalgene Inc)进行冷冻。亦可使用 在液态N2中慢速或快速冷冻的其他方法。
关于这一点，本发明的目的亦在于包括冷冻外来体的组合物。 质量控制
本发明亦公开并提供可用来鉴别已经制备(例如经过纯化和/或 制配)或正在制备期间的膜囊制品特征的新型组合物和方法。本发明 的组合物和方法可用来估测在样品或组合物中的外来体的数量，确定 外来体制品的表型，并评价外来体制品的生物活性。这些方法特别适 用于鉴别用于临床应用中产物特征，即用来控制外来体制品的质量和 组合物。这些方法对于治疗目的而言是非常重要的，因为基本上使用 自体的(即患者本身的)膜囊制品，这需要个体的特征参数。使用这 些组合物和方法可鉴别来自各种起源(即抗原呈递细胞、肿瘤细胞 等)、抗原-灵敏度(抗原-装载、抗原-游离等)、新鲜制备或储存的 来自初级细胞或无限增殖化细胞系等的外来体制品特征。 外来体的剂量确定
方法被开发出来以评估样品(或纯化的组合物)中存在的膜囊数 量。该方法涉及免疫复合体的形成和检测，使用识别存在于外来体上 细胞表面标记的抗体。
更具体而言，根据本发明，确定样品中膜囊剂量的方法包括(i)将 样品吸附在固相支持物上，(ii)使吸附的固相支持物与特异于外来体的 细胞表面标记的(捕捉)抗体接触，和(iii)确定(或确定剂量)抗体- 抗原免疫复合体的存在。
更优选的是，特异于外来体的细胞表面标记的抗体是抗-第II类 抗体，也就是与MHC第II类分子结合的抗体或抗-第I类抗体。此外， 在特定的具体实施方案中，至少平行使用二级捕捉抗体，从而进一步 增加关于外来体测定的选择性。例如，优选额外的捕捉抗体是针对抗 CD81细胞表面标记或针对抗MHC第I类分子。为了鉴别外来体的特 征(或确定剂量)，使用抗-CD81抗体是有利的，因为CD81从树突 细胞中显著降低，并因此提供对帝萨体特定的信号。在该步骤中，可 使用对外来体特异的其他抗体，例如抗-CD63或抗-CD9。
因此在优选的具体实施方案中，将外来体吸附在固相支持物上， 并分别与抗-第II类抗体和抗-CD81抗体接触。
根据传统的免疫学技术，可检测作为接触步骤的结果而形成的抗 体-抗原免疫复合体。优选的是，使用与第一和/或第二个捕捉抗体结 合标记显露抗体来显露该复合体。可利用放射性、酶活性、萤光标记、 化学发光标记等来标记显露抗体。复合体的测量值与存在于样品中外 来体的量相关(即提供其直接的指征)。如果使用两个抗体(例如抗- 第II类和抗-CD81)，可按照定量参数实施以每种抗体检测到的复合 体的平均值或比率。
在该方法中使用的各种抗体可以是单克隆或多克隆抗体，以天然 形成或其修饰(例如人源化)的片段或衍生物。在典型的实验中，捕 捉抗体是单克隆抗体。在更典型的实验中，显露抗体是经过标记的单 克隆或多克隆抗体。
在实施本发明方法时，可使用各种固相支持物，如多孔板，特别 是96-孔板或任何其他的滴定板。
此外，在进行本发明剂量确定方法时，最好使用纯化的外来体样 品，以降低非特异的背景信号。为了这个目的，该样品优选是纯化的 外来体样品，更优选的是接受过密度垫(超速)离心的样品。为了分 析目的，在200微升的D2O蔗糖密度垫上离心数毫升的外来体溶液。 可直接在垫溶液上进行ELISA。这种简单的纯化步骤允许足够的浓缩 和纯化。回收率接近100％。
在特定的具体实施方案中，已经开发出以ELISA为基础的分析， 从而提供在样品、组合物、流体等中的帝萨体的定量测量。图11a说 明HLA-DR(即MHC II)的测量，和图11b说明在帝萨体中CD81的 测量。HLA/DR测定是灵敏的，并在功能上与帝萨体的活性相关，因 为HLA/DR涉及抗原呈递。选择这种测定作为帝萨体制品的定量测定。 对HLA/DR确定的ELISA测定定量了终产物中的帝萨体。因为该测 定亦可测量在树突细胞上的HLA/DR，故该测定提供了每个树突细胞 和每份体积的分离的帝萨体涉及HLA/DR剂量的方法。 外来体的表型
方法被开发出来以评估存在于样品(或纯化的组合物)中的膜囊 的表型。该方法涉及免疫复合体的形成和检测，使用识别存在于外来 体上(中)的数个细胞(表面)标记的抗体。该方法尚包括使外来体 复合到固相支持物上，如小珠，从而允许合理并可靠地确定每个制品 的表型。
关于这一点，本发明的目的在于鉴别制品中膜囊特征的方法，其 包括使膜囊制品的样品平行地与二种或多种特异于该囊标记的抗体接 触，并确定抗原-抗体免疫复合体的形成。
更具体而言，该方法针对确定外来体制品的表型，即由在制品中 外来体表达的特定类型的细胞表面标记。考虑到外来体制品的自体性 质，从结构和潜在活性两者的角度来看，表型特征基本上在于制品的 组合物。
更优选的是，鉴别制品特征的方法包括使外来体结合到固相支持 物上的最初步骤，如小珠。更优选的是，以共价方式或通过抗体-介导 的亲和结合，将外来体附着到诸如小珠的固相支持物上。在典型的具 体实施方案中，使用直径大约1至10微米小珠，更优选的是3至5 微米，并可携带共价附着于其上或由免疫亲和力偶联的1000个以上 的外来体，更优选的是2000到5000个之间的外来体。然后将包被外 来体的小珠分配到板的小孔中，并平行地与选择的抗体接触。
抗体可与细胞表面标记或内部蛋白质结合。确实认为外来体与诸 如小珠的固相支持物的结合使得外部药剂，如抗体，得以利用某些内 在蛋白质。
优选的是，使用二种或多种在下文表1中列举的抗体：
表1 抗体 来源Ph armingen 抗CD11，更优选 抗CD11c 抗CD11b 30485x 30455x 抗HLA，更优选 抗HLA abc 32295x 抗CD81 33475x 抗CD63 36585x 抗CD58 36895x 抗CD1a 34224x 抗CD1b 抗CD9 30374x 抗CD86 33409x 抗CD82 35394x 抗CD83 36934x 抗乳粘附素*
*：兔抗-血清抗乳粘附素肽
优选标记这些抗体，从而允许检测和/或确定剂量所形成的免疫 复合体。标记可以是放射性、化学、酶、萤光等。优选的标记是萤光， 如FITC或PE。
更优选的是，使用至少5种不同的抗体，更优选的甚至是至少8 种不同的抗体。抗体优选是单克隆的。
在特定的具体实施方案中，使用直接染色法确定免疫表型。将一 小等份纯化的外来体与抗-第II类(例如抗-HLA/DR)-包被的磁珠一 起温育。然后将与抗-HLA-DR包被的磁珠相偶联的外来体同标记抗体 一起温育，更优选的是萤光结合(例如FITC或PE)的单克隆抗体。 使用流式细胞仪可测量四个参数。前向散射、侧向散射和两个萤光通 道。这两种-颜色的流式细胞仪分析允许在单一的测量中鉴定外来体上 的抗原。
图14呈现数个帝萨体制品所获得的结果。这些结果清楚证实要 求保护的用于确定外来体制品免疫表型方法的功效和速度。 外来体的功能
方法进一步被开发出来以评估样品(或纯化的组合物)中存在的 膜囊的生物活性。该方法涉及使用参考抗原，例如超-抗原(如SEE)， 来评估得自T细胞群的CTL淋巴细胞的活化作用。
因此，本发明的特定目的在于鉴别膜囊活性特征的方法，包括在 辅助细胞的存在下使装载超-抗原的囊与T细胞接触，并确定T细胞 的活化作用。
由许多不同类似细菌和病毒病原体来生产超抗原。超抗原直接与 MHC II分子结合，不需加工处理。代替在MHC II分子沟中的结合， 超抗原与MHC II分子的外表面及T细胞受体(TCR)的Vβ区结合， 而能够刺激极大量的T细胞(2-20％)。超抗原可与各种MHC II和 TCR结合并诱导强的T细胞反应的事实，使它们成为建立测试帝萨体 抗原呈递功能的普遍性和敏感性测定的诱人药剂。从各种来源可制备 或分离超抗原。在本发明中使用的优选超抗原是SEE抗原和ET404 (Toxin Technology Inc.)。可使用其他超抗原，如SEA和SEB。
T细胞可以是任何新鲜制备的包括T细胞的细胞群，如外周血液 单核细胞(“PBMC”)，以及可以是任何无限增殖化的T细胞系， 如Jurkat细胞。Jurkat细胞是无限增殖化的人类T细胞，在激活后分 泌IL-2，其在该生物测定中作为反应者(responder)细胞起作用。Jurkat 细胞的TCR的Vβ8与SEE结合。如同永生的肿瘤细胞，Jurkat细胞 是特别有用的，因为它们比初级细胞更不具异种性，并且更容易在实 验室中生长。
辅助细胞可以是在该生物测定中任何能够调节T细胞的激活信号 的细胞。辅助细胞可以是树突细胞，如任何活性初级树突细胞培养物 或树突细胞系。辅助细胞也可以是其他免疫细胞或细胞系，特别是抗 原呈递细胞或细胞系，如Raji细胞。Raji细胞是EBV-无限增殖化的 B-细胞，并已经显示在该生物测定中起作用。可在任何适当的培养基 中培养Raji细胞，例如RPMI。
在实施要求保护的方法时，使超抗原装载的囊在辅助细胞的存在 下与反应者T细胞接触，并评估T细胞活化作用。
根据各种技术，如细胞因子释放、蛋白质合成、反应者细胞溶解 等，可进行T细胞活化作用的测量。在优选的具体实施方案中，通过 确定培养基中产生的细胞因子来测量T细胞的活化作用，更具体而言， 是在培养基中产生的介白素-2。通常由ELISA来测量IL-2。
在该方法中，膜囊本身可利用超-抗原来装载，或是产生膜囊的 细胞(然后使所得囊暴露在超抗原下)。在优选的具体实施方案中， 将该囊与超抗原接触。
在特定的具体实施方案中，该功能性的测定首先在制配缓冲液中 将超抗原SEE与通过超滤、垫密度离心和渗滤从细胞培养上清液中制 备的外来体一起温育。可使用新鲜分离的外来体，或亦可冷冻储存在- 80℃的PBS中。然后通过分析区带离心，使用例如Optiprep，从未结 合的SEE中分离外来体与SEE的复合体。Optiprep(亦称为碘克沙醇) 是碘化的密度梯度培养基(Nycomed)，其允许从游离的SEE中定量 回收外来体/SEE复合体。因此，对于定量分析每批制品外来体而言， 该步骤在生物测定中是重要的。使用分离的复合体，在作为辅助细胞 的Raji细胞的存在下诱导T细胞活化。T细胞活化的读出是由Jurkat 细胞分泌的IL-2.
本发明制备方法胜过现有技术使用连续离心步骤的沉降技术的特 殊优点如下：
处理时间的长度：沉降处理比超滤和超速离心耗费更多的时间。 4升组织培养上清液通过沉降处理将需要最少12个小时，而进行超滤 和单一超速离心的组合时，如同其目前进行的，将消耗6-7小时。
密闭系统-满足GMP：在该方法中仅仅离心步骤以少量体积进行， 并可在目前可获得的密封离心管(转子6个离心管的容量各为33毫 升)中进行。这排除了如果欲进行大体积(数升)的离心步骤时所遭 遇到的问题。目前并没有可供如此大体积使用的密封离心管。离心应 已在一次性的开口离心管中进行，并将不满足目前规章的束缚。澄清、 超滤和无菌过滤均在生物安全的通风橱中进行，所以被认为基本上是 密闭系统。目前亦利用密封离心管进行超速离心，其排除了可能由于 在开口离心管中的污染引起的问题。
培养基的超滤：培养基的再处理，如AIM V，以便去除蛋白质凝 集物，这是整个加工处理纯化计划中的重要步骤。上游去除共-纯化的 蛋白质导致在处理之后较纯的外来体产物。特别是推测本发明允许产 生基本上不含凝集物的组合物，即其中凝集物相当于总蛋白质的2-4 ％以下。此外，结合珠蛋白的去除降低了不需要的免疫反应。
在沉降之后外来体的潜在凝集：外来体的沉降导致局部浓度极 高。在沉淀中高浓度的外来体具有导致凝集的产物的潜力。与使用超 滤的方法比较，电子显微镜给出一些沉降后外来体正在凝集的指征。 其次，通过电子显微镜的观察，外来体的超滤似乎产生较少的碎屑。
处理温度：可在冰上进行渗透的处理，即在大约4到10℃之间的 温度下。这是有利的，因为在游离肽和通过MHCI与外来体结合的那 些肽之间的平衡可受到温度的影响，因此这样的温度可防止诸如蛋白 酶的水解污染酶的作用。
外来体的纯度：外来体的沉降冒着被细胞碎屑和培养基污染物污 染的危险。去除污染的蛋白质凝集物是特别重要的，因为它们具有高 免疫原性。
外来体的回收：最终回收率为60-75％，显著大于原始沉降方法 (9个实验平均15％)。这意味着如果需要，则用来治疗患者的可用 剂量将能增加5倍，或允许以较少体积的血来进行滤析(apheresis) 和培养低5倍的细胞，致使该方法的成本相当大的降低。
本发明其他方面及优点明示于下列实施例中，这些实施例应看作 例证而非用于限制本发明。 实施例 1.培养基的制备
在使用之前，已经先通过超滤处理培养基(在该实施例中，临床 级的AIM V为Life Technologies，Inc.的不含血清的细胞培养基)，以 便去除凝集的蛋白质，凝集蛋白质的去除并不影响细胞生长，却相当 大地有助于后续纯帝萨体的分离。
使用500kDa中空纤维膜(来自A/G Technology，NeeDham，Mass 或来自备有相关产品的销售商)进行培养基的超滤。该膜的尺寸将蛋 白质凝集物保留在留存物中，而允许未-凝集的蛋白质与滤液一起通 过。收集滤液，通过0.22微米滤纸无菌过滤至小瓶中，并储存在4℃ 下直到使用为止。
在特定的实验中，处理50升AIM V使用了来自A/G Technology 的UFP-500-C-35A(0.5毫米孔径，14.5平方英尺表面积)中空纤维 滤芯。原料流进口的流速为13升/分钟，导致1升/分钟的滤液流，且 进口和出口压力分别为12-16psi和10psi。在1小时内完成该过程。 通过0.22微米的SartoPore或SartoBran滤纸(Sartorius Inc.)无菌过 滤滤液。图3和4证实降低了培养基的凝集物含量。由ELISA定量结 合珠蛋白显示通过超过滤去除了99％以上的结合珠蛋白相关凝集物。 更具体而言，UF培养基含有低于大约5纳克/毫升的结合珠蛋白凝集 物。
具体而言，BCA测定显示AIM V培养基的超滤去除培养基中2- 4％的总蛋白质。大部份被去除的蛋白质部分是凝集物。培养基中的 蛋白质浓度并不随超滤而有明显的改变，仅仅颗粒体的浓度发生变 化。使超滤的AIM V(UF AIM V)形成沉淀导致任何蛋白质模式与 在未经超滤的AIM V培养基中所观察到的模式基本上不同(参见图 3)。此外，在处理之后3个月使超滤的AIM V形成沉淀，如SDS-PAGE 所显示，并未说明存在蛋白质凝集物(参见图4)，这证实经过处理 的培养基可长期储存。
白蛋白(例如hSA)组合物的超滤亦允许制备每毫克hSA中含 有低于大约10纳克结合珠蛋白凝集物的加热hSA产物，即低于大约 0.001％的结合珠蛋白凝集物(wt)。 2.不成熟树突细胞的生产和培养
在白细胞滤析(leukopheresis)之后，从患者外周血液中获得树 突细胞前体。细胞培养程序是不含血清的，并以临床级的细胞培养基 进行，该培养基进一步超滤去除蛋白质凝集物(或颗粒体)，如在实 施例1中所描述，引入的白细胞滤析通常含有大约1至2×E10个细胞。 以补充有0.1％人类血清白蛋白(临床级)的PBS冲洗细胞四次以去 除血小板。然后以200×106个细胞/烧瓶的细胞密度在不含血清经过超 滤的培养基中将细胞平铺在大约100-150平方厘米的T型瓶中。从引 入的白细胞滤析中的白血球纯化树突细胞前体依赖于单核细胞对带电 荷的聚苯乙烯表面的粘附特性，如同出现在标准市售的组织培养烧瓶 中。在2小时的温育之后，单核细胞变成具有附着力并被保护下来， 而将剩下的非粘着细胞与培养基一起抛弃，并使用补充有GM-CSF和 IL-4或IL-13各50纳克/毫升以及γ干扰素的培养基交换。有粘着力的 单核细胞在GM-CSF和IL-4或IL-13的存在下进行分化，变成不成熟 的树突细胞。在培养第5天，对这些细胞再添加更多的GM-CSF和IL-13 或IL-4.可以500单位/毫升将干扰素γ加至细胞中，以便将树突细胞维 持在不成熟的状态。 3.在模型系统中装载抗原的程序
进行预备实验，以便评估将抗原装载到树突细胞内的枝术参数。 为此目的，以CMV肽脉冲不成熟的树突细胞，以便产生肽装载的帝 萨体。然后通过标准程序分离帝萨体，并通过测量由CMV特异的T 细胞纯种系所释放的IFN-γ来测定其活性。以CMV肽装载的帝萨体特 异性地刺激抗-CMV T细胞纯种系，且需要树突细胞的存在，这与我 们使用基于SEE的活性测定的发现一致(图2)。
因此使用CMV模型系统，通过在第5天将肽加至DC培养物中 可将该肽掺入帝萨体内。此外，我们发现肽装载的帝萨体对T细胞的 刺激作用需要DC，这与在SEE生物测定中对包含T细胞、DC和帝 萨体的需求一致，由此强调在这两个测定中帝萨体行为之间紧密相 关。 4.澄清
收集4升组织培养上清液，并以250毫升/分钟的流速通过3/0.8 微米的Sartoclean CA(500平方厘米表面积)(Sartorius Inc.)过滤。 滤纸上的进口压力不超过10psi(图5)。 5.浓缩
利用来自A/G Technology的UFP-500-C-4A中空纤维滤芯(0.7 平方英尺表面积；0.5毫米孔径)，将4升澄清的组织培养基浓缩成100 毫升。原料流的流速在225-275毫升/分钟之间，并且进口和出口压力 分别为4-7psi和3-6psi。在这些条件下，滤液流速在40-60毫升/分 钟之间。该过程需要大约60-80分钟完成(图6). 6.渗滤
在特定的实施例中，使外来体浓缩物对5倍体积的PBS渗滤(即 100毫升帝萨体浓缩物对500毫升PBS渗滤)。图7描述了在渗滤之 前和之后浓缩帝萨体的SDS-PAGE。在寒冷的条件下(在大约4-10℃ 之间)进行该步骤以及所有的后续步骤。 7.密度垫分离(不连续梯度)
在如下特定的实施例中，在密度垫上，通过(超速)离心纯化含 有帝萨体的浓缩和渗滤的培养基，以及在已经以抗原脉冲外来体的那 些实施例中：将外来体浓缩物(大约100毫升)等分至离心管中，并 置于4毫升蔗糖/Tris D2O缓冲之下。D2O密度垫由25-30％蔗糖/20mM Tris D2O(重量/重量％)(pH7.5-7.7)所组成。密度在1.18到1.21 克/毫升之间。密封离心管以确保为密闭系统。
图9a描述在超速离心之前和之后样品的SDS-PAGE，以及在垫 上方、垫中或沉淀中的含量。如同所示，大部份蛋白质并未沉降在蔗 糖/Tris D2O密度垫内。
这在图9b中进一步得到证实，这表明在垫中回收至少90％的外 来体。 8.制配和调整
通过渗滤，利用与先前浓缩和/或渗滤(参见实施例5和6)所用 形式相同的500kDa超滤中空纤维滤芯，使纯化的外来体接受缓冲液 交换。在渗滤之前，先以hSA(例如100微克/毫升)预处理该滤芯最 少15分钟，并选择滤芯大小处理10-20毫升培养基。图10描述为其 原始体积二千八百分之一的帝萨体样品的典型SDS-PAGE。
使制配的外来体通过0.22微米注射器(Millex GV(25毫米注射 器))无菌过滤。
采用ELISA测量存在于以PBS缓冲液调节的外来体制品(为原 始培养基的200-倍浓缩)中的结合珠蛋白凝集物的含量，并确定为基 本上低于大约0.1纳克/毫升，更具体而言，两个受试制品为0.091纳 克/毫升或0.044纳克/毫升。比较而言，通过ELISA发现，根据现有 公布的方法，在同样浓缩200-倍之后，所获得的外来体制品中凝集结 合珠蛋白的含量为400微克/毫升。这相当于存在于未经纯化的AIM V 培养基中的结合珠蛋白凝集物的定量回收(2微克/毫升)。因此，本 发明方法现有技术方法比较，导致在外来体的制品中降低结合珠蛋白 凝集物的污染五百万至一千万倍(400微克/毫升对40-90皮克/毫升)。 因为培养基的超滤以大约500的因数降低结合珠蛋白凝集物的含量， 另外的超滤、渗滤和/或密度垫步骤亦对增加纯化效果有显著的贡献。 这些结果更进一步解释了本发明方法在去除结合珠蛋白凝集物上的功 效。 9.外来体的剂量确定
在特定的具体实施方案中，开发基于ELISA的分析，以便提供 在样品、组合物、流体等中的外来体的定量测定。图11说明在帝萨 体中HLA-DR(即MHC II)(11b)和CD81(11a)的测量。HLA/DR 测定对帝萨体的活性是灵敏的而且在功能上相关。选择该测定作为帝 萨体制品的定量测定。在下文详述该测定。
由ELISA测量到的HLA/DR信号用于确定从帝萨体制品中获得 的MHC II分子的数目。MHC II的数目与先前已报道的细胞类型的数 目相关联(Cella等1997)。表2总结了这些值。
表2每个细胞数目的MHC II分子的近似数目(改编自Cella等 1997) 细胞类型 MHC II分子/细胞 (xE6) 新鲜单核细胞 ＜0.1 经过培养的单核细胞 ＜1.0 Raji细胞 2.0 不成熟的DC 5.2 成熟的DC 8.3
为了定量HLA/DR分子的含量，使用DC溶胞产物或Raji细胞 溶胞产物作为标准。图11显示在固定浓度的不成熟DC溶胞产物下滴 定抗-HLA/DR。从该图计算出HLA/DR分子的数目对不成熟树突细胞 为5.8×106个分子/细胞，这与表1中呈现的文献值一致。对Raji细胞 的溶胞产物亦观察到相同的结果(数据未显示)。
图12(A，B)描述了获自帝萨体制品的HLA/DR测定结果的实 施例。以相等的上清液体积为函数对HLA/DR信号进行作图。在密度 垫(即UC-垫)上超速离心并渗滤至制配缓冲液中之后，HLA/DR分 子的数目/微升帝萨体确定为4.7×1010。样品的回收率％为 73％HLA/DR。更具体而言，回收率％如下：
处理步骤 总回收率
通过0.8微米的澄清 100％
第一次超滤-浓缩 100％
第一次超滤-渗滤 86+/-2％
垫-第二次超滤-渗滤 85+/-2％
0.2微米的无菌过滤 75+/-3％
总而言之，HLA/DR确定的ELISA测定定量了终产物中的帝萨 体。因为该测定亦可测量树突细胞上的HLA/DR，该测定提供涉及每 个树突细胞和每份体积分离帝萨体上HLA/DR剂量确定的方法。关于 这一点，通常我们在纯化之后每个不成熟DC能够产生最少100,000 个HLA/DR分子(10-12个实验)。
使用可供捕捉的抗第I类抗体，也就是由HC-10细胞产生的抗体， 来进行类似的测定。结果提供在图12(C，D)中。从该滴定曲线(12C) 中可确定来自任何未知外来体制品的MHC-I分子的含量(12D)。 10.确定外来体的表型
在微量离心管中使用磁架以500微升的PBS冲洗5至10微升抗- HLA-DR包被的磁珠。抛弃上清液，并在已冲洗过的小珠中加入25、 50或100微升浓缩外来体制品(外来体浓度可能高达1000倍)。4℃ 在旋转板上温育该混合物大约2小时。温育之后，将500微升PBS加 至与外来体偶联的小珠中，并使用磁架冲洗小珠。去除上清液，并将 与外来体偶联的小珠悬浮于200微升染色缓冲液中。将20微升与外 来体偶联的小珠溶液等分至测试试管中，然后使其分别与一种标记的 分析抗体接触。在4℃下温育该抗体大约30分钟。然后在试管中加入 染色缓冲液，并以1200rpm离心5分钟。抛弃上清液，并在各管中加 入固定溶液(0.5毫升)。然后获得每个测定试管，并通过流式细胞 仪使用FACSCaliburTM装置对其进行分析。
图13提供数个帝萨体制品所获得的结果。这些结果清楚地证实 要求保护的用于确定帝萨体制品的免疫表型方法的功效和速度。 11.功能测定
每种测定需要大约20微升分离的帝萨体。在37℃下100微升终 体积中，将帝萨体与100纳克/毫升的SEE(10微升PBS中的1微克/ 毫升SEE的储存液，带有0.1％BSA)一起温育1小时。在1小时温育 之后，通过区带超速离心(2.2毫升)，在由Optiprep溶液组成的两 阶段不连续梯度上，从未结合的SEE中分离出帝萨体与SEE的复合 体(帝萨体/SEE)(图14-16)。
该Optiprep梯度的制备方法是首先将1.7毫升10％的Optiprep(1.67 毫升Optiprep加8.33毫升RPMI)加至每个测试试管中。接着将100微 升20％的Optiprep(3.33毫升Optiprep加6.67毫升RPMI)加至每个 试管的底部，随后在20％Optiprep之下加入100微升40％的Optiprep (6.67毫升Optiprep加3.33毫升RPMI)。然后将PBS中含0.1％BAS 的帝萨体/SEE样品以200微升终体积铺在梯度的上方。4℃下，在悬 吊式转子(TLS-55)中使用缓慢的加速和减速，以100,000rpm离心 试管40分钟。从试管底部收集200微升样品，其含有不含未结合SEE 的帝萨体/SEE的复合体。游离的SEE留在区带层(10％Optiprep)中， 而帝萨体/SEE复合体沉降在试管的20-40％区内。因为发现optiprep 会干扰ELISA的确定，所以如果需要这种确定时，优选使用D2O蔗 糖梯度。
将Raji细胞、帝萨体/SEE(或模拟品/SEE)，然后是Jurkat细 胞加至板孔中(每孔使用100微升(30,000个细胞)各种细胞)。亦 加入阳性和阴性对照：仅有Jurkat细胞(阴性对照)、Jurkat加1纳 克/孔SEE(阴性对照)、仅有Raji(阴性对照)、Raji和Jurkat加未 以SEE脉冲的帝萨体(背景对照)、Raji和Jurkat加1纳克/毫升SEE (阳性对照)。在5％CO2 37℃下，培养该板18小时。通过以1200rpm 离心(使用板托架)15分钟，从该板的每孔中收集细胞培养上清液。 在ELISA测定中使用200微升上清液来测定IL-2的分泌。可立即或 稍后(在该情况下，可以石蜡膜包裹板并冷冻至使用为止)进行ELISA 测定。
在Costar ELISA板(Costar 2581)中，使用IL-2 ELISA试剂盒(Duo 组DY202，R&D Systems)，依据制造者的说明进行IL2 ELISA测定。 结果显示在IL2分泌和每孔的外来体含量之间的剂量-依赖性关系，这 已经将其转变为与外来体储存液相等的体积。IL2分泌是SEE-依赖性 的，因为外来体需要SEE刺激非-抗原特异细胞(例如Jurkat)。在该 方法中，引入半数最大单位作为帝萨体滴度的定量测量值的一半。将 其定义为在所用实验条件下，达到由Jurkat分泌的半数最大IL2时的 外来体的体积。测量到的半数最大单位越小，代表滴度越高。 12.直接肽装载
该实施例描述直接装载的方法学、影响装载的参数、在参考肽和 靶肽之间与帝萨体的竞争结合以及以抗原装载的帝萨体的生物活性。 方案的产生以HLA-A12限制肽的直接装载为基础。相同方案可应用 在HLA-A1限制肽上。亦讨论了帝萨体的直接肽装载在肿瘤治疗临床 试验上的重要性和优势。
该实施例显示有可能直接装载抗原分子于帝萨体上，并且如此直 接装载的帝萨体能够刺激CTL纯种系。结果显示直接装载可能比间接 DC装载更有效，因为需要较少量的肽。 12.1.方法 在β2-m存在和缺乏的情况下，直接装载肽于外来体上
通过半胱氨酸将HLA-A2限制的参考肽FLPSDCFPSV进行生物 素酰化，所述参考肽衍生自B型肝炎核心抗原的天然表位。该参考肽 与未标记的参考肽竞争，暗示生物素酰化的肽仍维持其与HLA-A2分 子结合的能力。对于在β2-m存在下的直接肽装载，4℃下用等体积的 柠檬酸或醋酸缓冲液pH3.2-5.2处理100微升纯化的HLA-A2+和HLA- A2-阴性帝萨体90秒，降低pH值有利于结合内源肽的洗脱。处理之 后，立刻用含有Tris、外源肽(终浓度从0.01至10微克/毫升)和β2- m(终浓度从0-80微克/毫升)的pH11的鸡尾酒中和该制品，并在室 温下温育，允许在帝萨体表面上重形成第I类、β2-m和肽的三分子复 合体。对于在缺乏外源β2-m情况下的直接装载，首先使帝萨体与外源 肽(终浓度10或100微克/毫升)混合，然后用等体积的醋酸缓冲液 pH4.2-5.2混合，并在室温下温育30分钟。在这段期间发生肽的交换， 导致过量存在的外源肽的结合。外源肽可以仅为生物素酰化的肽，或 标记肽与增量靶肽的混合物。不需要去除未结合的肽和β2-m，因为信 号源是来自如下所述由抗-HLA-第I类抗体捕捉的第I类/肽复合体。 利用TRF测量与帝萨体结合的参考肽
在冰上用1％NP 40溶解装载肽的帝萨体30分钟。通过包被在 ELISA板上的兔抗-小鼠IgG，由抗-第I类抗体捕捉在溶胞产物中含有 标记参考肽的第I类分子的复合体。温育和冲洗之后，加入铕标记的 链霉抗生物素蛋白，通过增强缓冲液，从铕中产生萤光信号，并根据 厂商说明(Wallac)，利用Victor 2萤光读数器读出。将萤光信号的 水平与定量的铕标准水平比较，以铕标记的链霉抗生物素蛋白的比活 性为基础，可评价生物素酰化的参考肽的绝对含量。 参考肽和靶肽与帝萨体竞争结合 在β2-m存在下的竞争
在含有20微克/毫升β2-m的装载缓冲液中，将过量达100倍的 MAGE 3A1、MAGE-3、4和10肽与5微克/毫升生物素酰化的参考肽 混合，并装载于酸处理的帝萨体上。通过TRF检测参考肽的信号并计 算由MAGE3、4和10导致的信号降低。 在β2-m缺乏下的竞争
在pH4.8或5.2的醋酸缓冲液中，制备在5-20倍过量的生物素- 参考肽中的未标记肽(100微克/毫升)。将该肽加至等体积的帝萨体 中，并在室温下温育1小时。通过TRF检测参考肽的信号，并计算由 MAGE3、4和10或MAGE 3A1导致的信号降低。 SEE测定
在37℃下，将100微升直接装载肽的帝萨体在β2-m的存在或缺 乏之下与100纳克/毫升SEE一起温育1小时。通过区带密度梯度离 心去除未结合的SEE之后，将帝萨体和SEE的复合体与Raji细胞和 Jurkat细胞一起温育18小时。收集培养物上清液，测量来自Jurkat细 胞的IFN-γ分泌。 Mart-1特异的CTL纯种系刺激测定
如上所述以MART-1肽直接装载帝萨体，并在装载之后冲洗游离 的肽，再与DC和T细胞纯种系LT 11细胞一起温育24小时。根据 下列T细胞纯种系测定，利用ELISA，通过IL-2的分泌来测量生物 活性。
所使用的肽为HLA-A2限制的MART-1肽，其具有序列 ELAGIGILTV。
通过密度梯度离心去除未结合的Mart-1肽。应了解从帝萨体中 去除未结合的肽不是必须的，但降低非特异性结合。 T细胞纯种系测定
37℃下，在U型底的96-孔板中，将20×103个衍生自树突细胞 (BM-DC)的HLA A2阳性或阴性单核细胞与15微升(1×1010个第ii 类)的帝萨体制品一起温育2小时，然后将20×103个细胞的T细胞纯 种系LT11加至人类BM-DC细胞中。每孔的终体积为200微升。在24 小时之后，收获上清液，并通过ELISA分析IL-2的存在。使用直接 以10μm mart肽(ELAGIGILTV)脉冲的HLA A2+BM-DC细胞作为 阳性对照。 P1A肽装载的帝萨体
如下直接以OVA肽257-269(SIINFEKL)装载鼠科动物的H2b 和H2d帝萨体：将1份体积的醋酸钠缓冲液(0.2M，pH5)加至1份体 积的外来体中，并在4℃下温育90秒，然后加入含有10μm的OVA 肽和40微克/毫升的人类b2-微球蛋白的Tris 2M溶液(pH11)中和。 在室温下温育4小时之后，通过optiprep梯度从未结合的OVA肽中 分离出OVA帝萨体复合体。 T细胞纯种系测定
37℃下，在U型底的96-孔板中，将25×103个D1细胞与25微 升或50微升的帝萨体制品一起温育30分钟，然后将25×103个细胞的 T细胞杂交瘤(B3Z)加至D1细胞中。每孔的终体积为200微升。在 24小时之后，收获上清液，并通过ELISA分析IL-2的存在。使用直 接以10μmOVA肽脉冲的D1细胞作为阳性对照。 12.2.结果 在β2-m的存在下直接装载HLA-A2+帝萨体
按照描述，首先利用HLA-A2限制的参考肽HFLPSDC(生物素) FPSV-OH在HLA-A2+帝萨体上进行直接的肽装载。使用HLA-A2-帝 萨体作为HLA特异性对照。图17显示在帝萨体溶解之后，以生物素- 标记的参考肽装载的HLA-A2分子在板上被抗-第I类抗体捕捉。参考 肽与帝萨体的结合是HLA-A2特异的，因为它不与HLA-A2-帝萨体结 合。该结合依赖于肽和帝萨体的含量。
使用所述的TRF测定来评估直接肽装载的参数。如SEE测定所 测量，缓冲液的选择受到对肽装载功效的影响和对帝萨体完整性的影 响。测试装载缓冲液的pH值范围，以便使装载参考肽的条件最佳。 我们发现使用类似的装载条件，采用柠檬酸磷酸缓冲液或醋酸钠缓冲 液，获得可比较的肽结合信号(图18)。为了测试弱酸处理是否可改 变帝萨体上表达的分子的构象并削弱其功能，我们进行超抗原测定， 其中超抗原SEE与帝萨体的HLA-DR分子结合，在作为辅助细胞的Raji 细胞的存在下，从Jurkat细胞中诱导分泌IL-2。图19显示在SEE测 定中，以pH4.2的醋酸钠处理的帝萨体制品诱导与未处理的对照相同 含量的IL-2分泌。以相同pH4.2的柠檬酸/磷酸缓冲液处理的帝萨体 亦诱导IL-2，虽然程度低很多。关于这一点，柠檬酸缓冲液可使帝萨 体失活，所以使用柠檬酸缓冲液装载完整细胞的条件不能有效地装载 帝萨体。因此选择醋酸钠缓冲液进行进一步的研究。我们接下来测试 外源β2-m的存在是否可促进肽与帝萨体HLA-A2的结合。图20显示 利用10微克/毫升HLA-A2限制的生物素参考肽，20微克/毫升β2-m 的加入显著增加了参考肽结合的含量。
为了确定与HLA A2分子饱和结合所需的肽的含量，我们进行肽 滴定，其中在装载期间加入0-20微克/毫升的肽。图21显示当使用超 过1.25微克/毫升的参考肽时，装载便已经饱和了。使用三种不同的 帝萨体制品，通过改变在室温下的温育时间，来评估肽装载的动力学。 图22显示在所有三种测试的帝萨体中，肽结合在30分钟到4小时之 间的温育时间内相对较恒定，这说明大部分结合发生在30分钟内。 从我们的研究中，我们认为使用pH4.2的醋酸钠缓冲液的弱酸洗脱， 10微克/毫升第I类肽，20微克/毫升β2-m，以及在室温下装载30分 钟，对在帝萨体上装载第I类肽提供了最适条件。
我们设计了肽竞争性测定，以便提供未标记的靶肽可以相同的方 式装载于帝萨体上的证据。以1-100的比例，将未标记的靶肽MAGE- 3、4或10与5微克/毫升标记的参考肽混合。参考肽萤光信号的降低 表明未标记的靶肽对帝萨体的竞争性结合。如同图23证实，所有三 种MAGE衍生的肽均与参考肽竞争和帝萨体的结合。MAGE3和10 比MAGE-4竞争得更多，或许表示在该装载条件下，对HLA-A2分子 具有比MAGE-4更高的结合亲和力。
建立使用MART-1肽特异性T细胞纯种系LT11的功能测定，以 便测试帝萨体的生物活性，其测量体外的抗原特异性T细胞反应。依 据以第I类肽直接装载帝萨体的方案，在0.01至10微克/毫升的肽浓 度下，将MART-1、HLA-A2限制肽装载于HLA-A2+或HLA-A2-帝萨 体上。随后通过密度梯度离心冲洗装载的帝萨体以去除未结合的肽。 结果呈现于图24中，并显示以10μM Mart脉冲的HLA A2+BM-DC细 胞能够激活识别带有Mart肽的HLA A2的LT11纯种系。HLA A2- BM-DC细胞不能刺激LT11纯种系。以15微升Mart直接装载的HLA A2+帝萨体脉冲的BMDC细胞能够激活LT11纯种系，无论是何种单 元型的树突细胞。
先前，间接肽装载的帝萨体仅诱导少量水平的IL-2分泌，即使 是在将10微克/毫升Mart-1肽加至DC培养物中来制备帝萨体时。以 Mart-1肽直接装载的帝萨体一致且可再现地刺激LT11纯种系，这暗 示直接肽装载是生产具有生物活性帝萨体的较有效途径。
相同的方案亦适用于直接装载HLA-A1限制肽。在该实验中，生 物素酰化的参考肽EVDPC(生物素)GHLY衍生自天然的HLA-A1 限制的MAGE3-A1肽EVDPIGHLY，与A1+/A2-帝萨体(Exo 433)结 合，但不与A1-/A2+帝萨体(Exo 427)结合。相反，HLA-A2限制的 生物素酰化的参考肽衍生自B型肝炎核心抗原，与A1-/A2+结合，但 不与A1+/A2-帝萨体结合，这证实第I类抗原肽严格的HLA-等位基因- 依赖性装载。图10的下图显示未标记的MAGE3-A1肽和生物素酰化 的MAGE-3 A1肽竞争与A1+帝萨体(Exo 433)的结合。
直接装载方法亦适用于PIA肽和鼠科动物的帝萨体。结果呈现于 图25中。以25微升或50微升直接装载H2b帝萨体的OVA脉冲D1 细胞，能够激活识别带有OVA肽的Kb的B3Z细胞。当以直接装载H2d 帝萨体的OVA脉冲D1细胞时，我们亦观察到较低程度的活化作用。
使用HLA-A1限制肽，获得类似的结果。 在β2-m缺乏之下，HLA-A2+帝萨体的直接装载
如图20所示，在pH4.2的酸洗脱之后，可在中性pH值下将外源 肽装载于帝萨体上，而无需添加外源β2-m。因为结合信号是在20微 克/毫升β2-m存在下的四分之一至三分之一，故我们使实验条件最适， 以便在外源β2-m缺乏之下增加装载的效率。测试两种肽浓度，10和100 微克/毫升的生物素酰化的参考肽以及pH4.2、4.5、4.8和5.2的醋酸 钠缓冲液。图26显示参考肽在100微克/毫升下采用pH4.8的醋酸缓 冲液大大促进了参考肽的装载。
不象在β2-m存在下装载帝萨体，其中在酸处理90秒之后很快中 和帝萨体，在β2-m缺乏下装载帝萨体，需要它们在pH4.8或5.2下停 留延长的期间，通常室温下最少30分钟。图27显示在用pH4.8或5.2 未处理或处理后，由SEE装载的帝萨体诱导的Jurkat细胞分泌IL-2 并没有差异，这暗示该处理不会损伤外来体。
为了证实在β2-m缺乏下可装载靶肽MAGE-3、4和10，进行一 组竞争实验。图28中，在pH4.8下，5-20倍的MAGE-4和MAGE-10 肽与参考肽竞争为35％或66％，类似pH4.2在β2-m存在下的抑制程 度(参见图23)，这表示可通过两种方法来装载两个肽。图29显示 在pH5.2下由Mage-3所导致的抑制。装载MAGE-3似乎在pH5.2下 比在pH4.8下更有效率，因为MAGE-3的竞争在pH4.8时弱很多(数 据未显示)。
根据上文结果，我们在β2-m缺乏之下将Mart-1肽装载于HLA-A2+ 上，并在LT11测定中对它们进行了测试。图30显示在β2-m缺乏之 下以Mart-1肽装载的帝萨体的生物活性。在该实验中，在β2-m缺乏 之下pH4.8和5.2时，以10和100微克/毫升将Mart-1肽装载于HLA- A2+(Exo 447)和HLA-A2-(Exo 450)帝萨体上。作为对照，则在β2-m 存在下亦以10微克/毫升的Mart-1装载Exo 447。以三种不同条件装 载的帝萨体(pH4.8无β2-m、pH5.2无β2-m、pH4.2有β2-m)均具有 类似的生物活性，这表示对生成具有生物活性的帝萨体而言，并非绝 对需要β2-m。 在β2-m的存在和缺乏之下，HLA-A1+/B35+帝萨体的直接装载
相同的方案可适用于直接装载HLA-A1或B35限制肽。九聚体 的MAGE-3A1(EVDPIGHLY)衍生自MAGE-3蛋白质，由HLA-A1 和HLA-B35提供。为了测试是否可将该肽装载于HLA-A1+帝萨体上， 我们设计了称作MAGE-3A1C5的参考肽，其中以半胱氨酸取代 MAGE-3A1肽的异亮氨酸并以生物素标记。在该实验中，如图31的 上部所示，在β2-m的存在下，将生物素酰化的MAGE-3A1C5装载于 HLA-A1+/A2-帝萨体(Exo 433)上。我们发现同样的肽不能装载于 HLA-A1-/A2+帝萨体(Exo 427)上。相反，衍生自B型肝炎核心抗原 的HLA-A2限制、生物素酰化的参考肽可装载于A1-/A2+，但不能装 载于A1+/A2-帝萨体上，这证实第I类抗原肽严格的HLA-等位基因-依 赖性装载。图31的下部显示天然的MAGE3-A1肽与生物素酰化的 MAGE-3A1C5肽竞争对A1+帝萨体(Exo 433)的结合，这表示未标 记的MAGE3-A1肽对A1+帝萨体的结合能力。
由于HLA-A1+帝萨体的来源有限，我们使用HLA-B35+帝萨体(Exo 426)来测试MAGE 3-A1的结合以及在β2-m缺乏之下的抑制。对 HLA-A2+帝萨体使用相同的装载条件，我们在图32的上部中直接显示 MAGE-3A1C5可在pH4.8或pH5.2下与HLA-B35+帝萨体结合，而在 pH5.2下较少与HLA-A1-B35-帝萨体(Exo 424)的非特异性结合。图 32的下部显示，在缺乏β2-m之下pH4.8和5.2时，由天然的MAGE-3A1 肽导致的MAGE-3A1C5的抑制。在pH4.8处，通过天然MAGE-3A1 的结合抑制强很多，这暗示未标记的MAGE-3A1肽在该pH值下对 HLA-B35+帝萨体具有较佳的结合能力。这些结果显示直接肽装载在其 他HLA第I类等位基因上的广泛应用。
因此，该实施例描述了通过已知为直接装载的过程，生产以免疫 原性化合物(例如第I类限制的肿瘤衍生的肽)装载的具有生物活性 的帝萨体的极有效方法。帝萨体第I类分子通过弱酸处理丧失了内源 肽和β2-m，可有效地装载靶肽，如生化和功能数据所示。将与帝萨体 结合的参考肽的萤光信号与铕标准相比较，可定量测量与帝萨体结合 的肽的含量。表3显示在β2-m缺乏之下与帝萨体结合的参考肽的绝对 含量。依据供体和所用的装载条件，每1014个第II类分子有0.1-1.2 纳克之间的参考肽。该数目显著地接近大量制造的帝萨体制品的数目 (每1014个第II类分子1纳克)，其中以大得多的规模在pH4.8下用 10微克/毫升肽进行肽装载。即使在β2-m缺乏之下结合较少(图23)， 我们的LT11测定数据(图30)显示在利用不同条件装载的帝萨体之 间具有类似的生物活性，这表示在β2-m缺乏之下直接装载对生物功能 是足够的。
通过TRF和ELISA对在帝萨体上的第I类分子水平进行定量， 允许确定肽在第I类分子上的占有率。我们已经估计参考肽在帝萨体 的HLA-A2分子上的占有率高达15％，更优选的是高达40％。肽的高 占有率大大地改善了T细胞刺激活性，所述活性由体外T细胞测定来 测量。此外，肽装载的定量和帝萨体的第I类分子上肽占有率的确定 将有助于评估基于帝萨体的治疗候选物的剂量，这对于设计动物研究 和未来临床试验都是重要方面。
亦可在β2-m缺乏之下进行直接装载。使用高肽浓度和弱酸缓冲 液在HLA分子上观察到肽的交换。我们通过竞争实验已经证实以该 方式可将我们的靶肽MAGE-3、4和10特异性地装载于HLA-A2+帝萨 体上。在β2-m缺乏之下，Mart-1肽装载的帝萨体通过LT11刺激了IFN-γ 的分泌，这证实了帝萨体的生物活性。因此，没有β2-m来制造具有生 物活性的帝萨体是可行的，并由此排除了使用从人类供体中纯化的β2- m或非-GMP级的重组β2-m的困难。在β2-m下整体装载是较低的， 但似乎不影响LT 11的活化作用，这暗示生物测定比生化测定更灵敏。
我们已经证实直接肽装载对各种HLA第I类等位基因具有广泛 的应用，如HLA-A2、A1和B35。先前，帝萨体的肽装载依赖间接的 方法，需要增加细胞培养的操作，并因此增加污染的机会。直接肽装 载在制造帝萨体时是较安全的，其排除了对β2-m的需要以及将肽加至 每个培养烧瓶中的艰难任务。
表3 帝萨体制品 HLA-第II类 (1010/微升) 皮摩尔肽/ 16.6微升Dex样品 微克肽(10-9)/ 1014第II类 pH5.2无β2-m 100微克/毫升肽 Dex 375 2.89 1.4+/-0.1 0.42 Dex 430 3.99 6+/-.05 1.3 Dex 431 1.44 1.99+/-0.1 1.2 Dex 447 12.7 1.52+/-0.1 .01 PQ01 6.57 1.3+/-0.2 0.2 VP0023-02 1.21 0.93+/-0.1 0.7 pH5.2无β2-m 10微克/毫升肽 430 3.99 0.9+/-0.2 0.2 447 12.7 1.6+/-.06 0.11 pH4.8无β2-m 100微克/毫升肽 375 2.89 4.6+/-0.4 1.4 447 12.7 8.8+/-0.2 0.6 PQ01 6.57 5.9+/-10 0.8 VP0023-02 1.21 3.6+/-0.3 2.6 pH4.8无β2-m 10微克/毫升肽 375 2.89 1.2+/-0.3 0.36 447 12.7 2.4 0.16 PQ01 6.57 1.1+/-0.1 0.14 VP0023-02 1.21 1.7+/-0.5 1.2
在种种不同的生理环境中，已经证实从不同的细胞类型中释放外 来体。特别是已经证实B淋巴细胞释放带有第II类主要组织相容性复 合体分子的外来体，其在抗原呈递上扮演某种角色(Raposo等，J.Exp. MeD.183(1996)1161)。同样，亦已经证实树突细胞产生外来体(即 帝萨体(Dexosomes)，Dex)，具有独特的结构和功能特征，并在免疫 反应的介导上扮演某种角色，特别是在胞毒性T淋巴细胞的刺激上 (Zitvogel等，Nature Medicine 4(1998)594)。亦已经证实肿瘤细胞 以调节方式分泌特定的外来体(即特赛体(texosomes)，Tex)，其带 有肿瘤抗原，并能够呈递这些抗原，或将其转送给呈递抗原细胞(专 利申请第WO99/03499号)。亦知道肥大细胞在胞内囊状区室中积累 分子，其可在信号的影响下进行分泌(Smith和Weis，Immunology ToDay 17(1996)60)。因此，原则上细胞似乎通过其释放的膜囊发出信号并 彼此联络，该膜囊可携带抗原性蛋白质(或多肽或肽)、MHC分子 或任何其他信号(细胞因子、生长因子等)，具有独特的结构和功能 特征，在不同生理状态下产生。因此这些囊，尤其是外来体，代表特 别的目的产物用于诊断、接种疫苗或治疗应用，或用来递送目的分子。 因此，对于可用来以工业规模制备适宜生物用途特别是药物用途的膜 囊的有效方法，亦将特别感兴趣。
传统上制备膜囊(例如外来体)的方法涉及一系列不同的离心步 骤，以便从出现在培养基中的细胞或细胞碎屑中分离囊。关于这一点， 上文提及的文件基本上描述利用一系列300g、10,000g和70,000g或 100,000g的离心作用来制备囊，将在离心管底部所得的沉淀以其原始 体积的千分之一再悬浮盐溶液中，从而组成浓缩的外来体溶液。然而， 因为许多理由使这些方法基本上不适用于临床应用：1)时间的长度，2) 在GMP环境中的放大和有效性，3)被细胞碎屑污染的显著风险，4)因 为操作者的变化再现性差，5)起因于形成沉淀时的外来体聚集(在沉 淀中局部有高外来体浓度)，以及6)在最后加工结束时的低回收。因 此，需要制备膜囊的改良方法，其适合工业限制并允许生产具有治疗 品质的囊制品。
国际申请第PCT/FR00/00105号公开了通过层析技术制备膜囊的 方法，如阴离子析法和/或凝胶渗透层析法。
发明概述
本发明现在提供以高产量、高纯度和相对较短的时间来制备膜囊 的新型方法。本发明亦公开鉴别膜囊制品特征(分析或确定剂量)的 方法，其可用于药物生产中以确定囊的活性、表型和/或量。本发明现 在允许生产并鉴别很多在临床上可接受的膜囊的特征，具有再现性、 不同操作者的有限变化和增加产物质量。本发明进一步涉及从各种培 养基或组合物中去除诸如结合珠蛋白的颗粒体(particulate body)的 方法、所得组合物和培养基及其用途。本发明亦涉及将免疫原性化合 物装入膜囊中的新型方法及其用途。
更具体而言，本发明一方面在于使用密度垫离心来制备膜囊的方 法。
本发明另一方面在于使用一系列超滤步骤和/或澄清步骤来制备 膜囊的方法，更具体而言，是通过超滤的浓缩和渗滤组合，优选先澄 清。
本发明另一方面在于使用密度垫离心和超滤和/或澄清步骤来制 备膜囊的方法，更具体而言，是通过超滤的浓缩和渗滤组合，优选先 澄清，接着再是密度垫离心。
在特殊方面，本发明方法包括在渗滤之前或之后的密度垫离心。
本发明的方法可应用于各种含有膜囊的生物样品，包括生物流 体、培养物上清液、细胞裂解液或纯化前的溶液。在特定的具体实施 方案中，使用该方法从富含膜囊的生物样品中制备膜囊(例如纯化、 分开或分离)。
本发明的特殊方面在于从生物样品中制备膜囊的方法，包括：
a.在允许释放囊的条件下，培养生产膜囊的细胞群，
b.膜囊富集步骤，和
c.通过密度垫离心处理该富集的生物样品。
在进一步优选的具体实施方案中，在降低颗粒体含量的培养基 中，优选是丧失了结合珠蛋白凝集物的培养基，培养生产膜囊的细胞。 在本申请中，将证实使用这类培养基允许增加产量和/或达到较高的纯 度和质量水平。
富集步骤可包括一个或多个离心、澄清、超滤、纳米过滤 (nanofiltration)、亲和层析和/或渗滤步骤。
从步骤c)中通过任何适当的方法包括吸移或利用针头可收集外来 体的制品。
在优选的具体实施方案中，该方法尚包括得自步骤c的制品的灭 菌过滤d)步骤。
可使用本发明来制备来自各种来源的膜囊，包括由抗原呈递细胞 (如巨噬细胞、树突细胞、B淋巴细胞)、肿瘤细胞或产生囊的任何 其他细胞或细胞系所生产的膜囊，优选是转导抗原的膜囊。特别适合 制备由树突细胞产生的膜囊，优选是不成熟的树突细胞(即帝萨体)。 此外，在制备之前、期间或之后，膜囊或相对应的生产细胞可被一种 或多种抗原致敏。
本发明更优选的具体实施方案包括：
·制备膜囊的方法，包括：
b.在允许由抗原呈递细胞特别是树突细胞释放膜囊的条件下， 培养该抗原呈递细胞群，特别是树突细胞，
c.膜囊富集步骤，和
d.使用密度垫离心分离膜囊。
·制备膜囊的方法，包括：
a.获得不成熟的树突细胞群，
b.在允许由不成熟的树突细胞释放膜囊的条件下，培养该不成 熟的树突细胞群，
c.膜囊富集步骤，并
d.使用密度垫离心分离膜囊。
如上所述，可在该方法中引入以一种或多种特定抗原致敏囊(或 产生细胞)的额外步骤，可在步骤b)之前致敏产生细胞，或在步骤b) 之后直接致敏膜囊。
关于这一点，本发明公开直接装载外来体的程序，特别是在从抗 原呈递细胞培养物中预制备和纯化的外来体上直接将免疫原性化合物 (如肽或脂)掺入到MHC复合体内。根据本发明的方法，对于在从 不成熟的树突细胞培养物中预先纯化的帝萨体上直接将肽装入到MHC (第I类)复合体内，是特别有利的。
如上所述，将与第I或第II类HLA结合的肽装入衍生自树突细 胞的外来体(帝萨体)内，到目前为止通过间接装载已经接近，即在 产生囊的细胞的培养物中(例如在GM-CSF和IL-4存在下，从富含 单核细胞的粘着细胞中分化出的树突细胞(DC))，加入治疗性(抗原性) 肽(例如第I类限制的肿瘤肽)(例如在第6天，以10微克/毫升) (参见例如美国专利第5,846,827号及其引用的参考文献)。假定DC 吸收外源肽，并由此产生在外来体表面上藏匿有这些第I类肽的帝萨 体。利用鼠科动物P1A肥大细胞瘤肿瘤模型的体内实验显示以此方式 产生的帝萨体诱发抗-肿瘤的免疫学反应，其导致肿瘤退化。将Mart-1 肽间接装入帝萨体内，亦可刺激从Mart-1特异的CTL纯种系LT11中 IFN-γ的少量分泌，这暗示确实发生了某种程度的肽装载。然而，即使 使用一种与放射线检测灵敏度相似的生化方法时间分辨萤光分析 (fluorometry)(TRF)，仍不易检测到这些帝萨体上的第I类肽的 结合。
为了改善方法的效率和工业上实施，发明人目前已惊人地发现有 可能直接进行装载步骤，其中在从DC培养物中纯化出帝萨体之后， 再将肽加至其上，以代替将肽加至DC培养物中的步骤。特别是发明 人目前已经发现，可开发并限定选择的酸性培养基或缓冲液，以便保 护膜囊并允许将免疫原性化合物在该膜囊的表面处直接装入抗原呈递 分子，特别是MHC分子，如第I类、第II类或CD1分子。
因此，本发明的特定目的亦在于制备免疫原性膜囊的方法，所述 方法包括从生物样品中分离或纯化膜囊，并使所述分离或纯化的膜囊 在允许免疫原性化合物与抗原呈递分子(例如，对肽而言为MHC第I 类或第II类，对脂质抗原而言为CD1)结合的条件下，在所述膜囊的 表面上与免疫原性化合物(例如肽或脂质)接触。
在优选的具体实施方案中，该方法包括在使该膜囊与免疫原性化 合物接触之前、期间或之后使分离或纯化的膜囊暴露在选择的酸性培 养基下进行处理的步骤，以便能够或促进其装载。关于这一点，按照 在本申请中的公开，使用选择的酸性培养基或处理允许至少部分地去 除结合在该囊表面上的内源肽或脂质，和/或有助于免疫原性化合物的 交换。
在更优选的具体实施方案中，在该囊与免疫原性化合物接触之后 接受离心或渗滤，优选是密度离心，以便去除未结合的免疫原性化合 物。
免疫原性化合物可以是例如任何肽或脂质，其存在于与抗原呈递 分子相连的免疫系统中。肽可以是第I类限制肽、第II类限制肽，单 独或带有其他肽的混合物或组合，或甚至是肿瘤细胞的肽洗脱物。本 发明特别适合装载有第I类限制肽。脂质可以是微生物脂质、微生物 糖脂，或脂质或糖脂的肿瘤抗原，采用分离形式或各种组合或混合物 形式。
直接装载方法提供胜过现有技术的显著优点。具体而言，如实施 例中所说的，直接肽装载比现有的间接装载更有效，使用较少量的肽 便可获得表面HLA受体的较高占有率。这明显增加了膜囊的免疫原 性潜力。此外，可更精确地控制被装载肽的结构，因为被装载的肽并 未由完整细胞加工处理过，因此在装载时仍维持完整且未被修改。本 发明现在首次显示使用纯化膜囊如帝萨体可进行直接的肽装载。关于 这一点，本发明显示将膜囊放在低pH的条件下，不会丧失其活性和 功能性。本发明亦描述允许改善直接装载的特殊条件。本发明特别显 示用于间接装载(即整个细胞装载)的传统缓冲液培养基可被不同缓 冲液培养基有利地取代以便增加直接装载效率并获得较高占有率，这 说明囊的行为并不像整个细胞一样。
在优选的具体实施方案中，本发明针对制备包括与HLA第I类 分子结合的外源第I类肽的免疫原性膜囊的方法，该方法包括(i)使 分离或纯化的膜囊暴露在选择的酸性培养基下，(ii)使所述分离或 纯化的膜囊与第I类限制肽在允许该肽与在所述膜囊表面上的HLA第 I类分子复合的条件下接触，和(iii)收集被装载的膜囊。述语“外源 的”一词意指被加至组合物中的肽。
在特定的变体中，该方法包括下列步骤：(i)使分离或纯化的 膜囊暴露在选择的酸性培养基下，(ii)使所述分离或纯化的膜囊与 第I类限制肽，在β2-微球蛋白的存在下，在允许该肽与在所述膜囊表 面上的HLA第I类分子复合的条件下接触，和(iii)收集被装载的膜 囊。更优选的是，步骤(i)包括使分离或纯化的膜囊暴露在pH大约 3到5.5之间的酸性培养基下，更优选的是在大约3.2到4.2之间，历 时少于5分钟。因为允许有效率的装载，即使是在仅使用很少量的免 疫原性化合物情况下，在β2-微球蛋白存在下进行直接装载的步骤是有 利的。确实，在使用β2-微球蛋白时，发明人已经显示有可能使用限定 的酸性培养基，其基本上从膜囊中去除所有内源肽，并因此有利于功 能性MHC复合体的复溶，即使是利用低水平的免疫原性化合物(例 如从0.005至50微克/毫升)。因此，这个步骤特别适合肿瘤洗脱物、 脂质、天然抗原或其他不能以高产经济(例如通过合成)产生的免疫 原性化合物的直接装置。
在可获得较高量的免疫原性化合物的情况下，发明人已经限定第 二个共同直接装载的步骤，其中不需要β2-微球蛋白。该具体实施方案 是有利的，因为需要较少的处理(而得以不改变外来体)，且不需要 外源β2-m，这可降低该方法的成本和加入外源物质的潜在缺陷。在这 方面，在另一个特定的变体中，该方法包括下列步骤：(i)使分离或 纯化的膜囊在缺乏β2-微球蛋白下与第I类限制的免疫原性化合物(如 肽或脂质)接触，(ii)使(i)的混合物在允许该免疫原性化合物与 任何内源化合物交换的条件下，暴露在选择的酸性培养基下或进行处 理，所述内源化合物与在该膜囊表面上的HLA第I类分子结合。(iii) 中和该培养基，终止交换和/或使在(ii)中形成的复合体稳定，和(iv) 收集被装载的膜囊。更优选的是，步骤(ii)包括使混合物暴露在pH 大约4到5.5之间的酸性培养基中一段时间，足以在任何内源分子和 免疫原性化合物之间产生交换用于结合MHC复合体。确实，发明人 现在已经显示，与整个细胞形成对照，膜囊可抵抗延长暴露在酸性培 养基或条件下，因此允许通过任何所需的免疫原性化合物来置换内源 分子，而不改变或使MHC分子失去稳定性，且基本上不会降解或去 除内源β2-m。发明人亦已经限定特定的酸性培养基和条件，允许进行 该交换作用，而不改变膜囊的功能性。这些选择的培养基最特别的特 征在于pH在大约4至5.5之间，更优选在4.2到5.2之间。将膜囊优 选与上文选择的酸性培养基接触15分钟以上的时间，但通常2小时 以下，更优选1小时以下。根据此变体，该方法不包括使用β2-微球蛋 白，通过所需肽与内源肽之间的交换而发生装载，不释放内源β2-m。 在不含β2-微球蛋白的具体实施方案中，分离或纯化的膜囊通常是与过 量的外源免疫原性化合物，例如5至500微克/毫升的第I类限制肽或 脂质，在缺乏β2-微球蛋白下接触。该具体实施方案特别适合可大量获 得的免疫原性化合物的装载，如通过合成产生的肽。
如上所述，可使用各种免疫原性分子来实施该方法。肽优选是由 第I类或第II类分子提供的肽，即起因于由抗原呈递细胞如树突细胞、 巨噬细胞和B淋巴细胞加工处理抗原而产生的肽。优选类型的肽的代 表是第I类限制肽，更优选的是第I类限制的肿瘤肽，也就是衍生自 肿瘤抗原的肽，其由树突细胞或巨噬细胞提供给免疫系统。特定的肽 包括例如HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-B35或其他 单元型限制的肿瘤肽，得自各种肿瘤细胞或抗原，如Mage、Bage、Mart、 CEA、PSA等。当然可使用分离的肽或其混合物实施该方法，如肿瘤 细胞的肽洗脱物或其他肽组合。亦可根据本发明装载衍生自其他病原 体(病毒、细胞、寄生虫等)的抗原肽，而得以产生适合用来治疗各 种疾病状况的免疫原性膜囊，例如癌症、感染或免疫疾病。
脂质可以是任何在抗原呈递细胞表面上由CD1分子提供给免疫 系统的脂质、糖脂或脂蛋白。CD1分子是类似MHC的分子，负责将 脂质或糖脂抗原呈递给T细胞。已经描述了CD1的数种同型物，包 括CD1a、CD1b、CD1c、CD1d和CD1e，其涉及提供脂质抗原。在 特定的具体实施方案中，使用该方法将脂质抗原装载到膜囊表面上的 CD1分子处，特别是装载到CD1b和CD1d处。脂质可以是任何微生 物脂质、微生物糖脂、脂质或糖脂肿瘤抗原等。脂质的更优选例子包 括分枝杆菌脂质，如分枝菌酸、葡萄糖单分枝菌酸酯、己糖-1-磷酸类 异戊二烯和脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan)(LAM)的衍生 物，如磷脂酰肌醇甘露糖苷。其他例子包括神经酰胺本身，如神经节 苷脂、糖脂肿瘤抗原等。
本发明的特定具体实施方案包括：
-制备免疫原性膜囊的方法，包括：
b)在允许由抗原呈递细胞特别是树突细胞释放膜囊的条件下， 培养该抗原呈递细胞群特别是树突细胞，
c)膜囊富集或纯化步骤，和
d)使该膜囊与免疫原性化合物在允许该免疫原性化合物与在膜 囊表面上的MHC分子结合的条件下接触，以产生免疫原性膜囊。
-制备免疫原性膜囊的方法，包括：
a.获得不成熟的树突细胞群，
b.在允许由该不成熟的树突细胞释放膜囊的条件下，培养不成 熟的树突细胞群，
c.膜囊富集或纯化步骤，和
d.使该膜囊与免疫原性化合物在允许该免疫原性化合物与在膜 囊表面上的MHC分子结合的条件下接触，以产生免疫原性膜囊。
-制备免疫原性膜囊的方法，包括：
a.获得不成熟的树突细胞群，
b.在允许由该不成熟的树突细胞释放膜囊的条件下，培养不成 熟的树突细胞群，
c.膜囊富集或纯化步骤，和
d.使该膜囊与脂质抗原在允许该脂质抗原与在膜囊表面上的 CD1分子结合的条件下接触，以产生免疫原性膜囊。
如上所述，优选进行富集或纯化以及直接装载。
本发明的特定具体实施方案在于制备膜囊的方法，包括：
a.获得抗原呈递细胞群，更优选的是不成熟的树突细胞，
b.视需要用一种或多种抗原致敏该抗原呈递细胞，更优选的是 不成熟的树突细胞，
c.在允许由该抗原呈递细胞释放膜囊的条件下，更优选的是不成 熟的树突细胞，培养抗原呈递细胞群，更优选不成熟的树突细胞，
d.培养物上清液的澄清，
e.经过澄清的上清液的浓缩，
f.经过浓缩的上清液的渗滤，
g.使用密度垫离心，分离膜囊，
h.视需要使该膜囊与肽接触，以产生装载肽的膜囊，和
i.减菌过滤在步骤g中获得的膜囊。
减菌过滤步骤i)之前可以有缓冲液交换步骤，例如通过渗滤。 图1描述典型的方法计划。在上文方法中，可进行步骤b)或步骤h)。
此外，本发明亦提供从各种培养基或组合物中去除颗粒体的方 法。更具体而言，本发明证实传统的培养基含有颗粒体，如结合珠蛋 白和相关聚合物(例如结合珠蛋白凝集物)，并公开去除相同物的方 法。更广泛而言，该方法允许生产培养基或任何其他生物产品，如血 液蛋白质或多肽(或其衍生物)、制配溶液、胎牛血清等，其基本上 丧失了结合珠蛋白凝集物。
结合珠蛋白凝集物可显示出免疫抑制活性，并因此影响膜囊或其 他生物产品的生物特性、安全性和纯度，在下文中进一步证明。然而， 在本领域中并未提出颗粒体的问题，也未确定它们出现在各种生物产 品中，而且未获得有效去除它们的方法。现在，本发明提供制备高质 量的生物产品的有效方法，所得产物亦代表本发明的目的。
关于这一点，本发明通常在于包括基本上不含颗粒体的哺乳动物 细胞培养基的组合物，更优选的是不含结合珠蛋白凝集物。
本发明亦在于丧失了结合珠蛋白凝集物的细胞培养基。
本发明更在于在具有降低颗粒体含量的培养基中包括抗原呈递细 胞(或任何其他生产膜囊的细胞，特别是树突细胞)的物质的组合物， 更具体而言，其基本上不含结合珠蛋白凝集物。更优选的是，该培养 基是经过处理去除颗粒或凝集化合物的培养基，更具体而言，是通过 超滤处理的培养基。
本发明另一方面在于使用具有降低颗粒体含量的培养物或生产培 养基来生产或培养抗原呈递细胞(或任何生产膜囊的细胞)特别是树 突细胞的方法。更优选的是，该培养基是基本上不含结合珠蛋白凝集 物的培养基，更具体而言，是通过超滤处理的培养基。
本发明亦适用于血液产品的组合物的生产，所述血液产品基本上 不含凝集的结合珠蛋白，并在将药物用途的产品制配之前，先以各种 缓冲液处理。
关于这一点，本发明亦涉及包括血液多肽或其衍生物的组合物， 其基本上丧失了结合珠蛋白凝集物。更具体而言，本发明在于包括热 灭活的血液产品的组合物，其基本上丧失了结合珠蛋白凝集物。更优 选的是，本发明涉及(热灭活的)血清-白蛋白的组合物，更优选的是 人类的血清-白蛋白，基本上不含凝集的结合珠蛋白。
本发明亦在于处理生物产品的方法，更优选的是热灭活的生物产 品，以便降低其中所含有的结合珠蛋白凝集物的含量，该方法包括使 该产品接受过滤，更优选的是超滤。
本发明的特定目的亦在于制备生物产品的方法，包括(i)生物 产品的热灭活和(ii)该热灭活的生物产品的过滤。更优选的是，该 方法尚包括下列步骤(iii)浓缩该经过过滤、热灭活的生物产品，和/ 或(iv)其调整。该方法可用于各种生物产品中，包括从诸如人类血 液或血浆或血清的哺乳动物生物流体中分离出(或萃取出)的任何蛋 白质或多肽(或其衍生物)。如同将在本申请中进一步证明，该方法 首次允许生产具有降低结合珠蛋白凝集物含量的热灭活的生物产品， 更优选的是基本上不含结合珠蛋白凝集物，并因此将增加安全性。该 方法特别适合制备从血液或血浆中萃取出的药物蛋白质，如血清-白蛋 白，更优选的是人类血清-白蛋白，γ免疫球蛋白、凝固因子等。
本发明亦在于处理血清制品的方法，更优选的是胎牛血清制品， 以便降低其中所含有的结合珠蛋白凝集物的含量，所述方法包括使该 制品接受过滤，更优选的是超滤。
如同将在下文中进一步证明，术语“基本上不含”表示组合物或 培养基含有低于大约1ppm的结合珠蛋白凝集物，更优选的是低于大 约0.5ppm，甚至更优选的是SDS PAGE分析和定量ELISA无法检测 的结合珠蛋白凝集物。
本发明另一方面在于分析或鉴别在制品中的膜囊特征(或确定剂 量)的方法，以便确定其表型和/或活性和/或含量。
更具体而言，本发明一方面在于鉴别膜囊特征的方法，其包括使 膜囊平行地与两种或多种对该膜囊的标记成分特异的抗体接触，并确 定抗原-抗体免疫复合体的形成。
另一特定的方面包括鉴别膜囊制品的活性特征，包括在辅助细胞 存在下使超-抗原-装载的囊与T细胞接触，并确定T细胞的活化作用。
本发明亦提供在样品中确定膜囊剂量的方法，包括(i)将样品 装载在固相支撑物上，(ii)使该支撑物与抗-第II类抗体(或其他相 关抗体)接触，和(iii)确定抗体-抗原免疫复合体的存在。
本发明亦包括组合物，所述组合物包含(i)膜囊，(ii)缓冲剂 和(iii)冷冻保护剂(cryoprotectant)或稳定化合物。
本发明亦包括药物组合物，所述药物组合物包含免疫原性膜囊和 可药用的稀释剂或载剂，其中通过直接装载，例如通过从含有抗原呈 递细胞(例如树突细胞)的生物样品中分离膜囊，并将免疫原性化合 物装入该分离的膜囊中，并且优选去除未结合的免疫原性化合物(有 利地通过密度离心或渗滤)，从而获得该免疫原性膜囊。优选的组合 物包括免疫原性膜囊，其中在该囊表面上的HLA分子至少有15％， 优选有至少30％，更优选有至少40％已经装载了外源肽或脂质。
本发明亦包括制备药物产品的方法，所述药物产品包含免疫原性 膜囊和可药用的稀释剂或载体，其中该方法包括(i)从生物样品(例 如含有抗原呈递细胞(例如树突细胞))中分离膜囊，(ii)以免疫 原性化合物装载分离的膜囊，产生免疫原性膜囊，(iii)优选去除未 结合的免疫原性化合物(有利地通过密度离心或渗滤)，和(iv)使 该免疫原性膜囊与可药用的稀释剂或载体接触。
本发明另一方面包括试剂盒、诊断测定、膜囊的组合物、制备膜 囊的装置或装载抗原的抗原呈递细胞(如树突细胞)或膜囊。
这包括在受试对象中产生免疫反应的方法，包括(i)获得含有 树突细胞的生物样品，(ii)从该生物样品中分离或纯化膜囊，(iii) 使该纯化的膜囊与免疫原性化合物在允许该免疫原性化合物与在膜囊 表面上的MHC分子结合的条件下接触，和(iv)给受试对象施用(iii) 的膜囊，以便在该受试对象中产生免疫反应。该受试对象优选是人类， 虽然亦可考虑兽医用途。
本发明特别适合制备帝萨体(即由树突细胞产生的膜囊)或特萨 体(即由肿瘤细胞产生的膜囊)，更具体而言是人类来源的。这些膜 囊用于各种实验、生物、治疗、诊断或预防的应用中。具体而言，膜 囊可用来调节受试对象中的免疫反应，尤其是在如癌症、自身免疫疾 病、过敏、气喘、炎症反应等的病理症状中。
图1自身帝萨体分离和纯化的特定方法的综述。
图2在第5天时，在CMV pp65 HLA-A2限制肽的存在下培养 DC。在第7天时收集帝萨体并纯化。然后在HLA-A2阳性或HLA-A2 阴性DC的存在下，将经过纯化的CMV肽-脉冲的帝萨体加至CMV pp65HLA-A2限制的T细胞系中。以ELISPOT形式进行细胞培养，其 中以对IFN-γ特异的抗体包被培养孔，并以T细胞活化的测量值列举 特异性地分泌该细胞因子的细胞存在。
样品如下：
1.T+A2+DC+外源的/A2+DC/无肽
2.T+A2+DC+外源的/A2+DC/CMV肽
3.T+A2-DC+外源的/A2+DC/无肽
4.T+A2-DC+外源的/A2+DC/CMV肽
通过比较样品2与样品1，可看出T细胞对帝萨体的特定肽反应， 并证明刺激是由于肽被掺入到帝萨体中，并且通过比较样品4与样品 3，说明并非由于游离肽直接刺激DC。
图3在通过500kDa(MWCO)中空纤维膜超滤处理之前和之后， AIM V培养基的SDS-PAGE。以100,000xg超速离心1小时，使AIM V 和UF-处理的AIM V形成沉淀。抛弃上清液，并将沉淀区重悬浮于PBS 中，第2次以100,000xg重超速离心1小时。将沉淀再悬浮于千分之 一原始体积的PBS中。在8-16％丙烯酰胺凝胶上进行20微升沉淀(还 原条件)的电泳，随后以胶状的考马斯蓝染色。
图4在通过500kDa(MWCO)中空纤维膜的超滤处理之后3个 月，AIM V培养基的SDS-PAGE。以100,000xg超速离心1小时，使 UF-处理的AIM V形成沉淀。抛弃上清液，并将沉淀区重悬浮于PBS 中，第2次以100,000xg重超速离心1小时。将沉淀再悬浮于千分之 一原始体积的PBS中。在8-16％丙烯酰胺凝胶上进行20微升沉淀(还 原条件)的电泳，随后以胶状的考马斯蓝染色。
图5利用3/0.8微米胶囊滤纸的微滤系统的图解。
图6图解：使用中空滤芯系统超滤澄清的组织培养上清液。
图7在利用500kDa中空纤维膜以PBS渗滤之前和之后，含有 帝萨体的浓缩组织培养上清液的SDS-PAGE。样品以5倍体积的PBS 渗滤。在由30％蔗糖/Tris D2O缓冲液组成的密度垫上，通过超速离心 进一步纯化渗滤之前和之后的帝萨体。描述每个被分析样品的倍比浓 度。在8-16％丙烯酰胺凝胶上，进行20微升沉淀(还原条件)的电泳， 随后以胶状考马斯蓝染色。
图8a浓缩帝萨体在30％蔗糖/Tris D2O密度垫(密度＝1.190-1.210 克/毫升)内的超速离心-样品制备。
图8b从由30％蔗糖/Tris D2O缓冲液组成的密度垫上超速离心帝 萨体中收集样品。以制配缓冲液将沉淀重悬浮成其千分之一的原始体 积。
图9a在由30％蔗糖/Tris D2O缓冲液组成的密度垫上超速离心之 后收集到的帝萨体部分的SDS-PAGE。所有样品均标准化成其二十一 分之一的原始体积。部分如下：泳道1-超滤之后/超速离心之前，泳道 2-UC密度垫部分，泳道3-在垫底部的UC沉淀/复溶成其千分之一的 原始体积，泳道4-典型沉降法获得的UC沉淀/复溶成其千分之一的原 始体积，以及泳道5-在垫上方的UC。
图9b在以100,000xg超速离心1小时之后，蔗糖/D2O密度垫的 不同部分的HLA/DR ELISA。在垫以上未观察到HLA/DR，大约10％ 的信号在复溶的沉淀中(千分之一)，而90％在垫中。
图10帝萨体的SDS-PAGE和在PBS制配缓冲液中的渗滤。通 过以100,000xg超速离心1小时沉降，进一步浓缩帝萨体。以PBS复 溶沉淀至二千八百分之一的起始上清液体积。将3.3微升的帝萨体(还 原条件)装载到8-16％丙烯酰胺凝胶上，接着以胶状考马斯蓝染色。
图11外来体的ELISA。通过超速离心形成沉淀或通过在密度垫 溶液(30％蔗糖/20mM Tris在D2O中)上超速离心，纯化外来体。至 于比较，在相等的细胞培养相等物处使用DC溶胞产物。以无脂干奶 粉阻断非特异性结合位置，并通过特异的mAb检测CD81(图11a) 和HLA-DR(图11b)，接着利用与辣根过氧化酶结合的二级抗体检 测。采用化学发光检测将样品定量，并以细胞培养相等物的函数作图。
图12帝萨体制品的HLA/DR(图12a，b)和MHC I(图12c，D) ELISA。采用前述方法制备帝萨体制品。通过过滤使细胞培养物上清 液(3.7升)澄清，超滤浓缩，在蔗糖/D2O密度垫上超速离心浓缩， 并通过超滤/渗滤利用缓冲液交换浓缩。将体积标准化，表示100×原 始上清液体积的浓缩(1微升相等物＝1毫升上清液)。
图12a以过量外来体滴定抗-HLA/DR。图12b以过量抗-HLA/DR 滴定在垫(UC-垫)中超速离心之后以及在制配缓冲液(第2次UF) 渗滤之后的帝萨体。图12c以过量帝萨体滴定抗-MHC(HC-10杂交 瘤)。图12D以过量抗-MHC I滴定帝萨体A和B。
图13图13a：帝萨体对于特异表面受体的流式细胞仪分析。有 阴影的柱形图解释以萤光标记的抗体识别提及的受体的结合的特异强 度，而空心的柱形图显示无关的背景结合。图13b：如同图13a，除 了使用未标记的一级抗体并随后以萤光标记的二级抗体进行染色之 外，因为未获得作为直接萤光结合物的乳粘附素(lactadherin)抗体。
图14使用SEE-脉冲的帝萨体的超抗原测定。按照在实例中的描 述以SEE纯化和脉冲帝萨体，然后与Jurkat T细胞和Raji细胞一起温 育。用ELISA测量IL-2的产生，并以由HLA-DR ELISA测定确定的 每孔HLA-DR分子数的函数作图。采用S形曲线使数据合格，并根据 帝萨体制品的效力的测量，衍生计算的半数最大有效剂量(ED50)。
图15帝萨体的稀释量(在附图说明中出示)以SEE脉冲，并与 Jurkat和Raji细胞一起培养，来测试Dex制品的效力。在从Optiprep 垫中回收之后，使每个样品接受连续滴定，并在细胞测定中测试。数 据显示在每个帝萨体制品的稀释度修正之后，记录相同程度的活性， 如果看到曲线对于0.7微升至50微升的外来体范围记录到接近半数最 大活性(接近350皮克/毫升IL-2)，这代表在接近100倍的范围内测 定是线性的。测定结果令人意外，使得该测定在测量大范围浓度的未 知帝萨体制品时是极为有用的。
图16通过形成沉淀和区带超速离心纯化的外来体/SEE复合体的 HLA/DR ELISA比较。
图17与HLA-A2+(上方)和HLA-A2-(下方)帝萨体结合的 肽。以由装载帝萨体的说明所指示的浓度，使用生物素酰化的参考肽。 在y-轴上，以Eu萤光(每秒计数)来表示肽结合的含量，作为帝萨 体溶胞产物测定量的函数(在x-轴上，以微升体积表示。)
图18利用不同的缓冲液和pH值的肽装载。使用pH3.2-5.2的醋 酸或柠檬酸缓冲液，装载生物素酰化的参考肽。在y-轴上，以Eu萤 光计数来表示肽装载的量。
图19以pH4.2醋酸钠缓冲液的弱酸处理的帝萨体比pH4.2柠檬 酸处理的帝萨体保留了更佳的功能活性。
以柠檬酸(缓冲液A)或醋酸钠(缓冲液B)处理Dex，以‘SEE’ 超抗原脉冲，并在功能测定中测试，通过测量其诱发效应细胞分泌IL-2 的能力，从而评估对帝萨体生物活性的影响。在y-轴上，以帝萨体体 积为函数表示IL-2分泌。
图20β2-微球蛋白可促进直接的肽装载。利用浓度从0至80微 克/毫升的β2-微球蛋白，装载生物素酰化的参考肽。在y-轴上，以Eu 萤光(每秒计数)来表示肽结合的含量作为β2-微球蛋白浓度的函数。
图21参考肽与帝萨体结合的饱和度。以0-20微克/毫升的浓度 装载生物素酰化的参考肽。在y-轴上，以Eu萤光(每秒计数)来表 示肽结合的含量作为参考肽含量的函数。
图22与帝萨体结合的参考肽的动力学。在室温下，装载生物素 酰化的参考肽0.5至4小时。在y-轴上，以Eu萤光(每秒计数)来 表示肽结合的含量作为参考肽与帝萨体的温育时间的函数。
图23未标记的参考肽、MAGE3、4和10与生物素酰化的参考 肽对帝萨体的结合竞争。将1-100倍未标记的参考肽、MAGE-3、4和 10与生物素酰化的参考肽(5微克/毫升)一起温育，以便竞争对帝萨 体的结合。在y-轴上表示的抑制百分比作为竞争肽的数量的函数。
图24使用装载Mart-1的帝萨体的T细胞纯种系测定。
图25使用装载P1A的帝萨体的T细胞纯种系测定。R&D为100 单位的IL-2标准测定。
图26在缺乏β2微球蛋白的情况下，比较在pH4.8和5.2的醋酸 缓冲液中以生物素标记的参考肽与帝萨体的结合。在y-轴上，以Eu 萤光计数来表示肽装载的含量。
图27以pH4.8和5.2的醋酸钠缓冲液弱酸处理的帝萨体象未处 理的帝萨体一样保留了相同的功能活性。以pH4.8或5.2的醋酸钠(缓 冲液A)处理Dex，以‘SEE’超抗原脉冲，并在功能测定中测试， 通过测量其从效应细胞中诱发IL-2分泌的能力，来评估对帝萨体生物 活性的影响。在y-轴上以帝萨体体积为函数来表示IL-2的分泌。
图28 MAGE 4和10与生物素酰化的参考肽对帝萨体的结合的竞 争。将5-20倍的MAGE-4和10与100微克/毫升的生物素酰化的参考 肽一起温育，以便在pH4.8时缺乏β2微球蛋白的情况下竞争对帝萨体 的结合。在每栏的上方，以竞争肽含量为函数来表示抑制百分比。
图29 MAGE 3与生物素酰化的参考肽对帝萨体的结合的竞争。 将5-20倍的MAGE-3与100微克/毫升的生物素酰化的参考肽一起温 育，以便在pH4.8时缺乏β2微球蛋白的情况下竞争对帝萨体的结合。 在每栏的上方，以竞争肽含量为函数来表示抑制百分比。
图30在β2微球蛋白缺乏之下，通过装载Mart-1肽的帝萨体刺 激LT 11而分泌IFN-γ。通过装载Mart-1肽的帝萨体，在作为辅助细 胞的DC的存在下，刺激LT 11细胞，并在y-轴上以帝萨体为函数来 表示从LT 11中分泌的IFN-γ。以在β2微球蛋白的存在下pH4.2时亦 装载的Exo447作为对照。
图31在β2微球蛋白的存在下，HLA-A1限制肽的结合(上方方 格)和抑制(下方方格)。上方方格：HLA-A1限制、生物素标记的 肽MAGE-3C5特异性地与HLA-A1+帝萨体结合。下方方格：通过未 标记的MAGE-3A1肽抑制结合。
图32在缺乏β2微球蛋白的情况下，在HLA-A1/B35限制、生物 素标记的MAGE-3C5和未标记的MAGE-3A1/B35肽之间对HLA-B35+ 帝萨体(Exo 426)的竞争。
发明详述
如上所述，本发明提供制备和/或鉴别膜囊特征的新型方法和组 合物，其适用于药物领域，如各种病理学状况的免疫治疗。本发明亦 公开从组合物中去除结合珠蛋白凝集物的方法，如培养基、生物产品 及其类似物，其可用在各种药物或实验的范围中。
现在将提供各种步骤的详细说明，所述步骤根据本发明优选的特 定具体实施方案可被实施制备膜囊。应了解本发明并不限于包括所有 这些步骤的方法，还包括如同上文提及的单个步骤本身。
在图1中描述制备膜囊的完整方法的图解示意图。该通用方法包 含数个主要阶段，包括(i)生产含有膜囊的(生物)样品，(ii)富 集阶段，(iii)密度垫分离阶段，(iv)制配和调整阶段以及(v)质 量控制或鉴别特征的阶段。此外，本发明亦描述从诸如培养基的生物 物质中去除结合珠蛋白的方法。 结合珠蛋白凝集物的去除
本发明的特殊且重要的方面在于提供基本上不含诸如结合珠蛋白 (及相关聚合物)的颗粒体的组合物，更具体而言，为基本上不含结 合珠蛋白凝集物的组合物。本发明特别在于提供细胞培养基或生物产 品，如分离自生物流体的蛋白质或多肽(或其衍生物)(例如hSA组 合物、γ免疫球蛋白、凝固因子、血清等)或缓冲液制配，其基本上不 含凝集的结合珠蛋白。
结合珠蛋白是复合的(α-β)2四聚体蛋白质，以各种组合掺入两 种类型的α链、α-1(8.86kDa)和α-2(17.3kDa)。已经报告了在热 灭活血清产物后，结合珠蛋白可形成大的蛋白质凝集物(“Biological Functions of Haptoglobin-New Pieces to an OlD Puzzle”.W. Dobryszycka，Eur.J.Clin.Chem.Biochem.1997，35(9)，第647-654页； “Immunosuppressive Effect of Accute-Phase Reactant Proteins in vitro and its Relevance to Cancer”，R.Samak等，Cancer Immunol Immunother 1982，13，第38-43页)。此外，已知结合珠蛋白可显示出免疫原性活 性(Dobryszycka，同上，Oh等，J.National Cancer Institute 1990，82(11)， 第934-940页)。本发明现在认识到存在于许多生物产品中的结合珠 蛋白凝集物是非常重要的，并提出允许去除它的新型方法。
更具体而言，在本发明的上下文中，结合珠蛋白凝集物是指任何 包括结合珠蛋白多肽或链的颗粒体，更优选的是通过S-S结合与任何 其他多肽或蛋白质交联的颗粒体，例如，特别是结合珠蛋白多肽和白 蛋白的任何混合凝集物。这类结合珠蛋白凝集物亦可包括额外的组 份，如血红素结合蛋白、转铁蛋白(transferring)、Gc-球蛋白和/或β2- 糖蛋白，如同Jensen等(Vox Sang 67，1994，125)所描述。
虽然在研究和临床应用中常规使用培养基，但在本领域中未曾提 及大的可溶性蛋白质凝集物(或颗粒)的问题，亦未建议去除它们。 本发明现在显示，当通过超速离心形成沉淀时，得自AIM V的蛋白质 凝集物与帝萨体共同-纯化。此外，本申请亦显示在AIM V中通过超 滤产生的帝萨体的浓缩导致AIM V蛋白质的浓缩。再者，经过浓缩的 帝萨体的SDS-PAGE(图3)在42kDa和64kDa处显示2个主要的 条带，相当于结合珠蛋白的β-链和白蛋白。
因此，本发明证实在传统的哺乳动物细胞培养基中发现结合珠蛋 白凝集物(包括亚基、交联链、凝集形式等)。本发明进一步显示不 能借助传统的外来体纯化方法来去除结合珠蛋白凝集物。本发明现在 提供去除颗粒体的方法，更优选的是从诸如培养基、生物组合物、缓 冲制配等的生物物质中去除结合珠蛋白凝集物。本发明亦公开基本上 丧失了结合珠蛋白的物质的新型组合物及其用途。诸如结合珠蛋白凝 集物的大蛋白质凝集物的去除(或降低浓度)提供数个显著的优势， 如增加纯度、增加安全性、降低非特异的免疫抑制活性等。此外，本 发明亦公开不含凝集的结合珠蛋白的培养基仍允许有效的细胞培养和 外来体的生产，同时大大地促进了外来体的纯化。从培养基中去除蛋 白质凝集物，提供免于对血清组份如结合珠蛋白诱导不想要的免疫反 应的额外保护(Dobryszycka，同上)。关于这一点，人们认为结合珠 蛋白凝集物比已知是免疫抑制性的非凝集结合珠蛋白可引起更多的不 想要的免疫反应(Se-Kyung Oh等，J.Natl Cancer Inst.1990，82，934- 940，Interference with immune response at the level of generating effector cells by tumorassociated haptoglobin)。已知蛋白质凝集物具有比可溶 形式高出10,000(一万)倍的免疫原性，因为它们优先被抗原呈递细 胞捕捉(M.Kovacsovics-Bankowski等Proc Natl Acad Sci USA 1993，90， 4942-4946，Efficient major histocompatibility complex class I Presentation of exogenous antigen upon phagocytosis by macrophage)。所以，即使 以极低剂量存在，结合珠蛋白凝集物仍可能是有害的。
此外，本发明的方法亦允许去除其他颗粒体，如外来体，其可存 在于含有血清的培养基中。去除先存的外来体进一步增加了产物的纯 化，并避免被其他的免疫-刺激剂污染。 去除方法
根据本发明，可使用各种方法去除颗粒体(例如蛋白质凝集物， 更具体而言为结合珠蛋白凝集物)，如(超)过滤、微滤、尺寸排阻 层析法(SEC)、亲和层析法、离子交换层析法和超速离心。亦可能 通过这些方法，在利用培养基制配之前，先去除在人类血清组份中的 蛋白质凝集物(也就是部分V)。
在优选的具体实施方案中，通过超滤处理培养基或组合物，以便 去除蛋白质凝集物或其他颗粒体，更具体而言，为凝集的结合珠蛋白。
在特定的具体实施方案中，使用500kDa中空纤维膜进行超滤。 对该应用而言，这是优选的截留分子量(MWCO)，因为需要使诸如 转铁蛋白(大约75-80kDa)的蛋白质通过该膜。由ELISA测量转铁 蛋白的浓度显示它定量地通过了该大小的孔。该膜的尺寸将蛋白质凝 集物保留在存留物(retentate)中，而允许未凝集的蛋白质与滤液 (permeate)一起通过。收集滤液，通过0.22微米的滤纸灭菌过滤至 瓶中，并储存在4℃下至使用为止。
虽然500kDa MWCO的中空纤维膜对培养基的超滤是优选的， 但亦可使用其他尺寸的膜，如750kDa、300kDa、100kDa等。优选 直径在100kDa至1000kDa之间的膜来超过滤培养基，更优选的是在 200kDa到750kDa之间。关于这一点，申请人通过动态光散射测定， 现在已确定存在于培养基或其他生物产品如加热过的血清白蛋白中的 结合珠蛋白凝集物，90％直径在大约40纳米到大约200纳米之间。因 此，任何孔径低于大约40纳米的膜(或其他分离装置，如滤纸、中 空纤维等)都将是适合和优选地进行本发明。举例来说，500kDa的 MWCO代表孔径在大约20-25纳米之间。
同样，虽然中空纤维膜形式是超滤的优选具体实施方案，但亦可 以卡匣形式使用其他类型的超滤装置(也就是平板或框架的卡匣)， 如Millipore Pelicon和相关产品，以及得自Sartorius Inc或Filtronics Inc 的卡匣。膜的材料通常是由聚醚碸(PES)所组成，然而亦可使用其 他的材料，如聚丙烯。
此外，在培养基超滤中可使用大范围的操作参数。最佳处理的操 作参数通常是进口和出口压力维持在5-15psi之间。在处理过程中可 使用较低或较高的压力。
在另一特定的具体实施方案中，通过微滤(0.05微米、0.1微米、 0.2微米等)处理培养基以去除颗粒体(例如蛋白质凝集物)。优选 纤维的孔直径为0.5毫米，然而，亦可使用其他直径，如0.25毫米、 0.75毫米和1毫米。
这些各式各样的处理允许生产具有降低颗粒体含量的培养基或生 物产品，现在已经显示其可显著促进外来体的纯化以及所得制品的质 量。 不含凝集的结合珠蛋白的培养基
因此，在特定方面，本发明在于使用预处理的具有降低的颗粒体 含量的培养基，以及包括这类预处理的培养基的物质的组合物。确实， 目前已显示经预处理降低颗粒蛋白质(或蛋白质凝集物)含量的培养 基，显著降低了在该方法中出现的污染，增加该方法的效率，允许以 较高的纯度和安全性来生产外来体制品，而且不影响培养效力或细胞 的存活力。
因此，在本发明特定的具体实施方案中，通过培养在具有降低颗 粒体(或蛋白质凝集物)含量的培养基中的细胞所生产的生物样品来 制备膜囊。
此外，本发明的另一目的在于生产树突细胞的方法，包括在含有 生长因子和/或细胞因子的培养基中培养树突细胞前体，从而影响或刺 激该前体分化成树突细胞，特别是分化成不成熟的树突细胞，其中该 培养基具有降低的颗粒体含量，更优选是基本上不含结合珠蛋白凝集 物。
本发明亦在于包括在具有降低颗粒体含量，如结合珠蛋白凝集物 含量的培养基中树突细胞的组合物(或任何其他产生膜囊的细胞)， 更具体而言，是在基本上不含凝集的结合珠蛋白的培养基中。
培养或生产培养基可以是任何适合培养哺乳动物细胞的培养基， 特别是人类细胞的培养基。这类培养基的例子包括AIM V、RPMI、 DMEM及其类似物，更广泛而言，为任何包括蛋白质(或其血清或取 代物)的哺乳动物细胞培养基。优选的培养基包括不含血清的培养基， 其适合临床用途。
术语“基本上不含”、“丧失了”或“降低结合珠蛋白凝集物的 含量”表示该培养基或产物按凝集的结合珠蛋白的重量计优选含有低 于1ppm的结合珠蛋白凝集物，更优选的是低于0.5ppm。更具体而言， 通过SDS PAGE和ELISA，目前申请人已确定可从生物产物如AIM V 培养基中去除99％以上的结合珠蛋白凝集物。更具体而言，培养基基 本上缺乏具有直径超过100纳米的颗粒体(包括蛋白质凝集物、沉淀 物及其类似物)。在进一步优选的具体实施方案中，培养基基本上缺 乏不能通过500kDa膜的颗粒体(包括蛋白质凝集物、沉淀物及其类 似物)。本发明更优选的培养基是由ELISA确定(使用例如Sigma的 单克隆抗体H6395)的含有低于大约20纳克/毫升，更优选的是低于 大约10纳克/毫升的凝集的结合珠蛋白的培养基。此外，应注意的是 结合珠蛋白凝集物的存在通常不显著，直到培养基被浓缩时(通过超 速离心或超滤)才会显著。因此，本发明的优选培养基不含有如被SDS PAGE分析和ELISA测量到的结合珠蛋白凝集物。 不含凝集的结合珠蛋白的生物产品
本发明亦适用于生产基本上不含凝集的结合珠蛋白的生物产品 (例如血液产品)的组合物，以及在将产品制配用于药物用途之前， 先用来处理各种缓冲液。
关于这一点，本发明涉及包括生物多肽或其衍生物的组合物，其 基本上丧失了结合珠蛋白凝集物。更具体而言，本发明在于包括热灭 活的生物多肽的组合物，其基本上丧失了结合珠蛋白凝集物。该生物 多肽可以是任何从哺乳动物生物流体中，特别是从血液、血清或血浆 中分离(或萃取)出的多肽、蛋白质或肽。生物多肽的优选例子包括 血清-白蛋白、γ免疫球蛋白、凝固因子(例如因子VIII、因子IX)， 更优选是它们来源于人类。本发明的组合物更优选其特征在于含有低 于大约0.01％的结合珠蛋白凝集物，特别是低于大约0.001％。
在特定的例子中，本发明涉及热灭活的血清-白蛋白的组合物， 更优选的是人类血清-白蛋白，所述组合物基本上不含凝集的结合珠蛋 白。纯化的hSA被广泛用于药物工业上(血浆补体、蛋白质稳定剂等)。 经证实存在于hSA溶液中的结合珠蛋白是造成热处理期间形成凝集物 的原因。而且，凝集的蛋白质似乎比其未凝集的形式具有高出至少一 万倍的免疫原性，使得它们的存在可能对于该制品的活性和安全性是 有害的。现在，本发明允许从hSA制品中去除任何这类的结合珠蛋白 凝集物，更具体而言，经过如上所述的超滤，由此为药物用途提供具 有高纯度和质量的新型hSA组合物。更具体而言，本发明现在提供按 重量(wt)计含有低于大约0.01％凝集的结合珠蛋白的hSA制品，更 优选的是低于大约0.001％wt。本申请中所述的特定例子证实利用本发 明可获得含有大约0.00025％wt或更少的凝集的结合珠蛋白的白蛋白 制品。更优选的是，本发明的白蛋白制品(或组合物)为经过加热的 hSA制品(或组合物)，特别适合药物用途。
本发明亦在于处理生物产品，更优选的是热灭活的生物产品，以 降低其中所含有的结合珠蛋白凝集物的方法，该方法包括使该产品接 受过滤，更优选的是超滤。
本发明的特定目的亦在于制备生物产品的方法，包括(i)生物产品 的热灭活，以及(ii)热灭活的生物产品的过滤。更优选的是，该方法尚 包括(iii)浓缩该经过过滤、热灭活的生物产品，和/或(iv)及调整的步骤。 该方法可用于各种生物产品，所述生物产品包括任何分离(或萃取) 自哺乳动物生物流体如人类血液或血浆或血清的蛋白质或多肽(或其 衍生物)。如同在本申请中将进一步证明，该方法首次允许生产具有 降低结合珠蛋白凝集物含量的热灭活的生物产品，更优选生物产品基 本上不含结合珠蛋白凝集物，并因此增加安全性。该方法特别适用于 制备从血液或血浆中萃取的药物蛋白质，如血清-白蛋白，更优选的是 人类血清-白蛋白、γ免疫球蛋白、凝固因子等。过滤步骤优选包括超 滤，更优选的MWCO是在大约100kDa到大约1000kDa之间，通常 是在200kDa到750kDa之间。可以上文公开的任何装置和条件进行 该过滤。此外，亦可使用上述的其他方法。
关于这一点，本发明亦涉及处理白蛋白制品的方法，包括使白蛋 白制品接受过滤，优选的是超滤。更优选的方法在于在平均孔径为200 kDa到750kDa之间的多孔装置上通过超滤处理加热的hSA组合物(或 制品)。因为在药物领域中使用大量的hSA，申请人的方法和高质量 的组合物代表在安全性上的显著优势。 样品的生产
如同上文指出，本发明涉及膜囊的生产，并适合从各种来源来制 备膜囊，包括由抗原呈递细胞(如巨噬细胞、树突细胞、B淋巴细胞)、 肿瘤细胞或任何产生膜囊的其他细胞或细胞系生产的膜囊。其特别适 合制备由树突细胞生产的膜囊，优选由不成熟的树突细胞(即帝萨体) 生产。此外，可在制备之前、期间或之后使膜囊或对应的生产细胞对 一种或数种抗原致敏。 单核细胞的细胞培养
WO99/03499已公开生产含有帝萨体或其他膜囊的生物样品的各 种方法，在此引作参考。
在本发明范围内的优选方法学是基于从单核细胞前体或骨髓中生 产树突细胞(“DC”)，更优选的是不成熟的DC。确实，发明人已 经显示不成熟的DC具有产生外来体的能力，而成熟的DC基本上无 法这样做。更具体而言，在本发明的范围内，优选使用在细胞因子组 合的存在下，更优选的是在缺乏DC成熟因子或条件之下，处理单核 细胞前体(包含在血液或骨髓中)和/或一段不允许DC成熟的期间而 获得的不成熟树突细胞的组合物。
不成熟树突细胞的组合物优选基本上包括(即至少60％，优选 70％)不成熟的树突细胞。
因此，树突细胞的制备步骤有利地包括制备不成熟树突细胞的组 合物，特别是人类来源的不成熟树突细胞，尤其是得自单核细胞前体， 更具体而言，是以诸如GM-CSF+IL-4或GM-CSF+IL-13的细胞因子 的组合在成熟因子缺乏之下和/或在不含血清的培养基中进行处理，以 避免其成熟。
此外，在本发明的范围内，亦可能使用无限增殖化的树突细胞群。 这些群可由无限增殖化的树突细胞系(例如D1系或任何其他通过在 树突细胞中导入例如myc致癌基因而产生的系)所组成。它们亦可由 体外制备并无限增殖化的树突细胞所组成。无限增殖化的树突细胞的 目的在于组成对给定抗原组致敏细胞库，其可在工业上用来制备适宜 给整个患者家族施用的帝萨体。
为了生产膜囊(帝萨体)，在本领域技术人员已知的传统条件下 可简单培养不成熟的树突细胞群。然而，优选是在刺激帝萨体产生的 条件下培养这些细胞，特别是在能够刺激帝萨体产生的因子存在下， 尤其是诸如γ干扰素、介白素10或介白素12的细胞因子(例如参见申 请WO99/03499)。在根据本发明方法的优选具体实施方案中，在刺 激膜囊产生的条件下培养不成熟的树突细胞群。预备实验显示在临床 前的小鼠肿瘤模型中加入干扰素γ促进了体内帝萨体的效力。在第7 天，收集培养基，进行后续的帝萨体分离。
在本发明特定的具体实施方案中，在一种不含血清的细胞培养基 的临床级AIM V(Life Technologies，Inc.)中培养患者的外周血液样 品。在使用之前，使培养基接受超滤，去除凝集的蛋白质(例如结合 珠蛋白)，申请人显示该凝集蛋白质的去除不影响细胞的生长，还很 有助于后续分离纯的帝萨体。
当然，可通过任何其他的方法制备膜囊并用于本发明中。具体而 言，膜囊可以人工产生，或利用无限增殖化的细胞系产生或从先前建 立的集合或库中获得。 细胞或囊的致敏：抗原装载
在膜囊产生之前(或期间)，可使产生膜囊的细胞对抗原致敏。 或者，可致敏膜囊本身。本具体实施方案允许产生具有给定免疫原性 的囊。可使用不同已熟知的技术进行致敏，包括例如使细胞与抗原性 肽、抗原、蛋白质复合体、表达抗原的细胞或细胞膜、细胞凋零体、 膜囊、脂质体、肿瘤RNA或编码一种或多种抗原、抗原决定簇或表 位的任何核酸(可能由病毒或非-病毒载体携带)等接触(例如参见申 请WO99/03499)。或者，可通过囊的直接肽装载，也就是通过使囊 与抗原性肽接触，来进行致敏。确实，本申请显示囊的直接肽装载是 可能的，并给该囊提供改良的免疫原性。在优选的方法中，通过将产 生细胞与肽、抗原、RNA或核酸一起温育，或通过囊的直接肽装载， 来进行致敏。当然本申请不限于致敏或生产技术。
通过使细胞(或囊)暴露在该抗原、对应的蛋白质、肽、核酸及 其类似物之下，可使用许多抗原致敏树突细胞(或膜囊)。优选的抗 原为肿瘤抗原、病毒抗原、细菌抗原及其类似物。代表性的肿瘤抗原 包括黑色素瘤抗原(MAGE、MART、BAGE等)、前列腺特异的抗 原(例如PSMA)、CEA、ras、p53、Rb、肝脏肿瘤抗原等。
蛋白质抗原在树突细胞(“DC”)内部加工成特定的肽，然后 由MHC分子捕捉并呈递至细胞表面。对于给定的蛋白质，人类DC 的不同HLA单元型呈递不同的肽(表位)。通过在适当的条件下将 DC与肽一起温育，可将相关肽装载至MHC第I类的DC上。亦可能 体外直接将抗原装载在分离的帝萨体上。在特定的实施例中，为了用 于装载患者的帝萨体，合成包括HLA-A2的已知表位的MAGE-A3和- A4肽。在该实验中，患者的内含物标准包括HLA-A2单元型的表达。 HLA A2+单元型相对较频繁，大约有50％的人群存在。
此外，亦可加入对照抗原，如TT(破伤风毒素)和CMV肽，特 别是TT P2肽。对照抗原的目的是作为内在对照，以便利用已知抗原 测试帝萨体在抗原呈递上的功能。因此，作为阳性对照，亦利用例如 CMV肽(第I类)和TT P2肽(第II类)装载帝萨体。这些对照的 阳性反应显示帝萨体具有活性。CMV具有提供测试最初和回忆的抗 原反应两者的优点，因为大约50％的一般群体是对CMV具有免疫力 的(回忆的)，而剩下的则是幼稚的(最初的)。
其他的抗原是脂质抗原，如由CD1分子呈递给免疫系统的任何 脂质、糖脂或脂蛋白。脂质可以是任何微生物脂质、微生物糖脂、脂 质或糖脂的肿瘤抗原等。脂质的特定例子包括分枝杆菌脂质，如分枝 菌酸、葡萄糖单分枝菌酸酯、己糖-1-磷酸类异戊二烯和脂阿拉伯甘露 聚糖(LAM)的衍生物，如磷脂酰肌醇甘露糖苷。其他的例子包括神 经酰胺本身，如神经节苷脂、糖脂肿瘤抗原等。
下文的实施例3描述在树突细胞和帝萨体上装载和测定CMV肽 (抗原)的模型系统中获得的初步结果。结果证实经过装载的囊具有 刺激抗原特异的CTL的能力(图2)。
应了解在本发明中，可使用任何其他的致敏方法和抗原，以便鉴 别膜囊所需的免疫原性特性。
关于这一点，本发明也描述直接装载膜囊例如帝萨体的方法。可 使用第I类或第II类肽或脂质进行该方法，并提供胜过现有技术的显 著优点。特别如实施例中所说明，直接装载比现有的间接装载更有效 在于使用较低量的肽便可获得表面HLA受体的较高占有率。这明显 增加了膜囊的免疫原性潜力。此外，可更精确地控制已装载肽的结构， 因为被装载的肽并未由整个细胞加工处理，因此在装载后仍保持完整 和未经修饰。本发明现在首次提出并显示使用经过纯化的膜囊如帝萨 体可进行直接装载。关于这一点，本发明显示将膜囊置于低pH条件 下不会丧失其活性和功能性。本发明亦描述允许改善直接装载的特定 条件。本发明尤其显示利用不同缓冲液培养基可有利地代替间接装载 (即整个细胞的装载)所使用的传统缓冲液培养基，从而增加直接装 载的效率并获得较高占有率，这显示囊的行为并不像整个细胞一样。 本发明亦首次显示，与整个细胞对照，膜囊可抵抗延长的酸处理或培 养基，由此允许通过替换直接装载，即使是在缺乏加入β2-m的情况下。
在第一个变体中，直接肽装载的方法包括下列步骤：(i)使分离或 纯化的膜囊置于选择的酸性培养基下，和(ii)使(i)的膜囊优选在中和期 间或之后与选择的肽在β2-微球蛋白的存在下接触，以便将该肽装载到 该膜囊上。在进一步优选的具体实施方案中，选择的肽是由第I类分 子呈递的肿瘤抗原肽，也就是第I类限制的肿瘤肽。
在该第一个变体中，首先使膜囊(例如帝萨体)置于选择的酸性 培养基中。该酸性洗脱去除至少一部分内源以及在囊表面处与HLA 第I类或第II类分子结合的β2-微球蛋白(β2-m)，但不改变外来体 的生物和免疫特性。这步处理是有利的，因为它避免或降低了针对内 源肽的二级免疫反应。如同申请人确定，选择的酸性培养基或处理优 选包括使囊置于pH值在2至6之间的培养基下，更优选的是在3到 5.5之间。本申请确实显示可在如此酸性的pH值下处理外来体而仍保 留其生物特性。具体而言，本申请惊人地显示可使外来体接受弱酸的 处理、中和并装载所需的肽，而仍显示出刺激对所需肽的有效免疫反 应的能力。该培养基尚可包括任何适当的缓冲液，如柠檬酸盐、醋酸 盐等。关于这一点，本发明人已经显示更优选的培养基，包括醋酸钠， 与传统的柠檬酸盐缓冲液比较，其提供增加的装载性能。从任何传统 的培养基或生长培养基中可衍生选择的培养基，并通过在其中加入缓 冲条件来制备，以便达到所描述的pH值。培养基亦可以是人造的或 合成的，根据本领域已知的方法，使用各种缓冲液的营养物。基本上， 根据本发明选择的酸性培养基意指任何允许维持膜囊的培养基、生 长、调整或其他液态溶液或缓冲液，具有如上所述pH的溶液，并且 优选包括醋酸盐例如醋酸钠的溶液。
在低温下进行弱酸处理，通常低于8℃，优选大约4℃，基本上 持续15分钟或更短，优选10分钟或更短，更优选5分钟或更短。应 了解使用本申请和实施例的教导，专业技术人员可调整处理的条件(培 养基、pH值、温度、持续时间等)，而不背离本发明。
根据传统方法，通过增加该溶液的pH值可进行中和作用。中和 作用优选导致pH值在5.5以上的培养基，通常在大约6到大约9之 间。通常通过在培养基中加入pH值为大约10或11的中和培养基， 例如Tris缓冲的溶液，来进行中和作用。
肽与外来体接触应该在足以允许该肽与在外来体表面上的MHC 分子结合的条件下进行。通常在中和作用过程中或之后加入外源(第 I类)肽和β2-m，优选是过量的，以便在与该肽和β2-m形成复合体之 后促进HLA第I类的复溶，而得以装载该肽。不一定要在中和作用之 前消除分离的内源肽，或在接触之后去除未结合的肽。通常可使用从 0.005到50微克/毫升的β2-m。可通过各种技术生产肽和β2-m，如重 组生产、合成等。应了解β2-m优选是人类来源的(人类β2-m有市售 (Sigma)，并可通过传统技术生产)。例如在室温下可进行接触多 达大约2小时。实施例显示早在接触后30分钟便达到饱和。使用TRF 和生物素酰化的参考肽，我们可确定直接装载于帝萨体上肽的含量， 并证实在标记的参考肽和未标记的靶肽之间有结合竞争，这说明靶肽 直接装载于帝萨体上是成功的。以此方式，利用Mart-1肽在低至0.1 微克/毫升的浓度下装载帝萨体一致且再现地刺激Mart-1特异的CTL 纯种系LT11以产生IL-2(实施例12)。
在另一个变体中，该方法不需要使用β2-微球蛋白。确实，发明 人已经显示，有可能限定去除内源肽的适当条件，而不会彻底去除或 使内源β2-m丧失稳定性，以致于即使不使用外源β2-m也有可能直接 装载。在此优选的变体中，该方法包括下列步骤：(i)在缺乏β2-微球 蛋白的情况下，使分离或纯化的膜囊与第I类限制肽或脂质接触，(ii) 使(i)的混合物在允许肽或脂质与在该膜囊表面上的HLA第I类分子形 成复合体的条件下置于选择的酸处理，以及(iii)收集已经装载的膜囊。 更优选的是，步骤(ii)包括使该混合物在pH大约4到5.5之间接受弱 酸处理2小时以下，更优选在pH大约4.2到5.2之间处理1小时以下。 该具体实施方案是有利的，因为需要较少的处理，且不需要外源β2-m， 其降低了成本、操作和与人类-衍生产物有关的潜在问题。在此不含β2- 微球蛋白的具体实施方案中，分离或纯化的膜囊通常在缺乏β2-微球蛋 白的情况下与过量的外源肽接触，例如与5至500微克/毫升第I类限 制肽接触。当在如上限定的适当条件下接触后，通过以目的肽或脂质 替换与抗原呈递分子结合的内源化合物(例如对肽而言为MHC第I 或II类，且对脂质而言为CD1)(交换过程)而发生装载。由于存在 发明人限定的选择的酸性条件，使该交换成为可能或足以发生。亦通 过申请人证实诸如外来体的膜囊与整个细胞对照，可抵抗延长的酸性 暴露，并因此可接受限定的酸处理，足以使替换步骤更容易，而无需 加入外源β2-m，从而使该交换成为可能。一旦进行交换或替换，通常 在15至30分钟之后(若需要或更长或更短，依据其条件)，便可通 过升高溶液的pH值使装载的膜囊稳定，由此阻断该交换。可按照如 上所述进行中和作用。
如上所指出，可使用各种免疫原性化合物实施该方法，如肽或脂 质。该肽优选是由第I类或第II类分子提供的肽，即由抗原呈递细胞 如树突细胞和巨噬细胞和B淋巴细胞加工处理抗原而产生的肽。优选 类型的肽由第I类限制肽代表，更优选由第I类限制的肿瘤肽代表， 也就是衍生自肿瘤抗原的肽，其由树突细胞或巨噬细胞提供给免疫系 统。应了解可使用分离的肽或其混合物如肿瘤细胞的肽洗脱物或其他 肽的组合，来实施该方法。如上所述，脂质的特定例子包括细菌脂质 和糖脂肿瘤抗原。
下文的实施例12描述帝萨体直接装载的结果。该结果证实已装 载的囊刺激抗原特异的CTLs的能力。 样品的富集
如上所示，可使样品(例如上清液、溶胞产物、生物流体等)经 过富集步骤，其可包括一次或多次离心、澄清、超滤、纳米过滤、亲 和层析和/或渗滤步骤。在特定的具体实施方案中，富集步骤包括(i)细 胞和/或细胞碎屑的排除(澄清)，可能接着(ii)浓缩和/或渗滤步骤。 根据本发明，优选的富集步骤包括(i)细胞和/或细胞碎屑的排除(澄 清)，(ii)浓缩和(iii)渗滤。 样品的澄清
通过离心样品，例如以低速优选低于1000g，例如在100至700g 之间，排除细胞和/或细胞碎屑。在该步骤中，优选的离心条件是例如 以大约300g或600g离心1到15分钟。
优选的是，通过过滤样品来去除细胞和/或细胞碎屑，所述过滤 可能与上述离心组合进行。特别是可以使用具有递减孔隙度的滤纸进 行连续过滤。为了该目的，优选使用具有0.2微米以上例如在0.2到10 微米之间孔隙度的滤纸。使用具有10微米、1微米、0.5微米，接着 是0.22微米孔隙度的滤纸连续过滤是特别有可能的。
通过一次性的由醋酸纤维素组成的0.8微米胶囊滤纸进行微过滤 细胞培养基，以便去除细胞和碎屑。微过滤胶囊单次使用。图5表示 该方法的计划。最低限度的10个实验显示微滤纸的容量，例如500 平方厘米的表面积足以过滤2.5升至4升以上的树突细胞培养物上清 液。若需要可使用更大的表面积(例如1000平方厘米)，这取决于 悬浮液中碎屑的含量。
亦可使用其他孔径2微米、1微米、0.65微米、0.45微米等从帝 萨体中澄清细胞和细胞碎屑。微滤纸可含有前滤纸，即0.8微米的 Sartoclean CA(Sartorius Inc.)含有3.0微米的醋酸纤维素前滤纸。此外， 滤纸可由醋酸纤维素以外的其他材料所组成，如聚丙烯或聚醚碸 (PES)。
其他可用来从帝萨体中去除细胞和碎屑的方法为低速离心、通过 中空纤维的连续流动微过滤以及层析法。 浓缩
可进行浓缩步骤，以便降低在密度垫阶段待处理样品的体积。以 此方式，通过高速离心样品，例如在10,000到100,000g之间，引起 膜囊的沉降，可获得浓缩。这可包括一系列的差速离心，而以大约 70,000g进行最后的离心。可将在沉淀中获得的膜囊溶解于较少的体 积中，并在适当的缓冲液中进行后续的加工步骤。
优先通过超滤进行浓缩步骤。根据优选的具体实施方案，使(澄 清的)生物样品(例如上清液)接受超滤，优选的是切向超滤。切向 超滤由在两个分隔容器(滤液和留存物)之间用来浓缩和分级分离的 溶液所组成，其由具有确定的截留阈值的膜隔开。通过留存物分隔容 器中的流动，并在该分隔容器和滤液分隔容器之间应用膜压力，来进 行分离作用。可使用不同的系统来进行超滤，如螺旋形膜(Millipore， Amicon)、扁平膜或中空纤维(Amicon，Millipore，Sartorius，Pall，GF， Sepracor)。在本发明的范围内，有利的是使用具有低于1000kDa截 留阈值的膜，优选在300kDa到1000kDa之间，或更优选在300kDa 到500kDa之间。
在特定的具体实施方案中，通过孔径为0.5毫米截留值分子量 (MWCO)500kDa的中空纤维(A/G Technology Inc.)进行超滤，浓 缩澄清的组织培养上清液(例如在通过0.8微米滤纸的澄清之后获得 的)。该滤芯的孔径将帝萨体保留在留存物中，同时允许比该孔径更 小的蛋白质通过该膜。中空纤维的滤芯含有足够的表面积，允许迅速 地进行浓缩，但对帝萨体没有过量的剪切力。经受超滤的起始上清液 的体积通常为2-4升，然后将其降低至大约100毫升(20-至40-倍减 少)。图6描述了该操作设置。
亦可使用其他孔径如30kDa、100kDa、300kDa和750kDa来浓 缩帝萨体的体积。然而有可能会降低处理的效率和回收百分比。此外， 亦可使用得自诸如Millipore、Sartorius和Filtronics公司的其他超滤形 式，如“平板和框架”卡匣。亦可使用如由Amicon Inc提供的搅拌格 子来降低帝萨体的体积。
通过超滤浓缩帝萨体，在低剪切力之下采用中空纤维进行。进料 流的剪切力(例如对于0.7平方英尺表面积，流速＜300毫升/分钟)为 2000秒-1以下。在操作期间，系统的进口和出口压力在3-8psi(磅/平 方英寸)之间。可使用与目前所用参数相比较更严格的条件来浓缩帝 萨体。
在本发明的制备方法中，亦可使用其他技术，如离子交换和亲和 层析法以及流场-流动分级分离，来浓缩帝萨体。 渗滤
可对浓缩的帝萨体制品使用渗滤来降低污染培养基和细胞蛋白质 的浓度。根据数种允许以制配缓冲液交换样品缓冲液的技术进行渗 滤，包括超滤、层析法、超速离心以及通过透析袋。
在优选的具体实施方案中，利用超滤系统进行渗滤。如实验章节 证实，该具体实施方案是有效的。此外，如果通过超滤已经浓缩囊制 品，使用相同的方法学可轻易地组合渗滤步骤。
关于这一点，在特定的具体实施方案中，使用如浓缩步骤中所用 的相同的超滤膜(即500kDa MWCO中空纤维膜)，通过超滤渗滤外 来体。该具体实施方案是有利的，因为基本上可在相同的装置中进行 这两个步骤，对外来体具有有限的干预和处理，也就是仅通过修饰 导入中空纤维中的产物。
除了500kDa中空纤维之外，可利用其他孔径如30kDa、100kDa、 300kDa和750kDa，优选包括30到1000kDa之间，更优选在200到 750kDa之间。渗滤缓冲液可由除了在PBS中找到的那些赋形剂所组 成。渗滤中所用缓冲液的体积无论何处均可以为帝萨体浓缩物体积的 1至10倍。
渗滤所用的操作参数与先前对从澄清的组织培养基中浓缩帝萨体 所描述的那些参数类似。 外来体的密度垫分离和纯化
正如所示，本发明公开生物样品的处理，包括在密度垫上离心膜 囊，并从该垫中回收纯化的囊。密度垫离心提供胜过现有技术使用连 续离心或梯度密度离心的数个优点。这些优点包括缺乏囊的凝集，因 此使其接受减少的物理损伤；进一步纯化该膜，因为可去除额外的污 染物，如在下文将讨论；缺乏在垫中所用组份的毒性；降低蔗糖浓度 等。具体而言，密度垫允许在超速离心样品时，防止外来体形成沉淀。 在可溶性蛋白质(大约0.73)、外来体(大约0.88)和蛋白质凝集物 的偏微分比容上的差异使其成为分离和纯化的理想方法。预计蛋白质 凝集物(密度约为1.35)通过密度垫形成沉淀，而外来体仍保留在密 度垫中。简而言之，如下描述该方法(图8a和8b描述了该方法的计 划)。
在离心管的底部加入比浓缩的帝萨体溶液更高密度的溶液(即 垫)，结果形成不连续或台阶梯度(即密度上的急剧变化)。该垫导 致排除较低沉降系数的分子。此外，在执行终了时，垫使得重悬浮任 何沉降的物质变得更为容易，并防止损害可能无法抵抗形成沉淀的颗 粒。
此外，作为其他优点，相信密度垫允许进一步从组合物中排除任 何潜在污染的蛋白质凝集物，特别是结合珠蛋白凝集物。
已经显示膜囊尤其是帝萨体具有1.100至1.140克/毫升的密度。 因此，密度垫应该具有在大约1.10至大约1.15的终密度。
可由专业技术人员修改垫的组合物，以便达到上文优选的终密 度。垫溶液优选是轻微高渗的，渗透性在700-800mOs之间。在优选 的具体实施方案中，密度垫由在Tris缓冲液中的蔗糖/D2O所组成。在 每个离心管底部加入浓密的蔗糖/Tris D2O缓冲液，置换上方的浓缩帝 萨体溶液，形成可见的界面。以100,000xg超速离心大约1个半小时， 使帝萨体沉降至更浓密的蔗糖/Tris D2O垫内。浓密的垫含有富集和更 纯化的帝萨体群。极少量的帝萨体在垫上方或有时可在离心管底部可 见的沉淀内。此外，D2O先前已经用于临床环境中，并且未曾在所用 浓度下显示出任何的毒性影响。关于这一点，氘在人类中的天然多度 为15毫克/千克(0.15％wt)。
优选的是，如果使用D2O/蔗糖垫，最初垫溶液的密度应该在大 约1.175-1.210克/毫升的范围内(另外亦可使用这些特定限制的偏差)。 确实，申请人现已证实离心期间在垫中发生D2O/蔗糖的扩散，导致形 成微型-梯度以及在大约1.1到大约1.15克/毫升之间的终密度(即测 量出集中垫的密度在1.100到1.150克/毫升之间)。这不是预料中的， 但对纯化步骤提供了更多的优点，因为借着形成微型梯度，垫允许进 一步纯化外来体。
在其他例子中，可制备除蔗糖/D2O以外的其他溶液，其中该溶 液密度比外来体更高。关于这一点，可使用双重-标记的水(也就是D217O 或D218O)，即使这将允许进一步降低在垫中的蔗糖含量。可利用的 D218O(纯度97％)密度为1.22。可使用D2O和D217O或D218O的混合 物来分离囊和各种密度的细胞部分，而无需加入组份。
亦可制备在H2O(非-氘化)中较高浓度的蔗糖来产生具有可比 密度的溶液，虽然这类溶液将具有显著较高的高渗性并可诱导帝萨体 的溶解。可使用由磺克沙醇(iodixanol)(也就是OptiPrep)、普克 (Percoll)和发克(Ficoll)组成的商用密度培养基，以类似的方式捕 捉帝萨体，以供实验室处理和分析目的使用。
通过任何适当的方法，可从垫中收集纯化的外来体，包括以针头 刺穿离心管、吸取等。 制配和调整 通过渗滤制配外来体
可在适合临床使用或进一步储存的各种缓冲液或悬浮液中制配经 过纯化的外来体。
为了那个目的，通过渗滤采用500kDa超滤中空纤维滤芯，以与 先前在浓缩和/或渗滤中所用的相同形式(参见上文讨论)，可使纯化 的外来体经受缓冲液交换。在渗滤之前，优选用含有hSA(例如100微 克/毫升)并缺乏结合珠蛋白污染的缓冲液预调整该滤芯最少15分钟。 似乎hSA的存在防止由于与中空纤维基底膜结合而导致的帝萨体的非 特异性损失。使含有纯化(抗原脉冲)的外来体的超速离心垫部分(大 约16毫升)进行最少5倍体积的缓冲液交换，以便去除垫的组份(也 就是98％缓冲液交换)。使用与图5所述相同的设置，然而，将中空 纤维滤芯的尺寸缩小至容纳较小的体积。如前所述，可能不需要以低 剪切力(即2000秒-1)进行渗滤。
图10描述帝萨体样品原始体积二千八百分之一的典型SDS- PAGE。
可使用数种制配缓冲液来配制帝萨体。典型的缓冲液包含USP/NF 赋形剂。制配溶液可含有下列组份：1)缓冲剂，如Tris，2)冷冻保 护剂，如蔗糖、海藻糖、葡萄糖、甘油等，3)盐类，如NaCl、KCl、 MgCl2、CaCl2等，4)填充剂，如甘露糖醇、甘氨酸、淀粉等，5)抗 氧化剂，6)维生素，7)稳定蛋白质和肽，如hSA，以及8)其他广 泛接受用于制配的赋形剂。
关于这一点，本发明的目的在于组合物，其包括(i)膜囊，(ii)缓冲 剂，和(iii)冷冻保护剂或稳定化合物。该组合物优选进一步包括(iv)盐 类和/或填充剂和/或抗氧化剂和/或维生素。
典型的缓冲液包括PBS、20mM Tris/5％蔗糖/1mM MgCl2 pH7.4 或20mM Tris/5％蔗糖/1mM MgCl2 100微克/毫升hSA pH7.4，并使其 接受超滤以去除结合珠蛋白。
优选的是，上述的制配溶液基本上不含结合珠蛋白(或相关聚合 物以及颗粒体)。关于这一点，如前所公开，可使该制配溶液(或其 特定的个别组份，如白蛋白溶液)接受超滤以排除结合珠蛋白。最终 的处理进一步提供产物的较高的保证。 外来体的无菌过滤和冷冻
最后，可使收集(或制配)的物质接受进一步的处理和/或过滤 阶段，特别是为了灭菌目的。关于这一点，通过直径小于或等于0.3 微米的滤纸可无菌过滤外来体。典型的灭菌包括通过0.22微米的注射 滤器(25毫米)过滤，具有最低的损失(参见HLA/DR测定结果)。 在无菌过滤中，可使用由Millipore的“Durapore”材料所组成的滤器。 亦可使用由醋酸纤维素或聚醚砜所组成的其他滤器材料。在过滤外来 体之前，优选用含有100微克/毫升hSA(无结合珠蛋白)的制配缓冲 液预先使该注射滤器湿润。在受控的参数下用注射泵或由手引起的压 力无菌过滤外来体样品(约16毫升)。
亦可冷冻纯化的外来体(任选制成的和/或无菌的)，并储存在-80 ℃或-20℃或4℃的其他储存温度下。优选以1°/分钟的控制速度利用 “Mr.Forsty”低温-1℃冷冻容器(Nalgene Inc)进行冷冻。亦可使用 在液态N2中慢速或快速冷冻的其他方法。
关于这一点，本发明的目的亦在于包括冷冻外来体的组合物。 质量控制
本发明亦公开并提供可用来鉴别已经制备(例如经过纯化和/或 制配)或正在制备期间的膜囊制品特征的新型组合物和方法。本发明 的组合物和方法可用来估测在样品或组合物中的外来体的数量，确定 外来体制品的表型，并评价外来体制品的生物活性。这些方法特别适 用于鉴别用于临床应用中产物特征，即用来控制外来体制品的质量和 组合物。这些方法对于治疗目的而言是非常重要的，因为基本上使用 自体的(即患者本身的)膜囊制品，这需要个体的特征参数。使用这 些组合物和方法可鉴别来自各种起源(即抗原呈递细胞、肿瘤细胞 等)、抗原-灵敏度(抗原-装载、抗原-游离等)、新鲜制备或储存的 来自初级细胞或无限增殖化细胞系等的外来体制品特征。 外来体的剂量确定
方法被开发出来以评估样品(或纯化的组合物)中存在的膜囊数 量。该方法涉及免疫复合体的形成和检测，使用识别存在于外来体上 细胞表面标记的抗体。
更具体而言，根据本发明，确定样品中膜囊剂量的方法包括(i)将 样品吸附在固相支持物上，(ii)使吸附的固相支持物与特异于外来体的 细胞表面标记的(捕捉)抗体接触，和(iii)确定(或确定剂量)抗体- 抗原免疫复合体的存在。
更优选的是，特异于外来体的细胞表面标记的抗体是抗-第II类 抗体，也就是与MHC第II类分子结合的抗体或抗-第I类抗体。此外， 在特定的具体实施方案中，至少平行使用二级捕捉抗体，从而进一步 增加关于外来体测定的选择性。例如，优选额外的捕捉抗体是针对抗 CD81细胞表面标记或针对抗MHC第I类分子。为了鉴别外来体的特 征(或确定剂量)，使用抗-CD81抗体是有利的，因为CD81从树突 细胞中显著降低，并因此提供对帝萨体特定的信号。在该步骤中，可 使用对外来体特异的其他抗体，例如抗-CD63或抗-CD9。
因此在优选的具体实施方案中，将外来体吸附在固相支持物上， 并分别与抗-第II类抗体和抗-CD81抗体接触。
根据传统的免疫学技术，可检测作为接触步骤的结果而形成的抗 体-抗原免疫复合体。优选的是，使用与第一和/或第二个捕捉抗体结 合标记显露抗体来显露该复合体。可利用放射性、酶活性、萤光标记、 化学发光标记等来标记显露抗体。复合体的测量值与存在于样品中外 来体的量相关(即提供其直接的指征)。如果使用两个抗体(例如抗- 第II类和抗-CD81)，可按照定量参数实施以每种抗体检测到的复合 体的平均值或比率。
在该方法中使用的各种抗体可以是单克隆或多克隆抗体，以天然 形成或其修饰(例如人源化)的片段或衍生物。在典型的实验中，捕 捉抗体是单克隆抗体。在更典型的实验中，显露抗体是经过标记的单 克隆或多克隆抗体。
在实施本发明方法时，可使用各种固相支持物，如多孔板，特别 是96-孔板或任何其他的滴定板。
此外，在进行本发明剂量确定方法时，最好使用纯化的外来体样 品，以降低非特异的背景信号。为了这个目的，该样品优选是纯化的 外来体样品，更优选的是接受过密度垫(超速)离心的样品。为了分 析目的，在200微升的D2O蔗糖密度垫上离心数毫升的外来体溶液。 可直接在垫溶液上进行ELISA。这种简单的纯化步骤允许足够的浓缩 和纯化。回收率接近100％。
在特定的具体实施方案中，已经开发出以ELISA为基础的分析， 从而提供在样品、组合物、流体等中的帝萨体的定量测量。图11a说 明HLA-DR(即MHC II)的测量，和图11b说明在帝萨体中CD81的 测量。HLA/DR测定是灵敏的，并在功能上与帝萨体的活性相关，因 为HLA/DR涉及抗原呈递。选择这种测定作为帝萨体制品的定量测定。 对HLA/DR确定的ELISA测定定量了终产物中的帝萨体。因为该测 定亦可测量在树突细胞上的HLA/DR，故该测定提供了每个树突细胞 和每份体积的分离的帝萨体涉及HLA/DR剂量的方法。 外来体的表型
方法被开发出来以评估存在于样品(或纯化的组合物)中的膜囊 的表型。该方法涉及免疫复合体的形成和检测，使用识别存在于外来 体上(中)的数个细胞(表面)标记的抗体。该方法尚包括使外来体 复合到固相支持物上，如小珠，从而允许合理并可靠地确定每个制品 的表型。
关于这一点，本发明的目的在于鉴别制品中膜囊特征的方法，其 包括使膜囊制品的样品平行地与二种或多种特异于该囊标记的抗体接 触，并确定抗原-抗体免疫复合体的形成。
更具体而言，该方法针对确定外来体制品的表型，即由在制品中 外来体表达的特定类型的细胞表面标记。考虑到外来体制品的自体性 质，从结构和潜在活性两者的角度来看，表型特征基本上在于制品的 组合物。
更优选的是，鉴别制品特征的方法包括使外来体结合到固相支持 物上的最初步骤，如小珠。更优选的是，以共价方式或通过抗体-介导 的亲和结合，将外来体附着到诸如小珠的固相支持物上。在典型的具 体实施方案中，使用直径大约1至10微米小珠，更优选的是3至5 微米，并可携带共价附着于其上或由免疫亲和力偶联的1000个以上 的外来体，更优选的是2000到5000个之间的外来体。然后将包被外 来体的小珠分配到板的小孔中，并平行地与选择的抗体接触。
抗体可与细胞表面标记或内部蛋白质结合。确实认为外来体与诸 如小珠的固相支持物的结合使得外部药剂，如抗体，得以利用某些内 在蛋白质。
优选的是，使用二种或多种在下文表1中列举的抗体：
表1 抗体 来源Ph armingen 抗CD11，更优选 抗CD11c 抗CD11b 30485x 30455x 抗HLA，更优选 抗HLA abc 32295x 抗CD81 33475x 抗CD63 36585x 抗CD58 36895x 抗CD1a 34224x 抗CD1b 抗CD9 30374x 抗CD86 33409x 抗CD82 35394x 抗CD83 36934x 抗乳粘附素*
*：兔抗-血清抗乳粘附素肽
优选标记这些抗体，从而允许检测和/或确定剂量所形成的免疫 复合体。标记可以是放射性、化学、酶、萤光等。优选的标记是萤光， 如FITC或PE。
更优选的是，使用至少5种不同的抗体，更优选的甚至是至少8 种不同的抗体。抗体优选是单克隆的。
在特定的具体实施方案中，使用直接染色法确定免疫表型。将一 小等份纯化的外来体与抗-第II类(例如抗-HLA/DR)-包被的磁珠一 起温育。然后将与抗-HLA-DR包被的磁珠相偶联的外来体同标记抗体 一起温育，更优选的是萤光结合(例如FITC或PE)的单克隆抗体。 使用流式细胞仪可测量四个参数。前向散射、侧向散射和两个萤光通 道。这两种-颜色的流式细胞仪分析允许在单一的测量中鉴定外来体上 的抗原。
图14呈现数个帝萨体制品所获得的结果。这些结果清楚证实要 求保护的用于确定外来体制品免疫表型方法的功效和速度。 外来体的功能
方法进一步被开发出来以评估样品(或纯化的组合物)中存在的 膜囊的生物活性。该方法涉及使用参考抗原，例如超-抗原(如SEE)， 来评估得自T细胞群的CTL淋巴细胞的活化作用。
因此，本发明的特定目的在于鉴别膜囊活性特征的方法，包括在 辅助细胞的存在下使装载超-抗原的囊与T细胞接触，并确定T细胞 的活化作用。
由许多不同类似细菌和病毒病原体来生产超抗原。超抗原直接与 MHC II分子结合，不需加工处理。代替在MHC II分子沟中的结合， 超抗原与MHC II分子的外表面及T细胞受体(TCR)的Vβ区结合， 而能够刺激极大量的T细胞(2-20％)。超抗原可与各种MHC II和 TCR结合并诱导强的T细胞反应的事实，使它们成为建立测试帝萨体 抗原呈递功能的普遍性和敏感性测定的诱人药剂。从各种来源可制备 或分离超抗原。在本发明中使用的优选超抗原是SEE抗原和ET404 (Toxin Technology Inc.)。可使用其他超抗原，如SEA和SEB。
T细胞可以是任何新鲜制备的包括T细胞的细胞群，如外周血液 单核细胞(“PBMC”)，以及可以是任何无限增殖化的T细胞系， 如Jurkat细胞。Jurkat细胞是无限增殖化的人类T细胞，在激活后分 泌IL-2，其在该生物测定中作为反应者(responder)细胞起作用。Jurkat 细胞的TCR的Vβ8与SEE结合。如同永生的肿瘤细胞，Jurkat细胞 是特别有用的，因为它们比初级细胞更不具异种性，并且更容易在实 验室中生长。
辅助细胞可以是在该生物测定中任何能够调节T细胞的激活信号 的细胞。辅助细胞可以是树突细胞，如任何活性初级树突细胞培养物 或树突细胞系。辅助细胞也可以是其他免疫细胞或细胞系，特别是抗 原呈递细胞或细胞系，如Raji细胞。Raji细胞是EBV-无限增殖化的 B-细胞，并已经显示在该生物测定中起作用。可在任何适当的培养基 中培养Raji细胞，例如RPMI。
在实施要求保护的方法时，使超抗原装载的囊在辅助细胞的存在 下与反应者T细胞接触，并评估T细胞活化作用。
根据各种技术，如细胞因子释放、蛋白质合成、反应者细胞溶解 等，可进行T细胞活化作用的测量。在优选的具体实施方案中，通过 确定培养基中产生的细胞因子来测量T细胞的活化作用，更具体而言， 是在培养基中产生的介白素-2。通常由ELISA来测量IL-2。
在该方法中，膜囊本身可利用超-抗原来装载，或是产生膜囊的 细胞(然后使所得囊暴露在超抗原下)。在优选的具体实施方案中， 将该囊与超抗原接触。
在特定的具体实施方案中，该功能性的测定首先在制配缓冲液中 将超抗原SEE与通过超滤、垫密度离心和渗滤从细胞培养上清液中制 备的外来体一起温育。可使用新鲜分离的外来体，或亦可冷冻储存在- 80℃的PBS中。然后通过分析区带离心，使用例如Optiprep，从未结 合的SEE中分离外来体与SEE的复合体。Optiprep(亦称为碘克沙醇) 是碘化的密度梯度培养基(Nycomed)，其允许从游离的SEE中定量 回收外来体/SEE复合体。因此，对于定量分析每批制品外来体而言， 该步骤在生物测定中是重要的。使用分离的复合体，在作为辅助细胞 的Raji细胞的存在下诱导T细胞活化。T细胞活化的读出是由Jurkat 细胞分泌的IL-2.
本发明制备方法胜过现有技术使用连续离心步骤的沉降技术的特 殊优点如下：
处理时间的长度：沉降处理比超滤和超速离心耗费更多的时间。 4升组织培养上清液通过沉降处理将需要最少12个小时，而进行超滤 和单一超速离心的组合时，如同其目前进行的，将消耗6-7小时。
密闭系统-满足GMP：在该方法中仅仅离心步骤以少量体积进行， 并可在目前可获得的密封离心管(转子6个离心管的容量各为33毫 升)中进行。这排除了如果欲进行大体积(数升)的离心步骤时所遭 遇到的问题。目前并没有可供如此大体积使用的密封离心管。离心应 已在一次性的开口离心管中进行，并将不满足目前规章的束缚。澄清、 超滤和无菌过滤均在生物安全的通风橱中进行，所以被认为基本上是 密闭系统。目前亦利用密封离心管进行超速离心，其排除了可能由于 在开口离心管中的污染引起的问题。
培养基的超滤：培养基的再处理，如AIM V，以便去除蛋白质凝 集物，这是整个加工处理纯化计划中的重要步骤。上游去除共-纯化的 蛋白质导致在处理之后较纯的外来体产物。特别是推测本发明允许产 生基本上不含凝集物的组合物，即其中凝集物相当于总蛋白质的2-4 ％以下。此外，结合珠蛋白的去除降低了不需要的免疫反应。
在沉降之后外来体的潜在凝集：外来体的沉降导致局部浓度极 高。在沉淀中高浓度的外来体具有导致凝集的产物的潜力。与使用超 滤的方法比较，电子显微镜给出一些沉降后外来体正在凝集的指征。 其次，通过电子显微镜的观察，外来体的超滤似乎产生较少的碎屑。
处理温度：可在冰上进行渗透的处理，即在大约4到10℃之间的 温度下。这是有利的，因为在游离肽和通过MHCI与外来体结合的那 些肽之间的平衡可受到温度的影响，因此这样的温度可防止诸如蛋白 酶的水解污染酶的作用。
外来体的纯度：外来体的沉降冒着被细胞碎屑和培养基污染物污 染的危险。去除污染的蛋白质凝集物是特别重要的，因为它们具有高 免疫原性。
外来体的回收：最终回收率为60-75％，显著大于原始沉降方法 (9个实验平均15％)。这意味着如果需要，则用来治疗患者的可用 剂量将能增加5倍，或允许以较少体积的血来进行滤析(apheresis) 和培养低5倍的细胞，致使该方法的成本相当大的降低。
本发明其他方面及优点明示于下列实施例中，这些实施例应看作 例证而非用于限制本发明。 实施例 1.培养基的制备
在使用之前，已经先通过超滤处理培养基(在该实施例中，临床 级的AIM V为Life Technologies，Inc.的不含血清的细胞培养基)，以 便去除凝集的蛋白质，凝集蛋白质的去除并不影响细胞生长，却相当 大地有助于后续纯帝萨体的分离。
使用500kDa中空纤维膜(来自A/G Technology，NeeDham，Mass 或来自备有相关产品的销售商)进行培养基的超滤。该膜的尺寸将蛋 白质凝集物保留在留存物中，而允许未-凝集的蛋白质与滤液一起通 过。收集滤液，通过0.22微米滤纸无菌过滤至小瓶中，并储存在4℃ 下直到使用为止。
在特定的实验中，处理50升AIM V使用了来自A/G Technology 的UFP-500-C-35A(0.5毫米孔径，14.5平方英尺表面积)中空纤维 滤芯。原料流进口的流速为13升/分钟，导致1升/分钟的滤液流，且 进口和出口压力分别为12-16psi和10psi。在1小时内完成该过程。 通过0.22微米的SartoPore或SartoBran滤纸(Sartorius Inc.)无菌过 滤滤液。图3和4证实降低了培养基的凝集物含量。由ELISA定量结 合珠蛋白显示通过超过滤去除了99％以上的结合珠蛋白相关凝集物。 更具体而言，UF培养基含有低于大约5纳克/毫升的结合珠蛋白凝集 物。
具体而言，BCA测定显示AIM V培养基的超滤去除培养基中2- 4％的总蛋白质。大部份被去除的蛋白质部分是凝集物。培养基中的 蛋白质浓度并不随超滤而有明显的改变，仅仅颗粒体的浓度发生变 化。使超滤的AIM V(UF AIM V)形成沉淀导致任何蛋白质模式与 在未经超滤的AIM V培养基中所观察到的模式基本上不同(参见图 3)。此外，在处理之后3个月使超滤的AIM V形成沉淀，如SDS-PAGE 所显示，并未说明存在蛋白质凝集物(参见图4)，这证实经过处理 的培养基可长期储存。
白蛋白(例如hSA)组合物的超滤亦允许制备每毫克hSA中含 有低于大约10纳克结合珠蛋白凝集物的加热hSA产物，即低于大约 0.001％的结合珠蛋白凝集物(wt)。 2.不成熟树突细胞的生产和培养
在白细胞滤析(leukopheresis)之后，从患者外周血液中获得树 突细胞前体。细胞培养程序是不含血清的，并以临床级的细胞培养基 进行，该培养基进一步超滤去除蛋白质凝集物(或颗粒体)，如在实 施例1中所描述，引入的白细胞滤析通常含有大约1至2×E10个细胞。 以补充有0.1％人类血清白蛋白(临床级)的PBS冲洗细胞四次以去 除血小板。然后以200×106个细胞/烧瓶的细胞密度在不含血清经过超 滤的培养基中将细胞平铺在大约100-150平方厘米的T型瓶中。从引 入的白细胞滤析中的白血球纯化树突细胞前体依赖于单核细胞对带电 荷的聚苯乙烯表面的粘附特性，如同出现在标准市售的组织培养烧瓶 中。在2小时的温育之后，单核细胞变成具有附着力并被保护下来， 而将剩下的非粘着细胞与培养基一起抛弃，并使用补充有GM-CSF和 IL-4或IL-13各50纳克/毫升以及γ干扰素的培养基交换。有粘着力的 单核细胞在GM-CSF和IL-4或IL-13的存在下进行分化，变成不成熟 的树突细胞。在培养第5天，对这些细胞再添加更多的GM-CSF和IL-13 或IL-4.可以500单位/毫升将干扰素γ加至细胞中，以便将树突细胞维 持在不成熟的状态。 3.在模型系统中装载抗原的程序
进行预备实验，以便评估将抗原装载到树突细胞内的枝术参数。 为此目的，以CMV肽脉冲不成熟的树突细胞，以便产生肽装载的帝 萨体。然后通过标准程序分离帝萨体，并通过测量由CMV特异的T 细胞纯种系所释放的IFN-γ来测定其活性。以CMV肽装载的帝萨体特 异性地刺激抗-CMV T细胞纯种系，且需要树突细胞的存在，这与我 们使用基于SEE的活性测定的发现一致(图2)。
因此使用CMV模型系统，通过在第5天将肽加至DC培养物中 可将该肽掺入帝萨体内。此外，我们发现肽装载的帝萨体对T细胞的 刺激作用需要DC，这与在SEE生物测定中对包含T细胞、DC和帝 萨体的需求一致，由此强调在这两个测定中帝萨体行为之间紧密相 关。 4.澄清
收集4升组织培养上清液，并以250毫升/分钟的流速通过3/0.8 微米的Sartoclean CA(500平方厘米表面积)(Sartorius Inc.)过滤。 滤纸上的进口压力不超过10psi(图5)。 5.浓缩
利用来自A/G Technology的UFP-500-C-4A中空纤维滤芯(0.7 平方英尺表面积；0.5毫米孔径)，将4升澄清的组织培养基浓缩成100 毫升。原料流的流速在225-275毫升/分钟之间，并且进口和出口压力 分别为4-7psi和3-6psi。在这些条件下，滤液流速在40-60毫升/分 钟之间。该过程需要大约60-80分钟完成(图6). 6.渗滤
在特定的实施例中，使外来体浓缩物对5倍体积的PBS渗滤(即 100毫升帝萨体浓缩物对500毫升PBS渗滤)。图7描述了在渗滤之 前和之后浓缩帝萨体的SDS-PAGE。在寒冷的条件下(在大约4-10℃ 之间)进行该步骤以及所有的后续步骤。 7.密度垫分离(不连续梯度)
在如下特定的实施例中，在密度垫上，通过(超速)离心纯化含 有帝萨体的浓缩和渗滤的培养基，以及在已经以抗原脉冲外来体的那 些实施例中：将外来体浓缩物(大约100毫升)等分至离心管中，并 置于4毫升蔗糖/Tris D2O缓冲之下。D2O密度垫由25-30％蔗糖/20mM Tris D2O(重量/重量％)(pH7.5-7.7)所组成。密度在1.18到1.21 克/毫升之间。密封离心管以确保为密闭系统。
图9a描述在超速离心之前和之后样品的SDS-PAGE，以及在垫 上方、垫中或沉淀中的含量。如同所示，大部份蛋白质并未沉降在蔗 糖/Tris D2O密度垫内。
这在图9b中进一步得到证实，这表明在垫中回收至少90％的外 来体。 8.制配和调整
通过渗滤，利用与先前浓缩和/或渗滤(参见实施例5和6)所用 形式相同的500kDa超滤中空纤维滤芯，使纯化的外来体接受缓冲液 交换。在渗滤之前，先以hSA(例如100微克/毫升)预处理该滤芯最 少15分钟，并选择滤芯大小处理10-20毫升培养基。图10描述为其 原始体积二千八百分之一的帝萨体样品的典型SDS-PAGE。
使制配的外来体通过0.22微米注射器(Millex GV(25毫米注射 器))无菌过滤。
采用ELISA测量存在于以PBS缓冲液调节的外来体制品(为原 始培养基的200-倍浓缩)中的结合珠蛋白凝集物的含量，并确定为基 本上低于大约0.1纳克/毫升，更具体而言，两个受试制品为0.091纳 克/毫升或0.044纳克/毫升。比较而言，通过ELISA发现，根据现有 公布的方法，在同样浓缩200-倍之后，所获得的外来体制品中凝集结 合珠蛋白的含量为400微克/毫升。这相当于存在于未经纯化的AIM V 培养基中的结合珠蛋白凝集物的定量回收(2微克/毫升)。因此，本 发明方法现有技术方法比较，导致在外来体的制品中降低结合珠蛋白 凝集物的污染五百万至一千万倍(400微克/毫升对40-90皮克/毫升)。 因为培养基的超滤以大约500的因数降低结合珠蛋白凝集物的含量， 另外的超滤、渗滤和/或密度垫步骤亦对增加纯化效果有显著的贡献。 这些结果更进一步解释了本发明方法在去除结合珠蛋白凝集物上的功 效。 9.外来体的剂量确定
在特定的具体实施方案中，开发基于ELISA的分析，以便提供 在样品、组合物、流体等中的外来体的定量测定。图11说明在帝萨 体中HLA-DR(即MHC II)(11b)和CD81(11a)的测量。HLA/DR 测定对帝萨体的活性是灵敏的而且在功能上相关。选择该测定作为帝 萨体制品的定量测定。在下文详述该测定。
由ELISA测量到的HLA/DR信号用于确定从帝萨体制品中获得 的MHC II分子的数目。MHC II的数目与先前已报道的细胞类型的数 目相关联(Cella等1997)。表2总结了这些值。
表2每个细胞数目的MHC II分子的近似数目(改编自Cella等 1997) 细胞类型 MHC II分子/细胞 (xE6) 新鲜单核细胞 ＜0.1 经过培养的单核细胞 ＜1.0 Raji细胞 2.0 不成熟的DC 5.2 成熟的DC 8.3
为了定量HLA/DR分子的含量，使用DC溶胞产物或Raji细胞 溶胞产物作为标准。图11显示在固定浓度的不成熟DC溶胞产物下滴 定抗-HLA/DR。从该图计算出HLA/DR分子的数目对不成熟树突细胞 为5.8×106个分子/细胞，这与表1中呈现的文献值一致。对Raji细胞 的溶胞产物亦观察到相同的结果(数据未显示)。
图12(A，B)描述了获自帝萨体制品的HLA/DR测定结果的实 施例。以相等的上清液体积为函数对HLA/DR信号进行作图。在密度 垫(即UC-垫)上超速离心并渗滤至制配缓冲液中之后，HLA/DR分 子的数目/微升帝萨体确定为4.7×1010。样品的回收率％为 73％HLA/DR。更具体而言，回收率％如下：
处理步骤 总回收率
通过0.8微米的澄清 100％
第一次超滤-浓缩 100％
第一次超滤-渗滤 86+/-2％
垫-第二次超滤-渗滤 85+/-2％
0.2微米的无菌过滤 75+/-3％
总而言之，HLA/DR确定的ELISA测定定量了终产物中的帝萨 体。因为该测定亦可测量树突细胞上的HLA/DR，该测定提供涉及每 个树突细胞和每份体积分离帝萨体上HLA/DR剂量确定的方法。关于 这一点，通常我们在纯化之后每个不成熟DC能够产生最少100,000 个HLA/DR分子(10-12个实验)。
使用可供捕捉的抗第I类抗体，也就是由HC-10细胞产生的抗体， 来进行类似的测定。结果提供在图12(C，D)中。从该滴定曲线(12C) 中可确定来自任何未知外来体制品的MHC-I分子的含量(12D)。 10.确定外来体的表型
在微量离心管中使用磁架以500微升的PBS冲洗5至10微升抗- HLA-DR包被的磁珠。抛弃上清液，并在已冲洗过的小珠中加入25、 50或100微升浓缩外来体制品(外来体浓度可能高达1000倍)。4℃ 在旋转板上温育该混合物大约2小时。温育之后，将500微升PBS加 至与外来体偶联的小珠中，并使用磁架冲洗小珠。去除上清液，并将 与外来体偶联的小珠悬浮于200微升染色缓冲液中。将20微升与外 来体偶联的小珠溶液等分至测试试管中，然后使其分别与一种标记的 分析抗体接触。在4℃下温育该抗体大约30分钟。然后在试管中加入 染色缓冲液，并以1200rpm离心5分钟。抛弃上清液，并在各管中加 入固定溶液(0.5毫升)。然后获得每个测定试管，并通过流式细胞 仪使用FACSCaliburTM装置对其进行分析。
图13提供数个帝萨体制品所获得的结果。这些结果清楚地证实 要求保护的用于确定帝萨体制品的免疫表型方法的功效和速度。 11.功能测定
每种测定需要大约20微升分离的帝萨体。在37℃下100微升终 体积中，将帝萨体与100纳克/毫升的SEE(10微升PBS中的1微克/ 毫升SEE的储存液，带有0.1％BSA)一起温育1小时。在1小时温育 之后，通过区带超速离心(2.2毫升)，在由Optiprep溶液组成的两 阶段不连续梯度上，从未结合的SEE中分离出帝萨体与SEE的复合 体(帝萨体/SEE)(图14-16)。
该Optiprep梯度的制备方法是首先将1.7毫升10％的Optiprep(1.67 毫升Optiprep加8.33毫升RPMI)加至每个测试试管中。接着将100微 升20％的Optiprep(3.33毫升Optiprep加6.67毫升RPMI)加至每个 试管的底部，随后在20％Optiprep之下加入100微升40％的Optiprep (6.67毫升Optiprep加3.33毫升RPMI)。然后将PBS中含0.1％BAS 的帝萨体/SEE样品以200微升终体积铺在梯度的上方。4℃下，在悬 吊式转子(TLS-55)中使用缓慢的加速和减速，以100,000rpm离心 试管40分钟。从试管底部收集200微升样品，其含有不含未结合SEE 的帝萨体/SEE的复合体。游离的SEE留在区带层(10％Optiprep)中， 而帝萨体/SEE复合体沉降在试管的20-40％区内。因为发现optiprep 会干扰ELISA的确定，所以如果需要这种确定时，优选使用D2O蔗 糖梯度。
将Raji细胞、帝萨体/SEE(或模拟品/SEE)，然后是Jurkat细 胞加至板孔中(每孔使用100微升(30,000个细胞)各种细胞)。亦 加入阳性和阴性对照：仅有Jurkat细胞(阴性对照)、Jurkat加1纳 克/孔SEE(阴性对照)、仅有Raji(阴性对照)、Raji和Jurkat加未 以SEE脉冲的帝萨体(背景对照)、Raji和Jurkat加1纳克/毫升SEE (阳性对照)。在5％CO2 37℃下，培养该板18小时。通过以1200rpm 离心(使用板托架)15分钟，从该板的每孔中收集细胞培养上清液。 在ELISA测定中使用200微升上清液来测定IL-2的分泌。可立即或 稍后(在该情况下，可以石蜡膜包裹板并冷冻至使用为止)进行ELISA 测定。
在Costar ELISA板(Costar 2581)中，使用IL-2 ELISA试剂盒(Duo 组DY202，R&D Systems)，依据制造者的说明进行IL2 ELISA测定。 结果显示在IL2分泌和每孔的外来体含量之间的剂量-依赖性关系，这 已经将其转变为与外来体储存液相等的体积。IL2分泌是SEE-依赖性 的，因为外来体需要SEE刺激非-抗原特异细胞(例如Jurkat)。在该 方法中，引入半数最大单位作为帝萨体滴度的定量测量值的一半。将 其定义为在所用实验条件下，达到由Jurkat分泌的半数最大IL2时的 外来体的体积。测量到的半数最大单位越小，代表滴度越高。 12.直接肽装载
该实施例描述直接装载的方法学、影响装载的参数、在参考肽和 靶肽之间与帝萨体的竞争结合以及以抗原装载的帝萨体的生物活性。 方案的产生以HLA-A12限制肽的直接装载为基础。相同方案可应用 在HLA-A1限制肽上。亦讨论了帝萨体的直接肽装载在肿瘤治疗临床 试验上的重要性和优势。
该实施例显示有可能直接装载抗原分子于帝萨体上，并且如此直 接装载的帝萨体能够刺激CTL纯种系。结果显示直接装载可能比间接 DC装载更有效，因为需要较少量的肽。 12.1.方法 在β2-m存在和缺乏的情况下，直接装载肽于外来体上
通过半胱氨酸将HLA-A2限制的参考肽FLPSDCFPSV进行生物 素酰化，所述参考肽衍生自B型肝炎核心抗原的天然表位。该参考肽 与未标记的参考肽竞争，暗示生物素酰化的肽仍维持其与HLA-A2分 子结合的能力。对于在β2-m存在下的直接肽装载，4℃下用等体积的 柠檬酸或醋酸缓冲液pH3.2-5.2处理100微升纯化的HLA-A2+和HLA- A2-阴性帝萨体90秒，降低pH值有利于结合内源肽的洗脱。处理之 后，立刻用含有Tris、外源肽(终浓度从0.01至10微克/毫升)和β2- m(终浓度从0-80微克/毫升)的pH11的鸡尾酒中和该制品，并在室 温下温育，允许在帝萨体表面上重形成第I类、β2-m和肽的三分子复 合体。对于在缺乏外源β2-m情况下的直接装载，首先使帝萨体与外源 肽(终浓度10或100微克/毫升)混合，然后用等体积的醋酸缓冲液 pH4.2-5.2混合，并在室温下温育30分钟。在这段期间发生肽的交换， 导致过量存在的外源肽的结合。外源肽可以仅为生物素酰化的肽，或 标记肽与增量靶肽的混合物。不需要去除未结合的肽和β2-m，因为信 号源是来自如下所述由抗-HLA-第I类抗体捕捉的第I类/肽复合体。 利用TRF测量与帝萨体结合的参考肽
在冰上用1％NP 40溶解装载肽的帝萨体30分钟。通过包被在 ELISA板上的兔抗-小鼠IgG，由抗-第I类抗体捕捉在溶胞产物中含有 标记参考肽的第I类分子的复合体。温育和冲洗之后，加入铕标记的 链霉抗生物素蛋白，通过增强缓冲液，从铕中产生萤光信号，并根据 厂商说明(Wallac)，利用Victor 2萤光读数器读出。将萤光信号的 水平与定量的铕标准水平比较，以铕标记的链霉抗生物素蛋白的比活 性为基础，可评价生物素酰化的参考肽的绝对含量。 参考肽和靶肽与帝萨体竞争结合 在β2-m存在下的竞争
在含有20微克/毫升β2-m的装载缓冲液中，将过量达100倍的 MAGE 3A1、MAGE-3、4和10肽与5微克/毫升生物素酰化的参考肽 混合，并装载于酸处理的帝萨体上。通过TRF检测参考肽的信号并计 算由MAGE3、4和10导致的信号降低。 在β2-m缺乏下的竞争
在pH4.8或5.2的醋酸缓冲液中，制备在5-20倍过量的生物素- 参考肽中的未标记肽(100微克/毫升)。将该肽加至等体积的帝萨体 中，并在室温下温育1小时。通过TRF检测参考肽的信号，并计算由 MAGE3、4和10或MAGE 3A1导致的信号降低。 SEE测定
在37℃下，将100微升直接装载肽的帝萨体在β2-m的存在或缺 乏之下与100纳克/毫升SEE一起温育1小时。通过区带密度梯度离 心去除未结合的SEE之后，将帝萨体和SEE的复合体与Raji细胞和 Jurkat细胞一起温育18小时。收集培养物上清液，测量来自Jurkat细 胞的IFN-γ分泌。 Mart-1特异的CTL纯种系刺激测定
如上所述以MART-1肽直接装载帝萨体，并在装载之后冲洗游离 的肽，再与DC和T细胞纯种系LT 11细胞一起温育24小时。根据 下列T细胞纯种系测定，利用ELISA，通过IL-2的分泌来测量生物 活性。
所使用的肽为HLA-A2限制的MART-1肽，其具有序列 ELAGIGILTV。
通过密度梯度离心去除未结合的Mart-1肽。应了解从帝萨体中 去除未结合的肽不是必须的，但降低非特异性结合。 T细胞纯种系测定
37℃下，在U型底的96-孔板中，将20×103个衍生自树突细胞 (BM-DC)的HLA A2阳性或阴性单核细胞与15微升(1×1010个第ii 类)的帝萨体制品一起温育2小时，然后将20×103个细胞的T细胞纯 种系LT11加至人类BM-DC细胞中。每孔的终体积为200微升。在24 小时之后，收获上清液，并通过ELISA分析IL-2的存在。使用直接 以10μm mart肽(ELAGIGILTV)脉冲的HLA A2+BM-DC细胞作为 阳性对照。 P1A肽装载的帝萨体
如下直接以OVA肽257-269(SIINFEKL)装载鼠科动物的H2b 和H2d帝萨体：将1份体积的醋酸钠缓冲液(0.2M，pH5)加至1份体 积的外来体中，并在4℃下温育90秒，然后加入含有10μm的OVA 肽和40微克/毫升的人类b2-微球蛋白的Tris 2M溶液(pH11)中和。 在室温下温育4小时之后，通过optiprep梯度从未结合的OVA肽中 分离出OVA帝萨体复合体。 T细胞纯种系测定
37℃下，在U型底的96-孔板中，将25×103个D1细胞与25微 升或50微升的帝萨体制品一起温育30分钟，然后将25×103个细胞的 T细胞杂交瘤(B3Z)加至D1细胞中。每孔的终体积为200微升。在 24小时之后，收获上清液，并通过ELISA分析IL-2的存在。使用直 接以10μmOVA肽脉冲的D1细胞作为阳性对照。 12.2.结果 在β2-m的存在下直接装载HLA-A2+帝萨体
按照描述，首先利用HLA-A2限制的参考肽HFLPSDC(生物素) FPSV-OH在HLA-A2+帝萨体上进行直接的肽装载。使用HLA-A2-帝 萨体作为HLA特异性对照。图17显示在帝萨体溶解之后，以生物素- 标记的参考肽装载的HLA-A2分子在板上被抗-第I类抗体捕捉。参考 肽与帝萨体的结合是HLA-A2特异的，因为它不与HLA-A2-帝萨体结 合。该结合依赖于肽和帝萨体的含量。
使用所述的TRF测定来评估直接肽装载的参数。如SEE测定所 测量，缓冲液的选择受到对肽装载功效的影响和对帝萨体完整性的影 响。测试装载缓冲液的pH值范围，以便使装载参考肽的条件最佳。 我们发现使用类似的装载条件，采用柠檬酸磷酸缓冲液或醋酸钠缓冲 液，获得可比较的肽结合信号(图18)。为了测试弱酸处理是否可改 变帝萨体上表达的分子的构象并削弱其功能，我们进行超抗原测定， 其中超抗原SEE与帝萨体的HLA-DR分子结合，在作为辅助细胞的Raji 细胞的存在下，从Jurkat细胞中诱导分泌IL-2。图19显示在SEE测 定中，以pH4.2的醋酸钠处理的帝萨体制品诱导与未处理的对照相同 含量的IL-2分泌。以相同pH4.2的柠檬酸/磷酸缓冲液处理的帝萨体 亦诱导IL-2，虽然程度低很多。关于这一点，柠檬酸缓冲液可使帝萨 体失活，所以使用柠檬酸缓冲液装载完整细胞的条件不能有效地装载 帝萨体。因此选择醋酸钠缓冲液进行进一步的研究。我们接下来测试 外源β2-m的存在是否可促进肽与帝萨体HLA-A2的结合。图20显示 利用10微克/毫升HLA-A2限制的生物素参考肽，20微克/毫升β2-m 的加入显著增加了参考肽结合的含量。
为了确定与HLA A2分子饱和结合所需的肽的含量，我们进行肽 滴定，其中在装载期间加入0-20微克/毫升的肽。图21显示当使用超 过1.25微克/毫升的参考肽时，装载便已经饱和了。使用三种不同的 帝萨体制品，通过改变在室温下的温育时间，来评估肽装载的动力学。 图22显示在所有三种测试的帝萨体中，肽结合在30分钟到4小时之 间的温育时间内相对较恒定，这说明大部分结合发生在30分钟内。 从我们的研究中，我们认为使用pH4.2的醋酸钠缓冲液的弱酸洗脱， 10微克/毫升第I类肽，20微克/毫升β2-m，以及在室温下装载30分 钟，对在帝萨体上装载第I类肽提供了最适条件。
我们设计了肽竞争性测定，以便提供未标记的靶肽可以相同的方 式装载于帝萨体上的证据。以1-100的比例，将未标记的靶肽MAGE- 3、4或10与5微克/毫升标记的参考肽混合。参考肽萤光信号的降低 表明未标记的靶肽对帝萨体的竞争性结合。如同图23证实，所有三 种MAGE衍生的肽均与参考肽竞争和帝萨体的结合。MAGE3和10 比MAGE-4竞争得更多，或许表示在该装载条件下，对HLA-A2分子 具有比MAGE-4更高的结合亲和力。
建立使用MART-1肽特异性T细胞纯种系LT11的功能测定，以 便测试帝萨体的生物活性，其测量体外的抗原特异性T细胞反应。依 据以第I类肽直接装载帝萨体的方案，在0.01至10微克/毫升的肽浓 度下，将MART-1、HLA-A2限制肽装载于HLA-A2+或HLA-A2-帝萨 体上。随后通过密度梯度离心冲洗装载的帝萨体以去除未结合的肽。 结果呈现于图24中，并显示以10μM Mart脉冲的HLA A2+BM-DC细 胞能够激活识别带有Mart肽的HLA A2的LT11纯种系。HLA A2- BM-DC细胞不能刺激LT11纯种系。以15微升Mart直接装载的HLA A2+帝萨体脉冲的BMDC细胞能够激活LT11纯种系，无论是何种单 元型的树突细胞。
先前，间接肽装载的帝萨体仅诱导少量水平的IL-2分泌，即使 是在将10微克/毫升Mart-1肽加至DC培养物中来制备帝萨体时。以 Mart-1肽直接装载的帝萨体一致且可再现地刺激LT11纯种系，这暗 示直接肽装载是生产具有生物活性帝萨体的较有效途径。
相同的方案亦适用于直接装载HLA-A1限制肽。在该实验中，生 物素酰化的参考肽EVDPC(生物素)GHLY衍生自天然的HLA-A1 限制的MAGE3-A1肽EVDPIGHLY，与A1+/A2-帝萨体(Exo 433)结 合，但不与A1-/A2+帝萨体(Exo 427)结合。相反，HLA-A2限制的 生物素酰化的参考肽衍生自B型肝炎核心抗原，与A1-/A2+结合，但 不与A1+/A2-帝萨体结合，这证实第I类抗原肽严格的HLA-等位基因- 依赖性装载。图10的下图显示未标记的MAGE3-A1肽和生物素酰化 的MAGE-3 A1肽竞争与A1+帝萨体(Exo 433)的结合。
直接装载方法亦适用于PIA肽和鼠科动物的帝萨体。结果呈现于 图25中。以25微升或50微升直接装载H2b帝萨体的OVA脉冲D1 细胞，能够激活识别带有OVA肽的Kb的B3Z细胞。当以直接装载H2d 帝萨体的OVA脉冲D1细胞时，我们亦观察到较低程度的活化作用。
使用HLA-A1限制肽，获得类似的结果。 在β2-m缺乏之下，HLA-A2+帝萨体的直接装载
如图20所示，在pH4.2的酸洗脱之后，可在中性pH值下将外源 肽装载于帝萨体上，而无需添加外源β2-m。因为结合信号是在20微 克/毫升β2-m存在下的四分之一至三分之一，故我们使实验条件最适， 以便在外源β2-m缺乏之下增加装载的效率。测试两种肽浓度，10和100 微克/毫升的生物素酰化的参考肽以及pH4.2、4.5、4.8和5.2的醋酸 钠缓冲液。图26显示参考肽在100微克/毫升下采用pH4.8的醋酸缓 冲液大大促进了参考肽的装载。
不象在β2-m存在下装载帝萨体，其中在酸处理90秒之后很快中 和帝萨体，在β2-m缺乏下装载帝萨体，需要它们在pH4.8或5.2下停 留延长的期间，通常室温下最少30分钟。图27显示在用pH4.8或5.2 未处理或处理后，由SEE装载的帝萨体诱导的Jurkat细胞分泌IL-2 并没有差异，这暗示该处理不会损伤外来体。
为了证实在β2-m缺乏下可装载靶肽MAGE-3、4和10，进行一 组竞争实验。图28中，在pH4.8下，5-20倍的MAGE-4和MAGE-10 肽与参考肽竞争为35％或66％，类似pH4.2在β2-m存在下的抑制程 度(参见图23)，这表示可通过两种方法来装载两个肽。图29显示 在pH5.2下由Mage-3所导致的抑制。装载MAGE-3似乎在pH5.2下 比在pH4.8下更有效率，因为MAGE-3的竞争在pH4.8时弱很多(数 据未显示)。
根据上文结果，我们在β2-m缺乏之下将Mart-1肽装载于HLA-A2+ 上，并在LT11测定中对它们进行了测试。图30显示在β2-m缺乏之 下以Mart-1肽装载的帝萨体的生物活性。在该实验中，在β2-m缺乏 之下pH4.8和5.2时，以10和100微克/毫升将Mart-1肽装载于HLA- A2+(Exo 447)和HLA-A2-(Exo 450)帝萨体上。作为对照，则在β2-m 存在下亦以10微克/毫升的Mart-1装载Exo 447。以三种不同条件装 载的帝萨体(pH4.8无β2-m、pH5.2无β2-m、pH4.2有β2-m)均具有 类似的生物活性，这表示对生成具有生物活性的帝萨体而言，并非绝 对需要β2-m。 在β2-m的存在和缺乏之下，HLA-A1+/B35+帝萨体的直接装载
相同的方案可适用于直接装载HLA-A1或B35限制肽。九聚体 的MAGE-3A1(EVDPIGHLY)衍生自MAGE-3蛋白质，由HLA-A1 和HLA-B35提供。为了测试是否可将该肽装载于HLA-A1+帝萨体上， 我们设计了称作MAGE-3A1C5的参考肽，其中以半胱氨酸取代 MAGE-3A1肽的异亮氨酸并以生物素标记。在该实验中，如图31的 上部所示，在β2-m的存在下，将生物素酰化的MAGE-3A1C5装载于 HLA-A1+/A2-帝萨体(Exo 433)上。我们发现同样的肽不能装载于 HLA-A1-/A2+帝萨体(Exo 427)上。相反，衍生自B型肝炎核心抗原 的HLA-A2限制、生物素酰化的参考肽可装载于A1-/A2+，但不能装 载于A1+/A2-帝萨体上，这证实第I类抗原肽严格的HLA-等位基因-依 赖性装载。图31的下部显示天然的MAGE3-A1肽与生物素酰化的 MAGE-3A1C5肽竞争对A1+帝萨体(Exo 433)的结合，这表示未标 记的MAGE3-A1肽对A1+帝萨体的结合能力。
由于HLA-A1+帝萨体的来源有限，我们使用HLA-B35+帝萨体(Exo 426)来测试MAGE 3-A1的结合以及在β2-m缺乏之下的抑制。对 HLA-A2+帝萨体使用相同的装载条件，我们在图32的上部中直接显示 MAGE-3A1C5可在pH4.8或pH5.2下与HLA-B35+帝萨体结合，而在 pH5.2下较少与HLA-A1-B35-帝萨体(Exo 424)的非特异性结合。图 32的下部显示，在缺乏β2-m之下pH4.8和5.2时，由天然的MAGE-3A1 肽导致的MAGE-3A1C5的抑制。在pH4.8处，通过天然MAGE-3A1 的结合抑制强很多，这暗示未标记的MAGE-3A1肽在该pH值下对 HLA-B35+帝萨体具有较佳的结合能力。这些结果显示直接肽装载在其 他HLA第I类等位基因上的广泛应用。
因此，该实施例描述了通过已知为直接装载的过程，生产以免疫 原性化合物(例如第I类限制的肿瘤衍生的肽)装载的具有生物活性 的帝萨体的极有效方法。帝萨体第I类分子通过弱酸处理丧失了内源 肽和β2-m，可有效地装载靶肽，如生化和功能数据所示。将与帝萨体 结合的参考肽的萤光信号与铕标准相比较，可定量测量与帝萨体结合 的肽的含量。表3显示在β2-m缺乏之下与帝萨体结合的参考肽的绝对 含量。依据供体和所用的装载条件，每1014个第II类分子有0.1-1.2 纳克之间的参考肽。该数目显著地接近大量制造的帝萨体制品的数目 (每1014个第II类分子1纳克)，其中以大得多的规模在pH4.8下用 10微克/毫升肽进行肽装载。即使在β2-m缺乏之下结合较少(图23)， 我们的LT11测定数据(图30)显示在利用不同条件装载的帝萨体之 间具有类似的生物活性，这表示在β2-m缺乏之下直接装载对生物功能 是足够的。
通过TRF和ELISA对在帝萨体上的第I类分子水平进行定量， 允许确定肽在第I类分子上的占有率。我们已经估计参考肽在帝萨体 的HLA-A2分子上的占有率高达15％，更优选的是高达40％。肽的高 占有率大大地改善了T细胞刺激活性，所述活性由体外T细胞测定来 测量。此外，肽装载的定量和帝萨体的第I类分子上肽占有率的确定 将有助于评估基于帝萨体的治疗候选物的剂量，这对于设计动物研究 和未来临床试验都是重要方面。
亦可在β2-m缺乏之下进行直接装载。使用高肽浓度和弱酸缓冲 液在HLA分子上观察到肽的交换。我们通过竞争实验已经证实以该 方式可将我们的靶肽MAGE-3、4和10特异性地装载于HLA-A2+帝萨 体上。在β2-m缺乏之下，Mart-1肽装载的帝萨体通过LT11刺激了IFN-γ 的分泌，这证实了帝萨体的生物活性。因此，没有β2-m来制造具有生 物活性的帝萨体是可行的，并由此排除了使用从人类供体中纯化的β2- m或非-GMP级的重组β2-m的困难。在β2-m下整体装载是较低的， 但似乎不影响LT 11的活化作用，这暗示生物测定比生化测定更灵敏。
我们已经证实直接肽装载对各种HLA第I类等位基因具有广泛 的应用，如HLA-A2、A1和B35。先前，帝萨体的肽装载依赖间接的 方法，需要增加细胞培养的操作，并因此增加污染的机会。直接肽装 载在制造帝萨体时是较安全的，其排除了对β2-m的需要以及将肽加至 每个培养烧瓶中的艰难任务。
表3 帝萨体制品 HLA-第II类 (1010/微升) 皮摩尔肽/ 16.6微升Dex样品 微克肽(10-9)/ 1014第II类 pH5.2无β2-m 100微克/毫升肽 Dex 375 2.89 1.4+/-0.1 0.42 Dex 430 3.99 6+/-.05 1.3 Dex 431 1.44 1.99+/-0.1 1.2 Dex 447 12.7 1.52+/-0.1 .01 PQ01 6.57 1.3+/-0.2 0.2 VP0023-02 1.21 0.93+/-0.1 0.7 pH5.2无β2-m 10微克/毫升肽 430 3.99 0.9+/-0.2 0.2 447 12.7 1.6+/-.06 0.11 pH4.8无β2-m 100微克/毫升肽 375 2.89 4.6+/-0.4 1.4 447 12.7 8.8+/-0.2 0.6 PQ01 6.57 5.9+/-10 0.8 VP0023-02 1.21 3.6+/-0.3 2.6 pH4.8无β2-m 10微克/毫升肽 375 2.89 1.2+/-0.3 0.36 447 12.7 2.4 0.16 PQ01 6.57 1.1+/-0.1 0.14 VP0023-02 1.21 1.7+/-0.5 1.2
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