具有内源性带电配体的水解淀粉微球
阅读：318发布：2023-02-27
专利汇可以提供具有内源性带电配体的水解淀粉微球专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及直径为10-2000μm的可 生物 降解 微球，这些微球包括经由一个 羧酸 酯键偶联着至少一种类型配体的交联 水 解 淀粉 。该配体应当是一种内源性带电的分子，分子量小于1000Da，该配体除了用于将该配体与该微球偶联的官能团之外，还包括至少一个额外的羧酸官能团和/或至少一个胺官能团。平均0.05-1.5个配体被偶联到该水解淀粉中的每个 葡萄糖 部分上。，下面是具有内源性带电配体的水解淀粉微球专利的具体信息内容。
1.一种直径为10-2000μm的可生物降解微球，该微球包括经由一个羧酸酯键偶联着至少一种类型配体的交联水解淀粉，其中所述配体是一种内源性带电的分子，分子量小于
1000Da，该分子包括至少一个额外的羧酸官能团和/或至少一个胺官能团，并且其中平均
0.05-1.5个配体已经偶联到该水解淀粉的每个葡萄糖部分上。
2.根据权利要求1所述的一种微球，其中所述配体选自下组，其构成为：氨基酸、含氮的有机酸以及二酸。
3.根据权利要求1或2所述的一种微球，其中所述配体是带正电的。
4.根据权利要求1或2所述的一种微球，其中所述配体是带负电的。
5.根据权利要求1或2所述的一种微球，其中所述配体是两性离子的。
6.根据权利要求3或4所述的一种微球，其中该配体具有一种生理学活性的反离子。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的一种用于止血的微球，其中该微球的平均直径为
10-200μm。
8.根据权利要求7当从属于权利要求6时所述的一种微球，其中该反离子是鞣花酸。
9.一种用于与伤口愈合有关用途的材料，该材料包括当从属于权利要求3时根据权利要求3或根据权利要求6所述的微球，其中所述微球形成包括一个三维结构，该结构包括这些微球之间的空隙。
10.根据权利要求9所述的一种材料，其中每个微球均是一个尺寸均匀组分的一部分，该组分具有±15%的平均直径最大变化。
11.根据权利要求9或10所述的一种材料，其中这些微球所具有的平均直径是从
200μm至2000μm。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的一种材料，其中该配体是疏水的。
13.根据权利要求1-6中任一项所述的一种用于体外细胞培养的微球，其中这些微球所具有的平均直径是从200μm至1000μm。
14.根据权利要求1-6中任一项所述的一种用于血管栓塞的微球，其中该微球的平均直径是10-1200μm。
15.根据权利要求14当从属于权利要求6而权利要求6又从属于权利要求4时所述的一种微球，其中这时该反离子是一种细胞抑制剂。
16.一种伤口敷料，包括根据权利要求9-12中任一项所述的材料。
17.一种用于进行止血的方法，通过将一个有效量的根据权利要求1-8中任一项所述的一种微球给予具有流血伤口的哺乳动物。
18.一种用于进行伤口愈合的方法，通过将一个有效量的根据权利要求9-12中任一项所述的一种材料加入到具有伤口的哺乳动物。
19.一种用于体外细胞培养的方法，其中将根据权利要求1-6或13中任一项所述的至少一种微球加入至一种培养基中，同时向该培养基中添加有待培养的细胞，然后允许这些细胞增殖。
20.一种用于进行血管栓塞的方法，通过将一个有效量的根据权利要求1-6、14或15中任一项所述的一种微球添加至需要血管栓塞的哺乳动物。
具有内源性带电配体的水解淀粉微球
技术领域
[0002] 发明背景
[0003] 淀粉是一种分支的葡萄糖聚合物（具有α6分支的α4-葡萄糖链），是在植物和动物中发现的天然材料，在动植物体内它的功能是储存能量。该聚合物由直链淀粉（长链并且低分支）和支链淀粉（高度分支并且短链）组成。
[0005] 淀粉微球在体内被血浆淀粉酶降解为寡糖、麦芽糖，并且最终降解为葡萄糖进入正常代谢过程。
[0007] 此外，US 3,812,252涉及水解淀粉以及它在治疗伤口（包括慢性伤口）的用途。
[0010] 当内皮出现损伤时，内皮细胞停止抑制凝结，并且开始分泌诱导受伤后止血的凝结因子。止血具有三个主要步骤：1)血管收缩，2)通过血小板栓塞而暂时阻塞，以及3)血液凝结，即通过将纤维蛋白原转化为纤维蛋白并且形成凝块封闭该创口直至组织得以修复。
[0011] 在炎症期，细菌和碎片被吞噬并且除去，并且多种因子被释放出来，这些因子导致增生期所涉及的细胞出现迁移和分裂。
[0012] 在约2-3天内，成纤维细胞开始进入伤口位点，标志着增生期的开始，这一时期甚至会在炎症期结束之前。该时期的特征是血管新生、胶原沉积、肉芽组织形成、上皮形成、以及伤口收缩。在血管新生时，新血管的形成需要向伤口位置提供氧和营养素，用于支持稍后的伤口愈合期。同时，成纤维细胞开始在伤口位点积累，其数量在受伤后1至2周达到峰值。第一周结束时，成纤维细胞是伤口中的主要细胞。
[0013] 在受伤后最初2或3天内，成纤维细胞主要是增殖和迁移，而稍后它们是伤口位点铺设胶原基质的主要细胞。最初，成纤维细胞使用炎症期形成的纤维蛋白疱痂来迁移跨越，与纤连蛋白黏附。然后成纤维细胞将基质沉积至伤口床中，并且稍后至胶原中，它们可以附着其上用于迁移。由伤口基底生出的肉芽组织在炎症期开始出现在伤口中，并且继续生长直至伤口床被覆盖。肉芽组织由新生血管、成纤维细胞、炎症细胞、内皮细胞、肌纤维母细胞，和新的临时性细胞外基质的组分组成。当上皮细胞增殖并且”爬到”伤口床顶部时，表皮再次形成上皮，这为下层新形成的组织提供了覆盖物。
[0014] 细胞培养是使细胞在受控条件下生长的方法。细胞培养的历史发展和方法与组织和器官的培养方法密切相关。20世纪中期，动物细胞培养成为一项常见的实验室技术，但是将活细胞系从原组织源中分离并维持这一概念在19世纪才发现。组织培养是与有机体分离的组织和/或细胞的生长。这一过程典型地通过使用液体、半固体、或固体的生长培养基（例如肉汤或琼脂）而得以促进。在本说明书中，细胞培养和组织培养将作为同义词使用。
[0015] 一些细胞在自然状态下悬浮生长，而不附着在表面上，例如血流中的细胞。那些细胞可以悬浮生长。然而，大多数衍生自固体组织的细胞是锚定依赖的，即所谓的粘附细胞。粘附细胞需要一个表面（例如组织培养塑料或微载体），用于生长。用于粘附细胞生长的微载体是可获得的，例如葡聚糖微球。当粘附细胞在收获或传代时（传代培养物转运），这些细胞需要与其生长表面分开。通常，这一步骤是通过将胰蛋白酶-EDTA混合物加入到培养物中而完成的。
[0019] 在栓塞治疗中使用的试剂是能够流过血管结构复杂的栓塞试剂。此类实例是乙碘油，它由碘和罂粟籽油制成，是一种高度粘稠的试剂，并且经常用于化学栓塞，尤其用于肝癌；硬化药，它可将血管内皮层硬化；以及乙醇。
[0020] 微粒栓塞剂也用于栓塞前毛细管的微动脉或小动脉。 将血管暂时封闭5周。微球是无刺激栓塞法和化学栓塞法的常用试剂。聚乙烯醇（PVA）和丙烯酸明胶微球在体内是不可降解的，因此它们将永久保留在患者体内。依据不同情况，使用不同尺寸的微球，其直径范围为从约50μm至约1.2mm。
[0021] 发明概述
[0022] 在某些情况下，可能有兴趣的是改变可生物降解的淀粉微球的特性。本发明提供了改变可生物降解的淀粉微球的可生物降解性的方法；可生物降解的淀粉微球与生物系统和/或其组分的亲和力；可生物降解的淀粉微球的溶胀度；可生物降解的淀粉微球的溶胀速率；可生物降解的淀粉微球的可压缩性/弹性和/或与可生物降解的淀粉微球中和该微球上离子和分子的化学相互作用的选择性。以上说明的生物系统和/或其组分可以例如构成一个器官或细胞或它们的任一组分；细菌；病毒；蛋白质和酶类；多糖；脂类；小分子和/或离子。
[0023] 因此，本发明涉及直径为10-2000μm的可生物降解微球，该微球包括经由一个羧酸酯键偶联着至少一种类型配体的交联水解淀粉，其中所述配体是一种内源性带电的分子，分子量小于1000Da，包括至少一个额外的羧酸官能团和/或至少一个胺官能团，并且其中平均0.05-1.5个配体已经偶联到水解淀粉中的每个葡萄糖部分上。
[0024] 本发明还涉及该微球的不同用途和应用。
[0025] 发明说明书
[0026] 根据本发明的微球包括交联的酸性水解淀粉。这些微球可以通过在有机溶剂（例如甲苯或二氯乙烯）中乳化一种淀粉溶液，由酸性水解淀粉制造。这些聚葡萄糖链与交联试剂（例如表氯醇）交联，形成甘油醚（1,3-氧-丙-2醇）连接，如以下所示，形成可降解的淀粉微球（DSM）。
[0027] DSM 在体内被淀粉酶降解为低聚糊精，并且最终降解为葡萄糖。交联依然是尺寸可变的寡糖。这些物质在体内的变化过程目前未知，但是它们可能随尿液排出或被过滤至网状内皮系统并降解。
[0029] 本质上，这些可生物降解的淀粉微球被完全降解并且从它的生理环境（例如人体）消除。依据该应用，这些微球被定制为降解一定时间以适合旨定的用途。此时间范围可以从几分钟至3个月，最优选达到1个月。
[0030] 根据本发明的可生物降解微球的尺寸是微米级，并且更具体是从10μm至2000μm。
[0031] 通过将配体附接到DSM，并且更具体是附接到葡萄糖的羟基，可以改变DSM的特性。通过选择配体，以及附接该淀粉的配体的数量来影响DSM的特性。
[0032] 这些配体通过经由一个羧酸酯键而偶联到DMS的葡萄糖单体上，从而附接到DSM上。为了使这些配体能与该水解淀粉经由该酯键附接，这些配体应包括能够形成一个酯键的至少一个羧酸官能团，即至少一个-COOH基团。该酯键可以在体内通过化学水解或酶水解而水解，并且使用这种酯键产生一种生物学可分开的配体。
[0033] 此外，这些配体应当是具有生理学pH（即pH 6-8）的内源性带电物质。除了用于使该配体能够经由一个酯键附接到该水解淀粉上的羧酸官能团之外，这些配体还应当包括至少一个额外的羧酸官能团和/或至少一个伯、仲、叔或季胺官能团。由于这些配体是内源性化合物，因此DSM降解为被代谢和/或排泄的内源性化合物。
[0034] 因此，这些配体可以是带正电的、带负电的或两性离子的，即同时带正电和负电。这些配体还可以具有单极（疏水性）部分以进一步改变DSM的特性。此外，可能使用不同配体的混合物。
[0035] 带电的配体需要一种反离子。当配体带正电时，反离子带负电，并且当配体带负电时，反离子带正电。反离子可以是具有生理学活性的反离子。当配体是两性离子时，它构成它自己的反离子。
[0036] 内源性配体应当进一步是小分子，分子量小于1000Da。
[0037] 根据本发明，DSM中每个葡萄糖部分平均可以偶联0.05-1.5个配体。因此，在DSM中配体与葡萄糖的摩尔比是从1.5:1至1:20。
[0039] 可以优选用于本发明的某些实施方案的配体在表1中列出。
[0040] 表1示出了优选的配体。在这些结构中，R代表以下示出的水解淀粉中的吡喃葡2
萄糖基单体。R 代表在DSM的葡萄糖部分上、在其可能的任何位置2、3和/或6上的配体，正如以下所示。
萄糖基单体。R 代表在DSM的葡萄糖部分上、在其可能的任何位置2、3和/或6上的配体，正如以下所示。
[0041]
[0042]
[0043]
[0044]
[0045] 以上所说明的微球可以在止血、伤口愈合、体外细胞培养和血管栓塞中使用。以上所说明的微球还可以用于生产一种适合伤口愈合使用的可生物降解材料。
[0046] 以下将进一步讨论这些不同的应用。
[0047] 止血
[0048] 在用于止血的一些实施方案中，这些附接到微球上的配体优选是带正电的或两性离子的。
[0049] 在一些实施方案中，这些附接到微球上的配体优选是带正电的。然后，所使用的反离子可以是鞣花酸。
[0050] 对于止血，根据本发明的微球应当优选平均直径为从10μm至200μm。
[0051] 当用于止血时，可以将根据本发明的微球作为粉末（在溶液中或粘附到衬垫结构（例如纱布）上）添加到伤口上/中。
[0052] 伤口愈合
[0053] 对于伤口愈合，这些微球可以用于生产一种材料。该材料应当具有一种三维结构，该结构由这些微球和微球之间的空隙组成。
[0054] 由于这些空隙，该材料将能够透过气体和液体，并且因此当与液体接触时是非胶状的。
[0055] 该材料是非胶状材料这一事实是指，当伤口上/中使用该材料时可以避免薄膜形成层，并且由此可以防止在该层以下形成水肿；促进氧和营养素的有效转运，并且进一步促进细胞的无障碍迁移，并且允许压力有效传导至或传导自下层组织。
[0056] 该材料中的微球可以是一种尺寸均匀的组分。为了在微球之间建立空隙，在很多情况下优选的是该材料中微球的尺寸相当均匀。如果这些微球的尺寸不均匀，那么这些空隙将被更小的微球填充，由此产成更加结实的结构，对于该材料的预期作用而言这将是有害的。当这些微球形成均匀尺寸组分的一部分时，至少对于一些实施方案而言，这些微球的尺寸差异应当不超过距离中位数+15%。例如，对于300μm微球的组分，单个微球可以是从255μm至345μm。空隙的尺寸，即包裹在一起的尺寸均匀的圆球之间的空间，可以计算为((2/3的平方根)-1)≈该微球直径的0.155倍。
[0057] 该材料可以由一个单个、固体、多孔并且呈三维状的织网组成。
[0058] 这些微球可以被附接到基质背衬上，由此固定这些微球。这种背衬可以是普通纱布或一种聚合物泡沫材料。
[0059] 至少对于用于伤口愈合的一些实施方案而言，附接到这些微球上的配体优选是带正电的。
[0060] 至少对于用于伤口愈合的一些实施方案而言，附接到这些微球的配体优选是带正电的并且是疏水性的。
[0061] 对于伤口愈合，根据本发明的微球应当优选平均直径从200μm至2000μm。
[0062] 优选地，这些材料之间的空隙的直径是从30μm至300μm、并且更优选从100μm至300μm。这些空隙应当至少是30μm，因为这允许直径典型地为20-30μm的组织细胞和神经细胞束通过。
[0063] 此外，该材料的表面特征刺激了细胞附着和增殖。这涉及到细胞与材料表面的亲和力以及适合黏附的材料弹性。
[0064] 根据本发明的适合伤口愈合的可生物降解材料尤其增强了细胞在标准的伤口愈合过程或在NPWT（负压伤口治疗）过程中的附着、迁移、和增殖，尤其是对于伤口愈合过程的第三和第四阶段，即增生期和重塑期。
[0065] 根据本发明，适合伤口愈合的可生物降解材料的三维结构减少了瘢痕组织的形成。意识到瘢痕组织的特征是胶原的单向沉积，能够迫使胶原杂乱沉积的基质似乎会减少结疤。总体而言，根据本发明的材料刺激并促进了新生成的并且健康的肉芽组织总是向内生长。
[0066] 在伤口愈合时，有利的是通过选取一个或多个适当的配体，将材料的可生物降解性延迟2天至2周。这可以形成充分愈合而不需要更换敷料（如若不是如此则出于理由）。
[0067] 当用于伤口愈合或伤口护理时，可以将根据本发明的材料作为粉末（在溶液中或粘附到衬垫结构（例如纱布）上）或作为一种固体单个织网添加到伤口上/中。
[0068] 根据本发明的材料还可以形成伤口敷料的一部分。
[0069] 已经示出，当将2mm厚的一层平均直径为200μm、表面带正电的、非胶状可生物降解的淀粉球施用到伤口床上时，四天内就形成非常好的肉芽，同时细胞生长至高达500μm。
[0070] 体外细胞培养
[0071] 对于用于体外细胞培养，这些微球优选平均直径为从200μm至1000μm、更优选在200μm和500μm之间。
[0072] 对于用于体外细胞培养的一些实施方案中，这些配体优选是带正电的。
[0073] 对于细胞培养而言，空隙是很重要的，因为它能在培养物内允许粘附细胞和生长细胞进行有效通过，并且还允许生长基质和更大分子进行有效转运。
[0074] 血管栓塞
[0075] 对于血管栓塞，根据本发明的微球优选平均直径从10μm至1200μm。
[0076] 为了用于血管栓塞，至少在一些实施方案中，附接到这些微球上的配体优选是带负电的。
[0077] 对于肿瘤治疗而言，负电荷可以用于离子性结合至阳离子型的细胞抑制药物，然后它构成反离子。此类细胞抑制药物包括阿霉素、伊立替康、托泊特坎、表柔比星、丝裂霉素、顺铂和索拉非尼。
[0078] 正如以上所说明并且正如在权利要求中说明的根据本发明的任何实施方案的微球可以在增强、促进或进行止血、伤口愈合和/或血管栓塞的方法中使用。类似地，正如以上所说明并且正如在权利要求中所说明的根据本发明的任何实施方案的材料可以在促进或进行伤口愈合的方法中使用。
[0079] 然后，将这些微球或材料分别以一个有效量给予需要止血、伤口愈合和/或血管栓塞的哺乳动物，例如人类。它可以是体内或体外（例如皮肤上）具有流血伤口或其他类型的伤口的人。
[0080] 提及“给药”是指将根据本发明的微球或材料与需要止血、伤口愈合和/或血管栓塞的区域接触。对于伤口，为了止血或伤口愈合的目的，可以将该材料放置在伤口的空腔中或伤口表面上。对于伤口愈合，可以将DSM配制为粉末、悬浮液或软膏。对于止血，可以将DSM用作干粉或合并在纱布中或垫子中。对于栓塞，优选将DSM悬浮在适合介质（例如生理盐水）中。
[0081] 在本文中，“有效量”是一个量值，该量值将对止血、伤口愈合和/或血管栓塞产生积极作用。
[0082] 根据本发明的微球还可以在增强、促进或进行体外细胞培养的方法中使用。然后，可以将根据本发明的微球添加到适当的培养基中。有待培养的细胞也添加到该培养基中。这些微球可以与细胞同时加入、在添加细胞之前或之后将添加到培养基中。然后允许这些细胞增殖。如以上所解释，在本说明书中的细胞培养还包括组织培养。
[0083] 正如以上所说明并且正如权利要求中说明的根据本发明的任何实施方案的微球可以在增强、促进或进行止血、伤口愈合和/或血管栓塞中进一步使用。
[0084] 正如以上所说明以及正如权利要求中所说明的根据本发明的任何实施方案的微球可以进一步用于生产一种医疗装置或药物组合物。
[0085] 正如以上所说明以及正如权利要求中所说明的根据本发明的任何实施方案的微球可以进一步制造，特别是用于增强、促进或进行止血、伤口愈合和/或血管栓塞。
[0086] 贯穿本说明书和权利要求书，词语“包括”和“含有”是词语变体，例如“包括”和“包含”指“包括但并不局限于”，并且它们并非旨在排除其他部分、添加剂、组分、整体或步骤。
[0087] 贯穿本说明书的说明和权利要求，单数包括复数，除非本文另外要求。特别是，当使用不定冠词时，本说明书应当理解为注重的是复数形式和单数形式，除非本文另外要求。
[0088] 所说明的特性、整体、特征、化合物、化学部分或基团，连同本发明的具体方面、实施方案或实例应当理解为适用于在此说明的任何其他方面、实施方案或实例，除非与此不相容。
[0090] 本发明在实例中进行了更加详细地说明，它们涉及以下附图，其中：
[0091] 图1是一种可降解淀粉微球（DSM）以及本研究中进行的化学改性的示意图。
[0092] 图2说明了微球的溶胀可以被认为遵循菲克扩散，初始迅速溶胀速率呈指数级下降：
[0093] Y＝Y∞(1-e-kt)
[0094] 其中k=一阶溶胀常数，并且Y∞=最大溶胀时的体积增加。
[0095] 图3说明了血小板黏附。图3A示出了相差显微图像和荧光显微图像，这些图像显示了根据不同改性批次的DSM和DSM附着的血小板。图3B示出在两个聚集的DSM（批次4）之间的接点的特写镜头以及附接到DMS上的血小板聚集体。使用微分干涉相差（DIC）显微术成像。
[0096] 图4说明了三个DSM批次的体内研究。在抗凝大鼠体内的实验性流血模型中评估批次5、6和9。用批次9处理的所有动物获得初步止血，29%在20min的观察期内重新流血。其他批次表明了显著更少的止血效率，其中少量动物达到初步止血。
[0097] 图5说明了根据体内实验性研究中治疗批次的失血。通过称重由纱布收集的过量血液，测量失血。不同批次间的失血存在着显著差异（p=0.001），其中批次5是未改性的DSM，批次6证明出现凝结活化，批次9中的DSM吸附血小板。
[0098] 实例
[0099] 这些可降解淀粉微球（DSM）是通过乳化作用，将水解淀粉与甲苯中的表氯醇交联而制备的。随后，将DSM用乙醇然后用蒸馏水反复洗涤，并且最后用浓度增大的乙醇依次脱水，并且最终在60°C干燥过夜。
[0100] 关于DMS制备的细节
[0101] 将2g氢氧化钠溶解于280mL净化水中，并且加入2g硼氢化钠并溶解。通过缓慢搅拌至少2小时溶解153g水解淀粉。将20g表面活性剂（Rhodafac PA17）溶解于450g甲苯中。然后将淀粉溶液添加到甲苯溶液中并乳化，升温至70°C并且搅拌乳液直至已经得到所希望的液滴尺寸分布。加入22g表氯醇并且进行5小时的交联。将该混合物冷却至室温，并且允许沉积，随后倾析掉上清液。将DSM用95%乙醇洗涤三次，用0.8%乙酸洗涤一次，随后用净化水洗涤4次，并且最后用无水乙醇脱水，之后在通风干燥室中在60°C干燥。
[0102] 确定取代度（DS）
[0103] 取代度的定义是每个葡萄糖单体的取代基的平均数。
[0104] 采用碱性皂化的方法，随后使用过量碱的滴定用来确定取代度。向250mg的DSM样品中添加10mL的0.50M NaOH，并且允许将其静置于室温72h，偶尔摇动一下。用0.50M HCL滴定过量的NaOH，使用酚酞作为指示剂。
[0105] 用淀粉酶确定可降解性
[0106] DSM（3-6mg）样品用磷酸盐缓冲液（pH 7，5ml）稀释，并且添加400μl人唾液，随后在37°C孵育4h。将样品静置20分钟，或将样品离心、然后从底部取少量样品并且用显微镜分析以确定是否存在微球。
[0107] 用二酸（表1中列出的实例）取代DSM的通用操作
[0108] 将DSM（1g）悬浮于DMF（二甲基甲酰胺，10ml）中，向混合物中添加琥珀酸酐（154mg，1.54mmol）和吡啶（124μl，1.60mmol）。将该混合物搅拌并且加热至90°C过夜，然后用40ml乙醇、随后用5ml饱和NaHCO3洗涤三次，并且然后用30ml的水洗涤三次。将材-1料用乙醇进行脱水，并且在烘箱中在60°C干燥。用FTIR对该材料进行分析，示出1730cm的酯羰基。
[0109] DS：0.25（正如以上所说明进行确定）
[0110] 可被α-淀粉酶降解（正如以上所说明进行确定）。
[0111] 用酯类取代DSM的通用操作
[0112] 用甜菜碱改性
[0113] 将甜菜碱（1.66g，10,8mmol）和CDI（1.75g，10.8mmol）与50ml的DMF混合，并且加热至80°C达到2h。然后添加DSM（5g）并且升温至90°C，并且将该混合物搅拌过夜。将该混合物用乙醇（250ml）洗涤两次，用稀盐酸（250ml），并且用水（250ml）洗涤两次。将该材料用乙醇脱水，并且在60°C干燥过夜。
[0114] FTIR示出酯羰基在1751cm-1。
[0115] DS:0.23（正如以上所说明进行确定）。
[0116] 可被α-淀粉酶降解（正如以上所说明进行确定）。
[0117] 用二甲基甘氨酸改性
[0118] 正如以上使用甜菜碱的实例，但是使用了DSM(2g)、N，N-二甲基甘氨酸盐酸盐（430mg，3.1mmol）和CDI（500mg，3.1mmol）。
[0119] FTIR示出酯羰基在1,753cm-1。
[0120] DS：0.24（正如以上所说明进行确定）。
[0121] 可被α-淀粉酶降解（正如以上所说明进行确定）。
[0122] 用Nα-乙酰基-L-精氨酸改性
[0123] 正如以上使用甜菜碱的实例，但是使用了DSM(2g)、Nα-乙酰基-L-精氨酸（623mg，2.5mmol）和CDI（400mg，2.5mmol）。
[0124] FTIR示出酯羰基在1,748cm-1。
[0125] DS：0.24（正如以上所说明进行确定）。
[0126] 可被α-淀粉酶降解（正如以上所说明进行确定）。
[0127] 用脯氨酸改性
[0128] 正如以上使用甜菜碱的实例，但是使用了DSM（1g）、Boc-Pro-OH（266mg，1.2mmol）、CDI（200mg），随后用TFA将叔丁氧基羰基脱保护。
[0129] FTIR示出酯羰基在1,743cm-1。
[0130] 可被α-淀粉酶降解（正如以上所说明进行确定）。
[0131] 用甘氨酸改性
[0132] 正如以上使用甜菜碱的实例，但是使用了DSM（1g）、Boc-Gly-OH（216mg，1.2mmol）、CDI（200mg），随后用TFA将叔丁氧基羰基脱保护。
[0133] FTIR示出酯羰基在1,748cm-1。
[0134] 可被α-淀粉酶降解（正如以上所说明进行确定）。
[0135] 用苯丙氨酸改性
[0136] 正如以上使用甜菜碱的实例，但是使用了DSM（1g）、Boc-Phe-OH（327mg，1.2mmol）、CDI（200mg），随后用TFA将叔丁氧基羰基脱保护。
[0137] FTIR示出酯羰基在1,743cm-1。
[0138] 可被α-淀粉酶降解（正如以上所说明进行确定）。
[0139] 在电荷效应研究中使用不可拆分的表面改性
[0140] 这些表面改性说明于图1中。
[0141] 辛烯基琥珀酸酯（带负电并且疏水）
[0142] 将80g的DSM悬浮于净化水中，添加N-辛烯基琥珀酸酐（Pentagon）至0.08g/g干燥DSM中，并且将反应持续3h。通过添加0.75M NaOH使pH保持在7.4以上。将得到的材料用2000mL净化水洗涤8次，并且此后用浓度增加的乙醇脱水，并且最后在60°C干燥过夜（Hui Rea.Preparation and properties of octenyl succinic anhydride modified potato starch.Food Chemistry，2009;114:81-6）。
[0143] 羧甲基化作用（带负电）
[0144] 将50g的DSM悬浮于净化水中；将氯乙酸加入到0.1g/g干燥DSM中，并且将反应在70°C持续5h。在添加氯乙酸前，将它溶解于水中并用1M NaOH中和。将得到的材料用2000mL净化水洗涤6次，并且此后用浓度增加的乙醇脱水，并且最终在60°C干燥过 夜（Tomaski P，Schilling,C.H.Chemical modification of starch.Adv Carbohydr ChemBiochem 2004;59:175-403）。
[0145] 乙酰化作用（疏水性）
[0146] 将50g的DSM悬浮于净化水中，将乙酸酐加入到0.05g/g干燥DSM中。逐滴添加乙酸酐，并且通过添加0.75M NaOH将pH保持在7.3至7.8之间。将得到的材料用2000mL净化水洗涤7次，并且此后用浓度增加的乙醇脱水，并且最终在60°C干燥过夜(Sathe SK,Salunkhe,D.K.Isolation,Partial Characterisation and Modification of the Great Northern Bean(Phaseolus vulgaris L.)Starch.J Food Sci1981;46:617-21）。
[0147] 二乙氨基乙基氯，Aldrich（带正电）
[0148] 将50g的DSM悬浮于净化水中，加入0.375mol DEAE盐酸盐并且升温至60°C。加入250ml的3M氢氧化钠溶液并且将反应在60°C维持1小时。然后将DSM用20L净化水在布氏漏斗中洗涤。然后，将DMS脱水并干燥，如以上所述（Manousos M,Ahmed M,Torchio C,Wolff J,Shibley G,Stephens R,et al.Feasibility studies of oncornavirus production in microcarrier cultures.In Vitro 1980 Jun;16(6):507-15）。
[0149] 鞣花酸（吸收/被吸收的负电荷）
[0150] 使用两种不同的方法将鞣花酸（Alfa Aesar）被动吸附。方法1：将0.1mM鞣花酸溶解于水中，并且然后与DSM混合。方法2：将0.1mM鞣花酸溶解于乙醇中，并且然后与DSM混合（Ratnoff OD,Saito H.Interactions among Hageman factor,plasma prekallikrein,high molecular weight kininogen,and plasma thromboplastin antecedent.Proc Natl Acad Sci U S A1979 Feb;76(2):958-61）。如以上所述洗涤并干燥。鞣花酸受到被动吸收/吸附，并且不适用于电荷测量。
[0151] 用标准的改性方案（未优化）来产生不同表面改性。选择这些改性用于证明体内和体外止血作用的定义，并且不评估在人体内是否是毒理学上可接受的。
[0152] 表面电荷
[0153] 用一台PCD 02颗粒电荷检测器（Mütek）来测量表面电荷的程度。
[0154] 设计
[0155] 随机化并且盲化挑选九种不同的改性DSM。关于这些改性的信息没有发送给研究执行者。
[0156] DSM的特征化
[0157] 淀粉微球的形态学通过显微镜（AxioObserver Z1，Zeiss）观察进行确定，并且测量球体直径，得出这九个批次中每一批五个球体的最小值。通过在添加100μl磷酸盐缓冲液之前、以及之后按固定时间间隔（1、3、9、15和30s）测量直径来确定吸收。测量每一批次五个球体的最小值，然后假定DSM是完全球形的，以此计算它们的体积。通过将水扩散至聚合物以及和聚合物的水合作用出现微球的溶胀，这一过程继续向交联淀粉链最大松弛状态的平衡发展。因此，可以假定该过程遵循菲克扩散，初始迅速溶胀速率呈指数级下降。因此，该数据可以被解释为：
[0158] Y＝Y∞(1-e-kt)
[0159] 其中k是一阶膨胀常数，并且Y∞是最大溶胀时的体积增加。
[0160] 体外血小板黏附
[0161] 为了研究不同DSM批次之间可能的亲和力/相互作用以及已知对凝结过程中非常重要的因子，调查了与不同DSM批次的血小板黏附。将450μl富含肝素化血小板的血浆加入到含有1μg DSM的试管中，并且随后将它放在定轨摇床中以500rpm搅拌20分钟。此后，通过反复将DSM沉积到底部，并且用新鲜的PBS更换上清液，并且此后振荡该试管，由此在PBS中彻底地洗涤DSM。然后用PBS中的3.7%PFA固定DSM黏附的血小板，并且使用PBS中的0.1% Triton-X穿孔，并且最终用Alexa 546-鬼笔环肽荧光染色。该过程的每一个步骤之间进行彻底洗涤。使用AxioObserver Z1（Zeiss）荧光显微镜和AxioVision（Zeiss）成像软件获得DSM和荧光血小板的图像。
[0162] 实验型肾脏流血模型中的体内初步研究
[0163] 本研究依据优良实验室规范的指导进行，并获得当地大学动物实验伦理委员会的批准。根据以上说明的体外研究结果，选择三个不同批次的DSM。选择一个中性批次、一个激活凝结的批次以及一个具有血小板黏附特性的批次进行此次体内测试。这些批次对于本研究的调查者是盲化并且随机化的。将21只自由供应食物和水的成年驯化雄性史-道二氏大鼠（中位体重342g，iqr：314-360）麻醉（Hynorm,Janssen Pharma,Belgium and Midazolam Hameln,Pharma Hameln,GmbH)。当颈静脉插管（用于IV注射）以后，进行横向剖腹手术。在静脉给予200IU/kg普通肝素（UH,LEO Pharma A/S,Denmark）之后，切开左肾，并且将肾脏血管夹住2分钟。然后切除该侧肾脏的三分之一，并且将1mL随机化的DSM施用到原肾脏表面上，并且开始手工压迫(将纱布压在淀粉粉末与调查者手指之间），并且移开血管夹。压迫持续2分钟，然后释放，开始控制止血。如果发生流血，继续每分钟进行止血控制。初步止血的定义是从肾脏切除开始20分钟内没有可见的流血。对得到止血的动物再观察20分钟，观测可能出现的重新流血。用IV注射苯巴比妥酸和乙醇将所有动物安乐死。收集并称重失血。研究终结点为：获得初步止血的能力、达到止血的时间、重新流血的频率和失血。
[0164] 统计
[0165] 用中位值和个体或内部的四分位间距（iqr）来表示描述性数据。因为数据分布是2
倾斜的，所以进行非参数检定。进行χ 检定用于列联表，并且当比较不成对数据时，使用克拉斯-卡瓦立斯方差分析。p值<小于0.05被认为是显著的。
倾斜的，所以进行非参数检定。进行χ 检定用于列联表，并且当比较不成对数据时，使用克拉斯-卡瓦立斯方差分析。p值<小于0.05被认为是显著的。
[0166] 使用针对Mac和Windows的软件SPSS 17.0（www.spss.com）。
[0167] 结果
[0168] DSM的改性
[0169] 在表2中给出了表面电荷。该合成操作并未优化，并且羧甲基化作用并没有产生相当可观的表面电荷。乙酰化作用并有改变表面电荷，而其他方法应当导致显著的正的和负的表面电荷。
[0170] 表2
[0171] DSM的化学改性和所测量电荷的结果。
[0172]
[0173]
[0174] 1溶于水中
[0175] 2溶于乙醇中
[0176] 3更加广泛地交联
[0177] 淀粉球的特征化
[0178] 在这些批次之间，干燥直径中存在显著差异（p=0.006），批次6具有尺寸最小的球（中值直径是54μm，iqr：38-58），并且批次2具有尺寸最大的球（中值直径是72μm，iqr：67-76）。在加入磷酸盐缓冲液以后，所有批次的体积迅速增加（图2），并且在30s以后，相对于它们干燥体积，它们已经扩展了5至25倍（表3）。在这些批次之间，溶胀量显著不同（p=0.001）。
[0179] 表3
[0180] DSM干燥体积和在磷酸盐缓冲溶液中30秒以后。
[0181]
[0182]
[0183] *中位值（iqr），体积以皮升为单位（1pL=1ml-9）
[0184] 血小板刺激
[0185] 在三个改性的批次（编号4、7和9）中存在着明显的血小板与DSM黏附，而剩余的DSM批次根本不影响血小板（图3）。使用来自三个不同供体的PRP确认了这些结果。
[0186] 随机盲化的体内初步实验性研究
[0187] 与使用其他批次的14%-43%止血相比，使用批次9处理的所有动物都获得了初步止血（图4）。在这些组中达到止血的时间也不同（p=0.044），在它们终止流血前，批次9处理的动物是最快的（中位数2min：iqr：2-3:20），而批次6要求中位数是6min（n=3），并且批次5是10min（n=1）。只有两只批次9处理的动物重新流血（与其他批次相比，p=NS）。与其他批次相比，批次9处理的动物的失血较少（中位数1g，iqr：0.4-1.2）（批次5：5g，4.3-6.7，批次6：5.3g，2.2-8.6），p=0.001（图5）。
[0188] 通过吸收来自血液的液体（和小分子）并且在这些球上浓缩内源想凝结因子来假设DSM的止血作用，可能依赖与这些微球快速并且相当大的溶胀作用。在加入磷酸盐缓冲液之后，本研究中所有批次迅速增加了它们的体积，但是这些批次之间的溶胀速度和总量均不同。溶胀作用取决于聚葡萄糖链随着水合作用而出现的松弛。这一点受到很多交联的限制，并且可被这些配体的电荷排斥作用促进。尽管如此，我们仍能没有发现与所测量的特征（例如电荷）明显的相关性。低交联和高度快速的溶胀作用表明降解迅速，并且即使在该过程结束时施加的向内操作的位置空间受限，体积增加也并不危险。在本研究中，流体快速吸收以及DSM的溶胀并不足以在体内止血，使用未改性的微球处理的7只动物中只有1只获得了初步止血。
[0189] 具有体内良好的止血能力的DSM经证明是具有血小板刺激特性的DSM。血小板黏附着带正电的DSM，二乙氨基乙基（DEAE）制备的那些批次（4、7和9），这与所报道的与暴露带正电基团的表面的血小板附着相一致（Lee JH,Khang G,Lee JW，Lee HB.Platelet adhesion onto chargeable functional group gradient surfaces.J Biomed Mater Res1998May;40(2):180-6）。没有对与对应DEAE改性批次黏附的血小板进行客观定量，但是通过目测，在批次4、7和9之间，血小板的附着量中没有明显差异，即使在批次4和9之间存在着经测量的电荷差异。DEAE氯化物与DSM表面上的羟基基团反应，生成在生理pH下带正电的DEAE基团。DEAE配体导致生物学不可降解的微球，并且可能不适合人类使用。然而，作为有待区别的概念验证，如果这些球可以变为血小板附着的并且无论这是否具有任何临床止血显著性，该DEAE改性都是有价值的。快速有效的血小板刺激对于由聚集的血小板的物理栓塞所产生的瞬时止血是至关重要的。血小板还被要求用于有效扩增和增加凝血酶的产生，这是一个由受刺激的血小板表面强烈催化的过程，产生一种能稳定初级血小板栓塞的纤维蛋白织网。
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