用作干细胞标记的Tctex-1调控序列区
阅读：291发布：2020-05-11
专利汇可以提供用作干细胞标记的Tctex-1调控序列区专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本披露的一个方面涉及分离的Tctex-1 调控序列 ，其在成人神经前 体细胞 和干细胞中包括I类、II类和III类前体细胞中，以及在发育中具有转录活性。本披露的另一方面涉及在神经前体细胞中选择性表达基因序列的方法。在这些细胞中插入与表达特定序列能够用于标记、鉴定、分类、 跟踪 和操纵神经前体细胞和干细胞。，下面是用作干细胞标记的Tctex-1调控序列区专利的具体信息内容。
1.分离的核酸，其特征在于包含Tctex-1启动子的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的分离的核酸，其中所述核苷酸序列选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2。
3.包含如权利要求1所述的核酸的载体。
4.如权利要求3所述的载体，其中所述核酸可操作地连接于标记基因。
5.如权利要求3所述的载体，其中所述核酸可操作地连接于效应核酸。
6.如权利要求3所述的载体，其中所述核酸可操作地连接于编码目标蛋白的核酸。
7.宿主细胞，其特征在于包含如权利要求3-6任一所述的载体。
8.含有权利要求1所述核酸的药物成分。
9.含有权利要求3-6任一所述载体的药物成分。
10.含有权利要求7所述宿主细胞的药物成分。
11.对有神经疾病、紊乱或病症的对象进行治疗的方法，包括向对象给药如权利要求8所述药物成分的步骤，由此治疗所述有神经疾病、紊乱或病症的对象。
12.对有神经疾病、紊乱或病症的对象进行治疗的方法，包括向对象给药如权利要求9所述药物成分的步骤，由此治疗所述有神经疾病、紊乱或病症的对象。
13.对有神经疾病、紊乱或病症的对象进行治疗的方法，包括向对象给药如权利要求
10所述药物成分的步骤，由此治疗所述有神经疾病、紊乱或病症的对象。
14.如权利要求11所述的方法，其中所述给药药物成分的步骤包括鞘内给药所述药物成分的步骤。
15.含有核酸的试剂盒，其特征在于包括选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
16.在细胞群中的前体细胞中选择性表达目标核酸的方法，所述方法包括：将所述目标核酸置于Tctex调控序列的控制之下，所述Tctex调控序列在所述前体细胞中选择性发挥功能，以及将置于所述Tctex调控序列控制下的目标核酸导入所述细胞群，由此在所述细胞群中的所述前体细胞中选择性地表达所述目标核酸。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述调控序列包含选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述导入步骤包括使所述细胞群与含有所述核酸的病毒接触。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述病毒是腺病毒。
20.如权利要求16所述的方法，其中所述导入步骤包括对所述细胞群电穿孔。
21.如权利要求16所述的方法，其中所述导入步骤包括使所述细胞群与脂质体接触。
22.如权利要求16所述的方法，其中所述细胞群选自下组：神经管细胞群、脊髓细胞群或脑部组织细胞群。
23.如权利要求18所述的方法，其中所述细胞群选自下组：脑室区细胞群、室下区细胞群、侧脑室区细胞群、齿状回细胞群、下脑丘细胞群、嗅球细胞群和皮质组织细胞群。
24.如权利要求16所述的方法，其中所述前体细胞是神经前体细胞。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述神经前体细胞是I类神经前体细胞，II类神经前体细胞，或者III类神经前体细胞。
26.如权利要求16所述的方法，其中所述细胞群包括肠细胞。
27.如权利要求16所述的方法，其中所述前体细胞是肠前体细胞。
28.如权利要求16所述的方法，其中所述细胞群包括胚胎细胞群、幼年细胞群或成体细胞群。
29.如权利要求16所述的方法，其中所述核酸是效应核酸。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述效应核酸的产物选自下组：siRNA分子、反义分子、microRNA分子和适配子。
31.如权利要求16所述的方法，其中所述核酸编码目标蛋白。
32.如权利要求16所述的方法，其中所述核酸是标记。
33.在细胞群中标记前体细胞的方法，所述方法包括：
将标记基因置于Tctex调控序列的控制之下，所述Tctex调控序列在所述前体细胞中选择性发挥功能；将置于Tctex调控序列控制下的所述标记基因导入所述细胞群，并在所述前体细胞中使得所述标记基因表达，由此在细胞群中标记所述前体细胞。
34.从细胞群中分离标记细胞的方法，所述方法包括：
将标记基因置于Tctex调控序列的控制之下，所述Tctex调控序列在所述前体细胞中选择性发挥功能；将置于Tctex调控序列控制下的所述标记基因导入所述细胞群，并在所述前体细胞中使得所述标记基因表达，由此标记在细胞群中表达所述标记基因的细胞；以及从所述细胞群中分离所述标记的细胞。
35.如权利要求33所述的方法，其中所述导入步骤包括使所述细胞群与病毒接触。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述病毒是腺病毒。
37.如权利要求33所述的方法，其中所述导入步骤包括对所述细胞群电穿孔。
38.如权利要求33所述的方法，其中所述导入步骤包括使所述细胞群与脂质体接触。
39.如权利要求33所述的方法，其中所述的Tctex-1调控序列包括选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
40.如权利要求33所述的方法，其中所述细胞群选自下组：神经管细胞群、脊髓细胞群，或脑细胞群。
41.如权利要求40所述的方法，其中脑部组织选自下组：脑室区细胞群、室下区细胞群、侧室区细胞群、齿状回细胞群、下脑丘细胞群、嗅球细胞群和皮层组织细胞群。
42.如权利要求33所述的方法，其中所述前体细胞是神经前体细胞。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述前体细胞包括I类神经前体细胞，II类神经前体细胞，或者III类神经前体细胞。
44.如权利要求33所述的方法，其中所述细胞群包括肠组织。
45.如权利要求33所述的方法，其中所述前体细胞是肠前体细胞。
46.如权利要求33所述的方法，其中所述细胞群包括胚胎细胞群、幼年细胞群，或成体细胞群。
47.如权利要求33所述的方法，其中所述标记编码荧光蛋白。
48.如权利要求34所述的方法，其中所述分离步骤包括流式细胞术。
49.前体细胞的富集制品，其中所述富集制品包括转录活性的Tctex-1调控序列区域。
50.如权利要求49所述的富集制品，其中所述前体细胞是神经前体细胞。
51.如权利要求50所述的富集制品，其中所述神经前体细胞包括I类神经前体细胞，II类神经前体细胞，或者III类神经前体细胞。
52.如权利要求50所述的富集制品，其中所述前体细胞是非胚胎脑部神经前体细胞。
53.如权利要求50所述的富集制品，其中所述前体细胞分离自下组的组织：脑室区、室下区、侧室区、齿状回、下脑丘、嗅球和皮层组织。
54.如权利要求50所述的富集制品，其中所述神经前体细胞分离自胚胎细胞。
55.在细胞群中分析前体细胞活性的方法，所述方法包括：
将标记基因置于Tctex调控序列的控制之下，所述Tctex调控序列在所述前体细胞中选择性发挥功能；将置于Tctex调控序列控制下的标记基因导入所述细胞群，并在所述前体细胞中使得所述标记基因表达，由此在细胞群中分析前体细胞的活性。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述调控序列包括选自SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的核苷酸序列。
57.如权利要求55所述的方法，还包括罗列的表达所述标记基因的前体细胞。
58.如权利要求55所述的方法，还包括定量所述标记基因的表达。
59.如权利要求55所述的方法，还包括记录表达标记基因的所述前体细胞的位置。
60.如权利要求55所述的方法，还包括在不同的时间点记录测量值。
61.如权利要求55所述的方法，还包括检测超过一个的细胞群。
62.如权利要求55所述的方法，还包括在所述细胞群中导入实验试剂或者对照试剂。
63.如权利要求55所述的方法，其中所述标记编码荧光蛋白。
64.如权利要求55所述的方法，其中所述前体细胞是神经前体细胞。
65.如权利要求64所述的方法，还包括评估神经生成的进度。
66.如权利要求64所述的方法，其中所述细胞群模拟神经疾病、紊乱或病症，并且至少一个所述细胞群是对照。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述神经疾病、紊乱或病症是神经病学的、神经变性的或下脑丘的。
用作干细胞标记的Tctex-1调控序列区
[0001] 交叉引用相关申请
[0002] 本申请要求对以下美国临时申请的优先权：2009年9月18日申请的美国临时申请61/243,841，此申请在此全文参考并入。
[0003] 关于联邦资助的研究或开发的说明
[0004] 本发明根据由国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的合同EY11307得到政府资助，政府对于本发明拥有一定权利。
[0005] 发明背景
[0006] 本披露的一个方面涉及神经前体细胞特异性的分离的基因调控序列，以及使用所述调控序列标记、分离和操纵神经前体细胞的方法。
[0007] 中枢神经系统的干细胞研究是脑损伤以及其他人类疾病的创新性疗法开发的重大希望。研究人员对成人干细胞兴趣浓厚，因为这不存在由胚胎干细胞引起的伦理问题。成人干细胞研究的最终目标之一是更好地理解这些细胞的功能，使得科学家能够开发出在损伤的脑部直接操纵这些细胞的方法。
[0008] 在海马体的齿状回区(DG)，新的神经元在我们一生中持续不断地从颗粒细胞下层(subgranular zone，SGZ)的固定干细胞/前体细胞中产生(Altman and Das，1965；Cameron et al.，1993；Eriksson et al.，1998；Kornack and Rakic，1999)。成人生成的颗粒神经元与周围其他颗粒神经元在形态、突触连接和电生理学特性上没有分别(Cameron et al.，1993；Hastings and Gould，1999；Markakis and Gage，1999；van Praag et al.，2002)。因此，这些成人生成的细胞似乎参与了学习和记忆的功能。
[0009] 根据形态的不同和表达的分子标记，可以在成人的SGZ中分出至少三类部分重叠的细胞群(Ehninger and Kempermann，2008；Zhao et al.，2008)。I类前体细胞(或神经干样细胞，B类细胞(Seri et al.，2001))，是一种几乎不分裂的细胞，通过其表达的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和巢蛋白(Fukuda et al.，2003)，以及其通过高度细化分支进入分子层的放射状突起(Mignone et al.，2004)，可以鉴别此类细胞。核转录蛋白Sox2也被认为是大多数I类细胞的标记(Steiner et al.，2006)。至少有两类过渡扩增前体细胞。II类细胞(或D类细胞(Seri et al.，2001))是SGZ中增殖性最强的细胞，有短的水平结构，并表达转录因子Tbr2(T-box brain gene 2)(Hodge et al.，2008)和低水平的神经系细胞标记，例如双肾上腺皮质激素(DCX)。III类前体细胞代表神经定向的(commited to neural fate)低增殖性细胞，并在完成细胞周期之后成为有丝分裂后的神经元。这些细胞在形态上变化多样，并具有垂直定向突起(vertically orientated process)，表现出DCX、PSA-NCAM和TuJ 1。然而在成人海马齿状回中的神经干细胞的身份一直存在争议(Garcia et al.，2004；Palmer et al.，1997；Seaberg and van der Kooy，2002；Seri et al.，2001)，主导的观点认为I类前体细胞是产生过渡扩增前体细胞的主要前体，这些过渡扩增前体细胞随后分化成星形胶质细胞和颗粒神经元(Seri et al.，2004；Seri et al.，2001)。
[0010] 靶向于调控序列的选择已经从原理上证明，能够从成人海马体中分离到高产量和高纯度的神经系细胞特异性前体细胞。然而，前述的调控序列的组织特异性较弱。例如，Tα-tubulin启动子也是神经元的靶标；GFAP启动子也是星形胶质细胞的靶标。
[0011] 尽管很多研究着重于神经干细胞的特征描述和利用，但是许多研究已经表明，处于细胞周期中的(cycling)II类和III类前体细胞，而不是I类前体细胞，对各种调控影响有最大的反应性(Jessberger et al.，2005；Kempermann et al.，1998；Kronenberg et al.，2003)，因此它们非常有望在研究、开发和医学领域中用于操作和使用。
[0012] Tctex-1(或DYNLT1(Pfister et al.，2005))之前被认为是细胞质动力蛋白(King et al.，1996)的轻链，最近发现，它在成人齿状回区(DG)的干样细胞和处于细胞周期中的前体细胞中选择性富集，但是不在成熟的颗粒细胞和星形胶质细胞中富集(Chuanget al.，2001；Dedesma et al.，2006)。通过原位杂交，证实了Tctex-1在SGZ中富集的表达类型，表明Tctex-1的表达主要在转录水平受到调节。本申请披露了在成人海马区和Tctex-1：
GFP报告小鼠的齿状前体细胞中引导(specifying)Tctex-1表达的基因组序列，Tctex-1：
GFP报告小鼠中的成人海马干样细胞和前体细胞带有基因标记。
GFP报告小鼠的齿状前体细胞中引导(specifying)Tctex-1表达的基因组序列，Tctex-1：
GFP报告小鼠中的成人海马干样细胞和前体细胞带有基因标记。
[0013] 本披露还涉及在神经前体细胞中引导Tctex-1表达的基因组序列。本披露进一步涉及Tctex-1-GFP报告基因的构建体以及神经前体细胞和干细胞被标记的小鼠。
[0014] 发明概述
[0015] 本披露涉及在神经前体细胞中，包括在I类、II类和III类前体细胞中，具有转录活性的分离的Tctex-1的调控序列。本披露还涉及一种方法，通过将置于前述调控序列控制下的效应序列导入细胞群，从而在前述的细胞群中选择性地表达目标核酸，所述效应序列可以是siRNA，反义分子，microRNA，适配子或者是编码目标效应蛋白的序列。
[0016] 本披露还涉及一种标记所述细胞的方法，通过将置于所述调控序列控制下的标记导入细胞群，以选择性地获得神经前体细胞。本披露也涉及从脑部获得的这类细胞群的内容和性质。
[0017] 另外，本披露涉及评估细胞群中神经前体细胞和干细胞水平变化的方法，通过将置于所述调控序列控制下的标记导入所述细胞群，并测量在不同条件下所述标记的空间和时间变化。在某个实施方式中，所述不同的条件是神经疾病和正常对照。
[0019] 图1：鉴定Tctex-1基因的调控元件，其以发育的新生大脑皮质的VZ/SVZ为特异性靶标。(A)小鼠TCTEX-1基因示意图(上图)和编码融合3’端与Tctex-1的前五个残基的GFP的P/E-Tctex-1：GFP报告基因结构示意图(下图)。外显子用框表示；内含子用水平线表示；碱基1由外显子1的第一个核苷酸开始；ATG：启动密码子；pA：兔β球蛋白聚腺嘌呤，来源于pCAG载体。(B)用P/E-Tctex-1：GFP(绿色)和pCAG-HcRed(红色)共转染后的皮质切片的共聚焦图象。点划线表示脑室边界。箭形指向放射状神经胶质纤维，其末梢与脑室和软膜表面相连接。标尺＝10μm。
[0020] 图2：共定位研究表明，P/E-Tctex-1：GFP靶向于发育的新生大脑皮质中的放射状神经胶质细胞和中间前体细胞的混合物。P/E-Tctex-1：GFP转染的皮质切片用Pax6(A)，Tbr2(B)或Tbr1(C)共同标记的共聚焦图象。插图是框区域的放大图。尺度＝20μm；4μm(插图)
[0021] 图3：启动子活性谱测定表明，P/E-Tctex-1：GFP靶向于发育的新生大脑皮质中的放射状神经胶质细胞和中间前体细胞的混合物。显示了从经P/E-Tctex-1：GFP和P/GLAST：DsRed共转染(A)或P/E-Tctex-1：GFP和P/Tα-1：DsRed共转染(B)的脑部得到的皮质切片。用P/E-Tctex-1：DsRed和E/nestin：hGFP构建体共同电穿孔的皮质切片显示，表达GFP和DsRed的细胞群几乎完全重叠(C)。尺度＝20μm；4μm(插图)
[0022] 图4：成体小鼠(小鼠品系4)脑部的P/E-Tctex-1：GFP细胞的表达模式。表达GFP的细胞在DG(A)和侧脑室(B)中的分布模式。(C-F)显示了在第三脑室的表达GFP的细胞具有内源性Tctex-1(红色)的标记。(G，H)在成人SGZ中的三重标记：GFP，Sox2(红色，G，H)和GFAP(青色，G)或巢蛋白(青色，H)。GFP+细胞通常对Sox2(箭形，G，H)有免疫反应。GFP+细胞突起对GFAP(箭头，G)或巢蛋白(箭头，H)呈阳性。(I)GFP，Tctex-1(红色)和巢蛋白(青色)的三重标记显示内源性的Tctex-1位于nestin+/GFP+突起(箭头)和GFP+细胞体(箭形)。(J)共聚焦图象显示，Ki67标记的SGZ细胞不表达Tctex-1：GFP。标尺：50μm(A)；20μm(B，C，J)，5μm(G，H)；10μm(I)。
[0023] 图5：表达转基因P/E-Tctex-1：GFP的细胞在显示成体神经发生的大脑区域富集，这些细胞同时表达内源性Tctex-1(小鼠品系17)。显示了在表达P/E-Tctex-1：GFP的转基因小鼠中，DG(A)，侧脑室(B)和第三脑室(C)的表达GFP的细胞分布模式。放大图显示在DG(D-G)和第三脑室区(H-J)的Tctex-1(红色)和GFP(绿色)共标记。许多Tctex-1+的SGZ细胞有不规则的细胞核和水平导向表现(箭形)。标尺＝20μm。
[0024] 图6：表达Tctex-1-GFP转基因的细胞是增殖的有丝分裂SGZ细胞(小鼠品系17)。从携带P/E-Tctex-1：GFP的转基因小鼠得到的成体DG切片，用GFP和NeuN(A)，Ki67(B，C)，l-h(BrdU)(D)共同标记得到的共聚焦图象。插图显示Tctex-1-GFP与NeuN+信号是互相排斥的(A)。然而Tctex-1：GFP的SGZ细胞却经常表现出Ki67+或BrdU+(箭形，B，D)。
也显示了一个处于分裂期的Ki67+/Tctex-1：GFP+细胞(箭头，C；蓝色：DAPI)。比例尺＝
20μm；4μm(插图)。
也显示了一个处于分裂期的Ki67+/Tctex-1：GFP+细胞(箭头，C；蓝色：DAPI)。比例尺＝
20μm；4μm(插图)。
[0025] 图7：表示了II类和III类过渡扩增前体细胞的成体SGZ Tctex-1-GFP细胞。从P/E-Tctex-1：GFP小鼠得到的成体DG切片用Tbr2(A)，DCX(B)，GFAP(C)或Nestin(D)共同标记得到的共聚焦图象。插图显示了两组放大图片。(A)中的箭形显示所有的Tbr2+细胞都是Tctex-1：GFP+。(B)中的箭形、空箭形和箭头分别指Tctex-1：GFP+/DCX，Tctex-1：GFP-/DCX+和Tctex-1：GFP+/DCX细胞群。(C)中的箭形显示GFAP+突起经常与Tctex-1：
GFP+细胞相邻。但是，Tctex-1：GFP细胞不表达GFAP。(D)中的箭形显示Tctex-1：GFP+细胞偶尔被巢蛋白标记的纤维包围。标尺＝50μm；5μm(插图)
GFP+细胞相邻。但是，Tctex-1：GFP细胞不表达GFAP。(D)中的箭形显示Tctex-1：GFP+细胞偶尔被巢蛋白标记的纤维包围。标尺＝50μm；5μm(插图)
[0026] 图8：示意图，显示了成体SGZ中特异性标记和报告基因表达的估算时间轴。
[0027] 图9(本申请中显示为图9A-C)：合成构建体的核苷酸序列，包括小鼠Tctex-1调控序列的核苷酸序列和编码修饰的绿色荧光蛋白的核苷酸序列(SEQ ID NO：6)。在5’端的6个核苷酸和3’端的6个核苷酸是内切核酸酶的限制性位点。核苷酸序列
5’-GGGGATCCACCGGTCGCCACC-3’(SEQ ID NO：7)是一段接合序列。还列出了修饰的绿色荧光蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。
5’-GGGGATCCACCGGTCGCCACC-3’(SEQ ID NO：7)是一段接合序列。还列出了修饰的绿色荧光蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。
[0028] 图10：(本申请中显示为图10A-C)：人类Tctex-1调控序列的核苷酸序列与一段部分编码人类Tctex-1的核苷酸序列可操作地连接(SEQ ID NO：9)。还列出了两段人类Tctex-1片段的氨基酸序列(SEQ ID NO：10和11)。
[0029] 发明详述
[0030] 在以下的描述中，引用了作为本申请一部分的附图，其通过例举的方式来展示可以使用和采用的具体实施方式。详细描述了这些实施方式，以使本领域技术人员能够实施本发明。应理解，也可以使用其他实施方式，可以做出结构和逻辑的改变但仍然在本发明的范围以内。因此，对示例实施方式的下列描述不应认为具有限制作用，本发明的范围由所附的权利要求所界定。
[0031] 定义
[0033] 冠词“一”和“一个”在本申请中指代一个或者超过一个的语法上的对象。例如，“一个元件”表示一个元件或者超过一个的元件。
[0034] 术语“氨基酸”旨在包括所有天然和人工合成的分子，包括同时有氨基官能团和酸官能团并且能够形成天然氨基酸聚合物的分子。示例的氨基酸包括天然氨基酸；其类似物、衍生物和同类物；有不同侧链的氨基酸类似物和前述项目的所有立体异构体。
[0035] “融合蛋白”或“融合多肽”指的是本领域已知的嵌合蛋白，并可以通过本领域已知的方法制备。在许多融合蛋白的例子中，有两种不同的多肽序列，在一定情况下，可以会有更多。这些连接的序列可以在表达框内。融合蛋白可以包含一个结构域，其存在于表达所述第一种蛋白的某种生物体中(虽然在不同蛋白中)，或者它可以由不同种类的生物体表达的“种间”、“基因间”等融合。在多种实施方式中，融合多肽可以包含与第一多肽相连接的一种或者多种氨基酸序列。在第一多肽与超过一种氨基酸序列融合的情况下，融合序列可以存在同样序列的多个拷贝，或者，也可以是不同的氨基酸序列。融合多肽可以与第一个多肽的N端、或者C端、或者同时与N端和C端融合。示例的融合蛋白包括，含有谷胱甘肽S-转移酶标签(GST-tag)、组氨酸标签(His-tag)、免疫球蛋白结构域、免疫球蛋白结合的结构域、或荧光蛋白的多肽。
[0036] 术语“分离的多肽”指的是一种多肽，在一些实施方式中，其由重组的、合成来源、或其组合来源的DNA或RNA所制备，所述多肽(1)与它在自然界中正常存在时所关联的蛋白不在一起，(2)与它正常存在的细胞相分离，(3)基本上与同样细胞来源的其他蛋白相分离，(4)由不同物种的细胞表达，或(5)不存在于自然界中。
[0037] 术语“分离的核酸”指的是一种多核苷酸，其来源于基因组、cDNA、或人工合成、或其组合，所述核酸(1)与它在自然界中正常存在时所关联的多核苷酸不在一起，(2)所述多核苷酸的核酸序列可操作地连接于其他多核苷酸的核苷酸序列，条件是这两段序列在自然界中没有可操作地相连接。
[0039] 术语“标记”在本领域已知，在本申请中是指核酸序列，不是指在细胞染色体上通常包含内含子的DNA序列，那在本领域通常用术语“基因”来表示。这里，术语“标记”是指任何编码蛋白、多肽或者核酸的DNA序列，条件是所述编码的蛋白、多肽、或核酸的存在能够被检测或测量。本领域公知，标记所编码的蛋白、多肽或核酸也能够被例如抗体等的试剂所识别。
[0040] 术语“调节”当用于功能特性、生物活性或者生物反应过程(例如，酶活性或者受体结合)时，是指上调(例如，活化或者刺激)、下调(例如，抑制或者阻遏)的能力，或者改变所述功能特性，生物活性或者生物反应过程的质和量的能力。
[0041] 术语“调节因子”指的是具有调节能力的多肽、核酸、大分子、复合物、分子、小分子、化合物、物种等(天然或非天然)，或是从生物物质例如细菌细胞、植物细胞或组织、真菌细胞、动物细胞或组织中制备的具有调节能力的提取物。可以通过实验，评估调节因子作为功能特性、生物活性或生物过程或其组合的(直接或间接)抑制剂或激活剂的潜在活性(例如，作为激动剂、部分拮抗剂、部分激动剂、反向激动剂、拮抗剂、抗菌剂、抑制微生物感染或者增殖的抑制剂等)。在这些实验中，可以同时筛选许多调节因子。调节因子的活性可以是已知的、未知的或者部分已知的。
[0042] 术语“神经的”指的是中枢和外周神经系统。神经系统细胞的实例包括，神经元和神经胶质细胞。神经胶质细胞的实例包括，中枢和外周神经系统中的少突胶质细胞和星形胶质细胞。
[0043] 术语“神经疾病、紊乱或病症”指的是，神经系统功能、结构或者两者的失调，归因于比如在发育中的遗传或者胚胎缺陷，或例如毒药、外伤或神经疾病等外在因素。例如，神经系统紊乱包括，但不限于，中风(急性和慢性)、脊髓损伤、脑或脊髓外伤、脑和脊髓外伤、多发性硬化、肌萎缩侧索硬化症、阵发紊乱(例如，癫痫)，自主神经系统功能障碍(例如，动脉性高血压)、运动紊乱(例如，活动过多症)，运动障碍例如休息性震颤，基底神经节活动过多症(例如，亨廷顿舞蹈症和偏侧投掷症)，神经精神紊乱(例如，狂躁症，精神病，强迫症和成瘾，阿尔茨海默病，帕金森病)，下丘脑紊乱例如，高乳酸血症，颅咽管瘤，促性腺缺陷，生长激素缺乏，加压素缺乏，催乳素瘤，肥胖，神经性源痛综合症，肢体疼痛症，腓骨肌萎缩症，糖尿病性神经病变，神经压迫综合症，神经痛，神经肌肉接头疾病，POEMS综合征，视神经损伤疾病(例如，青光眼)，嗅觉紊乱例如嗅觉丧失，嗅觉衰退，嗅觉过敏和嗅觉学习和记忆受损和各种视网膜变性疾病(例如，色素性视网膜炎、黄斑变性)。术语“神经疾病、紊乱或病症”也指在发育的任何阶段与神经发生缺乏或过度、或神经突生长缺乏或过度有关的疾病、紊乱或者病症，包括学习障碍和其他例如痴呆、创伤后神经紧张性障碍、和包括焦虑和抑郁在内的情绪失调。
[0044] 术语“神经突”指的是神经元向外生长的任何过程。这里的术语神经突包括从神经元向外生长的所有的细胞突起(包括轴突和树突)。
[0045] 术语“神经突生长”指的是细胞从神经元向外生长的过程，或者指细胞群，其中的单个细胞突起构成了神经元向外生长的过程。
[0046] 术语“核酸”指的是核苷酸的聚合形式，可以是核糖核苷酸、脱氧核苷酸或者任一种核苷酸的修饰形式。该术语应该理解为包括由核苷酸类似物得到的RNA或DNA的类似物。在一些实施方式中，核酸的核苷酸序列可以是目标基因的正义或反义序列。在一些实施方式中，第一核酸与第二核酸可以形成双链结构，其中第二核酸与第一核酸有至少部分互补序列。在一些实施方式中，在核苷酸序列中有一部分与另一部分至少部分互补的单个核酸也可以形成双链结构。
[0047] 术语“可操作地连接于”，当在说明两个核苷酸序列之间的关系时，指的是一种邻近的位置关系，其中所述核苷酸序列之间的关系使得它们能够以预期的方式产生功能。例如，“可操作地连接于”编码序列的操控序列是位于邻近的位置，使得在操控序列容许的条件下，如当适当的分子(例如，诱导物和聚合酶)与操控或调控序列结合时，能够实现编码序列的表达。
[0048] “患者”、“对象”或“宿主”旨在包括人类和非人类的动物。非人类的动物包括所有的脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人类的灵长类、羊、狗、猫、牛、马、鸡、大象和爬行动物，但哺乳动物更为优选，例如非人类的灵长类、羊、狗、猫、牛和马。“患者”、“对象”或“宿主”也可以是家畜动物，例如牛、猪、羊、家禽和马，或家养动物，例如狗和猫。“患者”、“对象”或“宿主”可以是雄性或者雌性，可以是老年，可以是成年、青少年、儿童或者婴儿。术语“幼年”指的是婴儿、儿童、青少年、或介于出生和神经系统成熟之间的任何生物体。人类“患者”或“对象”可以是高加索人，或非洲人、亚洲人、闪族人，或其他种族或所述种族背景的混合。优选的“患者”或“对象”包括患有本发明所述神经疾病、病症或者紊乱或者处于这些疾病风险的人。
[0049] 短语“药学上可接受”，用于药物组合物时，指的是成分和剂量都在医学评判标准之内的药物成分，适用于人和动物的组织，且没有过度的毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，具有适当的益处/风险比。
[0050] 短语“药学上可接受的载剂”，指的是药学上可接受的物质、成分或者载剂，例如液体或固体填料、稀释剂、赋形剂、溶液或包封材料，其参与将任何补充剂或组合物或其中的组分从身体的一个器官或部分向身体的另一个器官或部分运输。术语“药学上可接受的载剂”指的是能够“接受”的载剂，其意义是能与其他药物成分兼容并且对其接受者无害。可以用作“药学上可接受的载剂”的实例包括：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和醋酸纤维素；(4)西黄蓍胶粉；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)辅药，例如可可脂和栓剂蜡类；(9)油脂，例如花生油，棉花油，红花油，芝麻油，橄榄油，玉米油和大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油，山梨糖醇，甘露糖醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯和十二酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；和(21)药物制剂中其他的无毒性相容性物质。
[0051] 术语“多肽”、“蛋白”和“肽”在这里可以互相交换使用。术语“多肽”指的是氨基酸残基的聚合物。示例的多肽包括基因产物、天然蛋白、前述物质的同系物、直系物、旁系物、片段和其他等价物、变体和类似物。
[0052] 术语“多肽片段”或“片段”，当用于参比多肽时，指的是这样一种多肽，其与参比多肽本身相比缺少氨基酸残基，但是其具有的氨基酸序列通常与参比多肽中处于对应位置的氨基酸序列相同。就参比多肽而言，所述缺失可以在参比多肽的氨基末端、或羧基末端、或两端都有。片段通常长为至少5、6、8或10个氨基酸、至少14个氨基酸，至少20、30、40或50个氨基酸，至少75个氨基酸、或者至少100、150、200、300、500或更多个氨基酸。片段可以保留参比多肽的一种或者更多生物活性。进一步地，片段可以包含特定区域的亚片段，所述亚片段保留了其来源区域的功能。
[0053] 术语“前体”，当用于一种细胞时，是指未完全分化的细胞。在身体正常细胞损耗以及组织损伤的情况下，会发生前体细胞的分化。前体细胞能够处于不同的分化阶段，可以是单能的、多潜能的、多功能的，或可以无限分裂。披露的前体细胞包括肌肉中的卫星细胞、成血管细胞或上皮前体细胞(EP)等等。也披露了中枢神经系统的神经干样细胞和中枢神经系统的过渡扩增前体细胞，所述神经干样细胞很少分裂，并具有复杂的结构；所述过渡扩增前体细胞更易于增殖，并在形态上更加多样。在某些实施方式中，前体细胞是分化较少，是“干细胞样的”和/或多潜能的，很难在原位与干细胞区分开来。
[0054] 术语“纯化的”，当用于目标物质时，指的是所述目标物质在制备物中处于主导地位(例如，该物质在制备物中的摩尔数比其他物质的大)。“纯化的成分”是指一种制备物，其中目标物质(在摩尔数上)至少是存在的其他所有物质的50％。在测定溶液或分散体系中目标物质的纯度时，用于溶解或分散物质的溶剂或基质通常不包括在所述测定中；反之，只考虑溶解或分散的物质(包括目标物质)。一般地，纯化的成分含有一种物质，其占组合物中存在的所有物质的约80％以上，或占存在的所有物质的超过85％、90％、95％、99％甚至更高。目标物质能被纯化至基本上为同质物(即，传统检测方法无法检测出组合物中的杂质)，其中组合物基本上只含有一种物质。技术人员可利用本披露中蛋白纯化的标准技术来纯化本披露中的蛋白。可以通过本领域技术人员已知的许多方法来检测多肽的纯度，例如通过氨基末端的氨基酸序列分析、凝胶电泳和质谱分析。
[0055] 术语“选择性”指的是亚群中的活性。例如，目标蛋白的“选择性表达”指的是目标蛋白被细胞群中的某个细胞亚群表达。
[0056] 术语“重组蛋白”或“重组多肽”指的是通过重组DNA技术得到的多肽。这样的技术的实例包括，向合适的表达载体中插入编码表达蛋白的DNA序列，并将所述载体用于转化宿主细胞以产生所述DNA编码的蛋白或多肽。
[0057] 术语“调控序列”是一个在说明书中通篇使用的概括性术语，指的是例如起始信号、增强子、操纵子和启动子等多核苷酸序列，需要或优选通过所述多核苷酸序列，来影响与之可操作地连接的编码或非编码序列的表达。Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述了示例的调控序列，包括，例如SV40的早期和晚期启动子、腺病毒或巨细胞病毒立即早期启动子、lac系统、trp系统、TAC或TRC系统、通过T7 RNA聚合酶直接表达的T7启动子、lambda噬菌体的主操纵子和启动区、fd包被蛋白的调控区，3-磷酸甘油酯激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酶的启动子，例如，Pho5、酵母α交配因子的启动子、杆状病毒群的多面体启动子和其他已知的控制原核和真核细胞及其病毒基因表达的序列及其各种组合。调控序列的特性和适应性因宿主生物而异。在原核生物中，所述调控序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“调控序列”狭义上包括影响表达的组件，也包括有益的添加组件，例如，前导序列和融合伴侣序列。在一些实施方式中，在需要表达的细胞类型中，多核苷酸序列的转录是在启动子(或其他调控序列)的控制下进行的。可以理解，控制多核苷酸的调控序列也可以是与控制天然形式的所述多核苷酸表达相同或者不同的调控序列。在某个实施方式中，调控序列是具有一段Tctex-1调控序列的核苷酸序列的分离的核酸。
[0058] 术语“序列同源性”指的是两段核苷酸序列之间的碱基匹配比例或两段氨基酸序列之间的氨基酸匹配比例。当序列同源性用百分比来表示时，例如，50％，所述百分比表示一段序列的一部分与另一段序列的一部分匹配的比例。可以引入空缺(两段中的任意序列)以使匹配度最大化；通常采用15个碱基或更少的空缺，更通常地6个碱基或更少的空缺，最通常地2个碱基或更少的空缺。术语“序列同一性”是指比较窗口中相同的序列。术语“序列同一性百分比”是通过将在比较窗口中两条被优化比对的序列进行比较来计算，确定两个序列中均出现相同氨基酸的位点数，以得到匹配位点数，用匹配位点数除以在比较窗口中总的位点数，然后将结果乘以100，得到序列同一性百分比。计算序列同一性的方法为本领域技术人员所熟知，并下面进一步详细说明。
[0059] 短语“全身给药”，“进行全身给药”，“外周给药”和“进行外周给药”的意思是，对患者、对象或宿主给予物质、补充剂、组合物、治疗剂或其他物质，而不是直接对中枢神经系统给药，因此这些物质会受到代谢和其他类似过程的影响。在某个实施方式中，给药方式是皮下给药。
[0060] 术语“Tctex-1”是“t-复合物相关的睾丸表达物1”或“T-复合物睾丸特异性蛋白1”的缩写。这两个术语对于本领域技术人员来说可以相互交换使用。本领域技术人员还使用其他术语用以指代人类Tctex-1蛋白，包括“CAG33212”、“TCTEL1”、“AAB03318”和“CW-1p”。所述术语包括在2007年1月11日公开的，PCT国际公开号WO/2007/005733中描述的突变Tctex-1蛋白，此公开文本在此全文参考并入。
[0061] 术语“治疗有效剂量”指的是当对需要治疗的患者或者对象给药时，足以产生有效治疗效果的调节剂、药物或者其他分子的量。治疗有效剂量会因为对象和治疗的病情、患者或对象的体重和年龄、病情严重程度、给药方式等的不同而不同，这可以由本领域普通人员很容易地判断。
[0062] 术语“治疗”在这里旨在包括治愈和改善病症或疾病的至少一种症状。
[0063] 术语“载体”指的是一种核酸，其能够转移与之相连接的核酸。在某个实施方式中，载体是一种游离体，即具有染色体外复制能力的核酸。其他披露的载体包括能够自主复制并表达与之相连接的核酸的载体。在本申请中，将能够引导与之可操作地连接的基因表达的载体叫做“表达载体”。通常，重组DNA技术中的表达载体通常是“质粒”的形式，质粒指的是，在载体形态下与染色体不相连的环状双链DNA分子。感染性表达载体，例如重组杆状病毒，用于在培养的细胞中表达蛋白。其他感染性表达载体，例如重组腺病毒和疫苗病毒，用作疫苗，以在被免疫者中表达外来抗原。然而，本发明旨在包括其他形式的表达载体，它们具有同等的功能，并在之后为本领域所知。
[0064] 除非特别说明，所有表示成分和反应条件的量等等的数字在所有情况下都理解为被术语“大约”所修饰。因此，除非有相反的说明，否则精确的数字参数可以随个别实施方式而变化。
[0065] 在成人脑部的未成熟区域，Tctex-1免疫反应性在增殖性神经前体细胞和干细胞中选择性地富集，但不在成熟的神经元中富集。本申请公开了Tctex-1基因的调控区，其特征在于能够引导转基因表达，所述转基因表达重现了内源性Tctex-1在空间与时间上的表达类型。在某些实施方式中，Tctex-1调控序列的长度是约1kbp、约2kbp、约3kbp、约4kbp、5kbp、约6kbp、约7kbp、约8kbp、约9kbp、约10kbp、约11kbp、约12kbp、约13kbp、约14kbp和约15kbp。在某些实施方式中，Tctex-1调控序列的长度是约6kbp到约10kbp。在某些实施方式中，Tctex-1调控序列的长度是约9kbp到约11kbp、约8kbp到约12kbp、约7kbp到约13kbp、约6kbp到约14kbp和约5kbp到约15kbp。在一些实施方式中，Tctex-1调控序列的长度是约5kbp到约7kbp，约4kbp到约8kbp，约3kbp到约9kbp，约2kbp到约10kbp和约1kbp到约11kbp。
[0066] 将绿色荧光蛋白(GFP)报告基因置于小鼠Tctex-1的控制之下，其含有6kb的5’上游序列、2kb的内含子1和0.2kb的内含子2。当通过子宫内电穿孔向小鼠新生大脑皮质递送时，这个构建体特异性地在nestin+/Pax6+/GLAST+放射状胶质细胞和Tbr2+中间前体细胞中靶向表达。对在同一个调控元件的控制下表达GFP转基因的小鼠进行鉴定，表明GFP的表达忠实于内源性Tctex-1在成人脑部齿状回颗粒下层(SGZ)、侧脑室的脑室区/室下区和第三脑室的室管膜层的表达。在四种独立的小鼠品系中对成人SGZ进行免疫定位与溴脱氧尿苷掺入的研究，结果证明，在两种小鼠品系(4和13)中，Tctex-1：GFP报告基因选择性地标记nestin+/Pax6+/GLAST+神经干样细胞。在另两种小鼠品系(17和18)中，Tctex-1：GFP选择性地在II类和III类过渡扩增前体细胞和一小类初期神经元子代中表达。P/E-Tctex-1报告小鼠的研究独立地证实了，Tctex-1在成体SGZ干细胞/前体细胞中的特异性富集。此外，这些研究表明类似的转录程序可以用于调控胚胎大脑皮层和成体海马体中的神经发生。
[0067] Tctex-1基因组序列引导GFP报告基因在发育的新生大脑皮质的神经干细胞和前体细胞中特异性表达
[0068] 近期的报告表明，类似的转录程序可以在成人SGZ和胚胎大脑皮层中控制神经生成(Hodge et al.，2008)。因此，在Tctex-1基因组区域中寻找一段能够引导在成人SGZ选择性表达的序列，使用了新生大脑皮质作为表达模型系统，因为IUE模型能够将报告基因迅速递送至新生大脑皮质(Saito and Nakatsuji，2001；Tabata and Nakajima，2001)。依据不同物种Tctex-1基因的比对，设计并生成了一个GFP报告基因构建体，在此构建体中，GFP的cDNA由小鼠Tctex-1的进化上保守的约6kb 5’上游区域、约2kb的内含子1和约0.2kb的内含子的2片段驱动，我们称之为P/E-Tctex-1：GFP(图1A)
[0069] P/E-Tctex-1：GFP质粒与一个控制性的报告质粒(CAG启动子引导的HcRed)通过子宫内电穿孔(IUE)一起共转染入13.5日胎龄的小鼠新生大脑皮层。对转染40小时之后得到的皮质部分进行共焦检测，结果证明，大部分具有强红色荧光的HcRed转染细胞与有丝分裂后的初期神经元相似；它们具有多极分化过程并且迁移进入中间区(IZ)。剩余的在脑室(VZ)和室下区(SVZ)的HcRed+细胞显示很弱的红色荧光，表明启动子活性减弱(图1B)。与此相反，含有大多数表达GFP的细胞的细胞体分散在VZ和SVZ区(图1B)。许多这些细胞都有放射状胶质(RG)细胞的特征，具有延伸的放射状突起(extended radial processes)，其末梢与脑室和软膜表面相连接(图1B，箭形)。
[0070] 为进一步鉴定Tctex-1调控序列靶向作用的细胞类型，对几种转录因子(例如Pax6，Tbr2，Tbr1)进行免疫染色，以标记在新生皮质发育的不同阶段的细胞(图2)。Pax6在RG细胞中特异性表达，RG细胞的细胞体在VZ中富集(Englund et al.，2005；Gotz et al.，1998)。Tbr2在中间前体细胞(或过渡扩增前体细胞)中表达，其主要分布在SVZ(Englund et al.，2005；Hodge et al.，2008)。之前发现有丝分裂后的神经元表达Tbr1，该神经元主要分布于IZ、底板和骨皮质(Englund et al.，2005；Hevner et al.，2001)。免疫染色的结果表明76％±3％和33％±1％的Tctex-1-GFP+细胞(3组独立实验中的300个细胞)也分别表达Pax6和Tbr2，实际上几乎没有Tctex-1-GFP+细胞是Tbr1+的(图2)。
[0071] 已证实，几种细胞类型特异性的报告基因能够靶向标记不同的新生皮质细胞群(Gal et al.，2006；Wang et al.，2007)。例如，Tα-1报告子优先靶向中间前体细胞和有丝分裂后的初期神经细胞(Wang et al.，2000)。GLAST启动子优先靶向RG细胞(Gal et al.，2006)。为了独立分析Tctex-1调控序列靶向的细胞类型，将pGLAST-DsRed2或pTα-1-DsRed与P/E-Tctex-1：GFP质粒通过电穿孔共同导入新生大脑皮质，并检测同时表达GFP和DsRed的细胞。对转染40小时后的脑部切片进行共焦显微检测，结果表明80％±4％和31％±3％的GFP+细胞也表达GLAST-和Tα-1-启动子引导的DsRed2(图3A，B)。
[0072] 最后，已报道，由巢蛋白(例如E/nestin：hGFP)的增强子元件驱动的报告基因构建体能在胚胎大脑中同时靶向RG和中间前体细胞(Gal et al.，2006)。在新生大脑皮层中通过电穿孔，共同导入E/nestin：hGFP报告基因构建体与含有在P/E-Tctex-1控制下的DsRed基因的报告基因质粒，并且比较它们的表达方式。转染的大脑皮层切片显示，几乎100％的DsRed+细胞也表达GFP(图3C)。启动子分析以及免疫染色研究表明，识别的Tctex-1调控序列在新生大脑皮层中的RG细胞和中间前体细胞中引导特异性的基因表达。
[0073] P/E-Tctex-1：GFP转基因小鼠的产生与鉴定
[0074] 为了评估鉴定在新生大脑皮层前体细胞中引导特异性表达的Tctex-1的基因片段是否也在成体神经干细胞/前体细胞中有转录活性，生成了携带P/E-Tctex-1：GFP基因的转基因小鼠。我们一共获得总共十六个独立品系的该种小鼠。其中，所有四个原始独立品系的测试小鼠产生了稳定表达转基因的后代。对所有四个品系(4，13，17，18)的8周龄小鼠脑部进行GFP免疫染色检测，结果显示，表达Tctex-1：GFP的细胞与表达内源性Tctex-1的细胞相似，在DG的SGZ(图4A，图5A，5D-G)和侧脑室(图4B，图5B)中富集。另外，在第三脑区中几乎所有细胞都发现有显著的GFP信号(图4C-F，图5C，H)，因此确认内源性Tctex-1的特异性富集(图C-F，图5H-J)。然而，DG区域的深入检测表明，这四个品系的小鼠分为两组，DG区域的GFP+细胞的鉴定将在以下单独描述。
[0075] P/E-Tctex-1：GFP主要在sox2+/nestin+/GFAP+干样SGZ细胞中显著表达[0076] 在两个独立品系(即品系4和品系13)小鼠中，DG区域的表达Tctex-1：GFP的细胞表现出长突起(long processes)，其在颗粒层放射状扩散并在分子层分支伸展。这些细胞在形态上和这部分脑部区域的神经干样细胞相似(Mignone et al.，2004)。事实上，大量表达GFP的细胞呈Sox2阳性(图4G，H中的箭形)，Sox2是主要与DG区域神经干样细胞相关的转录因子(Komitova and Eriksson，2004)。此外，用GFAP(图4G中的箭头)和nestin+(图4H中的箭头)免疫标记GFP+/Sox2+细胞的放射状突起。在这些GFP+细胞的细胞体和突起中检测到内源性Tctex-1(图4I)。最后，大多数SGZ Tctex-1+细胞是Ki67阴性，Ki67是处于细胞周期中的细胞的标记(图4J中的箭头)。这些结果共同表明，这两个转基因品系的小鼠中，GFP在成体SGZ的Sox2+/GFAP+/nestin+神经干样细胞中显著表达。
[0077] P/E-Tctex-1：GFP在成体DG区域中的过渡扩增前体细胞中显著表达
[0078] 对小鼠品系17和18的DG区域的检测显示，Tctex-1：GFP+细胞和NeuN+成熟颗粒神经元是互相排斥的(图6A)。与小鼠品系4和13中的Tctex-1：GFP细胞相比，相当部分的Tctex-1：GFP细胞是Ki67阳性(即品系17和18中分别有48％和42％的Ki67+细胞也表达GFP，图6B，C)。使用BrdU掺入分析方法，鉴定Tctex-1：GFP+细胞的增殖能力。在这些实验中，实验动物在6小时内连续接受3次BrdU注射，并且在最后一次注射之后存活1小时、24小时或72小时。大约26±4％的1小时BrdU掺入细胞也是Tctex-1：GFP+；这些细胞最可能是过渡扩增前体细胞。与此一致，这些细胞倾向于有切线方向的细胞体和短的水平结构(图6D，箭形)。存活时间延长使得在总的BrdU+细胞中的Tctex-1：GFP+/BrdU+细胞增加(即24小时收获组为55±6％和72小时收获组为70±3.3％)，表明在后者的前体细胞中也表达Tctex-1：GFP。
[0079] 使用标记II类和III类前体细胞的抗体进行共定位研究，以分析这些小鼠品系中的Tctex-1：GFP SGZ细胞的身份。细胞核Tbr2标记主要显示II类前体细胞和一部分的III类前体细胞(Hodge et al.，2008)。相反，由DCX衍生的突起的标记主要分布在III类前体细胞和有丝分裂后的初期神经元中。在低倍观察下，在SGZ中，DCX+细胞在数量上超过Tctex-1：GFP+细胞，后者在数量上超过Tbr2+细胞。详细的共焦检测显示，基本上所有的Tbr2免疫反应细胞也是Tctex-1：GFP+(图7A，箭形)。然而，也存在GFP-/Tbr2-细胞群(图7A，箭形)。DCX共定位的研究显示，检测到了所有DCX+/GFP+细胞(图7B，箭形)、DCX+/GFP-细胞(图7B，空箭形)和DCX-/GFP+细胞(图7B，箭头)三类细胞群。
[0080] 最后，几乎没有表达GFP的SGZ细胞对Sox、巢蛋白或GFAP呈阳性(图7C，D)。虽然GFAP标记的突起与GFP+突起通常极为接近，但其中的大多数并不重合(coincidental)(图7C，D)。相似地，巢蛋白标记的放射状突起没有显示出可检测的GFP+。
[0081] 在所有测试的4个P/E-Tctex-1：GFP小鼠品系中，实际上没有GFP+细胞在DG、SVZ或第三脑区表达成熟神经细胞标记NerN(图5A)。然而，检测了这4个品系小鼠中表达GFP报告基因的成体SGZ细胞，结果显示，一组小鼠(即品系4和13)的GFP选择性标记了I类神经干样细胞，而另一组小鼠(即品系17和18)带有GFP标记的II类和III类神经前体细胞。
[0082] 本申请公开了表达Tctex-1：GFP的细胞，其代表了II类和III类前体细胞。
[0083] 发育中脑部和成体脑部中的神经前体细胞有类似的基因调控途径
[0084] 在某个实施方式中，新生大脑皮层和成体SGZ前体细胞有共同的基因表达调控机制，这与近期提出的在新生大脑皮质和成人DG区域的转录因子(例如，Pax6，Tbr2)平行串联的概念相一致(Hodge et al.，2008)。在某个实施方式中，不同来源或者不同发育阶段的神经前体细胞可以显示重叠的细胞特性。
[0085] 虽然转基因小鼠是筛选基因表达调控元件的传统方法，但是却耗时、耗力和耗财。如果一种方法能够将转基因方法的优势和确定性与快速筛选技术相结合，那么将能够使研究人员迅速确定参与目标基因空间调控的DNA区域。本申请公开了Tctex-1基因的基因组片段，其在成体大脑中引导报告基因的表达。本申请还公开了“组织转染”的方便和快速的方法，用于在几类视网膜细胞中对启动子和增强子进行体内鉴定。
[0086] 最近提出，第三脑区是在侧脑室的SGZ和室下区(SVZ)之外的另一个显示出神经活性的位点(Xu et al.，2005)。虽然数量很少，但是有丝分裂的前体细胞似乎存在于成体小鼠第三脑区的室管膜层，这些细胞能够分化成神经细胞，其可迁移并融入下丘脑。这部分的神经活性很容易受到各种刺激物的上调(Xu et al.，2005)。有趣的是，最近显示，Sox2启动子驱动的GFP在第三脑区室管膜细胞中富集(Brazel et al.，2005)。我们巧合地观察到第三脑区室管膜细胞有高水平的Tctex-1启动子/增强子的活性和内源性Tctex-1，这进一步提示，第三脑区细胞可能具有与SGZ和SVZ前体细胞相似的固有特性；然而，一种尚未探明的抑制子能在正常的生理条件下抑制它们的有丝分裂活性。
[0087] 引导成体SGZ神经前体细胞的新型调控元件的鉴定
[0088] 在所有测试的4个P/E-Tctex-1：GFP小鼠品系中，实际上没有GFP+细胞在DG、SVZ或第三脑区表达成熟神经元标记NeuN(图5A)。然而，测定了这4个品系小鼠中表达GFP报告基因的成体SGZ细胞，结果显示，一组小鼠(即品系4和13)的GFP选择性标记了I类神经干样细胞，而另一组小鼠(即品系17和18)具有GFP标记的II类和III类神经前体细胞。
[0089] 在品系17和18中，BrdU和共定位研究表明，GFP报告基因水平在处于细胞周期的前体细胞中暂时较高，但一旦神经细胞分化后即迅速减少。虽然Tctex-1：GFP和内源性Tctex-1在成体SGZ中的分布类型在性质上是一致的，但是BrdU的出生标记实验表明，GFP-Tctex-1的表达与内源性Tctex-1相比有轻微的延迟。我们先前的结果显示，BrdU标记2小时的II类前体细胞中，约90％具有内源性Tctex-1(Dedesma et al.，2006)。BrdU标记1小时的细胞中，少于30％的细胞表现出Tctex-1：GFP。相反，BrdU标记72小时的III类前体细胞中，较高比例的细胞表达Tctex-1：GFP。在转基因小鼠品系中，观察到靶向于成体SGZ细胞的报告基因的表达延迟(图7)。例如，由巢蛋白基因增强子/启动子控制的GFP不仅在I类细胞(有内源性巢蛋白)中有表达，而且在II类细胞(没有内源性巢蛋白；Filippov et al.，2003；Steiner et al.，2006)中也有表达。DCX启动子引导的DsRed不仅在III类前体细胞中表达，而且在NeuN+成熟胶质神经细胞中也表达(Couillard-Despres et al.，2006)。
[0090] 已经分离了一些在成体神经干细胞/前体细胞中引导特异性表达的基因组片段(Couillard-Despres et al.，2006；Filippov et al.，2003；Fukuda et al.，2003；Steiner et al.，2006)。不过，分离到靶向于SGZ前体细胞且具有更高特异性的相对较小的基因组片段，这为这些细胞的实验操作增加了一种额外的有用工具。例如，该调控区域能够用于对目标基因进行选择性地功能失活或者功能激活的研究。另外，识别这些细胞的工具可以允许直接检测这些细胞在体内的发育情况(即命运图谱分析)。这些研究共同揭示了这些细胞的善意身份(bona fide identity)、生物特性及操作它们的有效方法。
[0091] 成体干细胞/神经前体细胞中Tctex-1的潜在功能
[0092] 通过免疫组织学和原位研究，首先描述了成体SGZ中神经干细胞/前体细胞中Tctex-1的选择性富集(Chuang et al.，2001；Dedesma et al.，2006)来说明。Tctex-1的调控区域引导的转基因GFP报告基因具有相似的表达类型，这独立证明了这些细胞中Tctex-1的特异性富集。已经报道了Tctex-1的几种细胞功能，依赖或不依赖于细胞质动力蛋白(Chuang et al.，2005；Machado et al.，2003；Mueller et al.，2002；Nadano et al.，2002；Nagano et al.，1998；Schwarzer et al.，2002；Tai et al.，1999；Tai et al.，2001)。非常有意思的是，Tctex-1与G蛋白信号2(AGS2)的活化剂同义，该活化剂与Gβ亚基结合，并且参与非典型不依赖于受体的G蛋白信号途径(Sachdev et al.，2007；Takesono et al.，1999)。非典型不依赖于受体的G蛋白信号途径在苍蝇成神经细胞和秀丽线虫的胚胎的细胞分裂对称性中起到关键作用(Gotta et al.，2003；Schaefer et al.，2001)，但是还没有显示AGS2是哺乳动物神经干细胞或前体细胞的标记。最近表明，哺乳动物G蛋白信号3(AGS3)的活化剂(不与Tctex-1同义)在新生大脑皮层发育中参与神经前体细胞的命运决定(Sanada and Tsai，2005)。
[0093] 肠前体细胞
[0094] 对肠前体细胞的鉴定(Barker et al，2007)及其在癌症中的作用(Barker et al.，2009)在最近引起了不小的兴趣。在许多芯片研究中发现，Tctex-1在肠前体细胞中富集(Mills et al 2002)，因而这里描述的调控序列也可用于靶向肠前体细胞。
[0095] Tctex-1调控序列
[0096] 在某个实施方式中，调控序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，即人类tctex-1调控序列。
[0097] 在某个实施方式中，调控序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，即小鼠tctex-1调控序列。
[0098] 在另一个实施方式中，调控序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，即小鼠tctex-1调控序列可操作地连接于编码GFP的核苷酸序列。
[0099] 在另一个实施方式中，调控序列与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少95％的序列同源度。
[0100] 在另一个实施方式中，调控序列与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少90％的序列同源度。
[0101] 在另一个实施方式中，调控序列与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少85％的序列同源度。在另一个实施方式中，调控序列与如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列具有至少80％的序列同源度。
[0102] 本申请公开了对有神经疾病、紊乱或病症的对象进行治疗的方法，包括向对象给药药物组合物的步骤，由此治疗所述有神经疾病、紊乱或病症的对象。
[0103] 本申请公开了在细胞群中的前体细胞中选择性地表达目标核酸的方法，所述方法包括：将所述目标核酸置于Tctex调控序列的控制之下，所述Tctex调控序列在所述前体细胞中选择性地发挥功能，以及将置于所述Tctex调控序列控制下的目标核酸导入所述细胞群，由此在所述细胞群中的所述前体细胞中选择性地表达所述目标核酸。
[0104] 本申请公开了在细胞群中标记前体细胞的方法，所述方法包括：将标记基因置于Tctex调控序列的控制之下，所述Tctex调控序列在所述前体细胞中选择性发挥功能；将置于Tctex调控序列控制下的所述标记基因导入所述细胞群，并在所述前体细胞中使得所述标记基因表达，由此在细胞群中标记所述前体细胞。
[0105] 本申请公开了从细胞群中分离标记细胞的方法，所述方法包括：将标记基因置于Tctex调控序列的控制之下，所述Tctex调控序列在所述前体细胞中选择性发挥功能；将置于Tctex调控序列控制下的所述标记基因导入所述细胞群，并在所述前体细胞中使得所述标记基因表达，由此标记在细胞群中表达所述标记基因的细胞；以及从所述细胞群中分离所述标记的细胞。
[0106] 本申请公开了评估细胞群中前体细胞的活性，所述方法包括：将标记基因置于Tctex调控序列的控制之下，所述Tctex调控序列在所述前体细胞中选择性发挥功能；将置于Tctex调控序列控制下的所述标记基因导入所述细胞群，并在所述前体细胞中使得所述标记基因表达，由此评估细胞群中前体细胞的活性。
[0107] 实用性
[0108] 研究和开发
[0109] 分离的Tctex-1调控序列能以很强的特异性靶向于前体细胞，为这些细胞的实验操作提供了有用的工具。
[0110] 含有由Tctex-1调控片段控制的标记的细胞、细胞系和小鼠提供了独特的工具，用于检测行为或前体细胞，包括研究成体和发育中的神经发生、和研究肠前体细胞在肠生理和疾病例如癌症中的作用。首先，它们能够通过对GFP+的处于细胞周期的细胞进行简单地评分，来检测不同的实验试剂和条件对前体细胞行为的影响。与[3-H]-胸苷相似，BrdU也能掺入到正在进行DNA合成的细胞的DNA中。掺入的BrdU能够被抗BrdU的抗体检测。虽然这个方法很有效，但是也有几个缺点：有细胞毒性，每次细胞分裂后BrdU被稀释；和免疫标记中需要冗长的过程。
[0111] 含有由Tctex-1调控片段控制的标记的细胞、细胞系和小鼠提供了工具，用于研究外伤、疾病或者衰老如何影响前体细胞。特别对于中枢神经系统，它们可用于研究脑部微环境和成体幼芽区细胞的增殖和神经性能力。对于肠，它们可用于研究肠隐窝微环境及其中细胞的增殖。它们可用于命运图谱分析实验：将含有Tctex-1调控序列的转基因小鼠与双重报告基因的小鼠(例如，Z/EG)杂交，其中Tctex-1调控序列引导可诱导形式的Cre重ERT2组酶的表达(例如，Cre )，从而在体内可追踪成体产生的细胞的个体发育、寿命和发育。
细胞和细胞系可用于体外鉴定，和/或与从其他小鼠分离得到的I类细胞相比较。与之类似，它们能够用来对目标基因进行选择性地功能失活或者功能激活的研究。
细胞和细胞系可用于体外鉴定，和/或与从其他小鼠分离得到的I类细胞相比较。与之类似，它们能够用来对目标基因进行选择性地功能失活或者功能激活的研究。
[0112] 另外，这些研究工具可用于发现和评估影响前体细胞的药物。在中枢神经系统，这些药物的适应症可涉及成体神经发生中与年龄、病症或疾病相关缺陷的逆转。相反，如果前体细胞参与了中枢神经系统的癌症，则适应性可涉及治疗所述癌症。在肠中，这些药物的适应症可涉及上皮更新中与年龄、病症或疾病相关缺陷的逆转。相反，如果前体细胞参与了肠癌，包括结肠癌，则适应性可涉及治疗所述癌症。
[0113] 置于Tctex-1调控序列控制之下的疗法
[0114] Tctex-1调控序列可用于选择性地导入一种分子，以操控前体细胞的活性，通过将编码该分子的核酸置于Tctex-1调控序列的控制下。所述序列能够编码具有治疗作用的蛋白。能够影响前体细胞命运的蛋白，例如控制或影响细胞功能，例如细胞周期、增殖、神经生成、细胞迁移、细胞分化、细胞生长和指导、细胞附着、突触形成和其他功能，这样的蛋白被称为“目标蛋白”。目标蛋白样品在表A中罗列。置于Tctex-1调控序列控制之下的分子也可以编码siRNA、microRNA、反义分子或适配子。这样的核酸分子被称为效应核酸。
[0115] 本申请公开的目标效应核酸是siRNA、microRNA、反义分子或适配子，其被置于Tctex-1调控序列的控制下，这些效应核酸的产物能够抑制目标蛋白的转录或者翻译，或者调节目标蛋白的功能。效应核酸的产物能够用来下调或者上调神经生成的水平或肠上皮更新的水平。
[0116] 目标效应核酸可以是置于Tctex-1调控序列控制之下的一段序列，该序列编码效应蛋白并调节目标蛋白的功能。效应蛋白可用于下调或者上调神经生成或肠上皮更新。
[0117] 目标蛋白样品(表A)
[0118] 神经生成阶段：胶质纤维酸性蛋白(GFAP)；巢蛋白；T-box脑部基因2蛋白(Tbr-2蛋白)；双肾上腺皮质激素(CDX)；唾液酸神经细胞附着分子(PSA-NCAM)；青色荧光蛋白(CFP)；Ho/rac鸟嘌呤交换因子(GEF)2(Lfc)；维生素；性别决定区Y-box2(SOX-2)；脑部脂肪酸结合蛋白(BFABP)；普洛斯彼罗相关同源框1(Prox-1)；βIII微管蛋白；神经细胞核(neuN)；钙结合蛋白；睫状神经营养因子(CNTF)。
[0119] 细胞增殖：PEgf、Fgf2、Il3、Nrp1、Ptn、Vegfa.Alk、Bai1、Cxcl1、Ndn、Notch2、Odz1.Ache、Cdk5r1、Cdk5rap1、Cdk5rap3、Erbb2、Mdk、Ndph、S100a6、S100b。
[0120] 细胞周期基因：Apbb1、Inhba、Mll1、Notch2、Apbb1、Inhba、Ep300、Fgf2、Hdac4、Hdac7、Mdk、Ndn、Pard6b、S100a6、S100b。
[0121] 细胞运动性与细胞迁移调控：Flna、Ntn1、Pafah1b1、Pard6b、Slit2、Stat3、Vegfa。
[0122] 细胞分化调控：Cdk5r1、Cdk5rap1、Cdk5rap2、Cdk5rap3、Ywhah、Dll1、Notch2、Shh、Ascl1、Hdac4、Hdac7、Inhba、Mdk、Ncoa6、Neurod1、Nog、Nrcam、Nrg1、Pax5、Pax6。
[0123] 生长因子与细胞因子：Artn、Bdnf、Bmp15、Bmp2、Bmp4、Bmp8b、Cxcl1、Gpi1、Egf、Fgf13、Fgf2、Gdnf、Il3、Inhba、Mdk、Ndph，Nrg1、Ptn、S100a6、Vegfa.Bmp15、Bmp2、Bmp4、Bmp8b、Cxcl1、Gpi1、Il3，Inhba、Mdk、Ptn。
[0124] 突触功能相关基因：Apoe、Grin1、S100b、Ywhah、Chrm2、Dlg4、Drd2、Drd5、Grin1、Nptx1、Ache、Nrcam、Pou4f1。
[0125] 细胞凋亡：Gdnf、Notch2、Sema4d、Adora1、Apoe、Inhba、Notch2、S100b，Adora2a、Ep300、Ntn1、Pax3、Rtn4、Vegfa、Ywhah。
[0126] 细胞附着：Robo1、Ache、Bai1、Dll1、Efnb1、Fez1、Nrcam、Nrp1、Nrp2、Pard3、Rac1、Sema4d、Slit2、Tnr。
[0127] 神经生成相关细胞信号基因：Dll1、Notch2、Dvl3、Adora1、Adora2a、Bai1、Chrm2、Cxcl1、Drd2、Drd5、Gnao1、Ncoa6、Notch2。
[0128] 或其他本领域已知的基因，包括2007年1月11日公开的WO/2007/005733中突变的Tctex-1基因，此文件在此全文参考并入。
[0129] 分离的细胞群
[0130] 本申请公开了使用任何本申请说明的或者本领域已知的标记方法，来分离Tctex-1标记的细胞的方法。Tctex-1基因在哺乳动物中高度保守(人和小鼠之间为2/133的碱基变化)。还公开了收获tctex-1-GFP标记的神经前体细胞的方法，包括用于神经移植的细胞。例如，在帕金森症中，存在进行性的神经细胞损失，特别是影响黑质纹状体的多巴胺能神经元。胎儿多巴胺前体细胞的移植能够改善患者的临床症状。用Tctex-1调控序列分离的细胞群可以用于减轻本申请所述的疾病、病症和紊乱的临床症状。
[0131] 神经生成
[0132] 由于不愿受到任何特定理论的束缚，以下只是关于神经生成的一种观点；然而，其他有效的理论可以并且会存在。
[0133] 神经发育
[0134] 在原肠胚细胞形成过程中，细胞迁移进入胚胎内部，形成三个胚层-内胚层(最内部层)、中胚层和外胚层(表面层)—所有的组织和器官都从中生成。简单地说，外胚层生成皮肤和神经系统，中胚层生成内脏而内胚层生成其他器官。在所有的脊椎动物中，在原肠胚形成之后就是神经胚形成，从胚胎的外胚层中形成神经管。在原肠胚形成后，从中胚层中形成脊索—一种沿胚胎背部延伸的有弹性的杆状体。脊索向上面覆盖的外胚层发出信号，诱导其成为神经外胚层。这最后使得沿着胎儿的背部形成一条神经干细胞条带。这条带称为神经板，是整个神经系统的发源。
[0135] 神经板在怀孕第三周向外折叠形成神经槽。从未来的颈部区域开始，神经槽的折叠逐渐形成神经管。神经管的前部叫做基板；后部叫做翼板。中间叫做神经椎板。在怀孕第四周后，神经管(神经孔)的开放末端封闭。在第四周后期，神经管的上级结构在未来的中脑区—中脑—弯曲。在中脑上方是前脑(将来的前脑)，下方是菱脑(将来的后脑)。
[0136] 胚胎神经管细胞有三层：脑室区，之后称为室管膜，在神经管的中央管区；中间区，由脑室区的分生细胞产生(包括早期放射状胶质细胞类型)，并在脑室区表面和外层(软膜)之间延伸；以及外边缘区，由中间区的神经细胞产生。
[0137] 中间区，或套层，增加细胞构成并通过神经生成和前体细胞分化而变成灰质。脑室区和室下区通过神经生成和前体细胞分化也成熟。边缘区的神经细胞和其他细胞突起都变成有鞘膜的白质。
[0138] 神经迁移是神经元从它们的起源或者生成地向它们在脑部的最终位置迁移的方法。有几种迁移的方法，例如放射状迁移和切线迁移。
[0139] 神经前体细胞在新生大脑皮层的脑室区增殖。第一批有丝分裂后的细胞迁移形成前板，其最终定向为形成Cajal-Retzius细胞和底板神经元。这通过神经元体细胞的迁移来实现。放射状神经胶质细胞的纤维作为细胞迁移的骨架，能够自身分裂，或转定位到皮质层板并分化成星形胶质细胞或神经细胞。神经元体细胞迁移能够在发育的任何时间发生。后继批次的神经元通过沿着放射状胶质纤维迁移，将前板分割形成皮质板。每个批次的迁移细胞以由内而外的方式通过前面的细胞层，这意味着最新的神经元最靠近表层。
[0140] 成体神经生成
[0141] 从出生之后到贯穿整个成年期间，新的神经元持续在脑部的两个主要区域生成：1)在侧脑室边缘(lining)的脑室区(SVZ)，其中新细胞通过侧迁移流迁往嗅球。
[0142] 室下区(SGZ)，其为海马区齿状回的部分区域。
[0143] 许多在SGZ的新细胞在出生后不久就死亡，但他们当中的一部分从功能上融入到周围的海马区脑组织中。
[0144] 有证据表明成人神经生成也可以在脑部的其他区域例如大脑皮层、小脑和下脑丘中发生。
[0145] 成体SGZ神经生成的阶段
[0146] 根据各自不同的形态和特异性分子标记的表达，鉴定了至少三种部分重叠的SGZ细胞群(Ehninger and Kempermann，2008)；(Duan et al.，2008；Zhao et al.，2008)。这在图7中有示意说明。
[0147] I类前体细胞(或神经干样细胞，B类细胞(Seri et al.，2001))，是一种几乎不分裂的细胞，通过其表达的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和巢蛋白(Fukuda et al.，2003)，以及其通过高度细化的分支进入分子层的放射状突起(Mignone et al.，2004)，可以鉴别此类细胞。也认为核转录蛋白Sox2是大多数I类细胞的标记(Steiner et al.，2006)。
[0148] 至少有两类GFP-/Nestin-的过渡扩增前体细胞：II类SGZ前体细胞有短的水平结构，并表达转录因子Tbr2(T-box brain gene 2)(Hodge et al.，2008)和低水平的神经系细胞标记，例如双肾上腺皮质激素(DCX)和唾液酸神经细胞附着分子(PSA-NCAM)。III类前体细胞代表神经定向的细胞，并在它们过渡成为有丝分裂后的神经元期间，这些细胞具有垂直的突起，并选择性表达神经DCX、PSA-NCAM和Tull。在这个脑部区域的细胞周期中的前体细胞(即II类和III类细胞)是操控的完美靶标，因为它们在体内对多种调控影响有强烈反应的能力(Kempermann et al.，1998；Kronenberg et al.，2003)。
[0149] 成体SVZ神经生成的阶段
[0150] 与齿状回中成体神经生成相反，脑室区生成的细胞要向其目标位置，嗅球，迁移较长的距离。这段长距离迁移使得嗅觉神经生成的时间跨度不同于齿状回神经生成：迁移：(2-6天)新生的细胞沿着侧迁移流(RMS)呈链状迁移，侧迁移流是一种由特定的星形胶质细胞维持的结构。在新生的神经元到达OB中间之后，它们从链状结构上脱离，并呈放射状迁移。神经细胞分化：(15-30天)在未成熟的神经细胞达到OB之后，开始分化为两种不同的局部中间神经细胞类型。超过95％分化为氨基丁酸能(GABA)的颗粒神经细胞，另外的成为球旁神经细胞，其表达作为神经递质的GABA或多巴胺。可以将新生颗粒细胞分为不会穿越僧帽状细胞层的树突状细胞和其他达到外部丛状细胞层的无树突的细胞。整合进入神经网络：(15-30天)新生颗粒细胞和球旁神经元整合进入OB网络并且对嗅觉刺激做出反应。
[0151] 幼年的神经生成
[0152] 幼年发育阶段对神经成熟，尤其是大脑皮质和大脑边缘部位，和行为成熟，尤其是复杂的学习能力例如社交技能很重要。幼年发育的特征也在于激素和生长因子的显著变化。在这高度可塑的发展阶段中，重要的神经化学和神经解剖学重构能形成神经网络和行为特征，并维持到成年期。多个使用幼年啮齿动物模型的研究显示，在青春期早期，轴突和树突过量产生，并在之后的青少年期内快速减少，这可能导致脑部的成熟和进入成年期。在幼年期后，在前脑、齿状回和脊椎海马体的神经生成大量减少(He and Crews 2007)。在幼年大脑的高水平的神经生成可以反映出成熟过程中的高水平的神经可塑性。实施例
[0153] 实施例1：质粒和转基因小鼠的产生
[0154] 从Dr.Connie Cepko(Harvard)处 获 得了 由 鸡actin-CMV(CAG)启 动 子 引导 的 HcRed。 从 Dr.Neeta Roy(Weill Medical College)处 获 得 了 的 E/neatin：hGFP(Roy et al.，2000a；Roy et al.，2000b；Wang et al.，2000)。 从 Dr.Nicholas Gaiano(Johns Hopkins University School of Medicine)处获得了pGLAST-DsRed2和pTα-1-DsRed2(Ever and Gaiano，2005)。为了产生P/E-Tctex-1：GFP和P/E-Tctex-1：
DsRed的报告构建体，从小鼠Tctex-1的细菌人工染色体重叠片段中提取(clone RP23-122p23，CHORE)一段EcoR1片段(跨越Tctex-1基因组序列的-5873NT到2861NT)。
在NT155和NT165之间的序列被GFP和DsRed编码序列替代(图1A)。最后，一段约9.5kb片段，其含有完整的Tctex-1调控区域和以上构建子中的报告基因，被转入并插入pCAGIG载体(从from Connie Cepko(Matsuda and Cepko，2004)获得)的骨架来产生转基因P/E-Tctex-1：GFP(图1A)和P/E-Tctex-1：DsRed。
DsRed的报告构建体，从小鼠Tctex-1的细菌人工染色体重叠片段中提取(clone RP23-122p23，CHORE)一段EcoR1片段(跨越Tctex-1基因组序列的-5873NT到2861NT)。
在NT155和NT165之间的序列被GFP和DsRed编码序列替代(图1A)。最后，一段约9.5kb片段，其含有完整的Tctex-1调控区域和以上构建子中的报告基因，被转入并插入pCAGIG载体(从from Connie Cepko(Matsuda and Cepko，2004)获得)的骨架来产生转基因P/E-Tctex-1：GFP(图1A)和P/E-Tctex-1：DsRed。
[0155] 为生成转基因小鼠，通过胶回收，从P/E-Tctex-1：GFP构建体中获得约10kb的SfoI/StuI片段，并用于原核转染(Hogan et al.，1986)。将DNA注入由C57BL/6JxCBA/J的F1代小鼠交配后获得的F2代受精卵中。通过基因组Southern blot分析和聚合酶链式反应(PCR)，使用识别GFP的引物(5’-GAGGAGCTGTTCACCGGGGTG-3’(SEQ ID NO：4)和5’-GTGGTTGTCGGGCAGCAGCAC-3’(SEQ ID NO：5))，发现47个存活的小鼠中有16个被确定为转基因阳性。在实验中使用两个独立品系的成年动物(13和17)。通过与CD1小鼠配种，繁殖各品系。所有的动物实验方法均得到威尔康奈尔医学院的动物保护和利用委员会的批准。
[0156] 实施例2：抗体
[0157] 我们使用的一抗(Abs)是NeuN(免疫原：从小鼠脑部纯化的细胞核，纯化的小鼠IgG1，1∶400，货号MAB377，Chemicon，Temecula，CA)，本研究中还使用了GFAP(免疫原：纯化的神经胶质纤维，小鼠克隆G-A-5，1∶400，货号G3893，Sigma，(Debus et al.，1983))，BrdU(大鼠IgG2a，克隆BU1/75；货号MAS250C，1∶200，Harlan Sera-Lab Ltd.，Loughborough，United Kingdom；免疫原：BrdU-牛血清白蛋白结合物，小鼠IgG1，克隆BMC9318，货号1170376，1∶200，Roche Applied Science，Indianapolis，IN)，双肾上腺皮质激素(DCX)(免疫原：人类DCX的C末端，山羊IgG，货号sc-8066，1∶500，Santa Cruz Biotechnologies，Santa Cruz，CA)，Sox2(兔Ab，1∶100，Stem Cell Tech)，和巢蛋白(免疫原：多聚甲醛固定的15天的大鼠胚胎脊髓，纯化小鼠IgG1，克隆大鼠401(Hockfield and McKay，1985)，1∶1,000，货号556309，BD Pharmingen，San Jose，CA)，DsRed兔Ab(免疫原：Discosoma sp.红色荧光蛋白，兔多克隆抗体，货号632496，Clontech，Mountain View，CA)，GFP兔Ab(免疫原：绿色荧光蛋白，兔血清，货号A6455，1∶1000，Molecular Probes，Eugene，OR)，GFP鸡Ab(免疫原：绿色荧光蛋白，鸡IgY，1∶1,000，分类号ab13970，Abcam，Cambridge，MA)，Tbr1，和Tbr2兔抗体(1∶1000，兔抗体，由Dr Robert Hevner赠送)(Englund et al.，2005)，Ki67(免疫原：Ki67，兔多克隆抗体，1∶1,000，分类号NCL-Ki67p，Novacostral，Newcastle，UK)，和ax6小鼠MAb(免疫原：Pax6，纯化的小鼠IgG1，1∶200，DevelopmentalStudies Hybridoma Bank，the University of Iowa，IA)。
使用了Alexa染料共轭(Invitrogen)，生物素共轭的第二抗体(Vector)，和Cy5共轭的第二抗体(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)。
使用了Alexa染料共轭(Invitrogen)，生物素共轭的第二抗体(Vector)，和Cy5共轭的第二抗体(Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA)。
[0158] 实施例3：子宫内电穿孔
[0159] 按照此前的描述，实施子宫内电穿孔(IUE)(Saito and Nakatsuji，2001；Tabata and Nakajima，2001)。简而言之，CD1小鼠(怀孕期13.5天)经腹腔注射氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉。使用拉长的毛细玻璃管(Drummond Scientific)，通过子宫向胚胎的靶向脑部区域注射无内毒素的质粒DNA(总体积为1μl，含有2μg单质粒，或双质粒各1μg)。通常将胚胎沿着前-后轴向平行排列，使用医用钳状电极，通过子宫对胚胎传递电压脉冲(37V，50msec；BTX Square Wave gene pulser)。
[0160] 实施例4：溴脱氧尿苷(BrdU)处理和免疫组织化学
[0161] 根据荧光蛋白的表达确定转染阳性的胚胎脑部，并在40小时后收获，在4℃下用含有4％的PFA的0.1M磷酸盐缓冲液固定。对于收获的成体脑部，用4％的PFA灌注动物(Chuang et al.，2001；Dedesmaet al.，2006)。用Leica切片机获得40μm的冠状切片(Leica，Nussloch，Germany)。使用之前说明的自由浮动方法进行免疫染色(Chuang et al.，2001)，但在Tbr1和Tbr2的检测中使用了抗原获得过程(Hevner et al.，2001)。使用常规方法进行GFP和DsRed免疫标记，用于检测电穿孔的脑切片中的报告蛋白。阴性对照(例如，去除第一抗体)在所有研究中没有任何特定的信号。在Leica共聚焦显微镜下观察所有的免疫标记样品。每个实验中至少分析3只小鼠。使用GraphPad Prism 4.0b软件进行统计分析(GraphPad Software，Inc)。
[0162] 为进行BrdU标记，将动物注射单剂量的BrdU(100μg/g体重)。重复注射3次，每次间隔两小时。动物在最后一次BrdU给药之后的1小时、24小时和72小时生存时间点进行多次灌注。如前所述，进行脑部切片、染色和打分(Dedesma et al.，2006)。
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