枯草芽孢杆菌F4启动子的调控序列文库
阅读：752发布：2020-05-13
专利汇可以提供枯草芽孢杆菌F4启动子的调控序列文库专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开涉及一种枯草芽孢杆菌F4启动子的 调控序列 文库，由SEQ ID NO.1-3所示的调控序列组成。本公开还提供了由含有所述调控序列文库中的调控序列的启动子所组成的枯草芽孢杆菌F4启动子文库、一种重组表达载体、表达外源蛋白的方法，以及，所述调控序列文库和启动子文库在制备重组表达载体和/或表达质粒中的用途。通过上述技术方案，可以获得有不同的启动外源蛋白转录的强度，从而根据实际生产目的需要对外源蛋白表达的启动强度进行合理选择和控制。，下面是枯草芽孢杆菌F4启动子的调控序列文库专利的具体信息内容。
1.枯草芽孢杆菌F4启动子的调控序列文库，其特征在于，所述启动子调控序列文库由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的调控序列组成。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌F4启动子的调控序列文库，其特征在于，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2能够提高启动子启动目的基因表达的强度，SEQ ID NO.3能够降低启动子启动目的基因表达的强度。
3.启动子文库，其特征在于，所述启动子文库由分别具有权利要求1所述的调控序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的启动子组成，所述启动子能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录。
4.根据权利要求3所述的启动子文库，其特征在于，所述具有调控序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的启动子具有不同的调控目的基因表达的强度。
5.根据权利要求3或4所述的启动子文库，其特征在于，所述启动子文库中的各启动子的长度为104-1000bp，所述调控序列位于启动子转录起始位点上游-25至-39位点处。
6.一种重组表达载体，该重组表达载体能够允许插入阅读框并使所插入的阅读框在细菌中表达出蛋白质，其特征在于，所述重组表达载体中的启动子选自权利要求3-5中任意一项所述的启动子文库中的启动子。
7.一种表达外源蛋白的方法，其特征在于，该方法包括：将编码所述外源蛋白的阅读框插入权利要求6所述的重组表达载体得到重组表达质粒，并将所述重组表达质粒导入感受态细菌中得到表达菌株，然后培养所述表达菌株。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述感受态细菌为枯草芽孢杆菌。
9.权利要求1-2中任意一项所述的调控序列文库或者权利要求3-5中任意一项所述的启动子文库在制备重组表达载体和/或表达质粒中的用途。
枯草芽孢杆菌F4启动子的调控序列文库
技术领域
背景技术
[0003] 在基因工程中，启动子是实现外源基因高效表达的因素之一。因为宿主菌多选用分裂能力强、分泌蛋白多的原核生物，所以利用原核生物启动子调控机制、寻找理想工程启动子对发酵行业尤为重要。
[0004] 实现外源蛋白的稳定高效表达需要一个适宜强度的启动子。F4启动子是从枯草芽孢杆菌ylbp启动子P16截短而来的，余小霞等(Yu,X.,Xu,J.,Liu,X.,Chu,X.,Wang,P.,Tian,J.,et al.(2015).Identification of a highly efficient stationary phase promoter in Bacillus subtilis.Scientific Reports,5,18405.)通过截短实验发现其发挥功能仅需103bp长度的片段，并将其命名为F4启动子。该启动子可在菌体生长的稳定期高效启动下游基因的表达。与工业上常用的组成型启动子P43、自诱导型Gsib启动子相比，具有更高的启动子活性，对于研究启动子序列与调控活性的对应关系具有天然的优势，是不可多得的好材料。
[0005] 但是启动子的应用不能仅追求其表达强度，启动子活性的高低往往不能反映于外源蛋白的表达量。这是二者的特性不能相互兼容所造成的。因此有必要开发构建一个启动子强度梯度的文库，从而针对不同外源蛋白、不同宿主细胞，以及，不同的工业生产需要而设计不同的启动子使用策略。
发明内容
[0006] 本公开的目的是开发出一种启动子调控序列文库，从而对枯草芽孢杆菌启动子的调控机制加以利用，为枯草芽孢杆菌启动子的产业应用提供更丰富的材料来源。
[0007] 为了实现上述目的，本公开提供了一种枯草芽孢杆菌F4启动子的调控序列文库，所述启动子调控序列文库由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的调控序列组成。
[0008] 本公开还提供了启动子文库，所述启动子文库由分别具有本公开第一个方面所述的调控序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的启动子组成。
[0009] 本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体能够允许插入阅读框并使所插入的阅读框在细菌中表达出蛋白质，所述重组表达载体中的启动子选自本公开所述的启动子文库中的启动子。
[0010] 本发明还提供了一种表达外源蛋白的方法，其中，该方法包括：将编码所述外源蛋白的阅读框插入如上所述的重组表达载体得到重组表达质粒，并将所述重组表达质粒导入感受态细菌中得到表达菌株，然后培养所述表达菌株。
[0011] 本发明还提供了如上所述的枯草芽孢杆菌F4启动子调控序列文库在制备重组表达载体和/或表达质粒中的用途。
[0012] 本发明还提供了如上所述的启动子文库在制备重组表达载体和/或表达质粒中的用途。
[0013] 通过上述技术方案，本公开在不进行诱导的条件下，可以根据生产目的的需要选取具有不同外源蛋白表达强度的调控序列或启动子，对外源蛋白表达的启动强度进行合理选择和控制。
[0014] 本公开所提供的调控序列文库以及启动子文库可以构成启动子强度的梯度库、可以用于表达不明确的外源蛋白，从而确定针对不同外源蛋白、不同表达菌株，满足不同生产需求的启动子。
[0017] 图1是以mApple为报告基因的启动子序列功能关系检测结果；F4(P)代表野生型启动子，F4(C1)代表SEQ ID NO.5所示的启动子；F4(C2)代表SEQ ID NO.6所示的启动子；F4(C3)代表SEQ ID NO.7所示的启动子。
[0018] 其中，图1A为表达的报告蛋白mApple在不同时间的荧光强度。
[0019] 图1B为不同菌株的生长曲线。
[0020] 图1C为各突变体与野生型表达蛋白质的比值，其中野生型为1。
[0021] 图2是以OPHC2为报告基因的启动子序列功能关系检测结果；
[0022] 其中，Free为WB600空载；F4(P)为野生型启动子；F4(C1)为SEQ ID NO.5所示的启动子；F4(C2)为SEQ ID NO.6所示的启动子；F4(C3)为SEQ ID NO.7所示的启动子。
具体实施方式
[0023] 以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0024] 本公开提供了枯草芽孢杆菌F4启动子的调控序列文库，所述启动子调控序列文库由SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的调控序列组成。
[0025] 在本公开中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“启动子”是指位于结构基因5'端上游的能被RNA聚合酶特异性识别并活化RNA聚合酶的DNA序列。本发明中，启动子是指原核生物的启动子。
[0026] 本公开中所述的枯草芽孢杆菌F4启动子是从枯草芽孢杆菌ylbp启动子P16截短获得的，余小霞等(Yu,X.,Xu,J.,Liu,X.,Chu,X.,Wang,P.,Tian,J.,et al.(2015).Identification of a highly efficient stationary phase promoter in Bacillus subtilis.Scientific Reports,5,18405.)的文章记载了该启动子的序列特征。该启动子野生型核心区段的103bp序列如SEQ ID NO.4所示。具有该核心区段是核酸能够具有启动子功能的必要条件，其本身也可以作为启动子；也可以在该核心片段的5’端进行适当的延长直至达到104-1000bp的长度，只要延长后得到的核酸还能够启动在枯草芽孢杆菌中的转录即可。
[0027] 本公开中所述调控序列是指一段控制基因表达的DNA片段，本公开的调控序列位于5’端转录起始位点上游，调控序列可以影响启动子启动转录起始的活性，进而影响目的蛋白的表达量。
[0028] 本公开所述的调控序列由枯草芽孢杆菌F4启动子-35区序列(-35TTGGATT-29)上游的4个碱基及下游的4个碱基组成，长度为15个碱基。
[0029] 在本公开中，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2能够提高启动子启动目的基因表达的强度，SEQ ID NO.3能够降低启动子启动目的基因表达的强度。
[0030] 应当理解的是，与本公开所提供的序列有碱基互补关系的核苷酸序列也属于本公开的保护范围。
[0031] 本公开所提供的启动子调控序列文库中的各核苷酸序列可以单独克隆进入启动子转录起始位点上游，从而可以提供不同的对启动子的调控作用，进而使启动子获得不同的启动转录的活性。
[0032] 值得注意的是，本公开所提供的启动子调控序列文库中的调控序列不仅适用于调控枯草芽孢杆菌F4启动子启动转录的活性，也同样适用于对其他启动子的调控，例如，在本公开的一种具体的实施方式中，所述调控序列可以用于调控在F4启动子野生型基础上对序列进行突变、替换、截短或延长所获得的能够在枯草芽孢杆菌中启动转录的启动子；或者，例如，在本公开的另一种具体的实施方式中，所述调控序列可以用于调控P43启动子启动转录的活性，并且可以不同程度的下调P43启动子启动转录的活性。
[0033] 本公开的第二个方面提供了一种枯草芽孢杆菌F4启动子文库，所述枯草芽孢杆菌F4启动子文库由分别具有本公开第一个方面所述的调控序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的启动子组成。
[0034] 其中，所述具有调控序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的启动子具有不同的调控目的基因表达的强度。
[0035] 在本公开的一种具体的实施方式中，具有调控序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的启动子相比于野生型启动子具有上调的启动基因表达的强度。具有调控序列SEQ ID NO.3的启动子相比于野生型启动子具有下调的启动基因表达的强度。
[0036] 其中，所述枯草芽孢杆菌F4启动子文库中的各启动子的长度为104-1000bp，所述调控序列位于启动子转录起始位点上游-25至-39位点处。
[0037] 在本公开中，对于启动子中除所述调控序列之外其他核酸片段的序列特征没有特别的限制，可以是在枯草芽孢杆菌F4启动子野生型的基础上对序列进行突变、替换、截短或延长所获得的能够在枯草芽孢杆菌中启动转录的启动子。例如，可以为与SEQ ID NO.4所示的野生型枯草芽孢杆菌F4启动子的核苷酸序列有约99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、85％、80％、75％、70％、65％或60％同源性的序列。
[0038] 在本公开的一种优选的实施方式中，所述启动子文库由SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的核苷酸组成。
[0039] 本公开的第三个方面提供一种重组表达载体，该重组表达载体能够允许插入阅读框并使所插入的阅读框在细菌中表达出蛋白质。所述重组表达载体中的启动子选自本公开所述的枯草芽孢杆菌F4启动子文库中的启动子。
[0040] 其中，待表达的蛋白质的阅读框序列可以通过查询或测序的方式确定，待表达的蛋白质的阅读框的DNA可以通过常规的分子生物学手段获得，例如全序列合成、PCR扩增和限制性酶切。通常地，所述重组表达载体上可以具有一些常规的元件，例如复制起始点、筛选基因、多克隆位点和转录终止信号等。
[0041] 本公开还提供了一种表达外源蛋白的方法，其中，该方法包括：将编码所述外源蛋白的阅读框插入如上所述的重组表达载体得到重组表达质粒，并将所述重组表达质粒导入感受态细胞中得到表达菌株，然后培养所述表达菌株。
[0043] 其中，本公开的启动子文库中的各启动子在细菌培养生产的对数晚期和平台期是能够具有相对其它时期更高的转录活性，因此特别优选地，上述表达外源蛋白的方法包括：培养所述表达菌株至对数晚期或平台期。
[0044] 本公开还提供了如上所述的枯草芽孢杆菌F4启动子调控序列文库在制备重组表达载体和/或表达质粒中的用途。可以将已有的重组表达载体和/或表达质粒中的启动子中的一个或多个的转录起始位点上游调控序列用常规的基因工程手段(例如限制性酶切和/或PCR的方式)替换为本发明如上所述的调控序列文库中的调控序列。
[0045] 本公开还提供了如上所述的启动子文库在制备重组表达载体和/或表达质粒中的用途。可以将已有的重组表达载体和/或表达质粒中的启动子中的一个或多个用常规的基因工程手段(例如限制性酶切和/或PCR的方式)替换为本发明如上所述的启动子文库中的启动子。
[0047] 实施例1
[0048] 委托试剂公司合成表1中所示的序列，并组成调控序列文库和启动子文库。
[0049] 表1
[0050]
[0051] 测试例1
[0052] 本测试例用于说明本公开的启动子调控序列对启动子转录活性的影响。
[0053] (1)mApple验证调控序列文库中各序列的转录活性。
[0054] 将表1所示的各调控序列分别克隆入野生型枯草芽孢杆菌F4启动子(SEQ ID NO.4所示序列)，即分别用所述调控序列替换SEQ ID NO.4所示序列中40-54bp处的核苷酸序列获得启动子文库，构建报告载体p43-G-F4-R:pUBC19，并在报告载体中构建报告基因mApple。载体pUBC19的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0055] 将获得的各报告载体分别转化枯草芽孢杆菌WB600，经测序验证正确后扩增获得菌体样本。
[0056] 每个样品采取3×6模式，即3个平行，每个平行6个重复。同时为了缩小各平行之间的误差，每个样品先划线活化，再挑3个大小一致的单克隆于3mL LB液体培养基中扩大培养，再分别以1％的接种量接种于50mL LB液体培养基中并充分混匀，从而使得各样品、各平行之间差别一致。各样品平行需用排枪从混匀的培养基中取8个(因为平板“边缘效应”，舍弃最外侧的2个重复样)200μL培养基于96孔板中并置于水平摇床中培养(37℃、750rpm/min)，每小时对其红色荧光强度和细胞密度进行测定，连续跟踪20h，最后比较各表达菌株和野生型的最大平均荧密值(相对荧光强度/OD600)，野生型为1，各表达菌株折算成占野生型的百分比，以此来衡量不同调控序列对启动子转录活性的影响。结果如图1(C)所示。
[0057] 测试例2
[0059] 将表达菌株、野生型(阳性对照)、WB600(阴性对照)等菌株划线，各挑选体态偏小，个体一致的三个克隆子(3个平行)于3mL LB液体培养基(含10μg/mL Kana)中，37℃、220rpm/min培养12h，每个平行以1％接种量接种于3个50mL含有相同浓度抗生素的LB液体培养基混匀，置于37℃、220rpm/min的摇床中培养20h，其中12h、20h各取样一次(1mL摇匀的发酵液)，离心、取上清。利用甲基对硫磷农药检测甲基对硫磷水解酶活性。结果如图2所示。
[0060] 以上结果表明，具有本公开所提供的调控序列文库中的调控序列的启动子可以形成不同的表达强度梯度。其中，文库中的具有SEQ ID NO.1的启动子相较于野生型启动子，报告基因为mApple时活性上调56.4％，报告基因为ophc2时，12h活性上调36.9％，20h活性上调24.3％；具有SEQ ID NO.2的启动子相较于野生型启动子，报告基因为mApple时活性上调79.9％，报告基因为ophc2时，12h活性上调48.9％，20h活性上调63.8％；而具有SEQ ID NO.3的启动子相较于野生型启动子，报告基因为mApple时活性下调69％，报告基因为ophc2时，12h活性下调94.4％，20h活性下调98.6％。
[0061] 测试例3
[0062] 本测试例用于检测本公开的启动子调控序列对P43启动子转录活性的影响。
[0063] 以P43-G-F4-G:pUBC19质粒为模板，用与Free-pUBC19片段含有同源末端的引物扩增P43-egfp片段。构建含报告基因egfp的报告载体P43-egfp:pUBC19并转化枯草芽孢杆菌WB600。选择正确的克隆进行试验。
[0064] 利用与测试例1相同的mApple荧光强度方法检测启动子调控序列对P43启动子转录活性的影响。
[0065] 相比于野生型P43启动子，含有调控序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的启动子的活性皆发生不同程度的下调，含有调控序列SEQ ID NO.3的启动子活性下调近30％。
[0066] 以上结果表明，具有本公开所提供的启动子调控序列文库中的启动子调控序列的P43启动子可以形成不同的表达强度梯度。
[0067] 以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。
[0068] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0069] 此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。
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