一种可注射型组织工程载体材料及其构建方法
专利汇可以提供一种可注射型组织工程载体材料及其构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 医学工程中用组织工程方法制备人工器官的技术领域，具体是涉及一种组织工程修复材料及其构建方法。该组织工程修复材料是利用初始状态为液态的可降解 生物材料 。以海藻酸钠—明胶共混体系作为载体 支架 ， 种子 细胞附着于载体支架上，形成具有三维结构和生理活性的 复合体 。本发明还提供一种注射型组织工程 骨修复 材料的构建方法。本发明通过体外和体内实验证实了海藻酸钠—明胶共混体系与成骨细胞相容性好，是一种可行的可注射组织工程支架材料。该共混体系构建的可注射性组织工程骨具有广阔的应用前景。，下面是一种可注射型组织工程载体材料及其构建方法专利的具体信息内容。
1、一种可注射型组织工程修复材料，包括载体支架和种子细胞， 种子细胞附着于载体支架上，形成具有三维结构和生理活性的复合 体，其特性在于：以可注射的海藻酸钠-明胶共混体系作为载体支架， 复合种子细胞：所述种子细胞为成骨细胞。
2、根据权利要求1所述的可注射型组织工程修复材料，其特征 在于：所述的可注射的海藻酸钠-明胶共混体系为将海藻酸钠与明胶 的质量比为2∶3，配制浓度为50g/L的海藻酸钠与明胶的共混体系。
3、根据权利要求2所述的可注射型组织工程修复材料，其特征 在于：所述海藻酸钠是用Ca2+作为交联剂处理后形成的有机网络结构 的海藻酸钠。
4、根据权利要求1所述的可注射型组织工程修复材料，其特征 在于：所述的成骨细胞为骨髓基质干细胞经诱导分化，传代增殖培养 至107数量级的成骨细胞。
5、根据权利要求1～4任意一项所述的可注射型组织工程修复材 料的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)种子细胞：抽取骨髓，以密度梯度离心法分离骨髓基质干细胞， 所用的培养基为10％胎牛血清的MEM培养液。成骨诱导细胞培 养液的配制：MEM培养液+10％FBS+50mg/LVitC+10-8mol/L 地塞米松+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠。细胞经传代增殖为107 数量级；
b)可注射性支架材料的构建：以MEM为溶剂，将海藻酸钠与明胶 的质量比为2∶3，配制浓度为50g/L的海藻酸钠与明胶的共混 体系；
c)种子细胞与海藻酸钠-明胶共混体系的复合：将种子细胞加入 步骤B构建的共混体系中，即获得所述的可注射性组织工程骨 修复材料。
技术领域
本发明属于生物医学工程中用组织工程方法制备人工器官的技 术领域，具体是涉及一种组织工程载体材料及其构建方法。
背景技术
发明内容
本发明的另一目的在于提供一种可注射性组织工程骨材料的构 建方法。
本发明所述的一种注射型组织工程载体材料，包括载体支架和种 子细胞，种子细胞附着于载体支架上，形成具有组织三维结构和生理 活性的复合体，以可注射性材料海藻酸钠-明胶共混体系作为支架载 体，复合种子细胞；所述的种子细胞为成骨细胞。
所述的可注射材料海藻酸钠-明胶共混体系为将海藻酸钠与明 胶的质量比为2∶3，配制浓度为50g/L的海藻酸钠与明胶的共混体系。
所述海藻酸钠是用Ca2+作为交联剂处理后形成的有机网络结构的 海藻酸钠。
所述的成骨细胞为骨髓基质干细胞经诱导分化，传代增殖培养至 107数量级的成骨细胞。
本发明所述的可注射组织工程骨修复材料的构建方法，包括以下 步骤：
A.种子细胞：抽取骨髓，以密度梯度离心法分离骨髓基质干细胞， 所用的培养基为10％胎牛血清的MEM培养液。成骨诱导细胞培 养液的配制：MEM培养液+10％FBS+50mg/LVitC+10-8mol/L地 塞米松+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠。细胞经传代增殖为107数量 级。
B.可注射性支架材料的构建：以MEM为溶剂，将海藻酸钠与明胶 的质量比为2∶3，配制浓度为50g/L的海藻酸钠与明胶的共混 体系。
C.种子细胞与海藻酸钠-明胶共混体系的复合：将种子细胞加入 步骤B构建的共混体系中，即获得所述的可注射性组织工程骨 修复材料。
所述的注射型组织工程骨修复材料的制备方法中，优选的海藻酸 钠是用Ca2+作为交联剂处理后形成的有机网络结构的海藻酸钠。
海藻酸钠是一种从海藻中提取的天然多糖聚合物，其分子量高、 呈线型、具有高水合性。因此其水溶性盐类在低浓度时就具有极高的 粘度，是很好的增稠、悬浮剂。其分子链上含有大量的羟基和羧基， 在二价离子如Ca2+存在的条件下，就会形成交联的海藻酸钙聚合物， 表现为含水率高的凝胶状态。大量的细胞生物学实验证明，其与细胞 的相容性很好，具有很好的机械强度，便于成形。
明胶是一种变性蛋白质，由动物的结缔组织或表皮组织中的胶原 部分水解而获得，是来源丰富的天然高分子材料。明胶呈无色或淡黄 色透明、半透明的薄片或微粒，在干燥情况下能长期储存。具有亲水 性强、成膜性好、侧链基团反应活性高、典型的两性电解质特征等诸 多优良的物理与化学性质。能溶于热水，冷却后冻成凝胶状物。具有 热可逆性，力学强度相对较差。同时，易于体内降解。
海藻酸钠和明胶在以往的应用中，通常都是单独使用，所以在材 料的弹性、机械强度、加工性能和含水率等性能方面均不甚理想。本 研究将明胶的降解性能及高含水率，与海藻酸钠良好的交联成形性能 及交联后的较高的机械强度相结合，从而得到了一种综合性能更好的 复合材料。
本发明通过实验结果证实了海藻酸钠-明胶共混体系与成骨细 胞的相容性好，动物实验证明了成骨性能确切，是一种可行的可注射 性组织工程载体支架材料。这种复合材料构建的可注射性组织工程载 体具有广阔的临床应用前景。
附图说明
图1为条件培养液12d细胞为致密岛状结构，形成钙化结节(倒 置显微镜20×10)；
图2凝胶中培养2w后，可观察到正在分裂的细胞(倒置显微镜20 ×10)；
图3皮下埋置实验组12w时CT下表现为阻射影；
图4皮下埋置实验组12w时见结节中有骨样组织，并有骨髓腔样 结构形成。(Mallory染色10×10)；
图5颅骨修复实验组12w三维CT重建见颅骨缺损基本修复；
图6颅骨修复实验组12w成熟骨组织，哈弗氏系统成熟(HE染 色10×10)。
具体实施方式
所述的可注射的海藻酸钠-明胶共混体系作为将海藻酸钠与明 胶的质量比为2∶3，配制浓度为50g/L的海藻酸钠与明胶的共混体系。
所述海藻酸钠是用Ca2+作为交联剂处理后形成的有机网络结构的 海藻酸钠。
所述的成骨细胞为骨髓基质干细胞经诱导分化，传代增殖培养至 107数量级的成骨细胞。
实施例一：种子细胞的培养
二月龄清洁级新西兰纯种大白兔(体重2.0～2.2kg，由北京海 淀区兴隆实验动物养殖场提供)。5％戊巴比妥钠0.6ml/kg耳缘静脉麻 醉后，用骨髓穿刺针抽取骨髓液2～3ml。将骨髓和备好的等体积PBS 混匀，密度梯度离心，吸取Percoll分离液与D-Hank’s液之间的乳 白色云雾状有核细胞层。将所得的细胞加入MEM培养基中吹打，调节 细胞密度为2×105。接种于塑料培养瓶中，置37℃、5％CO2的细胞培 养箱中培养，当细胞达80～90％融合时，进行传代培养。将细胞悬液 移至离心管中，MEM液洗涤2遍，转速500r/min离心5min。轻拍离 心的细胞团片使之松散，加入MEM，以5×104/ml接种到一次性培养 瓶或实验用的培养板中，加入条件培养基(MEM培养液+10％FBS+ 50mg/LVitC+10-8mol/L地塞米松+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠)进行连 续传代观察和实验(图1)。
实施例二：种子细胞与共混体系的复合
用MEM作为溶剂，配制浓度为50g/L的海藻酸钠与明胶的质量 比为2∶3的共混物溶液。25℃恒温下磁力搅拌0.5h，静置0.5h后低 速离心以使小气泡消失，得到透明粉红色胶状液体。将实施例一中的 成骨细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后成悬浮细胞，用台盼兰染色检验 细胞的存活率，大于90％。与海藻酸钠-明胶共混体系混合，细胞终 密度约为1×107/ml，将共混体系用一次性注射器注入0.6％CaCl2溶液 中，形成凝胶。生理盐水洗涤3次，培养液洗涤1次后。将凝胶放置 于培养皿中进行培养，倒置显微镜下观察细胞生长的状况。分别于 1d，2w后取材，通过冰冻切片HE染色观察了解成骨细胞在共混体系 中的形态变化。
实施例三：倒置显微镜观察和HE染色
体外构建的海藻酸钠-明胶共混体系/成骨细胞凝胶置于倒置 显微镜下直接观察所见，可看到细胞都呈现出圆形。在凝胶中培养 2w后，细胞仍呈现正常的圆形生长状态，并且能观察到正在分裂的 细胞(图2)。在凝胶中培养2w后，冰冻切片HE染色显示，成骨细 胞生长在海藻酸钠-明胶共混体系状态良好，细胞呈圆形或椭圆形， 胞核位于细胞中央。
实施例四：共混体系的体内异位成骨
将实施例二的海藻酸钠-明胶共混体系/成骨细胞凝胶1ml以注 射方式植入对应成骨细胞来源实验动物的皮下。分别于注射后12w行 埋置部位薄层CT扫描(层厚0.75mm)检查。
分别于注射后12w局麻下取材，取材后即时以10％甲醛固定10h， 逐级脱水，作组织切片，采用HE染色和Mallory三色法染色观察骨 形成情况。
海藻酸钠-明胶共混体系/成骨细胞凝胶实验组注射后12w时， 结节似骨组织样坚硬，标本外观和剖面类似于骨组织，切片前需行脱 钙处理。CT下表现为阻射影(图3)。结节中有骨样组织，并有骨髓 腔样结构形成，Mallory三色染色主要显示为多量褐红色成熟骨组织 (图4)。
实施例五：共混体系修补颅骨极限缺损
实验动物分别以5％戊巴比妥钠0.6ml/kg耳缘静脉麻醉后，用慢 钻在兔颅骨上制造直径为1.5cm圆形全层骨缺损。动物模型的制备后 1w，在局麻下，实验组在缺损处以实施例二构建海藻酸钠-明胶共混 体系/成骨细胞凝胶对应成骨细胞来源的实验动物以注射方式植入， 修复颅骨极限缺损。
于术后12w在麻醉状况下行头颅CT冠状位薄层扫描(层厚 0.75mm)检查，扫描结束后，将原始数据输入SIEMENS工作站，在 Syngo软件支持下行冠状面重建和三维重建。以耳缘静脉空气栓塞的 方法随机处死实验动物，取材后即时以10％甲醛固定10h，逐级脱水， 作组织切片，采用HE染色Mallory三色染色观察观察骨组织的形成 情况。
术后12w实验组三维重建见缺损基本修复(图5)。
对照组和空白组术后4，8，12w的CT显示：随着时间的推进， 缺损面积较手术后略有缩小，但边缘仍清晰。
12w时缺损区域和周围骨组织形成骨性结合，新生颅骨和原颅骨 的差异已难以辨认。骨小梁粗大，为成熟的层板状骨，哈弗氏系统成 熟(图6)。
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