具有增强的产量相关性状和/或非生物胁迫耐受性的植物和用于制备此类植物的方法
阅读：264发布：2023-03-01
专利汇可以提供具有增强的产量相关性状和/或非生物胁迫耐受性的植物和用于制备此类植物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 涉及通过调节SP1激活必需辅因子(CRSP)、Myb相关的CAB启动子结合蛋白(MCB)、Sirtuin 2(SRT2)或SPX-RING的表达修饰产量相关性状。另外，本申请涉及通过调节YRP2、YRP3或YRP4表达而改善的非 生物 胁迫耐受性。，下面是具有增强的产量相关性状和/或非生物胁迫耐受性的植物和用于制备此类植物的方法专利的具体信息内容。
1.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码
CRSP33样多肽的核酸表达，所述的CRSP33样多肽包含任意一个或多个以下的基序：
基序I：YPPPPPFYRLYK或基序，其以递增优选顺序具有与基序I有至少50％、55％、
60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高序列同一性的基序；
基序II：QGVRQLYPKGP或基序，其以递增优选顺序具有与基序II有至少50％、55％、
60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高序列同一性的基序；
基序III：LNRE LQLHILE LADVLVERPS QYARRVE或基序，其以递增优选顺序具有与基序III有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高序列同一性的基序；
基序IV：IFKNLHHLLNSLRPHQARAT或基序，其以递增优选顺序具有与基序IV有至少
50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高序列同一性的基序。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并表达编码CRSP33样多肽的核酸来实现。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述编码CRSP33样多肽的核酸编码表A1中
所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与这种核酸杂交的核酸。
4.根据权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述的核酸序列编码表A1中给出的任一种蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
5.根据任一项前述权利要求所述的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量、优选增加的种子产量。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
7.根据权利要求2至6任一项所述的方法，其中所述核酸有效连接于组成型启动子，优选有效连接于GOS2启动子，最优选有效连接于来自稻的GOS2启动子。
8.根据权利要求1至7任一项所述的方法，其中所述编码CRSP33样多肽的核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，进一步优选地来自茄科(Solanaceae)，更优选地来自番茄(Lycopersicum esculentum)。
9.由根据权利要求1至8任一项所述的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码CRSP33样多肽的重组核酸。
10.构建体，其包含：
(i)编码如权利要求1中定义的CRSP33样多肽的核酸；
(ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
11.根据权利要求10所述的构建体，其中所述的调控序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。
12.根据权利要求10或11的构建体在用于产生植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的产量，尤其增加的种子产量。
13.用根据权利要求10或11的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
14.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的种子产量，所述方法包括：
(i)在植物中导入并表达编码如权利要求1中定义的CRSP33样多肽的核酸；并且
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
15.转基因植物或来自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物因编码如权利要求1中定义的CRSP33样多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的种子产量。
16.根据权利要求9、13或15的转基因植物或来自其的转基因植物细胞，其中所述植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属植物(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
17.根据权利要求16的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是种子。
18.产物，其来自根据权利要求16的植物和/或根据权利要求17的植物的可收获部
分。
19.编码CRSP33样多肽的核酸在相对于对照植物增加产量、尤其在增加种子产量中的用途。
20.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码MCB多肽的核酸的表达。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述的MCB多肽包含一个或多个以递增优选顺序与任意一个或多个以下基序有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、
59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的基序：
(i)基序1：
WTEEEH[RK][KT]FL[AED]GL[ERK][QK]LGKGDWRGI[SA]K[NG]ASHAQKYFLR QTN(SEQ ID NO：188)；
(ii)基序2：
P[GN][KM]KKRR[AS]SLFD[VM][GM][IPA][ARP][DEA][LGY][SHK][PD][ANTY](SEQ ID NO：189)；
(iii)基序3：
[GLA][AGS][LST][GMP]Q[QSL][KS][RG][RK]RR[KR]AQ[ED]RKK[GA][IV]P(SEQ ID NO：
190)；
(iv)基序4：
WTEEEHR[ML]FLLGLQKLGKGDWRGI[SA]RN[YF]V[VIT][ST]RTPTQVASHAQK YFIRQ[ST]
N(SEQ ID NO：191)；
(v)基序5：[RK]RKRRSSLFD[MI]V[AP]D[ED](SEQ ID NO：192)；
(vi)基序6：RRCSHC[SG][HN]NGHNSRT(SEQ ID NO：193)；
(vii)基序7：SHAQKYF(SEQ ID NO：194)，
其中括号之间的氨基酸代表该位置处的备选氨基酸。
22.根据权利要求20或21的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并表达编码MCB多肽的核酸来实现。
23.根据权利要求20至22任一项所述的方法，其中所述编码MCB多肽的核酸编码表
A2中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与这种核酸杂交的核酸。
24.根据权利要求20至23任一项所述的方法，其中所述核酸序列编码表A2中给出的任一种蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
25.根据权利要求20至24任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量、优选增加的生物量和/或增加的种子产量。
26.根据权利要求20至25任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
27.根据权利要求20至25任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮的条件下获得。
28.根据权利要求22至27任一项所述的方法，其中所述核酸有效连接于组成型启动子，优选地有效连接于GOS2启动子，最优选地有效连接于来自稻的GOS2启动子。
29.根据权利要求20至28任一项所述的方法，其中所述编码MCB多肽的核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，进一步优选地来自十字花科(Brassicaceae)，更优选地来自拟南芥属(Arabidopsis)，最优选地来自拟南芥(AArabidopsis thaliana)。
30.通过根据权利要求20至29任一项的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码MCB多肽的重组核酸。
31.构建体，其包含：
(i)编码如权利要求20或21中定义的MCB多肽的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
32.根据权利要求31所述的构建体，其中所述调控序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。
33.根据权利要求31或32的构建体在用于产生植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的产量，尤其增加的生物量和/或增加的种子产量。
34.用根据权利要求31或32的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
35.用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，所述方法包括：
(i)在植物中导入并表达编码如权利要求20或21中定义的MCB多肽的核酸；并且
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
36.转基因植物或来自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物因编码如权利要求20或21中所定义MCB多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量。
37.根据权利要求30、34或36的转基因植物或来自其的转基因植物细胞，其中所述的植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属植物(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
38.根据权利要求37的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是苗生物量和/或种子。
39.产物，其来自根据权利要求37的植物和/或根据权利要求38的植物的可收获部
分。
40.编码MCB多肽的核酸在相对于对照植物增加植物中产量、尤其增加种子产量和/或苗生物量中的用途。
41.相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码SRT2多肽的核酸的表达。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述SRT2多肽包含以递增优选顺序与表C1中给出的任意一个或多个氨基酸结构域具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、
57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、
72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性的蛋白质结构域。
43.根据权利要求41或42的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并表达编码SRT2多肽的核酸实现。
44.根据权利要求41至43任一项的方法，其中所述编码SRT2多肽的核酸编码表A3中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与这种核酸杂交的核酸。
45.根据权利要求41至44任一项所述的方法，其中所述的核酸序列编码表A3中给出的任一种蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
46.根据权利要求41至45任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量、优选增加的生物量和/或增加的种子产量。
47.根据权利要求41至46任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
48.根据权利要求41至46任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮的条件下获得。
49.根据权利要求43至48任一项所述的方法，其中所述核酸有效连接于组成型启动子，优选地有效连接于GOS2启动子，最优选地有效连接于来自稻的GOS2启动子。
50.根据权利要求41至49任一项的方法，其中所述编码SRT2多肽的核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，进一步优选地来自十字花科，更优选地来自拟南芥属，最优选地来自拟南芥。
51.通过根据权利要求41至50任一项的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码SRT2多肽的重组核酸。
52.构建体，其包含：
(i)编码如权利要求41或42中定义的SRT2多肽的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
53.根据权利要求52所述的构建体，其中所述调控序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。
54.根据权利要求52或32的构建体在用于产生植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的产量，尤其增加的生物量和/或增加的种子产量。
55.用根据权利要求52或53的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
56.产生转基因植物的方法，所述的转基因植物相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，所述方法包括：
(i)在植物中导入并表达编码如权利要求41或42中定义的SRT2多肽的核酸；并且
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
57.转基因植物或来自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物因编码如权利要求41或42中所定义SRT2多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量。
58.根据权利要求51、55或57的转基因植物或来自其的转基因植物细胞，其中所述的植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属植物(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
59.根据权利要求58的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是苗生物量和/或种子。
60.产物，其来自根据权利要求58的植物和/或根据权利要求59的植物的可收获部
分。
61.编码SRT2多肽的核酸在相对于对照植物增加植物中产量、尤其增加种子产量和/或苗生物量中的用途。
62.增强植物中非生物胁迫耐受性的方法，其通过调节植物中编码YRP2多肽或者其直向同源物或旁系同源物的核酸的表达实现。
63.根据权利要求62的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并表达编码YRP2多肽的核酸实现。
64.根据权利要求62或63所述的方法，其中所述编码YRP2多肽的核酸编码表A4中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与这种核酸杂交的核酸。
65.根据权利要求62至64任一项所述的方法，其中所述核酸序列编码表A4中给出的任一种蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
66.根据权利要求64或65所述的方法，其中所述的核酸有效连接于组成型启动子，优选地有效连接于GOS2启动子，最优选地有效连接于来自稻的GOS2启动子。
67.根据权利要求62至66任一项的方法，其中所述编码YRP2多肽的核酸是番茄的。
68.通过根据权利要求62至67任一项的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码YRP2多肽的重组核酸。
69.构建体，其包含：
(i)编码如权利要求62或63中定义的YRP2多肽的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
70.根据权利要求69所述的构建体，其中所述的调控序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。
71.根据权利要求69或70的构建体在用于产生植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的非生物胁迫耐受性。
72.用根据权利要求69或70的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
73.用于产生相对于对照植物具有增加的非生物胁迫耐受性的转基因植物的方法，包括：
(i)在植物中导入并表达编码YRP2多肽的核酸；并且
(ii)在促进非生物胁迫的条件下培育植物细胞。
74.转基因植物或来自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物因编码YRP2多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有非生物胁迫耐受性。
75.根据权利要求68、72或74的转基因植物或从来自其的转基因植物细胞，其中所述的植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、甘蔗、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属植物(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
76.根据权利要求75的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是苗生物量和/或种子。
77.产物，其来自根据权利要求75的植物和/或根据权利要求76的植物的可收获部
分。
78.编码YRP2样多肽的核酸在相对于对照植物增加产量、尤其在增加非生物胁迫耐受性中的用途。
79.增强植物中非生物胁迫耐受性的方法，其通过调节植物中编码YRP3多肽或者其直向同源物或旁系同源物的核酸的表达实现。
80.根据权利要求79的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并表达编码YRP3多肽的核酸实现。
81.根据权利要求79或80所述的方法，其中所述编码YRP3多肽的核酸编码表A5中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与这种核酸杂交的核酸。
82.根据权利要求79至82任一项所述的方法，其中所述核酸序列编码表A5中给出的任一种蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
83.根据权利要求81或82所述的方法，其中所述的核酸有效连接于组成型启动子，优选地有效连接于GOS2启动子，最优选地有效连接于来自稻的GOS2启动子。
84.根据权利要求79至83任一项的方法，其中所述编码YRP3多肽的核酸是展叶剑叶藓的。
85.由根据权利要求79至84任一项的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码YRP3多肽的重组核酸。
86.构建体，其包含：
(i)编码如权利要求79或80中定义的YRP3多肽的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
87.根据权利要求86所述的构建体，其中所述的调控序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。
88.根据权利要求86或87的构建体在用于产生植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的非生物胁迫耐受性。
89.用根据权利要求86或87的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
90.用于产生相对于对照植物具有增加的非生物胁迫耐受性的转基因植物的方法，包括：
A.在植物中导入并表达编码YRP3多肽的核酸；并且
B.在促进非生物胁迫的条件下培育植物细胞。
91.转基因植物或来自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物因编码YRP3多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有非生物胁迫耐受性。
92.根据权利要求85、89或91的转基因植物或来自其的转基因植物细胞，其中所述的植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、甘蔗、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属植物(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
93.根据权利要求92的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是苗生物量和/或种子。
94.产物，其来自根据权利要求92的植物和/或根据权利要求93的植物的可收获部
分。
95.编码YRP3多肽的核酸在相对于对照植物增加产量、尤其在增加非生物胁迫耐受性中的用途。
96.增强植物非生物胁迫耐受性的方法，其通过调节植物中编码YRP4多肽或者其直向同源物或旁系同源物的核酸的表达实现。
97.根据权利要求96的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并表达编码YRP4多肽的核酸实现。
98.根据权利要求96或97所述的方法，其中所述编码YRP4多肽的核酸编码表A6中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与这种核酸杂交的核酸。
99.根据权利要求96至98任一项所述的方法，其中所述的核酸序列编码表A6中给出的任一种蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
100.根据权利要求98或99所述的方法，其中所述的核酸有效连接于组成型启动子，优选地有效连接于GOS2启动子，最优选地有效连接于来自稻的GOS2启动子。
101.根据权利要求96至100任一项的方法，其中所述编码YRP4多肽的核酸是普通小麦的。
102.通过根据权利要求96至101任一项的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述植物或其部分包含编码YRP4多肽的重组核酸。
103.构建体，其包含：
(i)编码如权利要求1或2中定义的YRP4多肽的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
104.根据权利要求103所述的构建体，其中所述的调控序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。
105.根据权利要求102或103的构建体在用于产生植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的非生物胁迫耐受性。
106.用根据权利要求102或103的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
107.用于产生相对于对照植物具有增加的非生物胁迫耐受性的转基因植物的方法，包括：
(i)在植物中导入并表达编码YRP4多肽的核酸；并且
(ii)在促进非生物胁迫的条件下培育植物细胞。
108.转基因植物或来自所述转基因植物的转基因植物细胞，所述转基因植物因编码YRP4多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有非生物胁迫耐受性。
109.根据权利要求102、106或108的转基因植物或来自其的转基因植物细胞，其中所述的植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、甘蔗、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属植物(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
110.根据权利要求109的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是苗生物量和/或种子。
111.产物，其来自根据权利要求109的植物和/或根据权利要求110的植物的可收获部分。
112.编码YRP4多肽的核酸在相对于对照植物增加产量、尤其在增加非生物胁迫耐受性中的用途。
113.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码
SPX-RING多肽的核酸的表达。
114.根据权利要求113所述的方法，其中所述的SPX-RING多肽包含以递增优选顺序与任意一个或多个以下基序具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、
59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性的基序：
(i)基序1-1至基序1-35(SEQ ID NO：340至374)；和
(ii)基序2-1至基序2-35(SEQ ID NO：375至409)；和
(iii)基序3-1至基序3-35(SEQ ID NO：410至444)。
115.根据权利要求113或114的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并表达编码SPX-RING多肽的核酸实现。
116.根据权利要求113至116任一项所述的方法，其中所述编码SPX-RING多肽的核
酸编码表A7中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与这种核酸杂交的核酸。
117.根据权利要求113至116任一项所述的方法，其中所述的核酸序列编码表A7中给出的任一种蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
118.根据权利要求113至117任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量、优选增加的生物量和/或增加的种子产量。
119.根据权利要求113至118任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
120.根据权利要求113至118任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮的条件下获得。
121.根据权利要求115至120任一项所述的方法，其中所述的核酸有效连接于组成型启动子，优选地有效连接于GOS2启动子，最优选地有效连接于来自稻的GOS2启动子。
122.根据权利要求113至121任一项所述的方法，其中所述编码SPX-RING多肽的核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，进一步优选地来自十字花科，更优选地来自拟南芥属，最优选地来自拟南芥。
123.通过根据权利要求113至122任一项的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码SPX-RING多肽的重组核酸。
124.构建体，其包含：
(i)编码如权利要求113或114中定义的SPX-RING多肽的核酸；
(ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
(ii)转录终止序列。
125.根据权利要求124所述的构建体，其中所述的调控序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。
126.根据权利要求124或125的构建体在用于产生植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的产量，尤其增加的生物量和/或增加的种子产量。
127.用根据权利要求124或125的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
128.用于产生转基因植物的方法，所述的转基因植物相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，所述方法包括：
(i)在植物中导入并表达编码如权利要求113或114中定义的SPX-RING多肽的核酸；
并且
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
129.转基因植物，其因编码如权利要求113或114中所定义的SPX-RING多肽的核酸
的受调节表达而相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，或从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞。
130.根据权利要求123、127或129的转基因植物或来自其的转基因植物细胞，其中所述的植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属植物(secale)、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
131.根据权利要求130的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是苗生物量和/或种子。
132.产物，其来自根据权利要求130的植物和/或根据权利要求131的植物的可收获部分。
133.编码SPX-RING多肽的核酸在相对于对照植物增加植物中产量、尤其在增加种子产量和/或苗生物量中的用途。
具有增强的产量相关性状和/或非生物胁迫耐受性的植物
和用于制备此类植物的方法
[0001] 本发明总体上涉及分子生物学领域并且涉及用于通过调节植物中编码Sp1激活必需辅因子(CRSP)多肽、更具体地编码CRSP33样多肽的核酸表达在植物中增强多种产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码CRSP33样多肽的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明也提供在本发明方法中有用的构建体。
[0002] 本发明总体上涉及分子生物学领域并且涉及用于通过调节植物中编码MCB(Myb相关的CAB启动子结合蛋白)的核酸表达而增强多种植物产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码MCB的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明也提供在本发明方法中有用的构建体。
[0003] 本发明总体上涉及分子生物学领域并且涉及用于通过调节植物中编码SRT2(Sirtuin2或沉默信息调节物2)的核酸表达而改善多种植物生长特征的方法。本发明还涉及具有编码SRT2的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物具有改善的生长特征。本发明也提供在本发明方法中有用的构建体。
[0004] 本发明总体上涉及分子生物学领域并且涉及用于通过调节植物中编码YRP2的核酸表达在植物中增强非生物胁迫耐受性的方法。本发明还涉及具有编码YRP2的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物具有增强的非生物胁迫耐受性。本发明也提供在本发明方法中有用的构建体。
[0005] 本发明总体上涉及分子生物学领域并且涉及用于通过调节植物中编码YRP3的核酸表达在植物中增强非生物胁迫耐受性的方法。本发明还涉及具有编码YRP3的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物具有增强的非生物胁迫耐受性。本发明也提供在本发明方法中有用的构建体。
[0006] 本发明总体上涉及分子生物学领域并且涉及用于通过调节植物中编码YRP4的核酸表达在植物中增强非生物胁迫耐受性的方法。本发明还涉及具有编码YRP4的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物具有增强的非生物胁迫耐受性。本发明也提供在本发明方法中有用的构建体。
[0007] 本发明总体上涉及分子生物学领域并且涉及用于通过调节植物中编码SPX-RING(SYG1、Pho81、XPR1锌指，RING型)的核酸表达而增强多种植物产量相关性状的方法。本发明还涉及具有编码SPX-RING的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物具有增强的产量相关性状。本发明也提供在本发明方法中有用的构建体。
[0008] 持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生经常含有异源性遗传组分的植物，所述异源性遗传组分可能不总是导致所希望性状从亲代植物中传递。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后将该遗传物质导入植物中。此类技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。
[0009] 具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物结构(例如枝条的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期萌发势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对增加作物产量有贡献。
[0010] 种子产量是尤其重要的性状，因为许多植物的种子对于人类和动物的营养非常重要。作物如谷物、稻、小麦、卡诺拉油菜(canola)和大豆占人类总卡路里摄取量的一半以上，不论是通过种子本身的直接消费，还是通过由加工的种子所饲养的肉类产品的消费。它们也是工业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的芽和根的来源)和胚乳(萌发以及幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，吸收糖类、油类和蛋白质的代谢前体，将其合成为贮存高分子，以使谷粒饱满。
[0011] 植物生物量是饲料作物(像苜蓿、青贮谷物和干草)的产量。已经在谷类作物中使用了产量的许多取代物。其中主要是植物大小的评估。可根据物种和发育阶段在许多方面测量植物大小，但包括总植物干重、地上干重、地上鲜重、叶片面积、茎体积、植物高度、莲座直径、叶长、根长、根质量、分蘖数目和叶数目。许多物种在给定发育阶段的植物不同部分大小之间维持保守比例。这些异速生长关系用于从这些大小测量之一外推到另一大小测量(例如Tittonell等2005Agric Ecosys&Environ 105：213)。早期发育阶段的植物大小通常与发育晚期的植物大小相关。具有较大叶片面积的较大植物通常比较小的植物吸收更多的光和二氧化碳并因此将可能在相同的期间内获得更大重量(Fasoula&Tollenaar2005Maydica 50：39)。此外，植物最初必须实现更大尺寸的微环境或遗传优势需要潜在的持续。植物大小和生长速率具有强的遗传组分(例如ter Steege等2005PlantPhysiology
139：1078)，并因此对于不同基因型范围，一种环境条件下植物大小有可能与在另一种环境条件下的大小相关(Hittalmani等2003Theoretical Applied Genetics 107：679)。这样，标准环境用于代替田地中作物在不同位置和时间遇到的不同的和动态的环境。
139：1078)，并因此对于不同基因型范围，一种环境条件下植物大小有可能与在另一种环境条件下的大小相关(Hittalmani等2003Theoretical Applied Genetics 107：679)。这样，标准环境用于代替田地中作物在不同位置和时间遇到的不同的和动态的环境。
[0012] 许多作物的一个重要性状是早期萌发势。提高早期萌发势是温带和热带稻栽培种中现代稻育种程序的重要目标。长根对于水中播种的稻的正确土壤锚定是重要的。当稻直接播种到被淹没的田间并且当植物必须快速出水时，较长的根与萌发势有关。当实施播种机播种时，较长的中胚轴和胚芽鞘对于好的幼苗萌出是重要的。将早期萌发势改造到植物中在农业中是重要的。例如，弱的早期萌发势局限于对于基于欧洲大西洋部玉米带种质的玉米杂种的引入产生限制。
[0013] 收获指数(种子产量与地上部分干重的比值)在许多环境条件下相对稳定并因此可经常获得植物大小与谷物产量间的稳健相关性(例如Rebetzke等2002Crop Science42：739)。因为大多数谷物生物量依赖于通过植物叶和茎的当前的或储藏的光合生产力，这些过程是内在关联的(Gardener等1985Physiology of Crop Plants.Iowa State University Press，68-73页)。因此，甚至在发育早期阶段选择植物大小已用作未来潜在产量的指标(例如Tittonell等2005Agric Ecosys&Environ 105：213)。当检测遗传差异对胁迫耐受性的影响时，标准化土壤性质、温度、水和养分可用性和光强度的能力是温室或植物生长室环境相比于田地的内在优势。然而，因缺少风或昆虫导致传粉差，或成熟根或株冠生长的空间不足对产量的人为限制可限制这些控制环境用于检测产量差异的使用。因此，在生长室或温室中标准化条件下测量早期发育阶段的植物大小是提供潜在遗传产量优势的指示的标准实践。
[0014] 另一重要的性状是提高的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界作物减产的主要原因，对于多数作物植物，将平均产量减少50％以上(Wang etal.，Planta(2003)218：1-14)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。提高植物对非生物胁迫的耐受性的能力对于世界上的农场主将具有主要的经济利益并且将允许在不利条件下和否则不可能栽培作物的领域中栽培作物。
[0015] 现在已经发现可以通过调节植物中编码YRP2多肽或YRP3多肽或YRP3多肽的核酸的表达在植物中增强针对多种非生物胁迫的耐受性。
[0016] 因此，通过优化上述因素之一可以提高作物产量。
[0017] 取决于最终用途，某些产量性状的修饰可以相对于其他性状是有利的。例如，对于诸如粮草或木材生产或生物燃料来源的应用，植物的营养部分的增加可以是想要的，对于诸如面粉、淀粉或油生产的应用，种子参数的增加可以是尤其想要的。甚至在种子参数中，一些可以比其他有利，这取决于应用。多种机理可以促进提高种子产量，无论其为增加的种子大小或增加的种子数目的形式。
[0019] 现在已经发现可以通过调节植物中编码CRSP33样多肽的核酸的表达在植物中改善多种产量相关性状。
[0020] 现在已经发现可以通过调节植物中编码MCB(Myb相关的CAB启动子结合蛋白)的核酸的表达在植物中改善多种产量相关性状。
[0021] 现在已经发现可以通过调节植物中编码SRT2(Sirtuin 2或沉默信息调节物2)的核酸的表达在植物中改善多种生长特征。
[0022] 现在已经发现可以通过调节植物中编码SPX-RING(SYG1，Pho81，XPR1-锌指，RING型)的核酸的表达在植物中改善多种产量相关性状。
[0023] 背景
[0024] 1.SP1激活必需辅因子(CRSP)多肽
[0025] 后生动物中基因转录的激活是一个由识别DNA中转录增强子位点的因子触发的多步骤过程。这些因子与辅激活物一起作用以指导通过RNA聚合酶II装置的转录启动。一类辅激活物，转录因子TFIID的TAF(II)亚基，可以充当激活物的靶标并且充当识别转录启动必需的核心启动子序列的蛋白质。由增强子结合因子如Sp1所致的转录激活据报道需要TFIID。Ryu等人(Nature.1999年2月4日；397(6718)：446-50)报道转录辅因子复合体CRSP是增强子结合蛋白Sp1活性必需的。他们将人因子CRSP描述为连同TAF(II)一起是由Sp1所致转录激活必需的。进一步报道对CRSP的纯化鉴定到近似相对分子质量
700,000(M(r)(大致700K)的复合体，其含有9个具有范围从33K至200K的M(r)值的亚基。克隆编码CRSP亚基的基因揭示CRSP33是酵母介体亚基Med7的同源物。
700,000(M(r)(大致700K)的复合体，其含有9个具有范围从33K至200K的M(r)值的亚基。克隆编码CRSP亚基的基因揭示CRSP33是酵母介体亚基Med7的同源物。
[0026] 2.Myb相关的CAB启动子结合(MCB)多肽
[0027] MYB蛋白是在植物中发育过程和防御应答方面发挥调节作用的转录因子超家族。在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中已经报道至少198种基因(YAnhui等人Plant Molecular Biology(2006)60：107-124)。拟南芥MYB转录因子已经划分成4个组：1)R2R3-MYB基因(126种转录因子)、2)R1R2R3-MYB基因(5个成员)、3)MYB相关基因(64个成员)和4)非典型MYB基因(3个成员)。所述组的同源基因存在于其他植物物种中。
[0028] 已经报道在第3组内部的MYB相关特异性亚组参与编码光系统II的集光叶绿素a/b结合蛋白的CAB(LHCP)基因家族的植物基因表达的调节(Churin等人Plant Molecular Biology 52：447-462，2003)。
[0029] 3.Sirtuin 2或沉默信息调节物2(SRT2)多肽
[0030] 组蛋白乙酰转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)分别是执行组蛋白乙酰化和脱乙酰化所需要的酶，所述酶作用于核心组蛋白氨基端附近存在的赖氨酸残基的e-氨基。由HDAC介导的乙酰化过低对染色质产生相反作用，从而使组蛋白与带负电荷的DNA更牢固地结合。因而，乙酰化过低与抑制基因表达有关。HDAC可以分成3个类型(Hollender和Liu 2008，J Integr Plant Biol.2008；50(7)：875-85)。III型(sirtuin)HDAC以基于它们与酵母沉默信息调节物2(Sir2)蛋白的序列同源性为基础。
[0031] 沉默信息调节物2(Sir2)蛋白或sirtuins是依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的蛋白脱乙酰酶。它们存在于众多亚细胞位置，包括细胞核、细胞质和线粒体。真核形式在调节转录抑制作用方面发挥重要作用。另外，它们参与微管组织与DNA损伤修复过程。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的Sir2p是对沉默至少三个基因座关键的几种因子之一。在这几种因子当中，它是独特的，因为它使rDNA以及接合型基因座和端粒沉默。Sir2p在复合体中与自身并且与Sir3p和Sir4p相互作用，Sir3p和Sir4p是两种能够与核小体相互作用的蛋白质。此外，Sir2p也与遍在蛋白化因子和/或复合体相互作用。Sir2p是酵母中一个多基因家族的部分，同源物是HST1、HST2、HST3和HST4。高度保守的结构同源物也存在于从细菌至人和植物的其他生物中。已经提出这个蛋白质家族在沉默作用、染色体稳定性和衰老过程中发挥作用。Sir2的同源物共享一个包括GAG和NID基序和推定的C4锌指的核心结构域。含有这三个保守基序的区域分别对于Sir2沉默功能是必需的，4个半胱氨酸也是如此。此外，已经显示与推定的Zn指相邻的保守残基HG是对ADP核糖基转移酶活性必需的。Sir样酶催化这样的反应，其中NAD(+)和组蛋白的剪切和/或蛋白质脱乙酰化作用与新代谢物O-乙酰-ADP-核糖的形成偶联。该反应对NAD(+)和生成这种潜在第二信使的依赖性为理解胞核、细胞质和线粒体Sir2样酶的功能和调节作用提供了新线索。
[0032] Sirtuin代表了一组独特的NAD-依赖性HDAC，与Rpd3和HD-tuin型不同，它们不受制滴菌素A(TSA)或丁酸钠抑制。全部生物中的sirtuin基于其高度保守的Sir2结构域内部的序列基序分成5个组。拟南芥具有两种分别属于IV组和II组的sirtuin蛋白：SRT1和SRT2(Hollender和Liu2008)。
[0033] 4.SPX-RING(SYG1，Pho81，XPR1-锌指，RING型)多肽
[0034] 蛋白质结构域SPX在SYG1/Pho81/XPR1蛋白后命名。这种180个残基长度的结构域存在于多种蛋白质的氨基末端。在酵母蛋白SYG1中，氨基端与G-蛋白β亚基直接结合并抑制交配信息素信号的转导，这表明该家族的全部成员参与G-蛋白相关的信号转导(Spain等人J Biol Chem 1995；270：25435-25444)。
[0035] 参与磷酸盐转运调节的几种蛋白质(包括来自酿酒酵的推定性磷酸酸盐水平感受器PH081和来自粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的NUC-2)的氨基端也是该家族的成员(Lee等人Mol Microbiol 2000；38：411-422)。
[0036] 该家族的几个成员是XPR1蛋白：嗜异性和多嗜性逆转录病毒受体赋予对小鼠白血病病毒(MLV)感染的易感性。由于对几种功能未知的来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、拟南芥、秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)和酿酒酵母的预测蛋白质具有额外相似性，先前已经指出SYG1、磷酸盐调节蛋白和XPR1序列之间的相似性。此外，考虑到XPR1与SYG1和磷酸盐调节蛋白序列之间存在相似性，已经提出XPR1可能参与G-蛋白相关的信号转导并且本身可以作为磷酸盐感受器发挥作用(Battini等人Proc Natl Acad Sci U S A1999；96：1385-1390)。
[0037] C3HC4型锌指(Zf-C3HC4RING型指)是40至60个残基的与两个锌离子配位的富含半胱氨酸的结构域，并且具有共有序列：C-X2-C-X(9-39)-C-X(1-3)-H-X(2-3)-C-X2-C-X(4-48)-C-X2-C其中X是任意氨基酸(Lorick等人Proc Natl Acad Sci U S A 1999；96：11364-11369)。许多含有RING指的蛋白质在遍在蛋白化途径中发挥重要作用(Borden KL，Freemont PS，Curr Opin Struct Biol 1996；6：395-401)。RING指是参与介导蛋白质-蛋白质相互作用的特化类型的Zn指。存在两种不同的变体，C3HC4型和C3H2C3型，它们是明显相关的，尽管半胱氨酸/组氨酸图式不同。后一类型有时候称作′RING-H2指′。RING结构域是参与多样化生物学过程中的蛋白质相互作用结构域。E3遍在蛋白-蛋白质连接酶活性是c-Cbl的RING结构域固有的并且可能是该结构域的一般功能。E3遍在蛋白-蛋白质连接酶决定遍在蛋白化的底物专一性并且已经被分成HECT和RING指家族。然而，最近已经将含有从酵母至人均保守的约70个氨基酸的结构域(U盒)的U-盒蛋白鉴定为一种新型的E3(Hatakeyama S，Nakayama Kl.J Biochem.2003年7月；134(1)：1-8)。多种RING指也显示与E2遍在蛋白-缀合酶(Ubc′s)的结合。
[0038] RING指的几个3D-结构是已知的(Borden KL，Freemont PS 1996)。锌连接系统的3D结构是RING结构域独有的并且称作′交叉支撑(cross-brace)′基序。金属配体对1和3配位以结合一个锌离子，而金属配体对2和4结合第二个锌离子。
[0039] 包含SPX和Zf-C3HC4RING型指的蛋白质也存在于植物界中。编码包含两种结构域的的蛋白质的拟南芥基因BAH1/NLA基因已经据报道参与拟南芥对氮限制的适应性应答(Peng等人Plant Mol Biol.2007年12月；65(6)：775-97)。
[0040] 概述
[0041] 1.SP1激活必需辅因子(CRSP)多肽
[0042] 出人意料地，现在已经发现调节编码CRSP33样多肽的核酸的表达产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状、尤其增加的种子产量的植物。
[0043] 根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码CRSP33样多肽的核酸的表达。
[0044] 2.Myb相关的CAB启动子结合(MCB)多肽
[0045] 出人意料地，现在已经发现：调节编码MCB多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。
[0046] 根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方法，包括调节植物中编码MCB多肽的核酸的表达。
[0047] 3.Sirtuin 2或沉默信息调节物2(SRT2)多肽
[0048] 出人意料地，现在已经发现调节编码SRT2多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。
[0049] 根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方法，包括调节植物中编码SRT2多肽的核酸的表达。
[0050] 4.YRP2多肽
[0051] 出人意料地，现在已经发现调节编码YRP2多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有对多种非生物胁迫增强的耐受性的植物。
[0052] 根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物中的耐受性在植物中增强针对多种非生物胁迫的耐受性的方法，包括调节植物中编码YRP2多肽的核酸的表达。
[0053] 5.YRP3多肽
[0054] 出人意料地，现在已经发现调节编码YRP3多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有对多种非生物胁迫增强的耐受性的植物。
[0055] 根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物中的耐受性在植物中增强针对多种非生物胁迫的耐受性的方法，包括调节植物中编码YRP3多肽的核酸的表达。
[0056] 6.YRP4多肽
[0057] 出人意料地，现在已经发现调节编码YRP4多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有对多种非生物胁迫增强的耐受性的植物。
[0058] 根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物中的耐受性在植物中增强针对多种非生物胁迫的耐受性的方法，包括调节植物中编码YRP4多肽的核酸的表达。
[0059] 7.SPX-RING(SYG1，Pho81，XPR1-锌指，RING型)多肽
[0060] 出人意料地，现在已经发现调节编码SPX-RING多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。
[0061] 根据一个实施方案，提供了相对于对照植物增强植物的产量相关性状的方法，包括调节植物中编码SPX-RING多肽的核酸的表达。
[0062] 定义
[0063] 多肽/蛋白质
[0064] 术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且指处于任意长度聚合形式的通过肽键连接在一起的氨基酸。
[0065] 多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
[0066] 术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互换使用并且指处于任意长度聚合未分枝形式中的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者的组合。
[0067] 对照植物
[0068] 选择合适的对照植物是实验设置的惯用部分并且可以包括对应的野生型植物或无目的基因的对应植物。对照植物一般是与待评估植物相同的植物物种或甚至是相同的变种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子是通过分离而缺少所述转基因的个体。如本文中所用的“对照植物”不仅指整株植物，还指植物部分，包括种子及种子部分。
[0069] 同源物
[0070] 蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的上述蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且与所述肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶来源的非修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性。
[0071] 缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
[0072] 插入指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入。插入可以包含单个或多个氨基酸的N端融合和/或C端融合以及序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插入会比N端融合或C端融合小约1-10个残基级别。N端或C端融合蛋白或融合肽的实例包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、 -表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、C蛋白表位和VSV表位。
[0073] 取代指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-片层结构的倾向)的其他氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸取代一般是单个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束；插入通常会是约1-10个氨基酸残基级别。氨基酸取代优选地是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本领域众所周知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.Freeman and Company(编辑)和下表1)。
[0074] 表1：保守性氨基酸取代的实例
[0075]残基 保守性取代 残基 保守性取代
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu，Val
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu，Val
[0076]
[0077] 氨基酸取代、缺失和/或插入可以使用本领域众所周知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作而轻易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的取代、插入或缺失变体的方法是本领域众所周知的。例如，用于在DNA中的预定位点处产生取代突变的技术是本领域技术人员众所周知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Clevelaand，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，San Diego，CA)、PCR-介导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法。
[0078] 衍生物
[0079] “衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然发生形式的蛋白质(如目的蛋白质)的氨基酸序列相比，它们包含以非天然发生的氨基酸残基对氨基酸的取代或非天然发生的氨基酸残基的添加。蛋白质“衍生物”也包含这样的肽、寡肽、多肽，其中与多肽的天然发生形式的氨基酸序列相比，它们包含天然发生的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸盐化等)氨基酸残基或非天然的改变氨基酸残基。与衍生物所来源的氨基酸序列相比，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加(例如报道分子或其他配体)，如为促进检测该衍生物而结合的报道分子，和与天然发生的蛋白质的氨基酸序列相对比的非天然发生的氨基酸残基。此外，“衍生物”也包括天然存在形式的蛋白质与标记肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白的融合物(标记肽的综述，见Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)。
[0080] 直向同源物/旁系同源物
[0081] 直向同源物和旁系同源物包含用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内起源于先祖基因复制的基因，而直向同源物是来自不同生物的起源于物种形成的基因，并且也来自共同的祖先基因。
[0082] 结构域
[0083] 术语”结构域″指沿进化相关蛋白质的序列比对结果而在特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其他位置处的氨基酸可以在同源物之间变动，然而在特定位置处的高度保守的氨基酸指示在蛋白质的结构、稳定性或功能方面可能是必需的氨基酸。结构域因通过在蛋白质同源物家族的比对序列中的高保守程度而被鉴定，它们可以用作鉴定物以确定任意的所讨论多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。
[0084] 基序/共有序列/标签
[0085] 术语”基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关蛋白质的序列中的短保守区。基序往往是结构域的高度保守部分，不过也可以仅包括结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
[0086] 杂交
[0087] 如本文中所定义的术语”杂交″是其中基本上同源的互补核苷酸序列相互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补性核酸均处于溶液中。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定到基质如磁珠、琼脂糖(Sepharose)珠或任何其他树脂的情况下发生。杂交过程也可以在互补性核酸之一固定至固相支持体如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅酸玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)上的情况下进行。为使杂交发生，通常将核酸分子热变性或化学变性以使双链解链成为两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其他二级结构。
[0088] 术语”严格性”指在其中发生杂交的条件。杂交的严格性受条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成影响。通常，将低严格性条件选择为在确定的离子强度及pH时低于特定序列热解链温度(Tm)约30℃。中等严格性条件是此时温度低于Tm约20℃并且高严格性条件是此时温度低于Tm约10℃。高严格性杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。然而，核酸可以在序列上偏离并且因遗传密码子的简并性而依旧编码基本上相同的多肽。因而有时候可能需要中等严格性杂交条件以鉴定此类核酸分子。
[0089] Tm是在确定的离子强度及pH时的温度，在所述温度下50％的靶序列与完全匹配的探针杂交。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在较高温度下特异性地杂交。从低于Tm约16℃直至32℃获得最大杂交速率。一价阳离子在杂交溶液中的存在降低了两条核酸链间的静电排斥，因而促进杂交体形成；这种作用对于高达0.4M的钠浓度是明显的(对于更高浓度，这种效应可以忽略)。甲酰胺降低DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数甲酰胺降低0.6-0.7℃，并且添加50％甲酰胺允许在30-45℃进行杂交，虽然杂交速率会降低。碱基对错配降低了杂交速率及双链体的热稳定性。平均而言并且对于大的探针来说，每％碱基错配Tm下降约1℃。取决于杂交体的类型，Tm可以使用下列等式计算：
[0090] 1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
[0091] Tm＝81.5℃+16.6xlog10[Na+]a+0.41x％[G/Cb]-500x[Lc]-1-0.61x％甲酰胺[0092] 2)DNA-RNA或RNA-RNA杂交体：
[0093] Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cbb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
[0094] 3)寡DNA或寡RNAd杂交体：
[0095] 对于＜20个核苷酸：Tm＝2(ln)
[0096] 对于20-35个核苷酸：Tm＝22+1.46(ln)
[0097] a或对于其他一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内是精确的。
[0098] b仅对于％GC在30％-75％范围内是精确的。
[0099] c L＝双链体的长度(以碱基对计)。
[0100] d Oligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。
[0101] 可以以众多已知技术的任何一种控制非特异性结合，例如用含蛋白质的溶液封闭薄膜、添加异源性RNA、异源性DNA及SDS至杂交缓冲液并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，一系列杂交可以通过改变以下条件之一进行：(i)渐进地降低复性温度(例如从68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)。本领域技术人员了解杂交期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。
[0102] 除杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗涤的功能。为除去因非特异性杂交所致的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。此类洗涤的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度及温度：盐浓度越低并且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性上或低于杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交分析法或基因扩增检测方法的合适严格性条件如上所述。也可以选择更严格或更不严格的条件。技术人员了解洗涤期间可以加以改变和将维持或改变严格性条件的多种参数。
[0103] 例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的典型高严格性杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格性杂交条件的实例包括在50℃于
4×SSC中或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交体长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。
4×SSC中或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交体长度。1×SSC是0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包含5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。
[0104] 为了定义严格性水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)MolecularCloning：a laboratory manual，第三版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，CSH，New York或参考Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989和每年更新版本)。
[0105] 剪接变体
[0106] 如本文中所用的术语”剪接变体”包含其中已经切除、替换、移位或添加所选内含子和/或外显子或其中内含子已经缩短或加长的核酸序列的变体。此类变体将是其中基本上保留了蛋白质的生物学活性的一种变体；这可以通过选择性保留蛋白质的功能性片段而实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制造。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域众所周知的(见例如Foissac和Schiex(2005)，BMC Bioinformatics.；6：25)。
[0107] 等位变体
[0108] 等位基因或等位变体是给定基因的替代形式，位于相同染色体位置内。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)和小插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的尺寸通常小于100bp。SNP和INDEL形成在大部分生物的天然存在性多态性株系中序列变体的最大集合。
[0109] 基因改组/定向进化
[0110] 基因改组或定向进化的组成为：反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸或其部分的变体(Castle等，(2004)Science304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
[0111] 调节元件/控制序列/启动子
[0112] 术语“调节元件”、“控制序列”和“启动子”均在本文中可互换使用并且在广义上意指能够实现与之连接的序列表达的调节性核酸序列。术语”启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别及结合RNA聚合酶和其他蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸控制序列。前述术语包括从典型的真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA框，具有或没有CCAAT框序列)中衍生的转录调节序列和应答发育刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式改变基因表达的额外调节元件(如，上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语还包括典型的原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括-35框序列和/或-10框转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的合成的融合分子或衍生物。
[0113] “植物启动子”包含介导编码序列区段在植物细胞中表达的调节元件。因此，植物启动子不需要是植物来源的，而是可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用待于本发明方法中表达及在本文中描述的核酸序列所转化的植物。这也适用于其他“植物”调节性信号，如“植物”终止子。用于本发明方法中的核苷酸序列上游的启动子可以由一个或多个核苷酸取代、插入和/或缺失而受到修饰，但不干扰启动子、可读框(ORF)或3′调节区如终止子或远离ORF的其他3′调节区的功能性或活性。启动子的活性还有可能因该启动子的修饰，或由更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替换该启动子而增加。为在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效连接至或包含合适的启动子，其中所述的启动子在正确时间点上并以所需要的空间表达模式表达基因。
[0114] 为鉴定功能性等效启动子，候选启动子的启动子强度和/或表达模式可以通过将该启动子与报道基因有效连接并分析该报道基因在植物多种组织的表达水平和模式而进行分析。合适的公知报道基因包括例如β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶。启动子活性通过测量β-葡糖醛酸糖苷酶或β-半乳糖苷酶的酶活性进行分析。启动子强度和/或表达模式随后可以与参考启动子(如本发明方法中所用的一种启动子)的启动子强度和/或表达模式比较。备选地，启动子强度可以使用本领域已知方法如Northern印迹法及放射自显影图的密度计分析法、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996GenomeMethods6：986-994)，通过定量mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18S rRNA)的mRNA水平比较而分析。通常“弱启动子”意指驱动编码序列在低水平上表达的启动子。“低水平”意指在每个细胞约1/10,000转录物至约1/100,000转录物、至约1/500,0000转录物的水平上。相反，“强启动子”驱动编码序列在高水平、或在每个细胞约1/10转录物至约1/100转录物、至约1/1,000转录物上表达。一般地，“中等强度启动子”意指这样的启动子，其比强启动子在更低水平上驱动编码序列的表达，尤其在所有情况下低于35S CaMV启动子控制下获得的水平上驱动编码序列表达。
[0115] 有效连接
[0116] 如本文中所用的术语”有效连接”指启动子序列与目的基因之间功能性地连接，以至于启动子序列能够启动目的基因转录。
[0117] 组成型启动子
[0118] “组成型启动子”指在生长和发育的大部分、但不必全部阶段期间和在大部分环境条件下在至少一个细胞、组织或器官内有转录活性的启动子。下表2a给出组成型启动子的实例。
[0119] 表2a：组成型启动子的实例
[0120]
[0121]
[0122] 遍在启动子
[0123] 遍在启动子在生物基本上所有组织或细胞内有活性。
[0124] 发育调节性启动子
[0125] 发育调节性启动子在某个发育期期间或在经历发育变化的植物部分内有活性。
[0126] 诱导性启动子
[0127] 诱导性启动子在应答化学品(综述见Gatz 1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有受诱导或增加的转录启动，或可以是“胁迫诱导性的”，即当植物暴露于多种胁迫条件时受到激活，或是“病原体诱导性的”，即当植物暴露于多种病原体时受到激活。
[0128] 器官特异性/组织特异性启动子
[0129] 器官特异性或组织特异性启动子是能够优先在某些器官或组织如叶、根、种子组织等内启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是在植物根中优势地具有转录活性的启动子，在植物的任何其他部分内基本上无活性，尽管在植物的这些其他部分内允许任何泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异的”。
[0130] 根特异性启动子的实例在下面的表2b中列出：
[0131] 表2b：根特异性启动子的实例
[0132]
[0133]
[0134] 种子特异性启动子主要在种子组织中具有转录活性，但不一定仅仅在种子组织中具有转录活性(在渗漏表达的情况下)。种子特异性启动子可以在种子发育和/或种子萌发期间有活性。种子特异性启动子可以是胚乳/糊粉粒/胚特异性的。种子特异性启动子(胚乳/糊粉/胚特异性)的实例在下面的表2c-2f中显示。种子特异性启动子的其他实例在Qing Qu和Takaiwa(Plant Biotechnol.J.2，113-125，2004)中给出，将其公开并入本文作为参考，就好像完整给出一样。
[0135] 表2c：种子特异性启动子的实例
[0136]
[0137]
[0138]
[0139] 表2d：胚乳特异性启动子实例
[0140]
[0141] 表2e：胚乳特异性启动子实例：
[0142]基因来源 参考文献
稻OSH1 Sato et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8117-8122，1996
KNOX Postma-Haarsma et al，Plant Mol.Biol.39：257-71，1999
PRO0151 WO 2004/070039
PRO0175 WO 2004/070039
PRO005 WO 2004/070039
PRO0095 WO 2004/070039
稻OSH1 Sato et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：8117-8122，1996
KNOX Postma-Haarsma et al，Plant Mol.Biol.39：257-71，1999
PRO0151 WO 2004/070039
PRO0175 WO 2004/070039
PRO005 WO 2004/070039
PRO0095 WO 2004/070039
[0143]
[0144] 表2f：糊粉特异性启动子实例：
[0145]
[0146] 如本文定义的绿色组织特异性启动子是主要在绿色组织中具有转录活性的启动子，基本上排除植物的任何其他部分，而仍然允许在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。
[0147] 可以用于实施本发明方法的绿色组织特异性启动子的实例在下面的表2g中显示。
[0148] 表2g：绿色组织特异性启动子实例
[0149]基因 表达 参考文献
玉米正磷酸二激酶 叶特异性 Fukavama et al.，2001
玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 叶特异性 Kausch et al.，2001
稻磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 叶特异性 Liu et al.，2003
稻小亚基Rubisco 叶特异性 Nomura et al.，2000
稻β扩展蛋白EXBP9 根特异性 WO 2004/070039
木豆小亚基Rubisco 叶特异性 Panguluri et al.，2005
豌豆RBCS3A 叶特异性
玉米正磷酸二激酶 叶特异性 Fukavama et al.，2001
玉米磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 叶特异性 Kausch et al.，2001
稻磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 叶特异性 Liu et al.，2003
稻小亚基Rubisco 叶特异性 Nomura et al.，2000
稻β扩展蛋白EXBP9 根特异性 WO 2004/070039
木豆小亚基Rubisco 叶特异性 Panguluri et al.，2005
豌豆RBCS3A 叶特异性
[0150]
[0151] 组织特异性启动子的另一实例是分生组织特异性启动子，其主要在分生组织中具有转录活性，基本上排除植物的任何其他组织，而仍然允许在这些其他植物部分中的任何渗漏表达。可以用于实施本发明方法的绿色分生组织特异性启动子的实例在下面的表2h中显示。
[0152] 表2h：分生组织特异性启动子的实例
[0153]
[0154] 终止子
[0155] 术语“终止子”包括这样的控制序列，其是在转录单位端的DNA序列，发出对初级转录物进行3’加工并聚腺苷化以及终止转录的信号。终止子可以衍生自天然基因、来自多种其他植物基因或来自T-DNA。待添加的终止子可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自其他植物基因或较不优选地来自任何其他真核基因。
[0156] 调节
[0157] 术语”调节”就表达或基因表达而言意指这样的过程，其中表达水平与对照植物相比因所述基因的表达而改变，表达水平可以是增加的或减少的。原先未受调节的表达可以是结构RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何类型表达，随后是翻译。术语“调节活性”应当意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何变化，这导致植物增加的产量和/或增加的生长。
[0158] 表达
[0159] 术语“表达”或“基因表达”指一种或多种特定基因或者遗传构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其指基因或遗传构建体转录为结构RNA(rRNA，tRNA)或者mRNA，其随后翻译成蛋白质或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。
[0160] 增加的表达/过量表达
[0161] 如本文中所用的术语”增加的表达”或“过量表达”意指对于原有野生型表达水平是额外的任何形式表达。
[0162] 在本领域内详细记载了用于增加基因或基因产物表达的方法并且它们包括例如，由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。可以在非异源形式的多核苷酸的适宜位置(一般是上游)内导入作为启动子或增强子元件的分离核酸，以便上调编码目的多肽的核酸的表达。例如，内源性启动子可以通过突变、缺失和/或置换而在体内改变(见Kmiec，US5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的正确方向及距离导入植物细胞，以便控制基因表达。
[0163] 若需要多肽表达，通常希望在多核苷酸编码区的3’末端包括多聚腺苷化区。多聚腺苷化区可以来自天然基因、来自多种其它植物基因或来自T-DNA。待添加的3’末端序列可以来自例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地来自另一植物基因或更不优选来自任何其它真核基因。
[0164] 内含子序列也可以添加至5′非翻译区(UTR)或部分编码性序列的编码序列上，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量。已经证实可剪接内含子在植物表达构建体和动物表达构建体中转录单位内的包含在mRNA水平及蛋白质水平上增加基因表达至多达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cell biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Gens Dev 1：1183-1200)。基因表达的此类内含子增强作用一般在位于转录单位5′末端附近时最强烈。
使用玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子是本领域已知的。对于一般信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。
使用玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子是本领域已知的。对于一般信息，见：《玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。
[0165] 内源基因
[0166] 本文中提及的“内源”基因不仅仅指如在植物中以其天然形式(即没有任何人类干预)存在的所讨论基因，还指处于分离形式的随后(再)导入植物(转基因)的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以遭遇转基因表达大幅降低和/或内源基因表达的大幅降低。分离的基因可以分离自生物或者可以是人造的，例如，通过化学合成。
[0167] 降低的表达
[0168] 本文中提及的”降低的表达”或“降低或基本去除”表达意指内源基因表达和/或多肽水平和/或多肽活性相对于对照植物的降低。与对照植物相比，降低或基本去除以递增优选顺序是至少10％、20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、85％、90％，或95％、96％、97％、98％、99％或更多的降低。降低表达的方法是本领域公知的，并且技术人员会轻易地能够调整已知用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子而实现降低内源基因在整株植物或在其部分中的表达。
[0169] 为了降低或基本去除内源基因在植物中的表达，需要核酸序列的足够长度的基本上连续的核苷酸。为了开展基因沉默，这个长度可以是少至20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10个或更少的核苷酸，或者该长度可以多至整个基因(包括5’和/或3’UTR，部分或全体)。基本上连续的核苷酸片段可以来自编码目的蛋白的核酸(靶基因)或来自能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物的任何核酸。优选地，基本上连续的核苷酸片段能够与靶基因(有义链或反义链)形成氢键，更优选地，基本上连续的核苷酸片段以递增优选顺序与靶基因(有义链或反义链)具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％、100％的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所讨论用于降低或基本去除内源基因表达的多种方法所需的。
97％、98％、99％、100％的序列同一性。编码(功能性)多肽的核酸序列不是本文中所讨论用于降低或基本去除内源基因表达的多种方法所需的。
[0170] 用于降低或基本去除内源基因在植物中表达，或用于降低蛋白质水平和/或活性的多种方法的实例是本领域技术人员公知的。技术人员会轻易地能够调整已知用于沉默的方法，以至于例如通过利用合适启动子而实现降低内源基因在整株植物或在其部分中的表达。
[0171] 表达的这种降低或基本去除可以使用常规工具和技术完成。用于降低或基本去除内源基因表达的优选方法是在植物中导入并表达这样的遗传构建体，其中核酸(在此情况下是来自目的基因或任何核酸的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能够编码任何一种目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)克隆至所述的遗传构建体内作为由间隔区(非编码性DNA)隔开的(部分或完全的)反向重复序列。
[0172] 在这种优选的方法中，使用核酸或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸序列，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)的反向重复序列(优选能够形成发夹结构)，通过RNA介导的沉默作用而降低或基本上去除内源基因的表达。反向重复序列在包含调控序列的表达载体中克隆。非编码性DNA核酸序列(间隔序列，例如基质附着区片段(MAR)、内含子、多接头等)位于形成反向重复序列的两个反向核酸之间。在反向重复序列转录后，形成具有(部分或完全)自身互补结构的嵌合RNA。这种双链RNA结构称作发夹RNA(hpRNA)。hpRNA由植物加工成为siRNA，其被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)中。RISC进一步切开mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。对于其它一般细节，见例如Grierson等(1998)WO 98/53083；Waterhouse等(1999)WO 99/53050)。
[0173] 本发明方法的实施不依赖在植物中导入并表达其中克隆入核酸作为反向重复序列的遗传构建体，而是几种公知“基因沉默”方法的任何一种或多种可以用来实现相同的效果。
[0174] 一种用于降低内源基因表达的如此方法是RNA介导的基因表达沉默(下调)。沉默作用在这种情况下由基本上与内源性靶基因相似的双链RNA序列(dsRNA)在植物中触发。这种dsRNA被植物进一步加工成约20到约26个核苷酸，称作短干扰性RNA(siRNA)。siRNA被掺入RNA诱导性沉默复合物(RISC)内，其中所述的RISC进一步切割内源性靶基因的mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。优选地，双链RNA序列对应于靶基因。
[0175] RNA沉默方法的另一个实例包括以有义方向导入核酸序列或其部分(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)至植物内。“有义方向”指与其mRNA转录物同源的DNA序列。因而将向植物中导入该核酸序列的至少一个拷贝。这种额外的核酸序列会降低内源基因表达，产生已知为共抑制作用的现象。当核酸序列的几个额外拷贝导入植物时，基因表达的降低将更明显，因为高转录物水平与共抑制作用的触发之间存在正相关。
[0176] RNA沉默方法的另一个实例包括使用反义核酸序列。″反义″核酸序列包含与编码蛋白质的″有义″核酸序列互补，即与双链cDNA分子的编码链互补，或与mRNA转录物序列互补的核苷酸序列。反义核酸序列优选地与待沉默的内源基因互补。互补性可以位于基因的“编码区”和/或”非编码区”内。术语”编码区″指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区。术语”非编码区″指分布在编码区两侧的被转录但不翻译成氨基酸的5’和3’序列(也称作5′和3′非翻译区)。
[0177] 反义核酸序列可以根据Watson和Crick碱基配对规则设计。反义核酸序列可以与整个核酸序列互补(在此情况下是从目的基因或从任何核酸中衍生的一段基本上连续的核苷酸，其中所述的任何核酸能够编码目的蛋白的直向同源物、旁系同源物或同源物)，不过也可以是仅与核酸序列的一部分(包括mRNA 5’和3’UTR)反义的寡核苷酸。例如，反义寡核苷酸序列可以与围绕编码多肽的mRNA转录物的翻译起点周围的区域互补。合适的反义寡核苷酸序列的长度是本领域已知的并且可以从长度约50、45、40、35、30、25、20、15或10个核苷酸或更少的核苷酸开始。本发明的反义核酸序列可以利用本领域已知方法，使用化学合成和酶连接反应而构建。例如，反义核酸序列(例如反义寡核苷酸序列)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中所述修饰的核苷酸被设计旨在增加分子的生物学稳定性或增加反义核酸序列与有义核酸序列之间所形成双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以用来产生反义核酸序列的修饰核苷酸的实例是本领域众所周知的。已知的核苷酸修饰包括甲基化、环化和′加帽′及用类似物(如肌苷)取代一个或多个天然存在的核苷酸。其它的核苷酸修饰是本领域众所周知的。
[0178] 这种反义核酸序列可以使用其中核酸序列已经以反义方向加以亚克隆(即从插入的核酸中转录的RNA将与目的靶核酸呈反义方向)的表达载体以生物学方式产生。优选地，反义核酸序列在植物中的产生借助稳定整合的核酸构建体进行，其中所述的核酸构建体包含启动子、有效连接的反义寡核苷酸和终止子。
[0179] 用于本发明方法中沉默作用的核酸分子(无论向植物中导入或在原位(in situ)产生)与编码多肽的mRNA转录物和/或基因组DNA杂交或结合，以便例如通过抑制转录和/或翻译而抑制蛋白质表达。杂交可以通过形成稳定双链体的常规核苷酸互补性所致，或在结合于DNA双链体的反义核酸序列的情况下，因双螺旋大沟内特异性相互作用所致。反义核酸序列可以通过转化或在特定组织部位直接注射而导入植物。备选地，反义核酸序列可以为了靶向所选择的细胞而受到修饰并且随后系统性施用。例如，对于系统性施用，反义核酸序列可以被修饰以便它们特异结合表达在所选择的细胞表面上的受体或抗原，例如通过连接反义核酸序列至与细胞表面受体或抗原结合的肽或抗体。反义核酸序列也可以使用本文中所述的载体送递至细胞内。
[0180] 根据又一个方面，反义核酸序列是α-异头核酸序列。α异头核酸序列与互补性RNA形成特定双链杂交分子，其中与惯常b-单元相反，所述链相互平行(Gaultier等(1987)Nucl Ac Res 15：6625-6641)。反义核酸序列也可以包含2′-o-甲基核糖核苷酸(1noue等(1987)Nucl Ac Res 15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215，327-330)。
[0181] 内源基因表达的降低或基本去除也可以使用核酶而进行。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与其具有互补区域的单链核酸序列，如mRNA。因此，核酶(例如锤头核酶(在Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334，585-591中描述)可以用来催化性地切割编码多肽的mRNA转录物，因而大幅度降低待翻译成多肽的mRNA转录物的数目。可以设计对核酸序列具特异性的核酶(见例如：Cech等美国专利号4,987,071；和Cech等美国专利号5,116,742)。备选地，对应于核酸序列的mRNA转录物可以用来从RNA分子库中选出具有特异性核糖核酸酶活性的催化性RNA(Bartel和Szostak(1993)Science261，1411-1418)。核酶用于植物中基因沉默的用途是本领域已知的(例如Atkins等(1994)WO 94/00012；Lenne等(1995)WO 95/03404；Lutziger等(2000)WO00/00619；Prinsen等(1997)WO 97/13865和Scott等(1997)WO97/38116)。
[0182] 基因沉默也可以通过插入诱变(例如T-DNA插入或转座子插入)或通过如Angell和Baulcombe((1999)Plant J.20(3)：357-62)、(AmpliconVIGS WO 98/36083)或Baulcombe(WO 99/15682)及其它人描述的策略而实现。
[0183] 当在内源基因上存在突变和/或在随后导入植物的分离的基因/核酸上存在突变时，基因沉默也可以发生。降低或基本去除可以由无功能的多肽引起。例如，多肽可以与多种相互作用性蛋白质结合；一个或多个突变和/或截短因而可以提供仍能够结合相互作用性蛋白质(如受体蛋白质)但不能表现其正常功能的多肽(如起信号作用的配体)。
[0184] 另一种基因沉默的方法是靶定与基因调节区(例如启动子和/或增强子)互补的核酸序列以形成阻止基因在靶细胞中转录的三螺旋结构。见Helene，C.，Anticancer Drug Res.6，569-84，1991；Helene 等，Ann.N.Y.Acad.Sci.660，27-361992 和 Maher，L.J.Bioassays 14，807-15，1992。
[0185] 其它方法，如使用针对内源性多肽的抗体以抑制此多肽在植物中的功能，或干扰所述多肽参与的信号途径，对于技术人员将是众所周知的。尤其，可以构思的是人造分子可以用于抑制靶多肽的生物学功能，或用于干扰靶多肽参与其中的信号途径。
[0186] 备选地，可以建立筛选程序以鉴定在植物群体中基因的天然变体，其中所述的变体编码具有降低活性的多肽。此类天然变体也可以用于例如进行同源重组。
[0187] 人工和/或天然的微RNA(miRNA)可以用来敲除基因表达和/或mRNA翻译。内源性miRNA是通常19-24个核苷酸长度的单链小RNA。它们的主要功能是调节基因表达和/或mRNA翻译。大多数的植物微RNA(miRNA)与其靶序列具有完全的或接近完全的互补性。然而，存在具有多达5个错配的天然靶标。它们由切酶家族的双链特异性RNA酶从具有特征性折回结构的较长的非编码性RNA中加工而来。在加工时，它们通过与RNA诱导性沉默复合物(RISC)的主要成分Argonaute蛋白质结合而掺入该复合体。MiRNA充当RISC的特异性成分，因此它们与细胞质中的靶核酸(大多是mRNA)碱基配对。后续的调节事件包括靶mRNA切割和破坏和/或翻译抑制。miRNA过量表达的作用因此在靶基因降低的mRNA水平上得到反映。
[0188] 通常21个核苷酸长度的人工微RNA(amiRNAs)可以遗传改造以特异性地负调节单个或多个目的基因的基因表达。植物微RNA靶的选择的决定因素是本领域众所周知的。用于靶识别的经验参数已经确定并且可以用来辅助设计特定的amiRNA，Schwab等，Dev.Cell8，517-527，2005。用于设计并产生amiRNA及其前体的便利工具也是公众可获得的，Schwab等，Plant Cell 18，1121-1133，2006。
[0189] 为最佳性能，用于降低内源基因在植物中表达的基因沉默技术需要使用来自单子叶植物的核酸序列以转化单子叶植物，和使用来自双子叶植物的核酸序列以转化双子叶植物。优选地，将来自任何给定植物物种的核酸序列导入同一个物种内。例如，将来自稻的核酸序列转化至稻植物。然而，并非绝对要求待导入的核酸序列起源于与该核酸序列将要导入的植物相同的植物物种。只要内源性靶基因与待导入的核酸之间存在相当大的同源性就足够了。
[0190] 上文描述的是用于降低或基本去除内源基因在植物中表达的多种方法的实例。本领域技术人员会轻易地能够调整前述用于沉默的方法以至于例如通过利用合适启动子而实现降低内源基因在整株植物或在其部分中的表达。
[0191] 选择性标记(基因)/报道基因
[0192] “选择性标记”、“选择性标记基因”或“报道基因”包括向细胞赋予表型的任何基因，其中在所述的细胞内表达所述基因以促进鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体所转染或转化的细胞。这些标记基因能够通过一系列不同原理鉴定核酸分子的成功转移。合适的标记可以选自赋予抗生素耐药性或除草剂抗性、引入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择性标记基因的实例包括赋予抗生素耐药性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin)(G418)、壮观霉素或杀稻瘟素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供 抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA或利用木糖的木糖异构酶或抗营养标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。目视标记基因的表达导致形成颜色(例如β-葡糖醛酸糖苷酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP及其衍生物)。这个名单仅代表少数的可能标记。本领域技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。
[0193] 已知当核酸稳定或瞬时整合至植物细胞时，仅小部分的细胞摄取外来DNA并且根据需要将其整合至细胞基因组，这取决于所用表达载体和使用的转染技术。为鉴定并选择这些整合子，通常将编码选择标记(如上文所述之一)的基因连同目的基因一起导入宿主细胞。这些标记可以在其中这些基因因例如常规方法所致的缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择标记的核酸分子可以导入宿主细胞中，与在包含编码本发明多肽或本发明方法中所用多肽的序列在同一载体上，或在单独的载体上。已经用导入的核酸稳定转染的细胞可以通过选择进行鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其它细胞死亡)。标记基因一旦不再需要可以从转基因细胞中除去或者切除。用于标记去除的技术是本领域公知的，有用的技术在上文定义部分中描述。
[0194] 因为一旦已经成功导入了核酸，则转基因宿主细胞中不再需要或不希望有标记基因，尤其抗生素耐药性基因和除草剂抗性基因，因此用于导入核酸的本发明方法有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种如此方法称作共转化法。共转化法使用同时用于转化的两种载体，一种载体携带本发明的核酸而另一种载体携带标记基因。高比例的转化体接受，或在植物的情况下，包含(高达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农杆菌(Agrobacterium)转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼有T-DNA的序列，它通常代表表达盒。标记基因随后可以通过进行杂交而从转化的植物中去掉。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与想要的核酸一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶来源植物杂交或转化体用导致转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定地转化。在一些情况下(大约10％)，转座子在已经成功发生转化时跳出宿主细胞的基因组并丢失。在其它更多情况下，转座子跳至不同位置。在这些情况下，标记基因必须通过进行杂交而去除。在微生物学中，开发了实现或促进检测这类事件的技术。又一个有利的方法依赖于重组系统；此方法的优势在于不必通过杂交去除。该类型的最知名系统称作Cre/lox系统。Cre1是去掉位于loxP序列之间序列的重组酶。若标记基因整合于loxP序列之间，则通过重组酶表达已经成功发生转化时，标记基因被去除。其它重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组。这些方法自然也可以应用至微生物如酵母、真菌或细菌。
[0195] 转基因的/转基因/重组
[0196] 为本发明目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”就核酸序列而言意指包含此核酸序列的表达盒、遗传构建体或载体或用本发明的核酸序列、表达盒或载体转化的生物，这些构建均通过重组方法产生，其中
[0197] (a)编码用于本发明方法中的蛋白质的核酸序列，或
[0198] (b)与本发明核酸序列有效连接的遗传控制序列，例如启动子，或
[0199] (c)a)和b)。
[0200] 不处于其天然遗传环境中或已经通过重组方法修饰，修饰有可能采用例如取代、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指来源植物中的或在基因组文库中存在的天然基因组基因座或染色体基因座。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地得到保留，至少部分地得以保留。该环境分布在核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp的序列长度。天然发生的表达盒—例如核酸序列的天然启动子与编码本发明方法中所用多肽的对应核酸序列的天然发生的组合，如上文所定义-在这种表达盒通过非天然的合成(“人工”)方法(如诱变处理)而受到修饰时，变成转基因表达盒。合适方法例如在US 5,565,350或WO00/15815中描述。
[0201] 为本发明目的，转基因植物因此如上理解为意指本发明方法中所用的核酸不位于所述植物基因组中(该核酸序列)的天然基因座内，所述核酸有可能同源或异源地表达。然而如所提及，转基因还意指尽管本发明核酸或在本发明方法中所用核酸处于植物基因组中该核酸序列的天然位置内，然而其序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经受到修饰。转基因优选地理解为意指本发明核酸在基因组中的非天然基因座内表达，即发生核酸的同源表达或优选异源表达。在本文中提到了优选的转基因植物。
[0202] 转化
[0203] 如本文中所提及的术语“引入”或“转化”包括外源性多核苷酸转移至宿主细胞内，无论用于转化的方法是什么。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚胎发生)的植物组织可以用本发明的遗传构建体转化并且可以从中再生整株植物。选择的具体组织将取决于可用于并且最适于正进行转化的具体物种的克隆性增殖系统。示例性组织靶包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、胼胝体组织、现存分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导的分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地引入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。备选地，多核苷酸可以整合至宿主基因组内。产生的转化植物细胞随后可以用来以本领域技术人员已知的方式再生出转化植物。
[0204] 外来基因转化至植物基因组内称作转化。植物物种的转化现在是相当常规的技术。有利地，几种转化方法中的任一方法可以用来将目的基因引入合适的祖先细胞。用于从植物组织或植物细胞中转化并再生出植物的方法可以用于瞬时转化或用于稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、增加游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微投射法(microprojection)。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature296，72-74；Negrutiu I等(1987)Plant Mol Biol 8：363-373)；原生质体的电穿孔法(Shillito R.D.等(1985)Bio/Technol 3，1099-1102)；对植物材料的微量注射法(Crossway A等，(1986)Mol.Gen Genet 202：179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击法(Klein TM等，(1987)Nature327：70)、(非整合性)病毒感染法等。转基因植物，包括转基因作物植物，优选地通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是在植物中(in planta)的转化法。为此目的，例如有可能使农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物的分生组织。根据本发明已经证明使转化的农杆菌混悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。植物随后继续培育直至获得所处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。用于农杆菌介导的稻转化的方法包括用于稻转化的公知方法，如在任一以下文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP 1198985 A1，Aldemita和Hodges(Planta 199：612-617，1996)；Chan等(Plant MolBiol 22(3)：491-506，1993)，Hiei等(Plant J 6(2)：271-282，1994)，其公开内容在本文中引入作为参考，如同完全给出那样。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol 14(6)：745-50，1996)或Frame等(Plant Physiol 129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容在本文中如充分所述那样引入作为参考。所述方法通过举例方式进一步由Jenes等，Techniques for Gene Transfer，在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。
待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥(拟南芥属于本发明的范围，不视为作物植物)或作物植物，例如烟草植物，通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适的培养基内培育。植物通过根癌农杆菌的转化例如由 和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从
F.F.White，Vectors for GeneTransfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering andUtilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页中获知。
待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。由这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物，如拟南芥(拟南芥属于本发明的范围，不视为作物植物)或作物植物，例如烟草植物，通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切碎的叶并随后将它们在合适的培养基内培育。植物通过根癌农杆菌的转化例如由 和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877中描述或尤其从
F.F.White，Vectors for GeneTransfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering andUtilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页中获知。
[0205] 除了转化体细胞(其随后必须再生成完整植物)之外，还有可能转化植物分生组织的细胞及特别转化发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然的植物发育过程，产生转基因植物。因此，例如拟南芥种子用农杆菌处理并且从发育植物中获得种子，其中一定比例的所述植物受到转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和Marks MD(1987)MolGen Genet 208：274-289；Feldmann K(1992)。在：编者C Koncz，N-HChua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页]。替代性方法基于反复去掉花序并使莲座叶丛中心中的切除部位与转化的农杆菌温育，因而转化的种子同样可以在较晚的时间点获得(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994)MolGen Genet，245：363-370)。然而，尤其有效的方法是改良的真空渗入法，如“花浸染”法。在拟南芥真空渗入法的情况下，完整植物在减压下用农杆菌混悬液处理[Bechthold，N(1993)。C R Acad Sci Paris Life Sci，316：1194-1199]，而在“花浸染法”的情况下，正在发育的花组织与表面活性剂处理的农杆菌混悬液短暂温育[Clough，SJ und Bent，AF(1998).The PlantJ.16，735-743]。在两种情况下收获了一定比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育而与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中以母体方式遗传，降低或消除了转基因经花粉流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过已在Klaus等，2004[Nature Biotechnology
22(2)，225-229]中示例性加以展示的方法实现。简而言之，待转化的序列连同选择性标记基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源的侧翼序列指导位点特异性整合至原质体系内。已经对众多不同植物物种描述了质体转化并且综述可以出自Bock(2001)在基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology).J MolBiol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progress towards commercialization of plastidtransformation technology).Trends Biotechnol.21，20-28。进一步生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式作了报道，所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等，2004，NatureBiotechnology 22(2)，225-229)。
22(2)，225-229]中示例性加以展示的方法实现。简而言之，待转化的序列连同选择性标记基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源的侧翼序列指导位点特异性整合至原质体系内。已经对众多不同植物物种描述了质体转化并且综述可以出自Bock(2001)在基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology).J MolBiol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progress towards commercialization of plastidtransformation technology).Trends Biotechnol.21，20-28。进一步生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式作了报道，所述无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等，2004，NatureBiotechnology 22(2)，225-229)。
[0206] T-DNA激活标签化
[0207] T-DNA激活标签化(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及在目的基因的基因组区域内或基因编码区上游或下游10kb处以如此结构插入T-DNA(通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子))，使得启动子指导被靶定基因的表达。通常，由靶定基因的天然启动子对所述靶定基因表达的调节作用遭到破坏并且该基因处在新导入的启动子控制下。启动子一般嵌入在T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如通过农杆菌感染，并导致在所插入T-DNA附近的基因的改良表达。因靠近所导入启动子的基因的改良表达，产生的转基因植物表现显性表型。
[0208] TILLING
[0209] 术语“TILLING”是基因组内定向诱导的局部损伤的缩写并且意指用于产生和/或鉴定核酸诱变技术，其中所述的核酸编码具有修饰表达和/或活性的蛋白质。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以显示在强度方面或在位置方面或在时间方面改良的表达(例如若突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比由处于其天然形式的基因所显出活性更高的活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法组合。一般在TILLING中遵循的步骤是：(a)EMS诱变(Redei GP和Koncz C(1992)在Methods in Arabidopsis Research，Koncz C，Chua NH，Schell J，Singapore编著，World Scientific Publishing Co，第16-82页；Feldmann等，(1994)在Meyerowitz EM，Somerville CR编著，Arabidopsis.ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，第137-172页；Lightner J和Caspar T(1998)在J Martinez-Zapater，J Salinas编者，Methods on Molecular Biology第82卷.Humana Press，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体的DNA制备和汇集；(c)PCR扩增目的区；(d)变性和复性以允许形成异源双链体；(e)DHPLC，其中将异源双链体是否在汇集物中的存在检测为色谱图中的一个额外峰；(f)鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物测序。用于TILLING的方法是本领域众所周知的(McCallum等，(2000)Nat Biotechnol 18：455-457；综述见Stemple(2004)Nat Rev Genet 5(2)：145-50)。
[0210] 同源重组
[0211] 同源重组允许选择的核酸在基因组中于确定的所选择位置内导入。同源重组是在生物科学中常规地用于低等生物如酵母或苔藓剑叶藓(Physcomitrella)的标准技术。用于在植物中开展同源重组的方法已经不仅对模式植物(Offringa等(1990)EMBO J 9(10)：3077-84)而且对作物植物例如稻(Terada等(2002)Nat Biotech 20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)Curr Opin Biotech 15(2)：132-8)进行了描述，并且存在不管靶标生物如何可通常应用的方法(Miller et al，NatureBiotechnol.25，778-785，2007)。
[0212] 产量
[0213] 术语”产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与指定作物、与面积并与时间段有关。单个植物部分基于它们的数目、大小和/或重量而直接对产量有贡献，或实际产量是对于某作物和一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的和评估的产量)除以种植的平方米数而确定。
[0214] 早期萌发势
[0215] 早期萌发势(尤其在植物生长早期期间活跃、健康、良好平衡的生长)可以因植物适应性增加而产生，其原因在于例如植物更好地适应其环境(即优化能源的使用和苗与根之间的分配)。具有早期萌发势的植物也显示增加的幼苗存活和更好的作物建立，这往往导致高度均匀的田块(作物整齐地生长，即大多数植物在基本上相同的时间上达到发育的各阶段)和往往更好及更高的产量。因而，早期萌发势可以通过多种因子如千粒重、萌发百分数、出苗百分数、幼苗生长、幼苗高度、根长度、根及苗生物量和众多其它因素而确定。
[0216] 增加/改善/增强
[0217] 术语“增加”，”改善”或“增强”是可互换的并且应当在本申请含义上指与如本文中定义的对照植物相比至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生长。
[0218] 种子产量
[0219] 增加的种子产量本身可以表现为下列一种或多种指标：a)种子生物量(种子总重量)增加，这可以基于单粒种子和/或每株植物和/或每平方米；b)每株植物增加的花数；c)增加的(饱满)种子数；d)增加的种子饱满率(其表述为饱满种子数与种子总数之间的比率)；e)增加的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)产量与总生物量的比率；和f)增加的千粒重(TKW)，这从计数的饱满种子数及其总重量外推而来。增加的TKW可以因增加的种子大小和/或种子重量所致，并且也可以因胚和/或胚乳尺寸的增加所致。
[0220] 种子产量的增加也可以表现为种子大小和/或种子体积的增加。此外，种子产量的增加本身也可以自我表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的增加。增加的产量也可以产生改良的结构，或可以因改良的结构而出现。
[0221] 绿色指数
[0222] 本文所用的“绿色指数”从植物的数字图像计算而来。对于属于图像上植物物体的每个像素，计算绿色值与红色值的比值(用于编码颜色的RGB模式)。将绿色指数表示为绿色与红色比值超过给定阈值的像素百分比。在正常生长条件下，在盐胁迫生长条件下，和在降低的养分有效性生长条件下，在开花之前测量最后成像中植物的绿色指数。相比，在干旱胁迫生长条件下，测量干旱后第一次成像中植物的绿色指数。
[0223] 植物
[0224] 如本文中所用的术语”植物”包含整株植物、植物的祖先及后代和植物部分，包括种子、枝条、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织及器官，其中每种所提及对象包含目的基因/核酸。术语”植物”也包含植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样每种提及的对象包含目的基因/核酸。
[0225] 特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族的全部植物，尤其单子叶植物和双子叶植物，包括选自以下的饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木：槭树属物种(Acer spp.)、猕猴桃属物种(Actinidia spp.)、秋葵属物种(Abelmoschus spp.)、剑麻(Agave sisalana)、冰草属物种(Agropyron spp.)、匍匐剪股颖(Agrostis stolonifera)、葱属物种(Allium spp.)、苋属物种(Amaranthus spp.)、欧洲海滨草(Ammophila arenaria)、凤梨(Ananas comosus)、番荔枝属物种(Annona spp.)、芹菜(Apium graveolens)、落花生属物种(Arachis spp.)、木波罗属物种(Artocarpus spp.)、石刁柏(Asparagus officinalis)、燕麦属物种(Avena spp.)(例如燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、Avena fatua var.sativa、杂种燕麦(Avena hybrida)、阳桃(Averrhoa carambola)、箣竹属(Bambusa sp.)、冬瓜(Benincasa hispida)、巴西栗(Bertholletia excelsea)、甜菜(Beta vulgaris)、芸苔属物种(Brassica spp.)(例如欧洲油菜(Brassica napus)、芜青物种(Brassica rapa ssp.)[卡诺拉油菜、油菜(oilseed rape)、蔓青(turnip rape)])、Cadaba farinosa、茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Canna indica)、大麻(Cannabis sativa)、辣椒属物种(Capsicum spp.)、Carex elata、番木瓜(Carica papaya)、大果假虎刺(Carissa macrocarpa)、山核桃属物种(Carya spp.)、红花(Carthamus tinctorius)、栗属物种(Castanea spp.)、美洲木棉(Ceiba pentandra)、苦苣(Cichorium endivia)、樟属物种(Cinnamomum spp.)、西瓜(Citrullus lanatus)、柑橘属物种(Citrus spp.)、椰子属物种(Cocos spp.)、咖啡属物种(Coffea spp.)、芋头(Colocasia esculenta)、非洲梧桐属物种(Cola spp.)、黄麻属(Corchorus sp.)、芫荽(Coriandrum sativum)、榛属物种(Corylus spp.)、山楂属物种(Crataegus spp.)、番红花(Crocus sativus)、南瓜属物种(Cucurbita spp.)、香瓜属物种(Cucumis spp.)、菜蓟属(Cynara spp.物种)、胡萝卜(Daucus carota)、山马蝗属物种(Desmodium spp.)、龙眼(Dimocarpus longan)、薯蓣属物种(Dioscorea spp.)、柿树属物种(Diospyros spp.)、稗属物种(Echinochloa spp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeis guineensis)、美洲油棕Elaeis(oleifera))、穇子(Eleusine coracana)、Eragrostis tef、蔗茅属(Erianthus sp.)、枇杷(Eriobotrya japonica)、桉属(Eucalyptus sp.)、红仔果(Eugenia uniflora)、荞麦属物种(Fagopyrum spp.)、水青冈属物种(Fagus spp.)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、无花果(Ficus carica)、金桔属物种(Fortunella spp.)、草莓属物种(Fragaria spp.)、银杏(Ginkgo biloba)、大豆属(Glycine spp.)(例如大豆、大豆(Soja hispida)或大豆(Soja max))、陆地棉(Gossypium hirstum)、向日葵属(Helianthus spp.)(例如向日葵(Helianthus annuus))、长管萱草(Hemerocallis fulva)、木槿属物种(Hibiscus spp.)、大麦属(Hordeum spp.)(例如大麦(Hordeum vulgare))、甘薯(Ipomoea batatas)、核桃属物种(Juglans spp.)、莴苣(Lactuca sativa)、山黧豆属物种(Lathyrus spp.)、兵豆(Lens culinaris)、亚麻(Linum usitatissimum)、荔枝(Litchi chinensis)、百脉根属物种(Lotus spp.)、棱角丝瓜(Luffa acutangula)、羽扇豆属物种(Lupinus spp.)、Luzula sylvatica、番茄属 (Lycopersicon spp.)( 例如番茄(Lycopersicon esculentum、Lycopersicon lycopersicum、Lycopersicon pyriforme))、硬度豆属物种(Macrotyloma spp.)、苹果属物种(Malusspp.)、凹缘金虎尾(Malpighia emarginata)、牛油果(Mammea americana)、芒果(Mangifera indica)、木薯属物种(Manihot spp.)、人心果(Manilkara zapota)、苜蓿(紫苜蓿)、草木樨属物种(Melilotus spp.)、薄荷属物种(Mentha spp.)、芒(Miscanthus sinensis)、苦瓜属物种(Momordica spp.)、黑桑(Morus nigra)、芭蕉属物种(Musa spp.)、烟草属物种(Nicotiana spp.)、木犀榄属物种(Olea spp.)、仙人掌属物种(Opuntia spp.)、鸟足豆属物种(Ornithopus spp.)、稻属(Oryza spp.)(例如稻、阔叶稻(Oryza latifolia))、稷(Panicum miliaceum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、鸡蛋果(Passiflora edulis)、欧防风(Pastinaca sativa)、狼尾草属物种(Pennisetum sp.)、鳄梨属物种(Persea spp.)、芹菜(Petroselinum crispum)、虉草(Phalaris arundinacea)、菜豆属物种(Phaseolus spp.)、猫尾草(Phleum pratense)、刺葵属物种(Phoenix spp.)、南方芦苇(Phragmites australis)、酸浆属物种(Physalis spp.)、松属物种(Pinus spp.)、阿月浑子(Pistacia vera)、豌豆属物种(Pisum spp.)、早熟禾属物种(Poa spp.)、杨属物种(Populus spp.)、牧豆草属物种(Prosopis spp.)、李属物种(Prunus spp.)、番石榴属物种(Psidium spp.)、石榴(Punica granatum)、西洋梨(Pyrus communis)、栎属物种(Quercusspp.)、萝卜(Raphanus sativus)、波叶大黄(Rheum rhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribes spp.)、蓖麻(蓖麻)、悬钩子属物种(Rubus spp.)、甘蔗属物种(Saccharum spp.)、柳属物种(Salix sp.)、接骨木属物种(Sambucus spp.)、黑麦(Secale cereale)、胡麻属物种(Sesamum spp.)、白芥属物种(Sinapis sp.)、茄属(Solanum spp.)(例如马铃薯(马铃薯)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(番茄))、两色蜀黍(两色蜀黍)、菠菜属物种(Spinacia spp.)、蒲桃属物种(Syzygium spp.)、万寿菊属物种(Tagetes spp.)、酸豆(Tamarindus indica)、可可树(Theobroma cacao)、车轴草属物种(Trifolium spp.)、Tripsacum dactyloides、Triticale sp.、Triticosecale rimpaui、小麦属(Triticum spp.)(例如普通小麦(普通小麦)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticum hybernum、马卡小麦(Triticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)、一粒小麦(Triticum monococcum)或普通小麦(Triticum vulgare))、小金莲花(Tropaeolum minus)、金莲花(Tropaeolum majus)、越桔属物种(Vaccinium spp.)、野碗豆属物种(Vicia spp.)、豇豆属物种(Vigna spp.)、香堇(Viola odorata)、葡萄属物种(Vitis spp.)、玉蜀黍、Zizania palustris、枣属物种(Ziziphus spp.)等等。
[0226] 发明详述
[0227] 出人意料地，现在已经发现：调节植物中编码CRSP33样多肽的核酸的表达了产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。根据第一个实施方案，本发明提供用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码CRSP33样多肽的核酸表达和任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。
[0228] 另外，现在已经出人意料地发现：调节植物中编码MCB多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。根据另一个实施方案，本发明提供用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码MCB多肽的核酸表达和任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。
[0229] 另外，现在已经出人意料地发现：调节植物中编码SRT2多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。根据另一个实施方案，本发明提供用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码SRT2多肽的核酸表达和任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。
[0230] 另外，现在已经出人意料地发现：调节植物中编码YRP2多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的非生物胁迫耐受性的植物。根据另一个实施方案，本发明提供用于相对于对照植物增强植物中针对多种非生物胁迫的耐受性的方法，包括调节植物中编码YRP2多肽的核酸表达和任选地选择具有针对非生物胁迫的增强耐受性的植物。
[0231] 另外，现在已经出人意料地发现：调节植物中编码YRP3多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的非生物胁迫耐受性的植物。根据另一个实施方案，本发明提供用于相对于对照植物增强植物中针对多种非生物胁迫的耐受性的方法，包括调节植物中编码YRP3多肽的核酸表达和任选地选择具有针对非生物胁迫的增强耐受性的植物。
[0232] 另外，现在已经出人意料地发现：调节植物中编码YRP4多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的非生物胁迫耐受性的植物。根据另一个实施方案，本发明提供用于相对于对照植物增强植物中针对多种非生物胁迫的耐受性的方法，包括调节植物中编码YRP4多肽的核酸表达和任选地选择具有针对非生物胁迫的增强耐受性的植物。
[0233] 另外，现在已经出人意料地发现：调节植物中编码SPX-RING((SYG/PHO81/XPR1-RING)多肽的核酸的表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。根据另一个实施方案，本发明提供用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码SPX-RING多肽的核酸表达和任选地选择具有增强的产量相关性状的植物。
[0234] 用于调节(优选增加)编码CRSP33样多肽或MCB多肽或SRT2多肽或YRP2多肽或YRP3多肽或YRP4多肽或SPX-RING多肽的核酸表达的优选方法是在植物中导入并表达编码CRSP33样多肽或MCB多肽或SRT2多肽或YRP2多肽或YRP3多肽或YRP4多肽或SPX-RING多肽的核酸。
[0235] 就CRSP33样多肽而言，下文对“在本发明方法中有用的蛋白质”的任何谈及意指如本文中定义的CRSP33样多肽。下文对“在本发明方法中有用的核酸”的任何谈及指能够编码这种CRSP33样多肽的核酸。待导入植物中(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将予以描述的这类型蛋白质的任意核酸，下文也称作“CRSP33样核酸”或“CRSP33样基因”。
[0236] 就MCB多肽而言，下文对“在本发明方法中有用的蛋白质”的任何谈及意指如本文中定义的MCB多肽。下文对“在本发明方法中有用的核酸”的任何谈及意指能够编码这种MCB多肽的核酸。待导入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)中的核酸是编码现在将予以描述的这种类型蛋白质的任意核酸，下文也称作“MCB核酸”或“MCB基因”。
[0237] 就SRT2多肽而言，下文对“在本发明方法中有用的蛋白质”的任何谈及意指如本文中定义的SRT2多肽。下文对“在本发明方法中有用的核酸”的任何谈及意指能够编码这种SRT2多肽的核酸。待导入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)中的核酸是编码现在将予以描述的这种类型蛋白质的任意核酸，下文也称作“SRT2核酸”或“SRT2基因”。
[0238] 就YRP2多肽而言，下文对“在本发明方法中有用的蛋白质”的任何谈及意指如本文中定义的YRP2多肽。下文对“在本发明方法中有用的核酸”的任何谈及意指能够编码这种YRP2多肽的核酸。待导入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)中的核酸是编码现在将予以描述的这种类型蛋白质的任意核酸，下文也称作“YRP2核酸”或“YRP2基因”。
[0239] 就YRP3多肽而言，下文对“在本发明方法中有用的蛋白质”的任何谈及意指如本文中定义的YRP3多肽。下文对“在本发明方法中有用的核酸”的任何谈及意指能够编码这种YRP3多肽的核酸。待导入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)中的核酸是编码现在将予以描述的这种类型蛋白质的任意核酸，下文也称作“YRP3核酸”或“YRP3基因”。
[0240] 就YRP4多肽而言，下文对“在本发明方法中有用的蛋白质”的任何谈及意指如本文中定义的YRP4多肽。下文对“在本发明方法中有用的核酸”的任何谈及意指能够编码这种YRP4多肽的核酸。待导入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)中的核酸是编码现在将予以描述的这种类型蛋白质的任意核酸，下文也称作“YRP4核酸”或“YRP4基因”。
[0241] 就SPX-RING多肽而言，下文对“在本发明方法中有用的蛋白质”的任何谈及意指如本文中定义的SPX-RING多肽。下文对“在本发明方法中有用的核酸”的任何谈及意指能够编码这种SPX-RING多肽的核酸。待导入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)中的核酸是编码现在将予以描述的这种类型蛋白质的任意核酸，下文也称作“SPX-RING核酸”或“SPX-RING基因”。
[0242] 如本文中定义的“CRSP33样多肽”指包含任意一个或多个以下基序的任一多肽：
[0243] 基序I：YPPPPPFYRLYK或基序，其以优选性升序具有与基序I具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高序列同一性的基序；
[0244] 基序II：QGVRQLYPKGP或基序，其以优选性升序具有与基序II具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高序列同一性的基序；
[0245] 基序III：LNRELQLHILELADVLVERPSQYARRVE或基序，其以优选性升序具有与基序III具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高序列同一性的基序；
[0246] 基序IV：IFKNLHHLLNSLRPHQARAT或基序，其以优选性升序具有与基序IV具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高序列同一性的基序。
[0247] 如上文所定义的此类CRSP33样多肽一般额外地以优选性升序与SEQID NO：2或SEQ ID NO：4所代表的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、
48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、
63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性。
48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、
63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性。
[0248] 使用总体比对算法如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。与总体序列同一性相比较，仅考虑保守的结构域或基序时，该序列同一性通常会较高。
[0249] 优选地，该多肽序列在构建系统树(如图2中所绘制的一个系统树)中使用时，与包含如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所代表氨基酸序列的CRSP33样多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0250] 如本文中定义的MCB多肽指以优选性升序与表A2的任意氨基酸序列、优选与表A2的MCB1组中的任意序列、更优选与SEQ ID NO：45所代表的序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、
48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、
63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性的任一多肽。
48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、
63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性的任一多肽。
[0251] 此外并且优选地，MCB多肽指包含至少一种具有以下InterPro条目编号(检索号)IPR014778(PFAM 00249)或IPR001005(也叫做SANT，DNA结合)或IPR006447(也叫做Myb样DNA结合区，SHAQKYF类)中任一编号的Myb DNA结合结构域的任一多肽。最优选地，Myb DNA结合蛋白结构域包含基序7(SHAQKYF(SEQ ID NO：194)。
[0252] Myb DNA结合结构域是本领域熟知的。一般，一个或多个Myb结构域存在于Myb转录因子中(Yanhui等人2006)。
[0253] 备选地，本发明的MCB多肽指包含Myb-DNA结合结构域并且在植物启动子(能够在植物细胞中驱动基因表达的启动子)内部存在时能够与核酸盒TATCCAC和/或GATAAGATA盒结合的任一多肽。所述MCB多肽也可以以优选性升序与至少50、60、70、80、
90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500个核苷酸长度的DNA片段结合，所述片段包含TATCCAC和GATAAGATA所代表的两种盒中任一种。
90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500个核苷酸长度的DNA片段结合，所述片段包含TATCCAC和GATAAGATA所代表的两种盒中任一种。
[0254] 在本发明方法中有用的进一步优选的多肽指包含下述蛋白质基序的MCB多肽，其中所述的蛋白质基序以优选性升序与任意一个或多个以下基序具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性：
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％序列同一性：
[0255] (i)基序1：
[0256] WTEEEH[RK][KT]FL[AED]GL[ERK][QK]LGKGDWRGI[SA]K[NG]ASHAQKYFLRQTN(SEQ ID NO：188)；
[0257] (ii)基序2：
[0258] P[GN][KM]KKRR[AS]SLFD[VM][GM][IPA][ARP][DEA][LGY][SHK][PD][ANTY](SEQ ID NO：189)；
[0259] (iii)基序3：
[0260] [GLA][AGS][LST][GMP]Q[QSL][KS][RG][RK]RR[KR]AQ[ED]RKK[GA][IV]P(SEQ ID NO：190)；
[0261] (iv)基序4：
[0262] WTEEEHR[ML]FLLGLQKLGKGDWRGI[SA]RN[YF]V[VIT][ST]RTPTQVASHAQ KYFIRQ[ST]N(SEQ ID NO：191)；
[0263] (v)基序5：[RK]RKRRSSLFD[MI]V[AP]D[ED](SEQ ID NO：192)；
[0264] (vi)基序6：RRCSHC[SG][HN]NGHNSRT(SEQ ID NO：193)：
[0265] (vii)基序7：SHAQKYF(SEQ ID NO：194)，
[0266] 其中括号之间的氨基酸代表该位置处的备选氨基酸。
[0267] 更优选地，在本发明中有用的多肽是表A2中任一多肽的同源物或直向同源物，甚至更优选地是表A2的任一种多肽，最优选地是由SEQ ID NO：45代表的多肽。
[0268] 备选地，MCB蛋白的同源物以优选性升序与SEQ ID NO：45所代表的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、
55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性，条件是该同源蛋白包含一个或多个如上文概括的保守基序。使用总体比对算法如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。与总体序列同一性相比较，仅考虑保守的结构域或基序时，该序列同一性通常会较高。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol147(1)；195-7)。
55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性，条件是该同源蛋白包含一个或多个如上文概括的保守基序。使用总体比对算法如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。与总体序列同一性相比较，仅考虑保守的结构域或基序时，该序列同一性通常会较高。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol147(1)；195-7)。
[0269] 如本文中定义的″SRT2多肽″指具有NAD1依赖性蛋白质脱乙酰酶活性的任一多肽。SRT2或Sirtuin多肽在结构上和功能上被充分表征(Hollender和Liu 2008)。一般而言，如本文中定义的″SRT2多肽″包含具有Pfam检索号PF2146的长约200个氨基酸的SRT2保守结构域。
[0270] Pfam PF2146结构域基于如HMMER2软件包所提供的隐蔽马尔科夫模型(HMM)搜索。在HMMER2中，如同BLAST，计算E-值(期望值)。E-值是期望仅因偶然而具有等于或优于该E-值的某个评分的命中数。优良的E-值远小于1。大约1是仅因偶然所期望的。原则上，决定匹配显著性所需要的全部就是E-值。下文是如Pfam数据库中提供的定义SRT2结构域的结构域评分。
[0271]
[0272] 指出了用来建立SRT2结构域的HMM模型。针对该模型比对Is(总体)和fs(片段)匹配的顺序以产生完整比对。建立方法可以是总体优先的，其中通过评分首先比对Is匹配结果，随后比对不重叠的fs匹配结果，其中匹配结果按照e值评分顺序比对，或是局部优先的，其中首先比对fs匹配结果，随后比对不重叠的Is匹配结果。显示了与HMM比对的单个结构域的评分。如果存在多于一个结构域，则序列评分是该Pfam条目的全部结构域评分的总和。如果仅存在单一结构域，则该蛋白质的序列和结构域将是相同的。
[0273] 显示了所用的SRT2结构域的收集截断值。该值是用来建立完整比对结果的搜索阈值。收集截断值是某序列必须达到以属于Pfam条目完整比对结果的最小评分。对于每个Pfam HMM，存在两个截断值，序列截断值和结构域截断值。
[0274] 受信任截断值指完整比对结果中最低评分匹配的比特评分。噪音截断值(NC)指不在完整比对结果中的最高评分匹配的比特评分。
[0275] 在本发明方法中有用的优选SRT2多肽指包含蛋白质结构域的多肽，其中所述的蛋白质结构域以优选性升序与表C1中所述的任意一个或多个氨基酸结构域具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、
65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性。
65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性。
[0276] 备选地，SRT2蛋白的同源物以优选性升序与SEQ ID NO：199所代表的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、
54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、
69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％总体序列同一性，条件是该同源蛋白包含如上文概括的保守基序。
54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、
69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％总体序列同一性，条件是该同源蛋白包含如上文概括的保守基序。
[0277] 使用总体比对算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。与整体序列同一性相比较，仅考虑保守的结构域或基序时，该序列同一性通常会更高。对于局部比对，所述Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。
[0278] 优选地，在本发明方法中有用的SRT2多肽指这样的多肽序列，该多肽序列在构建如Hollender和Lieu 2008年所述并且列于下文的全部18种拟南芥HDAC多肽的系统树中使用时，与代表拟南芥SRT2多肽的SRT1或SRT2多肽聚类，而不与任何其他多肽聚类。
[0279] 18种拟南芥蛋白的名单
[0280]HDA19：(At4G38130.1)
HDA6：(At5G63110.1)
HDA7：(At5G35600.1)
HDA9：(At3G44680.1)
HDA5：(At5G61060.1)
HDA15：(At3G18520.1)
HDA18：(At5G61070.1)
HDA2：(At5G26040.1)
HAD8：(At1G08460.1)
HDA14：(At4G33470.1)
HDA10：(At3G44660.1)
HDA17：(At3G44490.1)
HDT1：(At3G44750.1)
HDT2：(At5G22650.1)
HDT3：(At5G03740.1)
HDT4：(At2G27840.1)
SRT1：(At5G55760.1)
SRT2：(At5G09230.1)
HDA6：(At5G63110.1)
HDA7：(At5G35600.1)
HDA9：(At3G44680.1)
HDA5：(At5G61060.1)
HDA15：(At3G18520.1)
HDA18：(At5G61070.1)
HDA2：(At5G26040.1)
HAD8：(At1G08460.1)
HDA14：(At4G33470.1)
HDA10：(At3G44660.1)
HDA17：(At3G44490.1)
HDT1：(At3G44750.1)
HDT2：(At5G22650.1)
HDT3：(At5G03740.1)
HDT4：(At2G27840.1)
SRT1：(At5G55760.1)
SRT2：(At5G09230.1)
[0281] 如本文中定义的″YRP2多肽″指包含由SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：238和SEQ ID NO：240任一者所代表序列的任一多肽或其任一直向同源物和旁系同源物。
[0282] YTP2多肽及其直向同源物和旁系同源物一般与SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：238和SEQ ID NO：240任一者所代表的氨基酸以优选性升序具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、
59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性。
44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、
59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性。
[0283] 使用总体比对算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。与总体序列同一性相比较，仅考虑保守的结构域或基序时，该序列同一性通常会更高。
[0284] 优选地，该多肽序列在构建系统树中使用时，与包含如SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：238和SEQ ID NO：240所代表氨基酸序列的YRP2多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。用于构建及分析系统树的工具和技术是本领域熟知的。
[0285] 如本文中定义的″YRP3多肽″指包含由SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：253和SEQ ID NO：255任一者所代表序列的任一多肽及其任一直向同源物或旁系同源物。
[0286] YTP3多肽及其直向同源物和旁系同源物一般与SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：253和SEQ ID NO：255任一者所代表的氨基酸具有以优选性升序至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、
51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、
66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％的总体序列同一性。
51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、
66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％或99％的总体序列同一性。
[0287] 使用总体比对算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。与总体序列同一性相比较，仅考虑保守的结构域或基序时，该序列同一性通常会更高。
[0288] 优选地，该多肽序列在构建系统树中使用时，与包含如SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：253、SEQ ID NO：255任一者所代表氨基酸序列的YRP3多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0289] 用于构建及分析系统树的工具和技术是本领域熟知的。
[0290] 如本文中定义的″YRP4多肽″指包含由SEQ ID NO：262和SEQ IDNO：264任一者所代表序列的直向同源物和旁系同源物的任一多肽。
[0291] YTP4多肽及其直向同源物和旁系同源物一般与SEQ ID NO：262和SEQ ID NO：264任一者所代表的氨基酸具有以优选性升序至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、
47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、
62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、
77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的总体序列同一性。
47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、
62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、
77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的总体序列同一性。
[0292] 使用总体比对算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。与总体序列同一性相比较，仅考虑保守的结构域或基序时，该序列同一性通常会更高。
[0293] 优选地，该多肽序列在构建系统树中使用时，与包含如SEQ ID NO：262和SEQ ID NO：264任一者所代表氨基酸序列的YRP4多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。用于构建及分析系统树的工具和技术是本领域熟知的。
[0294] 如本文中定义的“SPX-RING多肽”指包含SPX(Pfam：PF03105)和Zf-C3HC4(锌指，RING型)结构域(Pfam：PF00097)的任一多肽。
[0295] 优选地，SPX-RING多肽包含保守的结构域，该保守结构域以优选性升序与任意一个或多个以下序列具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性：
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性：
[0296] (i)(i)如SEQ ID NO：271的第1至第152位氨基酸(SEQ ID NO：271中的SPX结构域)所代表的序列；
[0297] (ii)(ii)如SEQ ID NO：271的第217至第265位氨基酸(SEQ ID NO：271中的Zf-C3HC4结构域)所代表的序列。
[0298] 还优选地，在本发明方法中有用的SPX-RING多肽包含以优选性升序与任意一个或多个以下基序具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性的基序：
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性的基序：
[0299] (i)(i)基序1-1至基序1-35(SEQ ID NO：340至374)；和
[0300] (ii)(ii)基序2-1至基序2-35(SEQ ID NO：375至409)；和
[0301] (iii)(iii)基序3-1至基序3-35(SEQ ID NO：410至444)。
[0302] 表D1的基序1-1至基序1-35是包含于表A7的多肽的SPX结构域内部的保守蛋白质基序。表D1的基序3-1至基序2-35是包含于表A7多肽的Zf-C3HC4结构域内部的保守蛋白质基序。
[0303] SPX和Zf-C3HC4结构域可以在专用于蛋白家族、结构域和功能位点的蛋白数据库如Pfam(Finn等人Nucleic Acids Research(2006)数据库第34期：D247-D251)或集成蛋白特征序列数据库：PROSITE、PRINTS、ProDom、Pfam、SMART、TIGRFAMs、PIRSF、SUPERFAMILY、Gene3D和PANTHER的InterPro(Mulder等人2007Nucleic Acids Research，2007，数据库第34期D224-D228)中找到。Pfam编撰了覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐蔽马尔科夫模型(HMM)的庞大集合并且通过英国Sanger研究所可获得。如Pfam数据库中视为受信任的匹配是评分高于收集截断阈值的那些序列。Zf-C3HC4结构域(Pfam检索号：PF00097)的收集截断阈值在Pfam HMM fs方法中是16.0并且在PfamHMM ls方法中是15.2。SPX结构域(Pfam检索号：PF00097)的收集截断阈值在Pfam HMM fs方法中是
20.0并且在Pfam HMM ls方法中是25.0。然而，包含真实RING-H2结构域的潜在匹配依旧可以在收集截断值以下。备选地，可以使用interpro扫描来确定SPX和/或Zf-C3HC4结构域在多肽中的存在。在实施例部分中提供执行interpro扫描或蛋白质的方法的细节。
20.0并且在Pfam HMM ls方法中是25.0。然而，包含真实RING-H2结构域的潜在匹配依旧可以在收集截断值以下。备选地，可以使用interpro扫描来确定SPX和/或Zf-C3HC4结构域在多肽中的存在。在实施例部分中提供执行interpro扫描或蛋白质的方法的细节。
[0304] 备选地，多肽中的SPX和Zf-C3HC4结构域可以通过与包含此类结构域的已知多肽进行序列比较并在所述结构域区域内建立相似性而鉴定。可以使用本领域熟知的任意方法如Blast算法比对所述序列。发生与给定序列比对的概率作为确定相似多肽的基础。一般用来代表这种概率的参数称作e-值。所述E-值是S评分可靠性的一个量度。S评分是查询项与所示序列的相似性的一个度量。e-值描述了给定S评分预期以多大频率随机发生。e-值截断值可以如1.0那样高。来自使用SPX-RING多肽作为查询序列的BLAST搜索输出结果的受信任e-值的常见阈值低于1.e-10、1.e-15、1.e-20、1.e-25、1.e-50、1.e-75、1.e-100、1.e-200、1.e-300、1.e-400、1.e-500、1.e-600、1.e-700和1.e-800。优选地，在本发明方法中有用的SPX-RING多肽包含这样的序列，该序列以优选性升序在与如已知的SPX-RING多肽例如SEQID NO：271中所找到的SPX和Zf-C3HC4结构域的比对中具有低于 1.e-10、1.e-15、1.e-20、1.e-25、1.e-50、1.e-75、1.e-100、1.e-200、1.e-300、1.e-400、
1.e-500、1.e-600、1.e-700和1.e-800的e-值。
1.e-500、1.e-600、1.e-700和1.e-800的e-值。
[0305] 备选地，SPX-RING蛋白的同源物以优选性升序与SEQ ID NO：271所代表的氨基酸具有至少25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、
53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％总体序列同一性，条件是该同源蛋白包含如上文概括的保守基序。使用总体比对算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。与总体序列同一性相比较，仅考虑保守的结构域或基序时，该序列同一性通常会更高。对于局部比对，所述Smith-Waterman算法是特别有用的(SmithTF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。
53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％总体序列同一性，条件是该同源蛋白包含如上文概括的保守基序。使用总体比对算法，如程序GAP(GCG Wisconsin Package，Accelrys)中的Needleman Wunsch算法，优选地采用默认参数并且优选地采用成熟蛋白质的序列(即不考虑分泌信号或转运肽)，确定总体序列同一性。与总体序列同一性相比较，仅考虑保守的结构域或基序时，该序列同一性通常会更高。对于局部比对，所述Smith-Waterman算法是特别有用的(SmithTF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；195-7)。
[0306] 术语“结构域”、“特征序列”和“基序”在本文中的“定义”部分定义。存在用于鉴定结构域的专家数据库，例如，SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，5857-5864；Letunic 等 人(2002)Nucleic Acids Res30，242-244)、InterPro(Mulder 等人，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(A generalized profile syntax for biomolecular sequences motifs and its function in automatic sequence interpretation).(在)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.Altman R.，Brutlag D.，Karp P.，Lathrop R.，Searls D.编著，第53-61页，AAAI Press，Menlo Park；
Hulo等人，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))或Pfam(Bateman等人，Nucleic Acids Research 30(1)：276-280(2002))。一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具是在ExPASY蛋白质组服务器上可获得的(瑞士生物信息研究所维护(Gasteiger等人，ExPASy：
用于深入认识和分析蛋白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis)，Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。也可以使用常规技术如通过序列比对鉴定结构域或基序。
Hulo等人，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004))或Pfam(Bateman等人，Nucleic Acids Research 30(1)：276-280(2002))。一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具是在ExPASY蛋白质组服务器上可获得的(瑞士生物信息研究所维护(Gasteiger等人，ExPASy：
用于深入认识和分析蛋白质的蛋白质组服务器(The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis)，Nucleic Acids Res.31：3784-3788(2003))。也可以使用常规技术如通过序列比对鉴定结构域或基序。
[0307] 用于比对序列以做比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BE STFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)J Mol Biol 48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即覆盖完整序列的)比对。BLAST算法(Altschul等人，(1990)J Mol Biol 215：403-10)计算序列同一性百分数并且开展两个序列之间相似性的统计分析。用于开展BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地鉴定。相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中可用的方法之一确定(Campanella等，BMC Bioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences))。如对本领域技术人员显而易见，可以进行少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。此外，作为使用全长序列鉴定同源物的替代，也可以使用特定的结构域。使用上文提及的程序，使用默认参数，可以确定在完整核酸或氨基酸序列范围或所选结构域或保守基序范围内的序列同一性值。对于局部比对，Smith-Waterman算法是特别有用的(Smith TF，Waterman MS(1981)J.Mol.Biol 147(1)；
195-7)。
195-7)。
[0308] 另外，MCB多肽一般具有DNA结合活性。用于测量DNA结合活性的工具和技术是本领域熟知的。优选的方法如Rose等人1999Plantjournal 20，641-645；和/或由Rubio-Somoza，The Plant Journal(2006)45，17-30所描述。
[0309] 另外，当根据如实施例部分中所概括的本发明方法在稻中表达时，MCB多肽产生这样的植物，其具有增加的产量相关性状，尤其选自增加的植物种子重量、增加的种子饱满率、增加的收获指数和增加的饱满种子数中的任意一个或多个产量相关性状。
[0310] 另外，SRT2多肽(至少以它们的天然形式)一般具有组蛋白脱乙酰酶活性。用于测量组蛋白脱乙酰酶活性的工具和技术是本领域熟知的(Hollender和Liu 2008)。
[0311] 另外，当根据如实施例部分中所概括的本发明方法在稻中表达时，SRT2多肽产生这样的植物，其具有增加的产量相关性状，尤其以下产量相关性状中任一者：增加的绿色生物量、增加的萌发势(幼苗生长势)、增加的每株植物种子总重量、增加的饱满种子数、增加的每圆锥花序花数、增加的总种子数目和增加的干旱耐受性。
[0312] 另外，当根据如实施例7和8中所概述的本发明方法在稻中表达时，SPX-RING多肽产生这样的植物，其具有选自如下的增加的产量相关性状：增加的总种子重量、增加的收获指数和增加的种子饱满率。
[0313] 额外地，SPX-RING多肽可以显示优选的亚细胞位置，一般地是细胞核、细胞质、叶绿体或线粒体之中的一个或多个亚细胞位置。
[0314] 蛋白质亚细胞定位预测的任务是重要的并且得到充分研究。知晓蛋白质的定位有助于阐明其功能。用于蛋白质定位的实验方法涉及免疫定位至使用绿色荧光蛋白(GFP)或β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)对蛋白质标记。虽然与计算方法相比繁琐，然而此类方法准确。最近在从序列数据计算预测蛋白质定位方面取得长足进展。在本领域技术人员熟知算法当中，例如PSort、TargetP、ChloroP、LocTree、Predotar、LipoP、MITOPROT、PATS、PTS1、SignalP、TMHMM等是在瑞士生物信息研究所维护的ExPASyProteomics工具处可获得的。
[0315] 根据如本文实施例部分中概括的本发明方法在植物、尤其在稻中表达时，CRSP33样多肽产生具有增加的产量相关性状的植物。
[0316] 在植物、尤其在稻中表达时，YRP2多肽或YRP3多肽或YRP4多肽赋予增强的非生物胁迫耐受性至那些植物。
[0317] 就CRSP33样多肽而言，本发明通过用SEQ ID NO：1所代表的核酸序列转化植物进行说明，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：2的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用任一编码CRSP33样的核酸或如本文中定义的CRSP33样多肽实施。
[0318] 编码CRSP33样多肽的核酸的实例在本文实施例部分的表A1中给出。此类核酸可用于实施本发明的方法。在实施例部分的表A1中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：2所代表的CRSP33样多肽的直向同源物和旁系同源物的实例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用本文实施例部分的表A1中列出的任一序列)针对任一序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自下述生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中从所述生物衍生查询序列(在查询序列是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的情况下，第二BLAST因而会针对番茄序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地产生最高命中当中的所述查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且当反向BLAST时，优选地产生属于最高命中的所述查询序列。
[0319] 就MCB多肽而言，本发明通过用SEQ ID NO：44所代表的核酸序列转化植物进行说明，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：45的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用编码MCB的任一核酸或如本文中定义的MCB多肽实施。
[0320] 编码MCB多肽的核酸的实例在本文实施例部分的表A2中给出。此类核酸用于实施本发明的方法。在实施例部分的表A2中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：45所代表的MCB多肽的直向同源物和旁系同源物的实例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用本文实施例部分的表A2中列出的任一序列)针对任一序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序列是SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：45的情况下，第二BLAST因而将针对小麦序列进行)。随后比较第一BLASTS和第二BLASTS的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地产生最高命中当中的所述查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且当反向BLAST时，优选地产生属于最高命中的所述查询序列。
[0321] 就SRT2多肽而言，本发明通过用SEQ ID NO：198所代表的核酸序列转化植物进行说明，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：199的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用编码SRT2的任一核酸或如本文中定义的SRT2多肽实施。
[0322] 编码SRT2多肽的核酸的实例在本文实施例部分的表A3中给出。此类核酸用于实施本发明的方法。在实施例部分的表A3中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：199所代表的SRT2多肽的直向同源物和旁系同源物的实例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用本文实施例部分的表A3中列出的任一序列)针对任一序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序列是SEQ ID NO：198或SEQ ID NO：199的情况下，第二BLAST因而将针对稻序列进行)。随后比较第一BLASTS和第二BLASTS的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地产生最高命中当中的所述查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且当反向BLAST时，优选地产生属于最高命中的所述查询序列。
[0323] 就YRP2多肽而言，本发明通过用以下任一序列所代表的核酸序列转化植物进行说明：编码SEQ ID NO：236的多肽序列的SEQ ID NO：235，或编码SEQ ID NO：238的多肽序列的SEQ ID NO：237，或编码SEQ IDNO：240的多肽序列的SEQ ID NO：239。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用编码YRP2的任一核酸或如本文中定义的YRP2多肽实施。
[0324] 编码YRP2多肽的核酸的实例在本文实施例部分的表A4中给出。此类核酸用于实施本发明的方法。使用常规工具和技术，如交互式blast搜索，可以轻易地获得表A4中给出的氨基酸序列的直向同源物和旁系同源物。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用本文实施例部分的表A4中列出的任一序列)针对任一序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自下述生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中从所述生物衍生查询序列(在查询序列是SEQ ID NO：235或SEQ ID NO：236的情况下，第二BLAST因而会针对番茄序列进行；在查询序列是SEQ ID NO：237或SEQ ID NO：238的情况下，第二BLAST因而会针对展叶剑叶藓序列进行；在查询序列是SEQ ID NO：239或SEQ ID NO：240的情况下，第二BLAST因而会针对大豆序列进行)。随后比较第一BLASTS和第二BLASTS的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地产生最高命中当中的所述查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且当反向BLAST时，优选地产生属于最高命中的所述查询序列。
[0325] 就YRP3多肽而言，本发明通过用以下任一序列所代表的核酸序列转化植物进行：编码SEQ ID NO：245的多肽序列的SEQ ID NO：244，或编码SEQ ID NO：247的多肽序列的SEQ ID NO：246，或编码SEQ ID NO：249的多肽序列的SEQ ID NO：248，或编码SEQ ID NO：
251的多肽序列的SEQ ID NO：250，或编码SEQ ID NO：253的多肽序列的SEQ ID NO：252，或编码SEQ ID NO：255的多肽序列的SEQ ID NO：254。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用编码YRP3的任一核酸或如本文中定义的YRP3多肽实施。
251的多肽序列的SEQ ID NO：250，或编码SEQ ID NO：253的多肽序列的SEQ ID NO：252，或编码SEQ ID NO：255的多肽序列的SEQ ID NO：254。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用编码YRP3的任一核酸或如本文中定义的YRP3多肽实施。
[0326] 编码YRP3多肽的核酸的实例在本文实施例部分的表A5中给出。此类核酸用于实施本发明的方法。使用常规工具和技术，如交互式blast搜索，可以轻易地获得表A5中给出的氨基酸序列的直向同源物和旁系同源物。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用本文实施例部分的表A5中列出的任一序列)针对任一序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自下述生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中从所述生物衍生查询序列(在查询序列是SEQ ID NO：244或SEQ ID NO：245的情况下，第二BLAST因而会针对展叶剑叶藓序列进行；在查询序列是SEQ ID NO：246或SEQ IDNO：247的情况下，第二BLAST因而会针对展叶剑叶藓序列进行；在查询序列是SEQ ID NO：248或SEQ ID NO：249的情况下，第二BLAST因而会针对毛果杨(Populus trichocarpa)序列进行；在查询序列是SEQ ID NO：250或SEQ ID NO：251的情况下，第二BLAST因而会针对毛果杨序列进行；在查询序列是SEQ ID NO：252或SEQ ID NO：253的情况下，第二BLAST因而会针对稻序列进行；在查询序列是SEQ ID NO：254或SEQ IDNO：255的情况下，第二BLAST因而会针对稻序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地产生最高命中当中的所述查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且当反向BLAST时，优选地产生属于最高命中的所述查询序列。
[0327] 就YRP4多肽而言，本发明通过用以下任一序列所代表的核酸序列转化植物进行：编码SEQ ID NO：262的多肽序列的SEQ ID NO：261，或编码SEQ ID NO：264的多肽序列的SEQ ID NO：263。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用编码YRP4的任一核酸或如本文中定义的YRP4多肽实施。
[0328] 编码YRP4多肽的核酸的实例在本文实施例部分的表A6中给出。此类核酸用于实施本发明的方法。使用常规工具和技术，如交互式blast搜索，可以轻易地获得表A6中给出的氨基酸序列的直向同源物和旁系同源物。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用本文实施例部分的表A6中列出的任一序列)针对任一序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序列是SEQ ID NO：261或SEQ ID NO：262的情况下，第二BLAST因而将针对普通小麦序列进行；在查询序列是SEQ ID NO：263或SEQ ID NO：264的情况下，第二BLAST因而将针对番茄序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地产生最高命中当中的所述查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且当反向BLAST时，优选地产生属于最高命中的所述查询序列。
[0329] 就SPX-RING多肽而言，本发明通过用SEQ ID NO：270所代表的核酸序列转化植物进行说明，其中所述核酸序列编码SEQ ID NO：271的多肽序列。然而，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用编码SPX-RING的任一核酸或如本文中定义的SPX-RING多肽实施。
[0330] 编码SPX-RING多肽的核酸的实例在本文实施例部分的表A7中给出。此类核酸用于实施本发明的方法。在实施例部分的表A7中给出的氨基酸序列是由SEQ ID NO：271所代表的SPX-RING多肽的直向同源物和旁系同源物的实例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定其他直向同源物和旁系同源物。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用本文实施例部分的表A7中列出的任一序列)针对任一序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序列是SEQ ID NO：270或SEQ ID NO：271的情况下，第二BLAST因而将针对稻序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。如果来自第一blast的高阶位命中是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地产生最高命中当中的所述查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是来自与衍生该查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且当反向BLAST时，优选地产生属于最高命中的所述查询序列。
[0331] 高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中的几率越低)。E-值计算法是本领域熟知的。除了E-值外，比较也通过同一性百分数评定。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在大家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚类并鉴定直向同源物和旁系同源物。
[0332] 核酸变体也可以用于实施本发明的方法。此类变体的例子包括编码在实施例部分的表A1至A7中所给出任一个氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文中定义。在本发明方法中还有用的是这样的核酸，其编码在实施例部分的表A1至A7中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。在本发明方法中有用的同源物和衍生物与衍生它们的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功能活性。
[0333] 在实施本发明的方法中有用的其他核酸变体包括编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸的部分、与编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸杂交的核酸、编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸的剪接变体、编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸的变体。术语“杂交序列”、“剪接变体、“等位变体”、“基因改组”如本文中所描述。
[0334] 编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸不需要是全长核酸，因为本发明方法的实施不依赖于使用全长核酸序列。根据本发明，提供用于增强植物中产量相关性状和/或非生物胁迫耐受性的方法，包括在植物中导入并表达在实施例部分的表A1至A7中给出的任一个核酸序列的一部分或编码在实施例部分的表A1至A7中所给出任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分。
[0335] 核酸的一部分可以例如通过对所述核酸产生一个或多个缺失而制备。所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在产生组合几种活性的蛋白质。与其他编码序列融合时，翻译时产生的所得多肽可以大于对该蛋白质部分预测的多肽。
[0336] 就CRSP33样多肽而言，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的CRSP33样多肽，并且基本上具有与实施例部分的表A1中所给出氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该部分是在实施例部分的表A1中给出的任一种核酸的一部分，或是编码在实施例部分的表A1中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选地，该部分在长度上是至少500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000个或更多个连续核苷酸，所述的连续核苷酸是实施例部分的表A1中给出的任一个核酸序列或是编码在实施例部分的表A1中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQ ID NO：1的核酸的一部分。优选地，该部分编码下述氨基酸序列的片段，其中所述氨基酸序列在构建系统树(如图2中所描绘的一个系统树)中使用时，与包含如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所代表的氨基酸序列的CRSP33样多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0337] 就MCB多肽而言，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的MCB多肽，并且基本上具有与实施例部分的表A2中所给出氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该部分是在实施例部分的表A2中给出的任一种核酸的一部分，或是编码在实施例部分的表A2中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选地，该部分在长度上是至少100、200、300、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、
1800、1850、1900、1950、2000、2050个连续核苷酸，所述的连续核苷酸是实施例部分的表A2中给出的任一个核酸序列或是编码在实施例部分的表A2中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQ IDNO：44的核酸的一部分。优选地，该部分编码包含下述序列的氨基酸序列的片段，所述序列以优选性升序与表A2的任一氨基酸序列、优选地与SEQ1D NO：45所代表的序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、
35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、
50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、
65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％，或99％总体序列同一性。
1800、1850、1900、1950、2000、2050个连续核苷酸，所述的连续核苷酸是实施例部分的表A2中给出的任一个核酸序列或是编码在实施例部分的表A2中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQ IDNO：44的核酸的一部分。优选地，该部分编码包含下述序列的氨基酸序列的片段，所述序列以优选性升序与表A2的任一氨基酸序列、优选地与SEQ1D NO：45所代表的序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、
35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、
50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、
65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％，或99％总体序列同一性。
[0338] 就SRT2多肽而言，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的SRT2多肽，并且基本上具有与实施例部分的表A3中所给出氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该部分是在实施例部分的表A3中给出的任一种核酸的一部分，或是编码在实施例部分的表A3中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选地，该部分的长度是至少200、300、400、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550个连续核苷酸，所述连续核苷酸是实施例部分的表A3中给出的任一个核酸序列或是编码在实施例部分的表A3中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQ ID NO：198的核酸的一部分。优选地，该部分编码下述氨基酸序列的片段，其中所述氨基酸序列在构建如Hollender和Lieu 2008年所述并且列于下文的全部18种拟南芥HDAC多肽的系统树中使用时，与代表拟南芥SRT2多肽的SRT1或SRT2多肽聚类，而不与任何其他多肽聚类。
[0339] 就YRP2多肽而言，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的YRP2多肽，并且基本上具有与实施例部分的表A4中所给出氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该部分是在实施例部分的表A4中给出的任一种核酸的一部分，或是编码在实施例部分的表A4中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选地，该部分在长度上是至少1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350个或更多个连续核苷酸，所述的连续核苷酸是实施例部分的表A4中给出的任一个核酸序列或是编码在实施例部分的表A4中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：237或SEQ ID NO 239的核酸的一部分。优选地，该部分编码下述氨基酸序列的片段，其中所述氨基酸序列在构建系统树中使用时，与包含如SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：238或SEQ ID NO：240所代表的氨基酸序列的YRP2多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0340] 就YRP3多肽而言，在本发明方法中有用的部分编码了如本文中定义的YRP3多肽，并且基本上具有与实施例部分的表A5中所给出氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该部分是在实施例部分的表A5中给出的任一种核酸的一部分，或是编码在实施例部分的表A5中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选地，该部分在长度上是至少2000、2250、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000个或更多个连续核苷酸，所述的连续核苷酸是实施例部分的表A5中给出的任一个核酸序列或是编码在实施例部分的表A5中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：252或SEQ ID NO 254的核酸的一部分。优选地，该部分编码下述氨基酸序列的片段，其中所述氨基酸序列在构建系统树中使用时，与包含如SEQID NO：245、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：251、SEQID NO：253或SEQ ID NO：255所代表的氨基酸序列的YRP3多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0341] 就YRP4多肽而言，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的YRP4多肽，并且基本上具有与实施例部分的表A6中所给出氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该部分是在实施例部分的表A6中给出的任一种核酸的一部分，或是编码在实施例部分的表A6中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选地，该部分在长度上是至少1700、1750、1800、1850、1900、1950、2000、2050、2100、2150、2200、2250、2300、2350、2400、2450、2500、2550、2600、2650、2700、2750、2800、2850、2900、2950、3000、
3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400个或更多个连续核苷酸，所述的连续核苷酸是实施例部分的表A6中给出的任一个核酸序列或是编码在实施例部分的表A6中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQ ID NO：261或SEQ ID NO：263的核酸的一部分。优选地，该部分编码下述氨基酸序列的片段，其中所述氨基酸序列在构建系统树中使用时，与包含如SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：264所代表的氨基酸序列的YRP4多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
3050、3100、3150、3200、3250、3300、3350、3400个或更多个连续核苷酸，所述的连续核苷酸是实施例部分的表A6中给出的任一个核酸序列或是编码在实施例部分的表A6中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQ ID NO：261或SEQ ID NO：263的核酸的一部分。优选地，该部分编码下述氨基酸序列的片段，其中所述氨基酸序列在构建系统树中使用时，与包含如SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：264所代表的氨基酸序列的YRP4多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0342] 就SPX-RING多肽而言，在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的SPX-RING多肽，并且基本上具有与实施例部分的表A7中所给出氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该部分是在实施例部分的表A7中给出的任一种核酸的一部分，或是编码在实施例部分的表A7中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选地，该部分的长度是至少100、200、300、400、500、550、600、650、700、750、800、850、
900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550个连续核苷酸，所述连续核苷酸属于实施例部分的表A7中给出的任一个核酸序列或属于编码在实施例部分的表A7中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQ ID NO：270的核酸的一部分。优选地，该部分编码了包含下述基序的蛋白质片段，所述的基序以优选性升序与如表D1中所述的任一个或多个基序具有至少50％、51％、
52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、
67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或99％总体序列同一性。
900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550个连续核苷酸，所述连续核苷酸属于实施例部分的表A7中给出的任一个核酸序列或属于编码在实施例部分的表A7中所给出任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQ ID NO：270的核酸的一部分。优选地，该部分编码了包含下述基序的蛋白质片段，所述的基序以优选性升序与如表D1中所述的任一个或多个基序具有至少50％、51％、
52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、
67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或99％总体序列同一性。
[0343] 在本发明方法中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下、优选在严格条件下与编码如本文中所定义的CRSP33样多肽或MCB多肽或SRT2多肽或YRP2多肽或YRP3多肽或YRP4多肽或SPX-RING多肽的核酸或与如本文中定义的部分杂交的核酸。
[0344] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状和/或非生物胁迫耐受性的方法，包括在植物中导入并表达能够与实施例部分的表A1至A7中给出的任一种核酸杂交的核酸，或包括在植物中导入并表达这样的核酸，它能够与编码在实施例部分的表A中给出的任一核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。
[0345] 就CRSP33样多肽而言，在本发明方法中有用的杂交序列编码了如本文中定义的CRSP33样多肽，所述的CRSP33样多肽基本上具有与实施例部分表A1中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例部分的表A1中给出的任一种核酸的互补序列或与这些序列中任一者的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补序列杂交，其中所述的核酸编码在实施例部分的表A1中给出的任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3所代表的核酸的互补序列或与其一部分杂交。
[0346] 优选地，该杂交序列编码具有下述氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列是全长的并且在构建系统树(如图2中描绘的一个系统树)中使用时，与包含如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所代表的氨基酸序列的CRSP33样多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0347] 就MCB多肽而言，在本发明方法中有用的杂交序列编码了如本文中定义的MCB多肽，所述的MCB多肽具有基本上与实施例部分表A2中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例部分的表A2中给出的任一种核酸的互补序列或与这些序列中任一者的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补序列杂交，其中所述的核酸编码在实施例部分的表A2中给出的任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：44所代表的核酸的互补序列或与其一部分杂交。
[0348] 优选地，该杂交序列编码了具有包含下述序列的氨基酸序列的多肽，所述序列以优选性升序与表A2的任一氨基酸序列、优选地与SEQ ID NO：45所代表的序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、
45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、
60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％总体序列同一性。
45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、
60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％总体序列同一性。
[0349] 就SRT2多肽而言，在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的SRT2多肽，所述的SRT2多肽基本上具有与实施例部分表A3中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例部分的表A3中给出的任一种核酸的互补序列或与这些序列中任一者的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补序列杂交，其中所述的核酸编码在实施例部分的表A3中给出的任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：198所代表的核酸的互补序列或与其一部分杂交。
[0350] 优选地，该杂交序列编码了具有下述氨基酸序列的片段，其中所述氨基酸序列在构建如Hollender和Lieu 2008年所述并且列于下文的全部18种拟南芥HDAC多肽的系统树中使用时，与代表拟南芥SRT2多肽的SRT1或SRT2多肽聚类，而不与任何其他多肽聚类。
[0351] 就YRP2多肽而言，在本发明方法中有用的杂交序列编码了如本文中定义的YRP2多肽，所述的YRP2多肽基本上具有与实施例部分表A4中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与表A4中给出的任一种核酸的互补序列或与这些序列中任一者的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补序列杂交，其中所述的核酸编码在实施例部分的表A4中给出的任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：237或SEQ ID NO：239所代表的核酸的互补序列或与其一部分杂交。
[0352] 优选地，该杂交序列编码了具有下述氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列是全长的并且在构建系统树中使用时，与包含如SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：238或SEQ ID NO：240所代表的氨基酸序列的YRP2多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0353] 就YRP3多肽而言，在本发明方法中有用的杂交序列编码了如本文中定义的YRP3多肽，所述的YRP3多肽基本上具有与实施例部分的表A5中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与表A5中给出的任一种核酸的互补序列或与这些序列中任一者的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补序列杂交，其中所述的核酸编码在表A5中给出的任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：244、SEQ IDNO：246、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：252或SEQ IDNO：254所代表的核酸的互补序列或与其一部分杂交。
[0354] 优选地，该部分编码具有下述氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列是全长的并且在构建系统树中使用时，与包含SEQ ID NO：245、SEQ IDNO：247、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：253或SEQ IDNO：255所代表的氨基酸序列的YRP3多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0355] 就YRP4多肽而言，在本发明方法中有用的杂交序列编码了如本文中定义的YRP4多肽，所述的YRP4多肽基本上具有与实施例部分的表A6中给出的氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与表A6中给出的任一种核酸的互补序列或与这些序列中任一者的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补序列杂交，其中所述的核酸编码在表A6中给出的任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：261或SEQ IDNO：263所代表的核酸的互补序列或与其一部分杂交。
[0356] 优选地，该杂交序列编码了具有下述氨基酸序列的多肽，其中所述氨基酸序列是全长的并且在构建系统树中使用时，与包含如SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：264所代表的氨基酸序列的YRP4多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0357] 就SPX-RING多肽而言，在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的SPX-RING多肽，所述的SPX-RING多肽基本上具有与实施例部分的表A7中所给出氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例部分的表A7中给出的任一种核酸的互补序列或与这些序列中任一者的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或该杂交序列能够与下述核酸的互补序列杂交，其中所述的核酸编码在实施例部分的表A7中给出的任一个氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物。最优选地，该杂交序列能够与如SEQ ID NO：270所代表的核酸的互补序列或与其一部分杂交。
[0358] 优选地，该杂交序列编码了包含下述基序的多肽，所述基序以优选性升序与如表D1中所述的任一个或多个基序具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性。
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性。
[0359] 在本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文中所定义的CRSP33样多肽或MCB多肽或SRT2多肽或YRP2多肽或YRP3多肽或YRP4多肽或SPX-RING多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。
[0360] 根据本发明，提供用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达实施例部分的表A1至A7中给出的任一个核酸序列的剪接变体或下述核酸的剪接变体，其中所述的核酸编码在实施例部分的表A1至A7中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物。
[0361] 就CRSP33样多肽而言，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：3所代表的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由所述剪接变体编码的氨基酸序列在构建系统树(如图2中描绘的一个系统树)中使用时，与包含如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所代表氨基酸序列的CRSP33样多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0362] 就MCB多肽而言，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：44所代表的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO：45的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由所述剪接变体编码的氨基酸序列包含了以优选性升序与表A2的任一氨基酸序列、优选地与SEQ ID NO：45所代表的序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、
55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％总体序列同一性的序列。
55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％总体序列同一性的序列。
[0363] 就SRT2多肽而言，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：198所代表的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO：199的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由所述剪接变体编码的氨基酸序列在构建如Hollender和Lieu 2008年所述并且列于下文的全部18种拟南芥HDAC多肽的系统树中使用时，与代表拟南芥SRT2多肽的SRT1或SRT2多肽聚类，而不与任何其他多肽聚类。
[0364] 就YRP2多肽而言，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：237或SEQ ID NO：239中任一者所代表的核酸的剪接变体，或是编码SEQID NO：236、SEQ ID NO：238或SEQ ID NO：240中任一者的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由所述剪接变体编码的氨基酸序列在构建系统树中使用时，与包含SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：238或SEQ ID NO：240所代表的氨基酸序列的YRP2多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0365] 就YRP3多肽而言，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：252或SEQ ID NO：254中任一者所代表的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO：245、SEQID NO：247、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：253或SEQID NO：255中任一者的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由所述剪接变体编码的氨基酸序列在构建系统树中使用时，与包含如SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：253或SEQ ID NO：255所代表的氨基酸序列的YRP3多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0366] 就YRP4多肽而言，优选的剪接变体是由SEQ ID NO：261或SEQ IDNO：263中任一者所代表的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：264中任一者的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由所述剪接变体编码的氨基酸序列在构建系统树中使用时，与包含如SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：264所代表的氨基酸序列的YRP4多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0367] 优选的剪接变体是由SEQ ID NO：270所代表的核酸的剪接变体，或是编码SEQ ID NO：271的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由所述剪接变体编码的氨基酸序列包含以优选性升序与如表D1中所述的任一个或多个基序具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、
67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或99％总体序列同一性的基序。
67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或99％总体序列同一性的基序。
[0368] 在实施本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文中所定义的CRSP33样多肽或MCB多肽或SRT2多肽或YRP2多肽或YRP3多肽或YRP4多肽或SPX-RING多肽的核酸的等位变体，等位变体如本文中定义。
[0369] 根据本发明，提供用于增强植物中产量相关性状和/或非生物胁迫耐受性的方法，包括在植物中导入并表达在实施例部分的表A1至A7中给出的任一种核酸的等位变体，或包括在植物中导入并表达下述核酸的等位变体，其中所述核酸编码在实施例部分的表A1至A7中给出的任一个氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物。
[0370] 就CRSP33样多肽而言，由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上具有与SEQ ID NO：2的CRSP33样多肽和在实施例部分的表A1中描述的任一氨基酸相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3的等位变体或是编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由所述等位变体编码的氨基酸序列在构建系统树(如图2中描绘的一个系统树)中使用时，与包含如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4所代表氨基酸序列的CRSP33样多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0371] 就MCB多肽而言，由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上具有与SEQ ID NO：45的MCB多肽和在实施例部分的表A2中描述的任一氨基酸相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是SEQ IDNO：44的等位变体或编码SEQ ID NO：45的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由所述等位变体编码的氨基酸序列包含了以优选性升序与表A2的任一氨基酸序列、优选地与SEQ ID NO：45所代表的序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、
48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、
63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％总体序列同一性的序列。
48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、
63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％，或99％总体序列同一性的序列。
[0372] 就SRT2多肽而言，由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上具有与SEQ ID NO：199的SRT2多肽和在实施例部分的表A3中描述的任一氨基酸相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是SEQ IDNO：198的等位变体或编码SEQ ID NO：199的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由所述等位变体编码的氨基酸序列在构建如Hollender和Lieu 2008年所述并且列于下文的全部18种拟南芥HDAC多肽的系统树中使用时，与代表拟南芥SRT2多肽的SRT1或SRT2多肽聚类，而不与任何其他多肽聚类。
[0373] 就YRP2多肽而言，由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上具有与SEQ ID NO：236的YRP2多肽或在实施例部分的表A4中描述的任一氨基酸相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是SEQ IDNO：235、SEQ ID NO：237或SEQ ID NO：239中任一者的等位变体或是编码SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：238或SEQ ID NO：240的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由所述等位变体编码的氨基酸序列在系统树中与包含如SEQ ID NO：
236、SEQ ID NO：238或SEQ IDNO：240所代表的氨基酸序列的YRP2多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
236、SEQ ID NO：238或SEQ IDNO：240所代表的氨基酸序列的YRP2多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0374] 就YRP3多肽而言，由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上具有与SEQ ID NO：245的YRP3多肽或在实施例部分的表A5中描述的任一氨基酸相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是SEQ IDNO：244、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：250、SEQ IDNO：
252或SEQ ID NO：254中任一者的等位变体，或是编码SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：253或SEQ ID NO：255的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由所述等位变体编码的氨基酸序列在系统树中与包含如SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：253或SEQ ID NO：255所代表的氨基酸序列的YRP3多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
252或SEQ ID NO：254中任一者的等位变体，或是编码SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：253或SEQ ID NO：255的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由所述等位变体编码的氨基酸序列在系统树中与包含如SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：253或SEQ ID NO：255所代表的氨基酸序列的YRP3多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0375] 就YRP4多肽而言，由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上具有与SEQ ID NO：262的YRP4多肽或在实施例部分的表A6中描述的任一氨基酸相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是SEQ IDNO：261或SEQ ID NO：263中任一者的等位变体或是编码SEQ ID NO：
262或SEQ ID NO：264的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由所述等位变体编码的氨基酸序列在系统树中与包含如SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：264所代表的氨基酸序列的YRP4多肽聚类，而不与任何其他组聚类。
262或SEQ ID NO：264的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由所述等位变体编码的氨基酸序列在系统树中与包含如SEQ ID NO：262或SEQ ID NO：264所代表的氨基酸序列的YRP4多肽聚类，而不与任何其他组聚类。
[0376] 就SPX-RING多肽而言，由本发明方法中有用的等位变体编码的多肽基本上具有与SEQ ID NO：271的SPX-RING多肽和在实施例部分的表A7中描述的任一氨基酸相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括使用这些天然的等位基因。优选地，该等位变体是SEQ ID NO：270的等位变体或编码SEQ ID NO：271的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由所述等位变体编码的氨基酸序列包含以优选性升序与如表D1中所述的任何一个或多个基序具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性的基序。
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性的基序。
[0377] 基因改组或定向进化法也可以用来产生编码如上文所定义的CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸的变体，术语“基因改组”如本文中定义。
[0378] 根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状和/或非生物胁迫耐受性的方法，包括在植物中导入并表达在实施例部分的表A1至A7中给出的任一个核酸序列的变体，或包括在植物中导入并表达下述核酸的变体，所述的核酸编码在实施例部分的表A1至A7中给出的任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物，其中所述的变体核酸通过基因改组获得。
[0379] 就CRSP33样多肽而言，优选地，由基因改组获得的变体核酸所编码的氨基酸序列在构建系统树(如图2中所描绘的一个系统树)中使用时，与包含如SEQ ID NO：4所代表的氨基酸序列的CRSP33样多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0380] 就MCB样多肽而言，优选地，由基因改组获得的变体核酸所编码的氨基酸序列包含了以优选性升序与表A2的任一氨基酸序列、优选地与SEQID NO：45所代表的序列具有至少30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、
60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性的序列。
60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性的序列。
[0381] 就SRT2多肽而言，优选地，由基因改组获得的变体核酸所编码的氨基酸序列在构建如Hollender和Lieu 2008年所述并且列于下文的全部18种拟南芥HDAC多肽的系统树中使用时，与代表拟南芥SRT2多肽的SRT1或SRT2多肽聚类，而不与任何其他多肽聚类。
[0382] 就YRP2多肽而言，优选地，由基因改组获得的变体核酸所编码的氨基酸序列在构建系统树中使用时，与包含如SEQ ID NO：236、SEQ ID NO：238或SEQ ID NO：240所代表的氨基酸序列的YRP2多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0383] 就YRP3多肽而言，优选地，由基因改组获得的变体核酸所编码的氨基酸序列在构建系统树中使用时，与包含如SEQ ID NO：245、SEQ ID NO：247、SEQ ID NO：249、SEQ ID NO：251、SEQ ID NO：253或SEQ ID NO：255所代表的氨基酸序列的YRP3多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0384] 就YRP4多肽而言，优选地，由基因改组获得的变体核酸所编码的氨基酸序列在构建系统树中使用时，与包含如SEQ ID NO：262或SEQ IDNO：264所代表的氨基酸序列的YRP4多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
[0385] 就SPX-RING多肽而言，优选地，由基因改组获得的变体核酸所编码的氨基酸序列以优选性升序与如表D1中所述的任一个或多个基序具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、
69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％总体序列同一性的基序。
69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或
99％总体序列同一性的基序。
[0386] 另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见方法是基于PCR的方法(Current Protocols in Molecular Biology.Wiley编著)。
[0387] 编码CRSP33样多肽的核酸可以衍生自任何天然或人工的来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式修饰而来。优选地，编码CRSP33样多肽的核酸来自植物，还优选来自双子叶植物，更优选来自茄科，最优选地，该核酸来自番茄。
[0388] 编码MCB多肽的核酸可以来自任何天然或人工的来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式修饰而来。优选地，编码MCB多肽的核酸来自植物，还优选地来自单子叶植物，更优选地来自小麦属物种，最优选地来自普通小麦。
[0389] 编码SRT2多肽的核酸可以衍生自任何天然或人工的来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式修饰而来。优选地，编码SRT2多肽的核酸来自植物，还优选地来自单子叶植物，更优选地来自禾本科(Poaceae)，最优选地该核酸来自稻。
[0390] 编码YRP2多肽的核酸可以衍生自任何天然或人工的来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式修饰而来。优选地，编码YRP2多肽的核酸来自植物，还优选地来自苔藓、单子叶植物或双子叶植物，更优选地来自葫芦藓科(Funariaceae)、禾本科或豆科(Fabaceae)。
[0391] 编码YRP3多肽的核酸可以衍生自任何天然或人工的来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式修饰而来。优选地，编码YRP3多肽的核酸来自植物，还优选地来自苔藓、单子叶植物或双子叶植物，更优选地来自葫芦藓科、杨柳科(Salicaceae)或禾本科。
[0392] 编码YRP4多肽的核酸可以衍生自任何天然或人工的来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式修饰而来。优选地，编码YRP4多肽的核酸来自植物，还优选地来自单子叶植物或双子叶植物，更优选地来自禾本科或茄科。
[0393] 编码SPX-RING多肽的核酸可以衍生自任何天然或人工的来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式修饰而来。优选地，编码SPX-RING多肽的核酸来自植物，还优选地来自单子叶植物，更优选地来自禾本科，最优选地，该核酸来自稻。
[0394] 就CRSP33样多肽或MCB多肽或SRT2多肽或SPX-RING多肽而言，本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状的植物。尤其，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有增加的产量、特别是增加的种子产量的植物。术语“产量”和“种子产量”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
[0395] 就YRP2多肽、YRP3多肽或YRP4多肽而言，本发明方法的实施产生了具有针对非生物胁迫的增强耐受性的植物。
[0396] 本文中对增强的产量相关性状的谈及意指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获)部分和/或地下(可收获)部分。尤其，这类可收获的部分是种子，并且本发明方法的实施产生了相对于对照植物的种子产量而言，具有增加的绿色生物量和/或增加的早期萌发势和/或增加的种子产量。
[0397] 以玉米为例，产量增加可以表现为下列一种或多种指标：每平方米生长的(establish)植物数的增加、每株植物穗数的增加、行数的增加、每行粒数、粒重、千粒重、穗长度/直径、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)及其他。以稻为例，产量增加本身可以表现为下列一种或多种指标的增加：每平方米植物数、每株植物圆锥花序数、每圆锥花序小穗数、每圆锥花序花(小花)数(其表达为饱满种子数对主圆锥花序数之比)、种子饱满率的增加(其中种子饱满率是饱满种子数除以种子总数并乘以100)、千粒重的增加等等。
[0398] 就非生物胁迫耐受性而言，本发明提供了用于相对于对照植物增强植物中胁迫耐受性的方法。该方法包括调节植物中编码如本文中所定义的YRP2多肽或YRP3多肽或YRP4多肽的核酸的表达。
[0399] 植物一般通过生长得更慢而对暴露于胁迫作出应答。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻微胁迫在本文中定义为植物暴露的任何胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长而没有恢复生长的能力。与非胁迫条件下的对照植物相比，轻微胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物生长降低小于40％、35％、30％或25％，更优选小于20％或15％。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)上的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻微胁迫诱导的受损生长往往是农业上不希望的特征。“轻微胁迫”是植物暴露的常见生物和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过多的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、冷或冰冷温度所致。非生物胁迫可以是由水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫通常是病原体，如细菌、病毒、真菌、线虫和昆虫引起的那些胁迫。
[0400] 具体地，本发明的方法可以在(轻微)干旱条件下进行以产生相对于对照植物具有增加的产量的植物。如在Wang等(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致不利地影响植物生长及生产力的一系列形态学变化、生理学变化、生物化学变化和分子变化。已知干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫是相互联系的并可以通过相似机制而诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等(Plant Physiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫间极高程度的“串话”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以造成功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白质、上调抗氧化物质、积累相容性溶质和生长抑制。本文中所用的术语”非胁迫”条件是允许植物最佳生长的环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。具有最佳生长条件的植物(在非生物胁迫条件下生长)在给定环境中通常产生该植物平均产量的按优选性升序至少97％、95％、92％、90％、87％、85％、83％、
80％、77％或75％。可在收获和/或季节基础上计算平均产量。本领域技术人员清楚作物的平均产量生产。
80％、77％或75％。可在收获和/或季节基础上计算平均产量。本领域技术人员清楚作物的平均产量生产。
[0401] 本发明方法的实施相对于在相当条件下生长的对照植物，赋予在(轻微)干旱条件下生长的植物增强的干旱耐受性。因此，根据本发明，提供用于在(轻微)干旱条件下生长的植物中增强干旱耐受性的方法，该方法包括调节植物中编码YRP2多肽或YRP3多肽或YRP4多肽的核酸的表达。
[0402] 相对于对照植物，本发明方法的实施赋予营养缺乏条件下、尤其缺氮条件下培育的植物针对由营养缺乏所引起的胁迫的增强耐受性。因此，根据本发明，提供了用于增强针对由营养缺乏所致胁迫的耐受性的方法，该方法包括调节植物中编码YRP2多肽或YRP3多肽或YRP4多肽的核酸的表达。营养缺乏可以因缺少养分如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镁、锰、铁和硼及其他元素所致。
[0403] 相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予盐胁迫条件下培育的植物增强的盐耐受性。因此，根据本发明，提供了用于增强在盐胁迫条件下培育的植物中盐耐受性的方法，该方法包括调节植物中编码YRP2多肽或YRP3多肽或YRP4多肽的核酸的表达。术语“盐胁迫”不限于食盐(NaCl)，而是可以是NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2连同其他盐中的任一种或多种。
[0404] 就产量相关性状而言，本发明提供了用于相对于对照植物增加植物产量、尤其种子产量的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文中定义的CRSP33样多肽或MCB多肽或SRT2多肽或SPX-RING多肽的核酸的表达。
[0405] 因为本发明的转基因植物具有增加的产量，所以这些植物可能显示出相对于对照植物在其生命周期的对应阶段的生长速率增加的生长速率(在至少部分其生命周期中)。
[0406] 增加的生长速率可以对于植物的一个或多个部分(包括种子)是特异性的，或可以基本上遍及整株植物。具有增加的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以视为意指从干燥成熟种子成长至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受下列因素影响，如萌发速度、早期萌发势、生长速率、绿色指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的增加可以在植物生活周期中的一个或多个阶段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。在植物生活周期中的早期期间增加的生长速率可以反映增强的萌发势。生长速率的增加可以改变植物的收获周期，允许植物较晚播种和/或较早收获，否则这将不可能(相似的作用可以用较早的开花时间获得)。若生长速率足够地增加，可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部过程均在一个常规生长期内)。类似地，若生长速率足够地增加，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获玉米植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适植物)。从相同的根茎中收获额外次数在一些作物植物的情况中也是可能的。改变植物的收获周期可以导致每平方米的年生物量产量的增加(因任何特定植物可以生长并收获的次数(如在一年中)增加)。生长速率的增加也可以允许比其野生型对应物在更广泛的地理区域内培育转基因植物，因为对培育作物的区域限制往往由栽种时节(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件所决定。若缩短收获周期，则可以避开这类不利条件。生长速率可以通过从生长曲线中得到多种参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到其50％最大尺寸所花费的时间)和T-90(植物达到其90％最大尺寸所花费的时间)等。
[0407] 根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生相对于对照植物而具有增加的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供增加植物生长速率的方法，所述方法包括调节植物中核酸的表达，所述核酸编码本文中所定义的CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或SPX-RING多肽。
[0408] 相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加非胁迫条件下或轻度干旱条件下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码CRSP33样多肽或MCB多肽或SRT2多肽或SPX-RING多肽的核酸的表达。
[0409] 相对于可比较条件下生长的对照植物，本发明方法的实施给予在养分缺乏条件下、尤其缺氮条件下培育的植物提高的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加养分缺乏条件下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或SPX-RING多肽的核酸的表达。养分缺乏可以因缺少养分如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镁、锰、铁和硼及其他元素所致。
[0410] 相对于可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施给予盐胁迫条件下培育的植物增加的产量。因此，根据本发明，提供了用于增加盐胁迫条件下培育的植物中产量的方法，所述方法包括调节植物中编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或SPX-RING多肽的核酸表达。术语“盐胁迫”不限于食盐(NaCl)，不过可以是NaCl、KCl、LiCl、MgCl2、CaCl2连同其他盐中的任一种或多种。
[0411] 本发明包括通过本发明方法可获得的植物或其部分(包括种子)。植物或其部分包含了如上文所定义的编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸转基因。
[0412] 本发明也提供遗传构建体和载体以促进在植物中导入和/或表达编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸。所述遗传构建体可以插入适于转化至植物中并适于在转化的细胞中表达目的基因的载体，所述载体可以是市售的。本发明也提供如本文中定义的遗传构建体在本发明方法中的用途。
[0413] 更具体地，本发明提供构建体，其包含：
[0414] a)编码如上文所定义的CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸；
[0415] (b)一个或多个能够驱动(a)的核酸序列表达的调控序列；和任选地
[0416] (c)转录终止序列。
[0417] 优选地，编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸如上文所定义。术语“调控序列”和“终止序列”如本文中定义。
[0418] 植物用包含上述任一核酸的载体转化。技术人员非常清楚必须存在于所述载体上以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。此目的序列有效地连于一个或多个调控序列(至少与启动子)。
[0419] 有利地，任一类型的启动子，不管是天然还是合成的，都可以用于驱动核酸序列的表达，但优选地所述启动子是植物来源。组成型启动子尤其可用于方法中。优选地，组成型启动子也是中等强度的遍在启动子。见本文“定义”章节中关于多种启动子类型的定义。在本发明方法中也有用的是根特异性启动子。
[0420] 就CRSP33样多肽而言，应当明白本发明的适用性不限于由SEQ IDNO：1代表的编码CRSP33样多肽的核酸，本发明的适用性也不限于编码CRSP33样多肽的核酸受组成型启动子驱动时的表达。
[0421] 所述组成型启动子优选地是中等强度的启动子，更优选地选择自植物衍生的启动子，如GOS2启动子，更优选地是来自稻的GOS2启动子。还优选地，所述组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：43相似的核酸序列代表，最优选地，所述组成型启动子如SEQ ID NO：43所代表。对于组成型启动子的其他例子，见本文中的“定义”部分。
[0422] 任选地，可以在导入植物内的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选地，该构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQ ID NO：43相似的GOS2启动子和编码CRSP33样多肽的核酸。
[0423] 就MCB多肽而言，应当明白本发明的适用性不限于由SEQ ID NO：44代表的编码MCB多肽的核酸，本发明的适用性也不限于编码MCB多肽的核酸受组成型启动子驱动时的表达。
[0424] 所述组成型启动子优选地是中等强度的启动子，更优选地选择自植物衍生的启动子，如GOS2启动子，更优选地是来自稻的GOS2启动子。还优选地，所述组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：197相似的核酸序列代表，最优选地，所述组成型启动子如SEQ ID NO：197所代表。对于组成型启动子的其他例子，见本文中的“定义”部分。
[0425] 任选地，可以在导入植物内的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选地，该构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQ ID NO：197相似的GOS2启动子和编码MCB多肽的核酸。
[0426] 就SRT2多肽而言，应当明白本发明的适用性不限于由SEQ ID NO：198代表的编码SRT2多肽的核酸，本发明的适用性也不限于编码SRT2多肽的核酸受组成型启动子驱动时的表达。
[0427] 所述组成型启动子优选地是中等强度的启动子，更优选地选择自植物衍生的启动子，如GOS2启动子，更优选地是来自稻的GOS2启动子。还优选地，所述组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：230相似的核酸序列代表，最优选地，所述组成型启动子如SEQ ID NO：230所代表。对于组成型启动子的其他例子，见本文中的“定义”部分。
[0428] 任选地，可以在导入植物内的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选地，该构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQ ID NO：230相似的(名称)启动子和编码SRT2多肽的核酸。
[0429] 就YRP2多肽而言，应当明白本发明的适用性不限于由SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：237或SEQ ID NO：239代表的编码YRP2多肽的核酸，本发明的适用性也不限于编码YRP2多肽的核酸受组成型启动子驱动时的表达。
[0430] 所述组成型启动子优选地是中等强度的启动子，更优选地选择自植物衍生的启动子，如GOS2启动子，更优选地是来自稻的GOS2启动子。还优选地，所述组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：241相似的核酸序列代表，最优选地，所述组成型启动子如SEQ ID NO：241所代表。对于组成型启动子的其他例子，见本文中的“定义”部分。
[0431] 任选地，可以在导入植物内的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选地，该构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQ ID NO：241相似的(GOS2)启动子和编码YRP2多肽的核酸。
[0432] 就YRP3多肽而言，应当明白本发明的适用性不限于由SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：252或SEQ ID NO：254代表的编码YRP3多肽的核酸，本发明的适用性也不限于编码YRP3多肽的核酸受组成型启动子驱动时的表达。
[0433] 所述组成型启动子优选地是中等强度的启动子，更优选地选择自植物衍生的启动子，如GOS2启动子，更优选地是来自稻的GOS2启动子。还优选地，所述组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：256相似的核酸序列代表，最优选地，所述组成型启动子如SEQ ID NO：256所代表。对于组成型启动子的其他例子，见本文中的“定义”部分。
[0434] 任选地，可以在导入植物内的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选地，该构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQ ID NO：256相似的(GOS2)启动子和编码YRP3多肽的核酸。
[0435] 就YRP4多肽而言，应当明白本发明的适用性不限于由SEQ ID NO：261或SEQ ID NO：263代表的编码YRP4多肽的核酸，本发明的适用性也不限于编码YRP4多肽的核酸受组成型启动子驱动时的表达。
[0436] 所述组成型启动子优选地是中等强度的启动子，更优选地选择自植物衍生的启动子，如GOS2启动子，更优选地是来自稻的GOS2启动子。还优选地，所述组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：265相似的核酸序列代表，最优选地，所述组成型启动子如SEQ ID NO：265所代表。对于组成型启动子的其他例子，见本文中的“定义”部分。
[0437] 任选地，可以在导入植物内的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选地，该构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQ ID NO：265相似的(GOS2)启动子和编码YRP4多肽的核酸。
[0438] 就SPX-RING多肽而言，应当明白本发明的适用性不限于由SEQ IDNO：270代表的编码SPX-RING多肽的核酸，本发明的适用性也不限于编码SPX-RING多肽的核酸受组成型启动子驱动时的表达。
[0439] 所述组成型启动子优选地是中等强度的启动子，更优选地选择自植物衍生的启动子，如GOS2启动子，更优选地是来自稻的GOS2启动子。还优选地，所述组成型启动子由基本上与SEQ ID NO：447相似的核酸序列代表，最优选地，所述组成型启动子如SEQ ID NO：447所代表。对于组成型启动子的其他例子，见本文中的“定义”部分。
[0440] 任选地，可以在导入植物内的构建体中使用一个或多个终止子序列。优选地，该构建体包含这样的表达盒，其包含基本上与SEQ ID NO：447相似的(GOS2)启动子和编码SPX-RING多肽的核酸。
[0441] 额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员会知道可以在实施本发明中适用的终止子序列和增强子序列。内含子序列也可以添加至5′非翻译区(UTR)或编码序列上，以增加在胞浆内积累的成熟信息的量，如定义部分中所述。其他控制序列(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区之外)可以是蛋白质和/或RNA稳定元件。本领域技术人员会知道或可以轻易地获得此类序列。
[0442] 本发明的遗传构建体还可以包括在特定细胞类型中维持和/或复制所需的复制起点序列。一个实例是当需要将遗传构建体在细菌细胞中维持为附加型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)时。优选的复制起点包括，但不限于f1-ori和colE1。
[0443] 为检测如在本发明方法中所用核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因而，遗传构建体可以任选地包含选择性标记基因。文中的“定义”部分更加详细的描述了选择性标记。标记基因一旦不再需要可以从转基因细胞中除去或者切除。用于标记去除的技术是本领域公知的，有用的技术在上文定义部分中描述。
[0444] 本发明也提供了用于产生相对于对照植物具有增强的产量相关性状和/或非生物胁迫耐受性的转基因植物的方法，包含在植物中导入并表达编码如上文中所定义的CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的任一核酸。
[0445] 更具体地，本发明提供用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有增强的产量相关性状、尤其增加的(种子)产量，所述方法包括：
[0446] (i)在植物或植物细胞中导入并表达编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或SPX-RING多肽的核酸；和
[0447] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
[0448] (i)的核酸可以是能够编码如本文中所定义的CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或SPX-RING多肽的任一核酸。
[0449] 更具体地，本发明也提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有增强的非生物胁迫耐受性、尤其增加的(轻微)干旱耐受性，所述方法包括：
[0450] (i)在植物或植物细胞中导入并表达编码YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽的核酸；和
[0451] (ii)在非生物胁迫条件下培育植物细胞。
[0452] (i)的核酸可以是能够编码如本文中定义的YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽的任一核酸。
[0453] 该核酸可以直接地导入植物细胞中或导入植物自身(包括导入组织、器官或植物的任何其他部分)中。根据本发明的优选特征，该核酸优选地通过转化导入植物中。在本文中的“定义”部分中更详细地描述了术语“转化”。
[0454] 遗传修饰的植物细胞可通过本领域技术人员熟悉的所有方法再生。合适的方法可见于S.D.Kung和R.Wu、Potrykus或 和Willmitzer的上述出版物。
[0455] 通常在转化后，选择一种或多种标记存在的植物细胞或细胞群体，其中所述的标记由与目的基因一起共转移的植物可表达的基因编码，随后将转化的材料再生成整株植物。为了选择转化的植物，在转化中获得的植物材料原则上接受选择条件处理，以至于转化的植物可以与未转化的植物区分。例如，以上文所述方式获得的种子可以播种，在初始培育时期后，通过喷雾进行合适的选择。另一种可能性包括在使用合适选择剂的琼脂平板上生长种子(根据需要在消毒之后)，使得仅转化的种子可以生长成植物。或者，转化的植物通过上述那些选择性标记的存在筛选。
[0456] 在DNA转移和再生后，推测的转化植物可以例如使用Southern分析对目的基因的存在、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选或额外地，新引入DNA的表达水平可以使用Northern和/或Western分析进行监测，这两种技术是本领域技术人员众所周知的。
[0457] 产生的转化植物可以通过多种方法加以增殖，如通过克隆增殖法或经典育种技术。例如，第一代(或T1)转化植物可以进行自交，选择纯合的第二代(或T2)转化体，并且T2植物通过经典育种技术进一步增殖。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆转化体(例如被转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和未转化组织的移植体(例如在植物中，与未转化嫩枝嫁接的转化的根状茎)。
[0458] 本发明明确地扩展至通过文中所述的任意方法产生的任何植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明进一步扩展至包含已经通过任意前述方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或整株植物的后代，唯一要求是后代表现与通过本发明方法中的亲代所产生的那些后代相同的一种或多种基因型特征和/或表型特征。
[0459] 本发明也包括这样的宿主细胞，它们包含了编码如上文所定义的CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的分离的核酸。根据本发明优选的宿主细胞是植物细胞。对于本发明方法中所用的核酸或载体、表达盒或构建体或载体而言，宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中使用的多肽的全部植物。
[0460] 本发明的方法有利地适用于任一植物。特别用于本发明方法中的植物包括属于植物界超家族的全部植物，尤其是单子叶植物和双子叶植物，包括饲用或饲料豆类、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明优选的实施方案，植物是作物植物。作物植物的实例包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，植物是单子叶植物。单子叶植物的实例包括甘蔗。更优选地，植物是谷物。谷物的实例包括稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属植物、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
[0461] 本发明也扩展至植物的可收获部分如，但不限于种子、叶、果实、花、茎、根、根状茎、块茎和球茎，所述可收获部分包含编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的重组核酸。本发明进一步涉及来自、优选直接来自此类植物的可收获部分中的产物，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪及脂肪酸、淀粉或蛋白质。
[0462] 根据本发明优选的特征，受调控的表达是增加的表达。在本领域内详细记载了用于增加核酸或基因、或基因产物表达的方法并且实例在定义部分中提供。
[0463] 如上文所提及，用于调节编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸表达的优选方法是在植物中导入并表达编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸；然而使用其他熟知的技术，包括但不限于T-DNA活化标签法、TILLING、同源重组，也可以实现实施该方法的效果，即增强产量相关性状和/或非生物胁迫耐受性。在定义部分中提供对这些技术的描述。
[0464] 本发明也包括编码如本文中所述的CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽或SPX-RING多肽的核酸的用途和这些CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或SPX-RING多肽的用途，用于植物中增强任一的前述产量相关性状。
[0465] 本发明也包括编码如本文中所述的YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽的核酸的用途和这些YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽的用途，用于植物中增强任一前述非生物胁迫耐受性。
[0466] 编码本文中所述的CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸或CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽本身可以用于育种程序中，其中DNA标记被鉴定，其中所述的DNA标记可以与编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的基因遗传连锁。所述的核酸/基因或者CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽本身可以用来定义一种分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状和/或非生物胁迫耐受性的植物。
[0467] 编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸/基因的等位变体也可以在标记辅助的育种程序中使用。此类育种程序有时需要使用例如EMS诱变通过植物的诱变处理引入等位基因变异；备选地，程序可以以一组非有意引起的所谓的“天然”来源的等位变体开始。然后例如通过PCR进行等位变体的鉴定。接着是选择具有所讨论序列并且得到提高的产量的优异等位变体的步骤。一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施选择。可以在温室中或田间监测生长性能。其他任选步骤包括将鉴定了优异等位变体的植物与另一种植物杂交。这可以用来例如产生目标表型特征的组合。
[0468] 编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸也可以作为探针用于对基因遗传或物理作图，所述探针作为所述基因的组成部分并且作为与这些基因连锁的性状的标记。此类信息可用于植物育种中旨在开发具有所希望表型的品系。编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸的这种用途仅需要至少15个核苷酸长度的核酸序列。编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸可以作为限制性片段长度多态性(RFLP)标记使用。可以用编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸探测限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹(Sambrook J，Fritsch EF和Maniatis T(1989)Molecular Cloning，A Laboratory Manual)。产生的结合图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等(1987)Genomics 1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。此外，该核酸可以用来探测含有经限制性内切核酸酶处理的一组个体的基因组DNA的DNA 印迹，其中所述的一组个体代表亲代和具有确定的遗传杂交的后代。DNA多态性的分离被标出并用来计算编码CRSP33样多肽、或MCB多肽、或SRT2多肽、或YRP2多肽、或YRP3多肽、或YRP4多肽、或SPX-RING多肽的核酸在使用这个群体先前所获得的遗传图中的位置(Botstein等(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
[0469] 在Bernatzky和Tanksley(1986)Plant Mol.Biol.Reporter 4：37-41中描述了植物基因衍生的探针的产生和其在遗传作图中的用途。众多出版物描述了使用以上所提及的方法学或其改良方法对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员众所周知的。
[0470] 所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalian Genomic Analyasis：A Practical Guide，Academic press 1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。
[0471] 在另一实施方案中，核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)Trends Genet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大型克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等(1995)Genome Res.5：13-20)，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
[0472] 用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸而实施。实例可见于文中的“定义”部分。实例包括等位基因特异性扩增(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med 11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等，(1993)Genomics 16：
325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等，(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等，(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook，(1989)Nucleic Acid Res.17：
6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。使用基于PCR的遗传作图的方法，可能需要鉴定跨越相应于本发明核酸序列区域作图的亲本之间DNA序列的差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。
325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等，(1988)Science 241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)Nucleic Acid Res.18：3671)、放射杂交作图(Walter等，(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图(Dear和Cook，(1989)Nucleic Acid Res.17：
6795-6807)。为实施这些方法，使用核酸序列设计和产生用于扩增反应或引物延伸反应的引物对。这类引物的设计是本领域技术人员众所周知的。使用基于PCR的遗传作图的方法，可能需要鉴定跨越相应于本发明核酸序列区域作图的亲本之间DNA序列的差异。然而，这对作图方法通常不是必要的。
[0473] 如前文所述，本发明方法产生了具有增强的产量相关性状和/或非生物胁迫耐受性的植物。这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增强性状、和/或如其他的增强非生物性胁迫或生物胁迫耐受性的性状、增强的产量相关性状和/或针对其他非生物性胁迫和生物胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
[0474] 项目：
[0475] 1.SP1激活必需辅因子(CRSP)多肽
[0476] 1.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码CRSP33样多肽的核酸表达，所述的CRSP33样多肽包含任一个或多个以下的基序：
[0477] 基序I：YPPPPPFYRLYK或基序，其以优选性升序具有与基序I具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高序列同一性的基序；
[0478] 基序II：QGVRQLYPKGP或基序，其以优选性升序具有与基序II具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高序列同一性的基序；
[0479] 基序III：LNRELQLHILELADVLVERPSQYARRVE或基序，其以优选性升序具有与基序III具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高序列同一性的基序；
[0480] 基序IV：IFKNLHHLLNSLRPHQARAT或基序，其以优选性升序具有与基序IV具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更高序列同一性的基序。
[0481] 2.根据项1所述的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并表达编码CRSP33样多肽的核酸实施。
[0482] 3.根据项1或项2所述的方法，其中所述编码CRSP33样多肽的核酸编码表A1中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与该核酸杂交的核酸。
[0483] 4.根据项1至项4任一项所述的方法，其中所述的核酸序列编码表A1中给出的任一蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
[0484] 5.根据任一的前述项所述的方法，其中所述的增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量、优选增加的种子产量。
[0485] 6.根据项1至项5任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
[0486] 7.根据项2至项6任一项所述的方法，其中所述的核酸有效连接于组成型启动子，优选地有效连接于GOS2启动子，最优选地有效连接于来自稻的GOS2启动子。
[0487] 8.根据项1至项7任一项所述的方法，其中所述编码CRSP33样多肽的核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，进一步优选地来自茄科，更优选地来自番茄。
[0488] 9.由根据项1至项8任一项所述的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码CRSP33样多肽的重组核酸。
[0489] 10.构建体，其包含：
[0490] (i)编码如项1中定义的CRSP33样多肽的核酸；
[0491] (ii)能够驱动(i)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
[0492] (iii)转录终止序列。
[0493] 11.根据项10所述的构建体，其中所述的调控序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。
[0494] 12.根据项10或项11的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的产量，尤其增加的种子产量。
[0495] 13.用根据项10或项11的构建体所转化的植物、植物部分或植物细胞。
[0496] 14.用于产生转基因植物的方法，所述的转基因植物相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的种子产量，包括：
[0497] (i)在植物中导入并表达编码如项1中定义的CRSP33样多肽的核酸；和
[0498] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
[0499] 15.转基因植物，其因编码如项1中定义的CRSP33样多肽的核酸的受调节表达而相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的种子产量，或从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞。
[0500] 16.根据项9、13或15的转基因植物或从其中衍生的转基因植物细胞，其中所述的植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属植物、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
[0501] 17.根据项16所述的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是种子。
[0502] 18.产物，从根据项16所述的植物和/或从根据项17所述的植物的可收获部分衍生。
[0503] 19.编码CRSP33样多肽的核酸在相对于对照植物增加产量、尤其在增加种子产量中的用途。
[0504] 2.Myb相关的CAB启动子结合(MCB)多肽
[0505] 1.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码MCB多肽的核酸表达。
[0506] 2.根据项1所述的方法，其中所述的MCB多肽包含一个或多个以优选性升序与任一个或多个以下基序具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的基序：
75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的基序：
[0507] (i)基序1：
[0508] WTEEEH[RK][KT]FL[AED]GL[ERK][QK]LGKGDWRGI[SA]K[NG]ASHAQKYFLRQTN(SEQ ID NO：188)；
[0509] (i)基序2：
[0510] P[GN][KM]KKRR[AS]SLFD[VM][GM][IPA][ARP][DEA][LGY][SHK][PD][ANTY](SEQ ID NO：189)；
[0511] (i)基序3：
[0512] [GLA][AGS][LST][GMP]Q[QSL][KS][RG][RK]RR[KR]AQ[ED]RKK[GA][IV]P(SEQID NO：190)；
[0513] (iv)基序4：
[0514] WTEEEHR[ML]FLLGLQKLGKGDWRGI[SA]RN[YF]V[VIT][ST]RTPTQVASHAQ KYFIRQ[ST]N(SEQ ID NO：191)；
[0515] (v)基序5：[RK]RKRRSSLFD[MI]V[AP]D[ED](SEQ ID NO：192)；
[0516] (vi)基序6：RRCSHC[SG][HN]NGHNSRT(SEQ ID NO：193)；
[0517] (vii)基序7：SHAQKYF (SEQ ID NO：194)，
[0518] 其中括号之间的氨基酸代表该位置处的备选氨基酸。
[0519] 3.根据项1或项2的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并表达编码MCB多肽的核酸实现。
[0520] 4.根据项1至项3任一项所述的方法，其中所述编码MCB多肽的核酸编码表A2中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与该核酸杂交的核酸。
[0521] 5.根据项1至项4任一项所述的方法，其中所述的核酸序列编码表A2中给出的任一蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
[0522] 6.根据任一前述项的方法，其中所述的增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量、优选提高的生物量和/或增加的种子产量。
[0523] 7.根据项1至项6任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
[0524] 8.根据项1至项6任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫、或缺氮的条件下获得。
[0525] 9.根据项3至项8任一项所述的方法，其中所述的核酸有效连接于组成型启动子，优选地有效连接于GOS2启动子，最优选地有效连接于来自稻的GOS2启动子。
[0526] 10.根据项1至项9任一项所述的方法，其中所述编码MCB多肽的核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，进一步优选地来自十字花科，更优选地来自拟南芥属，最优选地来自拟南芥。
[0527] 11.由根据项1至项10任一项的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码MCB多肽的重组核酸。
[0528] 12.构建体，其包含：
[0529] (i)编码如项1或项2中定义的MCB多肽的核酸；
[0530] (ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
[0531] (iii)转录终止序列。
[0532] 13.根据项12所述的构建体，其中所述的调控序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。
[0533] 14.根据项12或项13的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的产量，特别具有增加的生物量和/或增加的种子产量。
[0534] 15.用根据项12或项13的构建体所转化的植物、植物部分或植物细胞。
[0535] 16.用于产生转基因植物的方法，所述的转基因植物相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，包括：
[0536] (i)在植物中导入并表达编码如项1或项2中定义的MCB多肽的核酸；和
[0537] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
[0538] 17.转基因植物，其相对于对照植物具有因编码如项1或项2中所定义MCB多肽的核酸的受调节表达所致增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，或从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞。
[0539] 18.根据项11、15或17的转基因植物或从其中衍生的转基因植物细胞，其中所述的植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属植物、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
[0540] 19.根据项18的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是苗生物量和/或种子。
[0541] 20.产物，从根据项18所述的植物和/或从根据项19所述的植物的可收获部分衍生。
[0542] 21.编码MCB多肽的核酸在相对于对照植物增加植物中产量、尤其增加种子产量和/或苗生物量中的用途。
[0543] 3.Sirtuin 2或沉默信息调节物2(SRT2)多肽
[0544] 1.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码SRT2多肽的核酸表达。
[0545] 2.根据项1所述的方法，其中所述的SRT2多肽包含以优选性升序与表C1中所述的任一个或多个氨基酸结构域具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性的蛋白质结构域。
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性的蛋白质结构域。
[0546] 3.根据项1或项2所述的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并表达编码SRT2多肽的核酸实现。
[0547] 4.根据项1至项3任一项的方法，其中所述编码SRT2多肽的核酸编码表A3中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与该核酸杂交的核酸。
[0548] 5.根据项1至项4任一项所述的方法，其中所述的核酸序列编码表A3中给出的任一蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
[0549] 6.根据任一前述项的方法，其中所述的增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量、优选提高的生物量和/或项的种子产量。
[0550] 7.根据项1至项6任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
[0551] 8.根据项1至项6任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫、或缺氮的条件下获得。
[0552] 9.根据项3至项8任一项所述的方法，其中所述的核酸有效连接于组成型启动子，优选地有效连接于GOS2启动子，最优选地有效连接于来自稻的GOS2启动子。
[0553] 10.根据项1至项9任一项所述的方法，其中所述编码SRT2多肽的核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，还优选地来自十字花科，更优选地来自拟南芥属，最优选地来自拟南芥。
[0554] 11.由根据项1至项10任一项所述的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码SRT2多肽的重组核酸。
[0555] 12.构建体，其包含：
[0556] (i)编码如项1或项2中定义的SRT2多肽的核酸；
[0557] (ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
[0558] (iii)转录终止序列。
[0559] 13.根据项12所述的构建体，其中所述的调控序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。
[0560] 14.根据项12或项13的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的产量，特别具有增加的生物量和/或增加的种子产量。
[0561] 15.用根据项12或项13的构建体所转化的植物、植物部分或植物细胞。
[0562] 16.用于产生转基因植物的方法，所述的转基因植物相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，包括：
[0563] (i)在植物中导入并表达编码如项1或项2中定义的SRT2多肽的核酸；和
[0564] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
[0565] 17.转基因植物，其相对于对照植物具有因编码如项1或项2中所定义SRT2多肽的核酸的受调节表达所致增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，或从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞。
[0566] 18.根据项11、15或17的转基因植物或从其中衍生的转基因植物细胞，其中所述的植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属植物、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
[0567] 19.根据项18的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是苗生物量和/或种子。
[0568] 20.产物，从根据项18所述的植物和/或从根据项19所述的植物的可收获部分衍生。
[0569] 21.编码SRT2多肽的核酸在相对于对照植物增加植物中产量、尤其增加种子产量和/或苗生物量方面的用途。
[0570] 4.YRP2多肽
[0571] 1.用于通过调节植物中编码YRP2多肽或者其直向同源物或旁系同源物的核酸表达在植物中增强非生物胁迫耐受性的方法。
[0572] 2.根据项1所述的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并表达编码YRP2多肽的核酸实施。
[0573] 3.根据项1或项2所述的方法，其中所述编码YRP2多肽的核酸编码表A4中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与该核酸杂交的核酸。
[0574] 4.根据项1至项3任一项所述的方法，其中所述的核酸序列编码表A4中给出的任一蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
[0575] 5.根据项3或项4所述的方法，其中所述的核酸有效连接于组成型启动子，优选地有效连接于GOS2启动子，最优选地有效连接于来自稻的GOS2启动子。
[0576] 6.根据项1至项5任一项的方法，其中所述编码YRP2多肽的核酸是番茄的。
[0577] 7.由根据项1至项6任一项所述的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码YRP2多肽的重组核酸。
[0578] 8.构建体，其包含：
[0579] (i)编码如项1或项2中定义的YRP2多肽的核酸；
[0580] (ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
[0581] (iii)转录终止序列。
[0582] 9.根据项8所述的构建体，其中所述的调控序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。
[0583] 10.根据项8或项9所述的构建体在用于产生植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的非生物胁迫耐受性。
[0584] 11.用根据项8或项9所述的构建体所转化的植物、植物部分或植物细胞。
[0585] 12.用于产生相对于对照植物具有增加的非生物胁迫耐受性的转基因植物的方法，包括：
[0586] (i)在植物中导入并表达编码YRP2多肽的核酸；和
[0587] (ii)在促进非生物胁迫的条件下培育植物细胞。
[0588] 13.转基因植物，其相对于对照植物具有因编码YRP2多肽的核酸的受调节表达所致的非生物胁迫耐受性，或从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞。
[0589] 14.根据项7、11或13的转基因植物或从其中衍生的转基因植物细胞，其中所述的植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、甘蔗、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属植物、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
[0590] 15.根据项14的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是苗生物量和/或种子。
[0591] 16.产物，从根据项14所述的植物和/或从根据项15所述的植物的可收获部分衍生。
[0592] 17.编码YRP2样多肽的核酸在相对于对照植物增加产量、尤其在增加非生物胁迫耐受性方面的用途。
[0593] 5.YRP3多肽
[0594] 1.用于通过调节植物中编码YRP3多肽或者其直向同源物或旁系同源物的核酸的表达在植物中增强非生物胁迫耐受性的方法。
[0595] 2.根据项1所述的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并表达编码YRP3多肽的核酸实现。
[0596] 3.根据项1或项2所述的方法，其中所述编码YRP3多肽的核酸编码表A5中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与该核酸杂交的核酸。
[0597] 4.根据项1至项3任一项所述的方法，其中所述的核酸序列编码表A5中给出的任一蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
[0598] 5.根据项3或项4所述的方法，其中所述的核酸有效连接于组成型启动子，优选地有效连接于GOS2启动子，最优选地有效连接于来自稻的GOS2启动子。
[0599] 6.根据项1至项5任一项的方法，其中所述编码YRP3多肽的核酸是展叶剑叶藓的。
[0600] 7.由根据项1至项6任一项所述的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码YRP3多肽的重组核酸。
[0601] 8.构建体，其包含：
[0602] (i)编码如项1或项2中定义的YRP3多肽的核酸；
[0603] (ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
[0604] (iii)转录终止序列。
[0605] 9.根据项8所述的构建体，其中所述的调控序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。
[0606] 10.根据项8或项9所述的构建体在用于产生植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的非生物胁迫耐受性。
[0607] 11.用根据项8或项9所述的的构建体所转化的植物、植物部分或植物细胞。
[0608] 12.用于产生相对于对照植物具有增加的非生物胁迫耐受性的转基因植物的方法，包括：
[0609] (i)在植物中导入并表达编码YRP3多肽的核酸；和
[0610] (ii)在促进非生物胁迫的条件下培育植物细胞。
[0611] 13.转基因植物，其相对于对照植物具有因编码YRP3多肽的核酸的受调节表达所致的非生物胁迫耐受性，或从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞。
[0612] 14.根据项7、11或13的转基因植物或从其中衍生的转基因植物细胞，其中所述的植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、甘蔗、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属植物、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
[0613] 15.根据项14所述的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是苗生物量和/或种子。
[0614] 16.产物，从根据项14所述的植物和/或从根据项15所述的植物的可收获部分衍生。
[0615] 17.编码YRP3样多肽的核酸在相对于对照植物增加产量、尤其在增加非生物胁迫耐受性方面的用途。
[0616] 5.YRP3多肽
[0617] 1.用于通过调节植物中编码YRP4多肽或者其直向同源物或旁系同源物的核酸的表达在植物中增强非生物胁迫耐受性的方法。
[0618] 2.根据项1所述的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并表达编码YRP4多肽的核酸实施。
[0619] 3.根据项1或项2所述的方法，其中所述编码YRP4多肽的核酸编码表A6中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与该核酸杂交的核酸。
[0620] 4.根据项1至项3任一项所述的方法，其中所述的核酸序列编码表A6中给出的任一蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
[0621] 5.根据项3或项4所述的方法，其中所述的核酸有效连接于组成型启动子，优选地有效连接于GOS2启动子，最优选地有效连接于来自稻的GOS2启动子。
[0622] 6.根据项1至项5任一项的方法，其中所述编码YRP4多肽的核酸是普通小麦的。
[0623] 7.由根据项1至项6任一项所述的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码YRP4多肽的重组核酸。
[0624] 8.构建体，其包含：
[0625] (i)编码如项1或项2中定义的YRP4多肽的核酸；
[0626] (ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
[0627] (iii)转录终止序列。
[0628] 9.根据项8所述的构建体，其中所述的调控序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。
[0629] 10.根据项8或项9所述的构建体在用于产生植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的非生物胁迫耐受性。
[0630] 11.用根据项8或项9所述的的构建体所转化的植物、植物部分或植物细胞。
[0631] 12.用于产生相对于对照植物具有增加的非生物胁迫耐受性的转基因植物的方法，包括：
[0632] (i)在植物中导入并表达编码YRP4多肽的核酸；和
[0633] (ii)在促进非生物胁迫的条件下培育植物细胞。
[0634] 13.转基因植物，其相对于对照植物具有因编码YRP4多肽的核酸的受调节表达所致的非生物胁迫耐受性，或从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞。
[0635] 14.根据项7、11或13的转基因植物或从其中衍生的转基因植物细胞，其中所述的植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、甘蔗、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属植物、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
[0636] 15.根据项14所述的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是苗生物量和/或种子。
[0637] 16.产物，从根据项14所述的植物和/或从根据项15所述的植物的可收获部分衍生。
[0638] 17.编码YRP4多肽的核酸在相对于对照植物增加产量、尤其在增加非生物胁迫耐受性方面的用途。
[0639] 7.SPX-RING(SYG1，Pho81，XPR1-锌指，RING型)多肽
[0640] 1.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码SPX-RING多肽的核酸的表达。
[0641] 2.根据项1所述的方法，其中所述的SPX-RING多肽包含以优选性升序与任一个或多个以下基序具有至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性的基序：
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％总体序列同一性的基序：
[0642] (i)基序1-1至基序1-35(SEQ ID NO：340至374)；和
[0643] (ii)基序2-1至基序2-35(SEQ ID NO：375至409)；和
[0644] (iii)基序3-1至基序3-35(SEQ ID NO：410至444)。
[0645] 3.根据项1或项2的方法，其中所述受调节的表达通过在植物中导入并表达编码SPX-RING多肽的核酸实现。
[0646] 4.根据项1至项3任一项所述的方法，其中所述编码SPX-RING多肽的核酸编码表A7中所列的任一种蛋白质或是这种核酸的一部分或是能够与该核酸杂交的核酸。
[0647] 5.根据项1至项4任一项所述的方法，其中所述的核酸序列编码表A7中给出的任一蛋白质的直向同源物或旁系同源物。
[0648] 6.根据任一前述项的方法，其中所述的增强的产量相关性状包括相对于对照植物增加的产量、优选提高的生物量和/或增加的种子产量。
[0649] 7.根据项1至项6任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在非胁迫条件下获得。
[0650] 8.根据项1至项6任一项所述的方法，其中所述增强的产量相关性状在干旱胁迫、盐胁迫或缺氮的条件下获得。
[0651] 9.根据项3至项8任一项所述的方法，其中所述的核酸有效连接于组成型启动子，优选地有效连接于GOS2启动子，最优选地有效连接于来自稻的GOS2启动子。
[0652] 10.根据项1至项9任一项所述的方法，其中所述编码SPX-RING多肽的核酸是植物来源的，优选地来自双子叶植物，进一步优选地来自十字花科，更优选地来自拟南芥属，最优选地来自拟南芥。
[0653] 11.由根据项1至项10任一项的方法可获得的植物或其部分，包括种子，其中所述的植物或其部分包含编码SPX-RING多肽的重组核酸。
[0654] 12.构建体，其包含：
[0655] (i)编码如项1或项2中定义的SPX-RING多肽的核酸；
[0656] (ii)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个调控序列；和任选地
[0657] (iii)转录终止序列。
[0658] 13.根据项12所述的构建体，其中所述的调控序列之一是组成型启动子，优选地是GOS2启动子，最优选地是来自稻的GOS2启动子。
[0659] 14.根据项12或项13的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物相对于对照植物具有增加的产量，特别具有增加的生物量和/或增加的种子产量。
[0660] 15.用根据项12或项13所述的的构建体所转化的植物、植物部分或植物细胞。
[0661] 16.用于产生转基因植物的方法，所述的转基因植物相对于对照植物具有增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，包括：
[0662] (i)在植物中导入并表达编码如项1或项2中定义的SPX-RING多肽的核酸；和[0663] (ii)在促进植物生长和发育的条件下培育植物细胞。
[0664] 17.转基因植物，其相对于对照植物具有因编码如项1或项2中所定义SPX-RING多肽的核酸的受调节表达所致增加的产量、尤其增加的生物量和/或增加的种子产量，或从所述转基因植物衍生的转基因植物细胞。
[0665] 18.根据项11、15或17的转基因植物或从其中衍生的转基因植物细胞，其中所述的植物是作物植物或单子叶植物或谷物，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱、二粒小麦、斯卑尔脱小麦、黑麦属植物、单粒小麦、埃塞俄比亚画眉草、蜀黍和燕麦。
[0666] 19.根据项18所述的植物的可收获部分，其中所述的可收获部分优选地是苗生物量和/或种子。
[0667] 20.产物，从根据项18所述的植物和/或从根据项19所述的植物的可收获部分衍生。
[0668] 21.编码SPX-RING多肽的核酸在相对于对照植物增加植物中产量、尤其在增加种子产量和/或苗生物量方面的用途。
[0670] 本发明现在将参考以下图进行描述，其中：
[0671] 图1显示多重比对结果，同时用框标出基序I至IV。在标准设置(缓慢比对，相似性矩阵：Gonnet(或Blosum 62)，空位开口罚分：10，空位延伸罚分：0.2)下，使用累进比对Clustal算法2.0(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等人(2003).Nucleic Acids Res31：3497-3500)进行多肽序列的比对。进行少许手工编辑以进一步优化该比对。
[0672] 图2显示了使用如Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序中提供的邻接聚类算法所构建的CRSP33样多肽的系统树。
[0673] 图3表示用于稻中增加在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下编码CRSP33样的核酸表达的双元载体。
[0674] 图4表示表A2的MCB1组的MCB多肽的多重比对结果。
[0675] 图5表示用于稻中增加在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下编码MCB的核酸表达的双元载体。
[0676] 图6表示SRT2多肽的多重比对结果。
[0677] 图7表示用于稻中增加在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下编码SRT2的核酸表达的双元载体。
[0678] 图8表示用于稻中增加在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下编码YRP2的核酸表达的双元载体。
[0679] 图9表示用于稻中增加在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下编码YRP3的核酸表达的双元载体。
[0680] 图10表示用于稻中增加在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下编码YRP4的核酸表达的双元载体。
[0681] 图11表示SPX-RING多肽的多重比对结果。
[0682] 图12表示用于稻中增加在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下编码SPX-RING的核酸表达的双元载体。实施例
[0683] 本发明现在参考如下实施例进行描述，所述实施例仅是阐明性的。以下实施例不意图完全限定或限制本发明的范围。
[0684] DNA操作：除非另外说明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)Molecular Cloning：a laboratory manual，第3版Cold Spring Harbor Laboratory Press，CSH，New York)或Ausubel等人(1994)，Current Protocols in Molecular Biology，Current Protocols第1卷和第2卷中描述的标准方案进行。用于植物分子研究工作的标准材料和方法在BIOS科学出版有限责任公司(BIOS Scientific Publications Ltd(英国))和Blackwell科学出版社(Blackwell Scientific Publications)(英国)出版的R.D.D.C ray的Plant Molecular Biology Labfax(1993)中描述。
[0685] 实施例1：鉴定与本发明方法中所用的核酸序列相关的序列
[0686] 1.1.SP1激活必需辅因子(CRSP)多肽
[0687] 使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定了与SEQ ID NOs 1和3相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。例如，将SEQ ID NO：1所编码的多肽用于TBLASTN算法中，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列划分。这种分析的结果通过配对比较进行观察，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果因偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以通过同一性百分数评定。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以增加E-值以显示更不严格的匹配。以这种方式，可以鉴定到短的近乎完全的匹配。下表A1提供了CRSP33样核酸序列的名单。
[0688] 表A1：CRSP33样多肽的实例：
[0689]
[0690] 1.2.Myb相关的CAB启动子结合(MCB)多肽
[0691] 用数据库搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。例如，由与本发明方法中所用核酸编码的多肽用于TBLASTN算法中，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列划分。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以通过同一性百分数评定。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以增加E-值以显示更不严格的匹配。以这种方式，可以鉴定到短的近乎完全的匹配。
[0692] 表A2提供了与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列的名单。
[0693] 表A2：MCB核酸和MCB多肽的实例：
[0694]
[0695]
[0696]
[0697] 在一些情况下，相关序列已经由研究机构如基因组研究所(TIGR；始于TA)初步地组装并且公开披露。真核生物基因直向同源物(EGO)数据库可以用来通过关键词搜索或通过使用BLAST算法以目的核酸序列或多肽序列鉴定此类相关序列。在其他情况下，已经为特定生物创建了专用核酸序列数据库，如由联合基因组研究所(Joint Genome Institute)创建。另外，登录专利数据库已经允许鉴定新的核酸序列和多肽序列。
[0698] 1.3.Sirtuin 2或沉默信息调节物2(SRT2)多肽
[0699] 用数据库搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。例如，由与本发明方法中所用核酸编码的多肽用于TBLASTN算法中，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列划分。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以通过同一性百分数评定。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以增加E-值以显示更不严格的匹配。以这种方式，可以鉴定到短的近乎完全的匹配。
[0700] 表A3提供了与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列的名单。
[0701] 表A3：SRT2核酸及其所编码多肽的实例：
[0702]
[0703] 在一些情况下，相关序列已经由研究机构如基因组研究所(TIGR；始于TA)初步地组装并且公开披露。真核生物基因直向同源物(EGO)数据库可以用来通过关键词搜索或通过使用BLAST算法以目的核酸序列或多肽序列鉴定此类相关序列。在其他情况下，已经为特定生物创建了专用核酸序列数据库，如由联合基因组研究所(Joint Genome Institute)创建。另外，登录专利数据库已经允许鉴定新的核酸序列和多肽序列。
[0704] 1.4.YRP2多肽
[0705] 使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定了与SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：237和SEQ ID NO：239相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。例如，由SEQ ID NO：235、SEQ ID NO：237和SEQ ID NO：239的核酸编码的多肽用于TBLASTN算法中，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列划分。这种分析的结果通过配对比较进行观察，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果因偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较结果也通过同一性百分数评定。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，增加E-值以显示更不严格的匹配。以这种方式，鉴定到短的近乎完全的匹配。
[0706] 表A4提供了YRP2核酸序列的名单。
[0707] 表A4：YRP2多肽的实例：
[0708]
[0709]
[0710] 在一些情况下，相关序列由研究机构如基因组研究所(TIGR；始于TA)初步地组装并且公开披露。真核生物基因直向同源物(EGO)数据库用来通过关键词搜索或通过使用BLAST算法以目的核酸序列或多肽序列鉴定此类相关序列。在其他情况下，为特定生物创建了专用核酸序列数据库，如由联合基因组研究所(Joint Genome Institute)创建。
[0711] 1.5.YRP3多肽
[0712] 使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定了与SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：246、SEQID NO：248、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：252和SEQ ID NO：254相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。例如，由SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：248.SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：252的核酸序列编码的多肽用于TBLASTN算法中，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列划分。这种分析的结果通过配对比较进行观察，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对因偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较结果也通过同一性百分数评定。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，增加E-值以显示更不严格的匹配。以这种方式，鉴定到短的近乎完全的匹配。
[0713] 表A5提供了YRP3核酸序列的名单。
[0714] 表A5：YRP3多肽的实例：
[0715]
[0716]
[0717] 在一些情况下，相关序列由研究机构如基因组研究所(TIGR；始于TA)初步地组装并且公开披露。真核生物基因直向同源物(EGO)数据库用来通过关键词搜索或通过使用BLAST算法以目的核酸序列或多肽序列鉴定此类相关序列。在其他情况下，为特定生物创建了专用核酸序列数据库，如由联合基因组研究所(Joint Genome Institute)创建。
[0718] 1.6.YRP4多肽
[0719] 使用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定了与SEQ ID NO：261和SEQ ID NO：263相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。例如，由SEQ ID NO：261和SEQ ID NO：263的核酸编码的多肽用于TBLASTN算法中，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列划分。这种分析的结果通过配对比较进行观察，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果因偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较结果也通过同一性百分数评定。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，增加E-值以显示更不严格的匹配。以这种方式，鉴定到短的近乎完全的匹配。
[0720] 表A6提供了YRP4核酸序列的名单。
[0721] 表A6：YRP4多肽的实例：
[0722]
[0723] 在一些情况下，相关序列由研究机构如基因组研究所(TIGR；始于TA)初步地组装并且公开披露。真核生物基因直向同源物(EGO)数据库用来通过关键词搜索或通过使用BLAST算法以目的核酸序列或多肽序列鉴定此类相关序列。在其他情况下，为特定生物创建了专用核酸序列数据库，如由联合基因组研究所(Joint Genome Institute)创建。
[0724] 1.7.SPX-RING(SYG1，Pho81，XPR1-锌指，RING型)多肽
[0725] 用数据库序列搜索工具，如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。由与本发明中所用核酸编码的多肽用于TBLASTN算法中，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列划分。该分析的输出结果通过逐对比较进行检验，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除E-值外，比较也可以通过同一性百分数评定。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内的相同核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以调节搜索的严格性。例如，可以增加E-值以显示更不严格的匹配。以这种方式，可以鉴定到短的近乎完全的匹配。
[0726] 表A7提供了与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列的名单。
[0727] 表A7：SPX-RING核酸和多肽的实例：
[0728]
[0729] 实施例2：比对与本发明方法中所用的多肽序列相关的序列
[0730] 2.1.SP1激活必需辅因子(CRSP)多肽
[0731] 在标准设置(缓慢比对，相似性矩阵：Gonnet(或Blosum 62)，空位开口罚分：10，空位延伸罚分：0.2)下，使用累进比对的ClustalW 2.0算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna 等 人 (2003).Nucleic Acids Res 31：
3497-3500)进行多肽序列的比对。进行少许手工编辑以进一步优化该比对。CRSP33样多肽在图1中比对。
3497-3500)进行多肽序列的比对。进行少许手工编辑以进一步优化该比对。CRSP33样多肽在图1中比对。
[0732] 使用如来自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序中所提供的邻接聚类算法构建CRSP33样多肽的系统树(图2)。
[0733] 2.2.Myb相关的CAB启动子结合(MCB)多肽
[0734] 在标准设置并使用如Invitrogen的VNTI软件包的Align软件中所提供Blosum62矩阵的情况下，使用累进比对Clustal 2.0算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等人(2003).NucleicAcids Res 31：3497-3500)进行MCB1组的MCB多肽序列的比对。MCB多肽在图4中比对。
[0735] 2.3.Sirtuin 2或沉默信息调节物2(SRT2)多肽
[0736] 在标准设置(缓慢比对，相似性矩阵：Gonnet(或Blosum 62(如果比对多肽))，空位开口罚分：10，空位延伸罚分：0.2)下，使用累进比对ClustalW2.0算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等人(2003).Nucleic Acids Res 31：3497-3500)进行多肽序列的比对。进行少许手工编辑以进一步优化该比对。SRT2多肽在图6中比对。
[0737] 在标准设置(缓慢比对，相似性矩阵：Gonnet，空位开口罚分：10，空位延伸罚分：0.2)下，使用累进比对ClustalW 2.0算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res 25：
4876-4882；Chenna等人(2003).Nucleic AcidsRes 31：3497-3500)进行多肽序列的比对。
进行少许手工编辑以优化该比对。
4876-4882；Chenna等人(2003).Nucleic AcidsRes 31：3497-3500)进行多肽序列的比对。
进行少许手工编辑以优化该比对。
[0738] 2.4.YRP2多肽
[0739] 在标准设置(缓慢比对，相似性矩阵：Gonnet(或Blosum 62(如果比对多肽))，空位开口罚分：10，空位延伸罚分：0.2)下，使用累进比对ClustalW2.0算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等人(2003).Nucleic Acids Res 31：3497-3500)进行多肽序列的比对。进行少许手工编辑以进一步优化该比对。
[0740] 使用如来自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序中所提供的邻接聚类算法构建YRP2多肽的系统树。
[0741] 2.5.YRP3多肽
[0742] 在标准设置(缓慢比对，相似性矩阵：Gonnet(或Blosum 62(如果比对多肽))，空位开口罚分：10，空位延伸罚分：0.2)下，使用累进比对ClustalW2.0算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等人(2003).Nucleic Acids Res 31：3497-3500)进行多肽序列的比对。进行少许手工编辑以进一步优化该比对。
[0743] 使用如来自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序中所提供的邻接法聚类算法构建YRP3多肽的系统树。
[0744] 2.6.YRP4多肽
[0745] 在标准设置(缓慢比对，相似性矩阵：Gonnet(或Blosum 62(如果比对多肽))，空位开口罚分：10，空位延伸罚分：0.2)下，使用累进比对ClustalW2.0算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等人(2003).Nucleic Acids Res 31：3497-3500)进行多肽序列的比对。进行少许手工编辑以进一步优化该比对。
[0746] 使用如来自Vector NTI(Invitrogen)的AlignX程序中所提供的邻接聚类算法构建YRP4多肽的系统树。
[0747] 2.7.SPX-RING(SYG1，Pho81，XPR1-锌指，RING型)多肽
[0748] 使用来自Vector NTI(Invitrogen)的Alignment X程序进行多肽序列的比对，其中所述Alignment X程序基于累进比对Clustal W 2.0算法(Thompson等人(1997)Nucleic Acids Res 25：4876-4882；Chenna等人(2003)，Nucleic Acids Res 31：3497-3500)，使用标准设置：空位开口罚分10，空位延伸罚分：0.2。SPX-RING多肽在图11中比对。
[0749] 实施例3：计算在实施本发明方法中有用的多肽序列之间的总体同一性百分数[0750] 3.1.SP1激活必需辅因子(CRSP)多肽
[0751] 使用MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application
that generates similarity/identity matrices usingprotein or DNA sequences)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)确定全长CRSP33样多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件产生DNA序列或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。
that generates similarity/identity matrices usingprotein or DNA sequences)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)确定全长CRSP33样多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件产生DNA序列或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。
[0752] 比较中所用的参数是：
[0753] 评分矩阵：Blosum62
[0754] 第一空位：12
[0755] 延伸空位：2
[0756] 也在结构域水平上产生局部比对的MATGAT表。
[0757] 3.2.Myb相关的CAB启动子结合(MCB)多肽
[0758] 使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)，CampanellaJJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件产生DNA序列或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。序列同一性在对角线的上半部分显示。
[0759] 比较中使用的参数是：
[0760] 评分矩阵：Blosum62
[0761] 第一空位：12
[0762] 延伸空位：2
[0763] 在表B1中显示所述多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的软件分析结果。
[0764] 与SEQ ID NO：45相比较，在实施本发明方法中有用的MCB多肽序列之间的百分数同一性可以低至34％氨基酸同一性。
[0765] 表B1：在所述多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的MatGAT结果
[0766]1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1.H.vulgare_TA34826_4513＊ 63，6 59，2 88，6 48，9 58，5 34，3 34，2 37 34，2
2.O.sativa_LOC_Os10g41260.1＊ 61，2 62，8 50，7 57，8 33 32，4 37，1 31，9
3.S.bicolor_TA25773_4558＊ 60，2 55，8 76，4 31，9 31，3 34，9 30，3
4.T.aestivum_TA69583_4565＊ 48，2 59，8 34 34，6 36，9 33，6
5.Z.mays_TA13716_4577999＊ 72，2 28，5 29，1 36，8 28，7
6.Z.mays_TA182110_4577＊ 32，1 32，2 33 31，5
7.O.sativa_LOC_Os08g05510.1＊ 71，7 51，3 67，3
8.S.bicolor_5287585＊ 63，3 89，1
9.S.officinarum_TA45655_4547＊ 59，2
10.Z.mays_TA15909_4577999＊
1.H.vulgare_TA34826_4513＊ 63，6 59，2 88，6 48，9 58，5 34，3 34，2 37 34，2
2.O.sativa_LOC_Os10g41260.1＊ 61，2 62，8 50，7 57，8 33 32，4 37，1 31，9
3.S.bicolor_TA25773_4558＊ 60，2 55，8 76，4 31，9 31，3 34，9 30，3
4.T.aestivum_TA69583_4565＊ 48，2 59，8 34 34，6 36，9 33，6
5.Z.mays_TA13716_4577999＊ 72，2 28，5 29，1 36，8 28，7
6.Z.mays_TA182110_4577＊ 32，1 32，2 33 31，5
7.O.sativa_LOC_Os08g05510.1＊ 71，7 51，3 67，3
8.S.bicolor_5287585＊ 63，3 89，1
9.S.officinarum_TA45655_4547＊ 59，2
10.Z.mays_TA15909_4577999＊
[0767] 表B2：在如下表多肽1至10中存在的基序1的多肽序列全长范围内总体同一性的MatGAT结果
[0768] 表B2.Matgat基序1
[0769]
[0770] 3.3.Sirtuin 2或沉默信息调节物2(SRT2)多肽
[0771] 使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)，CampanellaJJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件产生DNA序列或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。序列相似性在对角线下半部分显示，并且序列同一性在对角线的上半部分显示。
[0772] 比较中使用的参数是：
[0773] 评分矩阵：Blosum62
[0774] 第一空位：12
[0775] 延伸空位：2
[0776] 在表B3中显示所述多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的软件分析结果。在对角线上方以粗体给出同一性百分数而在对角线下方(正常字体)给出相似性百分数。
[0777] 与SEQ ID NO：199(Os_SRT2a)相比较，在实施本发明方法中有用的SRT2多肽序列之间的百分数同一性可以低至17.8％氨基酸同一性。
[0778] 表B3在所述多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的MatGAT结果
[0779]1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1.Os_SRT2a 187 193 574 178
56.7 45.7 59.3 99.5 51.5 19.3 24.8 21.3 18.9 19.0
2.A_thaliana_AT5G09230_1
71.8 67.0 19.3 18.2 67.9 68.4 20.9 57.0 52.1 21.6 20.6 23.1 18.7 18.0
3.A_thal iana_AT5G09230_4
54.7 69.2 18.0 15.6 51.7 53.2 20.2 45.7 42.8 19.6 20.0 19.4 21.0 17.0
4.A_thaliana_AT5G55760_1 534 183 575
35.3 34.9 28.3 19.7 18.9 19.9 46.8 19.6 21.9 15.6 69.5
5.G_max_Gm0004x00111
33.9 32.7 25.7 67.8 19.7 19.3 46.0 19.5 18.8 37.7 18.6 24.7 13.4 56.9
6.G_max_Gm0065x00389 368 320 186
73.3 81.2 61.3 78.1 57.7 51.3 19.2 21.8 22.7 19.2 18.6
7.M_truncatula_CR936364
73.8 84.4 63.0 36.4 31.5 88.8 18.4 59.5 53.5 21.7 22.8 23.2 19.6 18.7
8.O_sativa_Os04g0271000
36.4 36.2 30.2 74.3 62.1 35.2 34.6 17.8 21.7 45.3 20.4 23.5 16.1 58.7
9.O_sativa_Os12g0179800
99.5 72.0 54.7 36.2 34.1 73.5 73.8 35.8 52.0 20.1 25.0 21.5 19.1 19.1
10.P_patens_116322
66.7 70.2 57.8 34.7 31.3 69.2 70.1 35.0 67.2 22.0 24.8 23.3 20.5 21.5
11.P_patens_148151
38.7 40.6 32.3 61.5 49.7 37.9 39.3 60.7 39.9 41.1 22.2 27.1 19.7 48.6
12.P_patens_164363 35g 295 405 354
42.7 41.0 39.6 39.g 42.7 40.8 38.3 21.5 22.9 20.2
13.P_patens_172495
38.2 37.7 29.8 43.6 42.3 39.1 37.7 42.4 38.4 38.2 44.2 32.7 17.4 24.1
14.P_patens_86384
31.6 29.8 38.0 26.2 22.6 30.0 32.0 26.1 31.8 34.2 33.1 35.3 27.4 14.6
15.P_trichocarpa_798160
34.3 34.9 28.0 85.6 68.4 35.6 33.2 74.3 34.5 35.8 62.9 33.8 45.7 26.1
1.Os_SRT2a 187 193 574 178
56.7 45.7 59.3 99.5 51.5 19.3 24.8 21.3 18.9 19.0
2.A_thaliana_AT5G09230_1
71.8 67.0 19.3 18.2 67.9 68.4 20.9 57.0 52.1 21.6 20.6 23.1 18.7 18.0
3.A_thal iana_AT5G09230_4
54.7 69.2 18.0 15.6 51.7 53.2 20.2 45.7 42.8 19.6 20.0 19.4 21.0 17.0
4.A_thaliana_AT5G55760_1 534 183 575
35.3 34.9 28.3 19.7 18.9 19.9 46.8 19.6 21.9 15.6 69.5
5.G_max_Gm0004x00111
33.9 32.7 25.7 67.8 19.7 19.3 46.0 19.5 18.8 37.7 18.6 24.7 13.4 56.9
6.G_max_Gm0065x00389 368 320 186
73.3 81.2 61.3 78.1 57.7 51.3 19.2 21.8 22.7 19.2 18.6
7.M_truncatula_CR936364
73.8 84.4 63.0 36.4 31.5 88.8 18.4 59.5 53.5 21.7 22.8 23.2 19.6 18.7
8.O_sativa_Os04g0271000
36.4 36.2 30.2 74.3 62.1 35.2 34.6 17.8 21.7 45.3 20.4 23.5 16.1 58.7
9.O_sativa_Os12g0179800
99.5 72.0 54.7 36.2 34.1 73.5 73.8 35.8 52.0 20.1 25.0 21.5 19.1 19.1
10.P_patens_116322
66.7 70.2 57.8 34.7 31.3 69.2 70.1 35.0 67.2 22.0 24.8 23.3 20.5 21.5
11.P_patens_148151
38.7 40.6 32.3 61.5 49.7 37.9 39.3 60.7 39.9 41.1 22.2 27.1 19.7 48.6
12.P_patens_164363 35g 295 405 354
42.7 41.0 39.6 39.g 42.7 40.8 38.3 21.5 22.9 20.2
13.P_patens_172495
38.2 37.7 29.8 43.6 42.3 39.1 37.7 42.4 38.4 38.2 44.2 32.7 17.4 24.1
14.P_patens_86384
31.6 29.8 38.0 26.2 22.6 30.0 32.0 26.1 31.8 34.2 33.1 35.3 27.4 14.6
15.P_trichocarpa_798160
34.3 34.9 28.0 85.6 68.4 35.6 33.2 74.3 34.5 35.8 62.9 33.8 45.7 26.1
[0780] 3.4.YRP2多肽
[0781] 使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)，CampanellaJJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)确定全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件产生DNA序列或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。序列相似性在对角线下半部分显示，并且序列同一性在对角线的上半部分显示。
[0782] 比较中所用的参数是：
[0783] 评分矩阵：Blosum62
[0784] 第一空位：12
[0785] 延伸空位：2
[0786] 也可以产生特定结构域的局部比对结果的MATGAT表或关于特定结构域之间同一性/相似性％的数据。
[0787] 3.5.YRP3多肽
[0788] 使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)，Campanella JJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)确定全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件产生DNA序列或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。序列相似性在对角线下半部分显示，并且序列同一性在对角线的上半部分显示。
[0789] 比较中所用的参数是：
[0790] 评分矩阵：Blosum62
[0791] 第一空位：12
[0792] 延伸空位：2
[0793] 也可以产生特定结构域的局部比对结果的MATGAT表或关于特定结构域之间同一性/相似性％的数据。
[0794] 3.6.YRP4多肽
[0795] 使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)，CampanellaJJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)确定全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件产生DNA序列或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。序列相似性在对角线下半部分显示，并且序列同一性在对角线的上半部分显示。
[0796] 比较中所用的参数是：
[0797] 评分矩阵：Blosum62
[0798] 第一空位：12
[0799] 延伸空位：2
[0800] 也可以产生特定结构域的局部比对结果的MATGAT表或关于特定结构域之间同一性/相似性％的数据。
[0801] 3.7.SPX-RING(SYG1，Pho81，XPR1-锌指，RING型)多肽
[0802] 使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMC Bioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(an application that generates similarity/identity matrices using protein or DNA sequences)，CampanellaJJ，Bitincka L，Smalley J；该软件由Ledion Bitincka维护)确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件产生DNA序列或蛋白质序列的相似性/同一性矩阵，无需数据的预先比对。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum 62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵中。序列相似性在对角线下半部分显示，并且序列同一性在对角线的上半部分显示。
[0803] 比较中使用的参数是：
[0804] 评分矩阵：Blosum62
[0805] 第一空位：12
[0806] 延伸空位：2
[0807] 在表B4中显示所述多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的软件分析结果。在对角线上方以粗体给出同一性百分数而在对角线下方(正常字体)给出相似性百分数。
[0808] 与SEQ ID NO：271(5143_27_992_4530_40_1)相比较，在实施本发明方法中有用的SPX-RING多肽序列之间的同一性百分数可以低至41.3％氨基酸同一性。
[0809] 表B4：在所述多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的MatGAT结果
[0810]
[0811] 实施例4：鉴定在实施本发明方法中有用的多肽序列中所包含的结构域
[0812] 4.1.SP1激活必需辅因子(CRSP)多肽
[0813] 蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及有关充分表征的蛋白质的程度各异的生物学信息以获得蛋白质特征标识(protein signatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐蔽马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro在英国欧洲生物信息学研究所维护。
[0814] 4.2.Myb相关的CAB启动子结合(MCB)多肽
[0815] 蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及有关充分表征的蛋白质的程度各异的生物学信息以获得蛋白质特征标识(protein signatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐蔽马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro在英国欧洲生物信息学研究所维护。
[0816] 在表C1中呈现如SEQ ID NO：45所代表的多肽序列的InterPro扫描结果。
[0817] 表C1：如SEQ ID NO：45所代表的多肽序列的InterPro扫描结果(主要检索号)[0818]
[0819]
[0820] 4.3.Sirtuin 2或沉默信息调节物2(SRT2)多肽
[0821] 蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及有关充分表征的蛋白质的程度各异的生物学信息以获得蛋白质特征标识(protein signatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐蔽马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro在英国欧洲生物信息学研究所维护。
[0822] 在表C2中呈现如SEQ ID NO：199所代表的多肽序列的InterPro扫描结果。
[0823] 表C2：当执行如SEQ ID NO：199(OS_SRT2a)所代表的多肽序列和表A3的同源蛋白的InterPro扫描时所揭示的Sirt2结构域
[0824]
[0825]
[0826] 4.4.YRP2多肽
[0827] 蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及有关充分表征的蛋白质的程度各异的生物学信息以获得蛋白质特征标识(protein signatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐蔽马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro在英国欧洲生物信息学研究所维护。
[0828] 4.5.YRP3多肽
[0829] 蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及有关充分表征的蛋白质的程度各异的生物学信息以获得蛋白质特征标识(protein signatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐蔽马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro在英国欧洲生物信息学研究所维护。
[0830] 4.6.YRP4多肽
[0831] 蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及有关充分表征的蛋白质的程度各异的生物学信息以获得蛋白质特征标识(protein signatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐蔽马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro在英国欧洲生物信息学研究所维护。
[0832] 4.7.SPX-RING (SYG1，Pho81，XPR1-锌指，RING型)多肽
[0833] 蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及有关充分表征的蛋白质的程度各异的生物学信息以获得蛋白质特征标识(protein signatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖众多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐蔽马尔科夫模型(HMM)的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro在英国欧洲生物信息学研究所维护。
[0834] 在表C3中呈现如SEQ ID NO：271所代表的多肽序列的InterPro扫描结果。
[0835] 表C3：如SEQ ID NO：271所代表的多肽序列的InterPro扫描结果(主要检索号)[0836]
[0837] 实施例5：基于基序的序列分析
[0838] 使用4.0.0版MEME算法(Timothy L.Bailey和Charles Elkan，第二届分子生物学智能系统国际会议文集(Proceedings of the Second International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology)，第28-36页，AAAI Press，Menlo Park，California，1994)，发现了表A7的SPX-RING多肽中的众多保守基序。表D1显示表A7的SPX-RING多肽中高度保守的序列基序。
[0839]
[0840]
[0841]
[0842] 实施例6：在实施本发明方法中有用的多肽序列的拓扑结构预测
[0843] 6.1.SP1激活必需辅因子(CRSP)多肽
[0844] TargetP 1.1预测真核蛋白的亚细胞定位。基于预测的任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的存在进行位置分配。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地相加在一起。然而，根据TargetP，具有最高评分的位置是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
[0845] 对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
[0846] 可以选择许多参数，如生物组(非植物或植物)、截断值集合(无、预定义的截断值集合或用户指定的截断值集合)和切割位点预测的计算(是或否)。
[0847] 许多其他算法可以用来进行此类分析，包括：
[0848] ·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP 1.1；
[0849] ·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的Protein Prowler亚细胞定位预测器1.2版；
[0850] ·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB 2.5；
[0851] ·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。
[0852] ·PSORT(URL：psort.org)
[0853] ·PLOC(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。
[0854] 6.2.Myb相关的CAB启动子结合(MCB)多肽
[0855] TargetP 1.1预测真核蛋白的亚细胞定位。基于预测的任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的存在进行位置分配。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地相加在一起。然而，根据TargetP，具有最高评分的位置是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
[0856] 对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
[0857] 可以选择许多参数，如生物组(非植物或植物)、截断值集合(无、预定义的截断值集合或用户指定的截断值集合)和切割位点预测的计算(是或否)。
[0858] 许多其他算法可以用来进行此类分析，包括：
[0859] ·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP 1.1；
[0860] ·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的Protein Prowler亚细胞定位预测器1.2版；
[0861] ·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB 2.5；
[0862] ·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。
[0863] ·PSORT(URL：psort.org)
[0864] ·PLOC(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。
[0865] 6.3.Sirtuin 2或沉默信息调节物2(SRT2)多肽
[0866] TargetP 1.1预测真核蛋白的亚细胞定位。基于预测的任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的存在进行位置分配。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地相加在一起。然而，根据TargetP，具有最高评分的位置是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
[0867] 对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
[0868] 6.4.YRP2多肽
[0869] TargetP 1.1预测真核蛋白的亚细胞定位。基于预测的任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的存在进行位置分配。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地相加在一起。然而，根据TargetP，具有最高评分的位置是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
[0870] 对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
[0871] 可以选择许多参数，如生物组(非植物或植物)、截断值集合(无、预定义的截断值集合或用户指定的截断值集合)和切割位点预测的计算(是或否)。
[0872] 许多其他算法可以用来进行此类分析，包括：
[0873] ·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP 1.1；
[0874] ·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的Protein Prowler亚细胞定位预测器1.2版；
[0875] ·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB 2.5；
[0876] ·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。
[0877] ·PSORT(URL：psort.org)
[0878] ·PLOC(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。
[0879] 6.5.YRP3多肽
[0880] TargetP 1.1预测真核蛋白的亚细胞定位。基于预测的任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的存在进行位置分配。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地相加在一起。然而，根据TargetP，具有最高评分的位置是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
[0881] 对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
[0882] 可以选择许多参数，如生物组(非植物或植物)、截断值集合(无、预定义的截断值集合或用户指定的截断值集合)和切割位点预测的计算(是或否)。
[0883] 许多其他算法可以用来进行此类分析，包括：
[0884] ·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP 1.1；
[0885] ·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的Protein Prowler亚细胞定位预测器1.2版；
[0886] ·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB 2.5；
[0887] ·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。
[0888] ·PSORT(URL：psort.org)
[0889] ·PLOC(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。
[0890] 6.6.YRP4多肽
[0891] TargetP 1.1预测真核蛋白的亚细胞定位。基于预测的任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的存在进行位置分配。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地相加在一起。然而，根据TargetP，具有最高评分的位置是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
[0892] 对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
[0893] 可以选择许多参数，如生物组(非植物或植物)、截断值集合(无、预定义的截断值集合或用户指定的截断值集合)和切割位点预测的计算(是或否)。
[0894] 许多其他算法可以用来进行此类分析，包括：
[0895] ·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP 1.1；
[0896] ·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的Protein Prowler亚细胞定位预测器1.2版；
[0897] ·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB 2.5；
[0898] ·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。
[0899] ·PSORT(URL：psort.org)
[0900] ·PLOC(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。
[0901] 6.7.SPX-RING(SYG1，Pho81，XPR1-锌指，RING型)多肽
[0902] TargetP 1.1预测真核蛋白的亚细胞定位。基于预测的任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的存在进行位置分配。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地相加在一起。然而，根据TargetP，具有最高评分的位置是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。TargetP在丹麦技术大学(Technical University of Denmark)的服务器上维护。
[0903] 对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
[0904] 许多其他算法可以用来进行此类分析，包括：
[0905] ·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP 1.1；
[0906] ·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的Protein Prowler亚细胞定位预测器1.2版；
[0907] ·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB 2.5；
[0908] ·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。
[0909] ·PSORT(URL：psort.org)
[0910] ·PLOC(Park和Kanehisa，Bioinformatics，19，1656-1663，2003)。
[0911] 实施例7：克隆在本发明方法中使用的核酸序列
[0912] 7.1.SP1激活必需辅因子(CRSP)多肽
[0913] 使用cDNA文库(在pCMV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增SEQ ID NO：1的核酸序列。使用在50μl PCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。使用的引物是prm09914(SEQ ID NO：39；有义，起始密码子为粗体字)：5’-aaaaagcaggctcacaatggagaatgggaaaagagac-3’)和prm09915(SEQ ID NO：40；反向，互补)：5’-agaaagctgggttggttttaactagttccaccg-3’)，所述引物包含用于Gateway重组的AttB位点。使用标准方法，还纯化所扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间所述PCR片段在体内与pDONR201质粒重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”，pCRSP33样。质粒pDONR201作为 技术的部分从Invitrogen购买。
[0914] 包含SEQ ID NO：1的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的作为功能性元件的：植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：43)位于该Gateway盒上游。
[0915] 在LR重组步骤后，所得表达载体pGOS2::CRSP33样(图3)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
[0916] 7.2.Myb相关的CAB启动子结合(MCB)多肽
[0917] 使用定制的普通小麦籽苗cDNA文库(在MV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增在本发明方法中所用的核酸序列。使用在50μl PCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用Hifi TaqDNA聚合酶进行PCR。使用的引物是(SEQ ID NO：195；有义，起始密码子为粗体字)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggagacaaattcgtctgga-3’)和(SEQ ID NO：196；反向，互补)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgaaaatagagtctcatgtggaagc-3’)，所述引物包含用于Gateway重组的AttB位点。使用标准方法，还纯化所扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间，所述PCR片段在体内与pDONR201质粒重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”，pMCB。质粒pDONR201作为 技术的部分从Invitrogen购买。
[0918] 包含SEQ ID NO：44的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的作为功能性元件的：植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：197)位于该Gateway盒上游。
[0919] 在LR重组步骤后，所得表达载体pGOS2::MCB(图5)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
[0920] 7.3.Sirtuin 2或沉默信息调节物2(SRT2)多肽
[0921] 使用定制的稻籽苗cDNA文库(在MV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增在本发明方法中所用的核酸序列。使用在50μlPCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。使用的引物是(SEQ ID NO：228；有义，起始密码子为粗体字)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaa caatggcggcgggg-3’)和(SEQ ID NO：229；反向，互补)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtgcaccagcttaacttacgttt-3’)，所述引物包含用于Gateway重组的AttB位点。使用标准方法，还纯化所扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间，所述PCR片段在体内与pDONR201质粒重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”，pOs_SRT2。质粒pDONR201作为 技术的部分从Invitrogen购买。
[0922] 包含SEQ ID NO：198的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的作为功能性元件的：植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：230)位于该Gateway盒上游。
[0923] 在LR重组步骤后，所得表达载体pGOS2::SRT2(图7)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
[0924] 7.4.YRP2多肽
[0925] 使用cDNA文库(在pCMV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增核酸序列。使用在50μl PCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。使用标准方法，还纯化所扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”。质粒pDONR201作为 技术的部分从Invitrogen购买。
[0926] 包含SEQ ID NO：234、SEQ ID NO：236或SEQ ID NO：238的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的作为功能性元件的：植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：241)位于该Gateway盒上游。
[0927] 在所述LR重组步骤后，所得表达载体pGOS2::YRP2(图8)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
[0928] 7.5.YRP3多肽
[0929] 使用cDNA文库(在pCMV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增核酸序列。使用在50μl PCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。使用标准方法，还纯化所扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”。质粒pDONR201作为 技术的部分从Invitrogen购买。
[0930] 包含SEQ ID NO：244、SEQ ID NO：246、SEQ ID NO：248、SEQ ID NO：250、SEQ ID NO：252或SEQ ID NO：254的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的作为功能性元件的：植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：256)位于该Gateway盒上游。
[0931] 在所述LR重组步骤后，所得表达载体pGOS2::YRP3(图9)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
[0932] 7.6.YRP4多肽
[0933] 使用cDNA文库(在pCMV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增核酸序列。使用在50μl PCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。使用标准方法，还纯化所扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”。质粒pDONR201作为 技术的部分从Invitrogen购买。
[0934] 包含SEQ ID NO：261或SEQ ID NO：263的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的作为功能性元件的：植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：265)位于该Gateway盒上游。
[0935] 在所述LR重组步骤后，所得表达载体pGOS2::YRP4(图10)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
[0936] 7.7.SPX-RING(SYG1，Pho81，XPR1-锌指，RING型)多肽
[0937] 使用定制的稻籽苗cDNA文库(在MV Sport 6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板，通过PCR扩增在本发明方法中所用的核酸序列。使用在50μlPCR混合物中的200ng模板，在标准条件下使用Hifi Taq DNA聚合酶进行PCR。使用的引物是(SEQ ID NO：445；有义，起始密码子为粗体字)：5’-ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaa tgaagtttgccaagaagtac-3’)和(SEQID NO：446；反向，互补)：5’-ggggaccactttgtacaagaaagctgggtaaaaatccaccaactttagaa-3’)，所述引物包含用于Gateway重组的AttB位点。使用标准方法，还纯化所扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间，所述PCR片段在体内与pDONR201质粒重组以产生根据Gateway术语学的“进入克隆”，pSPX-RING。质粒pDONR201作为 技术的部分从Invitrogen购买。
[0938] 包含SEQ ID NO：270的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的作为功能性元件的：植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒。用于组成型特异性表达的稻GOS2启动子(SEQ ID NO：447)位于该Gateway盒上游。
[0939] 在LR重组步骤后，所得表达载体pGOS2::SPX-RING(图12)根据本领域熟知的方法转化至农杆菌菌株LBA4044中。
[0940] 实施例8：植物转化
[0941] 稻转化
[0942] 含有表达载体的农杆菌用来转化稻植物。将稻的日本栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过在70％乙醇中温育一分钟，随后在2％HgCl2中30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟而实施消毒。消毒的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中温育4周后，将盾片衍生的胚发生性愈伤组织切下并在同一种培养基上增殖。2周后，愈伤组织通过在同一种培养基上传代培养另外2周而繁殖或增殖。胚发生性愈伤组织片在新鲜培养基上传代培养3日，之后共培育(以增强细胞分裂活性)。
[0943] 含有表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后将细菌收集并重悬在液体共培育培养基中至密度(OD600)约1。将混悬液随后转移至培养皿并将愈伤组织在该混悬液内浸泡15分钟。愈伤组织组织随后在滤纸上吸干并转移至固化的共培育培养基上并且在黑暗中于25℃温育3日。共培育的愈伤组织在黑暗中于28℃在选择剂存在下于含有2，4-D的培养基上培育4周。在此时段期间，形成迅速生长的抗性愈伤组织岛。在这种材料转移至再生培养基并在光线下温育后，胚发生潜力释放并且苗在随后4-5周发育。将苗从愈伤组织中切下并且在含有植物生长素的培养基上温育2-3周，其中将苗从所述的培养基上转移至土壤。硬化的苗在高湿度和短日照下于温室中培育。
[0944] 一个构建体产生大约35个独立T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析以验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留表现选择剂耐受性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移植后3-5月收获。所述方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei等1994)。
[0945] 实施例9：其他作物的转化
[0946] 玉米转化
[0947] 玉米的转化根据对Ishida等(1996.Nature Biotech 14745-50)描述方法的改良方法进行。在玉米中的转化是基因型依赖的并且仅特定的基因型可操作用于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂种是用于转化的供体材料的良好来源，但是其他基因型也可以成功地使用。玉米穗从玉米植物中在授粉后大约11日(DAP)收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
[0948] 小麦转化
[0949] 小麦的转化用Ishida等Ishida等(1996)Nature Biotech 14(6)：745-50描述的方法进行。通常在转化中使用(可从墨西哥CIMMYT获得的)栽培品种Bobwhite。不成熟胚与含有表达载体的根癌农杆菌共培育并且转基因植物通过器官发生而恢复。在与农杆菌温育后，胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的再生培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但可以使用多种选择标记)。培养平板在25℃于光照下培养2-3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至生根培养基并在25℃培养2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝的T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
[0950] 大豆转化
[0951] 根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种对于通过这种方法的转化是可行的。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。从7日龄幼苗中切下下胚轴、胚根和一片子叶。进一步培育上胚轴和余下的子叶以发育腋生节。将这些腋生节切下并与含有表达载体的根癌农杆菌温育。在共培育处理之后，将外植体洗涤并转移至选择培养基。将再生的苗切下并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受的并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
[0952] 油菜/卡诺拉油菜转化
[0953] 使用5-6日龄幼苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)转化。商业栽培品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，但是也可以使用其他品种。对卡诺拉油菜种子作表面消毒以便体外播种。从体外幼苗中切下具有附着子叶的子叶柄外植体，并以(含有表达载体的)农杆菌通过叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而接种。外植体随后在含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂(Phytagar)的MSBAP-3培养基上在23℃，16小时光照下培养2天。在与农杆菌共培育2日后，将叶柄外植体转移至含有的3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上持续7日，并且随后在含头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗具有5-10mm长度时，将苗切下并转移至苗伸长培养基(含0.5mg/l BAP的MSBAP-0.5)。将长度大约2cm的苗转移至用于根诱导的生根培养基(MS0)。将生根的苗移植至温室的土壤中。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
[0954] 苜蓿转化
[0955] 苜蓿的再生性克隆使用(McKersie等，1999Plant Physiol 119：839-847)的方法加以转化。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW与AAtanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture 4：111-112)描述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，RA3品种(威斯康星大学)已经被选择用于组织培养中(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。将叶柄外植体与含有表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等，1999Plant Physiol119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。外植体在黑暗中在含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3天.外植体在半浓缩Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并平板接种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和合适抗生素以抑止农杆菌生长的相同SH诱导培养基上。在数周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素而含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半浓缩Murashige-Skoog培养基上萌发。将生根的幼苗移植至花钵内并且在温室中培育。从表现选择剂耐受性并含有单拷贝T-DNA插入物的植物中产生T1种子。
[0956] 棉花转化
[0957] 根据US 5,159,135中描述的方法使用根癌农杆菌转化棉花。将棉花种子在20分钟内在3％次氯酸钠溶液中表面消毒并在含有500μg/ml头孢噻肟的蒸馏水中洗涤。然后将种子转移到含有50μg/ml苯菌灵的SH培养基中用于发芽。去除4到6天龄幼苗的下胚8
轴，切成0.5cm小块并置于0.8％琼脂上。农杆菌悬浮液(约10 个细胞/ml，从用目的基因和合适的选择标记转化的过夜培养物稀释得到)用于接种下胚轴外植体。室温并光照下
3天后，将组织转移到具有Murashige和Skoog盐与B5维生素(Gamborget al.，Exp.Cell Res.50：151-158(1968))，0.1mg/l 2，4-D，0.1mg/l 6-糠胺嘌呤和750μg/ml MgCl2，并具有用于杀死残留细菌的50到100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄西林的固体培养基(1.6g/l Gelrite)中。2到3个月(每4到6周传代培养)后分离各细胞系并进一步在选择培养基上培养用于组织扩增(30℃，16小时光周期)。转化的组织随后在2到3个月内在非选择培养基上进一步培养以产生体细胞胚。将具有至少4mm长度的看起来健康的胚转移到具有细小蛭石中SH培养基的管中，补充0.1mg/l吲哚乙酸、6-糠胺嘌呤和赤霉酸。然后在30℃以16小时光周期培养胚，并将2到3片叶阶段的小植株转移到具有蛭石和营养物的盆中。植物变硬并随后移入温室中用于进一步培养。
轴，切成0.5cm小块并置于0.8％琼脂上。农杆菌悬浮液(约10 个细胞/ml，从用目的基因和合适的选择标记转化的过夜培养物稀释得到)用于接种下胚轴外植体。室温并光照下
3天后，将组织转移到具有Murashige和Skoog盐与B5维生素(Gamborget al.，Exp.Cell Res.50：151-158(1968))，0.1mg/l 2，4-D，0.1mg/l 6-糠胺嘌呤和750μg/ml MgCl2，并具有用于杀死残留细菌的50到100μg/ml头孢噻肟和400-500μg/ml羧苄西林的固体培养基(1.6g/l Gelrite)中。2到3个月(每4到6周传代培养)后分离各细胞系并进一步在选择培养基上培养用于组织扩增(30℃，16小时光周期)。转化的组织随后在2到3个月内在非选择培养基上进一步培养以产生体细胞胚。将具有至少4mm长度的看起来健康的胚转移到具有细小蛭石中SH培养基的管中，补充0.1mg/l吲哚乙酸、6-糠胺嘌呤和赤霉酸。然后在30℃以16小时光周期培养胚，并将2到3片叶阶段的小植株转移到具有蛭石和营养物的盆中。植物变硬并随后移入温室中用于进一步培养。
[0958] 实施例10：表型评估步骤
[0959] 10.1评估设置
[0960] 产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移到温室中用于生长和收获T1种子。保留6个事件，其中T1后代对于转基因的存在/缺失以3∶1分离。对于每个这些事件，通过监测可见标记表达选择约10个含有转基因的T1幼苗(杂合子和纯合子)和约10个缺少该转基因的T1幼苗(失效合子)。转基因植物和对应的失效合子在随机的位置上并排生长。温室条件是短日照(12小时光照)，光照中28℃，黑暗中22℃，和70％的相对湿度。在非胁迫条件下培育的植物以规律的间隔期浇水，以确保水和养分不是限制性的并确保满足植物完成生长和发育的需要。
[0961] 4个T1事件在T2代中按照与T1代相同的评估步骤进一步评估，但是每个事件具有更多个体。从播种阶段到成熟阶段，植物通过数字成像箱几次。在每个时间点，从至少6个不同角度对每株植物拍下数字图像(2048x1536像素，1600万色彩数)。
[0962] 干旱筛选
[0963] 在正常条件下在花盆土中培养来自T2种子的植物，直到它们接近抽穗期。然后将其转移到“干燥”区域，停止灌溉。向随机选择的花盆中插入湿度探测仪，以监测土壤水含量(SWC)。当SWC低于一定的阈值时，自动向植物持续补水，直到再次达到正常水平。然后将植物再次重新转移到正常条件下。其余的栽培(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培养的植物相同。详细记录正常条件下培养的生长和产量参数。
[0964] 氮使用效率筛选
[0965] 来自T2种子的稻植物在除了营养溶液之外的正常条件下生长与盆栽土壤中。花盆从移植到成熟用特定营养溶液浇灌，该溶液含有减少的氮(N)含量，通常低7到8倍。培养的剩余部分(植物成熟，种子收获)与不在非生物胁迫条件下生长的植物相同。如对正常条件下生长详述的记录生长和产量参数。
[0966] 盐胁迫筛选
[0967] 植物生长在由椰子纤维和argex(3∶1比例)组成的基质上。将小植株移植到温室后前两周内使用正常的营养物溶液。前两周后，向营养物溶液加入25mM盐(NaCl)，直到收获植物。然后测量种子相关的参数。
[0968] 10.2统计学分析：F-检验
[0969] 将双因子ANOVA(方差分析)用作植物表型特征的总体评估的统计学模型。对用本发明的基因转化的所有事件的所有植物测量的所有参数进行F-检验。进行F-检验以检查基因在所有转化事件中的效果并验证该基因的总体效果，也称作总体基因效果。F检验的真实总体基因效果的显著性阈值设为5％概率水平。显著F-检验值指向基因效果，表示并不仅仅是该基因的存在或其位置引起表型差异。
[0970] 因为实施了具有重叠事件的两个实验，故进行联合分析。这用于检验对这两个实验影响的一致性，并且如果一致，则用于积累来自两个实验的证据以提高结论的可信度。所用的方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。通过比较似然比检验与卡方分布获得P-值。
[0971] 10.3测量的参数
[0972] 生物量相关的参数测量
[0973] 从播种阶段到成熟阶段，植物通过数字成像箱几次。在每个时间点，从至少6个不同角度对每株植物拍下数字图像(2048x1536像素，1600万色彩数)。通过对来自地上植物部分的数字图像上区别于背景的像素总数计数来确定植物地上部分面积(或者叶子生物量)。该值对在相同时间点从不同角度拍摄的图像平均并通过校正转化为物理表面值，其以平方mm表示。实验表明以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是植物达到其最大叶子生物量的时间点时测量的面积。早期萌发势是萌发后三周的植物(幼苗)地上部分面积。根生物量的增加表示为总根生物量的增加(测量为在植物寿命中观察到的根的最大生物量)；或者表示为根/枝条指数的增加(测量为在根和枝条的活跃生长期中根质量和枝条质量之间的比值)。
[0974] 通过对来自地上植物部分的区别于背景的像素总数计数确定早期萌发势。该值对在相同时间点从不同角度拍摄的图像平均并通过校正转化为物理表面值，以平方mm表示。下文描述的结果是萌发后三周的植物的结果。
[0975] 种子相关的参数测量
[0976] 将成熟的主圆锥花序收获，计数，装袋，用条形码标记，然后在烘箱中37℃下干燥3天。然后将圆锥花序脱粒并收集和计数所有种子。用鼓风装置分离饱满的外壳与空壳。
丢弃空壳并再次计数剩余的部分。在分析天平上对饱满外壳称重。通过计数分离步骤后剩余的饱满外壳数来确定饱满种子数。通过对从植物收获的所有饱满外壳称重来测量总种子产量。通过对从植物收获的外壳数目计数测量每株植物的总种子数。从计数的饱满种子数和它们的总重量外推千粒重(TKW)。本发明中的收获指数(HI)定义为总种子产量和地上部
2 6
分面积(mm)之间的比值，再乘以因数10。每个圆锥花序的总花数在本发明中定义为种子总数和成熟主圆锥花序数目的比值。如本文定义的种子饱满率是饱满种子数在种子(或小花)总数中占的比例(表示为％)。
丢弃空壳并再次计数剩余的部分。在分析天平上对饱满外壳称重。通过计数分离步骤后剩余的饱满外壳数来确定饱满种子数。通过对从植物收获的所有饱满外壳称重来测量总种子产量。通过对从植物收获的外壳数目计数测量每株植物的总种子数。从计数的饱满种子数和它们的总重量外推千粒重(TKW)。本发明中的收获指数(HI)定义为总种子产量和地上部
2 6
分面积(mm)之间的比值，再乘以因数10。每个圆锥花序的总花数在本发明中定义为种子总数和成熟主圆锥花序数目的比值。如本文定义的种子饱满率是饱满种子数在种子(或小花)总数中占的比例(表示为％)。
[0977] 实施例11：转基因植物表型评价的结果
[0978] 11.1.SP1激活必需辅因子(CRSP)多肽
[0979] 下文给出了评价非胁迫条件下培育的转基因稻植物的结果，其中所述的转基因稻植物表达SEQ ID NO：1的核酸序列。对从F-检验具有p＜0.05和在5％阈值以上的产量参数显示总体百分数。
[0980]
[0981] 11.2.Myb相关的CAB启动子结合(MCB)多肽
[0982] 下文给出了评价非胁迫条件下T1和T2代转基因稻植物的结果，其中所述的转基因稻植物表达包含SEQ ID NO：44中最长可读框的核酸。关于产生转基因植物的细节，见前述实施例。
[0983] 在表E1中描述了在非胁迫条件下处于T1代的转基因稻植物中评价下文所述产量参数的结果。观察到生长势(早期萌发势；萌发势(EmerVigor))、收获指数(harvestindex)和植物高度(HeightMax)增加至少5％。
[0984] 表E1：
[0985]
[0986] 在表E2中给出了在非胁迫条件下处于T2代的转基因稻植物中评价下文所述产量参数的结果。观察到植物高度(最大高度)、总种子重量(totalwgseeds)、饱满种子数(nrfilledseed)、饱满率(fillrate)、收获指数(harvestindex)和千粒重增加至少5％(表E2)。
[0987] 表E2：
[0988]
[0989] 11.3.Sirtuin 2或沉默信息调节物2(SRT2)多肽
[0990] 下文描述了评价干旱胁迫条件下T2代转基因稻植物的结果，其中所述的转基因稻植物表达如前述实施例中所详述那样克隆的包含SEQ ID NO：198中最长可读框的核酸。观察到众多产量相关性状增加至少5％，所述的产量相关性状包括绿色生物量(AreaMax)、萌发势(EmerVigor)、总种子重量(totalwgseeds)、饱满种子数(nrfilledseed)、饱满种子数(nrfilledseed)、每圆锥花序花数(flowerperpan)和总种子数(nrtotalseed)(表E3)。
[0991] 表E3.干旱筛选下评价的结果
[0992]
[0993] 下文描述了评价非胁迫条件下T2代转基因稻植物根系的结果(表E4)，其中所述的转基因稻植物表达如前述实施例中所详述那样克隆的包含SEQ ID NO：198中最长可读框的核酸。根系如上文所述成像。根可以根据其直径分成两类：粗根组和细根组。与对照植物相比较，在转基因植物中观察到粗根相对于细根的比例增加(见表E4)。
[0994] 表E4.非胁迫条件下培育的植物
[0995]
[0996] 11.4.SPX-RING(SYG1，Pho81，XPR1-锌指，RING型)多肽
[0997] 下文描述了评价非胁迫条件下T1代转基因稻植物的结果，其中所述的转基因稻植物表达包含SEQ ID NO：270中最长可读框的核酸。关于产生转基因植物的细节，见前述实施例。
[0998] 下文描述了评价干旱筛选下转基因稻植物(前述实施例)的结果。观察到总种子重量(totalwgseeds)、饱满种子数(nrfilledseed)、饱满率(fillrate)、每圆锥花序花数和收获指数(harvestindex)增加至少5％。在表E5中显示了该实验中两个最佳事件的结果。
[0999] 表E5.转基因植物中与对照植物相比的增加百分数
[1000]产量性状 事件9A 事件21A 平均
总种子重量 42 33 37.5
饱满率 48 38 43
收获指数 33 28 30.5
饱满种子数 40 35 37.5
总种子重量 42 33 37.5
饱满率 48 38 43
收获指数 33 28 30.5
饱满种子数 40 35 37.5
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