促生长素抑制素类似物
阅读：968发布：2023-03-12
专利汇可以提供促生长素抑制素类似物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 总体上涉及一种由 氨 基酸序列X1CX2WKX3CT构成的经分离的肽，其中X1为F或A，X2为F或Y，而X3为T或V，它们可以为任意的组合或置换，并且其中每一个氨基酸均为L-构型，而且所述的肽在所述的两个半胱氨酸残基之间包含二硫键。可选择地，所述的两个半胱氨酸残基的两个硫 原子 可以通过三个 碳 原子连接。此外，本发明总体上涉及包含所述的肽的融合 蛋白质 、编码所述的肽或融合蛋白质的多核苷酸、制备所述的肽或融合蛋白质的方法、包含所述的肽或融合蛋白质的药物以及该药物的用途。，下面是促生长素抑制素类似物专利的具体信息内容。
1.一种由氨基酸序列X1CX2WKX3CT构成的经分离的肽，其中X1为F或A，X2为F或Y，而X3为T或V，它们可以为任意的组合或置换，并且其中每一个氨基酸均为L-构型，而且所述的肽在所述的两个半胱氨酸残基之间包含二硫键。
2.一种由氨基酸序列X1CX2WKX3CT构成的经分离的肽，其中X1为F或A，X2为F或Y，而X3为T或V，它们可以为任意的组合或置换，并且其中每一个氨基酸均为L-构型，而且所述的两个半胱氨酸残基的两个硫原子通过三个碳原子连接。
3.根据权利要求2所述的肽，其进一步包含与三个碳原子中的一个共价连接的亲水性聚合物。
4.根据权利要求3所述的肽，其中所述的亲水性聚合物为聚乙二醇。
5.一种融合蛋白质，其包含权利要求1-4中的任何一项的肽、以及一个或多个载体蛋白质。
6.一种多核苷酸，其包含编码权利要求1所述的肽的第一核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的多核苷酸，其中所述的第一核苷酸序列为：
5′-TTYTGYTTYTGGAARACNTGYACN-S′，其中Y＝C或T，其中R＝A或G，而其中N＝A、C、T或G，它们可以为任意的组合或置换。
8.根据权利要求6或权利要求7所述的多核苷酸，其进一步包含编码载体蛋白质的第二核苷酸序列。
9.一种载体，其包含权利要求6-8中的任何一项所述的多核苷酸。
10.根据权利要求9所述的载体，其进一步包含与权利要求6-8中的任何一项所述的多核苷酸可操作地连接的启动子。
11.一种制备权利要求1所述的肽的方法，其包含将权利要求6-8中的任何一项所述的多核苷酸或权利要求9或权利要求10所述的载体引入到能够表达所述的多核苷酸或载体的宿主细胞中，并由所述的宿主细胞中分离所述的肽。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述的宿主细胞为细菌细胞或酵母菌细胞。
13.一种制备权利要求2所述的肽的方法，其包含：
-将权利要求6-8中的任何一项所述的多核苷酸或权利要求9或权利要求10所述的载体引入到能够表达所述的多核苷酸或载体的宿主细胞；
-由所述的宿主细胞中分离所述的肽；以及
-将三碳桥引入到所述的两个半胱氨酸残基的两个硫原子之间。
14.根据权利要求13所述的方法，其进一步包含亲水性聚合物与三个碳原子之一共价连接的步骤。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述的亲水性聚合物为聚乙二醇。
16.用于医药用途的权利要求1-4中的任意一项所述的肽。
17.根据权利要求16所述的肽，其用于治疗激素紊乱；癌症；患有分泌血管活性肠肽的肿瘤患者的腹泻；严重的顽固性腹泻；长期复发的低血糖症；患有胰岛细胞增殖症的婴儿的胰岛素过多分泌；疑似食管血管曲张的患者的出血；以及由糖尿病所导致的眼病。
18.一种包含权利要求1-4中的任意一项所述的肽和可药用的载体的药物组合物。
促生长素抑制素类似物
技术领域
[0001] 本发明总体而言涉及自然界中并非天然存在的生物合成肽、编码该肽的多核苷酸、制备这种肽的方法以及这种肽的用途。本发明的肽可以用于医药领域中，例如治疗激素紊乱、癌症和出血紊乱。此外，本发明总体上涉及稳定性增强的修饰形式的肽、制造这种修饰肽的方法以及这种修饰肽的用途。具体而言，本发明涉及可以使用诸如聚乙二醇之类的聚合物来进行化学修饰的生物合成肽、以及所述肽或修饰形式的肽在治疗肢端肥大症、肿瘤(包括消化道激素分泌肿瘤)以及胃肠出血中的用途。
背景技术
[0002] 肢端肥大症是一种致残性的激素紊乱，其表征为头、手和脚的骨骼以及软组织增大。其导致过早死亡。每年，肢端肥大症的发病率为每百万人口3例。患病率为每百万人口60例。由于这种疾病的特征的发展具有潜伏性，所以在临床症状发病后在进行诊断时通常会耽搁7到10年。肢端肥大症是由于垂体腺体过多地分泌生长激素(GH)所导致的(通常由于垂体腺瘤的存在)。垂体生长激素细胞的增殖导致生长激素分泌达到异常高的水平，这会导致肢端肥大症的独特的临床特征。
[0003] 生长激素被分泌为191-氨基酸、4-螺旋束蛋白和更少丰富的176-氨基酸形式。生长激素通过穿越垂体门静脉循环的下丘脑释放激素和下丘脑抑制激素在下丘脑的控制之下以脉冲的方式进入循环。然后，其直接作用于特定的生长激素细胞表面受体。生长激素(i)诱导了外周胰岛素样生长因子1(IGF-1)的合成；(ii)诱导了循环(内分泌)和局部(自分泌和旁分泌)IGF-1诱导细胞的增殖；以及(iii)抑制了细胞凋亡。肢端肥大症的过多的发病和死亡是GH和IGF-1水平的持续升高的结果。对这两种激素的水平进行细致的终身的控制可以改善患者的健康并恢复正常的平均寿命。
[0004] 在针对肢端肥大症的当前治疗中，通常实施手术来除去分泌生长激素的微腺瘤。对于术后复发或持续的肿瘤而言，在抵抗医学治疗或对医学治疗不耐受的患者中，通常保留放射疗法。
[0005] 此外，当前治疗包括给药天然激素(生长激素抑制素)的化学合成类似物，其抑制了生长激素的分泌。奥曲肽乙酸盐(购自Novartis Pharmaceuticals，商品名为Sandostatin )为一种这样的类似物。在过去的二十年中，奥曲肽乙酸盐成为有效的且临床认可的治疗方法来治疗肢端肥大症。奥曲肽乙酸盐(系统IUPAC名为：(4RJS，10S，13R，16S，19R)-10-(4-氨基丁基)-19-[[(2R)-2-氨基-3-苯基-丙酰基]氨基]-16-苄基-N-[(2R，3R)-1，3-二羟丁-2-基]-7-(1-羟乙基)-13-(1H-吲哚-3-基甲基)-6，9，12，
15，18-五氧-1，2-二噻-5，8，11，14，17-吡咯环糊精-4-甲酰胺))为通过固相化学合成方法产生的八肽(Bauer et al.，(1982)Life Sciences，Vol.31，pp.1133-1140)。化学合成的奥曲肽乙酸盐的氨基酸序列为：
15，18-五氧-1，2-二噻-5，8，11，14，17-吡咯环糊精-4-甲酰胺))为通过固相化学合成方法产生的八肽(Bauer et al.，(1982)Life Sciences，Vol.31，pp.1133-1140)。化学合成的奥曲肽乙酸盐的氨基酸序列为：
[0006] (D)Phe-c[(L)Cys-(L)Phe-(D)Trp-(L)Lys-(L)Thr-(L)Cys]-(L)Thr(ol)[0007] 1 2 3 4 5 6 7 8
[0008] 另一种化学合成的生长激素抑制素类似物为兰乐肽乙酸盐(系统IUPAC名为：(4S，7S，10S，13R，16S，19S)-10-(4-氨基丁基)-19-[[(2R)-2-氨基-3-萘-2-基-丙酰基]氨基]-N-[(1S，2R)-1-氨基甲酰基-2-羟-丙基]-16-[(4-羟苯基)甲基]-13-(1H-吲哚-3-基甲基)-6，9，12，15，18-五氧-7-丙-2-基-1，2-二噻-5，8，11，14，17-吡咯环糊精-4-甲酰胺))。其购自Ipsen Pharmaceuticals，商品名为Somatuline LA 。兰乐肽乙酸盐的氨基酸序列为：
[0009] β-萘基-(D)丙氨酸-Cys-Tyr-(D)Trp-Lys-Val-Cys-Thr-CONH2
[0010] 1 2 3 4 5 6 7 8
[0011] 显然，兰乐肽乙酸盐在位置1处包含(D)丙氨酸，在位置4处包含(D)色氨酸。此外，它还具有交联两个半胱氨酸残基的二硫键。在结构上，兰乐肽乙酸盐与奥曲肽乙酸盐非常接近，兰乐肽乙酸盐表现出与奥曲肽乙酸盐非常相似的生长激素抑制素受体结合概况，并且兰乐肽乙酸盐与奥曲肽乙酸盐具有相同的医学适应症(Weckbecker，G.et al.，(2003)Nature Reviews，Vol.2，pp.999-1017)。
[0012] 已知，天然激素生长激素抑制素在其构造中具有环状部分，这是因为存在有延伸的反平行β片，而该反平行β片是由于在β转角的转弯处存在有Trp和Lys残基的原因。在奥曲肽乙酸盐和兰乐肽乙酸盐中，引入的D-Trp4以相同的方式来稳定药效基团β转角。
[0013] 此外，普遍已知的是，通过形成二硫键桥而环化的肽使得蛋白质和肽(包括生长激素抑制素)具有改善的化学和代谢稳定性。由于这个原因，将桥接单元Cys2-S-S-Cys7以化学方式引入到化学合成的奥曲肽乙酸盐和兰乐肽乙酸盐中。在奥曲肽乙酸盐中，所述的桥接单元使得所述肽的代谢稳定性提高3倍(Bauer et al.，(1982)Life Sciences，Vol.31，pp.1133-1140；Cai et al.，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，Vol.83，pp.1896-1900)。
[0014] 总之，插入两个D-氨基酸并形成二硫键桥会增加这种化学合成8氨基酸肽的血浆半衰期。在奥曲肽乙酸盐中，增加的半衰期由几分钟至1.5小时(Harris AG.，(1994)Somatostatin and somatostatin analogues：pharmacokinetics and pharmacodynamic effects.Gut，Vol.35，pp.1-4)。
[0015] 奥曲肽乙酸盐和兰乐肽乙酸盐以高的亲和性与生长激素抑制素受体亚型2(SST2)和生长激素抑制素受体亚型5(SST5)结合。它们以适度的亲和性与生长激素抑制素受体亚型3结合。它们不与生长激素抑制素受体亚型1或生长激素抑制素受体亚型4结合。此外，奥曲肽乙酸盐和兰乐肽乙酸盐还显示与D2多巴胺受体结合。
[0016] 已知，在奥曲肽乙酸盐的结构中，唯有Phe3-Trp4-Lys5-Thr6对其生物学活性是必需的。当奥曲肽乙酸盐与生长激素抑制素受体结合时，其向垂体发出了信号，从而抑制生长激素的分泌以及生长激素细胞的增殖，并且奥曲肽乙酸盐在肝脏上阻断了IGF-I的合成。作为针对SST2和SST5受体的生长激素抑制素配基，奥曲肽乙酸盐抑制了GH和IGF-I的水平，限制了肿瘤的生长，并阻止了GH与其受体间的、肝介导的结合和作用。作为GH受体拮抗剂，奥曲肽乙酸盐阻止了GH受体的信号传导，该信号传导使得外周血中的IGF-I的水平降低。
[0017] 生长激素分泌的抑制(响应于对患有肢端肥大症的患者给药奥曲肽乙酸盐)取决于生长激素抑制素受体亚型的可用性。已经证明，在试验肿瘤模型中，奥曲肽乙酸盐和兰乐肽乙酸盐的直接抗肿瘤活性是通过肿瘤细胞中表达的生长激素抑制素受体而介导的。这些抗增殖作用是由于阻断了细胞分化以及诱导细胞凋亡的结果。化学合成的生长激素抑制素类似物与生长激素抑制素受体的结合引发了特定的信号传导途径。在这种方式中，每一种生长激素抑制素受体亚型都可以介导不同的生物学作用。介导这些机制的受体亚型为SST1、SST2、SST4和SST5。虽然许多人类肿瘤表达出多于一种的生长激素抑制素受体亚型，但是SST2是主要的。生长激素抑制素类似物奥曲肽乙酸盐和兰乐肽乙酸盐对SST2受体具有高的亲和性。
[0018] 此外，生长激素抑制素及其合成类似物还发挥了多种间接的抗肿瘤作用。这些作用包括抑制会驱使肿瘤生长的生长因子和激素的释放。由这些生长激素抑制素类似物的间接作用所导致的肿瘤生长的降低包括抑制生长因子和激素(包括IGF-I和生长激素)的合成和分泌(并由此减小所述的作用)。生长激素抑制素类似物通过中枢和外周机制抑制了生长激素-IGF-1轴。SST2和SST5是介导对垂体生长激素释放的抑制作用的主要受体亚型。此外，生长激素抑制素类似物还通过SST2介导的酪氨酸磷酸酶(其导致STAT5b的脱磷酸以及IGF-I基因转录的减少)活性来抑制肝生长激素诱导的IGF-I的产生(Weckbecker，G.et al.，(2003)Nature Reviews，Vol.2，pp.999-1017；Susini C&Buscail L，(2006)Ann of Oncology Vol.17，pp.1733-1742)。
[0019] 生长激素抑制素受体亚型的可用性转而预示了奥曲肽乙酸盐疗法对患者血液中血清生长激素和IGF-I浓度的长期作用。使用300-600微克/天的皮下剂量见到了血清生长激素和IGF-I的最大程度的抑制。最初，以皮下注射的方式每天至少3次给予患者奥曲肽乙酸盐(因为其半衰期仅为1.5h)，并持续几个月的时间，以便将生长激素的水平降至正常水平。一旦过量产生的生长激素降低至正常水平，患者通常被转为(经过几个星期的时间)基于缓释聚合物的络合物集库(depot)制备物(例如Sandostatin 长效)。这种制备物通过深度肌内注射到臀部肌肉中来进行给予；但是不能给予到三角肌中，这是因为与大块的臀部肌肉相比，善宁(Sandostatin)在所述的肌肉中会产生过度的疼痛。奥曲肽乙酸盐由基于这种聚合物的缓释集库中的缓慢释放意味着，与每周一次(如果通过无痛皮下注射给予)相比，所述聚合物集库通常可以每两周给予一次(伴有疼痛)。
[0020] 集库制备物(即，长效释放奥曲肽乙酸盐-购自Sandostatin LAR )可以每14天注射给予。这些制备物可以保持有效的奥曲肽乙酸盐水平。报告表明，跟踪了9年、同时使用奥曲肽乙酸盐进行治疗的80％的这些患者，其生长激素的水平升高低于2.5μg/升，而IGF-I的水平是正常的。Eugonadism储存在患有肢端肥大症的三分之二的患者(患有性腺机能减退)中(S.Farooqi et al.(1999)Pituitary，Vol.2，pp.79-88；A.N.Paisley and PJ.Trainer，(2003)Current opinion in Pharmacology，Vol.3，pp.672-677；S.Melmed.(2006)New England Journal of Medicine，Vol.355，pp.2558-2573)。
[0021] 奥曲肽乙酸盐的效力的决定因素包括治疗前生长激素的水平、大量的肿瘤SST2和SST5表达的存在或缺乏、药品的剂量、用于评估状态的生物化学标准以及患者对治疗的依从性。虽然50％的患者都发生了肿块的收缩，但是如果终止使用奥曲肽乙酸盐进行治疗，则肿块还会逆转。
[0022] 此外，不愿意接受全外科切除手术的大腺瘤减负荷手术会增加随后奥曲肽乙酸盐治疗的效力。接受了所述药品的多于80％的患者报告症状有所改善，所述的症状包括头疼和外周软组织肿胀。肿瘤收缩与生物化学控制不必同时发生。因此，由于生长激素的水平保持较高，所以在未能改变对GH和IGF-I水平进行生物化学控制的手术之后以及在放射疗法之后，通常给药奥曲肽乙酸盐。使用奥曲肽乙酸盐的基本医药治疗是有效且安全的。由于不管患者是否经历了手术或辐射都可以取得与给药的长效药品等效的生物化学应答，所以可以对患有(i)不具有中枢压迫作用的迹象的外鞍区大肿瘤、(ii)太虚弱以至于不能进行手术的那些患者以及(iii)谢绝手术的那些患者提供基本的医药治疗。
[0023] 此外，奥曲肽乙酸盐和兰乐肽乙酸盐还可以用于治疗与消化道有关的良性肿瘤以及转移性良性肿瘤。估计每年胃肠良性肿瘤的总体发病率为8400万人。胃肠良性肿瘤包含90％的所有的良性肿瘤。使用奥曲肽乙酸盐进行治疗会改善患有良性综合症的50-80％患者的症状和生命品质。此外，奥曲肽乙酸盐可以停止肿瘤的发展。
[0024] 此外，已经显示奥曲肽乙酸盐在治疗方法上能够有效地治疗患有分泌血管活性肠肽的肿瘤(VIPomas)患者的腹泻，并且奥曲肽乙酸盐已经用于治疗由其他原因引起的严重的顽固性腹泻。在毒理学中，奥曲肽乙酸盐还用于治疗在过量使用磺酰脲类药物之后长期复发的低血糖症，并且已经用于患有胰岛细胞增殖症的婴儿中以帮助降低胰岛素的过多分泌。在患有疑似食管血管曲张的患者中，可以给予奥曲肽乙酸盐以帮助减少出血。此外，奥曲肽乙酸盐可以用于治疗伴有慢性胰腺炎所导致的疼痛的患者，治疗胸腺赘生物以及由糖尿病所导致的眼病。兰乐肽乙酸盐与奥曲肽乙酸盐具有相同的治疗适应症。
[0025] 需要规律地使用许多年的基于所有小分子肽的医药(例如奥曲肽乙酸盐和兰乐肽乙酸盐)的主要实践缺点是缺乏成本有效的大规模的制造方法来将它们制造成为全世界使用的药物医药。在当前，采用化学肽合成来制造天然形成的以及基因工程的肽，但是这种方法是非常昂贵的。结果，奥曲肽乙酸盐在患者中的临床应用达到用不起的昂贵程度。在患有肢端肥大症的患者中，在UK治疗单个患者的费用为大约￡16,000/年。当奥曲肽乙酸盐用于患有恶性肿瘤(malignant carcinoid tumour)的患者中时，在UK治疗单个患者的费用为大约￡32,000/年。
[0026] 工业制备作为医药的肽的主要障碍是经济型的大规模制备。在奥曲肽乙酸盐和兰乐肽乙酸盐的制造中，需要逐步式的固相化学合成，然后形成分子内的二硫键。在分子内形成二硫键以便在D-Trp存在下将所述肽的代谢稳定性提高3倍是主要的问题。此外，在化学合成的过程中还需要对侧链进行保护。这些技术问题导致产量低至14％。固相合成奥曲肽乙酸盐的其他意想不到的困难包括：(i)C-末端Cys残基的外消旋作用；(ii)所述肽的无效组装；(iii)有害的副反应；(iv)残基上无效的二硫键的形成；(v)在二硫键形成的过程中D-Trp的修饰；(vi)通过氨解作用而形成的不完全的及无效的肽残基裂解；(vii)在片段偶联过程中的外消旋作用；以及(viii)复杂的纯化过程。此外，当(a)L-Phe需要被D-Phe所替代时；(b)L-Trp需要被D-Trp所替代时；(c)需要线性肽进行环化以创建二硫键、从而增加线性肽的稳定性时，基于化学肽的合成的费用大量增加。兰乐肽乙酸盐的固相合成也存在相似的意想不到的困难。
[0027] 因此，可选择地，需要更经济且更有效的合成小肽(例如奥曲肽乙酸盐和兰乐肽乙酸盐)的方法。在这一方面中，通常使用细菌和酵母菌中的重组DNA方法。此外，如果显示糖基化在蛋白质的生物学活性中不起作用，则在常规使用的宿主(E.coli)中实施蛋白质的制备具有相当大的成本和制造益处。已经通过所述的技术在E.coli中制备了许多重组蛋白质。
[0028] 然而，所述的系统使用重组DNA技术提供了高的蛋白质产率，但是对于极小的天然形成的肽而言，问题在于它们必须作为较大的融合蛋白质的一部分来制备。因此，天然形成的肽的基因与较大的载体蛋白质的基因相连，然后所述的融合蛋白质在诸如E.coli之类的宿主细胞中作为单个的大型蛋白质表达。在合成蛋白质之后，所关注的肽接着必须由所述的融合伴侣上切除。事实上，该方法的主要问题在于这种极小肽非常容易被在大多数微生物的细胞质中发现的酶而形成蛋白质降解(这是因为这种极小的尺寸阻止了它们形成高级的三级结构)。因此，小肽通常在制备它们的宿主细胞中并且在它们可以由细胞的其他细胞质成分中成功分离之前被快速降解。
[0029] 此外，其他的问题在于已经发现许多异源蛋白质(即，并非宿主细胞中天然产生的蛋白质)会干扰细菌/酵母菌的生长，这是由于所述宿主细胞中制备的大量的异源蛋白质所导致的毒性作用的原因。此外，这些外源肽产物在所述的宿主细胞中通常是不稳定的。这意味着当所述的肽作为融合蛋白质的一部分在微生物中表达时需要更多的努力来稳定所述肽的表达。这些问题在需要在微生物系统中表达极短的肽链时、甚至在所关注的肽序列作为较大融合蛋白质的一部分进行表达时是特别相关的。
[0030] 即使使用重组DNA技术来进行重组肽的制备可以在较大的范围内取得并且可以使得这种制备是经济的，但是制备成本有效的医药的问题由于由细菌/酵母菌裂解液中、然后由所述的融合蛋白质中分离和纯化极小肽的高成本而复杂化。对于由细菌或酵母菌中制备肽而言，这些下游加工步骤通常导致了大量的额外的制备成本。例如，由细菌或酵母菌细胞中初始回收所述的肽可能需要多个不同的加工步骤，包括细胞的崩解和裂解；由崩解的和裂解的细胞中分离包含体(即，聚集的，并由此形成不可溶的蛋白质)；使分裂的包含体溶解以获得可溶的融合蛋白质；以及融合蛋白质的裂解，然后由载体蛋白质上分离所述的肽。因此，理想的是制备极小的重组肽的所有方面都得到改善和优化，从而使大规模的成本有效的制备成为现实。
[0031] 此外，对于基于肽的医药，问题还在于取得有效的药品传递。在研发用于肽的控释药品传递系统中当使用基于聚合物的基质时重要且未充分解决的问题之一是在所述肽被引入到基于生物降解的聚合物的基质中之后该肽的稳定性。高度酸性的微环境(即，pH1.5)通常通过聚(乳酸)和聚(乳酸-co-乙醇酸)聚合物(通常在微球体中使用)的降解而在包含所述肽的微球体中产生。已知这种情况是引入到所述基质中的肽的不稳定性的主要来源。肽的不稳定性是由于聚(乳酸)和聚(乳酸-co-乙醇酸)微球体的降解所导致，其中所述的降解使得引入的肽通过所产生的乳酸和乙醇酸单元的酰化作用而被共价修饰。酰化作用减缓了肽由肌内集库注射位点的吸收速率。目前，在降解的聚(乳酸)和聚(乳酸-co-乙醇酸)微球体内的肽药品的酰化作用作为主要的障碍(就作为新型且高效的药品的、基于生物活性肽的药品的稳定、持久且成功传递而言，仍需要克服)而被许多专家关注(Werle M.et al.，Amino Acids，(2006)Vol.30；pp.351-367)。
[0032] 上述问题在一项研究中得到了阐明，其中所述的研究为在37℃下在不同浓度(42.5％、21.3％和8.5％，wt/wt)和pH值(分别为2.25、1.47和1.85)的3种乳酸溶液中调查奥曲肽乙酸盐的酰化反应(Na et al.，AAPS PharmSciTech.，2003，4(4)：article72)。在这种温育过程中，以时间依赖性和浓度依赖性的方式测量奥曲肽乙酸盐的酰化产物。在30天的温育之后，在42.5％的乳酸溶液(pH 2.25)中，所保留的完整的奥曲肽乙酸盐的量仅为起始材料的51％。这是不具有生物活性的酰化奥曲肽乙酸盐的量增加的结果。
[0033] 聚乙二醇化是使用缓释制备物的备选方法，其可以用于增加蛋白质或肽的稳定性和半衰期。聚乙二醇化的肽和蛋白质的治疗作用效果包括更好的物理和热稳定性、增长的循环半衰期、降低的免疫原性和抗原性、以及降低的毒性。与天然的肽和蛋白质对抗暴露于有机溶剂的情况相比，聚乙二醇化的肽和蛋白质还显示出更好的稳定性。此外，聚乙二醇化的蛋白质的微球体还表现出不同的药品释放概况，与未聚乙二醇化的肽和蛋白质的情况相比，所述的微球体的肽和蛋白质的初始突释减少。但是，到目前为止，这些基于聚乙二醇化的方法局限于分子量(MWt)大于10kDa的基于蛋白质的药品。此外，稳定性的重点主要在于改善蛋白质的物理稳定性，例如它们的团聚和变性。
[0034] 本发明人目前已经制备出编码新型肽(并非在自然界中天然存在的)的、可以用于制备该新型肽的多核苷酸。所述的肽保持了奥曲肽乙酸盐中由重要的4个氨基酸构成的三维结合位点结构。所述的肽可以在宿主细胞中经济地制得，并可以在工业范围内在较少的成本有效的步骤中由宿主细胞中分离得到。此外，所述的肽还可以进行少数的成本有效的其他化学修饰，从而较大程度地增强它们的化学和代谢稳定性，由此较大程度地增加它们在患者中的治疗效力。
[0036] 图1示出了化学合成的奥曲肽乙酸盐的结构。仅有环状的氨基酸(即，Phe-(D)Trp-Lys-Thr)与生长激素抑制素细胞表面的受体结合。
[0037] 图2示出了包含两个D-氨基酸的化学合成的奥曲肽乙酸盐(分子量为1018Da)的分子模型。经标记的氨基酸(即，Phe-(D)Trp-Lys-Th)与生长激素抑制素细胞表面的受体结合。
[0038] 图3示出了根据本发明的叠加在化学合成的奥曲肽乙酸盐(包含两个D-氨基酸)的分子模型上的、生物合成的奥曲肽(包含L氨基酸Phe-Cys-Phe-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr)的分子模型。较粗的灰色的线＝生物(均为L-氨基酸)合成的八肽；较细的黑色的线＝化学(两个D-氨基酸)合成的奥曲肽乙酸盐。
[0040] 图5示出了根据本发明的生物合成的奥曲肽的分子模型，随后其通过插入与聚乙二醇共价连接的3-碳桥而被化学修饰。聚乙二醇化的八肽的每个化学成分显示如下：(a)点线圆圈画出了受体的结合氨基酸Phe-Trp-Lys-Thr；(b)虚线形状画出了余下的氨基酸(即，Phe-Cys-二硫键-Cys-Th)；(c)实线形状画出了聚乙二醇。
[0041] 图6示出了根据本发明的生物合成的奥曲肽的分子模型，随后其通过插入跨越八肽的二硫键的3-碳桥(显示为CCC)而被化学修饰。聚乙二醇可以与3-碳桥以共价方式连接。
[0042] 图7示出了本发明的生物合成的八肽的柔韧性。采用已经公开的分子模型协议(Zloh et al.，(2007)Nature Protocols，Vol.2，pp.1070-1083)，表明具有氨基酸序列FCFWKTCT的生物合成的八肽表现出一定程度的柔韧性，该柔韧性可以通过记录在刺激期间主链原子的均方根偏差(RMSD)值来进行监测。RMSD值的范围为1-4.4A。这表明所述八肽的柔韧性没有通过3-碳桥连接聚乙二醇而变差。因此，这种二硫键位点特异性的聚乙二醇化的八肽会保留充分的柔韧性从而能够与其生物学靶物有效地相互作用。
[0043] 图8示出了根据本发明的具有氨基酸序列FCFWKTCT且包含L-氨基酸的生物合成的八肽的分子模型，随后其通过插入具有聚乙二醇(其以共价方式与3-碳桥连接)的3-碳桥而被化学修饰，并且所述的分子模型叠加在包含D-氨基酸的化学合成的奥曲肽乙酸盐的分子模型上。这两种结构为能量最低的构象体(即，最稳定的形式)，并且使用在Zloh et al.，(2007)Nature Protocols，Vol.2，pp.1070-1083中公开的相同的分子建模方法预测出这两种结构。较粗的灰色的线＝生物(均为L-氨基酸)合成的八肽；较细的黑色的线＝化学(两个D-氨基酸)合成的奥曲肽乙酸盐。
[0045] 图10示出了本发明的版本1的质粒载体，并示出了如实施例2所定义的质粒八肽的pGex4.3克隆5(包含与甲硫氨酸残基连接的谷胱甘肽转移酶，其中在甲硫氨酸残基之*后为编码插入的八肽的序列)和pGex4.3载体的核苷酸排列。八肽 ＝八肽FCFWKTCT和克隆序列。编码八肽FCFWKTCT的序列具有下划线。在得自GE LifeSciences的GST-融合系统手册中具有载体和pGex系统的描述，其中所述的GE LifeSciences的网址为http://www4.gelifesciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/87478CFA7E09E0C7C
1256EB400417E59/$file/l 8115758.pdf。
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[0046] 图11示出了用于克隆实施例3所定义的版本2的八肽质粒的氨基酸序列和核苷酸序列。其包括TEV识别位点。X＝除了脯氨酸以外的任何氨基酸。八肽FCFWKTCT及其编码序列具有下划线。
[0047] 图12示出了本发明的版本2的质粒载体。其示出了实施例3所定义的质粒八肽的pGex4.3以及编码八肽FCFWKTCT的、具有额外的TEV酶切位点序列的序列的核苷酸序列排列。编码八肽FCFWKTCT的序列具有下划线。TS8v2包含与TEV蛋白酶识别序列连接的谷胱甘肽转移酶，其中在TEV蛋白酶识别序列之后为插入的编码八肽的序列。
[0048] 图13示出了如实施例2所述的由编码SjGST-TM-八肽的质粒(版本1)所表达的蛋白质的SDS-PAGE凝胶电泳(泳道1：标志物；泳道2：作为全部的细菌裂解液的SjGST-TM-八肽；泳道3：流过谷胱甘肽琼脂糖柱的SjGST-TM-八肽；泳道4：作为单一种类的MWt为27kDa的、经洗涤的SjGST-TM-八肽蛋白质)。
[0049] 图14示出了如实施例3所述的由编码SjGST-TEV-八肽融合蛋白质(版本2)所表达的蛋白质的SDS-PAGE凝胶电泳。泳道1：分子量标志物；泳道2：得自诱导细胞的全部裂解液；泳道3：经洗涤的SjGST-TEV-八肽蛋白质(Mol Wt＝28.4kDa)。
[0050] 图15示出了实施例5所定义的化学合成的奥曲肽乙酸盐的基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation-Time Of Flight Mass Spectroscopy(MALDI-TOF-MS))分析。化学合成的奥曲肽乙酸盐的理论质量为+1018Da。发现化学合成的奥曲肽的试验质量为1019Da。化学合成的奥曲肽Na 的理论质量+
为1041Da。化学合成的奥曲肽Na 的理论质量为1041Da。
为1041Da。化学合成的奥曲肽Na 的理论质量为1041Da。
[0051] 图16示出了实施例6所定义的试验质量的SjGST-TM-八肽融合蛋白质版本1的分析。SjGST的理论质量为25498Da。加入到SjGST中的八肽的理论质量为2259Da。这样得到了SjGST-TM-八肽版本1融合蛋白质的结合理论质量为27757。发现SjGST-TM-八肽的试验质量为27751Da。质量误差百分率为0.02％。理论质量与试验质量之间的质量误差百分率为0.1％是可接受的。
[0052] 图17示出了如实施例7所定义的试验质量的SjGST蛋白质(版本1)在其被凝血酶切割之后的MALDI-TOF-MS分析。使用100mM DTT还原纯化的融合蛋白质溶液，并通过PD-10凝胶滤柱与包含2mM EDTA的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.8)进行缓冲液交换。然后在37℃下，在10mM的磷酸钠缓冲液(pH7.8)中，将融合蛋白质的溶液经过24小时的凝血酶消化。向该溶液中加入3mM DTT，以防止二硫键的错误形成。然后进行MALDI-TOF-MS分析。
SjGST-TM-八肽融合蛋白质版本1的理论质量为27757Da。SjGST蛋白质在其被凝血酶切割后的理论质量为26150Da。SjGST蛋白质在其被凝血酶切割后的试验质量为26153Da。质量误差百分率为0.01％。八肽在其被凝血酶切割后的理论质量为1607Da。八肽在其被凝血酶切割后的试验质量不能由这种特定的MALDI-TOF光谱确定，这是因为对于小MWt分子而言，其分辨率低-如图18所示。
SjGST-TM-八肽融合蛋白质版本1的理论质量为27757Da。SjGST蛋白质在其被凝血酶切割后的理论质量为26150Da。SjGST蛋白质在其被凝血酶切割后的试验质量为26153Da。质量误差百分率为0.01％。八肽在其被凝血酶切割后的理论质量为1607Da。八肽在其被凝血酶切割后的试验质量不能由这种特定的MALDI-TOF光谱确定，这是因为对于小MWt分子而言，其分辨率低-如图18所示。
[0053] 图18示出了实施例8所定义的经纯化的SjGST-TM-八肽融合蛋白质版本1通过溴化氰在甲硫氨酸处进行化学切割之后得到的具有本发明序列FCFWKTCT的八肽的MALDI-TOF-MS分析。使用100mM DTT还原纯化的融合蛋白质溶液，并通过PD-10凝胶滤柱与包含2mM EDTA的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.8)进行缓冲液交换。然后在37℃下，在10mM的磷酸钠缓冲液(pH7.8)中，将所述溶液在与八肽紧密相连的甲硫氨酸残基处进行溴化氰(即，化学)介导的切割，并持续24小时。向所得溶液中加入3mM DTT，以防止二硫键的错误形成。然后进行MALDI-TOF-MS分析。八肽的理论质量为1035Da。生物合成的八肽在其由甲硫氨酸处被化学切割之后的试验质量为1034Da。质量误差百分率为0.09％。化学合成的奥曲肽乙酸盐与生物合成的八肽FCFWKTCT之间的试验质量差异为16Da。这是因为奥曲肽乙酸盐经过化学修饰而具有L-苏氨醇作为其C末端残基。在生物学八肽FCFWKTCT的情况下，天然形成的氨基酸L-苏氨酸作为C末端残基存在。
[0054] 图19示出了如实施例9所述的在具有乳糖的E.coli中SjGST-TEV-八肽融合蛋白质(版本2)的反应自诱导及其由包含体中的纯化。泳道1：MWt标志物；泳道2：得自E.coli诱导细胞的全部裂解液；泳道3：E.coli细胞裂解液在其经历超声处理之后得到的上清液；泳道4：所述的细胞团在使用2M脲和100mM Tris pH12.5处理后得到的上清液；泳道5：所述的细胞团在使用2M脲和100mM Tris pH12.5处理、然后用HCl将pH调节至8后得到的上清液；泳道6：由E.coli细胞在2M脲以及100mM Tris pH12.5中裂解、然后用HCl将pH调节至8后剩余得到的细胞团。在各泳道中，在17kDa处所见的蛋白质条带是加入用于消化细胞的溶菌酶。
[0055] 图20示出了实施例10所述的化学合成的奥曲肽乙酸盐的三碳桥聚乙二醇化。为了进行比较，奥曲肽乙酸盐的MALDI-TOF-MS光谱示于图15中。在图20中，显示化学合成的奥曲肽乙酸盐通过跨越所述肽的二硫键的三碳桥而与5kDa聚乙二醇共价连接。聚乙二醇化的奥曲肽乙酸盐的理论质量为6092Da(即，聚乙二醇为5073+奥曲肽乙酸盐为1019)。聚乙二醇的试验MWt为5073Da。聚乙二醇化的奥曲肽乙酸盐的试验MWt为6097Da。质量误差百分率为0.08％。
[0056] 图21如实施例11所述采用SDS-PAGE证明了SjGST-TM-八肽融合蛋白质(版本1)通过化学插入三碳桥(聚乙二醇以共价方式与其连接)而进行的修饰。泳道1：MWt标志物；泳道2：理论MWt为27757Da的经纯化的SjGST-TM-八肽(版本1)；泳道3：在4℃下
5Da聚乙二醇与SjGST-TM-OCT之间的二硫键位点特异性的桥接反应(持续72小时)、然后在37℃下使用凝血酶消化24小时。在27.7kDa处的SjGST-TM-八肽蛋白质条带消失，并且出现了单聚乙二醇化的蛋白质条带(即，所述肽的二硫键的单聚乙二醇化)、二聚乙二醇化的蛋白质条带(即，所述肽的二硫键的单聚乙二醇化以及在GST中二硫键的单聚乙二醇化)以及三聚乙二醇化的蛋白质条带(即，所述肽的二硫键的单聚乙二醇化以及在GST中两个二硫键的二聚乙二醇化)；泳道4：在反应缓冲液中5kDa聚乙二醇反应物(3当量浓度)的二硫键位点特异性的桥接。
5Da聚乙二醇与SjGST-TM-OCT之间的二硫键位点特异性的桥接反应(持续72小时)、然后在37℃下使用凝血酶消化24小时。在27.7kDa处的SjGST-TM-八肽蛋白质条带消失，并且出现了单聚乙二醇化的蛋白质条带(即，所述肽的二硫键的单聚乙二醇化)、二聚乙二醇化的蛋白质条带(即，所述肽的二硫键的单聚乙二醇化以及在GST中二硫键的单聚乙二醇化)以及三聚乙二醇化的蛋白质条带(即，所述肽的二硫键的单聚乙二醇化以及在GST中两个二硫键的二聚乙二醇化)；泳道4：在反应缓冲液中5kDa聚乙二醇反应物(3当量浓度)的二硫键位点特异性的桥接。
[0057] 图22如实施例12所述采用MALDI-TOF-MS证明了SjGST-TM-八肽(版本1)融合蛋白质通过化学插入三碳桥(聚乙二醇以共价方式与其连接)而进行的修饰。该图示出了凝血酶狡猾的二硫键位点特异性的聚乙二醇化SjGST-TM-八肽(版本1)蛋白质溶液的MALDI-TOF-MS。SjGST-TM-八肽(版本1)融合蛋白质的理论质量为27757Da。凝血酶切割的SjGST大片段的理论质量为26150Da。使用凝血酶的理论小切割产物为1607Da的片段。这意味着与八肽(1607Da)连接的聚乙二醇(5073Da)的理论质量＝6680Da。与八肽连接的聚乙二醇的试验质量为6692Da。质量误差百分率为0.1％。
[0058] 图23示出了本发明的肽的三个实例(与化学合成的奥曲肽乙酸盐相比)在减少BALB/C小鼠的血清生长激素(GH)水平中的作用。图23A示出了小鼠GH的水平(ng/ml)。图23B示出了与化学合成的奥曲肽乙酸盐相比GH的抑制百分率。
[0059] 在第一个方面中，本发明提供了由氨基酸序列X1CX2WKX3CT构成的经分离的肽，其中X1为F或A，X2为F或Y，而X3为T或V，它们可以为任意的组合或置换，并且其中每一个氨基酸均为L-构型，而且所述的肽在两个半胱氨酸残基之间包含二硫键。因此，本发明的肽可以具有以下氨基酸序列的任意一种：FCFWKTCT、FCFWKVCT、FCYWKTCT、FCYWKVCT、ACFWKTCT、ACFWKVCT、ACYWKTCT或ACYWKVCT。优选的是，本发明的肽由氨基酸序列FCFWKTCT或ACYWKVCT构成。
[0060] 在本文中使用标准的单字母或三字母氨基酸密码来定义氨基酸序列，其中G＝甘氨酸(GIy)、P＝脯氨酸(Pro)、A＝丙氨酸(Ala)、V＝缬氨酸(Val)、L＝亮氨酸(Leu)、I＝异亮氨酸(He)、M＝甲硫氨酸(Met)、C＝半胱氨酸(Cys)、F＝苯丙氨酸(Phe)、Y＝酪氨酸(Tyr)、W＝色氨酸(Trp)、H＝组氨酸(His)、K＝赖氨酸(Lys)、R＝精氨酸(Arg)、Q＝谷氨酰胺(Gln)、N＝天冬酰胺(Asn)、E＝谷氨酸(GIu)、D＝天冬氨酸Asp)、S＝丝氨酸(Ser)和T＝苏氨酸(Thr)。
[0061] 用于各氨基酸的DNA密码子如表1所示：
[0062] 表1
[0063]氨基酸 SLC DNA密码子
异亮氨酸 I ATT，ATC，ATA
亮氨酸 L CTT，CTC，CTA，CTG，TTA，TTG
缬氨酸 V GTT，GTC，GTA，GTG
苯丙氨酸 F TTT，TTC
甲硫氨酸 M ATG
半胱氨酸 C TGT，TGC
丙氨酸 A GCT，GCC，GCA，GCG
甘氨酸 G GGT，GGC，GGA，GGG
脯氨酸 P CCT，CCC，CCA，CCG
苏氨酸 T ACT，ACC，ACA，ACG
丝氨酸 S TCT，TCC，TCA，TCG，AGT，AGC
酪氨酸 Y TAT，TAC
色氨酸 W TGG
谷氨酰胺 Q CAA，CAG
天冬氨酸 N AAT，AAC
组氨酸 H CAT，CAC
谷氨酸 E GAA，GAG
天冬氨酸 D GAT，GAC
赖氨酸 K AAA，AAG
精氨酸 R CGT，CGC，CGA，CGG，AGA，AGG
终止密码子 终止 TAA，TAG，TGA
异亮氨酸 I ATT，ATC，ATA
亮氨酸 L CTT，CTC，CTA，CTG，TTA，TTG
缬氨酸 V GTT，GTC，GTA，GTG
苯丙氨酸 F TTT，TTC
甲硫氨酸 M ATG
半胱氨酸 C TGT，TGC
丙氨酸 A GCT，GCC，GCA，GCG
甘氨酸 G GGT，GGC，GGA，GGG
脯氨酸 P CCT，CCC，CCA，CCG
苏氨酸 T ACT，ACC，ACA，ACG
丝氨酸 S TCT，TCC，TCA，TCG，AGT，AGC
酪氨酸 Y TAT，TAC
色氨酸 W TGG
谷氨酰胺 Q CAA，CAG
天冬氨酸 N AAT，AAC
组氨酸 H CAT，CAC
谷氨酸 E GAA，GAG
天冬氨酸 D GAT，GAC
赖氨酸 K AAA，AAG
精氨酸 R CGT，CGC，CGA，CGG，AGA，AGG
终止密码子 终止 TAA，TAG，TGA
[0064] 本发明的经分离的肽保持了与化学合成的奥曲肽乙酸盐相同的三维结合位点结构，由此保持了与化学合成的奥曲肽乙酸盐相同的活性，其中在所述的肽中，每个氨基酸都以L-构型的形式(与D-构型相反)存在并且所述的肽在两个半胱氨酸残基之间都包含二硫键。奥曲肽乙酸盐包含D-Phe1和D-Trp4残基而兰乐肽乙酸盐包含D-Ala1和D-Trp4残基，然而本发明的肽完全由L-对映体构成。
[0065] 本发明的肽可以包含末端化学修饰。这种修饰可以通过例如由蛋白酶进行降解而降低所述肽的敏感性来增加其稳定性。
[0066] 本发明的肽FCFWKTCT的分子建模显示，该肽的预测的三维化学结构不能有效地与化学合成的奥曲肽乙酸盐相区分。如图3所示，所述肽FCFWKTCT中的氨基酸的相对位置位于与化学合成的奥曲肽乙酸盐的氨基酸相同的位置处。最重要的是，Phe3、Trp4、Lys5和Thr6在本发明的肽中与它们在奥曲肽乙酸盐中具有相同的相对位置。虽然赖氨酸5显示出不同的趋向，但是它的线性性质意味着它在溶液中具有极好的柔韧性。这意味着就赖氨酸5而言，图3中所述的两个位置之间的差异不具有生物学意义。已知图3中标记的氨基酸对于奥曲肽的生物学活性而言是必需的；它们负责奥曲肽乙酸盐与其细胞表面的受体相结合。因此，本发明的所述肽FCFWKTCT具有与奥曲肽乙酸盐相同的三维化学结合位点性质，并且分子建模研究预测本发明的所述肽FCFWKTCT在生物学系统中以相同的方式起作用。同样通过分子建模研究预测本发明的各种所述肽的三维构型均保留了奥曲肽乙酸盐和兰乐肽乙酸盐的相同的三维化学结合位点的性质。
[0067] 优选的是，通过使编码所述肽的多核苷酸在生物学宿主中表达来制得本发明的肽，因此取决于产生所述肽的生物学有机体蛋白质表达系统。因此，与用于产生奥曲肽乙酸盐或兰乐肽乙酸盐的化学合成方法相比，优选的是所述的肽是生物合成的。此外，本发明的肽的生物合成还可以使得两个半胱氨酸之间的二硫键自发形成。因此，在另一个方面中，本发明提供了编码本发明的肽的多核苷酸。优选的是所述的多核苷酸编码了与天然激素生长激素抑制素的其他氨基酸相分离的本发明八肽的8个氨基酸。因此，编码生长激素抑制素的天然基因组DNA由本发明的范围内排除。可以使用能够表达所述肽的任何生物学宿主。合适的宿主是本领域已知的，包括细菌、酵母菌、昆虫细胞和动物细胞。
[0068] 编码本发明的肽的多核苷酸可以为DNA或RNA。因此，在本文中描述DNA序列之处，可以理解为可以使用等价的RNA序列。
[0069] 编 码 本 发 明 的 肽FCFWKTCT 的 多 核 苷 酸 包 含 核 心 核 苷 酸 序 列5′-TTYTGYTTYTGGAARACNTGYACN-3′，其中R＝A或G，并且其中N＝A、C、T或G，它们可以为任意的组合或置换。当所述的多核苷酸被引入到细菌中用于表达的载体中时，根据细菌中最普通的密码子的使用情况，优选的多核苷酸序列为5′TTC TGT TTT TGG AAA ACC TGT ACC 3′。16个编码肽FCFWKTCT的备选核苷酸序列的实例如表2所示，其中带有下划线的序列相当于最通用的细菌密码子。所述的多核苷酸可以包含表2所示的任意一个序列，但是不限于这些序列。当编码肽FCFWKTCT的多核苷酸在酵母菌宿主细胞中表达时，可以根据酵母菌中最通用的密码子的使用情况来选择优选的密码子。
[0070] 表2
[0071]
[0072] 编 码 肽 ACYWKVCT、FCFWKVCT、FCYWKTCT、FCYWKVCT、ACFWKTCT、ACFWKVCT 或ACYWKTCT中的任何一种的多核苷酸分别包含下表3-9所示的核心序列。在表3-9所示的核心序列中，Y＝C或T，R＝A或G，而N＝A、C、T或G，它们可以为任意的组合或置换。16个编码各种肽的备选核苷酸序列的实例如表3-9所示，其中带有下划线的序列相当于最通用的细菌密码子。本发明的多核苷酸可以包含表3-9中所示的任何一种序列，但是不限于这些序列。当所述的多核苷酸在酵母菌宿主细胞中表达时，可以根据酵母菌中最通用的密码子的使用情况来选择优选的密码子。
[0073] 表3(对肽ACYWKVCT而言)
[0074]
[0075] 表4(对于肽FCFWKVCT而言)
[0076]
[0077] 表5(对于肽FCYWKTCT而言)
[0078]
[0079] 表6(对于肽FCYWKVCT而言)
[0080]
[0081] 表7(对于肽ACFWKTCT而言)
[0082]
[0083] 表8(对于肽ACFWKVCT而言)
[0084]
[0085] 表9(对于肽ACYWKTCT而言)
[0086]
[0087] 编码本发明的肽的多核苷酸可以被引入到用于转染到宿主细胞中的核苷酸载体中。所述的载体可以为DNA或RNA载体。该载体可以为质粒载体。优选的是，所述的载体包含与编码本发明的肽的多核苷酸可操作地连接的启动子序列。合适的核苷酸载体包括购得的质粒载体，例如pGex4.3(GE Healthcare)以及表3中所示的其他代表性实例。此外，还可以使用在Hosfield T et al.，(1998)Biotechniques，Vol.25，pp.306-309，di Guan et al.，(1988)，Gene，67；21-30或Makrides(1996)，Microbiol Rev.，Vol.60；512-538中描述的任意一种载体。
[0088] 因此，本发明提供了编码本发明的肽的表达载体。可以在本发明中使用的购得的表达系统的实例如表10所示，但是不限于这些实例。
[0089] 表10
[0090]
[0091] 优选的是，本发明的肽作为融合蛋白质的一部分被表达出来从而简化了由宿主细胞中的分离过程。融合蛋白质为包含本发明的肽以及一种或多种载体蛋白质的单个多肽。所述的载体蛋白质可以为能够由表达系统(其中产生了融合蛋白质)中分离出来的任何蛋白质。
[0092] 包含本发明的肽的融合蛋白质可以包含可以检测并由宿主细胞中分离出来的任何载体蛋白质。优选的是，所述的载体蛋白质为异源蛋白质(即，在宿主细胞中不能天然产生的蛋白质)。所述的载体蛋白质可以起到分子标记的作用，从而允许分离出本发明的肽。例如，所述的融合蛋白质可以包含任何购得的蛋白质标记(作为载体蛋白质)，例如谷胱甘肽-S-转移酶(GST)(GE Healthcare)、聚组氨酸标记的蛋白质(Clontech)、麦芽糖结合蛋白质(New England Biolab)、生物素化的融合蛋白质(Promega)、钙调蛋白结合肽(Stratagene)、β-内酰胺酶(Gelantis)以及本领域已知的其他物质。此外，还包括赋予融合蛋白质(例如可以引入到C末端的聚精氨酸)以离子电荷、从而能够使融合蛋白质通过离子交换色谱进行纯化然后再用合适的酶(例如就聚精氨酸而言为羧肽酶B)进行消化的任何蛋白质(Fuchs SM&Raines RT，(2005)Protein Science Vol.14；pp 1538-1544)。
[0093] 因此，在另一个方面，本发明提供了包含本发明的肽以及一种或多种载体蛋白质的融合蛋白质。本发明还提供了编码融合蛋白质的多核苷酸，其中所述的融合蛋白质包含本发明的肽以及载体蛋白质。编码本发明的融合蛋白质的多核苷酸可以被引入到本文所述的任何载体中。编码所述载体蛋白质的核苷酸序列在框架中可以位于如上文所述的核心核苷酸序列(或者编码本发明的肽的任何其他序列)的5′末端的紧密相邻上游，或者可以位于所述核心序列的紧密相邻的下游。可选择地，编码所述融合蛋白质的核苷酸序列还编码了所述肽与载体蛋白质之间的间隔区域。该间隔区域可以在所述肽与载体蛋白质之间提供充分的空间，从而使得载体蛋白质可以正确的折叠。
[0094] 此外，所述的间隔区域可以编码一种或多种切割位点(例如一种或多种酶或化学切割位点)，从而能够在表达出融合蛋白质之后将所述的肽与载体蛋白质分离开。可以引入到包含本发明的肽的融合蛋白质中的酶切割位点的实例包括蛋白酶识别序列，例如(a)TEV*蛋白质切割位点(Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-GlnX，其中X为除了脯氨酸以外的任何氨基酸，并* *
且 表示酶切割位点)；(b)肠激酶切割位点(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)；(c)因子Xa蛋白酶* *
切割位点(Ile-Glu/Asp-Gly-Arg)；(d)Arg-C蛋白酶切割位点(X-X-RX-X-)(其中X为除了脯氨酸以外的任何氨基酸，并且当该位点存在时，当所述肽被切割时在不具有任何其他N末端氨基酸的条件下所述肽的N末端的上游将会产生-Phe-Cys-Phe-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr序列)；(e)本领域已知的其他序列，例如用于得自烟草叶脉斑点病毒(TVMV)的蛋白酶、以及内含肽的切割位点。化学切割位点的合适的实例包括(a)用于通过溴化氰切割的甲硫氨酸；(b)用于通过甲酸切割的天冬氨酸；以及(c)本领域已知的其他切割位点。
且 表示酶切割位点)；(b)肠激酶切割位点(Asp-Asp-Asp-Asp-Lys)；(c)因子Xa蛋白酶* *
切割位点(Ile-Glu/Asp-Gly-Arg)；(d)Arg-C蛋白酶切割位点(X-X-RX-X-)(其中X为除了脯氨酸以外的任何氨基酸，并且当该位点存在时，当所述肽被切割时在不具有任何其他N末端氨基酸的条件下所述肽的N末端的上游将会产生-Phe-Cys-Phe-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr序列)；(e)本领域已知的其他序列，例如用于得自烟草叶脉斑点病毒(TVMV)的蛋白酶、以及内含肽的切割位点。化学切割位点的合适的实例包括(a)用于通过溴化氰切割的甲硫氨酸；(b)用于通过甲酸切割的天冬氨酸；以及(c)本领域已知的其他切割位点。
[0095] 用于上文所述的切割蛋白酶的识别序列的DNA密码子如表11所示。
[0096] 表11
[0097]
[0098] ●*其中X为任何氨基酸。
[0099] ●(Phe)(Cys)-其中Phe或Cys为优选的氨基酸。
[0100] 编码所述切割位点的核苷酸序列可以定位于编码本发明的肽的核心核苷酸序列5′的紧密相邻处。因此，核苷酸序列GARAAYTTATAYTTYCAR(编码TEV蛋白酶切割位点，其中Y＝C或T，并且其中R＝A或G，它们可以为任意的组合或置换)可以定位于编码本发明的肽的核心核苷酸序列5′的紧密相邻处。例如，编码肽FCFWKTCT和TEV蛋白酶切割位点的本发明的多核苷酸可以包含核心核苷酸序列5′-GARAAYTTATAYTTYCARTTYTGYTTYTGGAARACNTGYACN-3′，其中Y＝C或T，其中R＝A或G，并且其中N＝A、C、T或G，它们可以为任意的组合或置换。当所述的多核苷酸被引入到细菌中用于表达的载体中时，根据细菌中最通用的密码子的使用情况，优选的序列为5′GAA AAC CTG TAT TTT CAG TTC TGT TTT TGG AAA ACC TGT ACC 3′。当所述的蛋白质在酵母菌宿主中表达时，可以使用包含优选的酵母菌密码子的备选序列。编码所述融合蛋白质的肽部分的备选核苷酸序列的实例如表2-9中所示，其中带有下划线的序列相当于最通用的细菌密码子。编码本发明的融合蛋白质的多核苷酸可以包含表2-9中所示的任意一个序列，但是不限于这些序列。
[0101] 可以用于制备本发明的融合蛋白质的合适的表达和纯化系统包括购得的pET系统(Novagen)、Ni-NTA纯化系统(Qiagen)、pMAL蛋白质融合和纯化系统(New England TMBiolab)、PinPoint Xa蛋白质纯化系统(Promega)、CBP钙调蛋白结合肽亲和性标记系统TM
(Stratagene)、INTEIN 和INTEIN-TWIN系统(New England Biolab)、EndoproteinAce系统(Gelantis)等(例如参见表10)。
(Stratagene)、INTEIN 和INTEIN-TWIN系统(New England Biolab)、EndoproteinAce系统(Gelantis)等(例如参见表10)。
[0102] 自从1982年第一次化学合成的奥曲肽乙酸盐作为生长激素抑制素的生物学活性片段的构象稳定类似物以来，关于备选的生长激素抑制素类似物的研究完全集中在了备选的化学合成的肽片段上(Weckbecker，G.et al，(2003)Nature Reviews，Vol.2，pp.999-1017)。本发明的肽的生物学制备提供了制作肽的廉价的方法，其中所述的肽(1)在诸如E.Coli之类的宿主细胞中发生了二硫键的自发形成；(2)保留了奥曲肽乙酸盐的三维化学结构；(3)解决了基于奥曲肽乙酸盐的细胞的毒性问题(该毒性问题是犹豫D-氨基酸的存在，其损害了诸如E.Coli之类的有机物的生长(Meister，(1965)Biochemistry of the amino acids.New York Academic Press))；以及(4)允许在对E.Coli不具有毒性的包含体中制备所述的肽。因此，本发明能够以高产率且低成本来对所述的肽进行生物学制备。
[0103] 具体关于活体有机物中D-氨基酸的毒性作用，已经表明多个D-氨基酸(包括D-色氨酸)对E.coli是具有毒性的(Soutourina et al.，(2004)J.Biological Chemistry；VoI 279(41)：pp 42560-42565)。这是因为尽管在活体世界中可以找到D-氨基酸，但是核糖体蛋白质合成酶的选择性能够确保D-氨基酸不被引入到天然形成的多肽中。氨酰基-tRNA合成酶负责由天然形成的多肽中排除D-氨基酸的第一步。这是因为D-氨基酸导致通过三种不同的机制导致细胞毒性。D-氨基酸的细胞毒性的第一种机制是将D-氨基酸引入到多肽中会导致非功能蛋白质的形成。这由针对L-氨基酸的细胞蛋白质翻译机制的立体定向性所反应。在其中D-氨基酸被引入到基于12个氨基酸的肽中的试验中，证明了D-氨基酸的细胞毒性的第二种机制；表现为显著降低细胞生长和细胞增殖，其通过将tritrurn标记的胸苷引入到活体细胞中来测量(Hayry et al.，(1995)The FASEB journal，VoI 9；pp 1336-1344)。D-氨基酸的细胞毒性的第三种机制是过氧化物酶体D-氨基酸氧化酶(D-AAO)对于得自活体有机物的一些D-氨基酸的代谢和有效消除是重要的。这是因为D-AAO将D-氨基酸代谢为其相应的α酮酸和NH3。在该工艺中，辅酶黄素腺嘌呤二核甘酸由还原状态重新形成氧化状态会产生毒性过氧化氢，其转而会产生甚至更具有侵略性的反应性氧类物质。这些自由基会对细胞造成严重的损伤(Krug et al.，(2007)Am J.Physiol.Renal Physiol.VoI 293；pp F382-F390)。
[0104] 在另一个方面中，本发明提供了制备本发明的肽的方法，其包括将本发明的多核苷酸或载体引入到能够表达所述的多核苷酸或载体的宿主细胞中，并由所述的宿主细胞分离所述的肽。可以使用编码本发明的肽的多核苷酸或编码本发明的融合蛋白质的多核苷酸。在宿主细胞中制备本发明的肽可以确保每个氨基酸都以L-构型的形式提供。优选的是，如上文所述，所述的多核苷酸或载体包含编码融合蛋白质的核苷酸序列，其中所述的融合蛋白质包含本发明的肽以及载体蛋白质。因此，纯化本发明的肽的步骤优选的是包含由所述的宿主细胞中分离融合蛋白质，以及将所述的肽与融合蛋白质分离。
[0105] 可以简单地并由此以低成本地制备和分离本发明的肽和融合蛋白质。可以通过本领域的技术人员已知的任何方法将编码本发明的肽和融合蛋白质的多核苷酸或载体引入到合适的宿主细胞中。可以对宿主细胞的培养条件进行优化，从而制备出最高产率的肽或融合蛋白质。例如，lac启动子(tac、pac、rac)的衍生物是最强的细菌启动子之一，它们中的任意一者都可以在本发明的载体中使用。它们都可以多次用于E.coli中外源基因的诱导过表达。但是，它们在工业发酵过程中的使用受到了高成本的诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)的限制。适用于在本发明的方法中使用的大规模的培养系统可以将乳糖用作诱导剂，这是因为乳糖能够以与IPTG相同的效率诱导本发明的载体。在E.coli中，乳糖可以被用作诱导剂，并且即使在葡萄糖存在下，乳糖也可以用作碳源/能源 (Neubauer P.et al.，(1994)FEMS Microbiol Rev.Vol.14；pp.99-102；Vasala A.et al.，(2005)J.Biotechnol.Vol.117；pp.421-431)。这种低成本的方法可以与使用了改进的培养基和改进的生长条件的自诱导相结合(Studier FW.，(2005)Protein Expression and Purification Vol.41；pp.207-234)。实施例9中给出了使用E.coli和乳糖来对SjGST-TEV-奥曲肽融合蛋白质(版本2)进行高产率低成本的自诱导、随后由E.coli中的包含体中分离融合蛋白质的实例，并且该实例如图19所示。
[0106] 在所述的肽或融合蛋白质表达之后，可以可任选地进行所述肽或融合蛋白质的化学修饰，以便改善所述肽的稳定性以及简化分离所述肽的方法。
[0107] 然后，可以通过本领域已知的方法由所述的宿主细胞成分中分离出所述的肽。当所述的肽作为融合蛋白质的一部分表达时，可以通过本领域已知的方法由所述的融合蛋白质中分离出所述的肽。特别注意的是由包含体中分离蛋白质，这是因为该过程提供了相当大的制造和经济工艺的益处。这些益处是：(a)表达出高水平的蛋白质，当这些蛋白质以可溶性蛋白质的形式大量存在时其可能对宿主细胞是毒性的，但是当这些蛋白质存在于包含体中时，其是非毒性的；(b)可以容易地由细胞中分离出包含体，这是因为包含体的尺寸和密度与细胞污染物不同；(c)减少表达蛋白质的降解，这是由于其对细胞蛋白酶的蛋白质水解的攻击具有抗性；以及(d)所关注的蛋白质在包含体中具有同质性，这是因为污染物较少。
[0108] 简单地洗涤包含体会除去杂质，并进一步改善天然蛋白质的产率。这些益处使得在E.coli中以包含体的形式表达重组蛋白质(以用于商业化的制备蛋白质)得到广泛的发展。在由包含体中回收生物活性的蛋白质的过程中，必须确保蛋白质聚集体充分溶解，以及溶解的蛋白质随后折叠形成生物活性形式。已经表明，包含体的蛋白质以折叠途径中的中间阶段的形式存在，并且表明这些蛋白质具有相当大量的二级结构。如果得自包含体的蛋白质可以在不干扰其天然存在样的二级结构的条件下溶解，则在再次折叠的过程中蛋白质聚集的程度是低的，并且生物活性蛋白质的回收率较高。因此，在不产生无规则卷曲的蛋白质结构的条件下包含体聚集体的温和溶解对于生物活性蛋白质的回收率的改善是重要的。一种方法涉及在远离蛋白质的等电点的条件下对蛋白质聚集体进行pH冲剂。在较低浓度的变性剂存在的条件下，上述方法使得蛋白质溶解。一旦包含体蛋白质在这些温和的条件下溶解时，纯化蛋白质的随后的再次折叠是更容易的，并且使得生物活性蛋白质的回收率更高。就这一方面而言，已经表明，2M脲不能使蛋白质的结构解折叠，并且其还可以保持所述蛋白质的天然二级结构(Rathore A.S.et al.，(2003)Biotechnology Progress Vol.19；pp.1541-1546；Lee Y.S.et al.，(2003)，Biotechnology&Applied Biochemistry Vol.38；pp.9-13；DeNardo，SJ.et al.，(2003)Clinical Cancer Research Vol.9；pp.3854s-3864s；Pezza J.A.et al.，(2004)Chemical Communications pp.2412-2413；
Singh S.R.&Panda AK.(2005)Journal of Bioscience and Bioengineering.Vol.99；
pp.303-310；Rajan R.S.et al.，(2006)Protein Science Vol.15；pp.1063-1075；Wang F.et al.，(2008)Nuclear Medicine and Biology Vol.35；pp.665-671)。因此，制备本发明的肽的方法可以包含由宿主细胞的包含体中分离出本发明的肽或本发明的融合蛋白质。
Singh S.R.&Panda AK.(2005)Journal of Bioscience and Bioengineering.Vol.99；
pp.303-310；Rajan R.S.et al.，(2006)Protein Science Vol.15；pp.1063-1075；Wang F.et al.，(2008)Nuclear Medicine and Biology Vol.35；pp.665-671)。因此，制备本发明的肽的方法可以包含由宿主细胞的包含体中分离出本发明的肽或本发明的融合蛋白质。
[0109] 此外，可以通过使用固相再折叠工艺(整合有扩展床吸附色谱)来避免传统的溶液相再折叠过程中蛋白质聚集的问题。其结果是在得自细胞均浆的包含体中高产率的蛋白质能够正确折叠(Cho T.H.et al.，(2002)Bioseparation Vol.10，pp.189-196)。这种情况已经在E.coli中制备的人类表皮生长因子中得到证实。扩展床吸附色谱通过阳离子交换同时捕获了所述的蛋白质，并除去了稀释的培养肉汤中的细胞生物质。此外，可以以高的制备量实施所述的方法，从而得到高的产率(＞90％)，并得到20倍的纯化因子，其纯度高于80％。这种蛋白质纯化工艺是高效的，并且可以实施用于大规模且成本有效地制造(例如)本发明的肽(Lee Y.S.et al.，(2003)，Biotechnology&Applied Biochemistry Vol.38；
pp.9-13)。
pp.9-13)。
[0110] 在分离出融合蛋白质和/或化学修饰的融合蛋白质之后，可以通过酶或化学切割位点进行切割。例如，可以使用组氨酸标记的TEV酶对包含TEV酶切割位点的融合蛋白质进行位点特异性切割。可以通过流经镍琼脂糖柱除去组氨酸标记的TEV蛋白酶来纯化所述的肽。谷胱甘肽琼脂糖和镍琼脂糖柱的再生使它们能够再次使用。各方法的单个步骤的全部细节是本领域的技术人员所公知的(Structural Genomics Consortium et al.，(2008)Nature Methods，Vol.5(2)，pp.135-146)。
[0111] 如上文所述，可以对本发明的肽进行化学修饰，从而改善其稳定性，由此延长所述肽的半衰期并改善它们的治疗效力。这种修饰使得所述的肽特别适用于成本有效的治疗产品，其能够用作适于在一年或多年的内使用的长期治疗方法。本发明的修饰肽的改善的效力使得其特别适用于在较长的时间间隔内(长于用于给药奥曲肽乙酸盐或兰乐肽乙酸盐所允许的当前的给药规则)对患者进行给药。
[0112] 例如，可以通过例如下文中详细描述的二硫键位点特异性聚乙二醇化的方法使所述的肽和/或融合蛋白质聚乙二醇化：Shaunak et al.，(2006)Nature Chemical Biology.Vol.2，pp.312-313；Zloh et al.，(2006)Physical Chemistry.，Vol.F-3-O，pp.347-349；Brocchini et al.，(2006)Nature Protocols，Vol.1(5)，pp.2241-2252；Balan et al.，(2007)Bioconjugate Chemistry，Vol.18，pp.61-76；Godwin et al.，(2007)Theoretical Chemical Accounts，Vol.117，pp.259-265；Zloh et al.，(2007)Nature Protocols，Vol.2，pp.1070-1083；Brocchini et al.，(2008)，Advanced Drug Delivery Reviews，Vol.60(1)，pp.3-12。所述的聚乙二醇的大小可以为5kDa至40kDa。优选的大小为20kDa至30kDa。
[0113] 小蛋白质和肽往往比大蛋白质具有更多的二硫键，这是因为前者需要补偿它们相对低量的疏水作用。当溶剂可及的二硫键通常存在于大部分的蛋白质中时，可以将这种二硫键化学还原成两个游离的半胱氨酸硫原子，并且仍保持蛋白质或肽的三级结构。然后，可以通过二烷基化完成聚乙二醇化，从而使得两个半胱氨酸的硫原子通过3-碳桥再连接。这种方法的益处在于可以开发出选择性且高效的巯醇加成化学而无需对所述的蛋白质进行重组基因工程操作以引入游离的半胱氨酸(其增大了蛋白质或肽的不溶性)。更具体而言，这种方法学方法开发出了在所有天然形成的二硫键中两个硫原子的化学反应性。
[0114] 在两个半胱氨酸残基的两个硫原子之间插入三碳桥的预备步骤创造了这样的修饰肽，该肽具有(a)增加的稳定性的特别益处；以及(b)提供随后进一步修饰三碳桥的可能性。
[0115] 因此，本发明提供了由氨基酸序列X1CX2WKX3CT构成的经分离的肽，其中X1为F或A，X2为F或Y，而X3为T或V，它们可以为任意的组合或置换，并且其中每一个氨基酸均为L-构型，而且其中所述的两个半胱氨酸残基的两个硫原子通过三个碳原子连接。因此，所述的肽可以具有以下氨基酸序列的任意一种：FCFWKTCT、FCFWKVCT、FCYWKTCT、FCYWKVCT、ACFWKTCT、ACFWKVCT、ACYWKTCT或ACYWKVCT。优选的是，所述的肽由氨基酸序列FCFWKTCT或ACYWKVCT构成。因此，在本发明的肽中的两个半胱氨酸残基之间存在有稳定的相互作用。进一步的稳定的相互作用可以为(例如)通过插入三碳桥的二硫键的修饰。
[0116] 本发明实施的分子建模研究表明，在两个半胱氨酸残基的两个硫原子之间包含三个碳原子的肽FCFWKTCT保持了与化学合成的奥曲肽乙酸盐及其相似的三维构造(参见图6)。因此，所述的肽还可以与本文所述的、本发明的未经修饰的生物合成肽用于相同的用途(特别是医药用途)中。相似地，通过分子建模研究预测在两个半胱氨酸残基的两个硫原子之间包含三个碳原子的本发明各肽的三维构型保持了与奥曲肽乙酸盐或兰乐肽乙酸盐相同的三维化学结合位点性质。因此，这种肽保持了与奥曲肽乙酸盐或兰乐肽乙酸盐相同的活性。
[0117] 诸如聚乙二醇分子之类的亲水性聚合物可以以共价方式与三碳桥连接。优选的是，聚乙二醇分子的分子量为5kDa至50kDa，更优选的是聚乙二醇的分子量为10kDa至40kDa，最优选的是聚乙二醇的分子量为20kDa至30kDa。可选择地，本领域的技术人员已知的除了聚乙二醇以外的亲水性聚合物可以以共价方式与三碳桥连接。
[0118] 聚乙二醇化的反应物优选的是具有取代的丙烯基作为聚乙二醇反应物末端的共轭部分。该共轭部分可以包含吸电子基团(例如羰基)，α、β-不饱和双键，以及倾向于消除亚磺酸的α、β-磺酰基。吸电子基团促进了巯醇的加成，并降低α-质子的pKa使得消除反应可以进行。化学功能性的并列得到潜在的交叉共轭系统。在聚乙二醇单砜中的共轭双键初始形成了相互反应的且依次的加成-消除反应的序列。第一硫醇盐的加成反应可以消除亚磺酸衍生物。这在α、β’-位置处形成了另一个用于加成第二硫醇盐的共轭双键。如果两个硫醇是由蛋白质二硫键衍生得到的，则在初始二硫化物的半胱氨酸硫原子之间形成3-碳桥。与初始生物合成的二硫键相比，这种新的3-碳二硫桥对于化学和代谢降解、以及蛋白水解降解而言甚至是更稳定的。
[0119] 可以在较少的步骤中以较低的成本实施本发明的制备聚乙二醇化的肽的方法。包含本发明的肽的融合蛋白质可以制备，并随后按照上文所述被聚乙二醇化。然后，可以通过使所述的溶液流经针对GST-融合蛋白质的离子交换柱、尺寸排阻柱或亲和柱(例如谷胱甘肽琼脂糖亲和纯化柱)来由未反应的聚乙二醇中纯化得到所述的融合蛋白质。在使用谷胱甘肽琼脂糖亲和纯化柱的情况下，所述的GST融合蛋白质成为与谷胱甘肽琼脂糖柱相结合。然后可以通过洗涤所述的柱来除去内毒素(例如50柱体积的包含0.1％Triton X-114的PBS，然后是20体积柱体积的PBS)。在洗涤缓冲液中稀释内毒素。优选的是，所有这些过程都在4℃的条件下实施。
[0120] 优选的是，与化学合成的奥曲肽乙酸盐的不同聚二乙醇化形式的混合物(其可以合成)相比，本发明的肽的聚乙二醇化使得单聚乙二醇化的肽得以形成。可以通过尺寸排阻色谱由较小的非聚乙二醇化的肽中分离得到聚二乙醇化的蛋白质。
[0121] 之前公开的著作表明，分子建模研究可以有效地与基于化学的试验相结合，从而可靠地预测化学合成的结果以及得自生物测试的示值读数；Shaunak et al.，(2006)Nature Chemical Biology.Vol.2，pp.312-313；Zloh et al.，(2006).Physical Chemistry.，Vol.F-3-O，pp.347-349；Brocchini et al.，(2006)Nature Protocols，Vol.1(5)，pp.2241-2252；Balan et al.，(2007)Bioconjugate Chemistry，Vol.18，pp.61-76；Godwin et al.，(2007)Theoretical Chemical Accounts，Vol.117，pp.259-265；Zloh et al.，(2007)Nature Protocols，Vol.2，pp.1070-1083；Brocchini et al.，(2008)，Advanced Drug Delivery Reviews，Vol.60(1)，pp.3-12。因此，建模研究可以可靠地预测将3-碳桥插入到蛋白质或肽的可及二硫键中的结构效果。已经研发出公开的方法来查询蛋白质数据库(例如Protein Data Bank，PDB-www.pdb.org)并找到具有至少一个二硫键的蛋白质，其中所述的二硫键与所述蛋白质的表面接近，并且可以对其进行化学修饰。此外，可以习惯于采用计算机来预测插入3-碳桥是否会导致蛋白质三级结构的损失。使用这种方法，可以精确地测定在插入3-碳桥之后蛋白质的生物学活性表面的变化，以及测定将聚乙二醇与3-碳桥连接对蛋白质生物学活性的影响。使用集成的分子建模软件包Maestro v6.5和Macromodel v9.1来进行本文所述的分子建模研究。
[0122] 之前已经表明，当聚乙二醇存在于溶液中时，由于聚乙二醇会与人类清蛋白发生消极的优先作用(negative preferential interaction)，所以它们会稳定人类清蛋白的天然的紧凑状态。当聚乙二醇分子与清蛋白之间的相互作用为热力学不利时(Farruggia et al.，(1999)，Int.J.Biol.MacromoL，Vol.26，pp.23-33)，聚乙二醇不会使蛋白质或肽的生物学活性表面变差。计算机技术已经证明聚乙二醇可以独立地使本发明的肽发生折叠。聚乙二醇分子本身不会“包裹”在蛋白质的周围(Zloh et al.，(2006)Proceedings of6thEuropean Conference on Computational Chemistry，Slovakia)。但是，由于本发明的肽与聚乙二醇之间显著的尺寸差异，本领域的技术人员认为聚乙二醇包围了所述肽，由此阻碍了所述肽的生物学活性。本发明人令人惊奇地表明，本发明的肽的聚乙二醇化不会阻碍所述肽的生物学活性。
[0123] 通常使用纯化的蛋白质来实施聚乙二醇化的工艺。这需要额外的多步纯化工艺来收获所需的聚乙二醇化的蛋白质。已经表明，如果在体外，蛋白质(特别是包含体蛋白质)的再折叠和聚乙二醇化可以整合，则对制造产物的生物加工是有利的。为了由包含体直接获得生物学活性和聚乙二醇化的蛋白质而将聚乙二醇化与蛋白质的复性工艺相整合会显著地改善下游的加工操作。这在聚乙二醇化的脂肪酶中已经得到了证实(Kim M.Y.et al.，(2007)Journal of Biotechnology Vol.131，pp.177-179；Choi W.C.et al.，(2005)Process Biochem.Vol.40，pp.1967-1972)。使用脲和DTT使脂肪酶变性，然后用聚乙二醇进行修饰。共轭聚乙二醇分子不会妨碍脂肪酶的再折叠。因此，可以将聚乙二醇化与蛋白质的再折叠工艺整合到单一的工艺步骤中。换言之，可以在单一的加工操作中使得自包含体的溶解蛋白质聚乙二醇化及再折叠。在本发明中可以采用相同的方法。因此，制备本发明的聚乙二醇化的肽的方法可以包括在宿主细胞中由包含体中分离出本发明的肽或融合蛋白质、随后进行聚乙二醇化的肽的聚乙二醇化和再折叠的结合处理。聚乙二醇与本发明的肽或融合蛋白质的共价连接具有其他的益处：相当大地增加所述肽或融合蛋白质的溶解度，并由此减少蛋白质聚集体的形成(Raj an RS.，(2006)Protein Science VoI：15；pp.1063-1075)。奥曲肽乙酸盐和兰乐肽乙酸盐的不溶性已经成为工业上产品制造的主要问题。
[0124] 在另一个方面中，本发明提供了用于医药中的本发明的肽或聚乙二醇化的肽。本发明的肽或聚乙二醇化的肽可以用于治疗激素紊乱，特别是由于生长激素过表达所导致的激素紊乱。可以使用本发明的肽或聚乙二醇化的肽来进行治疗的激素紊乱的实例包括肢端肥大症和巨人症(S.Farooqi et al.，(1999)Pituitary，Vol.2，pp.79-88；A.N.Paisley and PJ.Trainer，(2003)Current opinion in Pharmacology，Vol.3，pp.672-677；S.Melmed，(2006)New England Journal of Medicine，Vol.355，pp.2558-2573)。
[0125] 此外，本发明的肽或聚乙二醇化的肽可以用于治疗癌症，特别是治疗分泌消化道激素的癌症，例如消化道相关性的良性肿瘤以及转移性良性肿瘤。
[0126] 此外，本发明的肽或聚乙二醇化的肽还可以用于治疗其中奥曲肽乙酸盐或兰乐肽乙酸盐已经显示出具有治疗效果的任何疾病或状况。例如，本发明的肽或聚乙二醇化的肽可以用于治疗患有分泌血管活性肠肽的肿瘤(VIPomas)患者的腹泻，并且治疗由其他原因引起的严重的顽固性腹泻。此外，本发明的肽或聚乙二醇化的肽还可以用于治疗在过量使用磺酰脲类药物之后长期复发的低血糖症，以帮助降低患有胰岛细胞增殖症的婴儿的胰岛素过多分泌，并帮助减少患有疑似食管血管曲张的患者的出血。此外，本发明的肽或聚乙二醇化的肽还可以用于治疗伴有慢性胰腺炎所导致的疼痛的患者，治疗胸腺赘生物以及由糖尿病所导致的眼病(S.Farooqi et al.，(1999)Pituitary，Vol.2，pp.79-88；A.N.Paisley and PJ.Trainer，(2003)Current opinion in Pharmacology，Vol.3，pp.672-677；S.Melmed.(2006)New England Journal of Medicine，Vol.355，pp.2558-2573)。
[0127] 因此，本发明提供了本发明的肽或聚乙二醇化的肽以用于治疗激素紊乱(例如肢端肥大症和巨人症)；癌症(例如消化道相关性良性肿瘤和转移性良性肿瘤)；患有分泌血管活性肠肽的肿瘤患者的腹泻；严重的顽固性腹泻；在过量使用磺酰脲类药物之后长期复发的低血糖症；患有胰岛细胞增殖症的婴儿的胰岛素过多分泌；以及疑似食管血管曲张的患者的出血。
[0128] 放射性标记的生长激素抑制素类似物为用于生长激素抑制素受体闪烁扫描法的有用的诊断工具。它们可以用于检测并定位表达小SST的肿瘤从而在精确确定(pin pointing)早期及转移性良性肿瘤中特别有用。与靶向放射性疗法有关的毒性意味着并列研发领域目前正在研究放射性标记的生长激素抑制素类似物在治疗患有表达SST的肿瘤患者中的用途。在内分泌肿瘤的具体指示中，认为带有活跃同位素(例如钇90(OctreoTher )或镥)的新型化合物由于放射线的深度渗透而提供肿瘤的有效疗法。
此外，已经发现钇标记的化合物DOTATOC能够稳定60％患者的疾病，20％的患者具有客观的应答(Weckbecker，G.et al.，(2003)Nature Reviews，Vol.2，pp.999-1017；Susini C&Buscail L，(2006)Ann of Oncology Vol.17，pp.1733-1742；Asnacios A et al.(2008)J.Clin.Oncology Vol.26，pp.963-970)。此外，本发明还提供了用作肿瘤显示剂的本发明的肽或聚乙二醇化的肽。例如，诸如放射性标记的可检测标记可以连接在两个硫原子之间包含三碳桥的本发明的肽上，由此可以在所述肽与其受体结合的情况下在肿瘤的位点处检测标记的肽。所述的标记可以直接连接在三碳桥上，或者可以连接在聚乙二醇分子(其与三碳桥连接)上。此外，还可以使用除了放射性标记以外的其他本领域已知的可检测标记。
此外，已经发现钇标记的化合物DOTATOC能够稳定60％患者的疾病，20％的患者具有客观的应答(Weckbecker，G.et al.，(2003)Nature Reviews，Vol.2，pp.999-1017；Susini C&Buscail L，(2006)Ann of Oncology Vol.17，pp.1733-1742；Asnacios A et al.(2008)J.Clin.Oncology Vol.26，pp.963-970)。此外，本发明还提供了用作肿瘤显示剂的本发明的肽或聚乙二醇化的肽。例如，诸如放射性标记的可检测标记可以连接在两个硫原子之间包含三碳桥的本发明的肽上，由此可以在所述肽与其受体结合的情况下在肿瘤的位点处检测标记的肽。所述的标记可以直接连接在三碳桥上，或者可以连接在聚乙二醇分子(其与三碳桥连接)上。此外，还可以使用除了放射性标记以外的其他本领域已知的可检测标记。
[0129] 此外，本发明提供了本发明的肽或聚乙二醇化的肽在制造用于治疗以下疾病的药剂中的用途，其中所述的疾病为：激素紊乱(例如肢端肥大症和巨人症)；癌症(例如消化道相关性良性肿瘤和转移性良性肿瘤)；患有分泌血管活性肠肽的肿瘤患者的腹泻；严重的顽固性腹泻；在过量使用磺酰脲类药物之后长期复发的低血糖症；患有胰岛细胞增殖症的婴儿的胰岛素过多分泌；以及疑似食管血管曲张的患者的出血；以及由糖尿病所导致的眼病。
[0130] 此外，本发明提供了治疗患有上述任意一种紊乱的患者的方法，其包括向所述的患者给药本发明的肽或聚乙二醇化的肽。
[0131] 此外，本发明还提供了包含本发明的肽或聚乙二醇化的肽、以及可药用的载体或稀释剂的药物组合物。本发明的肽或聚乙二醇化形式的肽可以以可药用的盐(例如乙酸盐)的形式提供。根据所需的向患者给药的方法，所述的药物组合物可以为任何合适的形式。其可以以单位剂量的形式提供，通常以密封容器的形式提供，以及可以以试剂盒的一部分的形式提供。通常(但并非必须)，这种试剂盒包含使用说明书。其可以包含多个所述的单位剂量形式。所述的药物组合物可以配制成用于治疗上文所述的任意一种紊乱。建议治疗剂量可以为300-600μg/天或20mg/月，范围为2-200mg/月。所述的组合物可以每日给药、每周三次给药、每周一次给药、每两周一次给药或每月一次给药。
[0132] 所述的组合物可以适用于任何合适的给药途径，例如通过肠胃外途径(包括皮下、肌肉内、静脉内或真皮内)、经口途径(包括口腔或舍下)、吸入途径、直肠途径、经鼻途径或经皮途径。皮下给药途径是优选的。这种组合物可通过制药领域中已知的任何方法来制备，例如通过在无菌条件下将活性组分与载体或赋形剂混合。
[0133] 适用于肠胃外给药的药物组合物包括：水性和非水性无菌注射溶液，其可以包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和溶质，其使得所述的配制物与目标受试者的血液或阻止基本上是等渗的；以及水性或非水性无菌悬浮液，其可以包含悬浮剂和增稠剂。可用于可注射溶液的赋形剂包括例如水、醇、多元醇、甘油和植物油。所述的组合物可以存在于单位剂量或多剂量的容器中，例如密封的安瓿和小瓶，并且可以在冻干(低压冻干)的条件下存放，只需在使用之前即刻加入所携带的无菌液体(例如注射用水)。临时性的注射溶液和悬浮液可以由无菌粉末、颗粒和片来制备。
[0134] 适用于经口给药的药物组合物可以以下形式存在：离散的单位，例如胶囊或片；粉末或颗粒；溶液、浆料或悬浮液(水性或非水性液体；或者可食用的泡沫或肠线；或乳剂)。用于片剂或硬胶质胶囊的合适的赋形剂包括乳糖、玉米淀粉或其衍生物、硬脂酸或其盐。用于软胶质胶囊的合适的赋形剂包括例如植物油、蜡、脂肪、半固态或液肽的多元醇等。
就制备融合和浆料而言，可以使用的赋形剂包括例如水、多元醇和糖。就制备悬浮液而言，可以使用油(例如植物油)来提供水包油或油包水悬浮液。
就制备融合和浆料而言，可以使用的赋形剂包括例如水、多元醇和糖。就制备悬浮液而言，可以使用油(例如植物油)来提供水包油或油包水悬浮液。
[0135] 适用于经皮给药的药物组合物可以以离散的小块的形式存在，欲与受试者的皮肤保持紧密接触一段较长的时间。例如，活性组分可以如在Pharmaceutical Research，3(6)：318(1986)中通常所述的电离子渗入疗法由所述的小块上进行传递。
[0136] 在本发明的方法中使用的另一种配制物采用了经皮传递装置(“小块”)。可以使用这种经皮小块来使得本发明的肽或聚乙二醇化的肽以受控的量进行连续的或不连续的注入。用于传递药物试剂的经皮小块的构造和用途是本领域公知的。这种小块可以构造成连续的、脉动的或即刻(on demand)传递的药物试剂。
[0137] 另一种配制物使用了可生物降解的微球体，该微球体可以以受控的且持久的方式释放本发明的肽和聚乙二醇化的肽。这种配制物可以包括合成的聚合物或共聚物、或者水凝胶植入物。这种配制物可以进行注射、吸入、经鼻或经口给药。用于传递药物试剂的可生物降解的微球体的构造和用途是本领域公知的(例如美国专利No.6,706,289)。
[0138] 此外，将根据本发明的二硫键位点特异性聚乙二醇化的八肽引入到可生物降解的微球体中可以得到具有不同释放模式(例如初始突释的八肽减少，然后是持久稳定的且持续的药品释放)以及得自降解微球体中失活八肽的稳定性的极有效且高效的控释系统。
[0139] 对于适用于皮下、静脉内、肌肉内等给药的配制物而言，可以通过本领域中任何公知的方法来制备合适的药物载体、以及配置和给药技术(例如参见Remington′s thPharmaceutical Sciences，Mack Publishing Co.，Easton，Pa.，20 版，2000)。
[0140] 适用于直肠给药的药物组合物可以以栓剂或灌肠剂的形式存在。适用于经鼻给药的药物组合物(其中所述的载体为固体)包括粒径为20-500微米的粗糙的粉末，其可以以采取吸嗅的方式(即，由与鼻子近距离保持的粉末容器中通过鼻子通道快速吸入)进行给药。其中载体为液体的用于以鼻喷雾或鼻滴剂的方式进行给药的合适的组合物包括活性组分的水性或油性的溶液。适用于通过吸入方式给药的药物组合物包括细颗粒粉或薄雾，其可以通过多种类型的计量加压的气雾剂、喷雾剂或吸乳器方式产生。
[0142] 本发明的物质的剂量可以在广泛的限定范围内变化，这取决于待治疗的疾病或紊乱、带治疗的个体的年龄和状况等，并且医生会最终确定待使用的合适的剂量。所述的剂量可以适当频繁的重复。如果有副作用发生，则可以根据常规的临床实施规则来减少所述剂量的量和/或频率。
[0143] 此外，本发明还提供了用于治疗患有上文所述的任何一种紊乱的患者的方法，其包括向所述的患者给药本发明的药物组合物。
[0145] 现在，参照以下非限定性实例来进一步描述本发明。
[0146] 实施例1：本发明的肽的预测结构的分子建模
[0147] 已经公开的分子建模方法(Zloh et al.，(2007)Nature Protocols，Vol.2，pp.1070-1083)用于所述的这些研究。将PDB文件输入到Maestro中，并通过使用合适的连接体和10kDa聚乙二醇链插入到3-碳桥中来修饰所述的二硫键。使用Macromodel软件、OPLS-2005力场以及GB/SA隐溶剂模型将所述的模型最小化，并在300K下进行2皮秒的随机刺激。对结构快照的所得轨迹进行分析。其表明，生物合成的八肽不会被10kDa的PEG所包裹(参见图4和5)。重要的是，这意味着生物合成的八肽的生物活性表面仍然可以与其生物学受体相互作用。
[0148] 生物合成的八肽表现为可以通过记录在刺激过程期间主链的均方根偏差(RMSD)的值来进行监测的柔韧度(参见图6)。RMSD值的范围为1-4.4A(参见图7)。这表明，奥曲肽的柔韧性没有因为通过3-碳桥连接聚乙二醇而变差。因此，这种二硫键位点特异性的聚乙二醇化的八肽保持了能够与其生物学受体结合位点进行有效的相互作用的、充分的柔韧性。
[0149] 使用针对生物合成八肽和二硫键位点特异性聚乙二醇化的八肽的构造研究来详细评价聚乙二醇化对生物合成八肽的构造的影响。发现，即使两个硫原子之间的距离由2.04A(生物合成的八肽)增大至3.94A(二硫键位点特异性聚乙二醇化的八肽)，但是对于所述八肽的环状部分的主链而言，这两种肽的最低能量(即，最稳定)的构造是相似的，RMSD值为0.58A。此外，涉及二硫键位点特异性聚乙二醇化的八肽与其受体之间的相互作用的氨基酸的趋向是特别相似的(参见图8)。这表明，当连接有较大的聚乙二醇分子时，对于提供给生物学相关受体而言，所述八肽上的生物学相关表面仍是可用的。
[0150] 这些建模研究的结果表明，生物合成的八肽的二硫键上聚乙二醇分子的存在不会阻止该八肽与其受体结合位点的相互作用。
[0151] 实施例2：包含生物合成的八肽(版本1)的DNA序列的pGex4.3质粒的形成[0152] 所构建的第一质粒由其N-末端至其C-末端编码了以下成分：-具有Schisostoma japonicum(Sj)谷胱甘肽-S-转移酶(GST)+凝血酶切割位点(T)+甲硫氨酸(M)+八肽的载体。
[0153] 构建引入了与以下8个氨基酸相应的核苷酸的双链63bpDNA的序列：
[0154] (L)Phe-c[(L)Cys-(L)Phe-(L)Trp-(L)Lys-(L)Thr-(L)Cys]-(L)Thr(COOH)[0155] 其还包含EcoR1和Xho1限制性酶切位点的识别序列。这使得其具有相容性，从而克隆到pGex4.3融合蛋白质载体中。构建所述的质粒。
[0156] 所述的DNA序列是基于最通用的细菌氨基酸密码子的使用情况。可以使用备选的DNA序列，例如如上文所述的那些。此外，在八肽DNA序列的5′末端，插入Met序列，从而可以促进氨基酸被溴化氰所切割。在DNA序列的3′末端，具有2个串联的终止密码子。
[0157] 图9所示的6个碱基对的八肽DNA序列是通过2条部分重叠且互补的寡核苷酸杂交而形成的(八肽正向：5′gga tec ccg aat tec atg ttc tgt ttt tgg aaa ace tgt ace 3′；八肽反向：5′gcg gcc get cga gtc eta tta ggt aca ggt ttt cca aaa aca3′)。在PCR扩增混合物中，2微升1mM等分各寡核苷酸杂交，并在20μL PCR反应混合物(Sigma JumpStart混合物)中通过5个循环的PCR扩增进行延伸。
[0158] 然后使用2体积的乙醇使双链寡核苷酸序列沉淀，再次悬浮于20μL的水中，并使用EcoR1和Xho1限制性酶消化1小时。然后，使用乙醇使经切割的序列沉淀，再次悬浮于20μL的水中，并使用Promega快速连接试剂盒将所述序列2μL连接到事先使用EcoR1和Xho1限制性酶切割的pGex4.3载体(2μL)中。核苷酸载体的序列比对如图10所示。在连接后，将构建体转化到JM109感受态细胞(Promega)中。
[0159] 使用八肽引物5′gga tec ccg aat tec atg ttc tgt ttt tgg aaa ace tgt ace3′和载体pGex4.3引物5′ccg gga get gca tgt gtc aga gg 3′，针对插入物的存在情况，通过PCR扩增来检查转化的集落。
[0160] 随后，阳性集落生长，提取质粒，并通过测序来检查DNA序列，从而证实插入物在正确的阅读框中。然后，使用pGex-TS8质粒转化E.ColiBL-21感受态细胞(Promega)。
[0161] 实施例3：包含八肽(版本2)的DNA序列的pGex4.3质粒的形成
[0162] 构建第二质粒，其由N-末端至其C-末端编码了以下成分：-具有Schisostoma japonicum(Sj)谷胱甘肽-S-转移酶(GST)+凝血酶切割位点(T)+甲硫氨酸(M)+八肽的载体。
[0163] 版本2的质粒在TTC TGT TTT TGG AAA ACC TGT ACC序列之前包含TEV切割序列。如图11所示，其替换了Met密码子。通过2条部分重叠且互补的寡核苷酸杂交而形成78bp DNA序列(八肽TEV正向：5′GGA TCC CCG AAT TCC GAA AAC CTG TAT TTT CAG TTC TGT TTT TGG 3′；八肽TEV反向：5′GCG GCC GCT CGA GTC CTA TTA GGT ACA GGT TTT CCA AAA ACA GAA 3′)。按照实施例1中版本1质粒所述的方法来进行寡核苷酸的延伸、限制性酶的消化、连接和克隆。
[0164] 核苷酸载体的序列比对如图12所示。
[0165] 使用质粒Sj-GST-T-TEV-八肽转染的BL21E.Coli的小试50ml培养物在2xTY培养基中生长。使用IPTG(0.1mM)将培养物诱导3小时，并收获。使细胞在包含1mg/ml溶菌酶、50mM Tris pH 8.5、10％甘油、10mMDTT、0.5％脱氧胆酸钠和蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)的裂解缓冲液中裂解。使用超声探针，将裂解物超声处理3次，并持续30秒，然后在16000g下离心10分钟，并将澄清的上清液施加到GST-琼脂糖柱上。在使用PBS充分洗涤之后，将融合蛋白质用40mm谷胱甘肽、50mM Tris pH 8洗涤。在4-20％聚丙烯酰胺凝胶上分析所选择的部分。泳道1：分子量标志物；泳道2：得自诱导细胞的全部裂解物；泳道3：经洗涤的融合蛋白质(MoIWt＝28.4kDa)。
[0166] 实施例4：八肽融合蛋白质的诱导及其纯化
[0167] 将使用编码八肽融合蛋白质(得自实施例1和2的版本1和2)的质粒载体转染的小试(20-200ml)及中试规模(1-5L)细菌培养物在E.CoIiBL21中表达。使培养物在2xTY培养基中生长，并在室温(25℃)下用0.1mM IPTG过夜诱导蛋白质。通过离心收集到总量为46g的E.coli细胞。使用细胞崩解剂使所述的细胞裂解。裂解缓冲液包含PBS、10mM DTT、
10mM EDTA、5％甘油和1％Triton X-100。通过离心分离可溶的蛋白质。通过加入2M脲pH
12.5来溶解包含体中不溶的蛋白质。当不溶的蛋白质溶解时，将它们以1∶5的比例稀释于水中，并且使用1N HCl将溶液的pH变化为7.5。
10mM EDTA、5％甘油和1％Triton X-100。通过离心分离可溶的蛋白质。通过加入2M脲pH
12.5来溶解包含体中不溶的蛋白质。当不溶的蛋白质溶解时，将它们以1∶5的比例稀释于水中，并且使用1N HCl将溶液的pH变化为7.5。
[0168] 通过使上清液流经谷胱甘肽琼脂糖亲和纯化柱来分离溶解的融合蛋白质。在这一阶段，融合蛋白质与谷胱甘肽琼脂糖柱结合。然后，在4℃下，通过使用50个柱体积的包含0.1％Triton X-114的PBS、然后使用20个柱体积的PBS进行洗涤来除去内毒素。使用该方法，将内毒素在洗涤缓冲液中洗涤。然后，通过流经镍琼脂糖柱来除去组氨酸标记的TEV酶。谷胱甘肽琼脂糖和镍琼脂糖柱的再生使这两种物质可以被再利用。所述方法的各单独的步骤的全部细节是本领域的技术人员已知的(Structural Genomics Consortium et al，(2008)Nature Methods，Vol.5(2)，pp.135-146)。
[0169] 如图13和图14所示，使样品的洗提部分在5-20％预制的聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)上解离，并使用Coomassie蓝蛋白质染色剂进行染色。
[0170] 实施例5：使用MALDI-TOF-MS对奥曲肽乙酸盐质量的测定
[0171] 建立该试验，以便使用MALDI-TOF-MS测定化学合成的奥曲肽乙酸盐的质量。化学合成的奥曲肽乙酸盐的理论质量为1018Da。如图15所示，化学合成的奥曲肽乙酸盐的试验质量为1019Da。
[0172] 化学合成的奥曲肽Na+的理论质量为1041Da。如图15所示，化学合成的奥曲肽Na+的试验质量为1041Da。
[0173] 实施例6：在不具有任何结合的谷胱甘肽(GSH)的条件下经分离的SjGST-TM-八肽融合蛋白质(版本1)的质量的测定
[0174] 建立该试验，以便测定不具有任何结合的谷胱甘肽(GSH)的经纯化的SjGST-TM-八肽融合蛋白质(版本1)的质量。
[0175] SjGST-TM-八肽版本1融合蛋白质的理论质量为27757Da。如图16所示，SjGST-TM-八肽版本1融合蛋白质的试验质量为27751Da。质量误差百分率为0.02％。理论质量与试验质量之间的质量误差百分率为0.1％是可接受的。
[0176] 该试验证实，谷胱甘肽(GSH)与融合蛋白质结合没有使质量增大。SjGST的理论质量为25498Da。当其他的氨基酸和八肽加入到SjGST中时，理论质量增加2259Da。还原形式的谷胱甘肽(GSH)的理论质量为307Da。甲硫氨酸的理论质量为131Da。
[0177] 实施例7：鉴定在纯化的融合蛋白质(版本1)中所述八肽的存在情况
[0178] 建立该试验，以便测定在纯化的融合蛋白质(版本1)中所述八肽的存在情况。使用100mM DTT还原纯化的蛋白质溶液，并通过PD-10凝胶滤柱与包含2mM EDTA的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.8)进行缓冲液交换。然后在37℃下，在10mM的磷酸钠缓冲液(pH7.8)中，将融合蛋白质的溶液经过24小时的凝血酶消化。向该溶液中加入3mM DTT(以防止二硫键的错误形成)，然后进行MALDI-TOF-MS分析。
[0179] SjGST-TM-八肽版本1融合蛋白质的理论质量为27757Da。使用凝血酶得到的理论切割产物为1607Da的片段。凝血酶切割后的SjGST大片段的理论质量为26150Da。
[0180] 如图17所示，凝血酶切割后的SjGST大片段的试验质量为26153Da。质量误差百分率为0.01％。所述八肽在其被凝血酶切割后的理论质量为1607Da。所述八肽在其被凝血酶切割后的试验质量不能由这种特定的MALDI-TOF光谱确定，这是因为对于小MWt分子而言，其分辨率低-如实施例8所述。
[0181] 实施例8：鉴定在纯化的SjGST-TM-八肽融合蛋白质(版本1)中所述八肽的存在情况
[0182] 建立该试验，以便测定在纯化的SjGST-TM-八肽融合蛋白质(版本1)中所述八肽的存在情况。使用100mM DTT还原纯化的蛋白质溶液，并通过PD-10凝胶滤柱与包含2mM EDTA的10mM磷酸钠缓冲液(pH7.8)进行缓冲液交换。然后在37℃下，在10mM的磷酸钠缓冲液(pH7.8)中，将所述的溶液经过对与所述八肽紧密相邻的甲硫氨酸残基进行溴化氰介导的切割，并持续24小时。向所得溶液中加入3mM DTT(以防止二硫键的错误形成)，然后进行MALDI-TOF-MS分析。
[0183] 所述八肽的理论质量为1035Da。如图18所示，生物合成的八肽在其由甲硫氨酸处被化学切割后的试验质量为1034Da。质量误差百分率为0.09％。化学合成的奥曲肽乙酸盐与生物合成的八肽之间的试验质量差异为16Da。这是因为奥曲肽乙酸盐经过化学修饰而具有L-苏氨醇作为其C末端残基。在生物学八肽的情况下，天然形成的氨基酸L-苏氨酸作为C末端残基存在。
[0184] 实施例9：在使用了乳糖的E.coli中SjGST-TEV-八肽融合蛋白质(版本2)的自诱导及其由包含体中的纯化
[0185] 建立该试验，以便证明在使用了乳糖的E.coli中SjGST-TEV-八肽融合蛋白质(版本2)的自诱导及其由包含体中的简单纯化。在第1天，将BL21DE3细胞中的版本2质粒的5ml培养物接种到LB培养基中，并在37℃下生长8小时。然后，将培养物以1/100的比例在新鲜的LB培养基(5ml)中稀释，并使其过夜生长。第2天，将培养物再次以1/100的比例在LB培养基(5ml)中稀释，并在37℃下生长8小时。然后，将培养物以1/100的比例在包含以下物质的培养基中稀释，并使其在37℃下过夜生长，其中所述的物质为：25mM Na2HPO4、25mM KH2PO4、50mM NH4Cl、2mMNa2SO4、2mM MgSO4、0.5％葡萄糖、0.25％天冬氨酸。第3天，将培养物接种于200ml包含以下物质的培养基中，其中所述的物质为：1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.05％葡萄糖、0.2％乳糖、0.5％甘油、2mM MgSO4、25mM Na2HPO4、25mM KH2PO4、50mM NH4Cl、2mM Na2SO4。然后，使细胞在28℃下在摇动条件下生长26小时，并收获。
[0186] 然后对得自50ml培养物的细胞团进行加工，从而得到包含体。将所述的细胞团在包含50mM Tris pH8.5、10％甘油、10mM DTT和0.5％脱氧胆酸盐的5ml裂解缓冲液中裂解。加入500μl溶菌酶(1mg/ml)，并在室温下将所述的溶液温育10分钟。将裂解物依次进行
5次超声处理，并持续30秒，然后在16000g下离心10分钟。收集上清液，并将细胞团再次悬浮于5ml的裂解缓冲液中，超声处理30秒，然后进行离心。将该工艺重复3-4次，并在各次超声处理后收集上清液。将剩余的细胞团再次溶解于2M脲和100mM Tris(pH 12.5)中。
5次超声处理，并持续30秒，然后在16000g下离心10分钟。收集上清液，并将细胞团再次悬浮于5ml的裂解缓冲液中，超声处理30秒，然后进行离心。将该工艺重复3-4次，并在各次超声处理后收集上清液。将剩余的细胞团再次溶解于2M脲和100mM Tris(pH 12.5)中。
[0187] 图19示出了在使用了乳糖的BL21 DE3 E.coli细胞中MWt为28.4kDa的SjGST-TEV-八肽融合蛋白质(版本2)的自诱导。泳道1：MWt标志物；泳道2：得自E.coli诱导细胞的全部裂解液；泳道3：E.coli细胞裂解液在其经历超声处理之后得到的上清液；
泳道4：所述的细胞团在使用2M脲和100mM Tris pH12.5处理后得到的上清液；泳道5：所述的细胞团在使用2M脲和100mM Tris pH12.5处理、然后用HCl将pH调节至8后得到的上清液；泳道6：由E.coli细胞在2M脲以及100mM Tris pH12.5中裂解、然后用HCl将pH调节至8后剩余得到的细胞团。在各泳道中，在17kDa处所见的蛋白质条带是加入用于消化细胞的溶菌酶。
泳道4：所述的细胞团在使用2M脲和100mM Tris pH12.5处理后得到的上清液；泳道5：所述的细胞团在使用2M脲和100mM Tris pH12.5处理、然后用HCl将pH调节至8后得到的上清液；泳道6：由E.coli细胞在2M脲以及100mM Tris pH12.5中裂解、然后用HCl将pH调节至8后剩余得到的细胞团。在各泳道中，在17kDa处所见的蛋白质条带是加入用于消化细胞的溶菌酶。
[0188] 实施例10：化学合成的奥曲肽乙酸盐的三碳桥聚乙二醇化
[0189] 在室温下，在1小时内，向化学合成的奥曲肽乙酸盐溶液(0.25mg/mL，0.25μmol)中加入PCEP HCl(70μg，0.25μmol，14μl 5mg/mL溶液)，其中所述的奥曲肽乙酸盐是在包含10mM EDTA(pH7.8)的50mM磷酸钠缓冲液中制备得到的。然后将聚乙二醇双砜(1.35mg，0.25μmol，1当量)加入到还原的奥曲肽乙酸盐中。将反应溶液温和旋转至混合，并在4℃下过夜。然后，使用PD-10脱盐柱将所述的溶液进行针对去离子水的脱盐处理。通过MALDI-TOF-MS分析对包含大量聚乙二醇化的奥曲肽乙酸盐的共轭部分(即，1ml的三分之一部分)进行分析。
[0190] 为了进行比较，将奥曲肽乙酸盐的MALDI-TOF-MS光谱示于图15中。在图20中，显示化学合成的奥曲肽乙酸盐通过跨越所述肽的二硫键桥的三碳桥与5kDa聚乙二醇共价连接。
[0191] 聚乙二醇化的奥曲肽乙酸盐的理论质量为6092Da(即，聚乙二醇为5073Da+奥曲肽乙酸盐为1019Da)。聚乙二醇的试验MWt为5073Da。聚乙二醇化的奥曲肽乙酸盐的试验MWt为6097Da。质量误差百分率为0.08％。
[0192] 实施例11：通过SDS-PAGE证实SjGST-TM-八肽融合蛋白质(版本1)的修饰，其中所述的修饰为将三碳桥以化学方式插入到聚乙二醇中使其共价连接
[0193] 向由SjGST-TM-八肽(版本1)(0.5mg/mL，1mL)融合蛋白质在50mM磷酸钠缓冲液pH7.4中形成的经纯化的溶液中加入100mM DTT(15.4mg)。然后，将所得的融合在室温下温育30分钟，随后使用Sephadex G-25 PD-10柱与包含10mM EDTA的50mM磷酸钠缓冲液pH7.8进行缓冲交换。向该溶液中加入二硫键位点特异性桥接5kDa聚乙二醇(0.29mg，5μmoles，3当量)中。在4℃下，将所得溶液温育72小时。然后将牛凝血酶(Sigma-Aldrich，相当于融合蛋白质的0.1当量)加入到所述的混合物中，并在37℃下温育24小时。然后通过SDS-PAGE和MALDI-TOF-MS对所得的溶液进行分析。
[0194] 在图21中，泳道1：MWt标志物；泳道2：理论MWt为27757Da的经纯化的SjGST-TM-八肽(版本1)；泳道3：在4℃下二硫键位点特异性桥接PEG 5Da与
SjGST-TM-OCT反应72小时、然后在37℃下使用凝血酶消化24小时。显示在27.7kDa处的经纯化的SjGST-TM-八肽(版本1)蛋白质条带消失，并且出现了单聚乙二醇化的蛋白质条带(即，所述肽的二硫键的单聚乙二醇化)、二聚乙二醇化的蛋白质条带(即，所述肽的二硫键的单聚乙二醇化以及在GST中二硫键的单聚乙二醇化)以及三聚乙二醇化的蛋白质条带(即，所述肽的二硫键的单聚乙二醇化以及在GST中两个二硫键的二聚乙二醇化)；泳道4：
在反应缓冲液中二硫键位点特异性桥接5kDa聚乙二醇反应物(3当量浓度)。
SjGST-TM-OCT反应72小时、然后在37℃下使用凝血酶消化24小时。显示在27.7kDa处的经纯化的SjGST-TM-八肽(版本1)蛋白质条带消失，并且出现了单聚乙二醇化的蛋白质条带(即，所述肽的二硫键的单聚乙二醇化)、二聚乙二醇化的蛋白质条带(即，所述肽的二硫键的单聚乙二醇化以及在GST中二硫键的单聚乙二醇化)以及三聚乙二醇化的蛋白质条带(即，所述肽的二硫键的单聚乙二醇化以及在GST中两个二硫键的二聚乙二醇化)；泳道4：
在反应缓冲液中二硫键位点特异性桥接5kDa聚乙二醇反应物(3当量浓度)。
[0195] 实施例12：通过MALDI-TOF-MS证实SjGST-TM-八肽融合蛋白质(版本1)的修饰，其中所述的修饰为将三碳桥以化学方式插入到聚乙二醇中使其共价连接
[0196] 使用100mM DTT还原实施例11所述的蛋白质溶液，并使用PD-10柱与包含10mM EDTA的50mM磷酸钠缓冲液pH 7.8进行缓冲交换。然后，在4℃下，将还原的SjGST-TM-八肽(版本1)溶液经过24小时的二硫键位点特异性的聚乙二醇化。在37℃下，将所得的溶液经过72小时的凝血酶消化，并进行MALDI-TOF-MS分析。
[0197] 图22示出了凝血酶消化的二硫键位点特异性聚乙二醇化SjGST-TM-八肽(版本1)蛋白质溶液的MALDI-TOF-MS。
[0198] SjGST-TM-八肽(版本1)融合蛋白质的理论质量为27757Da。凝血酶切割的SjGST大片段的理论质量为26150Da。使用凝血酶的理论小切割产物为1607Da的片段。这意味着与所述八肽(1607Da)连接的聚乙二醇(5073Da)的理论质量＝6680Da。与所述八肽连接的聚乙二醇的试验质量为6692Da。质量误差百分率为0.1％。
[0199] 实施例13：在体内所述八肽对生长激素水平的效果
[0200] 使用之前实施例中详细描述的化学工艺，使3个八肽(FCFWKTCT、ACYWKVCT和ACYWKTCT)以化学方式将三碳桥加入到聚乙二醇中使其共价连接。使用最高级别的化学制品，并且使用超纯的临床级别的水来用于缓冲液(包含10mM EDTA的50mM磷酸钠缓冲液，pH 7.8)和透析。所有溶液在使用之前都用氩气吹扫30分钟。避免反应混合物中存在高浓度的蛋白质以防止它们聚集。在室温下，在不潮湿的条件下，使用新制备的TCEP HCl(5mg/mL)还原所述的蛋白质。还原的蛋白质不能暴露于热或直射日光下。此外，避免还原蛋白质溶液的剧烈摇动。所述蛋白质与30kDa三碳桥聚乙二醇双砜的比例为1∶1。将共轭反应溶液温和地旋转以使其混合，并使30kDa三碳桥聚乙二醇双砜溶解，然后在4℃下将所述的溶液在黑暗中保持12小时。然后，使用具有5-7kDa MWt截留器的Pierce透析室对所述的溶液进行透析，以便除去未与30kDa聚乙二醇共价连接的任何八肽。在2小时、4小时和6小时后均更换1L的透析水。然后进行冻干从而除去水和其他挥发物。
[0201] 体内动物研究使用了重量大约为20克的雄性BALB/C小鼠。将由聚乙二醇化的八肽构成的各皮下注射物溶解于250μL的水中以用于注射。在各注射中所给的仅仅八肽的重量为125μg。各小鼠以4天的间隔共接受4次注射。以皮下方式将注射物给予到颈的后部处拧起的皮肤中。在最后注射的30小时时处死动物。收集血清以用于使用购得的酶免疫测试来进行生长激素的测定。未见临床毒性。
[0202] 图23示出了结果(n＝4)。在这种动物研究中，在降低血清生长激素(GH)的水平方面，所有三个聚乙二醇化的八肽比化学合成的奥曲肽具有更大的效力。当与化学合成的奥曲肽相比时，聚乙二醇化的FCFWKTCT八肽使得血清生长激素减少70％以上。与化学合成的奥曲肽相比时，聚乙二醇化的ACYWKVCT八肽使得血清生长激素减少78％以上。与化学合成的奥曲肽相比时，聚乙二醇化的ACYWKTCT八肽使得血清生长激素减少94％以上。
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