通过早期单个分离针叶树体细胞胚增加萌发势的方法
阅读：324发布：2023-02-23
专利汇可以提供通过早期单个分离针叶树体细胞胚增加萌发势的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 一方面，提供了用于增加在体外生产的针叶树 体细胞 胚的萌发势的方法。所述方法包括(a)在第一发育培养基中进行第一段时间的培育后，从第一胚培养物中单个分离出多个单个的未成熟的针叶树体细胞胚，以及(b)将多个单个分离的未成熟的针叶树体细胞胚，与第二发育培养基相 接触 ，进行第二段时间的培育。，下面是通过早期单个分离针叶树体细胞胚增加萌发势的方法专利的具体信息内容。
1.用于增加体外产生的松树体细胞胚的萌发势的方法，该方法包括：
(a)在第一发育培养基中进行第一段时间的培育后，从第一胚培养物中单个分离出多个单个的未成熟的松树体细胞胚；以及
(b)将多个单个分离的未成熟的松树体细胞胚，与第二发育培养基相接触，进行第二段时间的培育，其中第二发育培养基是上述步骤(a)用过的第一发育培养基，或者是与第一发育培养基组成相同的新鲜发育培养基，并且其中第二段培育时间的长度足够使多个单个分离的未成熟松树体细胞胚的至少一部分达到解剖学上的成熟。
2.权利要求1的方法，其中第一胚培养物是胚性胚柄团。
3.权利要求1的方法，其中第一段培育时间，是其长度足够在第一胚培养物中的多个未成熟松树体细胞胚的一部分上形成一或多个子叶原基的时间。
4.权利要求1的方法，其中第一段培育时间为至少6周。
5.权利要求1的方法，其中第一段培育时间为7周到8周。
6.权利要求1的方法，其中第二段培育时间为3周到5周。
7.权利要求1的方法，其中第一段培养时间和第二段培养时间的组合，总时间为至少
12周。
8.权利要求1的方法，其中单个分离步骤包括从第一胚培养物中挑取多个单个的未成熟松树体细胞胚。
9.权利要求8的方法，其中多个胚的挑取是基于选自胚的尺寸、胚的形状、胚的表面质地和胚的颜色的标准。
10.权利要求2的方法，其中单个分离步骤包括从多个单个的未成熟松树体细胞胚中取出胚性胚柄团。
11.权利要求10的方法，其中单个分离步骤包括从多个单个胚中洗掉至少一部分胚性胚柄团。
12.权利要求1的方法，其中与第二发育培养基接触的单个分离的未成熟松树体细胞胚彼此之间没有体接触。
13.权利要求1的方法，还包括在步骤(b)之前将单个分离的未成熟松树体细胞胚转移到多孔基质上。
14.权利要求1的方法，其中第一发育培养基的重量克分子渗透浓度在300mM/Kg到
400mM/Kg的范围内。
15.权利要求1的方法，其中第一发育培养基含有浓度为1%到10%的PEG。
16.权利要求1的方法，其中第二发育培养基的重量克分子渗透浓度在350mM/Kg到
450mM/Kg的范围内。
17.权利要求1的方法，其中第二发育培养基含有浓度范围为7%到15%的PEG。
18.权利要求1的方法，其中松树体细胞胚是火炬松。
19.用于生产成熟的松树体细胞胚的方法，包括：
(a)在诱导培养基中或其上培养松树体细胞，以产生胚胎发生细胞；
(b)将步骤(a)中制备的胚胎发生细胞培养在维持培养基中或其上，使胚胎发生细胞增殖并形成松树子叶前体细胞胚；
(c)将步骤(b)中形成的松树子叶前体细胞胚培养在第一发育培养基中或其上，进行第一段时间的培育；
(d)单个分离在步骤(c)中培育的多个松树体细胞胚；以及
(e)将多个单个分离的松树体细胞胚培育在第二发育培养基上，进行第二段时间的培育，其中第二发育培养基是上述步骤(c)用过的第一发育培养基，或者是与第一发育培养基组成相同的新鲜发育培养基，并且其中第二段培育时间的长度足够使多个单个分离的未成熟松树体细胞胚的至少一部分达到解剖学上的成熟。
通过早期单个分离针叶树体细胞胚增加萌发势的方法
[0001] 与相关申请的交叉引用
[0003] 本发明涉及通过早期单个分离针叶树体细胞胚增加萌发频率和萌发势的方法。
[0004] 发明背景
[0005] 对于制造木制品的针叶树例如松树和枞树的需求持续增加。对于提供足够的针叶树供应的难题，提出的一种解决方法是鉴定具有所需特性、例如生长快速的个体针叶树，并通过体细胞克隆生产大量的、遗传学同一的优良树种的无性繁殖系。
[0006] 体细胞克隆是从树的体细胞组织产生遗传学同一的树的过程。树的体细胞组织是雄性和雌性配子之外的树组织。在体细胞克隆的一种方法中，将树的体细胞组织培养在起始培养基中，该培养基含有激素、例如生长素和/或细胞分裂素，以启动能够发育成体细胞胚的胚胎发生细胞的形成。然后将胚胎发生细胞进一步培养在促进胚胎发生细胞增殖，形成子叶前胚(即不具有子叶的胚)的维持培养基中。然后将增殖的胚胎发生细胞培养在促进子叶体细胞胚的发育和成熟的发育培养基中，子叶体细胞胚可以例如放置在人工种子中并播种在土壤中，在那里萌发产生针叶树苗。树苗可以移植到生长位点进行随后的生长，并最终收获，以产生木材或木材衍生产品。或者，子叶体细胞胚也可以在萌发培养基中萌发，然后转移到土壤中进一步生长。
[0007] 针叶树胚的体细胞克隆中一直存在的问题，是刺激有效并且节约成本地形成能够萌发产生植株的体细胞胚。优选情况下，体外形成的针叶树体细胞胚，与在针叶树种子中体内形成的针叶树合子胚，在物理(physically)和生理上是相似的、或一致的。因此，对于从针叶树胚胎发生细胞生产活的针叶树体细胞胚的方法，存在着持续的需求。
发明内容
[0008] 一方面，提供了用于增加体外生产的针叶树体细胞胚的萌发势的方法。方法包括(a)在第一发育培养基中进行第一段时间的培育后，从第一胚培养物中单个分离出多个单个的未成熟的针叶树体细胞胚；以及(b)将多个单个分离的未成熟的针叶树体细胞胚，与第二发育培养基相接触，进行第二段时间的培育。
[0009] 另一方面，提供了用于生产成熟的针叶树体细胞胚的方法。方法包括(a)在诱导培养基中或其上培养针叶树体细胞，以产生胚胎发生细胞；(b)将步骤(a)中制备的胚胎发生细胞培养在维持培养基中或其上，使胚胎发生细胞增殖并形成针叶树子叶前体细胞胚；(c)将步骤(b)中形成的针叶树子叶前体细胞胚培养在第一发育培养基中或其上，进行第一段时间的培育；(d)单个分离在步骤(c)中培育的多个针叶树体细胞胚；以及(e)将多个分离的单个针叶树体细胞胚培育在第二发育培养基上，进行第二段时间的培育。
[0010] 本发明的方法可用于制备具有增加的萌发频率和萌发势的成熟的针叶树体细胞胚，它们可以通过例如遗传或生物化学手段进行表征，和/或如果需要的话，它们可以萌发以产生针叶树。因此，例如，本发明的方法可用于更有效地生产具有一种或多种所需特征、例如快的生长速度或改进的木材质量的个体针叶树的无性繁殖系。附图说明
[0011] 当通过参考下面的详细描述并结合随附的图，对本发明有了更好的理解时，本发明的上述方面以及许多附随优点将变得更容易理解，在这些图中：
[0012] 图1是针叶树体细胞胚的早期和晚期发育阶段的图解；
[0014] 图3用图形描述了在表5描述的处理条件下，在12周的发育结束时，三种基因型A、B和C中的每种的每个胚的干重的变化，如实施例3中所述；
[0015] 图4用图形描述了在表5描述的处理条件下，在12周的发育结束时，三种基因型A、B和C中的每种的每个胚的胚水分含量，如实施例3中所述；
[0016] 图5用图形描述了使用表5描述的发育处理条件产生的胚的萌发百分率，这是根据进行每种处理的所有三种基因型(A、B和C)的合并的数据，如实施例3中所述；
[0017] 图6用图形描述了通过表5描述的处理，基因型A的类别1、2和3萌发物和双极萌发物的萌发百分率，如实施例3所述；
[0018] 图7用图形描述了通过表5中描述的处理，基因型A的类别1的萌发物的萌发物根长度、下胚轴长度、子叶长度、上胚轴长度和上胚轴茎长度的数据，如实施例3中所述；
[0019] 图8用图形描述了通过表5中描述的处理，基因型B的类别1、2和3萌发物和双极萌发物的萌发百分率，如实施例3中所述；
[0020] 图9用图形描述了通过表5中描述的处理，基因型B的类别1的萌发物的萌发物根长度、下胚轴长度、子叶长度、上胚轴长度和上胚轴茎长度的数据，如实施例3中所述；
[0021] 图10用图形描述了通过表5中描述的处理，基因型C的类别1、2和3萌发物和双极萌发物的萌发百分率，如实施例3中所述；以及
[0022] 图11用图形描述了通过表5中描述的处理，基因型C的类别1的萌发物的萌发物根长度、下胚轴长度、子叶长度、上胚轴长度和上胚轴茎长度的数据，如实施例3中所述。
[0023] 优选实施方案的详细描述
[0024] 除非在本文中专门定义，所有本文中使用的术语都与本技术领域的专业人员所理解的具有同样的含义。
[0025] 本文中使用的术语“发育阶段”是指体细胞克隆过程中的时期，在此过程中，未成熟的胚中发生了组织发生和组织和器官的生长，达到了能够萌发成植株的全尺寸的成熟胚。
[0026] 本文中使用的术语“未成熟胚”是指还不能萌发成植株的胚，包括处于早期发育阶段的胚(即子叶前胚)和中期发育阶段的胚(即具有子叶或下胚轴但还没有发育完全的胚)。
[0027] 本文使用的术语“解剖学成熟”是指具有已发生的子叶和下胚轴的胚。
[0028] 本文使用的术语“子叶胚”是指具有明确的、细长的、带有潜伏(latent)分生组织中心的双极结构的胚，在一端具有一个或多个清晰可见的子叶原基，在相反一端具有潜伏的胚根。
[0029] 本文使用的术语“子叶前胚”是指尚未具有子叶的胚。
[0030] 本文使用的术语“正常萌发物”是指在评估时存在植物的所有预期部分。植物的预期部分可以包括胚根、下胚轴、一个或多个子叶、以及上胚轴。在裸子植物的情况下，正常萌发物的特征为胚根具有超过3mm的长度，并且与从自然(natural)种子萌发的胚的外观相比没有目测可察觉的畸形。
[0031] 本文使用的术语“胚根”是指植物胚的发育成产生的植株的初生根的部分。
[0032] 本文使用的术语“下胚轴”是指植物胚或苗的位于子叶下方但位于胚根上方的部分。
[0033] 本文使用的术语“上胚轴”是指苗茎位于子叶上方的部分。
[0034] 本文使用术语“胚性胚柄团”或“ESM”是指放置在营养培养基表面上，并留下来生长最多三个月时间的细胞团，其中营养培养基或者包含在半固体凝胶中，或者作为液体包含在能够提供物理支持的多孔基质中。在三个月的培育期间，体细胞胚从显微镜下可见的前体细胞团生长成可见的早期胚，并最终生长为解剖学上成熟的胚。在培育几周后，ESM的结构典型地由带有几个与培养基直接接触位于其上的胚的增殖垫状物组成，但是大部分胚形成在仍然增殖的细胞团的顶部或侧面上。
[0035] 除非指明，所有表示成百分率的浓度值是单位体积的重量百分率。
[0036] 按照本发明的方法，意外地发现了在体细胞胚生产的中期发育阶段单个分离未成熟的胚(也被称为早期单个分离)，然后将单个分离的胚在发育培养基上培育一段附加的时间，产生了与完成发育阶段后单个分离的胚(成熟胚)相比，以增加的萌发频率和/或萌发势萌发的胚，正如在实施例2和实施例3中更详细描述并在图2-11中显示的。
[0037] 按照前面的描述，一方面，提供了用于增加在体外生产的针叶树体细胞胚的萌发势的方法。方法包括(a)在第一发育培养基中进行第一段时间的培育后，从第一胚培养物中分离出多个单个的未成熟的针叶树体细胞胚，以及(b)将多个分离的未成熟的针叶树体细胞胚，与第二发育培养基相接触，进行第二段时间的培育。
[0038] 本发明的方法可用于生产来自任何针叶树的子叶体细胞胚，例如松属的成员，例如火炬松(Pinus taeda)和辐射松(Radiata pine)。同样地，例如绿枞(Douglas fir)胚也可以通过本发明的方法生产。
[0039] 按照本发明的方法生产的成熟针叶树体细胞胚群，与按照不包括在发育过程中单个分离未成熟胚、但其它方面都一致的对照方法生产的针叶树体细胞胚群相比，具有较高的萌发成针叶树植株的效率。
[0040] 根据本发明的方法，在单个分离之前，将未成熟胚的第一培养物在第一发育培养基中，进行第一段时间的培育。如图1中所示，体细胞胚的发育阶段可以分成包括组织发生(即从未分化的细胞形成不同组织)的早期阶段，包括器官生长和下胚轴发育和子叶发育的开始的中期阶段，以及包括器官生长的完成、下胚轴和子叶发育的完成(即解剖学成熟)和储存产物沉积的晚期阶段。具体来说，未成熟胚的早期发育包括根的初始发育、根冠发育的开始、中柱原分生组织的分化、以及苗端形成。中期发育包括下胚轴发育和子叶发育的起始，晚期发育包括下胚轴发育和子叶发育的完成，产生了解剖学上成熟的胚。
[0041] 根据本发明的方法，未成熟的针叶树体细胞胚、例如子叶前针叶树体细胞胚，可以从针叶树体细胞、例如从针叶树胚获得的细胞制备。例如，来自针叶树胚的细胞可以用激素诱导，形成胚性胚柄细胞团(ESMs)，它们可以按照本发明进行处理，产生成熟的针叶树体细胞胚。ESMs可以从例如从种子中取出的子叶前胚制备。例如，将种子表面消毒，取出子叶前胚，然后将其培养在允许形成ESMs的诱导培养基上或其中，该ESMs包括在出芽或分裂繁殖过程中的早期胚。典型情况下，将ESMs培养在维持培养基中，形成子叶前体细胞胚。ESM培养条件以及适合的诱导和维持培养基的非限制性实例在下面进一步描述。
[0042] 在本发明的方法的一个实施方案中，在单个分离前，将包含未成熟胚、例如含有多个子叶前体细胞胚的ESM的第一培养物，在第一促进子叶胚发育的发育培养基中或其上，进行第一段时间的培养。
[0043] 在某些实施方案中，第一段培育时间的长度，足以在第一胚培养物中，在多个胚的一部分(例如至少一个胚，至少10％的胚，至少25％、至少50％、超过50％或至少75％的胚)上形成至少一种下列结构：一个或多个具有子叶原基的胚；一个或多个具有子叶的胚；一个或多个具有4+子叶的胚；或一个或多个具有带有出现的下胚轴和根区的不同子叶的胚。
[0044] 在一个或多个胚上一种或多种结构(例如子叶原基或子叶)的形成，可以通过对培养的胚进行目测检测或成像分析来确定。目测检测或成像分析可以任选地在5-10X的放大倍数下进行。
[0045] 第一段培育时间可以根据基因型的不同而不同。在某些实施方案中，第一段培育期的长度从至少6周到至少8周，例如从7到8周。在第一发育培养基上的第一次培育可以在10℃到30℃，例如从15℃到25℃，或例如从20℃到23℃的温度下进行。用于具体基因型的第一段培育时间，可以使用实施例3中描述的方法来确定。
[0046] 在第一段培育时间结束时，例如，当在一部分胚上观察到存在一个或多个子叶原基时，或经过至少6周的时间后，方法包括了从第一胚培养物中单个分离多个的单个胚。
[0047] 按照本发明的方法，可以使用任何从第一胚培养物中物理分离单个胚的手段，来单个分离胚。例如，在胚性胚柄团(ESM)培养物的情况下，可以使用物理分离方法，例如洗去ESM(例如通过水性液体的压力控制的喷射进行喷射单个分离)、真空吸去ESM、振动、或从ESM中挑出胚。其它可用的单个分离方法的非限制性的例子包括根据物理属性例如尺寸、形状，通过例如筛网过滤或分拣胚，或根据其它的物理属性例如表面粗糙度、疏水性、密度或质量过滤或分拣胚。
[0048] 在某些实施方案中，单个分离步骤还包括根据一种或多种选择标准挑取单个胚。例如，本领域技术人员或计算机化的成像系统可以使用目测评估筛选标准，根据一种或多种形态特征来选择胚，这些特征包括但不限于胚的尺寸、形状(例如轴对称)、表面质地、颜色(例如没有可见的发绿)、不存在裂开的下胚轴，以及没有半透明的子叶。也可以根据与化学或外部结构吸附、反射率、透射率或通过使用近红外光谱术(NIR)的发射光谱相关的标准，来选择胚，例如在题为“用于体细胞胚的分类方法(Methods for Classification of SomaticEmbryos)”的美国专利申请No.2004/0072143中描述的，该专利申请在此引为参考。
[0049] 理想的胚，可以使用任何适合的仪器例如镊子，从第一胚培养物(例如胚性胚柄团)中单个地挑出(通过手动或自动的过程)。胚的挑取可以手动进行，或通过自动化的过程进行，例如在题为“用于植物胚的收获和多阶段筛选的自动系统和方法(Automated System andMethod for Harvesting and Multistage Screening of Plant Embryos)”的美国专利申请No.2004/0267457中描述的，该专利申请在此引为参考。
[0050] 在方法的某些实施方案中，将挑出的胚直接放置在第二发育培养基表面上，或放置在与第二发育培养基接触的多孔基质上，第二发育培养基可以是固体或液体形式的。
[0051] 可用于本发明方法的各种不同实施方案的多孔基质，典型情况下孔径在大约5微米到大约1200微米的范围内，例如从大约50到500微米，例如从大约70到大约150微米，例如大约100微米。多孔基质典型为平面的，可以是任何所需的形状或所选的维度，使其易于操作并适合于与第二发育培养基相接触。示例的多孔材料包括可消毒的和有足够强抗当将材料抬起，以便将单个分离的胚转移到体细胞胚生产过程的随后阶段、例如层化时发生的撕裂。可用的多孔材料的例子包括但不限于膜、尼龙纤维、编织的筛网(例如尼龙、不锈钢或塑料)、以及聚合物纤维。
[0052] 在某些实施方案中，单个分离的胚被转移到第二发育培养基中，或与第二发育培养基接触的多孔基质中，采用的方式使得单个分离的胚彼此不物理接触。正如在实施例2和实施例3中描述的，已经显示了与胚性胚柄团中的其它胚一起发育的胚，经历了对全胚发育具有抑制性的微环境。
[0053] 在某些实施方案中，将单个分离的胚与以前接触过细胞的(用过的)第二发育培养基相接触。在某些实施方案中，将单个分离的胚与第二发育培养基相接触，第二发育培养基是以前接触过细胞的第一发育培养基，例如在第一次培育期间使用的接触过细胞的发育培养基。例如，在胚性胚柄团培养物在第一发育培养基上培育的情况下，在第一段培育时间后，可以通过喷射单个分离方法将多个未成熟单个胚单个分离，导致将单个单个分离的胚转移到以前接触过细胞的第一发育培养基的表面上。
[0054] 按照本发明的方法，在单个分离后，将单个分离的未成熟胚与第二发育培养基接触第二段培育时间。在某些实施方案中，第二段培育时间的长度足以使多个被单个分离的胚的至少一部分(例如至少一个胚，至少10％的胚，至少25％、至少50％、超过50％或至少75％的胚)达到解剖学成熟(即具有发育的子叶和下胚轴)。
[0055] 第二段培育时间可以根据基因型的不同而不同。在某些实施方案中，第二段培育期的长度为至少3周，例如从3到5周。在某些实施方案中，胚在发育培养基上培育的总时间长度(包括第一段培育时间和第二段培育时间)为至少12周。在第二发育培养基上的第二次培育可以在10℃到30℃，例如从15℃到25℃，或例如从20℃到23℃的温度下进行。用于具体基因型的第二段培育时间，可以使用实施例3中描述的方法来确定。
[0056] 第一和第二发育培养基典型地含有支持体细胞胚的营养物质。适合的发育培养基典型情况下不包含生长促进激素，例如生长素和细胞分裂素。在某些实施方案中，第一和第二发育培养基具有同样的配方。在某些实施方案中，第一和第二发育培养基具有不同的配方。
[0057] 第一和/或第二发育培养基的重量克分子渗透浓度可以被调整到位于所需范围内的值，例如大约250mM/Kg到大约450mM/Kg。典型情况下，在本发明的方法中，350mM或更高的重量克分子渗透浓度是有利的。适合的发育培养基的例子BM3显示在本文的实施例1中。适合的发育培养基的另一个例子devB显示在本文的实施例3中。在方法的某些实施方案中，第二发育培养基具有的重量克分子渗透浓度(例如从350mM/Kg到450mM/Kg)高于第一发育培养基的重量克分子渗透浓度(例如从300mM/Kg到400mM/Kg)。在某些实施方案中，选择第二发育培养基的重量克分子渗透浓度以匹配第一段培育时间结束时第一发育培养基的重量克分子渗透浓度。
[0058] 在某些实施方案中，第一和/或第二发育培养基含有浓度为1％到15％的PEG。在某些实施方案中，第一发育培养基含有浓度为7％到10％(例如7％、8％、9％、10％)的PEG。在某些实施方案中，第二发育培养基含有浓度为8％到15％(例如8％、9％、10％、
11％、12％、13％、14％、15％)的PEG。在某些实施方案中，第二发育培养基含有比第一发育培养基更高浓度的PEG。
11％、12％、13％、14％、15％)的PEG。在某些实施方案中，第二发育培养基含有比第一发育培养基更高浓度的PEG。
[0059] 麦芽糖可以包含在第一和/或第二发育培养基中，作为体细胞胚的主要或唯一糖源。可用的麦芽糖浓度在大约1％到大约2.5％的范围内。
[0060] 第一和/或第二发育培养基可以含有结冷胶。结冷胶是以例如名称GELRITE和PHYTAGEL销售的胶凝剂。如果在发育培养基中包含结冷胶，其存在的浓度典型为低于大约0.5％，典型情况下浓度为大约0％到大约0.4％。第一和第二发育培养基典型为固体培养基，尽管一种或两种也可以是液体培养基。
[0061] 第一和/或第二发育培养基可以包含用于诱导培养基的吸附剂成分，例如本文描述的活性炭。示例的成熟培养基在实施例3中显示为devB。
[0062] 在某些实施方案中，第一和/或第二发育培养基还包含蔗糖和/或脱落酸。发育培养基中脱落酸的浓度可以在0.5mg/L到500mg/L之间。在本发明的方法的某些实施方案中，发育培养基中脱落酸的浓度在1mg/L到100mg/L之间。在某些实施方案中，发育培养基中脱落酸的浓度在5mg/L到20mg/L之间。
[0063] 在本发明的某些实施方案中，第一和/或第二发育培养基含有蔗糖作为主要的或唯一的可代谢糖源。可用的蔗糖浓度在大约1％到大约6％的范围内。
[0064] 在某些实施方案中，在第二发育培养基中培育后，将单个分离的胚在层化培养基中或其上，在大约1℃到大约10℃的温度下培养大约1周到大约6周的时间。典型情况下，层化培养基与发育培养基相似或一致，但是不含脱落酸，并具有较低浓度的结冷胶，典型情况下低于大约0.5％。层化培养基可以含有蔗糖作为主要或唯一可代谢糖源。示例的层化培养基在实施例1中显示为BM5。
[0065] 在某些实施方案中，本发明提供了用于生产成熟的针叶树体细胞胚的方法，包括下列步骤：(a)在诱导培养基中或其上培养针叶树体细胞，以产生胚胎发生细胞；(b)将步骤(a)中制备的胚胎发生细胞培养在维持培养基中或其上，使胚胎发生细胞增殖并形成针叶树子叶前体细胞胚；(c)将步骤(b)中形成的针叶树子叶前体细胞胚培养在第一发育培养基中或其上，进行第一段时间的培育；(d)单个分离在步骤(c)中培育的多个针叶树体细胞胚；以及(e)将多个单个分离的针叶树体细胞胚培育在第二发育培养基上，进行第二段时间的培育。
[0066] 因此，在某些实施方案中，将针叶树体细胞培养在诱导培养基中或其上，以产生胚胎发生细胞。胚胎发生细胞是能够产生一个或多个子叶针叶树体细胞胚、包括例如针叶树胚性胚柄团的细胞。诱导培养基典型情况下包含无机盐和有机营养物质。诱导培养基的重量克分子渗透浓度典型为大约160mg/kg或甚至更低，但是也可以高达170mM/kg。诱导培养基典型情况下包含生长激素。可以包含在诱导培养基中的生长激素的例子是生长素(例如2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D))和细胞分裂素(例如6-苯甲基氨基嘌呤(BAP))。生长素可以例如1mg/L到200mg/L的浓度使用。细胞分裂素可以例如0.1mg/L到10mg/L的浓度使用。
[0067] 诱导培养基可以包含吸附性成分，特别是当使用非常高浓度的生长激素时。吸附剂成分可以是任何在本发明的实践中使用的浓度下对胚胎发生细胞没有毒性，并且能够吸附生长催进激素以及在胚发育过程中产生的、存在于培养基中的有毒化合物的成分。可用的吸附性成分的非限制性的例子包括活性炭、可溶性聚乙烯吡咯烷酮、不溶性聚乙烯吡咯烷酮、活性氧化铝以及硅胶。吸附性成分可以例如大约0.1g/L到大约5g/L的量存在。可用于本发明的实践的诱导培养基的例子是本文实施例1中提出的BM1培养基。诱导培养基典型情况下为固体，可以通过包含胶凝剂进行固化。
[0068] 典型情况下，将针叶树体细胞在诱导培养基中或其上，培养从3周到10周，例如6周到8周的时间，培养温度为10℃到30℃，例如15℃到25℃，或例如20℃到23℃。
[0069] 维持培养基可以是固体培养基，或者它可以是液体培养基，其可以进行搅拌以促进胚胎发生组织的生长和繁殖。维持培养基的重量克分子渗透浓度典型情况下高于诱导培养基的重量克分子渗透浓度，典型为180-400mM/kg。维持培养基可以含有支持胚胎发生组织的营养物，可以包含催进细胞分裂和胚胎发生组织生长的激素，例如一种或多种生长素和/或细胞分裂素。典型情况下，维持培养基中的激素浓度低于它们在诱导培养基中的浓度。
[0070] 一般来说，希望、但不是必需在维持培养基中包含麦芽糖作为唯一或主要的可代谢糖源。可用的麦芽糖浓度的例子是在大约1％到大约2.5％的范围内。适合的维持培养基的例子是在本文实施例1中显示的BM2培养基。典型情况下，将针叶树胚胎发生细胞每周一次转移到新鲜维持培养基中。
[0071] 如上所述，将从针叶树胚胎发生细胞形成的子叶前针叶树体细胞，在第一发育培养基中或其上，进行第一段时间的培养，单个分离，然后在第二发育培养基上进行第二段时间的培养。可用的发育培养基和培育时间描述同上。
[0072] 在第二发育培养基中培养以后，可以任选地将子叶体细胞胚转移到层化培养基，进行另一段时间的培养。
[0073] 使用本发明的方法生产的针叶树子叶体细胞胚，如果需要的话，可以任选地萌发形成针叶树植株，这些植株可以生长成针叶树。也可以将子叶胚放置在人工种子中，用于随后的萌发。针叶树子叶体细胞胚可以在例如固体萌发培养基上、例如在本文的实施例1中描述的萌发培养基上萌发。然后可以将萌发的植株转移到土壤中用于进一步的生长。例如，可以将萌发的植株栽培在温室的土壤中，允许其生长直到移植到户外位点。典型情况下，对针叶树子叶体细胞胚进行光照以刺激萌发。
[0074] 本发明的方法产生的成熟的针叶树体细胞胚群，与按照不包括在发育过程中单个分离未成熟胚的步骤、但其它方面都一致的方法生产的针叶树体细胞胚群相比，具有以较高频率萌发的能力(即产生了更高产率的萌发物)。本发明的方法的某些实施方案产生的成熟的针叶树体细胞胚的萌发效率，与按照不包括在发育过程中单个分离未成熟子叶针叶树体细胞胚的步骤、但其它方面都一致的方法生产的成熟的针叶树体细胞胚的萌发效率相比，高至少100％(例如高100％到200％)，正如在下面的实施例2-3中进一步描述的和图1-11中显示的。
[0075] 下面的实施例仅仅说明了现在考虑到的实施本发明的最佳方案，但是不应该被解释为限制了本发明。
[0076] 实施例1
[0077] 本实施例描述了使用发育后单个分离从火炬松生产体细胞松树胚的方法。
[0078] 方法：
[0079] 在受精后4到5周，将含有合子胚的雌性配子体从种子中取出。除去种皮，但是除了切除珠心端之外，不将胚从周围的配子体中进一步剖出。球果(cone)在使用前储存在4℃。就在取出未成熟的胚之前，将种子进行灭菌，首先清洗，用去污剂处理，然后在15％H2O2中灭菌10分钟。在每次处理后将外植体用无菌蒸馏水充分清洗。
[0080] 表1和2显示了用于生产松树体细胞胚的培养基的示例组成。
[0081] 表1
[0082]
[0083] +如果需要固体培养基时使用。
[0084] 表2
[0085]
[0086] 诱导：将无菌的带有完整胚的配子体放置在固体BM1培养基上，在22℃到25℃的环境中，以24小时的暗光周期(dark photoperiod)保持3到5周。时间的长度取决于所培养的具体基因型。在这段时间结束时，形成了白色的粘质团，与初始的外植体相连。典型情况下，显微镜检查发现与团相连的大量早期胚。它们一般来说特征为具有长的薄壁的胚柄，连接有具有浓密的细胞质和大的细胞核的小头。
[0087] 诱导培养基的重量克分子渗透浓度在某些情况下可以高达150mM/kg，典型为大约120mM/kg或甚至更低(例如110mM/kg)。
[0088] 子叶前胚的维持和繁殖：将从诱导阶段产生的细胞团取出的早期胚首先放置在BM2胶化的维持和繁殖培养基上。该培养基与诱导培养基的差别在于生长激素(生长素和细胞分裂素二者)降低了至少一整个数量级。该培养基的重量克分子渗透浓度为130mM/kg或以上(典型情况下对于火炬松来说在大约120-150mM/kg的范围内)。温度和光照周期还是22℃到25℃，在暗处24小时。将胚在BM2固体培养基上培养12-14天，然后转移到液体培养基上进一步传代培养。该液体培养基与BM2具有同样的成分，但是缺少胶凝剂。在固体维持期结束时的胚典型情况下与来自诱导阶段的胚在外观上相似。在液体维持培养基上传代培养5到6周后，形成了高等的早期胚。它们的特征为光滑的胚头部，据估计典型情况下具有超过100个个体细胞，具有多个胚柄。
[0089] 胚的发育
[0090] 将早期未成熟胚转移到固体发育培养基上。发育培养基完全不含生长激素，或者它们的存在只有非常低的水平。典型情况下包含有脱落酸以促进进一步发育。此外，在该培养基中包含吸附剂成分是有利的。吸附剂成分可以选自许多具有高的表面积和/或受控的孔径的化学材料，例如活性炭，可溶或不溶形式的聚乙烯吡咯烷酮，活性氧化铝和硅胶。吸附剂成分通常存在的浓度为大约0.1-5g/L，更常见为大约0.25-2.5g/L。可以包含浓度为大约0.25％的结冷胶。
[0091] 该发育培养基的渗透压可以升高到显著超过维持培养基。已经发现，重量克分子渗透浓度高达350mM/kg或甚至更高，是有利的。优选情况下，发育在完全黑暗下在22℃到25℃下进行，直到子叶胚已经发育(例如达到解剖学成熟)。
[0092] 层化：在发育培养基上7到12周后，单个分离子叶胚，并转移到层化培养基BM5中。该培养基与发育培养基相似，但是缺少脱落酸、PEG-8000和结冷胶。将胚在层化培养基上，在大约1℃到大约10℃之间，在暗处培育3到6周。
[0094] 萌发：通过将仍然在滤纸支持物上的干燥的成熟胚，在用液体萌发培养基饱和的衬垫上放置大约24小时，将干燥的成熟胚重新水合。然后将胚单个地放置在用于萌发的固体BM6培养基上。这是缺少生长激素的基本培养基，通过减少蔗糖、肌醇和有机氮进行了修改。将胚在BM6培养基上，在23℃到25℃以及16小时光-8小时暗的光照周期的环境条件下，培育大约10周，直到产生的小植株具有发育完好的胚根和下胚轴以及绿色的子叶结构和上胚轴。
[0095] 因为降低了糖的浓度，萌发培养基的渗透压可能进一步低于发育培养基。正常情况下它要低大约150mM/kg(例如大约100mM/kg)。
[0096] 结果：
[0097] 使用本实施例中描述的方法，对于火炬松的三种代表性基因型获得的典型萌发频率如下：
[0098] 基因型A：萌发频率22％。
[0099] 基因型B：萌发频率12％。
[0100] 基因型C：萌发频率62％。
[0101] 实施例2
[0102] 本实施例描述了一系列实验，被设计用于测试未成熟胚的早期单个分离(在发育阶段)对萌发频率的影响。
[0103] 方法：
[0104] 进行了如下6种不同的实验，以测试早期单个分离的效果：
[0105] 实验2.1
[0106] 方法：将火炬松基因型A的胚性胚柄团培养物在固体发育培养基上培育12周，并对胚进行评估。在12周时，将一组小胚(108个胚)留在同一发育培养基平板上继续培育2周，将第二组小胚(108个胚)转移到不含ESM的新鲜发育培养基(配方相同)上，继续培育2周。在附加的培育时间结束时(总共在发育培养基上14周)，对来自第一和第二组的胚进行胚的尺寸和萌发百分率的评估。
[0107] 结果：本实验的结果概述在表3中。意外地发现，不被扰动地保留在发育培养基平板上继续培育2周的第一组小胚(108个胚)，在发育培养基上从第12周到第14周期尺寸没有生长，它们的萌发百分率为零。相反，意外地发现，在12周时单个分离(手工挑取)并转移到不含ESM的新鲜发育培养基(原来的配方)上并继续培育2周的第二组小胚(108个胚)，尺寸继续生长，并以与较早收获的胚(在12周时收获的大的或小的胚)匹配的比率萌发。因此，显示出将第一组小胚不受扰动地留下，并在ESM中继续保持2周，抑制了胚的活力和萌发潜能。
[0108] 实验2.2。本实验的实施是作为成像实验中的对照，以确定在发育过程中从发育培养基中取出未成熟的基因型A的火炬松胚，并放回到同一发育培养基上(以前接触过细胞)，是否将改变发育的过程。在本实验中，将生长在固体发育培养基上的未成熟胚，在发育培养基上的第5、6、7、8、9、10和12周时单个分离(手工挑取)，并放回到同一(以前接触过细胞的)不含ESM的发育培养基上。每种处理试验了7块胚的平板。在发育培养基上培育总共12周后，将胚层化2周。然后评估胚的萌发百分率。
[0109] 结果：本实验的结果概述在表3中。正如表3中所示，本实验证实了在实验2.1(如上所述)中的意外发现，即在发育阶段单个分离未成熟胚对萌发有显著的有益效果，最适的萌发百分率(86％)来自于在第8周从发育培养基单个分离(挑取)并重新放置在同一不含ESM的发育培养基上的胚。在发育培养基上培育10或12周时单个分离的胚的萌发百分率仅为48％。正如在上面的实施例1中描述的，在胚的层化时，在发育培养基上12周后的单个分离是标准的操作。因此，本发明的方法产生的萌发百分率是使用标准方法时常规获得的萌发百分率的大约两倍。
[0110] 实验2.3。本实验使用火炬松胚的三种不同基因型A、B和D进行，以观察在发育培养基上培育8周后转移到不同的新培养基是否具有有益的效应。将基因型A、B和D的每种胚的三个摇瓶涂布在平板上，每个摇瓶每种处理各10个平板。将胚或者在第8周时挑取并转移到新鲜发育培养基上，或者在12周时全体一起转移(在尼龙支持物上)到新鲜发育培养基上。对于两种条件来说，将新鲜发育培养基的重量克分子渗透浓度调整到与转移出胚的培养基的重量克分子渗透浓度相当。
[0111] 结果：本实验的结果概述在表3中。正如在表3中所示，基因型A和B的结果非常明显地显示出，在8周时转移到其重量克分子渗透浓度已经调整到与它所离开的旧培养基中相当的新鲜发育培养基，与在12周时全体一起转移相比，更加有利。基因型D产生的“正常”胚对于决定性测试来说太少，但是当将第2类萌发物包含在分析中时，似乎早期单个分离显示出相反的萌发趋势(p＝0.075)，第8周转移不如标准的12周时收获。但是，如果将较低的胚产量/ml也考虑在内时，那么这种降低是显著的，正如通过萌发物产量/ml所测量的。注意到基因型B在8周转移后也显示出胚产量/ml的明显降低，但是它的萌发物产量/ml仍然增加很多。基因型A的每ml胚产量不受影响。
[0112] 在另一个实验中，也确定了使用与上述相同的培养基进行全体一起转移(不单个分离)，不影响萌发百分率(数据未显示)。
[0113] 实验2.4。使用了更多的火炬松基因型(基因型A、C和D)以及固体或液体发育培养基，重复了上述实验2.2。基因型A使用每种处理9块平板进行试验。基因型C使用每种处理26块平板进行试验。基因型D使用每种处理9块平板进行试验。
[0114] 结果：该实验的结果概述在表3中。对于基因型A来说，确定了在第8周时转移时最适的，对照胚(在12周时收获)的萌发仅仅为第8周转移的胚的萌发的大约一半。还观察到了在第8周转移后基因型B和D的低的萌发率。
[0115] 实验2.5。进行了本实验，对火炬松基因型A和C在8周和12周时的单个分离进行了比较，使用喷射分离法进行单个分离(而不是手工挑取)，然后在各种不同培养基条件下培育，包括重新放置在使用过的培养基(以前接触过细胞的)或含有新鲜渗透压调节剂的新鲜培养基上。
[0116] 结果：本实验的结果显示在表3中。由于低的萌发百分率，结果是统计学不显著的，因此是无结论的。低的萌发率可能是由于喷射分离方法包含了突然的渗透压变化以及其它与手工转移的差别。但是，观察到了转移到新鲜培养基上的胚，与放置在使用过的培养基上的胚相比，萌发物的根长了60％(p＝0.003)。喷射分离方法可以进行修改，使用等渗溶液代替水，以避免与将胚暴露于突然的渗透压变化有关的问题。
[0117] 实验2.6。进行了本实验以比较在第7周和第9周时单个分离胚(手工挑取)并转移到新鲜固体培养基上对萌发频率的影响。在本实验中，对单个分离后的发育培养基没有进行渗透压调整，以匹配单个分离前的发育培养基。胚的转移从同样的平板上连续进行，允许进行精确的分板比较。12周的对照包含没有从中取出胚的平板。还包括了其它的对照，其中胚在第7或第9周时从发育培养基上直接转移到层化培养基上，然后用水调制并萌发(如实施例1中描述)。
[0118] 结果：本实验的结果显示在表3中。观察到了在第7周单个分离后的萌发百分率为72％，与此相比，第9周时单个分离的萌发百分率是43％，没有单个分离的12周对照的萌发百分率是12％。观察到的差异是巨大和统计学显著的。此外，第7周单个分离的胚在发育结束时的胚的干重，是对照萌发物的干重(没有低于最小水分含量要求以下)的3倍，与对照萌发物相比根的长度长54％。
[0119] 实验结果的总体概述：所有5个使用胚的人工单个分离(手工挑取)的实验，当胚在发育阶段过程中被单个分离，并转移到发育培养基(以前接触过细胞的培养基或新鲜培养基)中继续发育时，都显示出了对胚质量的一种或多种度量的显著效应(例如，较高的萌发百分率、较高的每ml萌发物产率、萌发物的根的较快的生长以及较大的胚干重方面的显著改进)。这些试验的结果概述在表3和图2中。图2用图形描述了5个实验(2.1，2.2，2.3，2.4和2.6)的萌发结果，其中胚在发育过程中通过手工进行转移，并且使用了在图例中指示的每种基因型(“G”)(基因型A、B、D或E)。
[0120] 如图2所示，最适合于单个分离的周似乎是在第7周到第10周之间，并观察到了某些基因型的具体的变化。
[0121] 具体来说，注意到基因型A在所有5个实验中显示出了大的改进。基因型B在测试了它的实验中显示出大的改进。基因型D在测试了它的两个实验中显示出降低，但是对照产生了非常低的萌发百分率。基因型E在测试了它的一个实验中显示出中度的降低。基因型C只在一个实验中进行了测试，由于喷射单个分离引入的混淆效应，没有获得结论性结果。
[0122] 这一系列实验的数据表明，与ESM一起或在其上发育的胚，经历了对整个胚发育具有抑制性的微环境，在发育过程中的单个分离增加了被单个分离的胚的萌发势。尽管不希望受到理论的束缚，但也有可能胚的胚柄丛本身分泌了其它抑制胚的发育的化合物。也有可能ESM中的胚是间接获取营养的，并与其它组织竞争，使得与直接接触培养基的胚相比，营养供应速度和培养基成分的化学组分减少了。
[0123]
[0124] 实施例3
[0125] 本实施例证实了当在胚发育期间单个分离未成熟胚时观察到的萌发频率的急剧增加，以及在具有各种不同的脱乙酰吉兰糖胶/PEG浓度的发育培养基上培育分离后胚的效果。
[0126] 基本原理：实验的设置是为了检查在发育后总体一起移动或在发育中期单个挑取(单个分离)到新鲜培养基上的胚的萌发百分率的效应。
[0127] 方法：
[0128] 子叶前胚的诱导和维持：
[0129] 来自三种不同基因型(火炬松的A、B和C)的体细胞胚按照实施例1中的描述进行诱导，并维持在维持培养基M2中(表2的BM培养基+1.1mg/L 2，4D；0.1mg/mL 6-BAP，0.1mg/mL激动素，以及1mg/mL ABA)。
[0130] 单个分离前胚的发育：
[0131] 将来自每种基因型(A、B和C)的子叶前胚铺在1/2尺寸(3.91升)的食品制备物盒(Cambro Company)之上，盒中含有600ml下面的表4中描述的半固体发育培养基B(dev B)。在每个盒中加入24个单独的100微米尼龙方形筛网(1.5×1.5英寸)，允许在发育的第7-8周时可以不扰动地移除整个培养物。
[0132] 使在1升摇瓶中、在维持培养基M2中生长的每种基因型(A、B和C)的针叶树体细胞胚细胞沉降。通过在摇瓶上画一道线来测量沉降的细胞体积(SCV)，通过使用多孔玻璃管吸取，抽出沉降细胞上方的上清液。然后将沉降细胞重新悬浮在洗涤培养基中，使其再次沉降，将一滴0.5ml SCV加到每个方形筛网上。每种基因型铺4个1/2金宝(cambro)盒，每个盒上铺有12mls SCV。
[0133] 表4
[0134]
[0135] 发育中期评估和单个分离：
[0136] 在发育7或8周后，根据基因型，将铺板的胚或者单个分离(从ESM细胞团中分别移出)到不同的dev B培养基的修改过的培养基中，或者将整个培养物方块(尼龙筛网)整体移动到新鲜的或以前使用过的(接触过细胞的)dev B培养基上，或者不触动培养物(对照)。
[0137] 将每种基因型(A、B和C)按照下面表5中列出的处理条件进行处理，每种处理8个平行样。
[0138] 表5：发育中期单个分离：处理条件
[0139]L/ )B v
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[0140] 在分离时，手工挑取所有目测成熟的子叶胚。被挑取的成熟胚的标准如下：所有胚具有4+子叶，没有可见的发绿(这包括所有绿色色调)，存在显著的具有下胚轴和存在的根区的子叶，下胚轴没有裂开，以及没有半透明的子叶。所有胚，无论大小，只要满足标准就被挑取。一个技术员使用解剖镜(5-10X放大倍数)在一个时间挑取一整块铺板的胚。
[0141] 单个分离后发育
[0142] 将挑取的胚在表5中显示的不同处理条件下进行处理，并在表5中显示的各种不同培养基上继续培育4到5周，使得总共在发育培养基上的总培育时间为12周(包括单个分离前和单个分离后培育时间)。
[0143] 发育后测量：
[0144] 在发育结束时(第12周)，在移动到层化培养基之前进行测量。
[0145] 对于每种基因型和处理来说，干重(“DW”)和水分含量(“MC”)测量三份平行样。每个胚的干重测量结果显示在图3中。每个胚的胚水分含量的结果显示在图4中。
[0146] 层化：
[0147] 在发育12周后，将所有胚或完整培养物移动到层化液体培养基中(单个聚酯衬垫上20mls BM5)，并放置在寒冷处，在培养基上在4℃下放置4周。
[0148] 在水上调制：
[0149] 在层化结束时，将所有用于萌发的胚移动到放置在小的皮氏培养皿中的干滤纸上。然后将皮氏培养皿在500mls水上放置12-13天。
[0150] 萌发：
[0151] 然后将所有胚在萌发盒中的100mls萌发培养基BM6(表2)上萌发6周(1周在暗处，其它时间在光照房间中)，然后评估萌发类别，并对类别1和2的萌发物进行器官测量。
[0152] 评估萌发物的萌发频率和萌发势：
[0153] 萌发百分率、干重和水分含量按照下面的描述进行评估。每个技术员在同一天一次处理种植在一个完整区块上的萌发。
[0154] 类别1萌发物(“cat1”)：出现根以及最少5片上胚轴叶片，每片最少5mm。类别1萌发物可以移植到温室环境中。
[0155] 类别2萌发物(“cat2”)：出现根以及上胚轴(双极)，但是上胚轴不满足类别1中提出的数量或长度标准。
[0156] 双极类别(“双极”)：是类别1和2的组合。
[0157] 类别3萌发物(“cat3”)：是只出现根的胚，没有上胚轴。
[0158] 对类别1和类别2的萌发物的根、下胚轴、子叶、上胚轴簇和上胚轴茎的长度进行评估。
[0159] 结果：
[0160] 在发育结束时，对不同处理条件下单个分离和培育的胚的胚干重和水分含量进行了检测。图3显示了对于三种基因型A、B和C的每种来说，在表4描述的处理条件下，在发育12周结束时，每个胚的干重。图3中的每个条代表三个样品的平均值。如图3中所示，胚的单个分离对于胚干重的显著增加来说是必需的。例如，对比处理1和3(未单个分离)与处理4、5和7-12(单个分离的)。将胚单个分离到以前使用过的培养基中(处理2)，给出了介于处理1(未单个分离，同样培养基)和处理3(未单个分离，移动到新鲜培养基中)之间的中间结果。单个分离造成的干重增加的程度随基因型而变化，基因型A对单个分离最具响应性。
[0161] 图4用图形显示了胚的水分含量与处理和基因型的关系。每个条代表三个样品的平均值。正如图4中所示，在来自所有处理的胚中测量到的水分含量都高于55％，最大的高于60％。
[0162] 萌发数据：合并的基因型分析的结果
[0163] 图5用图形显示了基于每种处理的所有三种基因型(A、B和C)的合并的数据，关于萌发类别1、2、3和双极萌发物的萌发百分率。误差线等于90％置信区间。
[0164] 正如在图5中显示的，在处理1(未触动的对照)和处理2(单个分离到用过的培养基中)之间，以及在处理1和处理4(单个分离到新鲜培养基中)之间，观察到了萌发百分率的统计学显著的差异(p≤0.001)。但是，在处理1和处理3(全ESM膜(未单个分离的)移动到新鲜培养基中)之间没有观察到统计学显著的差异(p＝0.22)。这些结果证明，单个分离步骤而不是培养基的差异，是本实验测试的参数中增加萌发频率的最关键参数。
[0165] 表6显示了类别1萌发物的根长度、下胚轴长度、子叶长度、上胚轴长度和上胚轴茎长度的合并的基因型数据。
[0166] 表6：类别1萌发物器官长度，合并的基因型
[0167]根长度 下胚轴长 子叶长度 上胚轴长度 上胚轴茎长度
处理
(mm) 度(mm) (mm) (mm) (mm)
1 17.6 7.6 4.3 9.9 0.9
2 28.2* 9.5* 5.5* 12.8* 1.1
3 17.7 8.6 4.8 10.8 1.0
4 29.1* 10.0* 6.6* 14.0* 1.2
5 27.4 10.4* 6.4* 13.5* 1.0
7 26.9 10.1* 6.2* 12.7* 1.3
8 28.4* 10.1* 6.5* 12.6* 1.1
9 27.4 10.3* 6.5* 12.3* 0.9
10 28.8* 10.1* 5.8* 13.4* 1.5
* * * *
11 28.7 10.7 6.5 12.7 1.3
12 26.3 9.9* 6.2* 12.2* 1.0
处理
(mm) 度(mm) (mm) (mm) (mm)
1 17.6 7.6 4.3 9.9 0.9
2 28.2* 9.5* 5.5* 12.8* 1.1
3 17.7 8.6 4.8 10.8 1.0
4 29.1* 10.0* 6.6* 14.0* 1.2
5 27.4 10.4* 6.4* 13.5* 1.0
7 26.9 10.1* 6.2* 12.7* 1.3
8 28.4* 10.1* 6.5* 12.6* 1.1
9 27.4 10.3* 6.5* 12.3* 0.9
10 28.8* 10.1* 5.8* 13.4* 1.5
* * * *
11 28.7 10.7 6.5 12.7 1.3
12 26.3 9.9* 6.2* 12.2* 1.0
[0168] *表示与处理1统计学上有差异的值(p＝0.05或以下)。
[0169] 表6中的数据证明了在处理1(对照)和处理2(单个分离到用过的培养基中)之间，以及在处理1和处理4(单个分离到新鲜培养基中)之间，器官长度的统计学显著的差异。但是，在处理1和处理3(全ESM膜(未单个分离的)移动到新鲜培养基中)之间没有观察到显著差异。这些结果与上面描述的图5中观察到的相一致。其中特别值得注意的是根的长度的统计学显著(p＝0.05)的增加，在处理2或4(以及其它单个分离的处理)中，与处理1或处理3(未单个分离的对照)相比，为1.6倍，而观察到的差异不是统计学显著的(p＝1.0)。
[0170] 萌发数据：个体基因型分析的结果
[0171] 图6用图形显示了通过处理，对于类别1、2和3萌发物和双极萌发物来说，基因型A的萌发百分率。误差线等于90％置信区间。图7用图形显示了通过处理，基因型A的类别1的萌发物的萌发物根长度(“根”)、下胚轴长度(“下胚轴”)、子叶长度(“子叶”)、上胚轴长度(“上胚轴”)和上胚轴茎长度(“茎”)的数据。
[0172] 图8用图形描述了通过处理，基因型B的类别1、2和3萌发物和双极萌发物的萌发百分率。误差线等于90％置信区间。图9用图形描述了通过处理，基因型B的类别1的萌发物的萌发物根长度、下胚轴长度、子叶长度、上胚轴长度和上胚轴茎长度的数据。
[0173] 图10用图形描述了通过处理，基因型C的类别1、2和3萌发物和双极萌发物的萌发百分率。误差线等于90％置信区间。图11用图形描述了通过处理，基因型C的类别1的萌发物的萌发物根长度、下胚轴长度、子叶长度、上胚轴长度和上胚轴茎长度的数据。
[0174] 结果概述：
[0175] 当结果来自于个体基因型时，所有测试的三种基因型(A、B和C)的合并的数据显示出同样的趋势。在处理1与处理2和处理4之间观察到了统计学显著的差异(p＝＜.001)但是在处理1与处理3之间没有观察到显著差异(p＝0.22)。这些结果证明，在本实验中测试的参数中，在发育过程中的早期单个分离，而不是培养基的差异，是增加萌发百分率和萌发势的最关键变量。
[0176] 对于萌发物的萌发势来说，基因型合并数据显示，在用处理1和2或4、而不是处理3进行处理后，器官长度之间存在显著差异。特别值得注意的是根的长度增加的显著差异(p＝0.05)，在处理2或4(以及其它处理)中，与处理1和3相比，为1.6倍，而在处理1和处理3之间没有差别(p＝1.0)。
[0177] 对于萌发物萌发势测量来说，用于寻找质量改进的最适合的类别是类别1萌发，它相当于可移植到温室环境中的胚。在图3中显示的处理1-4中干重差异的样式，与图6中显示的类别1萌发的萌发百分率紧密相关。例如，如图6中所示，通过在发育期间单个分离胚并将单个分离的胚转移到新鲜培养基中，与未单个分离的、未触动的对照相比，基因型A的萌发百分率增加了超过40个基点。
[0178] 来自个体基因型的数据与上述的合并数据具有同样的趋势。萌发百分率结果证明，分别显示在图6、图8和图10中的所有三种基因型(A、B和C)对表5中显示的处理条件具有相同的反应，尽管在未触动的对照(处理1，表5)中萌发的基础水平不同。
[0179] 在测试的三种基因型中，基因型B的萌发百分率是最低的，但是对于处理1-4来说，相对样式与基因型A和C相似(参见图8和9)。在最佳的早期单个分离处理4中，与未触动的、未单个分离的对照(参见图8)相比，观察到了34个基点的增加。
[0180] 如图10中所示，基因型C的对照胚的萌发百分率(60+％)，高于基因型A的(显示在图6中)，在单个分离并将胚转移到原始或新鲜培养基之后，与未触动的(未单个分离的)对照相比，增加了20个基点。对于基因型C来说，通过早期单个分离到旧的或新鲜的培养基中，类别1萌发物的器官长度也增加，如图11中所示。
[0181] 同样地，对于处理1-4来说，类别1萌发物的萌发物形态(图7)也与干重和萌发数据匹配(对于其它处理来说程度低些)。
[0182] 表7：每种测试的基因型的未单个分离的(处理1)与单个分离的(处理4)胚的萌发百分率(类别1)的比较
[0183]基因型 对照(处理1) 早期单个分离(处理4) 变化％
A 22％ 72％ 50
B 12％ 45％ 32
C 62％ 78％ 16
A 22％ 72％ 50
B 12％ 45％ 32
C 62％ 78％ 16
[0184] 结论：
[0185] 这些结果证明了令人吃惊的发现，即从胚性胚柄团(ESM)早期单个分离，在测试的三种基因型中增加了萌发的成功率，也增加了萌发物的萌发势。
[0186] 尽管已经对本发明的优选实施方案进行了说明和描述，但应该认识到，可以对它们进行各种不同的改变，而不背离本发明的精神和范围。
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