蛋白酶体激活性增亮肽水解产物和含有它们的组合物
阅读：76发布：2023-03-06
专利汇可以提供蛋白酶体激活性增亮肽水解产物和含有它们的组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及富含 生物 活性肽的肽 水 解 产物，所述水解产物是蛋白酶体激活剂。此外，本发明在一方面涉及在生理可接受介质中包含所述水解产物的化妆或制药组合物，在另一方面，涉及其用于除色素、增亮和/或增白 皮肤 和 预防 或 治疗 色素沉着瑕疵和因光老化而产生的皮肤迹象的用途。最后，本发明适用于使用所述肽水解产物的化妆治疗方法。，下面是蛋白酶体激活性增亮肽水解产物和含有它们的组合物专利的具体信息内容。
1.蛋白酶体激活性肽水解产物，特征在于所述水解产物富含多种生物活性肽，所述生物活性肽有小于6kDa的分子量，包含3至5个氨基酸，每种生物活性肽包含至少一个天冬氨酸残基、一个半胱氨酸残基和一个精氨酸残基。
2.权利要求1的富集的肽水解产物，特征在于所述生物活性肽是通式(I)：
X1-[Asp，Cys，Arg]-X2
其中，
X1是天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、精氨酸或不存在；
X2是组氨酸、赖氨酸、精氨酸或不存在。
3.前述权利要求的富集的肽水解产物，特征在于所述生物活性肽相应于下式中的一种：
(SEQ ID No.1)Arg-Asp-Cys-Arg-Arg
(SEQ ID No.2)Asn-Asp-Cys-Arg-Lys
(SEQ ID No.3)Asp-Cys-Arg-His
(SEQ ID No.4)Val-Asp-Cys-Arg
(SEQ ID No.5)Asp-Cys-Arg
4.权利要求1至3之一的富集的肽水解产物，特征在于其来自植物的水解，所述植物选自玉米(Zea mayz L.)、豌豆(Pisum sativum)、或水稻(Oryza sativa L.)。
5.权利要求1至3之一的富集的肽水解产物，特征在于其来自于酵母属的酵母的水解，更特别地是酿酒酵母的水解。
6.前述权利要求中任一项的肽水解产物，特征在于所述肽水解产物含有0.5至5.5g/l的肽性质的化合物。
7.前述权利要求中任一项的富集的肽化合物，特征在于所述肽被用作药物。
8.一种化妆组合物，其包含权利要求1至6之一的富集的肽水解产物作为活性成分。
9.权利要求8的化妆组合物，特征在于所述组合物以包含化妆可接受介质的适于局部应用的形式存在。
10.权利要求8或9之一的组合物，特征在于所述富集的肽水解产物在组合物中以占组合物总重量的0.0001％到20％的量存在，并优选以占组合物总重量0.05％到5％的量存在。
11.权利要求8至10中任一项的组合物，特征在于所述水解产物被溶解于一种或多种溶剂中，诸如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、一缩二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二甘醇、环多元醇、白凡士林、植物油或这些溶剂的任意混合物。
12.权利要求8至11任一项的组合物，特征在于所述组合物还含有促进所述富集的肽水解产物作用的至少一种其它活性成分。
13.权利要求12的组合物，特征在于所述活性成分是在增亮剂方面展现出活性的物质如脱屑剂；抚慰剂，有机或无机的光保护剂，增湿剂；其它脱色素剂，酪氨酸酶抑制剂；刺激皮肤或表皮大分子合成和/或预防其降解的物质；刺激成纤维细胞和/或角化细胞增殖或刺激角化细胞分化的物质；作用于细胞能量代谢的物质；脱色素肽，植物水解产物，抗老化剂，以及其混合物。
14.包含权利要求1至6之一所定义的所述富集的肽水解产物和化妆可接受介质的化妆组合物的用途，其用于增加蛋白酶体活性和改善蛋白酶体对涉及黑素生成的损坏蛋白的降解。
15.包含权利要求1到6之一所定义的所述富集的肽水解产物和化妆可接受介质的化妆组合物的用途，其用于对皮肤进行脱色素、增亮和/或增白。
16.权利要求15的组合物的用途，其用于预防和/或治疗色素沉着过多的瑕疵诸如黑斑病、黄褐斑、光化性雀斑样痣、日光性雀斑样痣、雀斑、意外性色素沉着瑕疵、瘢痕形成后色素沉着瑕疵。
17.权利要求15的用途，其用于治疗和/或预防由光老化引起的色素沉着过多性质的皮肤迹象。
18.一种化妆治疗方法，特征在于将包含有效量权利要求1至6之一所定义的富集的肽水解产物的组合物局部应用于要进行治疗的皮肤或上皮附属物，以对皮肤或上皮附属物进行脱色素、增亮和/或增白。
蛋白酶体激活性增亮肽水解产物和含有它们的组合物
[0001] 本发明涉及除色素活性成分领域以及特别是它们在化妆品中的用途。更具体地，本发明涉及富含生物活性肽的肽水解产物，所述水解产物是蛋白酶体激活剂，以及涉及其在化妆品和/或制药中作为增亮剂、除色素剂和/或增白剂的用途。所述水解产物也使得能够预防和/或治疗因光老化而产生的色素沉着过多性质的皮肤迹象、以及不同来源的色素沉着过多的瑕疵。
[0002] 在人类中，毛发和皮肤的颜色与个体因素(种族来源、性别、年龄等)及环境因素(特别是季节、生活区域等)相关联。其主要由黑素细胞产生的黑色素的性质和浓度来决定。黑色素具有保护皮肤细胞免受UV辐射损害作用并延缓皮肤光老化的特性。黑素细胞是特化的细胞，其通过称为黑素体的特定细胞器合成黑色素。黑色素合成、或黑素生成是复杂的过程，其精确的机制仍未被弄清楚，其图示化地涉及以下步骤：
[0003] 酪氨酸→多巴→多巴醌→多巴色素→黑色素。
[0004] 此黑色素事实上在决定皮肤颜色中起了基本所用。黑色素是由大的树突状细胞合成的：黑素细胞，位于表皮基底层的细胞。黑色素以两种不同的形式存在：褐黑素，黄色的色素；和真黑素，黑色的色素。正是这些色素的不同比例和大小，还有胡萝卜素和血液微循环，赋予了皮肤其很大的颜色多样性。
[0005] 黑色素的产生及其转移是通过不同因素调节的，诸如UV辐射、激素或化学产物。因此，UV辐射暴露的增加引起色素的合成并导致皮肤变深。会出现此色素形成中的失调(或多或少是良性的)。这些失调表现为例如雀斑、美人斑、弥漫性瑕疵诸如妊娠斑、黄褐斑和黑斑病、以及其它色素沉着过多疾病如雀斑痣。其它色素沉着过多瑕疵可以是由于例如不良的瘢痕形成，尤其在具有深色表型的个体中，或者其也可以是由于使用光敏性的药物等。但老化本身也可调节皮肤色素沉着。因此，一些人皮肤上中可出现斑点，其或多或少深色的或有色的，造成异质着色区形成老年斑或雀斑。最后，在一些亚洲或非洲群体中，需要增亮化妆治疗以获得纯净和均匀的肤色。
[0006] 因此，黑色素合成抑制剂或调节剂以及任何其它脱色素和/或增白产品的用途，在美容学和/或皮肤病学中受到特别关注。此用途不仅仅是在真皮肤有脱色素的需求时被关注，正如增白高度色素沉着的皮肤的情形或者抑制导致难看皮肤表象的色素沉着过度皮肤区的情形；其在某些致力于增亮肤色以赋予皮肤光亮度或赋予表面组织光泽的应用中也受到关注。
[0007] 至今，提出了许多或多或少有效的分子。在这些分子中，可以引用的有酚衍生物诸如氢醌和间苯二酚，其通过抑制酪氨酸酶活性来抑制L-酪氨酸转化成黑色素的一系列反应(Takano，1984)。还可以引用的有L-抗坏血酸及其衍生物、抗坏血酸基醋酸镁、曲酸或乳酸。
[0008] 但目前市场上的大多产品是有毒性的和/或不表现出足够的功效。例如，氢醌对黑素细胞有刺激性和有细胞毒性的。例如曲酸在溶液中不稳定等等。因此有需要有新的增白剂，其不表现出现有药剂的缺点但却一样有效。这就是为何需要探索其它途径，以发现作用于酪氨酸酶和黑色素的新脱色素剂。
[0009] 令人吃惊地，申请人发现了富含生物活性肽的肽水解产物，所述水解产物是蛋白酶体激活剂，可被用作增白剂并表现出良好的脱色素活性，且并不必然具有毒性。
[0010] 泛素-蛋白酶体途径在大量的生物学过程中起基本作用。事实上，蛋白通过蛋白酶体的降解机制中涉及重要的细胞机制，诸如DNA修、基因表达控制、细胞周期进展调节、新合成蛋白质量控制、凋亡或免疫应答(Glickman and Ciechanover，2002)。
[0011] 人细胞中存在的蛋白酶体是存在于细胞质和细胞核中的大尺寸多蛋白复合物。纯化形式的蛋白酶体包含2个大的亚基：一方面是被称为20S蛋白酶体的蛋白水解核，另一方面是结合至20S蛋白酶体两端的19S调节复合物(Coux et al.，1996；Glickman and Coux，2001)。20S蛋白酶体是中空圆柱体形的颗粒，由28个α和β亚基组成，分布在4个七元环中。肽酶活性存在于圆柱体内表面并且变构地相互影响。三种蛋白水解活性(“胰蛋白酶、糜蛋白酶和半胱天冬蛋白样酶”)与20S蛋白酶体相关，并帮助将蛋白破坏成含有3到
20个氨基酸的无活性肽。在20S蛋白酶体之外，26S蛋白酶体包含由大约20个亚基构成的
0.7MDa的19S调节复合物。最近的免疫纯化研究显示，其它蛋白可以与20S和19S蛋白酶体结合(例如11S调节复合物)。
20个氨基酸的无活性肽。在20S蛋白酶体之外，26S蛋白酶体包含由大约20个亚基构成的
0.7MDa的19S调节复合物。最近的免疫纯化研究显示，其它蛋白可以与20S和19S蛋白酶体结合(例如11S调节复合物)。
[0012] 考虑到由蛋白降解所控制的细胞过程的多样性，发现泛素-蛋白酶体途径的改变是一些遗传疾病和许多人类病理的根源或与其紧密相连并不令人意外，诸如结肠直肠癌、淋巴瘤、炎症反应综合症、或神经退行性疾病如帕金森病或阿尔茨海默病。
[0013] 近些年来完成了对于蛋白酶体在皮肤老化中作用的许多工作。最近所探索的一条途径是蛋白酶体及其对涉及黑素生成蛋白的降解作用。实验显示，在人的黑素细胞中，由藻类提取物激活蛋白酶体对酪氨酸酶的降解(Bulteau et al.Antioxid.Redox Signal；2006，1-2：136-143)。
[0015] 这就是申请人如何发现富含生物活性肽的肽水解产物能够激活蛋白酶体并因而可以对皮肤和上皮附属物进行脱色素、增亮甚或增白。
[0016] 因此，本发明的首个目标是蛋白酶体激活性的肽水解产物，富含生物活性肽，所述生物活性肽有小于6kDa的分子量，包含3到5个氨基酸，每种生物活性肽包含至少一个天冬氨酸残基、一个半胱氨酸残基和一个精氨酸残基。
[0017] 本发明的第二个目标是化妆品组合物，其包含所述富集的肽水解产物作为活性成分。
[0018] 此外，本发明的第三个目标是包含所述肽水解产物的化妆品组合物的用途，其用于改善蛋白酶体对损坏的蛋白的降解并由此对皮肤和/或上皮附属物进行脱色素，以及预防和/或治疗色素沉着过多的瑕疵。
[0019] 最后，本发明的第四个目标是对于要使用所述富含肽水解产物的组合物进行治疗的皮肤或上皮附属物的化妆治疗方法。
[0021] 附图2显示了通过HPLC获得的色谱图的例子，展示出相应于豌豆水解产物中的生物活性肽的峰。
[0022] 附图3显示了通过HPLC获得的色谱图的例子，展示出相应于水稻水解产物中的生物活性肽的峰。
[0024] 本发明的首个目标是蛋白酶体激活性的肽水解产物，富含多种生物活性肽，所述生物活性肽有小于6kDa的分子量，包含3到5个氨基酸，每种生物活性肽包含至少一个天冬氨酸残基、一个半胱氨酸残基和一个精氨酸残基。
[0025] “肽水解产物”理解为是指主要由肽或寡肽所代表的化合物的混合物。
[0026] “生物活性肽”理解为是指由经修饰或未修饰的肽键互相连接的至少3个氨基酸的连接所组成的蛋白片段，并且其呈现出作为蛋白酶体激活剂的活性。其以非活性形式存在于蛋白中，并在蛋白水解后变成有活性。
[0027] 本发明的所述富集的肽水解产物特征在于，其是蛋白酶体激活剂。
[0028] “蛋白酶体激活性”肽水解产物(和/或生物活性肽)理解为是指任何具有生物学活性的肽水解产物或肽或衍生物，其能够提高蛋白酶体的活性，这是通过增加蛋白酶体亚基的蛋白合成(通过直接或间接调控基因表达)，或者是通过其它生物过程如使得构成蛋白酶体的亚基稳定或者使RNA信使转录物稳定。
[0030] 优选地，肽水解产物富集了具有通式(I)的生物活性肽：
[0031] X1-[Asp，Cys，Arg]-X2
[0032] 其中：
[0033] X1是天冬酰胺、赖氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、精氨酸或不存在
[0034] X2是组氨酸、赖氨酸、精氨酸或不存在
[0035] 优选地，肽水解产物富含具有下式的生物活性肽：
[0036] (SEQ ID No.1)Arg-Asp-Cys-Arg-Arg
[0037] (SEQ ID No.2)Asn-Asp-Cys-Arg-Lys
[0038] (SEQ ID No.3)Asp-Cys-Arg-His
[0039] (SEQ ID No.4)Val-Asp-Cys-Arg
[0040] (SEQ ID No.5)Asp-Cys-Arg
[0041] 事实上，这些肽已被鉴定为特别具有作为蛋白酶体激活剂的活性，并由此作为增亮剂而受到特别关注。
[0042] 本发明的富集的肽水解产物可从各种蛋白来源获得，不论动物或植物来源。根据第一个实施方案，富集的肽水解产物来自于植物的水解，所述植物选自玉米(Zea mayz L.)、豌豆(Pisum sativum)、或水稻(Oryza sativa L.)。优选所使用的植物此前未经发酵。在第二个实施方案中，富集的肽水解产物来自酵母属(Saccharomyces)酵母的水解，更具体地是来自酿酒酵母种的水解。
[0044] 本发明也可通过使用豌豆科(豆科Fabaceae)的许多植物中的一种来进行。例如，可使用豌豆种的植物豌豆(Pisum sativum L)。术语豌豆也表示种子，其自身富含蛋白(25％)。
[0045] 来自水稻科(禾本科Poaceae)、特别是来自稻属(Oryza)、更优选的是水稻(Oryza sativa L)种的植物可被使用来实现本发明的水解产物。所使用的植物原料是种子，并且优选种子的外壳已经通过去壳步骤而去除。
[0046] 最后，本发明也可通过使用酵母属的酵母来进行，并优选地是酿酒酵母种的酵母。
[0047] 任何本领域技术人员已知的用于提取或纯化的方法，均可被使用以制备本发明的水解产物。
[0049] 对酵母，在第一个步骤中，将酵母在适合于其发育的培养基中以常规方式培养，优选是有乳糖存在。酵母通过离心收获，并接着悬浮于缓冲液中，优选磷酸盐缓冲液。在第二个步骤中，用弗氏细胞压碎器(French press)或球型研磨器来使细胞破裂，大部分不可溶的膜组分通过离心或过滤而除去。
[0050] 然后，依照修改过的常规方法(Osborne，1924)来提取蛋白；将植物研磨过的原料或酵母溶解产物悬浮于含有不溶性聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)类型(0.01-20％)吸附产物的碱性溶液中；事实上，发现此方法可以促进随后的水解和纯化操作。特别是与蛋白相互作用的苯酚型物质的浓度显著降低。
[0051] 在离心和过滤步骤之后，收集含有蛋白、碳水化合物和可能的脂类的可溶性部分。随后将此粗溶液在受控条件下水解以产生可溶性肽。水解被定义为涉及通过水切割分子的化学反应，此反应可在中性、酸性或碱性介质中完成。依照本发明，水解是通过化学方式和/或有利地使用蛋白水解酶来进行。可引用的有使用植物来源的内切蛋白酶(木瓜蛋白酶、波罗蛋白酶、无花果蛋白酶)和微生物(曲霉Aspergillus、根霉Rhizopus、杆菌bacillus等)。选择水解条件，以促进生物活性肽的富集。
[0052] 基于上述同样的原因，即消除多酚类物质，将一定量的聚乙烯聚吡咯烷酮在此受控的水解步骤中加入到反应介质中。过滤后，将酶和多聚物除去，获得首份滤液。
[0053] 此阶段获得的水解产物可再次纯化以选择低分子量的部分，优选小于6kDa的部分，且肽依其性质而产生。为了特异地富集水解产物中的生物活性肽，可以通过在孔隙率递减的过滤器中经连续的超滤步骤而有利地进行纯化，这是通过保留每一步的滤液和/或通过色谱类型的方法。
[0054] 然后本发明在水中或任何含有水的混合物中的进行稀释阶段，并随后通过超滤灭菌以获得富集的肽水解产物，其特征在于蛋白含量为0.5至5.5g/l。此富集的肽水解产物相应于本发明活性成分最纯化的形式。
[0055] 依照本发明获得的肽水解产物在高效液相色谱(HPLC)中进行定量和定性分析，使得能够分析分子量为0.2至25kDa的蛋白(依照合适的溶剂梯度)。随后分析能被分离的不同肽部分的生物效能。接着通过质谱分析这些不同的部分，以特异地从每个峰鉴定肽的氨基酸含量。也进行了序列分析，以确定生物活性肽的肽序列。
[0056] 最后，所获得的富集的肽水解产物由分子量小于6kDa的肽组成，并富含具有3到5个氨基酸的生物活性肽，包含至少一个天冬氨酸残基、一个半胱氨酸残基和一个精氨酸残基。
[0057] 依照本发明的此肽水解产物，富含生物活性肽，也可被用作药物。
[0058] 本发明的第二个目标涉及化妆组合物，其包含如前所述的富含生物活性肽的肽水解产物作为活性成分。
[0059] 优选地，本发明的组合物以包含化妆可接受介质的适于局部使用的形式存在。“化妆可接受”理解为是指介质适用于与皮肤或人的上皮附属物接触，没有毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应或其它副作用的风险。优选所述肽水解产物在组合物中以占组合物总重量0.0001％到20％的量存在，优选以占组合物总重量0.05％到5％的量存在。
[0060] 在本发明的组合物中，将富含生物活性肽的肽水解产物溶解于一种或多种溶剂中，如水、甘油、乙醇、丙二醇、丁二醇、一缩二丙二醇、乙氧基化或丙氧基化的二甘醇、环多元醇、白凡士林、植物油、或这些溶剂的任意混合物。
[0061] 按照另一有利的实施方案，将本发明的肽水解产物溶解在化妆或药物载体如脂质体中，或将其吸附至粉末状有机多聚物、矿物质支持物如华视和皂粘土上，而更常见的是溶解于或固定至任何生理可接受的载体。
[0062] 要应用于皮肤的组合物可以如下形式存在，水或水醇溶液、油包水乳剂或水包油乳剂、微乳剂、含水或无水凝胶、浆液、囊泡分散物、贴片、乳霜、喷雾、软膏、润发油、洗剂、胶体、溶液、悬浮液或其它形式。组合物也可以洗发剂、染发剂或要用刷子或梳子应用的睫毛膏的形式而应用于上皮附属物，尤其是睫毛、眉毛或毛发上，或指甲的处理如指甲油。
[0063] 在特定实施方案中，本发明的组合物还含有促进所述富集的肽水解产物作用的至少一种其它活性成分。可以非限制性的方式引用的有，在增亮剂方面展现出活性的成分类别如脱屑剂(desquamant agent)；抚慰剂，有机或无机的光保护剂；增湿剂；其它脱色素剂；酪氨酸酶抑制剂；刺激皮肤或表皮大分子合成和/或预防其降解的物质；刺激成纤维细胞和/或角化细胞增殖或刺激角化细胞分化的物质；作用于细胞能量代谢的物质；其它脱色素肽、植物水解产物、抗老化剂，以及它们的混合物。此外，还可将添加剂加入到组合物中，如增稠剂、乳化剂、湿润剂、润滑剂、芳香剂、抗氧化剂、成膜剂、螯合剂、多价螯合剂、调节剂等。
[0064] 在所有情况下，本领域技术人员会挑选这些佐剂以及它们的比例，以确保不会损害本发明组合物所期待的优势特性。例如，这些佐剂可占组合物总重量的0.01％到20％。当本发明的组合物是乳剂时，脂相可占组合物总重量的5％到80％，优选占组合物总重量的5％到50％。组合物中使用的乳化剂和辅-乳化剂可选自本领域中常规使用的那些。例如，它们可以组合物总重量的0.3％到30％来使用。
[0065] 最后，所述的组合物使得能增加蛋白酶体活性以及改善蛋白酶体对涉及黑素生成的损坏蛋白的降解。
[0066] 本发明的第三个目标涉及包含所述富集的肽水解产物和化妆可接受介质的化妆组合物的用途，其用于对皮肤进行脱色素、增亮和/或增白。
[0067] 本发明的组合物还预防和/或治疗色素沉着过多的瑕疵诸如黑斑病、黄褐斑、光化性雀斑样痣、日光性雀斑样痣、雀斑、意外性色素沉着过多瑕疵和瘢痕形成后色素沉着过多瑕疵。
[0068] 本发明的另一个目标涉及含所述肽化合物的组合物的用途，其用于治疗和/或预防因光老化而引起的色素沉着性质的皮肤迹象。“光老化”理解为是指因长期的和累积的阳光照射而引起的皮肤过早老化。
[0069] 最后，本发明的另一个目标是本发明的化妆组合物的用途，其用于增加蛋白酶体的活性，并改善蛋白酶体对涉及黑素生成的受损蛋白的降解。
[0070] 本发明最后的目标涉及化妆治疗的方法，其特征在于将含有有效量的本发明肽水解产物的组合物局部应用于要进行治疗的皮肤或上皮附属物，以对皮肤或上皮附属物进行脱色素、增亮和/或增白。此外，此化妆治疗方法也会预防和/或治疗因光老化而引起的色素沉着过多性质的皮肤迹象。
[0071] 以下实施例描述并证明了本发明所述的肽化合物的有效性，但不应被理解为是对本发明的限制。
[0072] 实施例1：从玉米胚饼(Zea mays L.)中制备肽水解产物
[0073] 将玉米胚饼(Zea mays L.)在存在2％POLYCLAR 10(聚乙烯吡咯烷酮-PCPP-不可溶)的情况下于10体积的水中置入溶液。使用1M氢氧化钠水溶液将混合物pH至6-8之间。
[0074] 调节pH后，将2％的木瓜蛋白酶加到反应介质中。在55℃搅拌2小时后获得水解。随后通过加热溶液到80℃，2小时而将酶灭活。离心后，回收上清的水溶液，相当于玉米粗水解产物。选择特定的水解条件，使得能够富集含有3到5个氨基酸包含至少一个天冬氨酸残基、一个半胱氨酸残基和一个精氨酸残基的生物活性肽。
[0075] 粗水解产物纯化的过程始于使用孔隙率递降(到0.2μm)的Seitz-Orion过滤板的成功过滤，以获得透明和澄清的黄色溶液，称为水解产物1。
[0076] 在这一步，玉米水解产物1的特征在于固体残余物测定在20到30g/kg，蛋白水平为20到25g/l和糖水平为2-5g/l。
[0077] 水解产物1的蛋白性质在NuPAGE Bis-Tris预置聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)电泳分析后被展示。玉米蛋白水解产物在NuPAGE LDS样品制备缓冲液的还原变性条件下被加热到70℃，10分钟。蛋白迁移在NuPAGE MES迁移缓冲液中使用标准的SeeBlue Plus2作为分子量标记完成。蛋白染色通过使用Coomassie Blue R-250完成。在这些条件下，观察到获得的蛋白具有小于6kDa的分子量。
[0078] 水解产物1随后通过使用Pellicon 2 Biomax 5kDa盒超滤去除高分子量蛋白而进行纯化，以仅保留小于5kDa的肽性质的化合物。
[0079] 在此终纯化后，完成稀释阶段以获得肽水解产物，其特征在于蛋白水平在3.5到5.5g/l间。此富含生物活性肽的肽水解产物相应于本发明的活性成分。
[0080] 此肽水解产物随后通过使用ChemStation软件运行HP 1100部件的高效液相色谱(HPLC)来进行分析。水解产物洗脱期间使用的柱子是Nucleosil 300-5 C4 MPN(125x4mm)柱，能使分子量在0.2到25kDa间的蛋白在以下条件下被色谱分析：
[0081] -甲醇梯度
[0082] -Uptisphere OPB 125x3mm柱
[0083] -溶剂A：含有0.1％七氟丁酸(HFBA)的HPLC级水
[0084] -溶剂B：含有0.1％七氟丁酸(HFBA)的HPLC级甲醇
[0085] -梯度：35分钟内溶剂A从100％到15％。
[0086] 通过HPLC(高效液相色谱)获得的色谱图的例子，具有相当于生物活性肽峰的展示，在附图1中给出。
[0087] 这些不同的部分随后通过质谱被分析，以特异地鉴定每个峰的肽的氨基酸含量。也完成了序列分析以确定生物活性肽的肽序列。
[0088] 实施例2：从豌豆(Pisum sativum L.)中制备富含生物活性肽的肽水解产物[0089] 肽水解产物从豌豆种的植物提取物中获得。显然，提取物可以从至少任何一种属于豌豆属的众多品种和物种的植物中制备。
[0090] 在第一步中，1kg去壳的豌豆通过有机溶剂己烷的作用而被去脂。
[0091] 如此获得的豌豆粉被置于10体积的含2％POLYCLAR 10(聚乙烯吡咯烷酮-PCPP-不可溶)的水中。混合物使用1M氢氧化钠水溶液调节pH至6到7间。
[0092] 调节pH后，2％的flavourzym 被加到反应介质中。在50℃搅拌2小时后获得水解。随后通过加热溶液到80℃，2小时而将酶灭活。如此获得的反应混合物相当于豌豆提取物。选择特定的水解条件，以使得能富集含有3到5个氨基酸包含至少一个天冬氨酸残基、一个半胱氨酸残基和一个精氨酸残基的生物活性肽。
[0093] 纯化过程始于使用孔隙率递降(到0.2μm)的Seitz-Orion过滤板的成功过滤，以获得透明和澄清的溶液。在这一步，豌豆水解产物的特征在于固体残余物测定在70-80g/kg，蛋白水平为55-65g/l，糖水平为2-5g/l和多酚水平为1-3g/l。
[0094] 此水解产物的蛋白性质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳而展示。对于此分析，使用NuPAGE Bis-Tris预置胶(Invitrogen)。豌豆蛋白水解产物在NuPAGE LDS样品制备缓冲液的还原变性条件下被加热到70℃，10分钟。蛋白迁移通过在NuPAGE MES迁移缓冲液中使用标准的SeeBlue Plus2作为分子量标记而完成。蛋白染色通过使用Coomassie Blue R-250完成。在这些条件下，2个大的蛋白家族被观察到：第一家族相当于分子量从20到25kDa的蛋白，后一家族是分子量小于5kDa的蛋白。
[0095] 此溶液随后通过使用正切流动过滤，排除分子量大于5kDa的蛋白而进行纯化。为此，豌豆水解产物在压力下被泵入装备有Pellicon 2Biomax30kDa盒的Pellicon 支持物。此第一滤液被回收以随后通过另一Pellicon 2Biomax 5kDa盒来过滤。纯化后，获得透明和澄清的米黄色豌豆肽水解产物。其特征在于固体残余物为50到55g/kg，蛋白含量为50到52g/l。
[0096] 此溶液随后通过使用ChemStation软件运行HP 1100部件的高效液相色谱(HPLC)来分析。豌豆提取物洗脱期间使用的柱子是Nucleosil 300-5 C4MPN(125x4mm)柱。此柱能使分子量为0.2到25kDa的蛋白被色谱分析(依照合适的溶剂梯度，与实施例1一致)。在这些层析分析条件下，几个肽部分能被分离。
[0097] 这些不同的部分随后通过质谱来分析，以特异地鉴定每个峰的肽的氨基酸含量。还完成了序列分析以确定生物活性肽的肽序列。通过HPLC(高效液相色谱)获得的色谱图的例子，具有相应于生物活性肽峰的展示，在附图2中给出。
[0098] 还完成了本发明的活性成分的氨基酸组成的确定。它在酸水解后被实现并通过使用PICT(异硫氰酸苯酯)前衍生化的高效液相色谱来鉴定。
[0099] 实施例3：从酿酒酵母中制备富含生物活性肽的肽水解产物
[0100] 肽水解产物可从酿酒酵母种的酵母提取物中获得。酵母被培养在适合它们生长的培养基中，优选存在乳酸，并随后被离心，以回收生物质。酵母生物质被置于10体积的含2％POLYCLAR 10(聚乙烯吡咯烷酮-PCPP-不可溶)和0.2％活性炭的水中。混合物使用
1M氢氧化钠水溶液调节pH至6到7.5间。
1M氢氧化钠水溶液调节pH至6到7.5间。
[0101] 调节pH后，将2％的木瓜蛋白酶加到反应介质中。在55℃搅拌2小时后获得水解。随后通过加热溶液到80℃，2小时而将酶灭活。离心后，随后获得反应混合物，相当于酵母提取物。选择特定的水解条件，以使得能富集含有3到5个氨基酸包含至少一个天冬氨酸残基、一个半胱氨酸残基和一个精氨酸残基的生物活性肽。
[0102] 纯化过程始于使用孔隙率递降(到0.2μm)的Seitz-Orion过滤板的成功过滤，以获得透明和澄清的溶液。在这一步，酵母提取物的特征在于固体残余物为25到35g/kg，蛋白水平10到15g/l和糖水平5-10g/l。
[0103] 此提取物的蛋白性质通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来展示。对于此分析，使用NuPAGE Bis-Tris预置胶(Invitrogen)。肽水解产物在NuPAGE LDS样品制备缓冲液的还原变性条件下被加热到70℃，10分钟。NuPAGE 抗氧化剂溶液被加到内室(负极)，以预防电泳期间还原蛋白的再氧化。蛋白迁移通过在NuPAGE MES迁移缓冲液中使用标准的SeeBlue Plus2作为分子量标记而完成。蛋白染色通过使用Coomassie Blue R-250完成。在这些条件下，3个大的蛋白家族被观察到：第一家族相当于分子量大于75kDa的蛋白，第二家族相当于分子量从20到25kDa的蛋白，最后一家族是分子量小于5kDa的蛋白。
[0104] 此溶液随后使用正切流动过滤，排除分子量大于5kDa的蛋白而进行纯化。为此，酵母肽水解产物在压力下被泵入装备有Pellicon 2Biomax 50kDa盒的Pellicon 支持物。此第一滤液被回收以随后通过另一Pellicon 2Biomax 10kDa盒过滤。第二滤液随后被回收，其再次通过最后的Pellicon 2 Biomax 5kDa盒洗脱。在纯化结束后，获得米色、透明和澄清的酵母植物提取物。其特征在于固体残余物为35到45g/kg，蛋白含量30到40g/l。
[0105] 此溶液随后通过使用ChemStation软件运行HP 1100部件的高效液相色谱(HPLC)来分析。酵母水解产物洗脱期间使用的柱子是Nucleosil 300-5C4 MPN(125x4mm)柱。此柱能使分子量为0.2到25kDa的蛋白被色谱分析(依照使合适的溶剂梯度，与实施例1一致)。在这些层析分析条件下，几个肽部分能被分离。
[0106] 这些不同的部分随后通过质谱来分析，以特异地鉴定每个峰的肽的氨基酸含量。还完成了序列分析以确定生物活性肽的肽序列。通过HPLC(高效液相色谱)获得的色谱图的例子，具有相当于生物活性肽峰的展示，在附图4中给出。
[0107] 还完成了本发明的活性成分的氨基酸组成的确定。它在酸水解后被实现并通过使用PICT(异硫氰酸苯酯)前衍生化的高效液相色谱而鉴定。
[0108] 实施例4：通过体外测试，证明富含生物活性肽的酵母肽水解产物的脱色素作用[0109] 依照本发明完成的富含生物活性肽酵母水解产物的脱色素活性在皮肤样品上被证明。
[0110] 6mm直径的活组织样品取自人的皮肤样品。这些活组织样品于体外被维持于6孔板中存在特异培养基(DMEM 1g/L，HAMF 12，SVF和抗生素)的插入物中。活组织样品随后被预处理24小时，用3％浓度的肽水解产物以每天2次的频率应用。其它皮肤样品不用相同2
的水解产物来预处理，并用作对照条件。随后，活组织被以100mJ/cm 的量暴露于中波UV辐射。预处理过的活组织再次使用3％浓度的肽水解产物以每天2次的频率应用处理24小时。
在此2次处理后，皮肤样品中表皮中存在的黑色素量的定量评估在依照Fontana-Masson方法染色后，用光学显微镜而组织学地完成。
的水解产物来预处理，并用作对照条件。随后，活组织被以100mJ/cm 的量暴露于中波UV辐射。预处理过的活组织再次使用3％浓度的肽水解产物以每天2次的频率应用处理24小时。
在此2次处理后，皮肤样品中表皮中存在的黑色素量的定量评估在依照Fontana-Masson方法染色后，用光学显微镜而组织学地完成。
[0111] 为此，将皮肤活组织包埋在石蜡中，制作了4μm厚度的组织学切片。这些切片随后通过Fontana-Masson技术染色：将石蜡从切片上除去，将切片水化并随后使用氢氧化铵银溶液处理。在微波炉中经过两分钟后，清洗切片，使用硫代硫酸钠处理，在脱水并用盖玻片封片之前，再次清洗并用苏木精复染，从而使在表皮中存在的黑色素通过光学显微镜被看到。
[0112] 结果：
[0113] 在中波UV辐射前，未处理过的皮肤对比使用酵母肽水解产物处理过的皮肤表现出更高的色素沉着水平。在中波UV辐射后，用所述水解产物处理过的皮肤对比来自对照条件下的未处理的皮肤表现出明显更低的色素沉着水平。因此，这些结果使我们能推断，不存在中波UV辐射时，富含生物活性肽的酵母肽水解产物对比未处理过的皮肤样品，降低了黑色素水平。此外，当皮肤样品被我们的活性成分预处理过时，通过中波UV辐射诱导的黑色素合成，非常明显地降低了。因此，依照本发明的肽水解产物能使皮肤的色素沉着显著地降低并抑制黑色素合成。
[0114] 实施例5：含遮光剂的脱色素化妆组合物
[0115]
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