猪小肠上皮细胞系及其建立方法
阅读：693发布：2023-03-10
专利汇可以提供猪小肠上皮细胞系及其建立方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了猪小肠上皮细胞系(ZYM-SIEC02)，该细胞系于_2010年_1月13_日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC-C201001，还公开了该细胞系的建立方法。该细胞系能够在营养条件要求低、细胞生长速度快，易于培养，便于推广应用。，下面是猪小肠上皮细胞系及其建立方法专利的具体信息内容。
1.猪小肠上皮细胞系，该细胞系于2010年1月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏登记入册编号为CCTCC-C201001。
2.权利要求1所述的猪小肠上皮细胞系的建立方法，其特征在于，包括下列步骤：
(1)无菌采取分离猪小肠回肠或空肠段，用组织块培养法分离培养小肠上皮细胞，于
37℃、5％的CO2培养箱内培养7～12天；
(2)采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入原代培养的猪小肠上皮细胞进行转染；
(3)待细胞转染pCI-neo-hTERT真核表达质粒后24小时后，使用ATV消化，以1∶1传至另一培养皿，48h后加600μg/mL G418筛选，第3天细胞开始死亡，后每三天换一次培养液且加入600μg/mL G418继续筛选，9天后大量细胞空泡化，第14天，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，转染组仍有较多细胞，将G418浓度降至300μg/mL维持筛选，每日观察，直至阳性克隆出现；使用滤纸片法将阳性克隆消化后，再运用无限稀释法样将阳性克隆分散为单个细胞，并将其种植于96孔板中，每孔细胞数量≤2个，标记每孔一个细胞的孔，
37℃、5％的CO2培养箱内扩大培养，72h后观察，将由一个细胞增殖得到的克隆消化转移到
48孔板，以此类推，得到抗G418阳性细胞。
(4)将阳性细胞在体外连续于37℃、5％的CO2培养箱内培养，分选后细胞呈现铺路石样单层贴壁生长，细胞间存在接触抑制，培养超过50代次即得永生化的细胞系。
3.根据权利要求2所述的猪小肠上皮细胞系的建立方法，其特征在于，所述的pCI-neo-hTERT导入原代培养的猪小肠上皮细胞进行转染，具体包括下列步骤：
4
(1)转染前48小时，ATV消化传至第3代的猪小肠皮细胞并计数，以1×10 个细胞/孔接种到12孔板内，使细胞在转染当天能达到80％～90％的汇合度；
(2)转染前24小时，更换新鲜的无血清高糖DMEM培养液；
(3)用无血清D-MEM/F-12培养液分别稀释2μL、4μL、6μL、8μLpCI-neo-hTERT质粒至体积为50μL，质粒浓度达到0.01μg/μL～0.04μg/μL，轻轻混匀，室温作用5分钟；
(4)用无血清D-MEM/F-12培养液稀释Lipofectamine 2000Reagent 4μL至体积为
50μL，轻轻混匀，室温作用5分钟；
(5)混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine 2000，此时总体积为100μL，轻轻混匀，室温作用20分钟；
(6)将12孔板中的旧培养液吸出，加入400μL无血清D-MEM/F-12培养液；
(7)逐滴将步骤(5)所得混合物加入到不同孔中，边加边摇动培养板，轻轻混匀；同时设立2孔未转染空白对照；
(8)于37℃、5％的CO2培养箱中孵育4～6小时，弃去培养液，加入完全D-MEM/F-12培养液。
4.根据权利要求3所述的猪小肠上皮细胞系的建立方法，其特征在于，所述完全D-MEM/F-12培养液：购买自invitrogen公司GIBCO的Dulbecco’s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12(Ham)(1∶1)培养基，加入5％胎牛血清。
猪小肠上皮细胞系及其建立方法
技术领域
[0001] 本发明属于动物细胞工程技术领域，涉及建立一种新的细胞系，特别涉及猪小肠上皮细胞系(ZYM-SIEC02)及其建立方法。
背景技术
[0002] 小肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells，IEC)是肠道的主要功能细胞，参与肠道的消化、吸收、免疫屏障和应激反应等，并与肠道的内、外分泌功能有密切关系。因此，进行小肠上皮细胞的分离培养是研究小肠功能、营养物质吸收机制及其调控的主要手段之一
[0003] 西北农林科技大学动科学院张彦明导师等人先后在对猪脐静脉血管内皮细胞分离与培养方法、应用端粒酶逆转录酶基因使猪血管内皮细胞永生化的初步研究、猪脐静脉血管内皮细胞永生化的初步研究中先后公开了猪脐静脉血管内皮细胞分离与培养方法、采用脂质体转染法将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入原代培养的猪静脉血管内皮细胞进行转染后应用G418筛选获得抗G418阳性细胞继续扩大培养，用荧光抗体进行细胞流式筛选得到表达的阳性细胞在体外连续培养箱内培养，分选后得永生化的细胞系。在该方法中将500μg/mL G418筛选至14天，用滤纸片加入胰酶消化单克隆细胞，在转入96孔中扩大培养，这样单克隆阳性细胞较少，细胞生长的数量非常少，生长缓慢，而且在生产过程中要加入20％的胎牛血清，生产成本高，不便于推广应用。2008年6月，张彦明导师等人开始尝试将同样的质粒转入原代猪小肠上皮细胞，但是在此次转染时发现，将600μg/mL G418筛选至14天，用滤纸片加入胰酶消化单克隆细胞，在转入96孔中扩大培养，得到的单克隆六个，细胞生长迅速，且在生产过程中只需加入5％血清(细胞复苏时除外，需要7％的血清)。
[0004] 参考文献
[0005] [1]洪海霞、张彦明、孙裴等，对猪脐静脉血管内皮细胞分离与培养[J].西北农林科技大学学报(自然科学版)2004年5月第32卷第5期。
[0006] [2]苏正元、张彦明、洪海霞等，应用端粒酶逆转录酶基因使猪血管内皮细胞永生化的初步研究[J].畜牧兽医学报.2007.38(4)：407～411。
[0008] [4]Hong H X，Zhang Y M，Xu H，and et al.(2007)Immortalization of swine umbilical vein endothelial cells with human telomerase reverse transcriptase.MolCells，24(3)：358-363附图说明
[0009] 图1为原代第3代猪小肠上皮细胞倒置显微镜观察图(×200)；
[0010] 图2为转染后60代猪小肠上皮细胞倒置显微镜观察图(×100)；
[0011] 图3为RT-PCR检测转染细胞中外源性hTERT的表达结果琼脂糖凝胶电泳图(阳性)；
[0012] 图4为免疫组化法检测hTERT基因(阳性)图；
[0013] 图5为免疫组化法检测hTERT基因(阴性)图；
[0014] 图6为western blot检测hTERT基因的蛋白表达结果图；
[0015] 图7为流式细胞仪(FCM)检测猪小肠细胞系(ZYM-SIEC02)第8代周期图；
[0016] 图8为流式细胞仪(FCM)检测猪小肠细胞系(ZYM-SIEC02)第58代周期图；
[0017] 图9为猪小肠细胞系(ZYM-SIEC02)生长曲线的测定图。
发明内容
[0018] 本发明的目的在于提供一种易于培养，生长速度快，操作方法简便的猪小肠上皮细胞系及其建立方法。
[0019] 该细胞系于2010年1月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏登记入册编号为CCTCC-C201001，保藏单位地址：湖北省武汉市武汉大学保藏中心。
[0020] 本发明还有一个目的是提供猪小肠上皮细胞系的建立方法，具体包括下列步骤：
[0021] (1)无菌采取分离新生仔猪小肠回肠或空肠段，用组织块法分离培养肠上皮细胞细胞，于37℃、5％的CO2培养箱内培养5～7天；
[0022] (2)采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入原代培养的猪小肠上皮细胞进行转染
[0023] (3)待细胞转染pCI-neo-hTERT真核表达质粒后24小时后对细胞进行1∶1传代处理，48h细胞贴壁且状态良好，加600μg/mL G418筛选，第3天细胞开始死亡，后每三天换一次培养液且加入600μg/mL G418继续筛选，9天后大量细胞空泡化，第14天，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，转染组仍有较多细胞，且已有G418抗性细胞开始生长，筛选一个月，G418浓度降至300μg/mL维持筛选，待镜下可见较大阳性克隆，使用滤纸片法将阳性克隆消化后，再运用无限稀释法样将阳性克隆分散为单个细胞，并将其种植于96孔板中，每孔细胞数量≤2个，标记每孔一个细胞的孔，37℃、5％的CO2培养箱内扩大培养，72h后观察，将由一个细胞增殖得到的克隆消化转移到48孔板，以此类推，得到抗G418阳性细胞。
[0025] 所述的pCI-neo-hTERT导入原代培养的猪小肠上皮细胞进行转染，具体包括下列步骤：
[0026] (1)转染前48小时，ATV消化传至第3代的猪小肠皮细胞并计数，以1×104个细胞/孔接种到12孔板内，使细胞在转染当天能达到80％～90％的汇合度；
[0027] (2)转染前24小时，更换新鲜的无血清高糖DMEM培养液；
[0028] (3)用无血清D-MEM/F-12培养液分别稀释2μL、4μL、6μL、8μLpCI-neo-hTERT质粒至体积为50μL，质粒浓度达到0.01μg/μL～0.04μg/μL，轻轻混匀，室温作用5分钟；
[0029] (4)用无血清D-MEM/F-12培养液稀释Lipofectamine 2000 Reagent(invitrogen公司购买，中文名称为脂质体2000，Cat.no.11668-027)4μL至体积为50μL，轻轻混匀，室温作用5分钟；
[0030] (5)混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine 2000，此时总体积为100μL，轻轻混匀，室温作用20分钟；
[0031] (6)将12孔板中的旧培养液吸出，加入400μL无血清D-MEM/F-12培养液；
[0032] (7)逐滴将步骤(5)所得混合物加入到不同孔中，边加边摇动培养板，轻轻混匀；同时设立2孔未转染空白对照；
[0033] (8)于37℃、5％的CO2培养箱中孵育4～6小时，弃去培养液，加入完全D-MEM/F-12培养液。
[0034] 所述的完全D-MEM/F-12培养液：购买自invitrogen公司GIBCO的Dulbecco’s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12(Ham)(1∶1)培养基，加入5％胎牛血清。
[0035] 本发明的猪小肠上皮细胞系(ZYM-SIEC02)与现有技术相比，具有以下优点：
[0036] (1)本发明的ZYM-SIEC02的营养条件要求低，现有细胞营养条件要求低，原先需要5％的胎牛血清，肝素、谷氨酰胺等各种营养物质，而现在的细胞只要求5％的血清，大大降低了培养的成本。
[0037] (2)本发明的ZYM-SIEC02通过应用无限稀释法获得的细胞的生长状态非常好，原来传代1∶1需要3～5天，现在的细胞传代1∶1传代需要16-24h，且细胞的生命力较以前非常强，便于规模化的应用。
[0038] (3)本发明的ZYM-SIEC02在体外传染50代以上仍然能够保持分裂增殖，不发生衰老和死亡，是一种永生化的细胞系，现已传至89代，为研究和预防猪病提供了基本的实验材料。
具体实施方式
[0039] 以下结合发明人给出的猪小肠上皮细胞系的原代培养所用的组织材料来源、取样过程、原代培养的培养基和培养条件、传代过程和次数、传代培养组成和传代培养的条件、新细胞系的分离和鉴定特征的实施例来进一步说明本发明。
[0040] 实施例1猪小肠上皮细胞系(ZYM-SIEC02)的建立方法
[0041] (1)无菌采取分离新生仔猪小肠回肠或空肠段，用组织块法分离培养肠上皮细胞细胞，于37℃、5％的CO2培养箱内培养7～12天。
[0042] (2)采用脂质体转染法，将编码hTERT和neo基因的真核表达质粒pCI-neo-hTERT导入原代培养的猪小肠上皮细胞进行转染。
[0043] (3)待细胞转染pCI-neo-hTERT真核表达质粒后24小时后，使用ATV消化，以1∶1传代至另一培养皿，48h后加600μg/mL G418筛选，第3天细胞开始死亡，后每三天换一次培养液且加入600μg/mL G418继续筛选，9天后大量细胞空泡化，第14天，未转染组细胞在G418作用下全部死亡，转染组仍有较多细胞，且已有G418抗性细胞开始生长，筛选一个月，G418浓度降至300μg/mL维持筛选，待镜下可见较大阳性克隆，使用滤纸片法将阳性克隆消化后，再运用无限稀释法样将阳性克隆分散为单个细胞，并将其种植于96孔板中，每孔细胞数量≤2个，标记每孔一个细胞的孔，37℃、5％的CO2培养箱内扩大培养，72h后观察，将由一个细胞增殖得到的克隆消化转移到48孔板，以此类推，得到抗G418阳性细胞
[0044] (4)将阳性细胞在体外连续于37℃、5％的CO2培养箱内培养，分选后细胞呈现铺路石样单层贴壁生长，细胞间存在接触抑制，培养超过50代次即得永生化的细胞系。
[0045] 所述步骤(2)中pCI-neo-hTERT导入原代培养的猪小肠上皮细胞进行转染，具体包括下列步骤：
[0046] (1)转染前48小时，ATV消化传至第3代的猪小肠皮细胞并计数，以1×104个细胞/孔接种到12孔板内，使细胞在转染当天能达到80％～90％的汇合度；
[0047] (2)转染前24小时，更换新鲜的无血清高糖DMEM培养液；
[0048] (3)用无血清D-MEM/F-12培养液分别稀释2μL、4μL、6μL、8μLpCI-neo-hTERT质粒至体积为50μL，质粒浓度达到0.01μg/μL～0.04μg/μL，轻轻混匀，室温作用5分钟；
[0049] (4)用无血清D-MEM/F-12培养液稀释Lipofectamine 2000 Reagent(invitrogen公司购买，中文名称为脂质体2000，Cat.no.11668-027)4μL至体积为50μL，轻轻混匀，室温作用5分钟；
[0050] (5)混合稀释的质粒和稀释的Lipofectamine 2000，此时总体积为100μL，轻轻混匀，室温作用20分钟；
[0051] (6)将12孔板中的旧培养液吸出，加入400μL无血清D-MEM/F-12培养液；
[0052] (7)逐滴将步骤(5)所得混合物加入到不同孔中，边加边摇动培养板，轻轻混匀；同时设立2孔未转染空白对照；
[0053] (8)于37℃、5％的CO2培养箱中孵育4～6小时，弃去培养液，加入完全D-MEM/F-12培养液。所述完全D-MEM/F-12培养液：购买自invitrogen公司GIBCO的Dulbecco’s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12(Ham)(1∶1)培养基，加入5％胎牛血清。
[0054] 实施例2细胞形态学特征
[0055] 细胞经转染后于相差显微镜下观察形态变化，并与原代猪小肠上皮细胞(如图1)进行比较。
[0056] ZYM-SIEC02(如图2)与原代细胞形态相似，细胞中央核明显，清晰可见2个或2个以上核仁。大多数细胞形态呈多角形或卵圆形，细胞呈典型的鹅卵石铺路石状排列，细胞间存在接触抑制。
[0057] 实施例3.RT-PCR检测转染细胞中外源性hTERT的表达
[0058] (1)引物设计与合成
[0059] 根据GenBank中已发表的人端粒酶反转录酶基因参考序列(登录号为NM-198255)设计1对特异性检测引物，上下游引物分别为P1：5′-TATGCCGTGGTCCAGAAG-3′；P2：5′-TATGCCGTGGTCCAGAAG-3′，扩增片段大小为416bp，引物由北京三博远志生物有限责任公司合成。
[0060] (2)细胞总RNA的提取
[0061] ①转染细胞与原代细胞分别用ATV消化后接种到35毫米培养皿中，待细胞铺满单层后取出，用灭菌PBS洗两遍，弃去液体。
[0063] ③加200μL氯仿，充分震荡至乳化均匀，4℃静置15分钟。
[0064] ④在4℃以12000转/分钟离心15分钟。
[0065] ⑤轻轻吸取上清450μL转移入另一新的DEPC水处理过的1.5mL灭菌EP管，加入500μL冰冷异丙醇(-20℃贮存)，轻轻颠倒混匀，置-20℃过夜。
[0066] ⑥在4℃以12000转/分钟离心10分钟。
[0067] ⑦弃上清，加入1mL冰冷的750mL/L乙醇，轻轻颠倒几次，在4℃以12000转/分钟离心10分钟。
[0068] ⑧弃上清，倒置EP管，室温干燥核酸。
[0069] ⑨加入20μL DEPC水溶解RNA。
[0070] (3)第一链cDNA合成
[0071] 在0.5mL PCR反应管中加入如下溶液和试剂进行反转录：
[0072]
[0073] 吹打混匀，稍离心，加入AMV反转录酶1.0μL，于42℃水浴作用1.5小时。
[0074] (4)PCR扩增双链cDNA
[0075] 在PCR反应管中配制如下反应体系：
[0076] 反转录产物(cDNA) 10μL
[0077] 10×PCR buffer(Mg2+free) 5μL
[0078] dNTP 4μL
[0079] 上游引物P1 0.5μL
[0080] 下游引物P2 0.5μL
[0081] MgCl2 3μL
[0082] 灭菌去离子水 26.5μL
[0083] Taq DNA聚合酶 0.5μL
[0084] 混匀后置于PCR扩增仪中，95℃预变性5分钟；94℃，30秒，58℃，30秒，72℃，30秒，进行30个循环；最后72℃延伸10分钟。扩增完成后，PCR产物用10g/L琼脂糖凝胶电泳观察结果(见图3，图中M.Maker；1.F10；2.F65；3.质粒；4.原代.)。
[0085] 实施例4免疫组化法检测细胞中外源性hTERT的表达
[0087] (1)在24孔塑料培养板孔内放置无菌的盖玻片0.5cm×0.6cm，SIECs和5
hTERT-SIECs用ATV消化成单细胞，计数后调整细胞浓度至2×10 个/mL，每孔中接种0.5mL细胞悬液。
hTERT-SIECs用ATV消化成单细胞，计数后调整细胞浓度至2×10 个/mL，每孔中接种0.5mL细胞悬液。
[0088] (2)待细胞生长至近融合状态(低密度单层)时，用PBS(0.01mol/L，pH 7.4)洗3遍，加入0.4g/L多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH 7.4)或者95％酒精，细胞面朝上，室温固定10分钟，用PBS冲洗3次，每次5分钟。
[0090] (4)除去PBS液，加50μL BSA封闭液，室温下孵育20min。甩去多余液体，不洗，加入1∶100倍稀释的兔抗人hTERT多克隆抗体50μL于盖玻片上，放入湿盒内4℃过夜。同时一抗滴加等量PBS做阴性对照，用PBS冲洗3次，每次5min。
[0091] (5)除去PBS液加入生物素标记的山羊抗兔IgG，于37℃孵育1小时后，用PBS洗涤3次，每次5min.
[0093] (7)除去PBS液加入100μL新配的DAB工作液，然后立即在倒置显微镜下观察，照相。图4中的细胞呈棕黄色，图5阴性细胞没有变化，说明培养的细胞表达hTERT基因。
[0094] 实施例5Western Blot检测
[0095] (1)蛋白样本制备：倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液，每瓶细胞加3ml4℃预冷的PBS(0.01M，pH7.2～7.3)。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。RIPA裂解液(1mM PMSF)，摇匀置于冰上。每瓶细胞加250～500μl裂解液，于冰上裂解30min。裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。并用枪吹打直至裂解液不再黏稠。
[0096] (2)SDS-PAGE电泳：安装好Bio-Rad微型凝胶电泳模具后按Bio-RadMini-Protean电泳系统的使用说明书安装好玻璃板，固定于制胶板上；根据实验检测抗原的分子量大小选择合适的电泳分离胶浓度在一小烧杯中按所需丙烯酰胺浓度配置一定体积的分离胶溶液，迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，等待30-60min，使凝胶聚合。当凝胶聚合后，在分离胶和水层之间会出现一个清晰的界面；制备积层胶，并在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶，立即在积层胶溶液中插入干净的实验预设计的梳子，将凝胶垂直放置于室温下；积层胶聚合完全后(30min)，移出梳子，把凝胶固定于电泳装置上，上下槽各加入Tris甘氨酸电泳缓冲液；将样品与凝胶加样缓冲液混合，在100℃加热5min以使蛋白质变性；设计加样顺序，按预定顺序加样。把电泳装置与电源连接好，调节好电压至60V，跑过积层胶后调至100V，待待溴酚蓝迁移到分离胶底部0.5cm处，关闭电源。
[0097] (3)转膜：将PVDF膜在甲醇中浸泡20min以上后转入转移液中。将滤纸也浸入转移液中。将胶卸下，左上切角，在转移液中稍稍浸泡一下，按顺序铺上膜与每侧三张滤纸。注意用玻棒逐出气泡，电转槽加入1L电转液。将胶平铺于海绵上，滴加少许电转液再次驱赶气泡，封紧后放入电转槽，注意膜在正极一侧。降温，将电泳槽置于冰水混合物中。恒流
400mA，4h。
400mA，4h。
[0098] (4)封闭及杂交
[0099] 将膜从电转槽中取出，TTBS稍加漂洗，浸没于封闭液中缓慢摇荡一小时。含兔抗人hTERT多克隆抗体的封闭液滴加于摇床的塑料膜上，将Western膜从封闭液中取出，滤纸贴角稍吸干，正面朝下贴在一抗上，注意不要留下气泡，室温下轻摇孵育一小时或4℃静置过夜。在反应体系外面罩一湿润平皿以防止液体过多蒸发。一抗孵育结束后，用TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次10min。山羊抗兔IgG(HRP)，按1∶10000比例稀释，室温轻摇一小时。二抗孵育结束后，用TTBS漂洗膜后再浸洗三次，每次10min。
[0100] (5)发光鉴定
[0101] 使用HRP-ECL发光法。将A、B发光液按比例稀释混合。膜用去离子水稍加漂洗，滤纸贴角吸干，反贴法覆于A、B混合液滴上，熄灯至可见淡绿色荧光条带(5min左右)后滤纸贴角吸干，置于保鲜膜内固定于片盒中，迅速盖上胶片，关闭胶盒，根据所见荧光强度曝光。取出胶片立即完全浸入显影液中1-2min，清水漂洗一下后放在定影液中至底片完全定影，清水冲净晾干，标定Marker，进行分析与扫描。(见图6)
[0102] 实施例6流式细胞仪(FCM)检测猪小肠细胞系(ZYM-SIEC02)周期
[0103] (1)待测ZYM-SIEC02样本制成单细胞悬液，然后1000转/分钟离心8分钟，弃上清。
[0104] (2)用4℃预冷的700mL/L冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小时。
[0105] (3)调整细胞浓度为106个/mL，取1mL细胞悬液，用PBS洗3次，细胞重悬于1m L PI染液(终浓度为50μg/mL)中，37℃孵育30分钟，进行流式细胞仪分析(见图7至8)。
[0106] 实施例7生长曲线的测定
[0107] 将第转染后第10、20、30、50代hTERT-SIECs按1×104个/孔接种于24孔板，3～4天换液1次，每天用2.5g/L胰蛋白酶消化细胞，血细胞计数板计数。每个时间点设3个平行孔，每个孔计数3次，取其平均值绘制细胞的生长曲线。图9说明细胞在第3天数量开始
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增长，到了第5、6天时细胞数量达到最大，约为5×10 个。
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增长，到了第5、6天时细胞数量达到最大，约为5×10 个。
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