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一种人类精子冷冻保护剂

阅读：460发布：2020-05-11

专利汇可以提供一种人类精子冷冻保护剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种适用于人类精子冷冻保存的冷冻保护剂，本发明提供的冷冻保护剂主要由以下成分组成：柠檬酸钠，三羟甲基氨基甲烷，三羟甲基甲胺基乙磺酸，甘油和海藻糖。本发明提供的冷冻保护剂无卵黄等动物源性成分，避免了潜在的生物安全隐患。与现有技术相比，采用本发明提供的冷冻保护剂对人类精子进行冷冻保存，经过解冻后能够取得更好的复苏率，复苏后的前向运动精子较多，前向运动能力较好，同时复苏后的精子的自发顶体反应率和DNA碎片率更低，即顶体完整的精子多，精子的核损伤小，对精子功能的保护能力更好。，下面是一种人类精子冷冻保护剂专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种人类精子冷冻保护剂，其特征在于，每100毫升保护剂含有如下组分：柠檬酸钠，三羟甲基氨基甲烷，三羟甲基甲胺基乙磺酸，海藻糖，甘油和五蒸水余量。
2.依照权利要求1所述的柠檬酸钠，其特征在于，每100毫升保护剂含有柠檬酸钠0.325±0.095克。
3.依照权利要求1所述的三羟甲基氨基甲烷，其特征在于，每100毫升保护剂含有三羟甲基氨基甲烷0.875±0.255克。
4.依照权利要求1所述的三羟甲基甲胺基乙磺酸，其特征在于，每100毫升保护剂含有三羟甲基甲胺基乙磺酸0.305±0.075克。
5.依照权利要求1所述的海藻糖，其特征在于，每100毫升保护剂含有海藻糖5.5±2.1克。
6.依照权利要求1所述的甘油，其特征在于，每100毫升保护剂含有甘油13±5毫升。
7.依照权利要求1所述的冷冻保护剂，其特征在于，其pH值为7.5。

说明书全文

一种人类精子冷冻保护剂

技术领域

[0001] 本发明涉及人类细胞的冻存领域，具体地说，涉及一种人类精子冷冻保护剂。

背景技术

[0002] 人类精子的冷冻保存是保证辅助生殖技术顺利开展的前提之一，冷冻保存技术的提高，有助于提高临床上辅助生殖中可利用的精子质量。精子的冷冻保护剂配方的完善是提高人类精子冷冻保存的关键因素之一。超低温的冷冻过程中的冰晶形成，损伤精子的结构，影响精子的功能，如自发顶体反应率和精子DNA碎片率的提高，进而影响精子的受精功能。因此，精子的冷冻保护不仅需求对精子运动性进行保护，还需要提高精子功能方面的保护效果。目前临床上采用的冷冻保护剂主要分为两类，一类为市售冷冻保护剂，一类为各临床应用场所自制冷冻保护剂。市售冷冻保护剂的缺点在于精子的冷冻保护效果，特别是精子功能方面的保护效果有限，而部分自制冷冻保护剂含有卵黄等动物源性成分，存在一定的生物安全隐患。发明专利申请201301725422公布了一种人类冷冻保护剂，其公布的保护剂成分中含有新鲜蛋黄，存在生物安全隐患。发明专利申请2015110283406公布了一种无卵黄的冷冻保护剂，虽然在冷冻复苏率方面有一定的提高，但是并无针对精子功能方面的保护。本发明提供一种无卵黄等动物源性成分的冷冻保护剂，适用于程序化冻存人类精子，并在解冻后可以获取理想的冷冻复苏率和降低精子在冷冻过程中功能方面的损伤。

发明内容

[0003] 本发明提供了一种人类精子的冷冻保护剂，可以在一定程度上降低冷冻中对精子功能的损伤。

[0004] 为实现上述目的，本发明提供如下人类精子冷冻保护剂，具体技术实施方案如下：

[0005] 一种人类精子冷冻保护剂，每100毫升保护剂含有如下成分：

[0006] 柠檬酸钠0.325±0.095克，三羟甲基氨基甲烷(Tris)0.875±0.255克，三羟甲基甲胺基乙磺酸(TES)0.305±0.075克，甘油13±5毫升，海藻糖5.5±2.1克。

[0007] 具体制备方法如下：

[0008] A、称取适量柠檬酸钠，三羟甲基氨基甲烷和三羟甲基甲胺基乙磺酸，用50毫升五蒸水搅拌至充分溶解，以柠檬酸调节溶液pH值到7.5；

[0009] B、称取适量海藻糖，加入上述溶液，缓慢搅拌至充分溶解；

[0010] C、量取适量甘油，加入上述溶液，缓慢搅拌至充分溶解；

[0011] D、加入五蒸水，定容至100毫升；

[0012] E、上述配置溶液，经充分溶解后，依次分别经过0.45微米和0.25微米滤器过滤；

[0013] F、将过滤后的保护剂分装，放入超低温冰箱冻存；

[0014] 与现有的技术相比，本发明的优势在于，冷冻保护剂中无卵黄等动物源性成分，操作简便，制备时间短，使用本保护剂进行人类精子的冷冻保存，在解冻后能够获得较好的复苏效果，复苏后精子的前向性运动能力较好，同时与市售保护剂相比，自发顶体反应率和精子DNA碎片率降低。

具体实施方式

[0015] 下面将对本发明实施过程中的技术方案进行详细、完整的描述，值得注意的是，所描述的方案仅代表部分实施方式。本领域的科技工作者在阅读本发明内容后，基于本发明中的实施方式，技术工作者在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明的保护范围。

[0016] 实施例1：

[0017] A、取消毒后洁净容量瓶，量取50毫升五蒸水，加入柠檬酸钠0.3克，加入五蒸水中，搅拌至充分溶解；

[0018] B、称取三羟甲基氨基甲烷0.8克，三羟甲基甲胺基乙磺酸0.3克，加入上述溶液，搅拌至充分溶解；

[0019] C、用0.1mol/L的柠檬酸溶液调节上述溶液至pH7.5；

[0020] D、称取海藻糖5.5克，加入上述溶液，缓慢搅拌，避免气泡产生，至充分溶解；

[0021] E、量取甘油10毫升，加入上述溶液，缓慢较慢，避免气泡产生，至充分溶解；

[0022] F、使用孔径为0.45微米过滤器过滤上述溶液，过滤后溶液放入无菌清洁容器中暂存；

[0023] G、使用0.22微米过滤器过滤上述溶液，取部分过滤后溶液进行病原体培养，其余溶液分装冻存至-80℃冰箱。待病原体培养结果为阴性后，分装溶液方可应用于实践；

[0024] H、取新鲜充分液化后的人类精液0.5毫升，加入上述配置保护剂0.5毫升于冻存管中，充分混匀。

[0025] I、按照程序冷冻仪预设值的冷冻程序冻存上述精子与保护剂混合液，完成冷冻程序后，将冻存管冻存在液氮罐中。

[0026] 以下通过实验对比检测本发明提供的精子冷冻保护剂的冷冻效果：

[0027] A、选取市售精子冷冻保护剂(对比例1)，与本发明提供的人类精子冷冻保护剂进行对比，具体实施方案与实施例1相同；

[0028] B、按世界卫生组织第五版精液常规分析标准，随机选取10例正常人类精液；

[0029] C、在精液充分液化后，采用计算机辅助分析系统分析并记录精液常规参数，将每例精液随机分为四份，其中一份用于检测自发顶体反应，一份用于精子DNA碎片率检测，剩余另外两份用于冷冻保存对比实验：一份采用对比例1保护剂，按照使用说明书操作；另一份采用本发明提供实施例1配置保护剂；

[0030] D、按精液：保护剂＝1:1(体积比)的比例将液化后精液与精子冷冻保护剂充分混匀，即1毫升混匀液体中，含有0.5毫升精液和0.5毫升保护剂；

[0031] E、按照程序冷冻仪设置程序进行冷冻，程序完毕后放入液氮中保存30分钟；

[0032] F、37℃水浴摇床解冻，将充分解冻后的混合液分为三份，其中，一份用于计算机辅助分析系统检测解冻后精液常规参数，一份用于检测自发顶体反应，一份用于精子DNA碎片率检测；

[0033] 采用本发明提供的人类精子冷冻保护剂，与市售人类精子冷冻保护剂按相同比例，相同方法进行冷冻保存，采用相同解冻方法解冻后，使用计算机辅助精子分析系统，对比精子的冷冻复苏率、精子活力和前向运动精子总数进行对比分析，采用市售试剂盒对自发顶体反应率和精子DNA碎片率检测，得到实验数据如下表：

[0034] 新鲜精液对比例1 实施例1
前向运动精子数 46.94±17.3 36.02±16.31 39.72±16.11
曲线速度 80.77±12.18 60.34±10.36 66.89±10.88
冷冻复苏率 70.31±16.44 77.16±18.68
自发顶体反应率 36.32±20.44 71.27±16.29 62.25±15.34
精子DNA碎片率 15.15±7.21 22.52±12.07 16.13±7.07

[0035] 解冻后精子活力÷冷冻保存前精子活力＝冷冻复苏率。

[0036] 自发顶体反应率的检测采用安徽安科生物工程(集团)股份有限公司精子顶体染色试剂盒(PSA-FITC染色法)，按说明书操作并计数。

[0037] 精子DNA碎片率检测采用浙江星博生物科技股份有限公司精子核完整性染色试剂盒，按说明书操作并计数。

[0038] 由以上数据可知，采用本发明所提供的冷冻保护剂，与市售保护剂对比例1相比，在解冻后的前向运动精子数增加，复苏率增加；同时自发顶体反应率降低，意味着采用本发明提供的保护剂冷冻后，顶体完整的精子数目要多于市售保护剂对比例1,；精子DNA碎片率降低，意味着采用本发明提供的保护剂冷冻后精子的DNA损伤较对比例1小，说明采用本发明提供的冷冻保护剂对人类精子功能的保护性较好。

[0039] 根据以上所给的实施例，本领域的技术人员或者研究人员可以在不脱离本发明原理的情况下对实施例进行变化、修改、替换，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

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