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细胞因子产生细胞片及其利用方法

阅读：897发布：2023-03-01

专利汇可以提供细胞因子产生细胞片及其利用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且通过改变构成细胞片层叠体的细胞的种类、混合比例、接种的细胞数而改变细胞片层叠体内的细胞的状态，能够最优化促进血管新生的细胞因子的产生，另外也能够最优化血管内皮网络构建。，下面是细胞因子产生细胞片及其利用方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种细胞片或其的层叠体，其特征在于，所述细胞片具有产生与促进血管新生有关的细胞因子的能力，构成所述细胞片的细胞中至少包含有成纤维细胞，并且包含骨骼肌成肌细胞10%以上。
2.根据利要求1所述的细胞片或其的层叠体，其中，成纤维细胞来源于骨骼肌肌肉组织。
3.根据权利要求1、2的任一项所述的细胞片或该细胞片的层叠体，其中，以75%～25%的比例含有骨骼肌成肌细胞，细胞因子为血管内皮细胞增殖因子（VEGF）和/或肝细胞增殖因子（HGF）。
4.一种细胞片或该细胞片的层叠体，通过在进行接种的血管内皮细胞上重叠权利要求
1～3的任一项所述的细胞片或细胞层叠体而构建血管内皮细胞网络。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的细胞片或该细胞片的层叠体，其中，该细胞从生物体组织中提取。
6.根据权利要求1～5的任一项所述的细胞片或该细胞片的层叠体，其中，选自骨骼肌成肌细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞的至少一种细胞来源于自体组织。
7.根据权利要求1～6的任一项所述的细胞片或该细胞片的层叠体，其中，细胞为进行了荧光标记的细胞。
8.一种权利要求1～7的任一项所述的细胞片的制造方法，其特征在于，在表面覆盖有水合力在0～80℃的温度范围内变化的聚合物的细胞培养支撑体上，在聚合物的水合力弱的温度区域培养该细胞，其后，使培养液变化至聚合物的水合力变强的状态的温度而使培养的细胞以片状剥离。
9.一种权利要求1～7的任一项所述的细胞片的制造方法，其中，每1层细胞片所接种
5 5 2
的细胞为1.0×10 ～7.0×10 个／cm。
10.一种权利要求1～7的任一项所述的细胞片层叠体的制造方法，其特征在于，将剥离的细胞片进一步层叠在其他的片状培养细胞上，或者重复该操作而将细胞片层叠。
11.一种权利要求8～10的任一项所述的细胞片或该细胞片的层叠体的制造方法，其中，剥离方法中，不实施通过蛋白质分解酶进行的处理而由细胞培养支撑体剥离。
12.一种权利要求8～11的任一项所述的细胞片或该细胞片的层叠体的制造方法，其中，剥离方法为如下方法：在培养结束时，在培养细胞上紧贴载体，与载体一起剥离。
13.一种权利要求8～12的任一项所述的细胞片或该细胞片的层叠体的制造方法，其中，水合力在0～80℃的温度范围内变化的聚合物为聚（N-异丙基丙烯酰胺）。
14.根据权利要求1～7的任一项所述的细胞片或该细胞片的层叠体，其用于将得到的细胞片或该细胞片的层叠体移植入生物体内的心脏的用途。
15.根据权利要求14所述的细胞片或该细胞片的层叠体，其中，将得到的细胞片或该细胞片的层叠体用于以下用途：选自由心力衰竭、缺血性心脏病、心肌梗塞、心肌病、心肌炎、肥大型心肌病、扩张期肥大型心肌病和扩张型心肌病组成的组的至少一种心脏的疾患或障碍的治疗，或者心肌壁重建的移植。

说明书全文

细胞因子产生细胞片及其利用方法

技术领域

[0001] 本发明涉及在药物研发、药学、医学、生物等领域中有用的、产生与血管新生有关的细胞因子的细胞片、构建有高密度的血管内皮细胞网络的细胞片、其制造方法以及其利用方法。本申请是以2011年2月28日所提出的日本专利申请（日本特愿2011-043198号）为基础主张优先权的申请。

背景技术

[0002] 近年来，为了使受到损伤的生物体组织再生，各种各样的再生医疗技术备受瞩目。关于这些，以心肌组织的再生为例已经进行了多项研究，如：向心肌组织将心肌细胞、骨骼肌成肌细胞、间充质干细胞直接注入并再生的方法；如后所述，在特殊的温度响应性基材上培养心肌组织细胞，使温度变化，制成低损伤的心肌组织细胞片并移植进行再生的方法（参照专利文献1。）等，一部分细胞也开始转向人的临床研究。

[0003] 专利文献2中公开有：以心肌功能的改善、血管新生的促进、心肌组织的再生为目的，将选自心肌细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞以及骨骼肌成肌细胞的细胞作为移植片而进行利用的方法。另外，专利文献3中公开有：以心脏功能恢复为目的，将骨骼肌细胞组合物作为移植片而利用的方法。根据专利文献2和3，动物实验的例中，通过注入上述的移植片，确认有心功能的恢复，显示出其有效性。但是，专利文献2和3中公开的细胞移植片均为注入细胞悬浮液的方法，被移植的细胞具有如下问题：从移植部位流出且难以控制移植部位，另外，由于移植的细胞坏死而不能进行有效的移植等，期望更进一步的改善。

[0004] 作为解决上述问题的一种方法，开发出利用细胞片的移植法。预先，将成为移植片的细胞培养成片状，将它们移植入功能降低的生物体组织，从而现有的细胞悬浮液注入法中常见的、细胞向移植部位周边的流出被抑制到最小限度，作为再生医疗的新技术而备受关注。

[0005] 移植所利用的多数细胞片，使用包括人细胞在内的动物细胞中特别是附着依赖性的细胞而制作。为了制成细胞片，需要将动物细胞在生物体外进行培养，将它们暂时附着于基材表面上。接着，将培养的细胞不散开地剥离、保持其在基材表面上培养的形态而使之剥离，这是必不可少的。

[0006] 作为细胞片的制作方法，专利文献1中公开有一种新型的细胞培养法，在被对水的上限或下限临界溶解温度为0～80℃的高分子覆盖基材表面的细胞培养支撑体上，在上限临界溶解温度（Upper critical solution temperature）以下或下限临界溶解温度(Lower critical solution temperature)以上培养细胞，其后设为上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，由此不进行酶处理而使培养细胞剥离。另外，专利文献4中公开有，利用该温度响应性细胞培养基材在上限临界溶解温度以下或下限临界溶解温度以上培养皮肤细胞，其后设为上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，由此使培养皮肤细胞以低损伤剥离。通过利用温度响应性细胞培养基材，能够谋求对于现有的培养技术进行各种各样的新型的拓展。

[0007] 进一步，专利文献5中发现，在用温度响应性聚合物覆盖基材表面而成的细胞培养支撑体上培养心肌组织的细胞，得到心肌样细胞片，其后，将培养液温度设为上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，使培养的细胞片层叠体紧贴于聚合物膜，使之在该状态下与聚合物膜一起剥离，以及将其用规定的方法使之三维结构化，由此构建出结构缺陷少、在体外具备作为心肌样组织的几种功能的细胞片、以及三维结构。然而，此处的方法中，细胞片的层叠并非无限地进行，心肌样细胞片中以3层左右、厚度为100μm左右为界限，如果为其以上的厚度，则存在只有培养基、间质液扩散细胞才能存活的问题点。为了制作具有其以上的厚度的细胞片，制作伴随能够向三维化的组织中运送氧、营养的血管网的细胞片的技术的开发不可缺少，成为再生医疗领域的研究者等共同的课题。

[0008] 将大鼠心肌细胞片移植到大鼠心肌梗塞模型时，由于改善了由缺血而降低的心功能，因此确认了细胞片对于心肌的有效性（非专利文献1）。另外，通过作为能够临床应用的细胞的成肌细胞片、脂肪组织或来源于经血的间充质干细胞片，也确认有心功能改善；显示出来源于各种各样的细胞种的细胞片的有效性（非专利文献2、非专利文献3、非专利文献4）。

[0009] 将包含成肌细胞的细胞片移植至患病部位时，由细胞片稳定并持续地分泌血管内皮细胞增殖因子（VEGF）、肝细胞增殖因子（HGF）等各种细胞因子，它们促进血管新生，另外，由于基质细胞衍生因子（Stromal Cell-derived Factor1，SDF-1）等的分泌，干细胞被动员至细胞片移植部位周边，由此启示了心功能改善的可能性（旁分泌效果）。进一步，可以认为由细胞片分泌的细胞因子，也作用于细胞片层叠体自身，对细胞片层叠体内部的血管网构建也带来影响（自分泌效果）。

[0010] 以此为背景，非专利文献5中公开有，作为得到具有100μm以上的厚度的细胞片层叠体的方法，在生物体内将细胞片层叠，在细胞片内新生出血管网时，进一步将细胞片层叠，通过重复该操作，得到1mm厚的心肌片层叠体。其中，启示出为了得到具有厚度的细胞片层叠体，需要对被层叠的细胞片内的各细胞供给营养、氧。为了用非专利文献5中公开的方法制作赋予了血管网的细胞片层叠体，有必需在生物体内重复层叠细胞片而从生物体侧衍生血管网的必要。每逢层叠细胞片都必须将移植部位开口，是一种向移植侧施加大的负担的方法。

[0011] 为了在生物体外制作具有超过100μm的厚度的细胞片层叠体，在生物体外赋予血管网的技术的开发是不可或缺的。公开有将大鼠心肌细胞和血管内皮细胞共培养时，能够得到在细胞片内形成有血管内皮细胞的网络结构的细胞片层叠体。将得到的细胞片层叠体移植于生物体内时，在移植部周边衍生出来源于细胞片的血管内皮细胞网络的毛细血管，更厚的心肌组织的再生变得可能（非专利文献6）。另外，通过构建血管内皮细胞网络，不仅能够制作具有厚度的细胞片层叠体，通过形成的血管网，各种细胞因子有效地分泌于移植部周边组织，由此也能够期待移植后的治疗效果的大幅提高。

[0012] 如上所述，本领域中，为了在生物体外制作模仿了生物体组织的组织，赋予血管网的技术是必不可缺的，要求进一步的改良。但是，到目前为止，尝试构建包含细胞片层叠体的三维生物体组织时，定量并且简便地评价三维生物体组织内所构建的血管内皮细胞网络的方法不存在。因此，对于最佳的构建有血管内皮网络的细胞片层叠体的设计方法尚无报道。因此，发明人等开发了将在细胞片层叠体内作为三维结构所构建的血管内皮细胞网络用二维的解析手法进行评价的技术（专利文献6）。通过利用该技术，变得可能将细胞片层叠体内的血管内皮细胞网络进行简单地评价。如果能够发明设计预先构建高密度的血管内皮网络的细胞片层叠体的方法，则可以认为不仅在生物体外也能够稳定地制作具有厚度的细胞片层叠体，促进血管新生且能够期待良好的治疗效果的细胞片层叠体也变得能够得到。

[0013] 现有技术文献

[0014] 专利文献

[0015] 专利文献1：日本特开平2-211865号公报

[0016] 专利文献2：日本特表2002-518006

[0017] 专利文献3：日本特表2003-505475

[0018] 专利文献4：日本特开平05-192138号公报

[0019] 专利文献5：日本再表2002-008387号公报

[0020] 专利文献6：国际公开2010/101225公报

[0021] 非专利文献

[0022] 非专利文献1：Transplantation、80、1586-1595、2005

[0023] 非专利文献2：J.Thorac.Cardiovasc.Surg.、130、1333-1341（2005）[0024] 非专利文献3：Nat.Med.、12、459-465（2006）

[0025] 非专利文献4：Stem Cells、26、1695-1704（2008）

[0026] 非专利文献5：FASEB J.、20（6）、708-710（2006）

[0027] 非专利文献6：J.Biochim.Biophysic.Res.Commun.、341、573-582（2006）发明内容

[0028] 发明要解决的问题

[0029] 本发明意图在于确立：具有产生促进血管新生的细胞因子的能力和/或高密度地构建血管内皮网络的细胞片层叠体的制作方法。即，本发明能够提供：与现有的方法相比较产生促进血管新生的细胞因子的能力优异，和/或与以往相比较血管内皮网络被高密度构建的细胞片层叠体。

[0030] 用于解决问题的方案

[0031] 本发明人等为了解决上述问题，从各种角度在讨论的基础上进行了研究开发。其结果发现，利用温度响应性培养基材而得到的细胞片层叠体做出了与生物体内的结构相近的特殊的环境。进一步，发现通过改变构成该细胞片层叠体的细胞的种类、混合比例、接种的细胞数而改变细胞片层叠体内的细胞的状态，能够最优化促进血管新生的细胞因子的产生，另外能够最优化血管内皮网络构建。本发明基于所述见解而完成。

[0032] 即，本发明提供细胞片或其的层叠体、以及其利用方法，该细胞片的特征在于，为具有产生与促进血管新生有关的细胞因子的能力的细胞片，构成所述细胞片的细胞中至少含有成纤维细胞，并且包含骨骼肌成肌细胞（skeletal myoblast）10%以上；和/或构建有血管内皮细胞网络。

[0033] 发明的效果

[0034] 使用本发明所述的、制作细胞片层叠体的方法时，与现有提供的细胞片或细胞片层叠体相比较，与血管新生有关的细胞因子的产生能力高，和/或在生物体外的环境下制作高密度地构建有血管内皮网络的细胞片或细胞片层叠体变得可能；所述细胞片层叠体的特征在于，具有产生与促进血管新生有关的细胞因子的能力；或具有产生与血管新生有关的细胞因子的能力且构建有血管内皮细胞网络。另外，通过利用本发明而制作的细胞片或细胞片层叠体能够成为心功能恢复能力高的移植材料。附图说明

[0035] 图1表示实施例1或者3中进行的、血管网络形成的定量评价的方法。绿（黑白画面中，淡灰色的网状部分）所表示的是血管内皮细胞。

[0036] 图2为表示实施例1中进行的、成肌细胞的密度对细胞片层叠体内的血管内皮细胞网络形成造成的影响的图。绿（黑白画面中，淡灰色的部分）所表示的是血管内皮细胞。5 2
表示1.15×10 个／cm 的接种密度的情况。

[0037] 图3为表示实施例1中进行的、成肌细胞的密度对细胞片层叠体内的血管内皮细胞网络形成造成的影响的图。绿（黑白画面中，淡灰色的网状部分）所表示的是血管内皮细5 2
胞。表示2.3×10 个／cm 的接种密度的情况。

[0038] 图4为表示实施例1中进行的、成肌细胞的密度对细胞片层叠体内的血管内皮细胞网络形成造成的影响的图。绿（黑白画面中，淡灰色的网状部分）所表示的是血管内皮细5 2
胞。表示4.6×10 个／cm 的接种密度的情况。

[0039] 图5为表示实施例1中进行的、成肌细胞的密度对细胞片层叠体内的血管内皮细胞网络形成造成的影响的图。表示Z轴方向的各细胞片层中存在的血管内皮细胞的比例。各图的1～5下面的数字为将最下层的细胞片作为第1层时的层数。d表示细胞片层叠体的厚度。

[0040] 图6为表示实施例2中进行的、成肌细胞的密度对促进血管新生的细胞因子产生能力造成的影响的图。表示培养开始第48小时的1细胞·每1日的细胞因子产量（pg）。

[0041] 图7为表示实施例2中进行的、成肌细胞片的层叠枚数对促进血管新生的细胞因子产生能力造成的影响的图。表示培养开始第48小时的1细胞·每1天的细胞因子产量（pg）。

[0042] 图8为表示实施例2中进行的、使成肌细胞和成纤维细胞混合存在进行培养时的、促进血管新生的细胞因子（VEGF、HGF）的各时间（24小时―48小时、144小时―168小时）中的1细胞·每1天的产量的图（a，b）。表示成肌细胞的myo下所示的数字表示细胞接种时混合存在的成肌细胞的比例。c和d为将a和b中得到的结果以成肌细胞的真正比例进行校正的结果。

[0043] 图9为表示实施例2中进行的、由混合存在有成肌细胞（myo）和成纤维细胞的细胞片和细胞片层叠体产生的细胞因子（VEGF、HGF）的1细胞·每1天的产量的图（a、b）。表示成肌细胞的myo下所示的数字表示细胞接种时混合存在的成肌细胞的比例。a和b中的红色圆圈（黑白画面中，棒状图中记载的○标记）表示5层的细胞片层叠体中的1细胞·每1天的细胞因子产量。c和d为将a和b中得到的结果以成肌细胞的真实比例进行校正的结果。

[0044] 图10为表示实施例3中进行的成肌细胞和成纤维细胞的混合比例对细胞片层叠体内的血管内皮细胞网络形成造成的影响的概略图。

[0045] 图11为表示实施例3中进行的成肌细胞和成纤维细胞的混合比例对细胞片内的内皮细胞网络形成造成的影响的照片。a为表示只有成肌细胞的细胞片内所构建的血管内皮网络（绿（黑白画面中，淡灰色的网状部分））的照片，b为表示包含成肌细胞50%、成纤维细胞50%的细胞片内所构建的血管内皮细胞网络（绿（黑白画面中，淡灰色的网状部分））的照片。

[0046] 图12为表示实施例3中进行的成肌细胞和成纤维细胞的混合比例在5层的细胞片层叠体内对血管内皮细胞网络形成造成的影响的照片。a为表示包含成肌细胞81%、成纤维细胞19%的细胞片内所构建的血管内皮细胞网络（绿（黑白画面中，淡灰色的网状部分））的照片；b为表示包含成肌细胞61%、成纤维细胞39%的细胞片内所构建的血管内皮细胞网络（绿（黑白画面中淡灰色的网状部分））的照片；c为表示包含成肌细胞41%、成纤维细胞59%的细胞片内所构建的血管内皮细胞网络（绿（黑白画面中，淡灰色的网状部分））的照片；
d为表示包含成纤维细胞100%的细胞片内所构建的血管内皮细胞网络（绿（黑白画面中淡灰色的网状部分））的照片。

[0047] 图13为表示实施例3中进行的成肌细胞和成纤维细胞的混合比例在5层的细胞片层叠体内对血管内皮细胞网络形成造成的影响的照片。最上段的图表示XY轴方向的血管内皮网络（绿（黑白画面中淡灰色的网状部分））的状态。第2段的图表示存在于Z轴方向的血管内皮细胞（绿（黑白画面中淡灰色的网状部分））的状态。第3段目的图表表示存在于细胞片各层的血管内皮细胞的比例。图表示全部细胞片层叠结束后的培养开始96小时后的血管内皮细胞网络的状态。为如下细胞片层叠体：越是左侧的列，细胞片制作时所接种的成肌细胞的比例越多；越是靠近右侧的列，成纤维细胞的比例越多（从左开始，成肌细胞的比例：100%、80%、60%、40%、20%、0%）。各图的1～5下面的数字为将最下层的细胞片作为第1层时的层数。h表示细胞片层叠体的厚度。

[0048] 图14为表示实施例3中进行的成肌细胞和成纤维细胞混合存在的细胞片层叠体2
内所达成的血管内皮细胞网络的构建度的图。L表示每1mm 的网络的长度的总计；NT表示
2
每1mm 的网络的端点数；L／NT为L除以NT的值。带有影子的区域表示包含成肌细胞和成纤维细胞的细胞片层叠体中的最佳的构建血管内皮网络的混合比例的范围。

具体实施方式

[0049] 本发明涉及分泌与促进血管新生有关的细胞因子和/或构建有高密度的血管内皮细胞网络的细胞片或其的层叠体、以及其利用方法。本发明提供的细胞片层叠体与通过现有的方法制作的细胞片相比较，高浓度地产生选自血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、上皮生长因子（EGF）的至少一种促进血管新生的细胞因子。另外，本发明能够提供一种细胞片层叠体，其高浓度地分泌与促进血管新生有关的细胞因子和/或具有最优化的血管内皮细胞网络。

[0050] 作为评价通过本发明制作的细胞片层叠体内所构建的、高密度的血管内皮细胞网络的手法，优选使用细胞片层叠体、目标细胞的二维解析细胞评价系统，用二维的解析手法以三维信息的形式得到目标细胞的选自生死、增殖、游走以及分化的至少一种相关生物学指标（参照专利文献：国际公开2010／101225号公报）。作为该二维解析装置，只要是将细胞做成为二维的信息、平面的信息而得到的手法，就没有特别的限定；例如，作为该装置，可列举出：荧光显微镜、光学显微镜、实体显微镜、激光显微镜、共焦显微镜等显微镜类；酶标仪装置类、其他具有微镜的装置类等。观察既可以在图像上进行，也可以在显微镜视野下通过目视而观察。另外，对于其解析手法也是，只要是利用上述的装置的通常的方法，就没有特别的限定，可列举出如下方法，例如：将细胞通过试剂、蛋白质、基因等至少一种以上的方法进行荧光染色和/或色素染色，用上述的显微镜类等观察其染色程度。标记细胞是指该进行了荧光染色和/或色素染色的细胞。使用上述的评价方法，将通过本发明制作的细胞片层叠体进行评价，由此期望能够确认能够确实地制造出特征在于大量地产生促进血管新生的细胞因子和/或构建最佳的血管内皮网络的细胞片或细胞片层叠体。

[0051] 为了制作本发明的细胞片层叠体，温度响应性基材变得必要。该基材是指对具有特定的表面的细胞培养基材在电子束照射下使温度响应性聚合物接枝化而成的基材。对于基材的材质，没有特别的限制，作为细胞附着表面，有将聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚甲基丙烯酸甲酯的任意者或两者以上组合而成的物质。其中，特别是，聚苯乙烯为通常使用的细胞培养用基材，所以优选。基材的覆盖中所使用的温度响应性聚合物在水溶液中具有上限临界溶解温度或者下限临界溶解温度为0℃～80℃、更优选为20℃～50℃。上限临界溶解温度或者下限临界溶解温度超过80℃时，存在细胞灭死的可能性而不优选。另外，上限临界溶解温度或者下限临界溶解温度低于0℃时，通常细胞增殖速度极度地降低，或者细胞灭死，因而也不优选。

[0052] 本发明中使用的温度响应性聚合物可以为均聚物、共聚物的任意者。作为这样的聚合物，可列举出例如：日本特开平2-211865号公报所公开的聚合物。具体而言，例如，通过以下的单体的均聚或者共聚而得到。作为能够使用的单体，可列举出例如：（甲基）丙烯酰胺化合物、N-（或N，N-二）烷基取代（甲基）丙烯酰胺衍生物、或者乙烯基醚衍生物；为共聚物的情况下，可以使用其中的任意的两种以上。更进一步，也可以使用与上述单体以外的单体类的共聚物、聚合物之间的接枝或共聚、或者聚合物、共聚物的混合物。另外，也可以在不有损聚合物本来的性质的范围内进行交联。此时，因为被培养、剥离的物质为细胞，所以分离在5℃～50℃的范围内进行，所以作为温度响应性聚合物，可列举出：聚-N-正丙基丙烯酰胺（均聚物的下限临界溶解温度21℃）、聚-N-正丙基甲基丙烯酰胺（均聚物的下限临界溶解温度27℃）、聚-N-异丙基丙烯酰胺（均聚物的下限临界溶解温度32℃）、聚-N-异丙基甲基丙烯酰胺（均聚物的下限临界溶解温度43℃）、聚-N-环丙基丙烯酰胺（均聚物的下限临界溶解温度45℃）、聚-N-环氧乙基丙烯酰胺（均聚物的下限临界溶解温度约35℃）、聚-N-环氧乙基甲基丙烯酰胺（均聚物的下限临界溶解温度约45℃）、聚-N-四氢糠基丙烯酰胺（均聚物的下限临界溶解温度约28℃）、聚-N-四氢糠基甲基丙烯酰胺（均聚物的下限临界溶解温度约35℃）、聚-N，N-乙基甲基丙烯酰胺（均聚物的下限临界溶解温度56℃）、聚-N，N-二乙基丙烯酰胺（均聚物的下限临界溶解温度32℃）等。作为本发明中所使用的用于共聚的单体，可列举出：聚丙烯酰胺、聚-N，N-二乙基丙烯酰胺、聚-N，N-二甲基丙烯酰胺、聚环氧乙烷、聚丙烯酸及其盐、聚甲基丙烯酸羟乙酯、聚丙烯酸羟乙酯、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、羧甲基纤维素等含水聚合物等；没有特别的限制。

[0053] 对于本发明中所使用的、上述的各聚合物向基材表面覆盖的方法，没有特别的限制，可以通过例如：将基材与上述单体或聚合物通过电子束照射（EB）、γ射线照射、紫外线照射、等离子体处理、电晕处理、有机聚合反应的任意者，或者通过涂布、混炼等物理吸附等2
而进行。温度响应性聚合物在培养基材表面的覆盖量在1.1～2.3μg／cm 的范围即可，
2 2 2
优选为1.4～1.9μg／cm，进一步优选为1.5～1.8μg／cm。覆盖量少于1.1μg／cm时，即便给与刺激该聚合物上的细胞也难以剥离，工作效率显著变差而不优选。相反地，为
2
2.3μg／cm 以上时，在该区域细胞难以附着，使细胞充分地附着变困难。这样的情况下，如果在温度响应性聚合物覆盖层上进一步覆盖细胞粘接性蛋白质，基材表面的温度响应性
2
聚合物覆盖量为2.3μg／cm 以上即可；此时的温度响应性聚合物的覆盖量为9.0μg／
2 2 2
cm 以下即可，优选为8.0μg／cm 以下即可，更优选7.0μg／cm 以下。温度响应性聚合
2
物的覆盖量为9.0μg／cm 以上时，即便在温度响应性聚合物覆盖层上进一步覆盖细胞粘接性蛋白质，细胞也难以附着而不优选。对于这样的细胞粘接性蛋白质的种类，没有任何限定，可列举出例如：胶原蛋白、层粘连蛋白、层粘连蛋白5、纤维连接蛋白、基底膜等单独、或两种以上的混合物。另外，这些细胞粘接性蛋白质的覆盖方法只要根据常规方法即可，通常将细胞粘接性蛋白质的水溶液涂布于基材表面，其后去除其水溶液而进行冲洗的方法。本发明为欲使用尽可能利用温度响应性培养皿的细胞片本身的技术。因此，温度响应性聚合物层上的细胞粘接性蛋白质的覆盖量变得极多而不优选。温度响应性聚合物的覆盖量、以及细胞粘接性蛋白质的覆盖量的测定按照常规方法即可，可列举出例如：使用FT-IR-ATR直接测量细胞附着部的方法；将预先标签化的聚合物用同样的方法固定化，根据被固定化于细胞附着部的标签化聚合物量进行推测的方法等，可以使用任意的方法。

[0054] 本发明中，为了将培养的细胞片由温度响应性基材进行剥离回收，将附着有被培养的细胞的培养基材的温度设为培养基材上的覆盖聚合物的上限临界溶解温度以上或下限临界溶解温度以下，可以由此使之剥离。此时，既可以在培养液中进行，也可以在其他的等渗液中进行，可以根据目的而进行选择。以将细胞更快、更高效地进行剥离、回收为目的，可以单独或组合使用轻轻叩击或摇晃基材的方法以及使用移液管而搅拌培养基的方法等。

[0055] 作为温度响应性聚合物以聚（N-异丙基丙烯酰胺）为例而对以上的事项进行说明。已知聚（N-异丙基丙烯酰胺）为具有31℃的下限临界溶解温度的聚合物，只要是游离状态，在水中31℃以上的温度下引起脱水合，聚合物链凝聚产生白色浑浊。相反地，31℃以下的温度下聚合物链水合而成为溶解于水中的状态。本发明中，该聚合物覆盖于培养皿等基材表面被固定。因此，只要是31℃以上的温度，基材表面的聚合物也同样地进行脱水合，聚合物链覆盖于基材表面而被固定，因此基材表面变得表现出疏水性。相反地，31℃以下的温度时，基材表面的聚合物水合，由于聚合物链覆盖于基材表面且被固定，因此基材表面变得表现出亲水性。此时的疏水的表面为细胞能够附着、增殖的适度的表面；而亲水的表面成为细胞不能附着程度的表面，培养中的细胞、或细胞片仅通过冷却就即能够剥离。

[0056] 作为实施覆盖的基材，可以使用全部的以通常细胞培养中所应用的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等化合物为代表的通常能够赋予形态的物质，例如，除了上述以外的聚合物化合物、陶瓷类等。

[0057] 对于本发明的培养基材的形状，没有特别的限定，可列举出例如：皿、多孔板、烧瓶、多孔膜上培养的细胞培养池之类形态的物质、或者平膜状的物质等。作为实施覆盖的基材，可列举出：以通常细胞培养中使用的玻璃、改性玻璃、聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等化合物为代表的通常能够赋予形态的物质，例如：上述以外的高分子化合物、陶瓷类等。

[0058] 进一步，对于温度响应性聚合物向培养基材覆盖的方法，没有特别的限制，例如：根据日本特开平2-211865号公报所记载的方法即可。即，所述的覆盖可以将基材和上述单体或聚合物通过电子束照射（EB）、γ射线照射、紫外线照射、等离子体处理、电晕处理、有机聚合反应的任意者，或者通过涂布、混炼等物理的吸附等而进行。

[0059] 本发明中提供的细胞片层叠体为以细胞片单独或与包含其他细胞的片组合的状态被层叠的物质即可。此时，利用两种以上的不同的细胞时，得到在不同的细胞间相互作用、细胞的流动性变化的细胞片，或得到促进血管新生的细胞因子产生高的细胞片，因而优选。对于本发明中利用的细胞，没有特别的限制，细胞片或细胞片层叠体内的流动性影响血管内皮细胞网络构建的成熟度，因此优选由流动性高的细胞与流动性低的细胞组合而成的细胞片或细胞片层叠体。作为流动性高的细胞，可列举出：骨骼肌成肌细胞、血管内皮细胞、间充质干细胞、进一步心肌细胞、表皮基底膜细胞等，没有特别的限制。另外，作为流动性低的细胞，可列举出成纤维细胞、分化的表皮角化细胞，没有特别的限定。通过将流动性高的细胞和流动性低的细胞混合，制作各种各样的具有流动性的细胞片层叠体变得可能。作为流动性高的细胞和流动性低的细胞的组合，例如：可以是包含肌组织的细胞和成纤维细胞的组合，具体而言，也可以是由骨骼肌成肌细胞和成纤维细胞的组合，或者也可以是由心肌细胞和成纤维细胞的组合。制作由肌组织的细胞和成纤维细胞的组合形成的细胞片时，制作作为使各种细胞混合存在的比例，以90%～25%的比例包含肌组织的细胞、以剩余的比例包含成纤维细胞的细胞片即可；优选制作以75%～25%的比例包含肌组织的细胞、以剩余的比例包含成纤维细胞的细胞片；最优选制作以60%～40%的比例包含肌组织的细胞、以剩余的比例包含成纤维细胞的细胞片。通过本发明，以最佳的细胞的混合比例制作的细胞片高浓度地产生选自血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子（HGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）、上皮生长因子（EGF）的至少一种促进血管新生的细胞因子，另外，成为作为构建血管内皮细胞网络的场所具有最佳的流动性的细胞片，因而优选。

[0060] VEGF被称为血管内皮细胞增殖因子，为通常作为配体结合于血管内皮细胞表面存在的血管内皮细胞增殖因子受体(VEGFR)的糖蛋白。作为刺激增殖、游走、分化，促进纤溶酶原激活剂、胶原酶等蛋白酶活性以及胶原蛋白凝胶中的血管样结构形成的、所谓的血管新生的全部的步骤，在体内(in vivo)促进血管新生的因子而已知。VEGF具有使微小血管的血管通透性亢进的作用，也涉及其他单核细胞·巨噬细胞的活性化。本发明的例的情况下，主要由骨骼肌成肌细胞分泌，在包含骨骼肌成肌细胞和成纤维细胞的细胞片中，根据骨骼肌成肌细胞的比例，制作单位细胞的VEGF的产量多的细胞片。可以认为，由细胞片或细胞片层叠体产生的VEGF促进细胞片层叠体的内部的血管内皮网络构建，另外，向患部移植时，向移植部周边分泌VEGF，促进移植部周边的血管新生。

[0061] HGF被称为肝细胞增殖因子，是具有如下特征的因子：通常由成纤维细胞、巨噬细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞等产生，主要作为控制上皮系细胞的增殖或功能的旁分泌因子起作用。HGF不仅在肝实质细胞，在血管内皮细胞也具有游走能力的促进、管腔形成等形态形成诱导作用、抗细胞凋亡作用、血管新生作用以及免疫应答调节作用等。本发明的例的情况下，HGF通过骨骼肌成肌细胞和成纤维细胞相互作用而被促进分泌。在由骨骼肌成肌细胞和成纤维细胞形成的细胞片或细胞片层叠体中，所包含的骨骼肌成肌细胞的比例为90%～25%、优选为75%～25%、最优选为60%～40%，这时制作出单位细胞的HGF产生量大的细胞片，故优选。可以认为，通过由细胞片或细胞片层叠体产生的HGF，促进细胞片层叠体自身的内部的血管内皮网络构建、管腔形成，另外，向患部移植时，向移植部周边分泌HGF，促进移植部周边的血管新生。

[0062] VEGF和HGF均为主要的促进血管新生因子，在胶原蛋白凝胶、基底膜内的内皮细胞培养体系的二维评价中，观测到：使两因子作用时，对血管结构的占有面积、全长造成影响，具有协同效应（非专利文献：Xin et al.，“Hepatocyte growth factor enhances vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis in vitro and in vivo，”Am.J.Pathol.，158，1111-1120(2001)、Sulpice et al.，“Cross-talk between the VEGF-A and HGF signaling pathways in endothelial cells，”Biol.Cell，101，525-539(2009)）。因此，也可以为产生VEGF和HGF两者的细胞片或细胞片层叠体。通过产生VEGF和HGF两种因子，协同效应被促进，细胞片或细胞片层叠体内的血管内皮细胞网络形成被促进，管腔形成等的形态形成诱导作用、血管新生作用被促进，故优选。在包含骨骼肌成肌细胞和成纤维细胞的细胞片或细胞片层叠体中，所含的骨骼肌成肌细胞的比例为
75%～25%、优选为60%～40%，这时制作出单位细胞的VEGF和HGF产生量大的细胞片，故优选。可以认为，通过由细胞片或细胞片层叠体产生的VEGF和HGF，在细胞片层叠体内部，高密度的血管内皮网络、管腔形成被促进，另外，向患部移植时，向移植部周边分泌VEGF和HGF，促进移植部周边的血管新生。

[0063] 本发明的方法中，制作细胞片时，接种的细胞数根据使用细胞的动物种类、细胞种类而不同，为了制作本发明的例子的包含骨骼肌成肌细胞和成纤维细胞中的一种或两5 5 2 5
种细胞的细胞片，每片细胞片为1.0×10 ～7.0×10 个／cm 即可，优选为1.15×10 ～
5 2 5 5 2
4.6×10 个／cm 即可，进一步优选为1.5×10 ～4.3×10 个／cm 即可，最优选为
5 6 2
2.0×10 ～3.9×10 个／cm 即可。制作伴随着血管内皮细胞网络的细胞片或细胞片层叠
5 2
体时，接种浓度为1.0×10 个／cm 以下时细胞密度低、血管内皮细胞的游走过早、构建血
5 2
管内皮细胞网络变难，从实施本发明的观点出发不优选。为6.0×10 个／cm 以上时，血管内皮细胞的游走变缓慢，不能构建充分的血管内皮细胞网络，从实施本发明的观点出发不优选。

[0064] 该细胞片层叠体的流动性不受本发明的目的的限定，可以认为：例如成为以移植为目的的细胞片的指标。例如，如实施例所述，结果为细胞片层叠体具有流动性的程度越高，相应地血管变得越容易从生物体侧侵入，相应地移植的细胞片层叠体越适合于生物体。另外，也期待在其他的细胞中，层叠体的流动性高时，血管网容易侵入。

[0065] 制作细胞片层叠体时，对于层叠单层的细胞片的位置、顺序、层叠次数，没有特别的限制，根据被覆盖或补充的组织，可以适宜变更为使用来源于粘接性强的滑膜的细胞片等。另外，层叠次数为10次以下即可，优选为8次以下，进一步优选为4次以下即可。层叠次数变多时，氧、营养成分难以到达层叠的中心部的细胞片而不优选。此时，可以通过细胞片层叠体内构建血管网的方法来防止。对于构建血管网的方法，没有特别的限定。例如：可以通过将只由血管内皮细胞形成的细胞片或以一定比例包含血管内皮细胞的细胞片夹杂于通过本发明的方法制作的细胞片之间，或者层叠于最上层、或者敷于最下层的方法而制作；也可以通过预先在培养基材上接种血管内皮细胞，在接种的血管内皮细胞上层叠细胞片的方法而制作。通过在预先接种于培养基材上的血管内皮细胞上层叠细胞片的方法制作细胞片层叠体时，接种的血管内皮细胞数的个数根据层叠的细胞的种类、血管内皮细胞的4 2 4 2
种类而变化，例如为0.1～5.0×10 个／cm 即可，优选为0.3～3.0×10 个／cm 即可，
4 2 4 2
最优选为0.5～2.0×10 个／cm 即可。0.1×10 个／cm 以下时，血管内皮细胞网络不
4 2
能充分地形成，另外，为5.0×10 个／cm 以上时，血管内皮网络结构过密地形成而不优选。

[0066] 对于制作本发明的细胞片层叠体的方法，也没有特别的限定，例如，通过使培养细胞以片状剥离，根据需要使用培养细胞迁移夹具而使培养细胞片之间层叠而得到。此时，对于培养基的温度，只要覆盖于培养基材表面的前述聚合物具有上限临界溶解温度时为其温度以下、或者前述聚合物具有下限临界溶解温度时为其温度以上，没有特别的限制。但是不用说，在培养细胞不增殖的低温区域、或者培养细胞灭死的高温区域中的培养是不切实际的。对于除了温度以外的培养条件，按照常规方法进行即可，没有特别的限制。例如：对于使用的培养基，可以是血管内皮细胞用基础培养基；可以是骨骼肌成肌细胞用基础培养基；也可以是成纤维细胞用基础培养基；可以是广泛的粘附细胞的培养中使用的基础培养基；
也可以是此后添加与血管新生有关的1或多个细胞因子的培养基。根据细胞的种类而制作的培养基，成为适应各自的细胞培养特性的组成（例如，添加细胞因子等）。特别是，血管内皮细胞用基础培养基中添加有与血管新生有关的细胞因子，与广泛的粘附细胞的培养中使用的基础培养基相比较是高价的。根据本发明，细胞片层叠体自身产生促进血管新生的细胞因子，因此即便使用没添加促进血管新生的细胞因子的基础培养基，细胞片层叠体内也构建有血管内皮细胞网络。即便使用廉价的基础培养基，也能够制作伴随着血管内皮细胞网络形成的细胞片层叠体，最终移植中涉及的成本降低。另外，细胞片层叠体自身分泌促进血管新生的细胞因子，所以在移植部位周边也促进血管新生，能够期待成为治疗效果高的移植材料。这些培养基，既可以是添加有公知的胎牛血清（FCS）等血清的培养基，也可以是没有添加这样的血清的无血清培养基。另外，所使用的培养细胞迁移夹具只要能够捕捉剥离的细胞片，就没有特别的限定；可列举出例如：多孔膜或纸、橡胶等膜类或板类、海绵体类等；为了容易地进行层叠操作，也可以利用带有柄的夹具上安装有多孔膜或纸、橡胶等膜类或板类、海绵体类等的夹具。

[0067] 本发明的细胞片层叠体是这样的：从覆盖有温度响应性聚合物的细胞培养基材上剥离、根据需要使用培养细胞迁移夹具而得到的培养细胞片，培养时不会受到中性蛋白酶、胰蛋白酶等所代表的蛋白质分解酶带来的损伤，培养时所形成的细胞-基材间的基底膜样蛋白质也不会受到酶带来的破坏；另外，保持细胞-细胞间的桥粒结构，结构的缺陷少并且强度高。

[0068] 本发明中，对于构建有血管内皮网络的细胞片层叠体的利用方法，没有特别的限定，可以通过例如：将构成细胞片层叠体的细胞设为成肌细胞，将标记细胞设为进行了荧光标记的血管内皮细胞，通过荧光显微镜追踪标记细胞的游走性，由此评价血管网构建。

[0069] 本发明的细胞没有特别的限定，可列举出例如：动物、昆虫、植物等的细胞、细菌类。其中，动物细胞大多有市售而优选。作为动物细胞的来源，可列举出：人、猴、狗、猫、兔、大鼠、裸鼠、小鼠、豚鼠、猪、羊、中国仓鼠、牛、狨猴、非洲绿猴等，没有特别的限定。另外，上述的各种细胞可以为由胚胎干细胞（ES细胞）、诱导多能性干细胞（iPS细胞）分化而得到的细胞，没有任何限定。

[0070] 对于本发明所利用的细胞没有特别的限定，例如：可以为将细胞通过试剂、蛋白质、基因等至少一种以上的方法而荧光染色和/或色素染色而成的细胞。

[0071] 对于人，只要利用本发明所示的细胞片层叠体，所移植的细胞片层叠体在人的生物体内能长时间表现出功能。接着，通过被剥离的细胞片层叠体的大小、形状、或两者能够控制功能的表达量。这样的细胞片层叠体，例如其构成细胞为心肌细胞、心成肌细胞、成肌细胞、间充质干细胞时，能应用于选自心力衰竭、缺血性心脏病、心肌梗塞、心肌病、心肌炎、肥大型心肌病、扩张期肥大型心肌病和扩张型心肌病组成的组的心脏的疾病或者伴随障碍的各疾患的治疗、或以心肌壁的重建为目的而使用；根据使用的细胞种类而适宜地特定移植目的地，没有特别限制。

[0072] 实施例

[0073] 以下，基于实施例进一步详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限定。

[0074] [实施例1]

[0075] 构建血管内皮细胞和成肌细胞片的共培养系统（专利文献：国际公开2010／101225号公报）。图1表示细胞片内所构建的血管内皮细胞网络形成的定量的评价方法。
将细胞片内所构建的血管内皮细胞（绿）网络进行图像处理，推导出网络的长度（L）和网络的端点数（NT）。该系统为通过将网络的长度（L）除以端点数（NT）（L／NT），能够比较血管内皮网络的构建度。

[0076] （高密度·低密度成肌细胞片的血管内皮细胞的行为分析）

[0077] 使用上述的系统，将细胞密度不同的细胞片和内皮细胞共培养，研究细胞密度的不同对于内皮细胞网络形成造成的影响。另外，观察内皮细胞的形状、结合度，预测各自条件下的网络形成过程。

[0078] （实验条件）

[0079] 制作接种密度为1.15×105细胞数/cm2（超低密度）、2.3×105细胞数/cm2（低5 2
密度）、4.6×10 细胞数/cm（高密度）的单层成肌细胞片，用细胞示踪橙（CellTracker Orange）（红）染色后，层叠为5层。培养96小时后，将内皮细胞用抗CD31抗体进行染色并观察网络（图2、图3、图4、图5）。实验条件如下。

[0080] （初代细胞培养）

[0081] 细胞培养使用Corning Incorporated.制造的聚苯乙烯制培养容器2
（225cmT-flask）。成肌细胞培养中，在培养面涂布层粘连蛋白（Sigma Corporation.制）。层粘连蛋白涂布面如下制作：将层粘连蛋白的利用磷酸缓冲溶液（PBS、Sigma
2
Corporation.制）稀释20倍的溶液以每25cm 培养面1ml进行添加，37℃·5%CO2存在下孵育1小时，由此使蛋白吸附后，用PBS洗涤而制作。

[0082] （单层传代培养）

[0083] 实验中使用支架依赖性人骨骼肌成肌细胞(Camble×Corporation.制)和正常人脐带静脉内皮细胞(Lonza Corporation.制)，在CO2培养箱（MCO-17AI、三洋电机株式会社制）内在37℃、5%CO2气氛下进行培养。成肌细胞培养中，培养基使用分别添加了抗生素-抗真菌剂100×(Invitrogen公司制)1vol%、1MHEPES buffer(Sigma Corporation.制)2vol%、胎牛血清(以下，FBS、GIBCO公司制)10vol%的Dulbecco’s改进的Eagles培养基（DMEM、Sigma Corporation.制）、（以下DMEM(10%FBS)）。初代·传代培养中，将包含0.1%的胰蛋白酶（Sigma Corporation.制）和0.02%的EDTA（乙二胺四乙酸Ethlenediamine2
tetra-acetic acid、Sigma Corporation.制）的胰蛋白酶溶液以每1cm 培养面积1mL进行滴加，37℃下使之反应3分钟，将细胞剥离。向悬浮状的细胞中加入与胰蛋白酶等量的胰蛋白酶抑制剂溶液（Wako Pure Chemical Industries、Osaka、Japan），使酶分散反应停止。
在1000rpm、室温下进行5分钟的离心分离而回收细胞，进一步将通过培养基再悬浮的细胞
3 2
悬浮液以存活细胞浓度1.0×10 细胞数/cm 接种至培养面，以深度成为2mm的方式加入培养基。另外，培养基交换每24小时进行。

[0084] 内皮细胞培养中，培养基使用EBM-2（Lonza制）（以下EBM）。初代·传代培养中，将包含0.1%的胰蛋白酶（Sigma Corporation.制）和0.02%的EDTA（Ethlenediamine tetra-acetic acid、Sigma Corporation.制）的胰蛋白酶溶液以每1cm2培养面积1mL进行滴加，37℃下使之反应5分钟，将细胞剥离。向悬浮状的细胞中加入与胰蛋白酶等量的胰蛋白酶抑制剂溶液（Wako Pure Chemical Industries、Osaka、Japan），使酶分散反应停止。在1450rpm、室温下进行5min的离心分离而回收细胞，进一步将通过培养基再悬浮的细胞
3 2
悬浮液以存活细胞浓度2.5×10 细胞数/cm 接种至培养面，以深度成为2mm的方式加入培养基。另外，培养基交换每48小时进行。

[0085] （成肌细胞片和内皮细胞的共培养）

[0086] 作为细胞培养基材，使用聚苯乙烯制的35mm培养皿（culture dish）（Corning Incorporated.制）和温度响应性培养容器（24孔微孔，CellSeed公司制）。温度响应性培养容器是指使聚苯乙烯面接枝聚合有N-异丙基丙烯酰胺的培养面；将32℃作为临界点，表面可逆地变化为疏水性、亲水性，因此能够通过温度变化容易地使细胞由培养面剥离且维持细胞间粘接。

[0087] 成肌细胞片的制作如下进行：37℃下预孵育24小时后，以成为铺满的方式，向温5 2 5 2 5 2
度响应性培养容器中以1.15×10 细胞数/cm、2.3×10 细胞数/cm、4.6×10 细胞数/cm的量接种成肌细胞。24小时后，20℃、5%CO2气氛下进行30分孵育，将剥离的细胞片由上部用明胶凝胶进行回收。其成为1层的细胞片，重复细胞的剥离·回收，由此制作多层片。

[0088] 片共培养系统的构建按照以下的顺序进行。预先，将内皮细胞在35mm培养皿（culture dish）中进行24小时前培养。此处，培养基使用包含20%FBS的EBM培养基，内皮4 2
细胞的接种密度设为0.5×10 细胞数/cm。前培养后，在包含内皮细胞的皿（dish）上搭载多层的成肌细胞片，20℃、加湿状态下静置2小时（细胞片向皿上的转印），导入包含10%FBS的DMEM，37℃下静置1小时（明胶溶解），接着进行培养基交换，开始培养。

[0089] 细胞质染色如下进行，为了知道组织的高度，此外检查成肌细胞的流动时，为了将片用颜色区分，将成肌细胞在片制作前进行细胞质的染色。将包含0.1%的胰蛋白酶（Sigma Corporation.制）和0.02%的EDTA（Ethlenediamine tetra-acetic acid、Sigma2
Corporation.制）的胰蛋白酶溶液以每1cm 培养面积1mL进行滴加，37℃下使之反应3分钟，将细胞剥离。向悬浮状的细胞中添加与胰蛋白酶等量的胰蛋白酶抑制剂溶液（Wako Pure Chemical Industries、Osaka、Japan），使酶分散反应停止。通过1000rpm、室温下进行5分钟的离心分离而回收细胞，进一步对通过无血清培养基悬浮的细胞悬浮液添加等量的无血清培养基稀释的10μM CellTracker Orange CMTMR(Molecular probes制)(或者CellTracker green CMFDA(Molecular probes制))，制成为5mM的细胞示踪染料（CellTrakcer Dye）。37℃、5%CO2气氛下静置15分钟后，以1000rpm、在室温下进行5分钟的
5 2 5
离心分离而回收细胞，再次用DMEM10%FBS进行悬浮后，以1.15×10 细胞数/cm、2.3×10
2 5 2
细胞数/cm、4.6×10 细胞数/cm 的量接种。

[0090] 抗体染色如下进行，为了在混合有成肌细胞和内皮细胞的组织内鉴定内皮细胞、进行观察，通过Anti-CD31(鼠单克隆抗人Mouse MonoclonalAnti-Human CD31、DAKO公司制)进行抗体染色。CD31为存在于内皮细胞的分子量100kD的识别糖蛋白的抗体。将细胞用PBS进行洗涤后，加入4%多聚甲醛·磷酸缓冲液（和光纯药株式会社制），4℃下静置一晩而固定。用PBS将培养面洗涤2次，加入用PBS稀释过的0.1%Triton X-100，对细胞赋予透过性。用PBS洗涤2次后，浸渍于PBS稀释的0.1%牛血清白蛋白（和光纯药株式会社制）1小时。其后，浸渍于用0.1%牛血清白蛋白稀释至40倍的anti-CD31抗体中，4℃下静置一晩。用PBS洗涤2次，在用0.1%牛血清白蛋白稀释至200倍的第二抗体（Alexa Fluor(R)488goat anti-mouse IgG，Molecular Probes制）中，室温下浸渍1小时。PBS中洗涤2次后，滴加Slow fade(Molecular Probes公司制)1、2滴，加盖玻璃盖片(IWAKI公司制)，通过共焦显微镜(EX-20、OLYNPUS公司制)取得三维图像，进行细胞观察。

[0091] （细胞行为的评价顺序）

[0092] 血管网络的定量评价：将用激光共聚焦显微镜取得的网络的照片使用Image ProPlus将网络进行二维图像解析(图1)。通过由目视决定的阈值进行二值化，计算使用形态学过滤器（Morphological filter）细线化而成的图像的网络的长度（L）和端点数（NT），进行各自的网络的比较。

[0093] 培养96小时后，通过网络度（网络长度/端点数）定量评价内皮细胞网络的值。结果，超低密度片中，不进行网络形成就不能解析（图2）。低密度片中L/NT的平均值为
1.12mm/tips、高密度片中为0.54mm/tips，高密度片的情况下与低密度片相比较，大约成为二分之一的值（图3、图4）。另外，网络长度L（mm）没有见到不同，而端点数NT（tips）在高密度片情况下取约2倍的值。

[0094] 将培养96小时后的内皮细胞在各层中的分布示于图5。可见低密度片中约7成的内皮细胞存在于第5层；另一方面，高密度片中，内皮细胞多分布于第1层和第5层。

[0095] 由图3和图4，分别在高密度片（4.6×105细胞数/cm2）、低密度片（2.3×105细胞2
数/cm）中，网络长度L（mm）没有差别，因此可以认为内皮细胞数相同。另一方面，可以认为由于端点数N（T tips）在高密度片中増加，所以在高密度片内，内皮细胞之间的连接恶化。
内皮细胞在片内与成肌细胞一起工作，在水平方向形成网络，但高密度片与低密度片相比较，流动性小，因此可以认为内皮细胞的水平方向的游走被抑制而网络的连接恶化。

[0096] 另外，观察到低密度、高密度片分别在第5层有内皮细胞的结块。作为能够结块的理由，可以认为是因为在片内部游走的内皮细胞到达片上部，一部分增殖。高密度片中，与低密度片相比较，第5层的分布减少，因此可以认为内皮细胞在垂直方向的游走被抑制（图5）。

[0097] [实施例2]

[0098] （依赖于培养状态的成肌细胞的细胞因子生成能力）

[0099] 5层细胞片为由铺满形成的单层片立体地重叠而成的立体组织，可以说三维也是密密地铺满的状态。细胞由于接触抑制而成为一时丧失增殖性的状态。为了理解以铺满状态被立体培养的片形成细胞的细胞因子生成，与更单纯的体系、即通常的平面培养时的细胞因子特性进行比较。培养状态可看作是根据低密度、高密度、片、层叠片和细胞的疏密培养、平面·立体培养而成为分层结构。对于该分层结构研究单位细胞的细胞因子生成。

[0100] 将成肌细胞以1.0×104细胞数/cm2、8.0×104细胞数/cm2、2.3×105细胞数/cm2（与片相同的接种密度）的密度进行接种，提取培养初期的48小时（即，从开始培养48小时后）的培养基，检测VEGF、HGF的生成量。利用通过台盼蓝染色算出的细胞数而进行标准化，作为单位细胞的平均生成水平而进行比较。

[0101] 将由培养48小时时提取的培养基求出的单位细胞的VEGF、HGF的生成量示于图6中。由用ELISA检测出的浓度和培养基体积求出总生成量，由上述细胞密度和培养皿面积得到的总细胞数进行标准化而算出。为了进行比较，一并记载将成肌细胞5层片的培养48小时时的生成量用细胞数进行标准化的值。细胞密度越大单位细胞生成量增大，特别是以5 2
铺满的密度（1.9×10 细胞数/cm）计，VEGF成为最大。该结果表示，通过取密密的铺满状态，成肌细胞的VEGF生成能力增大。可以认为5层片培养的值也与之接近，只用铺满状态的细胞制作的片作为移植材料在VEGF分泌能力（分泌效率）这一点是有效的。

[0102] 另一方面，如图7所示，可知虽然细胞片制作法不同，但伴随着细胞片的层叠数上升，与上述的结果同样地，VEGF、HGF的生成量也都上升。这可以认为是，伴随着细胞片内的细胞密度的变化的细胞的游走性产生差别，其结果代谢变化；结果，生成量变化。

[0103] 由以上可知，成肌细胞移植中，与使用单细胞进行相比，以细胞片状、特别是以层叠细胞片的结构供给细胞从患部的细胞因子生成量的观点出发是有效的。

[0104] 可知由骨骼肌组织提取并分离的成肌细胞群中混合有成纤维细胞（Rhoads et al.、“Satellite cell-mediated angiogenesis in vitro coincides with hypoxia-inducible factor pathway、”Am J.Physiol.Cell Physiol.、296、C1321-C1328、(2009)）。成纤维细胞存在于各种组织中，炎症反应时移动至患部对于治疗起作用。特别是可以认为，通过活跃地生成细胞外基质（ECM;Extracellular matrix）、细胞因子，对于生物体组织的结构保持、细胞的生理学状态的维持起作用（Tomasak et al.、“Myofibroblasts and mechano-regulation of connective tissue remodeling、”Nat.Rev.Mol.Cell Biol.、3、349-363(2002)）。因此，混合的成纤维细胞有可能对细胞片整体的力学的性质、片内的成肌细胞的游走性·分化带来影响。但是，对于片整体的性质和所含的成纤维细胞的比例的关系现在还未知。以高比例包含成纤维细胞时，存在对于与细胞间粘接有关的膜蛋白质或ECM的表达·形成模式、细胞游走性起作用的细胞因子类的分泌模式变化的可能性。

[0105] 因此，将由成肌细胞和真皮成纤维细胞的混合细胞制作的5层细胞片接种于聚苯乙烯面，进行片培养，由每24小时提取的培养基通过ELISA（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）法测定细胞因子类分泌量。使成肌细胞的比例变化至100%、75%、50%，研究这些细胞因子的成肌细胞纯度依赖性。

[0106] 对细胞片所具有的旁分泌效果中的、被称为具有促进血管新生效果的细胞因子类进行蛋白质水平的评价。作为片移植后对心患病部通过促进血管内皮细胞（和血液中所含的内皮前体细胞）的游走性而促进移植组织内血管新生的靶标，可列举出：有生长因子(Growth factor)类的VEGF、HGF。每24小时取得培养基，由在各时点取得的培养基得到的吸光度求出检测浓度，乘以培养基体积，由此作为片样品在24小时生成的各因子的质量而进行评价（图8a、b）。

[0107] ·实验条件

[0108] 细胞：人骨骼肌成肌细胞、Np6(Lot number4F1618;Lonza，Inc.)

[0109] 人真皮成纤维细胞、Np8(Lot number3C0243;Cascade Biologics，Inc.)[0110] 培养基：DMEM(10%FBS)

[0111] 培养面：聚苯乙烯培养皿（5层片培养）、24孔(well)温度响应性培养面（片形成;CellSeed，Inc.）、涂布层粘连蛋白的聚苯乙烯培养面（成肌细胞增殖）

[0112] 培养环境：37℃、包含5%CO2的空气（in air）

[0113] 接种密度：2.3×105细胞数/cm2（片形成）

[0114] 片培养时间段：48小时、168小时

[0115] 培养基体积：1.76mL（5层片培养、培养基深度0.2cm）

[0116] 培养基交换：每24小时

[0117] 提取试样：每24小时的培养基（ELISA）

[0118] 靶标：VEGF(血管内皮生长因子，Vascular endothelial growth factor)[0119] HGF(肝细胞生长因子，Hepatocyte growth factor)

[0120] 如图8a、b所示，VEGF、HGF在培养48小时时以浓度计在500～5000pg/mL的范围内被检测出；与能够观测到的、例如通过添加VEGF、HGF对内皮细胞的游走性或网络形成产生促进效果的数量级（VEGF：3000pg/mL～10ng/mL;HGF；2500～5000pg/mL）部分地一致（Pepper et al.、“Potent synergism between vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in the induction of angiogenesis in vitro、”Biochem.Biophys.Res.Com.、189、824-831(1992)、Bussolino et al.、“Hepatocyte growth factor is a potent angiogenic factor which stimulates endothelial cell motility and growth、”J.Cell Biol.、119、629-641(1992)）。伴随着成纤维细胞混合，VEGF生成减少，但HGF生成增大。这些明显的变化对于成纤维细胞混合率几乎显示出线形的变化，因此启示主要由成肌细胞分泌VEGF、由成纤维细胞分泌HGF。可以认为VEGF的蛋白质分泌能力中，成肌细胞片混合有成纤维细胞时对于内皮细胞不优选但对于HGF分泌能力是相反的；细胞片中的成肌细胞和成纤维细胞可能存在有最佳的含有平衡。

[0121] 由以上观测到，5层成肌细胞片的培养中，由含有成纤维细胞导致的对各细胞因子特性的调整。此处，成肌细胞群本来混合有成纤维细胞，通过双重抗体染色（成肌细胞：肌间线蛋白（desmin）；成纤维细胞：TE-7antigen）成肌细胞总数被评价为78.2±2.1%。因此，关于图8a、b，将培养初期的48h的细胞因子生成量相对于实际的成肌细胞总数RM在图8c、d中再做图。

[0122] 检测含有真皮成纤维细胞对于作为5层细胞片的模仿体系的、高密度培养中的成肌细胞的效果。将成肌细胞和成纤维细胞分别以100：0、75：25、50：50、25：75、0：100进行混合而调整细胞群（细胞片的体系中，使用包含超过50%的真皮成纤维细胞的细胞群，则不5 2
能形成片）。将这些细胞群以高密度（1.9×10 细胞数/cm）接种，提取培养24-48小时（即，从开始培养起24-48小时后）的培养基，测定VEGF和HGF的生成量。用由计数而求出的细胞数标准化，作为单位细胞的生成量而进行比较。将结果示于图10。为了进行比较而搭载的5层片的培养48小时时的VEGF和HGF的生成，显示出与高密度培养相近的混合率依赖性。VEGF生成量伴随着成纤维细胞的混合表现出单调减少，而对于HGF生成量以50%混合表现出最大值。因此，可以认为对于VEGF生成，主要成肌细胞起作用；HGF通过成肌细胞和成纤维细胞的相互作用而协同地生成（图9）。

[0123] [实施例3]

[0124] （对于成肌·成纤维细胞混合片的内皮细胞的网络形成）

[0125] 在内皮细胞上搭载成肌细胞片和成肌·成纤维细胞混合片而进行共培养。可知细胞片自体具有的片流动性、细胞因子分泌模式等特性通过成纤维细胞混合而被调整，可以认为这些对血管内皮细胞赋予周围环境的调整。因此，对于混合片能够对网络结构形成带来怎样的影响进行研究（图10）。

[0126] 图11表示使用骨骼肌成肌细胞和真皮成纤维细胞的混合片的网络形成的结果。共培养48小时（即，将骨骼肌成肌细胞和真皮成纤维细胞的混合片、与血管内皮细胞共培养开始起48小时后）时，成肌细胞50%混合片一者比成肌细胞100%片还能够形成密的多分枝的均质的网络结构。

[0127] 本研究中，来源于人骨骼肌组织的成纤维细胞难以到手，因此至今为止通过混合来源于人真皮的成纤维细胞来检测含有成纤维细胞对于成肌细胞片的效果。通过细胞形态、细胞骨架分布或特异的标记的评价中，报告有来源于骨骼肌、真皮、肺、皮下组织的成纤维细胞均具有类似的形质（Xin et al.、“Hepatocyte growth factor enhances vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis in vitro and in vivo、”Am.J.Pathol.、158、1111-1120(2001)）。然而，成肌细胞（myoblast）含有来源于骨骼肌组织的成纤维细胞，实际上根据其批次不同而混入的程度不同。被指为再生医疗中不可或缺的来自患者本人的细胞增殖的过程中，成纤维细胞含量具有增大的可能性。因此，得到本来含有的来源于骨骼肌的成纤维细胞带来的影响的见解，对于作为移植材料的细胞片的特性评价是重要的。因此，使用通过医学部的工程研究团队所保持的细胞，研究对网络形成的影响。

[0128] 为了进行片移植的临床实验，使用从同一患者提取的、成肌细胞批次（片形成时，成肌细胞纯度80%（批次A）、10%（批次B）的两种），分别将其以100：0、75：25、50：50混合，由此制备成肌细胞比率分别为80%、62%、45%的细胞悬浮液（通过抗体染色确认除了成肌细胞以外，为来源于骨骼肌的成纤维细胞）。使用它们制作5层细胞片，检测与内皮细胞共培养48小时时的网络形成（图12）。

[0129] ·实验条件

[0130] 细胞：人骨骼肌成肌细胞、Np3(Lot hMB21A;肌间线蛋白阳性81%)

[0131] 人骨骼肌成肌细胞、Np3(Lot hMB21;肌间线蛋白阳性0%)

[0132] 人脐带静脉内皮细胞、Np4(Lot4F0709;Lonza、Walkersville、MD、USA)[0133] 培养基：DMEM(10%FBS;成肌细胞)

[0134] 培养面：聚苯乙烯培养皿（5层片培养）、24孔(well)温度响应性培养面（片形成;CellSeed、Inc.）、涂布层粘连蛋白的聚苯乙烯培养面（成肌细胞增殖）

[0135] 培养环境：37℃、包含5%CO2的空气（in air）

[0136] 接种密度：2.3×105细胞数/cm2（片形成）

[0137] 培养基体积：1.76mL（5层片培养，培养基深度0.2cm DMEM/10%FBS）

[0138] 培养基交换：每24小时

[0139] 共培养时间段：48小时

[0140] 染色试剂：抗CD-31抗体（内皮细胞标记）、CellTracker Orange CMTMR（片形成细胞·细胞质染色）

[0141] 观察：共焦激光扫描显微镜（x10）

[0142] 图12和图13登载使用了共焦激光扫描显微镜的观察照片。能够观察到，相比于与成肌细胞81%片的共培养，成纤维细胞含量增大的61%、41%片中网络结构密且更均匀地形成。可知，细胞片形成中，成肌细胞：成纤维细胞的混合比例以成肌细胞为基准计，优选为100%以下且40%以上。至少关于成肌细胞片的网络形成，可以认为来源于骨骼肌的成纤维细胞也赋予与来源于真皮的成纤维细胞类似的效果。

[0143] 至今为止，由细胞片的细胞因子生成的测定已确认，伴随着成纤维细胞在成肌细胞群的含有，VEGF、HGF的生成模式被调制成逆方向。均被称为主要的促进血管新生因子，在例如胶原蛋白凝胶、基底膜内的内皮细胞培养系的二维的评价中，可观测到两因子作用于血管结构的占有面积、全长的协同效应。另外可以认为，对于内皮细胞，通过与细胞骨架相关的信号有关，由此HGF对于网络结构的分支结构起作用（Sulpice et al.、“Cross-talk between the VEGF-A and HGF signaling pathways in endothelial cells、”Biol.Cell、101、525-539(2009)）。因此，这两因子可能在内皮细胞的血管新生信号中具有相辅助的作用；通过与混合片的共培养观测到的对于网络形成的效果，暗示有参与的可能性（图14）。

[0144] 通过将成肌细胞和成纤维细胞的构成比率、以及细胞的接种浓度最优化，可知不止细胞片层叠体内外的细胞因子产生能提高、血管内皮细胞网络构建被高度化。将细胞片内构建有血管内皮细胞网络的细胞片移植时，与移植部周边的血管网迅速地连接，治疗效果高。另外，现在进行的对心疾病患者的通过成肌细胞片的治疗可以认为是利用由细胞片分泌的细胞因子等的旁分泌效果。因此，可以认为通过本发明制作的细胞因子产量高、高度地构建有血管内皮细胞网络的细胞片取得了更好的治疗效果。

[0145] 产业上的可利用性

[0146] 只要是本发明所示的制造方法，就能够得到分泌促进血管新生的细胞因子和/或构建有血管内皮细胞网络的细胞片层叠体。这不仅与治疗效果高的移植片的提供有关，进一步与制作具有厚度的细胞片层叠体也有关，可用于各种各样的组织的再生医疗中。

[0147] 附图标记说明

[0148] RG：绿色的体积元（voxel）占1枚图像切片的比例（RG：Ratio of green voxel）[0149] d：拍摄的细胞片层叠体的厚度

[0150] RM：前细胞数中的成肌细胞所含的比例

[0151] z：片厚度[μm]

[0152] L：血管网络长度占1图像的总计[mm/mm2]

[0153] NT：血管网络每1mm2的端点数的个数[tip/mm2]

[0154] L/NT：将L除以NT的值。[mm/tip]

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