一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白及应用
阅读：1015发布：2021-01-08
专利汇可以提供一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白及应用，该蛋白具有426个 氨 基酸，如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白理论等电点为9.150，分子量为47.18kD；该蛋白具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所对应的基因序列中开放阅读框（ORF）全长1281bp。实验结果表明：河蟹肝胰腺 组织切片 的免疫组化结果进一步印证了这一推断。而且，基因序列分析显示Esflol蛋白含有两个可能的cAMP或cGMP依赖性蛋白激酶磷 酸化 位点，提示Esflol存在参与到cAMP/cGMP介导的 信号 通路的可能性。结果证明Esflol是CHH调控的信号通路中的一环。对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白在和CHH特异结合，提升了熟蟹肝胰腺的营养价值和 风 味。，下面是一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白及应用专利的具体信息内容。
1.一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白，其特征在于该蛋白具有426个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白理论等电点为9.150，分子量为47.18kD；该蛋白具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所对应的基因序列中开放阅读框（ORF）全长1281bp。
2.权利要求1所述对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白在和CHH特异结合，缩短中华绒螯蟹的生长期，加快其生长发育方面的应用。
3.权利要求2所述的应用，其中缩短中华绒螯蟹的生长期指的是提高河蟹肝胰腺糖原累积，提升熟蟹肝胰腺的营养价值和风味。
4.一种表达中华绒螯蟹Esflol的特异性引物，具有如下的核苷酸序列
F1:5‘-AATTCCATATGATTCCCATTTTCATCA-3’；
R1:5‘-AATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCTACACGGAGGTT-3’。
一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白及应用
[0001] 本研究受到国家自然科学基金青年基金（31302168）；天津市应用基础与前沿技术研究计划(一般项目)（14JCYBJC30700）；天津师范大学博士基金（52XB1303）的支持。
技术领域
背景技术
[0003] 甲壳动物高血糖激素（CHH），是神经多肽激素家族的成员之一。该蛋白仅存在于节肢动物中，在血淋巴葡萄糖水平调节、蜕皮以及应激过程中起着关键作用。虽然细胞膜上的鸟苷酸环化酶（GC）已被公认为Y器官的CHH受体，但在肝胰脏中的受体仍然没有确定。在本研究中，我们通过对河蟹转录组分析，筛选并克隆到了一个在去眼柄后表达量提高了2.8倍的基因—中华绒螯蟹flotilin类似蛋白（Esflol）作为目标分子去研究。通过体外原核表达系统，我们获得了重组flotilin蛋白。利用CHH与重组flotilin蛋白的Pull-down实验以及大分子互作仪检测，我们发现CHH可以和flotilin直接结合。该结果是首次在甲壳动物肝胰腺中发现的CHH结合蛋白，同时表明可以通过体外表达flotilin来调节CHH的浓度。
[0004] 甲壳动物高血糖素（CHH）属于CHH神经肽家族。这个家族包含了一类结构相关的多肽，包括蜕皮抑制激素（MIH），卵黄/精巢抑制激素（VIH/GIH），大腭器抑制激素（MOIH）以及离子转运多肽（ITP）。所有这些成员都只在节肢动物中发现。
[0005] 学界广泛认为，CHH是能够调控几种生理活性的多效分子，如血糖水平，脂类代谢，蜕皮与应激反应。第一次对CHH的描述是关于其对糖代谢的调控的。肝脏和肌肉是CHH的主要靶标器官，肝脏在蜕皮过程中的所起到的作用是储存能量，肌肉亦是另一个糖原的储存场所。学者们认为，CHH在对下游分子的调节机理上在肝脏和肌肉这两种器官中是明显不同的。肌肉的糖原只供给其自身，相比之下肝脏所合成与储存的糖原是供给全身的。
[0006] 在外界环境的胁迫下，机体中糖原的变化和总碳水化合物的变化总是伴随着CHH的分泌量的变化。当剪去斑节对虾和罗氏沼虾的眼柄后，糖原磷酸化酶明显下降而糖原合成酶的明显上升，这预示着去除眼柄能够促进糖原的积累。另外，肝胰腺在含CHH溶液中的浸泡能够使得葡萄糖转化为糖原的比例降低。综合这些得到的证据表明CHH确实是参与肝脏的糖原代谢的，但CHH的受体以及信号传导通路还是不明确。在甲壳动物中，已经明确的证实了当减去眼柄之后，肝脏的细胞内cGMP水平会显著下降，而不是cAMP。也即表明，在甲壳动物中蛋白激酶G替代了蛋白激酶A参与到了CHH介导酶激活系统。但是细胞膜表面直接和CHH作用的分子依然悬而未决。
[0007] flotilins被认为是定位在细胞膜表面脂筏（lipid raft）上的连接性蛋白。除此之外，它们能分布在细胞内体，吞噬体，高尔基体甚至细胞核，直到现在，关于flotilins是否只在质膜上存在还没有定论。
[0008] 在flotilin家族中存在两种同源异构体，flotilin1和flotilin2。一般认为，这两类蛋白会相互结合形成异源多聚体，并参与到一些细胞活动中，如轴突再生，膜蛋白更新，以及内吞作用等等。虽然flotilin在种间进化上十分保守，但它的确切功能依然存在较大的争议并需要进一步的证据来证明许多的推断。最早，在金鱼的视网膜细胞轴突再生的研究中发现了flotilin，当时被命名为再生reggies。敲除flotilins可显著减弱机体对胆固醇的吸收，这意味着它在NPC1L1介导的胆固醇吸收机制中起着关键的作用。在T细胞c中，flotilins被定位在细胞的一端，形成一个flotilin帽子结构，这个结构能够激活PrP导致主要的T细胞受体复合体CD3的回收，而连接这一受体和一类信号分子如Vav的通路也被人们发现。也就是说，flotilin形成的亚结构能作为T细胞的信号平台。
[0009] 据推测，在细胞某些特定位置的Flotilins能够参与细胞膜以及膜表面蛋白的更新。在脂肪细胞，Flotilins能够从细胞深层将GLUT4回收到细胞表面。一些数据还支持说Reggie/flotilin蛋白能在细胞相互接触的区域参与信号过程。
[0010] 作为理解甲壳动物中Flotilin类似蛋白功能的第一步，我们找到了一个了河蟹E.sinesisflotilin类似基因，命名为Esflol。在本研究中，我们对Esflol进行了原核表达，并检测了其与CHH的结合能力。结果显示，Esflol能和CHH特异结合。
发明内容
[0011] 本发明公开了一种对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白，其特征在于该蛋白具有426个氨基酸，如SEQ ID NO.1所示，编码的蛋白理论等电点为9.150，分子量为47.18kD；该蛋白具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所对应的基因序列中开放阅读框（ORF）全长1281bp。
[0012] 本发明进一步公开了一种表达中华绒螯蟹Esflol的特异性引物，具有如下的核苷酸序列：F1:5‘-AATTCCATATGATTCCCATTTTCATCA-3’；
R1:5‘-AATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCTACACGGAGGTT-3’。
R1:5‘-AATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCTACACGGAGGTT-3’。
[0013] 本发明更进一步公开了对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白在和CHH特异结合，缩短中华绒螯蟹的生长期，加快其生长发育治疗方面的应用。其中缩短中华绒螯蟹的生长期指的是提高河蟹肝胰腺糖原累积。实验结果证实：（1）本发明，证明CHH能够与Esflol产生特异性结合作用。
[0014] （2）本发明证实Esflol能够作为CHH的受体参与CHH对河蟹血糖水平的调控。
[0015] 本发明公开的对CHH具有结合活性的重组河蟹Esflol蛋白及应用所具有的积极效果在于：（1）能够缩短养殖产业上中华绒螯蟹的养殖周期，实现养殖户利润的最大化。
[0016] （2）提高养殖河蟹的平均重量，增加亩产。
[0018] 本发明所筛选的核苷酸及氨基酸序列如下：SEQ ID NO.1所示的Esflol核苷酸序列：
ATGATTCCCATTTTCATCACGTGTCCGCCCAATGAAGTCCTGGTGGTGTCTGGCCTCGGGTTCACGCAGCCAGCCATGATCACTGGAGGCCGCGTGCTCGTCGTGCCCGGCCTGATGAGATGGAGCAGACTGTCCCTGAACGTTCGCACCATCACAGTCCACTCACCTGATGTGTACACGGCCCGAGGTGTTGCCATCAAGGTTACAGGAGTAGCTCAGGTCAAAATCAACACCCAGCATCCCAAGGTCCTGGCGATGGCTTGCGAGCATTTCCTGAAGAAGAAGCAGAGCGAGATCGACACCCTCATCACTTCGACGCTGGAGGGTCACCAACGCGGCATTATGGGCACGATGAATGTTGAGGACATCTACAAAAATCGAAAGCTGTTCAACGAGCGAGTGTTTAACGTGGCCTCCAAGGACCTCTACAACCTTGGCCTCCACGTCATCTCCTACACCATCACGGATCTCAGTGACGACATGGGTTACCTAAAAGCTCTGGGCAAGGGGAGGACAGCCGAGGTACAACGTGACGCTCGGATCGGGGAGGCGGAGGCAAAGAAGGACGCAATGATAGAGAAATGCATTGCCTCGGAGCAGCTGATGAAGGCGAAGCTTGCCAATGACACGCTGGTAGCCGAATTTAACAGGGATTTCCAGTTGAAGAAAGCCACTTATGACCAGGAGGTTCGGGCTAAGCAAGCAGAAACCGACCTTGCGTTTGAACTTCGGACCTGCAAGACAAAACAGAAGATCAAAGAAGAAGTGATGGAGACGAAGGTGGTGGAGAGGAAGGCCAGGATCTTAGTGGCGGAGCAGCAAATTCAACTAACTGAGAAAAaGCTGGAGGCCGAGGTGAAGCAACCATCGGATGCGGAAAAATTCAGGCTGGAGACCATTGCCGGGGCCCAGAAACAAAGGCTGCTTCTGGAGGCTGAGGCGGCGGCGGAGGCGAAGCGGCTGATGGGCGAGGCTCAAGCACTGGCCATCACGGCTAAGGGTAATGCAGAGGCCACCAATATGCACCGCAAGGCAGAGGCGTGGAAGGAGTTCAAGGACGCGGCGATGTTAAGTATGTACCTGGAGACCCTGCCCAAGCTGGTGGGCGAGGTCGGCAGCGCCCTGGGCAATGTCAAAAGCATCAAGATGGTGTCCTCAGGTGACTCTCCTATCGGGGCACAGAAACTGACCCAGGAAATCATGGACATCAGCAGCAACGTGCCCGCCATGGTCAAGAATCTCACGGGCGTCAACTTCATGAAGAACCTCCGTGTAGCATGA
SEQ ID NO.2所示的Esflol氨基酸序列：
MIPIFITCPPNEVLVVSGLGFTQPAMITGGRVLVVPGLMRWSRLSLNVRTITVHSPDVYTARGVAIKVTGVAQVKINTQHPKVLAMACEHFLKKKQSEIDTLITSTLEGHQRGIMGTMNVEDIYKNRKLFNERVFNVASKDLYNLGLHVISYTITDLSDDMGYLKALGKGRTAEVQRDARIGEAEAKKDAMIEKCIASEQLMKAKLANDTLVAEFNRDFQLKKATYDQEVRAKQAETDLAFELRTCKTKQKIKEEVMETKVVERKARILVAEQQIQLTEKKLEAEVKQPSDAEKFRLETIAGAQKQRLLLEAEAAAEAKRLMGEAQALAITAKGNAEATNMHRKAEAWKEFKDAAMLSMYLETLPKLVGEVGSALGNVKSIKMVSSGDSPIGAQKLTQEIMDISSNVPAMVKNLTGVNFMKNLRVA.
附图说明：
图1质粒PET30-Esflol转化至Rosetta菌株后PCR insertcheck 电泳结果；
图2 Esflol中稀有密码子检测情况（灰色部分表示稀有密码子的种类及数量）图3 PET30-Esflol与空白PET30诱导表达以及破碎纯化SDS-PAGE检测结果；
图4 CHH抗体Western Blot检 测Pull-down各组分：1.T1实验 组，Bait:CHH, Prey:Esflol;2.C1对照组，Bait: Wash solution,Prey:Esflol;3.C2对照组Bait:CHH, Prey:Wash solution；
图5 Western Blot检测Esflol Pull-down结果（以膜蛋白提取物为阳性对照）Pull-down Esflol组， Bait:CHH, Prey:Esflol；Control Esflol组，膜蛋白；
图6 Western Blot检测Esflol Pull-down结果（以原核表达蛋白样品为阳性对照）Pull-down Esflol组，Bait：TBS，Prey: rEsflol;Control Esflol组，rEsflol；
图7 CHH与Esflol互作结果分析。
ATGATTCCCATTTTCATCACGTGTCCGCCCAATGAAGTCCTGGTGGTGTCTGGCCTCGGGTTCACGCAGCCAGCCATGATCACTGGAGGCCGCGTGCTCGTCGTGCCCGGCCTGATGAGATGGAGCAGACTGTCCCTGAACGTTCGCACCATCACAGTCCACTCACCTGATGTGTACACGGCCCGAGGTGTTGCCATCAAGGTTACAGGAGTAGCTCAGGTCAAAATCAACACCCAGCATCCCAAGGTCCTGGCGATGGCTTGCGAGCATTTCCTGAAGAAGAAGCAGAGCGAGATCGACACCCTCATCACTTCGACGCTGGAGGGTCACCAACGCGGCATTATGGGCACGATGAATGTTGAGGACATCTACAAAAATCGAAAGCTGTTCAACGAGCGAGTGTTTAACGTGGCCTCCAAGGACCTCTACAACCTTGGCCTCCACGTCATCTCCTACACCATCACGGATCTCAGTGACGACATGGGTTACCTAAAAGCTCTGGGCAAGGGGAGGACAGCCGAGGTACAACGTGACGCTCGGATCGGGGAGGCGGAGGCAAAGAAGGACGCAATGATAGAGAAATGCATTGCCTCGGAGCAGCTGATGAAGGCGAAGCTTGCCAATGACACGCTGGTAGCCGAATTTAACAGGGATTTCCAGTTGAAGAAAGCCACTTATGACCAGGAGGTTCGGGCTAAGCAAGCAGAAACCGACCTTGCGTTTGAACTTCGGACCTGCAAGACAAAACAGAAGATCAAAGAAGAAGTGATGGAGACGAAGGTGGTGGAGAGGAAGGCCAGGATCTTAGTGGCGGAGCAGCAAATTCAACTAACTGAGAAAAaGCTGGAGGCCGAGGTGAAGCAACCATCGGATGCGGAAAAATTCAGGCTGGAGACCATTGCCGGGGCCCAGAAACAAAGGCTGCTTCTGGAGGCTGAGGCGGCGGCGGAGGCGAAGCGGCTGATGGGCGAGGCTCAAGCACTGGCCATCACGGCTAAGGGTAATGCAGAGGCCACCAATATGCACCGCAAGGCAGAGGCGTGGAAGGAGTTCAAGGACGCGGCGATGTTAAGTATGTACCTGGAGACCCTGCCCAAGCTGGTGGGCGAGGTCGGCAGCGCCCTGGGCAATGTCAAAAGCATCAAGATGGTGTCCTCAGGTGACTCTCCTATCGGGGCACAGAAACTGACCCAGGAAATCATGGACATCAGCAGCAACGTGCCCGCCATGGTCAAGAATCTCACGGGCGTCAACTTCATGAAGAACCTCCGTGTAGCATGA
SEQ ID NO.2所示的Esflol氨基酸序列：
MIPIFITCPPNEVLVVSGLGFTQPAMITGGRVLVVPGLMRWSRLSLNVRTITVHSPDVYTARGVAIKVTGVAQVKINTQHPKVLAMACEHFLKKKQSEIDTLITSTLEGHQRGIMGTMNVEDIYKNRKLFNERVFNVASKDLYNLGLHVISYTITDLSDDMGYLKALGKGRTAEVQRDARIGEAEAKKDAMIEKCIASEQLMKAKLANDTLVAEFNRDFQLKKATYDQEVRAKQAETDLAFELRTCKTKQKIKEEVMETKVVERKARILVAEQQIQLTEKKLEAEVKQPSDAEKFRLETIAGAQKQRLLLEAEAAAEAKRLMGEAQALAITAKGNAEATNMHRKAEAWKEFKDAAMLSMYLETLPKLVGEVGSALGNVKSIKMVSSGDSPIGAQKLTQEIMDISSNVPAMVKNLTGVNFMKNLRVA.
附图说明：
图1质粒PET30-Esflol转化至Rosetta菌株后PCR insertcheck 电泳结果；
图2 Esflol中稀有密码子检测情况（灰色部分表示稀有密码子的种类及数量）图3 PET30-Esflol与空白PET30诱导表达以及破碎纯化SDS-PAGE检测结果；
图4 CHH抗体Western Blot检 测Pull-down各组分：1.T1实验 组，Bait:CHH, Prey:Esflol;2.C1对照组，Bait: Wash solution,Prey:Esflol;3.C2对照组Bait:CHH, Prey:Wash solution；
图5 Western Blot检测Esflol Pull-down结果（以膜蛋白提取物为阳性对照）Pull-down Esflol组， Bait:CHH, Prey:Esflol；Control Esflol组，膜蛋白；
图6 Western Blot检测Esflol Pull-down结果（以原核表达蛋白样品为阳性对照）Pull-down Esflol组，Bait：TBS，Prey: rEsflol;Control Esflol组，rEsflol；
图7 CHH与Esflol互作结果分析。
[0019] 具体实施方式：下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定；其中所用试剂均有市售；
实施例1
中华绒螯蟹Esflol的原核表达与纯化
原核表达载体为PET-30 vector，表达菌株为Rosetta菌株。 Etaq酶，DNA marker DL2000，pMD19-T vector，Nde I，EcorⅠ， DNA Ligation kit均购自TaKaRa公司；琼脂糖、SanPrep柱式DNA小量抽提试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、LB固体培养基、LB液体培养基、异丙醇、异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、甘氨酸、EDTA、SDS、TEMED、Acrylamide（40%）、过硫酸胺、考马斯亮蓝R-250、溴酚蓝、Tris等试剂均购自上海生工生物工程有限公司；蛋白marker购自Fermentas公司；其他试剂均为国产分析纯。
实施例1
中华绒螯蟹Esflol的原核表达与纯化
原核表达载体为PET-30 vector，表达菌株为Rosetta菌株。 Etaq酶，DNA marker DL2000，pMD19-T vector，Nde I，EcorⅠ， DNA Ligation kit均购自TaKaRa公司；琼脂糖、SanPrep柱式DNA小量抽提试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、LB固体培养基、LB液体培养基、异丙醇、异丙基-B-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、甘氨酸、EDTA、SDS、TEMED、Acrylamide（40%）、过硫酸胺、考马斯亮蓝R-250、溴酚蓝、Tris等试剂均购自上海生工生物工程有限公司；蛋白marker购自Fermentas公司；其他试剂均为国产分析纯。
[0020] 1.1表达载体的构建（1）设计PCR引物
F1:5‘-AATTCCATATGATTCCCATTTTCATCA-3’；
R1:5‘-AATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCTACACGGAGGTT-3’，
上游引物添加NdeI酶切位点，下游引物加6个His密码子和EcorI酶切位点。以中华绒螯蟹肝胰腺组织cDNA为模板进行PCR，反应体系及程序如下：
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，进行测序。
F1:5‘-AATTCCATATGATTCCCATTTTCATCA-3’；
R1:5‘-AATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCTACACGGAGGTT-3’，
上游引物添加NdeI酶切位点，下游引物加6个His密码子和EcorI酶切位点。以中华绒螯蟹肝胰腺组织cDNA为模板进行PCR，反应体系及程序如下：
PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，进行测序。
[0021] （2）以PET30 vector为表达载体，Rosetta为表达菌种，构建原核表达体系，具体步骤同上。
[0022] 1.2 Esflol的诱导表达（1）实验前一日用灭菌的小锥形瓶摇菌10mL用于次日转接入大瓶内培养，一个大瓶（330mL）中可转入3mL菌液。
（2）在3只大三角瓶的培养基里加入Amp（50-400μg/mL）与盐酸壮观霉素素溶液（10-100μg/mL），两种抗生，然后将小锥形瓶中的菌液在超净工作台内转入大瓶中，再将大瓶放到摇床内复摇。
（2）在3只大三角瓶的培养基里加入Amp（50-400μg/mL）与盐酸壮观霉素素溶液（10-100μg/mL），两种抗生，然后将小锥形瓶中的菌液在超净工作台内转入大瓶中，再将大瓶放到摇床内复摇。
[0023] （3）当大瓶内的菌液浓度适宜(OD值0.4-0.6)后，取1ml未诱导的菌液至一1.5mL离心管中做对照（0h取样），暂时保存于4℃冰箱中，其余加入IPTG至终浓度0.1-10mM诱导，0.1mol/LIPTG：LB 培养基=1:100。（4）分时间点取样，以0h,1h,2h,3h,4h,5h,6h分别取1ml诱导物转入1.5mL EP管中，同样暂时保存于4℃冰箱中，待所有时间点样品均收集完，室温下3000rpm离心1min,弃上清，将离心下来的菌体重悬于24μL去离子水中。其余菌液4℃，3000-10000rpm，2-10min，分批将菌体收集在2个100mL大离心管中，-80℃超低温冰箱中保存备用。（5）各时间点样品中加入6μL的5×SDS sample buffer，充分混匀，电磁炉上100℃水浴加热5-20min,室温冷却后-20℃保存，隔天室温融化后涡旋仪混匀，短离后每种悬液取
6μL上清点样于10%浓度的SDS-PAGE凝胶上。制胶及电泳步骤同3.1.4.2。
（6）胶跑完后，染色液染色2h以上后进行过夜脱色，脱色液没过胶，一侧放置一段打结的卫生纸，将染色盒置于摇床上摇摆直至脱色完全。
6μL上清点样于10%浓度的SDS-PAGE凝胶上。制胶及电泳步骤同3.1.4.2。
（6）胶跑完后，染色液染色2h以上后进行过夜脱色，脱色液没过胶，一侧放置一段打结的卫生纸，将染色盒置于摇床上摇摆直至脱色完全。
[0024] （7）可用含有空载PET30的Rosetta菌株作为对照，进行诱导表达，以确定重组的Esflol表达载体是否表达目的蛋白。具体诱导表达步骤同上。
[0025] 1.3 Esflol蛋白的纯化蛋白粗提样制备
（1）取出超低温冰箱中保存的菌体，每管中加入30mL bufferA，涡旋仪震荡将菌体均匀重悬。
（1）取出超低温冰箱中保存的菌体，每管中加入30mL bufferA，涡旋仪震荡将菌体均匀重悬。
[0026] （2）每管中加入溶菌酶至浓度0.1-10mg/mL,混匀，冰上静置10-30min。
[0027] （3）用超声破碎仪破碎，程序为超声3s，间隔3s，10min，400w,每一管重复3次，破碎一次后要将离心管拿出放在冰上，使破碎液降温，此时可以破碎另一管。破碎后4℃，8000-14000rpm，离心10min，将上清标记为buffer A wash，沉淀待用。
[0028] （4）先在含沉淀的离心管中加约15mL buffer B，涡旋仪重悬沉淀，然后补齐buffer B至30mL，盖严盖子，用双手剧烈震荡15min。震荡完后4℃，8000-14000rpm，离心10min，上清标记为buffer B wash，沉淀待用。
（5）洗涤完毕后加入WashⅠ，同样先加约15mL重悬沉淀，然后补至30mL,用手剧烈震动25min，然后4℃，8000-14000rpm，离心10min，目的蛋白在上清中，余下的沉淀为一些细胞碎片，脂类，杂蛋白，也包括部分目的蛋白。上清过0.22μm的滤膜，收集过膜后的蛋白溶液，准备过蛋白纯化仪，进行蛋白细提纯。
1.4 蛋白过纯化仪提纯
（1）打开蛋白纯化仪系统，调整所有参数，调整流速为1-4mL/min。
（5）洗涤完毕后加入WashⅠ，同样先加约15mL重悬沉淀，然后补至30mL,用手剧烈震动25min，然后4℃，8000-14000rpm，离心10min，目的蛋白在上清中，余下的沉淀为一些细胞碎片，脂类，杂蛋白，也包括部分目的蛋白。上清过0.22μm的滤膜，收集过膜后的蛋白溶液，准备过蛋白纯化仪，进行蛋白细提纯。
1.4 蛋白过纯化仪提纯
（1）打开蛋白纯化仪系统，调整所有参数，调整流速为1-4mL/min。
[0029] （2）依次用均经过0.22μm滤膜的20%乙醇、去离子水、WashⅠ润洗系统，在以20%乙醇润洗的过程中安装镍柱，注意避免安装过程中进入空气，安装后流速调整至1mL/min。每种组分润洗均达到pH、电导、紫外三个指标达到平衡状态再更换下一组分。每次更换润洗组分后，立即用注射器从B2口抽取部分液体以避免空气进入纯化仪，同时使新的组分快速充满系统。
（3）将UV调零，准备上样。上样时，UV指示线出现吸收峰，指示样品中蛋白含量。
（3）将UV调零，准备上样。上样时，UV指示线出现吸收峰，指示样品中蛋白含量。
[0030] （4）上样完毕后，依次用Wash系列洗脱，目的是洗脱非特异性结合在镍柱上的杂蛋白。
[0031] （5）最后用Elution洗脱目的蛋白，收集UV出现单一峰图时的洗脱液。保存于-80℃超低温冰箱。洗脱后再依次用去离子水、20%乙醇清洗系统中残余尿素，20%乙醇清洗过程中卸下镍柱，保证镍柱中充满20%乙醇液体，保存于4℃冰箱中。清洗系统至各指标均达到平衡水平后关闭蛋白纯化仪系统。
[0032] 1.5 蛋白复性和冻干（1）配制梯度复性液，过0.22μm滤膜。取出-80℃超低温冰箱中保存的蛋白样品4℃融化样品。
（2）剪取合适长度的透析袋，去离子水中浸泡30min，恢复柔软状态后，将一端折叠三次后用干净的夹子夹紧。将融化后的蛋白样品用移液枪加入到透析袋中，挤出袋中残余空气，避免袋子过满，预留部分空间，将透析袋另一侧同样折叠三次用干净的夹子夹紧。轻轻挤压袋子观察是否有液体漏出，如没有则将透析袋浸入8M尿素复性缓冲液中。
（2）剪取合适长度的透析袋，去离子水中浸泡30min，恢复柔软状态后，将一端折叠三次后用干净的夹子夹紧。将融化后的蛋白样品用移液枪加入到透析袋中，挤出袋中残余空气，避免袋子过满，预留部分空间，将透析袋另一侧同样折叠三次用干净的夹子夹紧。轻轻挤压袋子观察是否有液体漏出，如没有则将透析袋浸入8M尿素复性缓冲液中。
[0033] （3）将纯化后的蛋白在4℃条件下进行复性，利用磁力搅拌器使装有纯化蛋白的透析袋在复性缓冲液中匀速缓慢转动。蛋白在每一浓度梯度的尿素复性缓冲液中复性4h（可适当延长复性时间至过夜）后，换下一浓度的尿素复性缓冲液，直到0M。（4）复性完毕后将蛋白样品用移液枪取出，置于1.5mL EP管中，4℃，1000rpm离心
10min，弃去沉淀，移液枪吸取上清转移至新的5mL EP管中，并在-80℃超低温冰箱中冷冻过夜。
10min，弃去沉淀，移液枪吸取上清转移至新的5mL EP管中，并在-80℃超低温冰箱中冷冻过夜。
[0035] 实施例2Esflol与CHH的Pull-Down实验
（1）利用构建好的Esflol与CHH构建好的原核表达系统，经过表达、纯化、复性，最终获得溶解于TBS溶液中的两种目的蛋白，保存于-80℃超低温冰箱中备用。
（1）利用构建好的Esflol与CHH构建好的原核表达系统，经过表达、纯化、复性，最终获得溶解于TBS溶液中的两种目的蛋白，保存于-80℃超低温冰箱中备用。
[0036] （2）将超低温冰箱中保存的蛋白样品取出，于室温融化，Nanodrop检测蛋白浓度后，放置在冰上备用；（3）将三组预装柱与回收管组装好，分别标记为T1、C1、C2；
（4）配制30mlwash solution：将TBS溶液与Pierce Lysis Buffer按照1：1-1:3的比例混匀，并加入3-6M 咪唑Stock Solution，令wash solution中咪唑终浓度为10mM；
（5）用涡旋仪将HisPur Cobalt Resin填料混匀，用减掉前端尖头的枪头向每一个预装柱灌入50μL完全混匀的填料；
（6）向每个柱子中加入400μL wash solution，将柱子的上下盖子盖严，上下颠倒数次，将柱子上下盖子全部除去，放回回收管中；
（7）800-1400g，离心10-50s，倒掉回收管中的液体，将柱子下方的盖子盖好。重复以上步骤共洗涤五次；
（8）将1.5ml TBS-CHH蛋白溶液与Pierce Lysis Buffer按照1：1的比例混匀，向T1与C2两个柱子中分别加入800μL蛋白样品稀释液，再向C1中加入等量的wash solution。
（4）配制30mlwash solution：将TBS溶液与Pierce Lysis Buffer按照1：1-1:3的比例混匀，并加入3-6M 咪唑Stock Solution，令wash solution中咪唑终浓度为10mM；
（5）用涡旋仪将HisPur Cobalt Resin填料混匀，用减掉前端尖头的枪头向每一个预装柱灌入50μL完全混匀的填料；
（6）向每个柱子中加入400μL wash solution，将柱子的上下盖子盖严，上下颠倒数次，将柱子上下盖子全部除去，放回回收管中；
（7）800-1400g，离心10-50s，倒掉回收管中的液体，将柱子下方的盖子盖好。重复以上步骤共洗涤五次；
（8）将1.5ml TBS-CHH蛋白溶液与Pierce Lysis Buffer按照1：1的比例混匀，向T1与C2两个柱子中分别加入800μL蛋白样品稀释液，再向C1中加入等量的wash solution。
[0037] （9）将柱子的上下盖子盖好，并用封口膜密封，4°C于摇床上轻轻摇晃孵育1h；（10）利用Proteo Extract Native Membrane Protein Extraction Kit膜蛋白抽提试剂盒（购自merckmillipore公司）提取中华绒螯蟹肝胰腺中的膜蛋白；
（11）取下柱子的上下盖子，放入回收管中，1250g离心30s。回收离心得到的液体，标记为bait flow-through；
（12）盖好柱子下方的盖子，向每个柱子中加入400μL 洗涤缓冲液，盖好上下盖子，上写颠倒数次，取下所有盖子，将柱子置于回收管中。1250g离心30s，重复以上步骤共洗涤5次；
（13）盖好柱子下方的盖子，将提取的膜蛋白分别加入T1、C1中，每个柱子800μL，再向C2中加入等量的wash solution；
（14）将柱子的上下盖子盖好，并用封口膜密封，4°C于摇床上轻轻摇晃孵育1h；
（15）取下柱子的上下盖子，放入回收管中，1250g离心30s。回收离心得到的液体，标记为prey flow-through；
（16）盖好柱子下方的盖子，向每个柱子中加入400μL wash solution，盖好上下盖子，上写颠倒数次，取下所有盖子，将柱子置于回收管中。1250g离心30s，重复以上步骤共洗涤
5次；
（17）准备1mL290mM Elution Buffer：70μL 4M 咪唑 Stock Solution 加入到
930μLwash solution中，并完全混匀；
（18）盖好柱子下方盖子，每个柱子中加入250μL Elution Buffer，盖好柱子上下盖子，在摇床上轻轻摇晃孵育5min；
（19）取下柱子的上下盖子，将柱子置于回收管中。800-1400g离心1-50s，将回收的液体对应标记为T1 Elution、C1 Elution、C2 Elution；
（20）以SDS-PAGE与Western Blot检测Pull-Down结果。
（11）取下柱子的上下盖子，放入回收管中，1250g离心30s。回收离心得到的液体，标记为bait flow-through；
（12）盖好柱子下方的盖子，向每个柱子中加入400μL 洗涤缓冲液，盖好上下盖子，上写颠倒数次，取下所有盖子，将柱子置于回收管中。1250g离心30s，重复以上步骤共洗涤5次；
（13）盖好柱子下方的盖子，将提取的膜蛋白分别加入T1、C1中，每个柱子800μL，再向C2中加入等量的wash solution；
（14）将柱子的上下盖子盖好，并用封口膜密封，4°C于摇床上轻轻摇晃孵育1h；
（15）取下柱子的上下盖子，放入回收管中，1250g离心30s。回收离心得到的液体，标记为prey flow-through；
（16）盖好柱子下方的盖子，向每个柱子中加入400μL wash solution，盖好上下盖子，上写颠倒数次，取下所有盖子，将柱子置于回收管中。1250g离心30s，重复以上步骤共洗涤
5次；
（17）准备1mL290mM Elution Buffer：70μL 4M 咪唑 Stock Solution 加入到
930μLwash solution中，并完全混匀；
（18）盖好柱子下方盖子，每个柱子中加入250μL Elution Buffer，盖好柱子上下盖子，在摇床上轻轻摇晃孵育5min；
（19）取下柱子的上下盖子，将柱子置于回收管中。800-1400g离心1-50s，将回收的液体对应标记为T1 Elution、C1 Elution、C2 Elution；
（20）以SDS-PAGE与Western Blot检测Pull-Down结果。
[0038] 大分子互作仪检测Esflol与CHH的结合（1）所有反应均在30℃条件下于黑色96孔板中进行，首先用河蟹生理盐水平衡链亲和生物素包被生物传感器与仪器；
（2）将10μM溶解于河蟹生理盐水的生物素化的rCHH加入板中孵育100-500s，使其被生物传感器捕捉；
（3）用生理盐水清洗30-100s，洗去未结合的rCHH；
（4）设置四个递减的浓度梯度，（以452nM为起始浓度，1.3倍连续稀释）将Esflol溶解于河蟹生理盐水中；
（5）将所有浓度的Esflol与rCHH结合300s，再分离600s。为保证排除非特异性结合，设置一组不含有Esflol的河蟹生理盐水作为对照组；
（6）利用ForteBio Data Analysis Software 7.0对结果进行分析。
（2）将10μM溶解于河蟹生理盐水的生物素化的rCHH加入板中孵育100-500s，使其被生物传感器捕捉；
（3）用生理盐水清洗30-100s，洗去未结合的rCHH；
（4）设置四个递减的浓度梯度，（以452nM为起始浓度，1.3倍连续稀释）将Esflol溶解于河蟹生理盐水中；
（5）将所有浓度的Esflol与rCHH结合300s，再分离600s。为保证排除非特异性结合，设置一组不含有Esflol的河蟹生理盐水作为对照组；
（6）利用ForteBio Data Analysis Software 7.0对结果进行分析。
[0039] 实施例3结果
1. 中华绒螯蟹Esflol的原核表达
1.1 Esflol原核表达载体构建
本实验成功构建了PET30-Esflol表达载体，并通过Rosetta菌株进行原核表达成功获得了重组Esflol蛋白。在构建原核表达体系的过程中，表达菌株的选择至关重要。Esflol分子量较大，属于膜蛋白，通过原核表达并得到具有一定难度。真核细胞密码子偏好性和原核系统有所不同，因此，在利用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。Esflol蛋白中就具有这样的稀有密码子。所以最终选择Rosetta菌株作为表达菌株，Rosetta是一种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种稀有密码子对应的 tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，同时它又能够促进二硫键的形成，帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。Esflol蛋白的获得为下一步的研究提供了实验材料，为对其功能的探索奠定了基础。图1中显示为构建好的PET30-Esflol原核表达载体转化到Rosetta菌株后挑选单一克隆的PCR insertcheck1%琼脂糖凝胶电泳结果。
在目的大小1300左右的位置出现清晰单一的条带，后经测序证明为接入了Esflol的PET30载体，证明原核表达体系构建成功。图2稀有密码子分析显示Esflol中含有12个稀有密码子，较适合选用Rosetta作为表达菌种。
1. 中华绒螯蟹Esflol的原核表达
1.1 Esflol原核表达载体构建
本实验成功构建了PET30-Esflol表达载体，并通过Rosetta菌株进行原核表达成功获得了重组Esflol蛋白。在构建原核表达体系的过程中，表达菌株的选择至关重要。Esflol分子量较大，属于膜蛋白，通过原核表达并得到具有一定难度。真核细胞密码子偏好性和原核系统有所不同，因此，在利用原核系统表达真核基因的时候，真核基因中的一些密码子对于原核细胞来说可能是稀有密码子，从而导致表达效率和表达水平很低。Esflol蛋白中就具有这样的稀有密码子。所以最终选择Rosetta菌株作为表达菌株，Rosetta是一种携带pRARE2质粒的BL21衍生菌，补充大肠杆菌缺乏的七种稀有密码子对应的 tRNA，提高外源基因、尤其是真核基因在原核系统中的表达水平，同时它又能够促进二硫键的形成，帮助表达需要借助二硫键形成正确折叠构象的真核蛋白。Esflol蛋白的获得为下一步的研究提供了实验材料，为对其功能的探索奠定了基础。图1中显示为构建好的PET30-Esflol原核表达载体转化到Rosetta菌株后挑选单一克隆的PCR insertcheck1%琼脂糖凝胶电泳结果。
在目的大小1300左右的位置出现清晰单一的条带，后经测序证明为接入了Esflol的PET30载体，证明原核表达体系构建成功。图2稀有密码子分析显示Esflol中含有12个稀有密码子，较适合选用Rosetta作为表达菌种。
[0040] 1.2 PET30-Esflol与PET30空载体诱导表达对照以及Esflol的纯化由图三中重组载体与空载载体诱导表达的对照结果可以看出，虽然重组载体诱导表达
0h与6h后并未观察到有某一蛋白呈现出表达量由少至多的变化，但是经过和空载PET30诱导表达结果进行对比不难发现，在预测大小48kD的位置上，重组载体的0h、6h和包涵体沉淀样品中均出现了空载表达时不存在的蛋白条带，后经镍柱His标签特异性纯化，条带更加明显，确定了重组载体成功表达了Esflol蛋白。
0h与6h后并未观察到有某一蛋白呈现出表达量由少至多的变化，但是经过和空载PET30诱导表达结果进行对比不难发现，在预测大小48kD的位置上，重组载体的0h、6h和包涵体沉淀样品中均出现了空载表达时不存在的蛋白条带，后经镍柱His标签特异性纯化，条带更加明显，确定了重组载体成功表达了Esflol蛋白。
[0041] 1.3 Esflol蛋白的复性冻干及质谱鉴定结果纯化后的Esflol蛋白，经过复性冻干，取部分粉末溶解于2% SDS中，经SDS-PAGE检测后发现，在预测大小48kD的位置有一条单一清晰的蛋白条带。割取此条带进行蛋白质谱分析，质谱测序结果得到的氨基酸序列与Esflol根据mRNA翻译预测的氨基酸序列进行对比，有五条以上成功匹配，证明通过原核表达得到的蛋白确为Esflol蛋白。
[0042] 与Esflol的Pull-down结果分析Pull-down实验是利用一种蛋白与亲和柱特异性结合作为诱饵蛋白，从而筛选出能与诱饵蛋白特异性结合的蛋白。本实验假定CHH与Esflol蛋白为上游激素与下游直接受体的关系，所以选择原核表达获得的拥有6个组氨酸标签的rCHH作为诱饵蛋白，从中华绒螯蟹肝胰腺组织中提取的包含有Esflol的膜蛋白样品作为待捕获蛋白。因为原核表达获得的rCHH与rEsflol都具有His标签，为了避免待捕获蛋白与亲和柱的非特异性结合，应避免待捕获蛋白自身带有His标签，而具有生理活性的CHH半衰期较短，只有10-15min，较不容易从生物体中直接获得。所以最终确定原核表达获得经过复性的rCHH作为诱饵蛋白，含有Esflol蛋白的中华绒螯蟹肝胰腺组织膜蛋白提取物作为待捕获蛋白样品进行Pull-down实验。从实验结果显示，实验组中虽然并未见在Esflol蛋白目的大小位置出现对应条带，但是在26kD-17kD之间出现了单一清晰明亮的两条带，两条条带分子量之和约为48kD。因为Esflol蛋白的抗体与Esflol蛋白的相互识别是具有特异性的。之后仅用重组Esflol进行Pull-down实验得到了同样结果。所以分析第一次实验结果中出现的两条条带可能是Esflol蛋白与rCHH蛋白结合后造成了Esflol蛋白的降解，或是Pull-down体系使Esflol蛋白降解，从而造成了Western Blot结果最终呈现出两条小分子量的条带，后经对照实验也验证了这一推测。图5、图6中显示在48kD左右的位置阳性对照有明显的条带，而在实验组中，于26kD至17kD大小间出现两条清晰明亮的条带。
[0043] 大分子互作仪检测Esflol与CHH的结合结果分析Fortebio生物大分子互作仪基于生物膜层反射光干涉技术，可以检测未标记的生物分子之间的相互作用情况。本实验运用此技术，将rCHH作为作用底物，令四种浓度的rEsflol与之反应，观察结果最终发现分子结合动力学系数KD=1.83x10-9，表明了rCHH可以与rEsflol直接结合，验证了之前实验的推论，证明了Esflol是CHH的直接作用蛋白。图七中显示将生物素化的rCHH作为作用底物，四种浓度的Esflol与之结合的情况。观察结果最终发现分子结合动力学系数KD=1.83x10-9，表明了CHH可以与Esflol直接结合，Esflol能够作为CHH的受体参与CHH对河蟹血糖水平的调控。能够缩短养殖产业上中华绒螯蟹的养殖周期，实现养殖户利润的最大化，同时可以提高养殖河蟹的平均重量，增加亩产，更可以达到提升熟蟹肝胰腺的营养价值和风味的效果。
[0044] 讨论机体的生理过程是被体内的诸多神经多肽调节的。在节肢动物中，很多的神经多肽是通过G蛋白藕连信号通路，并且有环核苷酸的参与（cAMP和从cGMP）以及二价钙离子的参与。当十足目（Decapoda）的甲壳动物受到外界环境刺激的时候，MIH和CHH通过激活信号通路增加cAMP和cGMP的含量来抑制蜕皮。之前的研究结果表明，蟹的Y器官细胞膜存在一个特异的MIH和CHH受体。CHH的受体很可能是在膜上的鸟氨酸环化酶。但是，CHH对蜕皮的抑制效果比MIH小10到20倍，这也明示着CHH的主要功能是调节葡萄糖代谢而不是抑制蜕皮。先前的研究已经表明，CHH调节糖代谢的主要效应器官是肝胰腺和肌肉，但是该多肽激素的受体一直没能确定下来。本研究中，为了理清CHH调节的糖代谢途径下游的效应分子，我们做了转录组分析和表达特征分析。在去除眼柄之后表达量有明显变化的所有单一基因中，由于其所在家族成员参与人的胰岛素信号通路，我们选择了Esflol这一基因作为研究对象。此外，该基因的表达量在去除眼柄之后有了2.8倍的提高。以上结果都显示出Esflol基因在河蟹肝胰腺中参与到了糖代谢的过程当中。
[0045] 本研究克隆到了Esflol基因的全长cDNA序列并将其与人的flotillin1基因进行比对，发现N端存在一个SPFH结构域（stomatin/ prohibitin/ flotillin/ HflK/ C），从第6个氨基酸残基到第188个氨基酸残基。SPFH结构域存在于多种真核以及原核生物的膜蛋白中，如prohibitin（抗增殖蛋白），stomatin（红细胞7.2b蛋白）和podocin（肾小球足细胞特异表达的跨膜蛋白），这些蛋白都有很多不同的功能。但是，flotillin不用于SPFH家族成员，它有一个特征性的输水跨膜区域。在我们的研究中，疏水性分析显示Esflol含有一个输水结构域，揭示了该蛋白为一个跨膜蛋白。河蟹肝胰腺组织切片的免疫组化结果进一步印证了这一推断。而且，基因序列分析显示Esflol蛋白含有两个可能的cAMP或cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点，提示Esflol存在参与到cAMP/cGMP介导的信号通路的可能性。所有结果都证明Esflol是CHH调控的信号通路中的一环。
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