MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法
阅读：589发布：2020-05-13
专利汇可以提供MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法，所述方法选择不含增强子且在转录起始位点上含有CpG岛的启动子为靶启动子，用所述靶启动子替换pEGFP-C1载体上的CMV启动子，构建中间载体，在中间载体的Ase I酶切位点插入MAR序列，构建表达载体；所述表达载体能使靶启动子表达框内的EGFP基因表达量持续稳定高效表达；本发明所述方法可以应用于 抗体 及蛋白药物的工业化生产领域或 基因 治疗 的表达载体构建，提高生产效率，降低生产成本，具有良好的社会效益和经济效益。，下面是MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法专利的具体信息内容。
1.一种MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）选择不含增强子且在转录起始位点含有CpG岛的启动子为靶启动子；
（2）用所述靶启动子替换商业载体pEGFP-C1上的外源基因表达框中的CMV启动子，构建中间载体；
（3）在所述中间载体的外源基因表达框上游Ase I酶切位点插入MAR序列，构建表达载体；所述表达载体经验证能使EGFP基因表达量持续稳定高效表达。
2.根据权利要求1所述MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法，其特征在于，所述靶启动子为人源SOX2基因启动子。
3.根据权利要求1或2所述MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法，其特征在于，所述构建中间载体步骤中，用带AgeI和AseI双酶切位点引物扩增所述靶启动子序列，所述引物为：
SOX2＃正向引物：CCGTGATTAAT (Ase I)AGACAAGGAAGGTTTTGAGGAC
SOX2＃反向引物：ATATGACCGGT(Age I)ATCCGGGCTGTTTTTCTGGTT。
MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法
技术领域
背景技术
[0002] 重组治疗性抗体、疫苗或蛋白药物（统称重组药）是重大疾病如癌症、类风湿关节炎、乙型肝炎和艾滋病等疾病的有效药物，这些重组药应用于市场主要存在的问题是研发和生产成本很高，导致药品价格昂贵，因此降低研发和生产成本是重组药生产的迫切需求。
[0003] 重组药细胞株筛选的复杂性和生产过程中表达量下降即生产细胞株不稳定的现象，是研发和生产中的主要障碍，其关键环节在于构建稳定高效表达载体。表达载体在不同的细胞系中因整合位置和表观遗传因素引起的转基因沉默是影响重组药稳定高产的主要原因。其中表观遗传机制导致的生产不稳定尤其复杂和难以捉摸，这些表观因素包括组蛋白修饰(低乙酰化)、DNA甲基化和染色质重塑等。
[0004] 通常情况下细胞表达载体的表达框中启动子常常选择启动效率高的强启动子，但是强启动子易受宿主细胞自我保护机制的抵抗，在启动子区域及关联基因附近形成阻碍基因表达的染色质修饰和染色质三维结构改变。因此克服和避免强启动子区域的染色质三维结构变化导致的表观抑制是表达载体高效和稳定表达的关键。现有技术中主要用染色质调节元件如MARs（Matrix attachment regions ，MARs)克服强启动子的沉默效应从而获得较高表达，但却未关注到调节区域染色质三维结构的改变对表达载体表达能力的综合影响。MAR序列是最早认为能将基因组在拓朴结构上分隔为不同结构域的DNA元件（Phi-Van L,
1996）；MAR序列能将转基因与周围的基因组的负面作用隔绝开（绝缘功能），因此能克服转基因位置效应(Seibler,et al,2005； McKnight, et al, 1992)，能增强基因转录效率(Bode,et al, 2000)；MAR序列还能通过阻碍DNA甲基化支持组蛋白乙酰化维持长期的高转录水平(Dang, et al, 2000；Kurre，et al,2003)。可是，MARs与弱启动子结合时对表达量调控的解决方案却未见报道。
1996）；MAR序列能将转基因与周围的基因组的负面作用隔绝开（绝缘功能），因此能克服转基因位置效应(Seibler,et al,2005； McKnight, et al, 1992)，能增强基因转录效率(Bode,et al, 2000)；MAR序列还能通过阻碍DNA甲基化支持组蛋白乙酰化维持长期的高转录水平(Dang, et al, 2000；Kurre，et al,2003)。可是，MARs与弱启动子结合时对表达量调控的解决方案却未见报道。
[0005] 通过对基因工程中常用的真核生物强启动子特征进行分析，发现在TSS（转录起始位点）附近存在许多转录调控元件参与染色质的表观调节，这些元件是主动调节关联启动子区域染色质重塑的DNA序列。其中，增强子和CpG岛尤其重要。增强子以不同的方式影响组蛋白H3上的第4个赖氨酸（K4）、第9个赖氨酸（K9）和第36个赖氨酸（K36）的组蛋白甲基化。在增强子连接的基因编码区所有三个赖氨酸残基都高度三甲基化，而K9和K36的二甲基化不受增强子的影响；在增强子区域只在K4和K9处出现单甲基化，有别于基因编码区的组蛋白甲基化修饰。CpG岛会有选择性地募集大量染色质，CpG岛区染色质常常形成半胱胺酸甲基化缺失、低水平的组蛋白H1、高水平的组蛋白乙酰化及等无核小体区域的DNaseI高敏感性位点（Wang, B., J. Sun, et al. (2016). "Small-Activating RNA Can Change Nucleosome Positioning in Human Fibroblasts." Journal of Biomolecular Screening 21(6): 634-642；Wangbin, Hu Yunzhang (2017). Promoter-targeted small activated RNAs alter nucleosome positioning, , RNA activation, Springer Nature, Chapter 6）。
[0006] 相比之下，弱启动子则通常不含增强子，但弱启动子上可能存在CpG岛。现有技术中还未见有MAR序列与特定类型弱启动子结合提高表达能力的报道，也没有关于利用MAR序列与弱启动子共同作用形成更有利于克服启动子区域稳定的开放染色质三维结构层面的报道。
发明内容
[0007] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中未见采用MAR序列与弱启动子结合构建表达载体应用于重组药等相关领域，提供一种MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法，所构建的表达载体能持续稳定高效表达32天以上，以满足工业上的生产和推广使用。
[0008] 为了解决以上所述技术问题，本发明所述MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法包括以下步骤：（1）选择不含增强子且在转录起始位点含有CpG岛的启动子为靶启动子；
（2）用所述靶启动子替换商业载体pEGFP-C1上的外源基因表达框中的CMV启动子，构建中间载体；
（3）在所述中间载体的外源基因表达框上游Ase I酶切位点插入MAR序列，构建表达载体；所述表达载体经验证能使EGFP基因表达量持续稳定高效表达。
（2）用所述靶启动子替换商业载体pEGFP-C1上的外源基因表达框中的CMV启动子，构建中间载体；
（3）在所述中间载体的外源基因表达框上游Ase I酶切位点插入MAR序列，构建表达载体；所述表达载体经验证能使EGFP基因表达量持续稳定高效表达。
[0009] 进一步，本发明所述靶启动子为人源SOX2基因启动子。
[0010] 进一步，本发明所述构建中间载体步骤中，用带AgeI和AseI双酶切位点引物扩增所述靶启动子序列，所述引物为：SOX2＃正向引物：CCGTGATTAAT (Ase I)AGACAAGGAAGGTTTTGAGGAC
SOX2＃反向引物：ATATGACCGGT(Age I)ATCCGGGCTGTTTTTCTGGTT。
SOX2＃反向引物：ATATGACCGGT(Age I)ATCCGGGCTGTTTTTCTGGTT。
[0011] 哺乳动物细胞表达载体整合到宿主细胞基因组后，由于受整合位置染色质重塑蛋白或其它各种表观修饰因素的影响，导致表达载体出现表达被抑制的转基因沉默现象。对转基因沉默的机制一般认为受表观修饰的影响，但由于表观修饰复杂多样，很难一概而论，因此需要从更为宏观的层面来理解转基因沉默的机制，即染色质的三维结构。一般认为染色质三维结构无致密核小体覆盖时，该位点的基因转录或表达激活；如果染色质在三维结构上被核小体紧密覆盖，该位点的基因转录沉默。自然状态下，基因组上有些位置总是处于易被DNA酶Ⅰ可以切割的敏感区域，而有些位置则不能用DNA酶进行切割，这表明因DNA序列的不同导致该区域被染色质保护的程度不同，因此DNA序列对染色质三维结构的调节发挥重要作用。以往的研究表明，能调节染色质结构的DNA序列包括染色质调控元件如MAR序列和UCOE序列等；另外，启动子上的调节元件如CpG岛和增强子等序列也会影响染色质重塑进而影响染色质的三维结构。已报道的技术中，将MAR序列与某些启动子相连时能克服沉默效应，上调基因的表达。但是关于MAR与何种启动子能建立更稳定更高效表达载体的问题仍未解决。
[0012] 本发明所述靶启动子属于弱启动子，是指不含增强子且转录起始位点含有CpG岛的启动子；所述CpG岛指CG含量在全部DNA序列碱基中≥60%；CG即二核苷酸。
[0013] 本发明是通过靶启动子（如SOX2基因启动子）上参与染色质调节CpG岛与MAR序列共同作用建立更有利于MAR形成染色质隔离区域的推断，得到的一种新的构建高效表达载体的方法，证明MAR序列与靶启动子上转录起始位点位置CpG岛共同作用时能获得大于含增强子的强启动子的表达效率。
[0014] 本发明所述方法的主要作用机制为MAR和靶启动子的CpG岛共同作用改变启动子附近染色质三维结构，形成稳定开放染色质或其它适合于转录的结构。
[0015] 本发明的有益效果：本发明所述方法通过MAR序列与所述靶启动子结合构建重组载体（表达载体），表达载体在转染到CHO细胞后，能在培养32天后使EGFP基因表达量不但高于商业载体pEGFP-C1的EGFP表达量，同时还高于由MAR序列与含增强子的启动子（如OCT4或CMV启动子）结合时的表达量，以及其它染色质调节序列（如UCOE序列）与所述靶启动子结合时的EGFP表达量；本发明提供了一种新的、用MAR序列与弱启动子结合构建高效表达载体的方法，可应用于重组蛋白及药物生产、基因工程、基因治疗等领域。附图说明
[0016] 图1为所述中间载体pSOX2的结构示意图；图2为所述表达载体pSOX2-MAR的结构示意图；
图3为实施例所述对照载体ⅠpSOX2-UCOE的结构示意图；
图4为实施例所述对照载体ⅡpOCT4-MAR的结构示意图；
图5为ELISA分析测试重组载体pSOX2、pSOX2-UCOE、pSOX2-S278、pSOX2-U-S278的表达量,并与商业载体pEGFP-C1中EGFP蛋白表达量对比图（注：带*的载体表示该载体与其它载体EGFP表达量差异显著,统计值P<0.05）；
图6为qRT-PCR定量法检测各个表达载体pSOX2、pSOX2-UCOE、pSOX2-S278、pSOX2-U-S278相对商业载体pEGFP-C1的EGFP基因表达量的对比图（注：带*的载体表示该载体与其它载体EGFP表达量差异显著,统计值P<0.05）；
图7为重组载体pSOX2、pSOX2-UCOE、pSOX2-S278、pSOX2-U-S278与商业载体pEGFP-C1的荧光强度测试结果对比分析图（注：带*的载体表示该载体与其它载体EGFP表达量差异显著,统计值P<0.05）；
图8为实施例中所述人源SOX2基因启动子序列；
图9为述实施例中所述MAR序列。
图3为实施例所述对照载体ⅠpSOX2-UCOE的结构示意图；
图4为实施例所述对照载体ⅡpOCT4-MAR的结构示意图；
图5为ELISA分析测试重组载体pSOX2、pSOX2-UCOE、pSOX2-S278、pSOX2-U-S278的表达量,并与商业载体pEGFP-C1中EGFP蛋白表达量对比图（注：带*的载体表示该载体与其它载体EGFP表达量差异显著,统计值P<0.05）；
图6为qRT-PCR定量法检测各个表达载体pSOX2、pSOX2-UCOE、pSOX2-S278、pSOX2-U-S278相对商业载体pEGFP-C1的EGFP基因表达量的对比图（注：带*的载体表示该载体与其它载体EGFP表达量差异显著,统计值P<0.05）；
图7为重组载体pSOX2、pSOX2-UCOE、pSOX2-S278、pSOX2-U-S278与商业载体pEGFP-C1的荧光强度测试结果对比分析图（注：带*的载体表示该载体与其它载体EGFP表达量差异显著,统计值P<0.05）；
图8为实施例中所述人源SOX2基因启动子序列；
图9为述实施例中所述MAR序列。
具体实施方式
[0017] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。
[0018] 本发明所述MAR序列调控弱启动子构建高效表达载体的方法包括以下步骤：（1）选择不含增强子且在转录起始位点含有CpG岛的启动子为靶启动子；
（2）用所述靶启动子替换商业载体pEGFP-C1上的外源基因表达框中的CMV启动子，构建中间载体；
（3）在所述中间载体的外源基因表达框上游Ase I酶切位点插入MAR序列，构建表达载体；所述表达载体经验证能使EGFP基因表达量持续稳定高效表达。
（2）用所述靶启动子替换商业载体pEGFP-C1上的外源基因表达框中的CMV启动子，构建中间载体；
（3）在所述中间载体的外源基因表达框上游Ase I酶切位点插入MAR序列，构建表达载体；所述表达载体经验证能使EGFP基因表达量持续稳定高效表达。
[0019] 进一步，本发明所述靶启动子为人源SOX2基因启动子。
[0020] 进一步，本发明所述构建中间载体步骤中，用带AgeI和AseI双酶切位点引物扩增所述靶启动子序列，所述引物为：SOX2＃正向引物：CCGTGATTAAT (Ase I)AGACAAGGAAGGTTTTGAGGAC
SOX2＃反向引物：ATATGACCGGT(Age I)ATCCGGGCTGTTTTTCTGGTT。
SOX2＃反向引物：ATATGACCGGT(Age I)ATCCGGGCTGTTTTTCTGGTT。
[0021] 本发明所述方法构建出的表达载体表达EGFP基因的表达量与现有商业载体pEGFP-C1的表达量相比有显著提升；所述基因表达量显著提升是指，表达载体转入CHO细胞中，培养32天后，进行荧光强度分析、定量PCR分析和ELISA分析，将分析结果与商业载体pEGFP-C1相比，其表达外源EGFP基因的表达量显著高于商业载体pEGFP-C1的表达量（p<0.05），且在32天以上仍能持续稳定表达。
[0022] 实施例：本发明所述靶启动子指的是不含增强子且在转录起始位点含有CpG岛的启动子，人源SOX2基因启动子符合所述靶启动子的要求，本实施例以人源SOX2基因启动子为例说明构建本发明所述表达载体的方法。
[0023] Ⅰ、用人源SOX2基因启动子替换PEGFP-C1载体上的CMV启动子，构建中间载体pSOX2。
[0024] （1）利用人SOX2基因启动子克隆通过人SOX2基因启动子（ ENSG00000181449）扩增，扩增引物为：
SOX2＃正向引物：CCGTGATTAAT (Ase I)AGACAAGGAAGGTTTTGAGGAC
SOX2＃反向引物：ATATGACCGGT(Age I)ATCCGGGCTGTTTTTCTGGTT
利用高保真TAQ酶，50μL体系进行PCR扩增,扩增条件为：
95℃ 5分钟；95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 45秒，重复25个循环；72℃ 5分钟，常温保存。扩增出来的序列即为含增强子且在转录起始位点上含有CpG岛的启动子序列，其DNA序列见图8。
SOX2＃正向引物：CCGTGATTAAT (Ase I)AGACAAGGAAGGTTTTGAGGAC
SOX2＃反向引物：ATATGACCGGT(Age I)ATCCGGGCTGTTTTTCTGGTT
利用高保真TAQ酶，50μL体系进行PCR扩增,扩增条件为：
95℃ 5分钟；95℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 45秒，重复25个循环；72℃ 5分钟，常温保存。扩增出来的序列即为含增强子且在转录起始位点上含有CpG岛的启动子序列，其DNA序列见图8。
[0025] （2）将pEGFP-C1表达载体用AgeI和AseI双酶切去除,胶回收不含CMV的大片段。
[0026] pEGFP-C1载体是目前商业上常用的表达效果较好的载体，本发明所述方法将靶启动子用于连接到载体，替换pEGFP-C1载体上的CMV启动子，构建中间载体pSOX2。
[0027] （3）将上述步骤（1）中获得的SOX2基因启动子的PCR产物经凝胶回收后也同步用AgeI和AseI双酶切。
[0028] （4）连接连接体系（10μL）：含T4 DNA连接酶的连接混合液5μL，pEGFP-C1双酶切大片段0.5μL，双酶切PCR产物4.5μL；反应条件：16℃连接1h(连接试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司)。
[0029] （5）转化提前备好冰块，取感受态细胞（冰水混合状态）100μL加入到步骤（4）连接体系中，冰浴
30分钟；转42℃水浴，90秒；转冰浴，1-2分钟；加LB培养基，37℃水浴45分钟；离心机最大离心转速1秒，弃大部分上清液后，混匀后涂布于有IPTG和X-gal的培养基，37℃过夜培养。
30分钟；转42℃水浴，90秒；转冰浴，1-2分钟；加LB培养基，37℃水浴45分钟；离心机最大离心转速1秒，弃大部分上清液后，混匀后涂布于有IPTG和X-gal的培养基，37℃过夜培养。
[0030] （6）筛选，质粒提取，送生物公司检测通过菌落PCR筛选出的菌落在37℃用试管进行液体培（含卡那青霉素），再经三角瓶过夜扩大培养，利用质粒小量抽提试剂盒提取质粒DNA；经AseⅠ酶切鉴定后，电泳观察酶切结果。将阳性克隆质粒送生物公司进行测序，确认SOX2启动子替换正确，即获得重组载体pSOX2（中间载体）；其结构示意图参见图1。
[0031] Ⅱ、在pSOX2载体的外源基因表达框上游Ase I酶切位点插入MAR序列，构建表达载体（1）人工合成MAR序列
本发明中用到的MAR序列来自HUBB-LCR (beta-globin locus control region)序列（Genebank:NG_052895），见图9。
本发明中用到的MAR序列来自HUBB-LCR (beta-globin locus control region)序列（Genebank:NG_052895），见图9。
[0032] （2）载体酶切 在载体pSOX2的AseⅠ位点进行单酶切载体酶切（50μL体系）
pSOX2载体：44μL
10×NEB Buffer：3.1 5μL
Ase Ⅰ：1μL
反应时间：37℃ 1h
酶切载体纯化：
a、向载体酶切体系离心管中加入50μL 膜结合液并混匀；
b、移液至吸附柱中，吸附柱置于集液管中；
c、离心机转速13,000转/分钟，舍弃集液管中的液体；
d、加700μl 膜洗脱液，离心13,000转/分钟，弃集液管中液体；
e、重复步骤d；
f、弃集液管中液体，离心1分钟；
g、将吸附柱移至1.5ml离心管中；
h、加入50μl无核酸酶的去离子水到吸附柱中，室温静置1min，离心1min；收集离心产物。
pSOX2载体：44μL
10×NEB Buffer：3.1 5μL
Ase Ⅰ：1μL
反应时间：37℃ 1h
酶切载体纯化：
a、向载体酶切体系离心管中加入50μL 膜结合液并混匀；
b、移液至吸附柱中，吸附柱置于集液管中；
c、离心机转速13,000转/分钟，舍弃集液管中的液体；
d、加700μl 膜洗脱液，离心13,000转/分钟，弃集液管中液体；
e、重复步骤d；
f、弃集液管中液体，离心1分钟；
g、将吸附柱移至1.5ml离心管中；
h、加入50μl无核酸酶的去离子水到吸附柱中，室温静置1min，离心1min；收集离心产物。
[0033] （3）平端化 对酶切后的pSOX2载体进行平端化处理将酶切过的pSOX2质粒进行平端化：
pSOX2质粒5μl，10×缓冲液 1μl,3μl无菌水于70℃保温5分钟，加入0.5μl T4 DNA 聚合酶,轻柔混合，37℃反应5min后，进行乙醇沉淀。
pSOX2质粒5μl，10×缓冲液 1μl,3μl无菌水于70℃保温5分钟，加入0.5μl T4 DNA 聚合酶,轻柔混合，37℃反应5min后，进行乙醇沉淀。
[0035] 平端化后pSOX2载体9μg碱性磷酸酶缓冲液 (10X) 15μl
细菌碱性磷酸酶 (1U/μl) 2μl
补充无核酸酶的去离子水至150μl,在65℃水浴锅中反应30分钟后，进行纯化；
a、取与质粒或酶切产物等体积的膜结合液加入离心管中，混匀；
b、用移液枪移至吸附柱内，室温静置3-5分钟，离心一分钟；
c、取收集管中液体重新加至吸附柱中，重新离心1分钟,去废液；
d、加700ul膜洗脱液,离心一分钟，去废液；
e、加500ul膜洗脱液离心4分钟，去废液；
f、再空柱离心一分钟后，将吸附柱移到新离心管中；
g、加50ul无核酸酶的去离子水于柱中心膜上，室温静置3-5min，离心1min.取收集管中液体加到吸附柱中，再次离心，产物保存于4℃。
细菌碱性磷酸酶 (1U/μl) 2μl
补充无核酸酶的去离子水至150μl,在65℃水浴锅中反应30分钟后，进行纯化；
a、取与质粒或酶切产物等体积的膜结合液加入离心管中，混匀；
b、用移液枪移至吸附柱内，室温静置3-5分钟，离心一分钟；
c、取收集管中液体重新加至吸附柱中，重新离心1分钟,去废液；
d、加700ul膜洗脱液,离心一分钟，去废液；
e、加500ul膜洗脱液离心4分钟，去废液；
f、再空柱离心一分钟后，将吸附柱移到新离心管中；
g、加50ul无核酸酶的去离子水于柱中心膜上，室温静置3-5min，离心1min.取收集管中液体加到吸附柱中，再次离心，产物保存于4℃。
[0036] （5）连接用与前述中间载体pSOX2连接相同的方法，将MAR序列与步骤(4)去磷酸化后的切酶片段连接。
[0037] （6）转化与前述中间载体pSOX2转化的方法相同。
[0038] （7）筛选、质粒提取、送生物公司检测用与上述中间载体pSOX2相同的方法，通过菌落PCR筛选，提取质粒DNA，经AseⅠ酶切鉴定后，电泳观察酶切结果，将阳性克隆质粒送生物公司进行测序，确认MAR序列替换正确，即获得表达载体pSOX2-MAR，所述表达载体调控的表达框结构为MAR-SOX2启动子-EGFP-多克隆位点-SV40 poly A；其结构示意图参见图2。
[0039] Ⅲ、为了比较表达载体pSOX2-MAR的表达效果，另外构建两个对照载体，共同进行比较。
[0040] （1）用染色质调节元件UCOE序列与人源SOX2基因启动子结合构建载体作为对照一：在中间载体pSOX2上的MluI酶切位点上插入UCOE序列，构建出对照载体Ⅰ即pSOX2-UCOE载体，其结构示意图参见图3。
[0041] （2）用MAR序列与不含CpG岛、但含增强子的人OCT4基因启动子结合构建载体作为对照二：用人OCT4基因启动子替换商业载体pEGFP-C1上的外源基因表达框中CMV启动子，构建中间载体pOCT4；在中间载体pOCT4上的MluI酶切位点上插入MAR序列，构建出对照载体Ⅱ即pOCT4-MAR载体，其结构示意图参见图4。
[0042] Ⅳ、表达载体高效表达的验证将以上构建所得的载体pSOX2、pSOX2-MAR、pSOX2-UCOE和pOCT4-MAR分别进行荧光强度分析、定量PCR分析和ELISA分析，进行验证，具体方法为：
1、大提质粒（用Promega公司试剂盒）
（1）取50ml的离心管做好标记，将含有上述质粒的培养菌液倒入其中多次离心（4000g/min,10min），弃上清，留沉淀；
（2）加入10ml solutionⅠ震荡∕吹打混匀；
（3）加入10ml solutionⅡ在2-3min内轻轻的上下翻转8-10次；
（4）再加入5ml 预冷的N3 buffer，轻轻翻转10次，得到裂解液；
（5）准备注射器，拔出活塞，在出口处装上帽子后，将裂解液倒入枪管中；
（6）取下帽子，下面放新的离心管，轻轻插入活塞，通过注射收集液体；
（7）测量液体体积，加入液体体积1/10体积的ETR solution，翻转10次；
（8）将其插入冰中冰浴10min，在冰浴过程中，翻转混匀几次，液体由浑浊变得澄清；
（9）放入42℃水浴锅中水浴5min，液体由澄清变得浑浊；
（10）4000g离心5min，管底会有一层蓝色物质出现，将上层清液转入新的离心管中，加入上层清液体积的1/2体积的无水乙醇，轻轻翻转6-7次，室温静置1-2min，得到清液；
（11）柱平衡：取出HiBind DNA Maxi columns（装有吸附柱的绿色离心管）加入3ml GPS Buffer，室温静置4min，4000g离心3min，倒废液；
（12）将清液转入HiBind柱中，4000g离心3min，倒废液；
（13）重复上一步骤，直至清液全部过滤；
（14）向柱中加入10ml HBC Buffer，4000g离心3min，倒废液；
（15）向柱中加入15ml DNA Wash Buffer，4000g离心3min，倒废液；
（16）向柱中加入10ml DNA Wash Buffer，4000g离心3min，倒废液；
（17）空柱4000g离心10min，将吸附柱放入新的离心管中，加入3ml Endo-free Elution Buffer(无内毒素洗脱液)，室温静置5min；
（18）4000g离心5min，将液体再次移入柱中，静置5min，4000g离心5min；
（19）将收集到的DNA分装到1.5ml 离心管中，做好标记。
1、大提质粒（用Promega公司试剂盒）
（1）取50ml的离心管做好标记，将含有上述质粒的培养菌液倒入其中多次离心（4000g/min,10min），弃上清，留沉淀；
（2）加入10ml solutionⅠ震荡∕吹打混匀；
（3）加入10ml solutionⅡ在2-3min内轻轻的上下翻转8-10次；
（4）再加入5ml 预冷的N3 buffer，轻轻翻转10次，得到裂解液；
（5）准备注射器，拔出活塞，在出口处装上帽子后，将裂解液倒入枪管中；
（6）取下帽子，下面放新的离心管，轻轻插入活塞，通过注射收集液体；
（7）测量液体体积，加入液体体积1/10体积的ETR solution，翻转10次；
（8）将其插入冰中冰浴10min，在冰浴过程中，翻转混匀几次，液体由浑浊变得澄清；
（9）放入42℃水浴锅中水浴5min，液体由澄清变得浑浊；
（10）4000g离心5min，管底会有一层蓝色物质出现，将上层清液转入新的离心管中，加入上层清液体积的1/2体积的无水乙醇，轻轻翻转6-7次，室温静置1-2min，得到清液；
（11）柱平衡：取出HiBind DNA Maxi columns（装有吸附柱的绿色离心管）加入3ml GPS Buffer，室温静置4min，4000g离心3min，倒废液；
（12）将清液转入HiBind柱中，4000g离心3min，倒废液；
（13）重复上一步骤，直至清液全部过滤；
（14）向柱中加入10ml HBC Buffer，4000g离心3min，倒废液；
（15）向柱中加入15ml DNA Wash Buffer，4000g离心3min，倒废液；
（16）向柱中加入10ml DNA Wash Buffer，4000g离心3min，倒废液；
（17）空柱4000g离心10min，将吸附柱放入新的离心管中，加入3ml Endo-free Elution Buffer(无内毒素洗脱液)，室温静置5min；
（18）4000g离心5min，将液体再次移入柱中，静置5min，4000g离心5min；
（19）将收集到的DNA分装到1.5ml 离心管中，做好标记。
[0043] 2、转染细胞准备：电转前1-2天，将细胞转至T75细胞培养瓶，至转化前细胞汇合度约50-70%，此时细胞数约为2×107，而每次电转约需106个；2.5-10 ml PBS缓冲液缓慢冲洗细胞，吸出PBS，用0.4ml 0.25%Trypsin-EDTA胰酶消化液消化细胞，加入2.6ml含血清的培养基，中和胰酶；离心收集细胞，用1ml HEPES Buffer重悬液重悬细胞，使之密度为2.5×106个/ml。
[0044] 3、电击转化（1）设置电转程序280V 20ms；
（2）将质粒加入电击杯（20ug）；
（3）向电击杯中加入1×106个细胞，约400ul,颠倒混匀；
（4）将电击杯放入电击槽，脉冲电击一次，电击后电击杯置冰上5min;
（5）将电击后的细胞吸到含0.8ml培养基的12孔板中；
（6）轻轻晃动12孔板，混匀细胞，放入CO2恒温培养箱中培养。
（2）将质粒加入电击杯（20ug）；
（3）向电击杯中加入1×106个细胞，约400ul,颠倒混匀；
（4）将电击杯放入电击槽，脉冲电击一次，电击后电击杯置冰上5min;
（5）将电击后的细胞吸到含0.8ml培养基的12孔板中；
（6）轻轻晃动12孔板，混匀细胞，放入CO2恒温培养箱中培养。
[0045] 4、G418筛选（1）转染后培养：转染后培养24小时或者更长时间，待细胞密度增至50%-70%汇合时；
（2）加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养；
（3）换液:根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3-5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选10-14天后，可见有抗性的克隆出现；
（4）单克隆鉴定：利用有限稀释法获得的单克隆细胞，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。
（2）加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养；
（3）换液:根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3-5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。筛选10-14天后，可见有抗性的克隆出现；
（4）单克隆鉴定：利用有限稀释法获得的单克隆细胞，提取总RNA，做RT-PCR检测目的基因是否存在。
[0046] 5、定量检测标记蛋白EGFP表达量在重组的载体：中间载体pSOX2、表达载体pSOX2-MAR、对照载体ⅠpSOX2-UCOE和对照载体ⅡpOCT4-MAR中，其表达框上增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为标记蛋白，通过分析标记蛋白来观察载体表达的效率。
[0048] 7、qRT-PCR分析（1）提取细胞总RNA
用Trizol试剂进行RNA提取并用Promega公司逆转录试剂盒进行逆转录为cDNA。
用Trizol试剂进行RNA提取并用Promega公司逆转录试剂盒进行逆转录为cDNA。
[0049] （2）定量PCR实验所需要的PCR反应体系为20 ul，内参用GAPDH,引物均分别用EGFP和GAPDH基因的通用检测引物。将配制好的样品和内参在罗式定量PCR仪上各做3个重复。使用2－△△CT方法分析基因表达相对变化。
[0050] 对比分析结果见图6。
[0051] 8、ELISA（酶联免疫）（1）包被：在96孔聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml用0.05M PH7.6的碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml的抗体液（同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔），4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。（简称洗涤，下同）；
（2）加样：加0.1ml稀释的待检样品于已包被的反应孔中，做好标记，置于37℃孵育1小时，然后洗涤；
（3）加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml，
37℃孵育0.5～1小时，洗涤；
（4）加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟；
（5）终止反应：于各反应孔中加入2mol/L 硫酸0.05ml；
（6）结果判定：在酶标仪将波长调为450nm，以空白对照孔调零后测各孔OD值。
（2）加样：加0.1ml稀释的待检样品于已包被的反应孔中，做好标记，置于37℃孵育1小时，然后洗涤；
（3）加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体（经滴定后的稀释度）0.1ml，
37℃孵育0.5～1小时，洗涤；
（4）加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟；
（5）终止反应：于各反应孔中加入2mol/L 硫酸0.05ml；
（6）结果判定：在酶标仪将波长调为450nm，以空白对照孔调零后测各孔OD值。
[0052] 对比分析结果见图5。
[0053] 9、表达载体的表达效率评价（1）SOX2基因启动子描述
SOX2基因启动子截取自SOX2基因的5`UTR区域1200bp长度，包含TATA box和位于CpG岛区域的转录起始位点。构建的中间载体pSOX2质粒即用SOX2基因启动子替换商业载体pEGFP-C1中表达外源基因的CMV启动子。pSOX2质粒转染CHO细胞32天后经qRT-PCR,ELISA表达量和荧光强度综合分析表明,pSOX2质粒在CHO细胞中启动下游EGFP蛋白表达的量低于商业载体pEGFP-C1（图5-7）。
SOX2基因启动子截取自SOX2基因的5`UTR区域1200bp长度，包含TATA box和位于CpG岛区域的转录起始位点。构建的中间载体pSOX2质粒即用SOX2基因启动子替换商业载体pEGFP-C1中表达外源基因的CMV启动子。pSOX2质粒转染CHO细胞32天后经qRT-PCR,ELISA表达量和荧光强度综合分析表明,pSOX2质粒在CHO细胞中启动下游EGFP蛋白表达的量低于商业载体pEGFP-C1（图5-7）。
[0054] （2）构建的质粒载体pSOX2-MAR（表达载体）高于对照质粒pSOX2（中间载体）用qRT-PCR,ELISA和荧光强度分析测试分析结果表明，pSOX2-MAR质粒经转化CHO细胞32天后EGFP蛋白的表达量和表达稳定性好于不加MAR调节的对照质粒pSOX2（图5-7）。
[0055] （3）构建的质粒载体pSOX2-MAR高于对照质粒pSOX2-UCOE（对照载体Ⅰ）用qRT-PCR,ELISA和荧光强度分析结果表明，pSOX2-MAR质粒经转化CHO细胞32天后EGFP蛋白的表达量与pSOX2-UCOE质粒相比显著增加，表明MAR作用于SOX2启动子时，其表达效率和稳定性高于染色质调控序列UCOE与SOX2启动子的共同作用（图5-7）。
[0056] （4）构建的质粒载体pSOX2-MAR高于对照质粒pOCT4-MAR（对照载体Ⅱ）用qRT-PCR,ELISA和荧光强度分析测试分析结果表明，pSOX2-MAR质粒经转化CHO细胞32天后EGFP蛋白的表达量和表达稳定性好于MAR与含增强子但不含CpG岛的对照质粒pOCT4-MAR（图5-7）。
[0057] 本发明所述方法通过构建表达载体与对比载体的比较，得出如下结论：（1）MAR序列与所述靶启动子结合时，能够使靶启动子发挥更大效率，其激活效率高于MAR序列与含增强子的启动子共同作用。
[0058] （2）MAR序列与所述靶启动子作用对靶启动子表达效率的影响显著高于用另一个染色质调节序列UCOE序列（Homo sapiens chromosome 7, GRCh38.p12: 26200227 to 26201780）与所述靶启动子的共同作用。
[0059] 以上仅为本发明的部分实施方式，实施例并非用于限定本发明，本领域技术人员可知，根据本说明书内容可有多种实施方式均能实现本发明所述技术方案，根据本发明所述技术方案作出的简单替换或同质变化，均应落入本发明的保护范围。
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