技术领域
[0001] 本
发明属于生物技术领域，具体涉及从健康人的脐带组织或胎盘组织中提取干细胞，经体外培养、扩增，然后提取干细胞培养、扩增过程中分泌的生物活性因子和干细胞内的生物活性物质并应用。
背景技术
[0002] 干细胞(stem cell)是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，是形成人体各种组织、器官的“祖宗细胞”、“万能细胞”。根据其发育阶段可分为胚胎干细胞和成体干细胞，根据分化潜能大小又可以分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。
[0003] 间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞，可以从骨髓、外周血、脂肪及
皮肤等多种组织中获得，作为一类多能干细胞，它可以向成骨、软骨、肌肉、神经及胰岛样细胞等方向增殖分化。目前MSCs主要来源于成人骨髓，但成人骨髓MSCs细胞数量及增殖分化潜能随供体年龄的增加而下降，
病毒感染率较高，且采集具有创伤，使其来源受限。最近，已开发出从脐带或胎盘组织提取MSCs，它也是一类具有多向分化潜能的干细胞，越来越多的研究表明其极具开发潜质，与骨髓MSCs相比具有明显的优势：(1)来源充足，取材方便，成本低廉；(2)间充质干细胞含量丰富，较为原始，分化能
力强，可在体外进行分离、培养，扩增迅速，且生物学性状稳定，多次传代扩增仍能保持旺盛功能，可以提供充足的细胞来源；(3)免疫原性极低，免疫排斥的概率极低，且还具有一定的免疫抑制功能；(4)可以支持造血和促进移植功能；(5)旁分泌能力强，在增殖生长过程中会产生大量生物活性因子。
[0004] 干细胞不但可以产生或分泌大量的生物活性因子，而且干细胞内也含有丰富的生物活性物质，这些干细胞生物活性因子或物质可有效调控机
体细胞信号传导、活化人体干细胞，进而生理性修复或替代
机体损伤、病变及衰老的细胞等。例如干细胞可以产生干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、基质细胞源性生长因子(SDF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、
碱性
成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素-6与白介素-7(IL-6与IL-7)、巨核细胞集落刺激因子(M-CSF)、
肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等因子，这些细胞因子具有促进
细胞增殖、分化、抗凋亡等功能；干细胞还可以产生天然免疫蛋白，例如IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等，可以抵御或修复自身和外界因素对机体细胞造成的损伤。
[0005] 研究表明人体骨髓、血管、脂肪组织、骨骼肌、心脏和大脑，也包括在
肺、肝、胰腺、消化道、皮肤、
视网膜、乳房、卵巢、前列腺和睾丸的上皮内均可分离到相应的干细胞。理论上，干细胞可以修复身体任何部位的组织缺损，可以利用干细胞去
治疗遗传
疾病、恶性疾病和退变性疾病等。2007年10月10日，国际干细胞权威杂志《Cell》系列刊物《Cell-Stem Cell》的一篇研究论文揭示干细胞功能下降可导致人类衰老，并证明干细胞衰老过程是受到外在和内在因素共同调控的。
[0006] 因此，利用干细胞分泌产生的生物活性因子或干细胞内的生物活性物质激活机体干细胞，进而通过自身干细胞生理性修复或替代机体损伤、病变及衰老的细胞，在疾病防治与保健美容领域具有广阔的应用前景。目前实际中利用的干细胞生物活性因子或物质大多存在以下不足：(1)直接利用胎盘等组织提取，致得到的干细胞生物活性因子或干细胞内生物活性物质纯度低；(2)利用含有动物源成分的培养液进行干细胞培养扩增(例如，使用胎
牛血清)，提取的分泌物质中不可避免的含有动物来源的成分甚至含有存在于动物体内的特定病毒等，若应用于临床或保健美容则存在较大的安全隐患；(3)胚胎干细胞等在增殖分化过程不易控制，致瘤性大，提取此类干细胞的分泌物质中可能含有使正常干细胞恶性转化的因子，而骨髓等组织的干细胞分化程度较高，开始表达相关人白细胞
抗原，直接应用可能会产生免疫排斥反应；(4)干细胞内含有丰富的生物活性物质，对干细胞的增殖分化等有重要作用，但在增殖分化过程这类物质并不分泌到细胞外，实际中尚未出现提取间充质干细胞内生物活性物质的
专利技术。
[0007] 鉴于上，我们研究开发从人脐带或胎盘组织中提取干细胞，利用无血清间充质干细胞培养基(不含动物源成分)进行体外培养、扩增，然后提取干细胞培养、扩增过程中分泌的生物活性因子和干细胞内的生物活性物质，利用这类生物活性因子或生物活性物质激活人体自身干细胞来生理性修复或替代机体损伤、病变和衰老的组织细胞。
发明内容
[0008] 本发明的目的是：1、提供可以活化机体干细胞的生物活性因子群和干细胞的裂解液(其主要成分为干细胞内生物活性物质群)；2、提供干细胞分泌的生物活性因子和干细胞裂解液的制备方法；3、提供干细胞分泌的生物活性因子和干细胞裂解液的用途。
[0009] 本发明的技术方案如下：
[0010] 从健康人的脐带或胎盘组织中提取干细胞，利用无血清间充质干细胞培养基(不含动物源成分)进行体外培养、扩增，并维持干细胞的高增殖能力和
稳定性状。收集脐带或胎盘干细胞培养扩增过程中更换的废液，并置于-80℃
冰箱中保存；脐带或胎盘干细胞体外最多传代至第5代，此时收集的干细胞不但产量高、活性强，而且生物学性状稳定。将收集的废液经融化、低温分离、
超滤和浓缩即可得到含丰富生物活性因子的组合物；将收集的干细胞调整至合适浓度密封于冻存管中，经超低温液氮反复冻融至细胞
破碎，再通过低温分离、纯化等现代生物技术手段，即可获得高纯度的干细胞内生物活性物质群或组合物即为高纯度的干细胞裂解液。
[0011] 整个过程要求无细菌、
真菌、病毒、衣原体和支原体等污染。
[0012] 本发明获得的干细胞为间充质干细胞，制备的生物活性因子或物质富含干细胞因子群、多肽、天然免疫蛋白和核酸等，该生物活性因子或物质群可促进机体干细胞增殖、分化，活化机体干细胞，提高身体免疫力和抗衰老作用。该干细胞生物活性因子或物质群组合物可制成针剂、涂剂、膏剂、霜剂或粉剂等，在医学、保健和美容领域有极佳的应用前景。
[0013] 本发明与现有产品或技术相比具有明显优势：第一，克服了
现有技术直接从脐带或胎盘等组织中提取的有效生物活性物质纯度、产量和活性不高的缺点，本发明从脐带或胎盘组织提取的干细胞进行培养、扩增，收集高产量、高纯度的干细胞，利用超低温等现代技术进行提取、分离、纯化等，从而获得高纯度、高产量和高活性的干细胞生物活性因子或物质；第二，克服了现有技术中利用含动物源成分培养基的不足，因为利用含有动物源成分的培养基进行干细胞培养、扩增(例如，使用胎牛血清)，提取的分泌物质中不可避免的含有动物来源的成分甚至含有存在于动物体内的特定病毒等，若应用于临床或保健美容则存在较大的安全隐患；第三，本发明干细胞来源为脐带或胎盘组织间充质干细胞，增殖分化能力强，易于控制，生物学性状稳定，且本发明所利用的干细胞严格控制在5代以内(包括第5代)，将细胞非正常分化控制在最低范围内，从而保证了产品
质量的稳定；第四，本发明通过对干细胞的物理性裂解破碎，提取了干细胞内的生物活性物质，因为干细胞在增殖分化过程很多生物活性物质并不分泌到细胞外，而这些物质对干细胞的增殖分化等有着重要作用。
具体实施方式
[0015] 从健康人的脐带组织提取干细胞，此干细胞主要为间充质干细胞，获得的干细胞进行体外培养、扩增。原代细胞收集后按1∶2比率进行传代培养，当细胞约80％汇合时，利用胰酶进行消化、收集，按相同的比率进行传代，最多传代培养至第5代，收集5代以内(包括第5代)的细胞，此时收集的干细胞生物学性状稳定，增值能力强，同时收集培养、扩增过程中更换的废培养液于-80℃冰箱中保存。具体过程如下：
[0016] ①采集健康人的脐带；
[0018] ③将脐带组织剪切成1～2mm3大小的小
块；
[0019] ④将剪切后小块种植于加有无血清间充质干细胞培养液的培养皿(直径为100mm)中，置于37℃、饱和湿度、5％CO2
培养箱中培养；
[0020] ⑤每3～4天半量换液，培养14～16天细胞生长约80％汇合，并收集更换的废培养液于-80℃冰箱中保存；
[0021] ⑥当细胞约80％汇合时，利用0.25％胰酶对细胞进行消化，以1～3×105cells/ml接种于培养皿中传代培养，并收集更换的废培养液于-80℃冰箱中保存；
[0022] ⑦当细胞约80％汇合时，利用0.25％胰酶对细胞进行消化，收集第1代细胞，按1∶2比率进行传代，置于37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养，并收集更换的废培养液于-80℃冰箱中保存；
[0023] ⑧若需多次传代，重复步骤⑦即可；
[0024] ⑨分离、纯化获得高纯度间充质干细胞，利用FACS Calibur流式细胞仪分析其间充质干细胞纯度。
[0025] 实施例2、胎盘组织干细胞制备
[0026] 从健康人的胎盘组织提取干细胞，此干细胞主要为间充质干细胞，获得的干细胞进行体外培养、扩增。原代细胞收集后按1∶2比率进行传代培养，当细胞约80％汇合时，利用胰酶进行消化、收集，按相同的比率进行传代，最多传代培养至第5代，收集5代以内(包括第5代)的细胞，此时收集的干细胞生物学性状稳定，增值能力强，同时收集培养、扩增过程中更换的废培养液于-80℃冰箱中保存。具体过程如下：
[0027] ①采集健康人的胎盘羊膜下组织或绒毛膜组织；
[0028] ②PBS反复冲洗除去血迹；
[0029] ③将胎盘羊膜下组织或绒毛膜组织剪切成1～2mm3大小的小块；
[0030] ④将剪切后小块种植于加有无血清间充质干细胞培养液的培养皿(直径为100mm)中，置于37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养；
[0031] ⑤每3～4天半量换液，培养14～16天细胞生长约80％汇合，并收集更换的废培养液于-80℃冰箱中保存；
[0032] ⑥当细胞约80％汇合时，利用0.25％胰酶对细胞进行消化，以1～3×105cells/ml接种于培养皿中传代培养，并收集更换的废培养液于-80℃冰箱中保存；
[0033] ⑦当细胞约80％汇合时，利用0.25％胰酶对细胞进行消化，收集第1代细胞，按1∶2比率进行传代，置于37℃、饱和湿度、5％CO2培养箱中培养，并收集更换的废培养液于-80℃冰箱中保存；
[0034] ⑧若需多次传代，重复步骤⑦即可；
[0035] ⑨分离、纯化获得高纯度间充质干细胞，利用FACS Calibur流式细胞仪分析其间充质干细胞纯度。
[0036] 实施例3、脐带或胎盘组织干细胞分泌的生物活性因子的制备
[0037] 将干细胞培养扩增过程中收集的废液融化，混合，经0.25微米滤器过滤，再经截留分子量为50KD中空纤维超滤柱超滤，将超滤后的液体进行浓缩，即可得到含有丰富干细胞生物活性因子的组合物。
[0038] 实施例4、脐带或胎盘组织干细胞内生物活性物质的制备
[0039] 将体外培养获得的脐带或胎盘组织干细胞浓度调整为5×106～1×107个/毫升密封于冻存管中，经超低温液氮反复冻融4～5次至细胞破碎，再通过低温分离、纯化等现代生物技术手段，便可获得高纯度的干细胞内生物活性物质群或组合物即为高纯度的干细胞裂解液。
[0040] 该生物活性物质群主要来自间充质干细胞，包含但不限于干细胞生长因子(SCF)、神经生长因子(NGF)、基质细胞源性生长因子(SDF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、白介素-6与白介素-7(IL-6与IL-7)、巨核细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、干扰素(IFN)等因子、脱
氧核糖核酸(DNA)及核糖核酸(RNA)、活性多肽、以及免疫蛋白IgG、IgA、IgM、IgD、IgE等等，这些物质可以促进机体干细胞生长、增殖，起到活化干细胞作用，从根本上调节人体生理机能。
[0041] 实施例5、脐带或胎盘组织干细胞分泌生物活性因子和干细胞内生物活性物质的活性验证
[0042] 将干细胞生物活性因子或干细胞内生物活性物质按15微克/毫升浓度加入到培养基中，并以此种浓度的培养基培养正常传代至第8代的脐带或胎盘间充质干细胞(此代细胞的增殖能力减弱，活性降低)，
显微镜下观察细胞的生长状态，并于第3天收集细胞，与对照组相比，添加干细胞生物活性因子或干细胞内生物活性物质的组别，间充质干细胞增殖能力显著增强。
[0043] 实施例6、脐带或胎盘组织干细胞分泌生物活性因子和干细胞内生物活性物质在医学中的应用
[0044] 将干细胞生物活性因子或干细胞内生物活性物质按10～50微克/毫升浓度加入
