包含含锌磁性金属氧化物纳米颗粒的磁共振成像造影剂
阅读：64发布：2022-01-03
专利汇可以提供包含含锌磁性金属氧化物纳米颗粒的磁共振成像造影剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及包含含锌 水 溶性金属 氧 化物纳米颗粒并且具有提高的造影作用的MRI 造影剂 。所述含锌 水溶性 金属氧化物纳米颗粒的特征在于将锌添加到含有金属氧化物纳米颗粒的基质中或取代所述基质中的金属，导致MRI造影作用改进。此外，本发明的含锌金属氧化物纳米颗粒包括其中所述纳米颗粒与 生物 活性物质(例如 蛋白质 、 抗体 和化学材料)相缀合的具有“含锌金属氧化物纳米颗粒－生物/化学活性物质”之杂化结构的MRI造影剂。，下面是包含含锌磁性金属氧化物纳米颗粒的磁共振成像造影剂专利的具体信息内容。
1.包含含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI造影剂。
2.权利要求1所述的MRI造影剂，其中所述含锌金属氧化物纳米 颗粒是其中锌被添加到金属氧化物纳米颗粒基质中以取代基质金属或 被引入到间隙空洞中的化合物。
3.权利要求2所述的MRI造影剂，其中所述含锌金属氧化物纳米 颗粒与所述金属氧化物纳米颗粒基质相比较而言饱和磁化度Ms提高或 者MR造影作用R2或R1增强。
4.权利要求3所述的MRI造影剂，其中所述含锌金属氧化物纳米 颗粒与所述金属氧化物纳米颗粒基质相比较而言MRI造影作用R2或 R1增加至少40％。
5.权利要求1至3中任一项所述的MRI造影剂，其中所述含锌金 属氧化物纳米颗粒是其中锌被添加到金属氧化物基质中以取代一部分 基质金属原子或被引入到间隙空洞中的化合物，
其中所述金属氧化物基质是具有下述化学式的化合物：
(a)MaOb(0
(b)McM’dOe(0
(c)ZnfMa-fOb(0
7.权利要求5所述的MRI造影剂，其中M’是选自Li、Na、K、 Rb、Cs、Be、Mg、Ca、Sr、Ba、Ra、Ge、Ga、Bi、In、Si、Ge、Ti、 V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Y、Zr、Nb、Mo、Tc、Ru、Rh、Pd、 Ag、Cd、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、Au、Hg、镧系元素和锕系元 素的元素。
8.权利要求5所述的MRI造影剂，其中所述含锌金属氧化物纳米 颗粒是其中锌被添加到金属氧化物基质中以取代一部分基质金属原子 或被引入到间隙空洞中的化合物，
其中所述金属氧化物基质是具有下述化学式的化合物：
(e)M”hFeiOj(0
(f)ZnkM”h-kFeiOj(0
其中所述金属氧化物基质是具有下述化学式的化合物：
(g)FelOm(0
(i)ZnqFel-qOm(0
11.权利要求1至3中任一项所述的MRI造影剂，其中所述含锌金 属氧化物纳米颗粒的饱和磁化度为至少60emu/g(磁性原子)。
12.权利要求1至3中任一项所述的MRI造影剂，其中所述含锌 金属氧化物纳米颗粒自身分散在水中，或者所述含锌金属氧化物纳米颗 粒被待分散在水溶液中的水溶性多官能团配体包覆。
13.权利要求1至3中任一项所述的MRI造影剂，其中通过包括 下述步骤的方法制备所述含锌金属氧化物纳米颗粒：
(1)在有机溶剂中合成水不溶性含锌纳米颗粒；
(2)将所述水不溶性含锌纳米颗粒溶解在第一溶剂中，并将水溶 性多官能团配体溶解在第二溶剂中；以及
(3)将由步骤(2)所得的两种溶液相混合使得所述多官能团配体 缀合在所述水不溶性含锌纳米颗粒的表面上，随后通过溶解在水溶液中 进行分离。
14.权利要求13所述的MRI造影剂，其中所述水溶性多官能团配 体包括与所述含锌金属氧化物纳米颗粒相键合的连接区(LI)。
15.权利要求14所述的MRI造影剂，其中所述含锌金属氧化物纳 米颗粒与所述水溶性多官能团配体的连接是通过使用选自离子键、共价 键、氢键、疏水键、金属-配体配位共价键或其组合的键而形成的。
16.权利要求14所述的MRI造影剂，其中所述水溶性多官能团配 体还包含：
用于键合活性物质的反应区(LII)；
用于交联配体的交联区(LIII)；或
包含所述反应区(LII)和所述交联区(LIII)的反应-交联区(LII-LIII)。
17.权利要求14所述的MRI造影剂，其中所述连接区(LI)包含 选自以下的官能团：-CHO、-COOH、-NH2、-SH、-CONH2、-PO3H、 -OPO4H、-SO3H、-OSO3H、-N3、-NR3OH(R＝CnH2n+1，0≤n≤16)、-OH、 -SS-、-NO2、-CHO、-COX(X＝F、Cl、Br或I)、-COOCO-、-CONH- 或-CN以及含有至少两个碳原子的烃。
18.权利要求16所述的MRI造影剂，其中所述反应区(LII)包含 选自以下的至少一个官能团：-CHO、-SH、-COOH、-NH2、-OH、-PO3H、 -PO4H2、-SO3H、-OSO3H、-NR3+X-(R＝CnHm，0≤n≤16，0≤m≤34，X＝ OH、Cl或Br)、NR4+X-(R＝CnHm，0≤n≤16，0≤m≤34，X＝OH、Cl或 Br)、-N3、-SCOCH3、-SCN、-NCS、-NCO、-CN、-F、-Cl、-I、-Br、 环氧基、-ONO2、-PO(OH)2、-C＝NNH2、-HC＝CH-、以及-C≡C-。
19.权利要求16所述的MRI造影剂，其中所述交联区(LIII)包含 选自以下的至少一个官能团：-SH、-CHO、-COOH、-NH2、-OH、-PO3H、 -PO4H2、-SO3H、-OSO3H、-NR3+X-(R＝CnHm，0≤n≤16，0≤m≤34，X＝OH、 Cl或Br)、NR4+X-(R＝CnHm，0≤n≤16，0≤m≤34，X＝OH、Cl或Br)、 -N3、-SCOCH3、-SCN、-NCS、-NCO、-CN、-F、-Cl、-I、-Br、环氧 基、-ONO2、-PO(OH)2、-C＝NNH2、-HC＝CH-以及-C≡C-。
20.权利要求14所述的MRI造影剂，其中所述水溶性多官能团配 体是选自二巯基丁二酸、二巯基马来酸、二巯基戊二酸、四甲基氢氧化 铵和四乙基氢氧化铵中的至少一种。
21.权利要求14所述的MRI造影剂，其中所述水溶性多官能团配 体是包含至少一个氨基酸的肽，所述氨基酸具有-SH、-COOH、-NH2 或-OH中的至少一种作为官能团。
22.权利要求14所述的MRI造影剂，其中所述水溶性多官能团配 体是选自蛋白质、白蛋白、抗生物素蛋白、抗体、第二抗体、细胞色素、 酪蛋白、肌球蛋白、大豆球蛋白、胡萝卜素、胶原、磷脂、球蛋白和光 蛋白中的至少一种。
23.权利要求14所述的MRI造影剂，其中所述水溶性多官能团配 体包括选自下述物质中的至少一种：葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰 葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、N-乙酰神经氨酸、果糖、木糖、山梨醇、 蔗糖、麦芽糖、糖醛(glycoaldehyde)、二羟基丙酮、赤藓糖、赤藓酮 糖、阿拉伯糖、木酮糖、乳糖、海藻糖、mellibose、纤维二糖、棉子糖、 松三糖、麦芽三糖、水苏四糖、estrodose、木聚糖、阿拉伯聚糖、己聚 糖、果聚糖、半乳聚糖、甘露聚糖、琼脂胶、藻酸、半纤维素、羟丙基 甲基纤维素(hypromellose)、直链淀粉、去氧丙酮、甘油醛、甲壳素、 琼脂糖、葡聚糖、核糖、核酮糖、半乳糖、羧甲基纤维素、糖原葡聚糖 (glycogendextran)、羰基葡聚糖(carbodextran)、多糖、环葡聚糖 (cyclodextran)、支链淀粉(pullulan)、纤维素、淀粉、糖原、碳水化 合物、聚磷腈(polyphosphagen)、聚交酯、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、聚 己内酯、聚酸酐、聚马来酸、聚马来酸衍生物、聚氰基丙烯酸烷基酯、 聚羟基丁酸酯、聚碳酸酯、聚原酸酯、聚乙二醇、聚-L-赖氨酸、聚羟 基乙酸、聚甲基丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮。
24.权利要求16所述的MRI造影剂，其中所述连接区(LI)的官 能团包括-COOH或-OH，所述反应区(LII)的官能团包括-COOH、-NH2、 -NR4+X-(R＝CnHm，0≤n≤16并且0≤m≤34，X＝OH、Cl或Br)、或-SH。
25.权利要求16所述的MRI造影剂，其中所述含锌金属氧化物纳 米颗粒是含锌金属氧化物纳米颗粒与生物/化学活性物质的杂化纳米颗 粒，其中活性物质与水溶性多官能团配体的反应区(LII)相键合。
26.权利要求25所述的MRI造影剂，其中所述活性物质选自化学 官能单体、聚合物、无机载体、无机材料以及生物功能物质。
27.权利要求26所述的MRI造影剂，其中所述化学官能单体是选 自抗癌剂、抗生素、维生素、含有叶酸的药物、脂肪酸、类固醇、激素、 嘌呤、嘧啶、单糖和二糖中的至少一种。
28.权利要求26所述的MRI造影剂，其中所述化学官能单体包括 选自以下中的至少一种官能团：COOH、-NH2、-SH、-SS-、-CONH2、 -PO3H、-PO4H2、-PO2(OR1)(OR2)(R1、R2＝CsHtNuOwSxPyXz，X＝-F、 -Cl、-Br或-I，0≤s≤20，0≤t≤2(s+u)+1，0≤u≤2s，0≤w≤2s，0≤x≤2s，0≤y≤2s 以及0≤z≤2s)、-SO3H、-OSO3H、-NO2、-CHO、-COSH、-COX、-COOCO-、 -CORCO-(R＝ClHm，0≤l≤3，0≤m≤2l+1)、-COOR、-CN、-N3、-N2、-NROH (R＝CsHtNuOwSxPyXz，X＝-F、-Cl、-Br或-I，0≤s≤20，0≤t≤2(s+u)+1， 0≤u≤2s，0≤w≤2s，0≤x≤2s，0≤y≤2s以及0≤z≤2s)、-NR1NR2R3(R1，R2，R3＝ CsHtNuOwSxPyXz，X＝-F、-Cl、-Br或-I，0≤s≤20，0≤t≤2(s+u)+1，0≤u≤2s， 0≤w≤2s，0≤x≤2s，0≤y≤2s以及0≤z≤2s)、-CONHNR1R2(R1，R2＝ CsHtNuOwSxPyXz，X＝-F、-Cl、-Br或-I，0≤s≤20，0≤t≤2(s+u)+1，0≤u≤2s， 0≤w≤2s，0≤x≤2s，0≤y≤2s以及0≤z≤2s)、-NR1R2R3X’(R1，R2，R3＝ CsHtNuOwSxPyXz，X＝-F、-Cl、-Br或-I，0≤s≤20，0≤t≤2(s+u)+1，0≤u≤2s， 0≤w≤2s，0≤x≤2s，0≤y≤2s以及0≤z≤2s)、-OH、-SCOCH3、-F、-Cl、-Br、 -I、-SCN、-NCO、-OCN、-环氧基、-C＝NNH2、-HC＝CH-以及-C≡C-。
29.权利要求26所述的MRI造影剂，其中所述聚合物是选自以下 聚合物中的至少一种：葡聚糖、羰基葡聚糖(carbodextran)、多糖、环 葡聚糖(cyclodextran)、支链淀粉(pullulan)、纤维素、淀粉、糖原、 碳水化合物、单糖、二糖、寡糖、聚磷腈、聚交酯、聚(乳酸-共-羟基乙 酸)、聚己内酯、聚酸酐、聚苹果酸、聚苹果酸衍生物、聚氰基丙烯酸 烷基酯、聚羟基丁酸酯、聚碳酸酯、聚原酸酯、聚乙二醇、聚-L-赖氨 酸、聚羟基乙酸、聚甲基丙烯酸甲酯以及聚乙烯吡咯烷酮。
30.权利要求26所述的MRI造影剂，其中所述无机载体选自金属 氧化物、金属硫族(chalcogen)化合物、无机陶瓷材料、碳材料、半导 体基质及其组合。
31.权利要求26所述的MRI造影剂，其中所述无机材料选自以下 物质：
包含选自第一族元素、第二族元素、过渡金属元素、第十四族元素、 第十五族元素、镧系元素和锕系元素中至少一种元素的金属氧化物；
包含选自第十三族元素、第十二族元素、第十四族元素、第十五族 元素和第十六族元素中至少两种的半导体；
过渡金属元素、第十三族元素、第十四族元素、第十五族元素和第 十六族元素。
32.权利要求31所述的MRI造影剂，其中所述无机材料选自以下 物质：
包含选自以下元素中至少一种的金属氧化物：Li、Na、Be、Ca、 Ge、Ba、Mg、Sr、Ra、Sc、Ti、V、Y、Tc、Mn、Fe、Co、Ni、Zn、 Zr、Nd、Cr、Ru、Rh、Pd、Ag、Cd、Hf、Ta、W、Re、Os、Ir、Pt、 Au、B、Al、Ga、In、C、Si、Ge、An、Pb、P、As、Sb、Bi、Ce、 Pr、Nd、Pm、Sm、Tb、Dy、Ho、Er、Tm、Yb、Lu、镧系元素和锕 系元素；
包含选自以下元素中至少两种的半导体：Ga、In、Tl、Zn、Cd、 Hg、C、Si、Ge、Sn、Pb、N、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Te以及 Po；
Au；Ag；Pt；Cu；Pd；Mo；Os；W；Ti；W；V；Cr；Zn；Nb； Ru；Rh；Ir；Co；Mn；Fe；Ni；Cr；Y；Zr；Cd；Ta；Re；Al；Ga； In；C；Si；Sn；Pb；As；Sb；Bi；Se；Te以及Po。
33.权利要求26所述的MRI造影剂，其中所述生物功能材料是选 自以下材料中的至少一种：DNA，RNA，肽，靶特异性结合物质如抗原、 抗体、半抗原、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、 蛋白质A、蛋白质G、凝集素、选择素，药物活性物质如抗癌剂、抗生 素、激素、激素拮抗剂、白细胞介素、干扰素、生长因子、肿瘤坏死因 子、内毒素、淋巴毒素、尿激酶、链激酶、组织纤溶酶原激活剂、蛋白 酶抑制剂、烷基磷酸胆碱、表面活性剂、心血管药物、胃肠道药物、神 经药物，生物活性酶如水解酶、氧化还原酶、裂解酶、异构酶和合成酶， 酶辅因子以及酶抑制剂。
34.权利要求1至3中任一项所述的MRI造影剂，其中所述含锌 金属氧化物纳米颗粒与放射性同位素相键合。
35.权利要求34所述的MRI造影剂，所述MRI造影剂被用于单 光子发射计算机断层成像(SPECT)或正电子发射断层成像(PET)。
36.权利要求1至3中任一项所述的MRI造影剂，其中所述水溶 性含锌金属氧化物纳米颗粒包含荧光材料。
37.权利要求36所述的MRI造影剂，其中所述MRI造影剂用于 光成像和光谱术。
38.权利要求1至3中任一项所述的MRI造影剂，其中所述含锌 金属氧化物纳米颗粒与X射线成像剂和超声成像剂相结合。
39.权利要求38所述的MRI造影剂，其中所述MRI造影剂用于X 射线成像和超声成像。
技术领域
本发明涉及包含含锌磁性金属氧化物纳米颗粒的磁共振成像造影 剂。
背景技术
纳米技术是一种在原子或分子水平上控制或操纵材料的技术，其中 结合了多种技术，适用于制备新材料和新设备。纳米技术具有广泛的应 用，例如应用于电学、材料学、通讯、机械、医药、农业、能源和环境。 使得纳米级颗粒变得重要的原因在于它们能提供微米级颗粒所不具有 的独特特征。尤其是，相比于微米级颗粒，通过在纳米水平进行控制， 纳米级颗粒可具有显著改善的材料性质。
预计纳米尺寸磁性材料可用于多个生物医学领域并大大促进这些 领域的发展。与血管和细胞相比较而言，磁性纳米颗粒更小，其大小与 蛋白质相似，这使得它们可到达各种类型的生物组织，因此磁性纳米颗 粒已经用于生物学诊断多年。此外，近年来纳米技术的快速发展使得能 制备可受人工磁力控制的功能强的磁性纳米颗粒。同时，广泛研究了其 体内化学/生物学稳定性。
磁性纳米颗粒可用在多种纳米生物技术中，例如利用磁共振成像 (MRI)的分子成像、疾病的跟踪和诊断、高热疗法、药物递送、磁性 生物传感器和微流体系统。尤其是，磁性纳米颗粒可用作MRI的诊断 探针。在外加磁场下，在纳米颗粒中诱导出磁矩μ。感应磁场影响围绕 磁性纳米颗粒的水分子之氢原子的自旋-自旋(T2)弛豫时间和自旋-晶 格(T1)弛豫时间，从而导致磁共振信号增强。成像信号的增强可以作 为弛豫度(R＝1/T)进行测量。
磁性纳米颗粒的上述性质可用于对组织中水质子密度、血管分布、 疾病(例如癌症)的诊断以及分子和细胞水平上的生命现象进行成像。 直到现在，已经如下开发了磁性纳米颗粒MRI造影剂：
美国专利No.4,849,210公开了被引入到生物可降解基质材料(蛋白 质、碳水化合物、脂质等)中的30nm大小的超顺磁性磁铁矿颗粒以及 其在内脏(例如肝脏或脾脏)MRI中的应用；
美国专利No.5,023,072公开了用于胃肠道MRI的铁氧化物超顺磁 性纳米颗粒。顺磁性、超顺磁性和铁磁性颗粒与多糖相结合用于胃肠道 成像；
美国专利No.5,055,288公开了用于血管成像的生物可降解超顺磁性 铁氧化物。单个铁氧化物的直径小于50nm，其聚集体的直径小于400 nm。这两者在生物环境中均是稳定的；
EP No.0656368公开了利用纳米级的羧基多糖包覆的磁性铁氧化物 纳米颗粒。所述纳米颗粒是利用共沉淀法制备的，其大小范围为约2至 7nm，用于例如脑血管系统成像和药物递送系统；
美国专利No.6,023,777公开了与碳水化合物缀合的磁铁矿颗粒。所 述纳米颗粒是通过共沉淀法在水性介质中合成的并且利用超声波反应 与碳水化合物聚合物进行缀合以用作胃肠外施用的MRI造影剂；
美国专利No.6,599,498公开了利用碳水化合物包覆的并且是热稳定 性的MRI造影剂。所述铁氧化物纳米颗粒是通过共沉淀法合成的使得 大小为约10nm，并且用于血管系统的MRI；
美国专利申请公开No.US2006-0222594公开了一种能选择性靶向的 磁性纳米颗粒MRI造影剂，其中利用由聚合物组成的胶束包覆由共沉 淀法合成的铁氧化物纳米颗粒；
韩国专利申请公开No.KR2006-0098213公开了用于肿瘤诊断的纳 米颗粒。将通过高温热分解在有机溶剂中合成的铁氧化物磁性纳米颗粒 溶解在水中并与抗体连接，以形成用于肿瘤诊断的纳米杂化体。
用于这些MR造影剂的磁性纳米颗粒应当满足其高效MRI应用的 下述必要条件：
1)它们应当具有足够高的磁矩以灵敏地对外部磁场作出反应；
2)它们应当表现出极好的MR造影作用；
3)它们应当稳定地分散在水性介质和体内环境中；
4)可将它们与生物活性物质相缀合；以及
5)它们应当表现出低毒性和高生物相容性。
按照上述现有技术制备的基于纳米颗粒的成像造影剂、可商购的造 影剂(例如Feridex和Resovist)以及被水溶性配体所围绕的铁氧化物 纳米颗粒具有相对低的磁矩和相对弱的MR造影作用(R2)。这导致在 MRI中表现出信号增强作用降低，因此已表明它们在MRI诊断中具有 显著问题。
解决这些问题的方法是开发具有提高磁矩的含有磁性纳米颗粒的 MR造影剂。为了实现增加磁矩的目的，控制金属氧化物纳米颗粒的组 成可能是一种方法(Ittrich et al，Rofo 2005，177，1151；Shultz et al，J. Magn.Magn，Mater.2007，311,464)。已经尝试将各种金属掺杂物添加 到铁氧化物纳米颗粒基质中。然而，大多数可能的金属掺杂物(例如 Co、Ni、Mg、Ba等)不增加磁矩，在某些情形下添加金属(例如Co、 Ni、Mg、Ba)之后甚至降低磁矩(Valdés-Solís et al，Nanotechnology 2007， 18，145603)。
最近，作为提高MRI造影作用的唯一一个实例，韩国专利申请公 开No.KR2006-0098213公开了具有改善的MR造影作用的含锰金属氧 化物纳米颗粒。这是基于锰对磁矩的改善。在此情形下，掺杂锰使得金 属氧化物的磁矩增加了约10％，但是MR造影作用(R2)增加了70至 100％。
因此，显然，开发新的具有更多提高磁矩的金属氧化物在最大程度 提高MR造影作用中非常重要。
预计纳米尺寸磁性材料可用于多个生物医学领域并大大促进这些 领域的发展。与血管和细胞相比较而言，磁性纳米颗粒更小，其大小与 蛋白质相似，这使得它们可到达各种类型的生物组织，因此磁性纳米颗 粒已经用于生物学诊断多年。此外，近年来纳米技术的快速发展使得能 制备可受人工磁力控制的功能强的磁性纳米颗粒。同时，广泛研究了其 体内化学/生物学稳定性。
磁性纳米颗粒可用在多种纳米生物技术中，例如利用磁共振成像 (MRI)的分子成像、疾病的跟踪和诊断、高热疗法、药物递送、磁性 生物传感器和微流体系统。尤其是，磁性纳米颗粒可用作MRI的诊断 探针。在外加磁场下，在纳米颗粒中诱导出磁矩μ。感应磁场影响围绕 磁性纳米颗粒的水分子之氢原子的自旋-自旋(T2)弛豫时间和自旋-晶 格(T1)弛豫时间，从而导致磁共振信号增强。成像信号的增强可以作 为弛豫度(R＝1/T)进行测量。
磁性纳米颗粒的上述性质可用于对组织中水质子密度、血管分布、 疾病(例如癌症)的诊断以及分子和细胞水平上的生命现象进行成像。 直到现在，已经如下开发了磁性纳米颗粒MRI造影剂：
美国专利No.4,849,210公开了被引入到生物可降解基质材料(蛋白 质、碳水化合物、脂质等)中的30nm大小的超顺磁性磁铁矿颗粒以及 其在内脏(例如肝脏或脾脏)MRI中的应用；
美国专利No.5,023,072公开了用于胃肠道MRI的铁氧化物超顺磁 性纳米颗粒。顺磁性、超顺磁性和铁磁性颗粒与多糖相结合用于胃肠道 成像；
美国专利No.5,055,288公开了用于血管成像的生物可降解超顺磁性 铁氧化物。单个铁氧化物的直径小于50nm，其聚集体的直径小于400 nm。这两者在生物环境中均是稳定的；
EP No.0656368公开了利用纳米级的羧基多糖包覆的磁性铁氧化物 纳米颗粒。所述纳米颗粒是利用共沉淀法制备的，其大小范围为约2至 7nm，用于例如脑血管系统成像和药物递送系统；
美国专利No.6,023,777公开了与碳水化合物缀合的磁铁矿颗粒。所 述纳米颗粒是通过共沉淀法在水性介质中合成的并且利用超声波反应 与碳水化合物聚合物进行缀合以用作胃肠外施用的MRI造影剂；
美国专利No.6,599,498公开了利用碳水化合物包覆的并且是热稳定 性的MRI造影剂。所述铁氧化物纳米颗粒是通过共沉淀法合成的使得 大小为约10nm，并且用于血管系统的MRI；
美国专利申请公开No.US2006-0222594公开了一种能选择性靶向的 磁性纳米颗粒MRI造影剂，其中利用由聚合物组成的胶束包覆由共沉 淀法合成的铁氧化物纳米颗粒；
韩国专利申请公开No.KR2006-0098213公开了用于肿瘤诊断的纳 米颗粒。将通过高温热分解在有机溶剂中合成的铁氧化物磁性纳米颗粒 溶解在水中并与抗体连接，以形成用于肿瘤诊断的纳米杂化体。
用于这些MR造影剂的磁性纳米颗粒应当满足其高效MRI应用的 下述必要条件：
1)它们应当具有足够高的磁矩以灵敏地对外部磁场作出反应；
2)它们应当表现出极好的MR造影作用；
3)它们应当稳定地分散在水性介质和体内环境中；
4)可将它们与生物活性物质相缀合；以及
5)它们应当表现出低毒性和高生物相容性。
按照上述现有技术制备的基于纳米颗粒的成像造影剂、可商购的造 影剂(例如Feridex和Resovist)以及被水溶性配体所围绕的铁氧化物 纳米颗粒具有相对低的磁矩和相对弱的MR造影作用(R2)。这导致在 MRI中表现出信号增强作用降低，因此已表明它们在MRI诊断中具有 显著问题。
解决这些问题的方法是开发具有提高磁矩的含有磁性纳米颗粒的 MR造影剂。为了实现增加磁矩的目的，控制金属氧化物纳米颗粒的组 成可能是一种方法(Ittrich et al，Rofo 2005，177，1151；Shultz et al，J. Magn.Magn，Mater.2007，311,464)。已经尝试将各种金属掺杂物添加 到铁氧化物纳米颗粒基质中。然而，大多数可能的金属掺杂物(例如 Co、Ni、Mg、Ba等)不增加磁矩，在某些情形下添加金属(例如Co、 Ni、Mg、Ba)之后甚至降低磁矩(Valdés-Solís et al，Nanotechnology 2007， 18，145603)。
最近，作为提高MRI造影作用的唯一一个实例，韩国专利申请公 开No.KR2006-0098213公开了具有改善的MR造影作用的含锰金属氧 化物纳米颗粒。这是基于锰对磁矩的改善。在此情形下，掺杂锰使得金 属氧化物的磁矩增加了约10％，但是MR造影作用(R2)增加了70至 100％。
因此，显然，开发新的具有更多提高磁矩的金属氧化物在最大程度 提高MR造影作用中非常重要。
发明内容
技术问题
因此，本发明的一个目的在于提供一种新的金属氧化物纳米颗粒 MRI造影剂，其与现有的金属氧化物纳米颗粒相比具有显著提高的MR 信号增强作用和诊断灵敏度。尽管以前还没有提出用于上述目的的任何 特定金属添加剂，但本发明通过实验发现并表明尤其是通过利用锌代替 金属氧化物纳米颗粒基质中的金属或者通过将锌添加到间隙空洞中，能 诱导改进金属氧化物纳米颗粒的磁矩和MR造影作用。本发明的另一个 目的在于提供在水性介质中具有高的胶体稳定性和生物相容性的含锌 MRI造影剂。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了包含含锌磁性金属氧化物纳米颗 粒的MRI造影剂，其特征在于锌原子/离子取代金属氧化物纳米颗粒基 质中的金属或者被添加到金属氧化物纳米颗粒基质的间隙空洞中。本文 中的术语“基质”指其中可添加或减除各种原子的无机纳米颗粒核心和 母体结构。所述含锌金属氧化物磁性纳米颗粒与不含锌的金属氧化物纳 米颗粒基质相比较而言特征在于增大的磁矩和增强的MR信号(R2、 R1)。
本发明提供了MRI造影剂，其特征在于所述含锌金属氧化物纳米 颗粒是其中锌原子/离子被添加到金属氧化物基质中以取代基质中的金 属或被引入到间隙空洞中的化合物，
其中所述金属氧化物纳米颗粒基质是具有下述化学式的化合物：
(a)MaOb(0合金)；或
(b)McM’dOe(0其中所述含锌金属氧化物纳米颗粒具有下述化学式：
(c)ZnfMa-fOb(0(d)ZngMc-gM’dOe(0更优选地，所述含锌金属氧化物纳米颗粒是其中锌原子/离子被添加 到金属氧化物纳米颗粒基质中以取代基质中金属或者被引入到间隙空 洞中的化合物，
其中所述金属氧化物基质是具有下述化学式的化合物：
(e)M”hFeiOj(0其中所述含锌金属氧化物纳米颗粒具有下述化学式：
(f)ZnkM”h-kFeiOj(0最优选地，所述含锌金属氧化物纳米颗粒是其中锌被添加到金属氧 化物基质中以取代基质中金属或者被引入到间隙空洞中的化合物，
其中所述金属氧化物基质是具有下述化学式的化合物：
(g)FelOm(0(h)MnnFeoOp(0其中所述含锌金属氧化物纳米颗粒具有下述化学式：
(i)ZnqFel-qOm(0(j)ZnrMnn-rFeoOp(0由于围绕在每个纳米颗粒周围的加帽配体(capping ligand)或水溶 性多官能团配体，将含锌磁性金属氧化物纳米颗粒自身溶解在水中或分 散在水溶液中。与不含锌的金属氧化物磁性纳米颗粒的MRI造影剂相 比，所述包含含锌磁性金属氧化物纳米颗粒的MRI造影剂具有极好的 磁性(饱和磁化度)和MR造影增强作用(R2或R1)。
此外，本发明还提供了与生物活性材料(例如抗体和蛋白质)以及 化学材料(例如荧光材料)相结合的用于诊断的含有“含锌金属氧化物 纳米颗粒和生物/化学活性材料的杂化纳米颗粒”的MRI造影剂。
本发明还提供了特征在于与用于正电子发射断层成像(PET)和单 光子发射断层成像(SPECT)的成像造影剂(例如放射性同位素)、X 射线成像造影剂(例如碘和硫酸钡)以及超声成像造影剂(例如微泡) 相结合的MRI造影剂。
有益效果
根据本发明的含锌金属氧化物纳米颗粒和含锌金属氧化物杂化纳 米颗粒在水溶液中是稳定的，并且具有极好的磁性和低毒性，所述磁性 与已知的铁氧化物和氧化锰纳米颗粒相比显著增强，因此显著增加了 MRI灵敏度。根据本发明的含锌金属氧化物纳米颗粒或其与生物材料 相缀合的含锌金属氧化物纳米颗粒可用于显著改善常规的磁共振成像 并且可用在诊断治疗系统中。
附图说明
图1举例说明了包含含锌铁氧体磁性纳米颗粒(Zn0.4Fe2.6O4)的 MRI造影剂的(1A)透射电镜(TEM)图、(1B)高分辨TEM及其快 速傅里叶变换图像以及(1C)X射线衍射模式分析。
图2举例说明了具有不同锌含量的包含含锌铁氧体磁性纳米颗粒的 MRI造影剂的TEM图像：(2A)ZnxMn1-xFe2O4(x＝0、0.1、0.2、0.3、 0.4、0.8)、(2B)ZnxFe3-xO4(x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.8)。
图3举例说明了包含含锌铁氧体磁性纳米颗粒的MRI造影剂的X 射线能量色散分析(EDAX)：(3A)ZnxMn1-xFe2O4(x＝0、0.1、0.2、 0.3、0.4、0.8)、(3B)ZnxFe3-xO4(x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.8)。
图4举例说明了其中各种类型的金属氧化物被掺入到用作基质的 Fe3O4纳米颗粒中时所述纳米颗粒的饱和磁化度的比较。
图5举例说明了各种不含锌的金属铁氧体(MFe2O4，M＝Mn，Fe， Co和Ni)和含锌金属铁氧体(Zn0.3Mn0.7Fe2O4)的MRI造影作用的比 较。图5A举例说明了大小为15nm的不含锌的金属铁氧体纳米颗粒的 TEM图像。图5B举例说明了大小为15nm的含锌金属铁氧体的TEM 图像。图5C举例说明了含有相同浓度的图5A和5B纳米颗粒的水的 T2快自旋回波磁共振图和R2弛豫系数的比较。
图6举例说明了根据锌含量的包含含锌磁性金属铁氧体纳米颗粒的 MRI造影剂的饱和磁化度。
图7举例说明了根据锌含量的包含含锌磁性金属铁氧体纳米颗粒的 MRI造影剂的MRI信号。(7A)ZnxMn1-xFe2O4(x＝0、0.1、0.2、0.3、 0.4和0.8)和ZnxFe3-xO4(x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.8)纳米颗粒和 菲立磁(Feridex)、CLIO(交联铁氧化物)的T2快自旋回波MRI，(7B) 图(7A)的彩色编码图像，(7C)根据锌含量的R2弛豫图。
图8举例说明了在水溶液中合成的含锌铁氧化物纳米颗粒 (ZnxFe3-xO4，x＝0.2、0.4)。(8A，8B)TEM图像，(8C，8D)EDAX 分析。
图9是含锌铁氧体纳米颗粒ZnxFe3-xO4(x＝(9A)0.4，(9B)0.3， (9C)0.2，(9D)0.1)的根据锌含量的扩展X射线吸收精细结构(EXAFS) 谱。
图10举例说明了通过利用水溶性多官能团配体进行表面修饰并分 散在水中的含锌MRI造影剂(Zn0.4Fe2.6O4)的各种含水溶液的稳定性 试验。图10A举例说明了根据盐浓度的含水溶液的稳定性。图10B举 例说明了根据酸度(pH)变化的含水溶液的稳定性。
图11举例说明了其中通过尾静脉注射包含含锌铁氧体磁性纳米颗 粒(Zn0.4Fe2.6O4，核心大小：15nm)的MRI造影剂的小鼠肝脏的MR 图像。图11A举例说明了注射纳米颗粒造影剂之前小鼠肝脏的MR图 像。图11B至11D举例说明了注射纳米颗粒造影剂之后小鼠肝脏的MR 图像：注射后立即(11B)、注射10分钟后(11C)和注射30分钟后(11D)。
图12举例说明了含锌金属氧化物纳米颗粒和生物材料的杂化纳米 颗粒的制备(12A)，其中所述生物材料与所述锌锰铁氧体纳米颗粒相缀 合、(12B)电泳和(12C)蛋白质染色。
图13举例说明了包含含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI造影剂的细 胞毒性。(13A)含锌磁性纳米颗粒造影剂(Zn0.4Fe2.6O4)的细胞活力的 根据处理量的比较，(13B)在100μg/ml的处理量下铁氧化物(Fe3O4) 和含锌磁性纳米颗粒造影剂(Zn0.4Fe2.6O4和Zn0.4Mn0.6Fe2O4)的细胞活 力的比较。
图14举例说明了将锌锰铁氧体纳米颗粒与荧光染料(罗丹明)相 缀合而得到的磁-光双模式纳米颗粒。图14A举例说明了荧光光致发光 谱和荧光图像的结果，图14B举例说明了所述双模式纳米颗粒的R2自 旋-自旋弛豫系数，图14C举例说明了磁共振图像的结果。
发明实施方式
本发明人发现，当锌被包含在含有不同金属添加剂的金属氧化物纳 米颗粒中时，磁性显著增强，他们开发了具有显著增强的磁性和提高的 MRI信号增强作用的包含含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI造影剂。根 据本发明的“含锌金属氧化物纳米颗粒”是其中锌原子/离子被添加到 金属氧化物纳米颗粒基质中以取代金属原子或者被添加到间隙空洞中 的纳米颗粒。所述含锌金属氧化物纳米颗粒具有极好的磁矩和R2、R1 MRI信号增强作用、在水溶液中的高胶体稳定性、以及由于生物相容 性提高而带来的低毒性，并且其易于与具有生物活性和化学活性的材料 相缀合，从而满足作为MRI造影剂的最佳条件。
本发明说明书中所用的“含锌金属氧化物纳米颗粒”意指直径范围 为1nm至1000nm、优选2nm至100nm的纳米级颗粒。它们以1 μg/ml～500mg/ml，优选1μg/ml～50mg/ml的浓度分散在水中。所述纳 米颗粒的流体力学直径为1nm至500μm，优选1nm至50μm。
所述“金属氧化物纳米颗粒基质”意指其中被加入锌的无机纳米材 料母体。用作基质的金属氧化物是具有下述化学式的纳米颗粒：
MaOb(0McM’dOe(0具有下述化学式的纳米颗粒是优选的：M”hFeiOj(0因此，通过取代一部分所述金属原子或者被添加到间隙空洞中，它 们具有下式：
ZnfMa-fOb(0ZngMc-gM’dOe(0更优选地，其是包含ZnkM”h-kFeiOj(0优选地，在所述含锌金属氧化物纳米颗粒中，锌和其它金属材料的 化学计量含量比如下：0.001<‘锌/(全部金属材料-锌)’<10，优选0.01< ‘锌/(全部金属材料-锌)’<1，更优选0.03<‘锌/(全部金属材料-锌)’<0.5。 当包含如上所述的锌时，可获得高饱和磁化度。
与此相关，术语“含锌”意指将锌原子置于存在于所述金属氧化物 纳米颗粒基质的晶体结构的氧原子间的阳离子间隙孔洞之中的四面体 孔洞或八面体孔洞中。因此，当生长所述含锌水溶性或水分散性的金属 氧化物纳米颗粒时，在作为基质的所述金属氧化物纳米颗粒首先合成 后，存在于基质上的四面体孔洞或八面体孔洞中的金属原子被锌所取 代，或者当生长所述金属氧化物纳米颗粒基质时，金属原子和锌同时被 掺入以合成所述纳米颗粒，使得锌被置于氧原子的阳离子间隙孔洞之中 的四面体孔洞或八面体孔洞中(例如ZnO+Fe2O3→ZnFe2O4)。尤其是， 在四面体孔洞中的锌是重要的，因为它们在增强纳米颗粒的磁矩中发挥 着作用。其中待添加锌的纳米颗粒的金属氧化物的组成可以是非化学计 量的。
与金属氧化物基质相比较而言，本发明的含锌金属氧化物纳米颗粒 具有更好的饱和磁化度(Ms)或MRI造影作用(R2或R1)。本发明的 含锌金属氧化物的饱和磁化度优选是60emu/g(磁性原子)或更高，更 优选为100emu/g(磁性原子)或更高，最优选为125emu/g(磁性原子) 或更高。当颗粒具有上述磁矩时，其能有效用作MRI造影剂。换言之， 与金属氧化物纳米颗粒基质相比较而言，本发明的含锌金属氧化物纳米 颗粒的MRI造影作用(R2或R1)增加了至少10％，更优选增加了至 少40％，甚至更优选增加了100％或更多，最优选增加300％或更多。
本发明中所用的“含锌金属氧化物纳米颗粒”意指其中水溶性多官 能团配体与所述含锌金属氧化物纳米颗粒相键连并围绕在其周围的纳 米颗粒，或者不与特定配体相连接而本身能溶解或分散在水溶液中的纳 米颗粒。
本发明的含锌金属氧化物纳米颗粒可以多种形式提供，所述形式将 取决于选择何种含锌金属氧化物和多官能团配体。
本文中所用的“水溶性多官能团配体”指可与含锌纳米颗粒相键连 以溶解在水中并稳定所述纳米颗粒并且使得所述纳米颗粒能够与生物/ 化学活性材料相键连的配体。
所述水溶性多官能团配体可包括(a)连接区(LI)，还可包括(b) 反应区(LII)、(c)交联区(LIII)或同时包含所述反应区(LII)和所述 交联区(LIII)的反应-交联区(LII-LIII)。下文中将详细描述所述水溶性 多官能团配体。
所述“连接区(LI)”意指所述多官能团配体的一部分，其包含能与 所述纳米颗粒相结合的官能团，优选该官能团的末端部分。因此，优选 所述连接区包含与构成所述纳米颗粒的材料具有高亲和力的官能团。在 此，所述纳米颗粒可通过离子键、共价键、氢键、疏水键或金属-配体 配位共价键与所述连接区相连。因此，可根据构成所述纳米颗粒的材料 来选择所述多官能团配体的多种连接区。例如，利用离子键、共价键、 氢键或金属-配体配位共价键的连接区可包含-COOH、-NH2、-SH、 -CONH2、-PO3H、-OPO4H、-SO3H、-OSO3H、-N3、-NR3OH(R＝CnH2n+1， 0≤n≤16)、OH、-SS-、-NO2、-CHO、-COX(X＝F、Cl、Br或I)、-COOCO-、 -CONH-或-CN，利用疏水键的连接区可包含含有两个或更多个碳原子 的烃链，但不限于这些。
所述“反应区(LII)”意指所述多官能团配体的一部分，其包含能 与所述活性物质相结合的官能团，优选与所述连接区相对的另一末端部 分。所述反应区的官能团可根据所述活性物质及其化学式的种类(见表 1)而改变。在本发明中，所述反应区可包含-SH、-CHO、-COOH、-NH2、 -OH、-PO3H、-OPO4H2、-SO3H、-OSO3H、-NR3+X-(R＝CnHm，0≤n≤16 并且0≤m≤34，X＝OH、Cl、Br)、NR4+X-(R＝CnHm，0≤n≤16，并且 0≤m≤34，X＝OH、Cl、Br)、-N3、-SCOCH3、-SCN、-NCS、-NCO、 -CN、-F、-Cl、-I、-Br、环氧基、-ONO2、-PO(OH)2、-C＝NNH2、-HC＝CH-、 或-C≡C-，但不限于这些。
所述“交联区(LIII)”意指所述多官能团配体的一部分，其包含能 与相邻多官能团进行交联的官能团，优选其核心部分。所述“交联”意 指通过分子间相互作用使多官能团配体与另一个相邻的多官能团配体 相连接。所述分子间相互作用包括疏水相互作用、氢键、共价键(例如 二硫键)、范德华力以及离子键，但不限于这些。因此，可根据分子间 相互作用对所述可交联官能团进行多种选择。所述交联区可包含例如 -SH、-CHO、-COOH、-NH2、-OH、-PO3H、-OPO4H2、-SO3H、-OSO3H、 -NR3+X-(R＝CnHm，0≤n≤16并且0≤m≤34，X＝OH、Cl、Br)、NR4+X- (R＝CnHm，0≤n≤16并且0≤m≤34，X＝OH、Cl、Br)、-N3、-SCOCH3、 -SCN、-NCS、-NCO、-CN、-F、-Cl、-I、-Br、环氧基、-ONO2、-PO(OH)2、 -C＝NNH2、-HC＝CH-或-C≡C-作为官能团。
(表1)
多官能团配体中反应区的示例性官能团
I II III R-NH2 R′-COOH R-NHCO-R′ R-SH R′-SH R-SS-R′ R-OH R′-(环氧基) R-OCH2CH(OH)-R′ R-NH2 R′-(环氧基) R-NHCH2CH(OH)-R′ R-SH R′-(环氧基) R-SCH2CH(OH)-R′ R-NH2 R′-COH R-N＝CH-R′ R-NH2 R′-NCO R-NHCONH-R′ R-NH2 R′-NCS R-NHCSNH-R′ R-SH R′-COCH3 R′-COCH2S-R R-SH R′-O(C＝O)X R-S(C＝O)O-R′ R-(氮丙啶基) R′-SH R-CH2CH(NH2)CH2S-R′ R-CH＝CH2 R′-SH R-CH2CH2S-R′ R-OH R′-NCO R′-NHCOO-R R-SH R′-COCH2X R-SCH2CO-R′ R-NH2 R′-CON3 R-NHCO-R′ R-COOH R′-COOH R-(C＝O)O(C＝O)-R′+H2O R-SH R′-X R-S-R′ R-NH2 R′CH2C(NH2+)OCH3 R-NHC(NH2+)CH2-R′ R-OP(O2-)OH R′-NH2 R-OP(O2-)-NH-R′ R-CONHNH2 R′-COH R-CONHN＝CH-R′ R-NH2 R′-SH R-NHCO(CH2)2SS-R′
(I：多官能团配体中反应区的官能团，II：活性物质，以及III：I和 II反应的示例性键)
在本发明中，本身含有上述官能团的化合物可用作水溶性多官能团 配体，而且通过本领域中公知的化学反应进行修饰或制备使得具有上述 官能团的化合物也可用作水溶性多官能团配体。
对于本发明的含锌水溶性纳米颗粒而言，所述多官能团配体的一个 实例是二巯基丁二酸，因为二巯基丁二酸最初含有连接区、交联区和反 应区。也就是说，二巯基丁二酸官能团一侧的-COOH与纳米颗粒键连， 另一端部分上的COOH和SH起到与活性物质相连接的作用。在-SH的 情形下，其可通过与另一个-SH进行氧化而得的-SS-键用作交联区。除 了二巯基丁二酸以外，其它含有作为连接区(LI)官能团的-COOH、作 为反应区(LII)和交联区(LIII)官能团的-COOH、-SH或-NH2的化合 物也可用作所述多官能团配体。所述化合物的实例包括二巯基马来酸和 二巯基戊二酸，但不限于这些。
在根据本发明的含锌水溶性金属氧化物纳米颗粒中，所述多官能团 配体的其它优选实例包括四甲基氢氧化铵(TMAOH)。TMAOH是合 适的，因为其含有连接区和反应区。换句话说，TMAOH在与金属氧化 物纳米颗粒表面相连接的一侧具有-OH，并且在其末端具有通过离子键 与活性物质相连接的N(CH3)4+。除了TMAOH以外，含有作为连接区 (LI)官能团的-OH和作为反应区(LII)官能团的N(CH3)4+或-N(CH3)3+ 的化合物也可用作优选的多官能团配体。这些化合物的另一个实例包括 四乙基氢氧化铵、三甲基丙醇铵，但不限于这些。
在根据本发明的含锌水溶性金属氧化物纳米颗粒中，所述多官能团 配体的其它优选实例包括肽。肽是由氨基酸组成的低聚体/聚合物。因 为氨基酸在其两端具有-COOH和-NH2官能团，所以肽具有连接区 (attachment region)和反应区。此外，尤其是，包含一个或多个氨基 酸(其具有-SH、-COOH、-NH2和-OH中的一个或多个)作为侧链的 肽可用作优选的水溶性多官能团配体。
对于根据本发明的水溶性纳米颗粒而言，所述优选的多官能团配体 的另一个实例是蛋白质。蛋白质是由比肽更多的氨基酸组成的聚合物， 也就是说，由几百个或几十万个氨基酸组成，其末端含有-COOH或-NH2 官能团，并且含有多个-COOH、-NH2、-SH、-OH、-CONH2等。因为 与上述肽一样，就蛋白质的结构而言，蛋白质可天然地包含连接区、交 联区和反应区，因此其可用作本发明的多官能团配体。优选作为相转移 配体的蛋白质的代表性实例包括结构蛋白、贮存蛋白、转运蛋白、激素 蛋白、受体蛋白、收缩蛋白、防御蛋白和酶蛋白。更具体而言可以是白 蛋白、抗体、第二抗体、抗原、抗生物素蛋白、细胞色素、酪蛋白、肌 球蛋白、大豆球蛋白、胡萝卜素、胶原、球蛋白、光蛋白、链霉抗生物 素蛋白、蛋白质A、蛋白质G、蛋白质S、免疫球蛋白、凝集素、选择 素、血管生成素、抗癌蛋白、抗生素蛋白、激素拮抗剂蛋白、白细胞介 素、干扰素、生长因子蛋白、肿瘤坏死因子蛋白、内毒素蛋白、淋巴毒 素蛋白、组织纤溶酶原激活剂、尿激酶、链激酶、蛋白酶抑制剂、烷基 磷酸胆碱、表面活性剂、心血管药物蛋白、神经药物蛋白和胃肠道药物。
对于根据本发明的水溶性纳米颗粒而言，所述优选的多官能团配体 的另一些实例包括含有疏水区和亲水区的两亲性配体。在有机溶剂中合 成的纳米颗粒的情形下，具有长烷基链的疏水性配体包覆表面。在此时 添加的两亲性配体的疏水区和纳米颗粒表面的疏水性配体通过分子间 相互作用彼此相连接以稳定所述纳米颗粒。此外，所述纳米颗粒的最外 面部分显示出亲水性官能团，从而可制得水溶性纳米颗粒。在此，分子 间相互作用包括疏水相互作用，氢键和范德华力。在此，通过疏水相互 作用与纳米颗粒相连接的部分是连接区(LI)，另外可通过有机化学方 法将反应区(LII)和交联区(LIII)引入其中。此外，为了增加在含水 溶液中的稳定性，可使用具有多个疏水区和多个亲水区的两亲性聚合物 配体。两亲性配体之间的交联还可增加纳米颗粒在水性介质中的胶体稳 定性。两亲性配体的疏水区可以是由含有2个或更多个碳原子的链组成 的直链或支链结构，更优选是烷基官能团，例如乙基、正丙基、异丙基、 正丁基、异丁基、叔丁基、辛基、癸基、十四烷基、十六烷基、二十烷 基、二十四烷基、十二烷基、环戊基和环己基；具有含有碳碳双键的不 饱和碳链的官能团，例如乙炔基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯 基、辛烯基、癸烯基和十八碳烯基；以及具有含有碳碳叁键的不饱和碳 链的官能团，例如丙炔基、异丙炔基、丁炔基、异丁炔基、辛炔基和癸 炔基。此外，亲水区的实例包括在特定pH下中性，但在较高或较低的 pH下则带正电荷或负电荷的官能团，例如-SH、-COOH、-NH2、-OH、 -PO3H、-OPO4H2、-SO3H、-OSO3H和-NR3+X-。其优选的实例包括其 中所用单体包括以下成分的聚合物和嵌段共聚物：丙烯酸、烷基丙烯酸、 ataconic acid、马来酸、富马酸、丙烯酰胺基甲基丙磺酸、乙烯磺酸、 乙烯磷酸、乙烯乳酸、苯乙烯磺酸、烯丙基铵、丙烯腈、N-乙烯吡咯烷 酮和N-乙烯甲酰胺，但是不限于这些。
在根据本发明的水溶性纳米颗粒中，所述多官能团配体的优选其它 实例包括单糖、二糖和生物可降解聚合物。所述多官能团配体的优选实 例包括葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、 N-乙酰神经氨酸、果糖、木糖、山梨醇、蔗糖、麦芽糖、糖醛 (glycoaldehyde)、二羟基丙酮、赤藓糖、赤藓酮糖、阿拉伯糖、木酮 糖、乳糖、海藻糖、mellibose、纤维二糖、棉子糖、松三糖、麦芽三糖、 水苏四糖、estrodose、木聚糖、阿拉伯聚糖、己聚糖、果聚糖、半乳聚 糖、甘露聚糖、琼脂胶、藻酸、半纤维素、羟丙基甲基纤维素 (hypromellose)、直链淀粉(amylose)、去氧丙酮、甘油醛、甲壳素、 琼脂糖、葡聚糖、核糖、核酮糖、半乳糖、羧甲基纤维素、糖原葡聚糖 (glycogendextran)、羰基葡聚糖(carbodextran)、多糖、环葡聚糖 (cyclodextran)、支链淀粉(pullulan)、纤维素、淀粉、糖原、碳水化 合物、聚磷腈、聚交酯、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、聚己内酯、聚酸酐、 聚马来酸、聚马来酸衍生物、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚羟基丁酸酯、聚 碳酸酯、聚原酸酯、聚乙二醇、聚-L-赖氨酸、聚羟基乙酸、聚甲基丙 烯酸甲酯、聚乙烯吡咯烷酮等。
另一方面，本发明提供了含锌金属氧化物-生物/化学活性材料的杂 化纳米颗粒，其中具有生物功能特性的化学功能性分子或生物材料与所 述含锌金属氧化物纳米颗粒的反应区相结合。
本文中所用的“含锌金属氧化物纳米颗粒和生物/化学活性物质的杂 化纳米颗粒”意指包含含锌金属氧化物纳米颗粒的纳米颗粒，其中所述 多官能团配体被加帽和溶解。所述生物活性材料(例如抗体、蛋白质、 抗原、肽、核酸、酶和细胞)或化学活性材料(例如单体、聚合物、无 机载体材料、荧光材料和药物)通过共价键、离子键和疏水键与配体的 活性材料相缀合。
在本发明中，“含锌金属氧化物纳米颗粒和生物/化学活性物质的杂 化纳米颗粒”的实例包括其中化学功能性分子与所述含锌金属氧化物相 结合的形式。所述化学功能性分子包括单体、聚合物、无机载体、无机 材料、生物功能材料等。
与此相关，所述单体是各种类型的化学品，单体的实例包括抗癌剂、 抗生素、维生素、含有叶酸的药物、脂肪酸、类固醇、激素、嘌呤、嘧 啶、单糖和二糖。然而，单体的实例不限于这些。
优选的化学功能单体在其末端或侧链上具有选自下述基团中的一 个或多个官能团：-COOH、-NH2、-SH、-SS-、-CONH2、-PO3H、-OPO4H2、 -PO2(OR1)(OR2)(R1、R2＝CsHtNuOwSxPyXz，X＝-F、-Cl、-Br或-I，0≤s≤20， 0≤t≤2(s+u)+1，0≤u≤2s，0≤w≤2s，0≤x≤2s，0≤y≤2s，0≤z≤2s)、-SO3H、 -OSO3H、-NO2、-CHO、-COSH、-COX、-COOCO-、-CORCO-(R＝ClHm， 0≤l≤3，0≤m≤2l+1)、-COOR、-CN、-N3、-N2、-NROH(R＝CsHtNuOwSxPyXz， X＝-F、-Cl、-Br或-I，0≤s≤20，0≤t≤2(s+u)+1，0≤u≤2s，0≤w≤2s，0≤x≤2s， 0≤y≤2s，0≤z≤2s)、-NR1NR2R3(R1，R2，R3＝CsHtNuOwSxPyXz，X＝-F、-Cl、 -Br或-I，0≤s≤20，0≤t≤2(s+u)+1，0≤u≤2s，0≤w≤2s，0≤x≤2s，0≤y≤2s， 0≤z≤2s)、-CONHNR1R2(R1，R2＝CsHtNuOwSxPyXz，X＝-F、-Cl、-Br或 -I，0≤s≤20，0≤t≤2(s+u)+1，0≤u≤2s，0≤w≤2s，0≤x≤2s，0≤y≤2s，0≤z≤2s)、 -NR1R2R3X’(R1，R2，R3＝CsHtNuOwSxPyXz，X＝-F、-Cl、-Br或-I，X’＝-F、 -Cl、-Br或-I，，0≤s≤20，0≤t≤2(s+u)+1，0≤u≤2s，0≤w≤2s，0≤x≤2s，0≤y≤2s， 0≤z≤2s)、-OH、-SCOCH3、-F、-Cl、-Br、-I、-SCN、-NCO、-OCN、 -环氧基、-C＝NNH2、-HC＝CH-以及-C三C-。
聚合物的实例包括葡聚糖、羰基葡聚糖、多糖、环葡聚糖、支链多 糖、纤维素、淀粉、糖原、碳水化合物、单糖、二糖、寡糖、聚磷腈、 聚交酯、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、聚己内酯、聚酸酐、聚马来酸、聚马 来酸衍生物、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚羟基丁酸酯、聚碳酸酯、聚原酸 酯、聚乙二醇、聚-L-赖氨酸、聚羟基乙酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙 烯吡咯烷酮等。
无机载体的实例包括金属氧化物、金属硫族(charcogenide)化物、 无机陶瓷材料、碳材料、由II族/VI族、III族/V族、以及IV族元素组 成的半导体基质、金属基质及其组合等，优选地，其是二氧化硅(SiO2)、 二氧化钛(TiO2)、铟锡氧化物(ITO)、纳米管、石墨、富勒烯、CdS、 CdSe、CdTe、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、Si、GaAs、AlAs、Au、Pt、 Ag、Cu。
所述无机材料选自：金属氧化物(由选自第一族和第二族金属元素、 过渡金属元素、第十三族元素、第十四族元素、第十五族元素、镧系元 素和锕系元素中的至少一种元素组成的金属氧化物)；半导体(由选自 第十三族元素、第十二族元素、第十四族元素、第十五族元素和第十六 族元素中至少两种元素组成的半导体)；过渡金属；第十三族元素；第 十四族元素；第十五族元素和第十六族元素，但不限于这些。
本发明的“含锌金属氧化物纳米颗粒和生物/化学活性材料的杂化纳 米颗粒”的一个实例被构建成使得所述含锌金属氧化物纳米颗粒选择性 地与生物功能性分子相缀合。所述生物功能性分子的实例包括蛋白质、 肽、DNA、RNA和生物功能性药物，并且优选组织特异性结合物质， 例如抗原、抗体、半抗原、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗 生物素蛋白、蛋白质A、蛋白质G、凝集素和选择素；药物活性物质例 如抗癌剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、白细胞介素、干扰素、生长因 子、肿瘤坏死因子、内毒素、淋巴毒素、尿激酶、链激酶、组织纤溶酶 原激活剂、蛋白酶抑制剂、烷基磷酸胆碱、表面活性剂、心血管药物、 胃肠道药物和神经药物；生物活性酶例如水解酶、氧化还原酶、裂合酶、 异构酶和合成酶；酶辅因子以及酶抑制剂，但不限于这些。
下文将详细描述制备本发明的水溶性含锌金属氧化物纳米颗粒的 方法。
本发明的水溶性含锌金属氧化物纳米颗粒可通过利用本领域公知 的气相纳米颗粒合成法或液相(包括含水溶液、有机溶剂或多溶剂体系) 纳米颗粒合成法来制得。
作为制备本发明纳米颗粒的优选方法的一个实例，可通过下述步骤 制备纳米颗粒：(1)在有机溶剂中合成水不溶性纳米颗粒，(2)将所述 水不溶性纳米颗粒溶解在第一溶剂中，并将水溶性多官能团配体溶解在 第二溶剂中，以及(3)将由步骤(2)所得的两种溶液相混合使得所述 多官能团配体缀合在所述水不溶性纳米颗粒表面上，随后通过溶解在含 水溶液中进行分离。
所述方法的步骤(1)涉及用于制备水不溶性纳米颗粒的方法。在 本发明一个实施方案中，可通过包括以下步骤的方法制备水不溶性纳米 颗粒：将纳米颗粒前体引入到含有表面稳定剂的有机溶剂中，在50至 600℃、优选在100至600℃维持一段时间使得所述纳米颗粒前体物质进 行纳米颗粒生长的化学反应，然后分离和纯化以制备所得的水不溶性纳 米颗粒。
作为纳米颗粒前体，可以使用基于金属硝酸盐的化合物、基于金属 硫酸盐的化合物、基于金属乙酰丙酮化物的化合物、基于金属氟乙酰乙 酸盐的化合物、基于金属卤化物的化合物、基于金属高氯酸盐 (perchlororate)的化合物、基于金属氨基磺酸盐的化合物、基于金属 硬脂酸盐的化合物、或基于有机金属的化合物，但不限于这些。
作为有机溶剂，可以使用基于苯的溶剂、烃溶剂、基于醚的溶剂、 聚合物溶剂或离子型液体溶剂，并且优选苯、甲苯、卤代苯、辛烷、壬 烷、癸烷、苄醚、苯醚、烃醚、聚合物溶剂或离子液体溶剂，但不限于 这些。
在所述制备方法的步骤(2)中，将上述制备的纳米颗粒溶解在第 一溶剂中，而将多官能团配体溶解在第二溶剂中。作为第一溶剂，可以 使用基于苯的溶剂、烃溶剂、基于醚的溶剂、卤代烃、醇、基于亚砜的 溶剂、基于酰胺的溶剂等，并且优选苯、甲苯、卤代苯、戊烷、己烷、 壬烷、癸烷、苄醚、苯醚和烃醚、二氯甲烷、溴代甲烷、甲醇和乙醇， 二甲基亚砜、二甲基甲酰胺。作为第二溶剂，可以使用如上所述的第一 溶剂以及水。
在所述制备方法的步骤(3)中，将两种溶液混合，使得水不溶性 纳米颗粒的有机表面稳定剂被水溶性多官能团配体代替。可利用本领域 中公知的方法分离被水溶性多官能团配体代替的纳米颗粒。可通过离心 或过滤来分离被水溶性多官能团配体取代的纳米颗粒。分离后，通过滴 定步骤将pH优选调节至5到10以得到更稳定分散的水溶性纳米颗粒。
根据上述方法制备的含锌金属氧化物纳米颗粒具有均一的粒径分 布(粒径分布(σ)<10％)和高结晶度。此外，利用该方法，可精确控 制纳米颗粒基质中的锌含量。换言之，通过改变锌和其它金属前体材料 的比例，可将纳米颗粒中的锌含量控制在化学计量比为0.001<‘锌/(全 部金属-锌)，<10。尤其是促进锌在四面体孔洞中的沉积，这增加了磁矩。
在一种制备含锌金属氧化物纳米颗粒MRI造影剂的替代方法中， 不必通过如上述方法所述在有机溶剂中合成的纳米颗粒的相转变来制 备水溶性纳米颗粒，而是可通过金属前体水溶液中的化学反应由晶体生 长进行合成。该方法可通过已知的合成水溶性纳米颗粒的方法(其为通 过将锌前体添加到含有多官能团配体的水溶液中来合成水溶性含锌金 属氧化物纳米颗粒的方法)来实施。本发明的含锌金属氧化物磁性纳米 颗粒具有增强的磁性以及MRI信号增强作用，而不限于具体的制备方 法。
所得的水溶性纳米颗粒的实例描述在表2中。
(表2)
制备的含锌纳米颗粒及其性质
编 号 基质 锌含量 (＝锌/ 总金 属-锌) 化学式 核心 大小 (nm) 水溶性多官能 团配体 磁化 度 (emu /g) MRI造 影作用 (R2， 毫秒-1) 1 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 6 二巯基丁二酸 92 2 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 6 四甲基氢氧化铵 92 3 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 6 BSA 92 4 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 6 羰基葡聚糖 92 5 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 9 二巯基丁二酸 108 6 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 9 四甲基氢氧化铵 108 7 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 9 BSA 108 8 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 9 羰基葡聚糖 108 9 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 12 二巯基丁二酸 136 10 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 12 四甲基氢氧化铵 136
11 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 12 BSA 136 1.2 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 12 羰基葡聚糖 136 13 铁氧体 0.034 Zn0.1Fe2.9O4 15 二巯基丁二酸 126 0.0024 14 铁氧体 0.034 Zn0.1Fe2.9O4 15 四甲基氢氧化铵 128 15 铁氧体 0.034 Zn0.1Fe2.9O4 15 BSA 126 16 铁氧体 0.034 Zn0.1Fe2.8O4 15 羰基葡聚糖 126 17 铁氧体 0.071 Zn0.2Fe2.8O4 15 二巯基丁二酸 138 0.0031 18 铁氧体 0.071 Zn0.2Fe2.8O4 15 四甲基氢氧化铵 138 19 铁氧体 0.071 Zn0.2Fe2.8O4 15 BSA 138 20 铁氧体 0.071 Zn0.2Fe2.8O4 15 羰基葡聚糖 138 21 铁氧体 0.111 Zn0.3Fe2.7O4 15 二巯基丁二酸 152 0.0038 22 铁氧体 0.111 Zn0.3Fe2.7O4 15 四甲基氢氧化铵 152 23 铁氧体 0.111 Zn0.3Fe2.7O4 15 BSA 152 24 铁氧体 0.111 Zn0.3Fe2.7O4 15 羰基葡聚糖 152 25 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 15 二巯基丁二酸 161 0.0045 26 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 15 四甲基氢氧化铵 161 27 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 15 BSA 161 28 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 15 羰基葡聚糖 161 29 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 15 羟丙基甲基纤维素 161 30 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 15 中性抗生物素蛋白 161 31 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 15 抗体(IgG) 161 32 铁氧体 0.364 Zn0.8Fe2.2O4 15 二巯基丁二酸 115 0.0016 33 铁氧体 0.364 Zn0.8Fe2.2O4 15 四甲基氢氧化铵 115 34 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 6 二巯基丁二酸 107 35 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 6 四甲基氢氧化铵 107 36 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 6 BSA 107
37 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.5Fe2O4 6 羰基葡聚糖 107 38 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 9 二巯基丁二酸 129 39 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 9 四甲基氢氧化铵 129 40 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 9 BSA 129 41 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 9 羰基葡聚糖 129 42 锰铁氧体 0.071 Zn0.2Mn0.6Fe2O4 12 二巯基丁二酸 135 43 锰铁氧体 0.071 Zn0.2Mn0.8Fe2O4 12 四甲基氢氧化铵 135 44 锰铁氧体 0.071 Zn0.2Mn0.8Fe2O4 12 BSA 135 45 锰铁氧体 0.071 Zn0.2Mn0.8Fe2O4 12 羰基葡聚糖 135 46 锰铁氧体 0.111 Zn0.3Mn0.7Fe2O4 12 二巯基丁二酸 146 47 锰铁氧体 0.111 Zn0.3Mn0.7Fe2O4 12 四甲基氢氧化铵 146 48 锰铁氧体 0.111 Zn0.3Mn0.7Fe2O4 12 BSA 146 49 锰铁氧体 0.111 Zn0.3Mn0.7Fe2O4 12 羰基葡聚糖 146 50 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 12 二巯基丁二酸 153 51 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 12 四甲基氢氧化铵 153 52 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 12 BSA 153 53 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.8Fe2O4 12 羰基葡聚糖 153 54 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 12 羟丙基甲基纤维素 153 55 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 12 中性抗生物素蛋白 153 56 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 12 抗体(IgG) 153 57 锰铁氧体 0.034 Zn0.1Mn0.9Fe2O4 15 二巯基丁二酸 140 0.0034 58 锰铁氧体 0.034 Zn0.1Mn0.9Fe2O4 15 四甲基氢氧化铵 140 59 锰铁氧体 0.034 Zn0.1Mn0.9Fe2O4 15 BSA 140 60 锰铁氧体 0.034 Zn0.1Mn0.9Fe2O4 15 羰基葡聚糖 140
61 锰铁氧体 0.071 Zn0.2Mn0.9Fe2O4 15 二巯基丁二酸 154 0.0041 62 锰铁氧体 0.071 Zn0.2Mn0.8Fe2O4 15 四甲基氢氧化铵 154 63 锰铁氧体 0.071 Zn0.2Mn0.8Fe2O4 15 BSA 154 64 锰铁氧体 0.071 Zn0.2Mn0.8Fe2O4 15 羰基葡聚糖 154 65 锰铁氧体 0.111 Zn0.3Mn0.7Fe2O4 15 二巯基丁二酸 166 0.0046 66 锰铁氧体 0.111 Zn03Mn0.7Fe2O4 15 四甲基氢氧化铵 166 67 锰铁氧体 0.111 Zn0.3Mn0.7Fe2O4 15 BSA 166 68 锰铁氧体 0.111 Zn0.3Mn0.7Fe2O4 15 羰基葡聚糖 166 69 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 15 二巯基丁二酸 175 0.0052 70 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 15 四甲基氢氧化铵 175 71 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 15 BSA 175 72 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 15 羰基葡聚糖 175 73 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 15 羟丙基甲基纤维素 175 74 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 15 中性抗生物素蛋白 175 75 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 15 抗体(IgG) 175 76 锰铁氧体 0.364 Zn0.8Mn0.2Fe2O4 15 二巯基丁二酸 138 0.0036 77 锰铁氧体 0.364 Zn0.8Mn0.2Fe2O4 15 四甲基氢氧化铵 138 78 钴铁氧体 0.111 Zn0.3Co0.7Fe2O4 12 二巯基丁二酸 79 钴铁氧体 0.111 Zn0.3Co0.7Fe2O4 12 四甲基氢氧化铵 80 钴铁氧体 0.111 Zn0.3Co0.7Fe2O4 12 BSA 81 钴铁氧体 0.111 Zn0.3Co0.7Fe2O4 12 羰基葡聚糖 82 钴铁氧体 0.154 Zn0.4Co0.6Fe2O4 12 二巯基丁二酸 83 钴铁氧体 0.154 Zn0.4Co0.6Fe2O4 12 四甲基氢氧化铵
84 钴铁氧体 0.154 Zn0.4Co0.6Fe2O4 12 BSA 85 钴铁氧体 0.154 Zn0.4Co0.6Fe2O4 12 羰基葡聚糖 86 镍铁氧体 0.111 Zn0.3Ni0.7Fe2O4 12 二巯基丁二酸 87 镍铁氧体 0.111 Zn0.3Ni0.7Fe2O4 12 四甲基氢氧化铵 88 镍铁氧体 0.111 Zn0.3Ni0.7Fe2O4 12 BSA 89 镍铁氧体 0.111 Zn0.3Ni0.7Fe2O4 12 羰基葡聚糖 90 镍铁氧体 0.154 Zn0.4Ni0.6Fe2O4 12 二巯基丁二酸 91 镍铁氧体 0.154 Zn0.4Ni0.6Fe2O4 12 四甲基氢氧化铵 92 镍铁氧体 0.154 Zn0.4Ni0.6Fe2O4 12 BSA 93 镍铁氧体 0.154 Zn0.4Ni0.6Fe2O4 12 羰基葡聚糖 94 氧化锰 0.154 Zn0.4Mn2.6O4 6 四甲基氢氧化铵 95 氧化锰 0.154 Zn0.4Mn2.6O4 6 BSA 96 氧化锰 0.154 Zn0.4Mn2.6O4 6 羰基葡聚糖 97 氧化钴 0.25 Zn0.2Co0.8O 7 四甲基氢氧化铵 98 氧化钴 0.25 Zn0.2Co0.9O 7 BSA 99 氧化钴 0.25 Zn0.2Co0.8O 7 羰基葡聚糖 100 氧化镍 0.25 Zn0.2Ni0.8O 10 四甲基氢氧化铵 101 氧化镍 0.25 Zn0.2Ni0.8O 10 BSA 102 氧化镍 0.25 Zn0.2Ni0.8O 10 羰基葡聚糖
下文中将详细描述包含含锌水溶性金属氧化物纳米材料的MRI造 影剂的应用。
本发明的“含锌金属氧化物纳米颗粒”相比于常规含有金属氧化物 纳米颗粒的MRI造影剂具有更高的磁矩，因此其可实现更高水平的高 灵敏度诊断。此外，与常规MRI造影剂相比较而言，甚至少量的本发 明的“含锌金属氧化物纳米颗粒”也可提供将信号增强至所期望水平的 作用。因此，与常规材料相比，它们可用作具有较低生物学毒性和副作 用的造影剂。
由于含锌水溶性金属氧化物纳米颗粒与常规铁氧化物纳米颗粒相 比较而言具有极好的R2、R1MRI信号增强作用，因此可进行早期疾病 诊断和极少量生物分子的检测。一般而言，在癌细胞、脑血管事件或心 肌梗塞发生部位的表面上具有过度表达的生物标志物。可以通过本领域 中已知的方法获得所述具有靶向特异性并能与所述生物标志物(例如生 物聚合物和化学分子，比如抗体、蛋白质、核酸、酶等)选择性结合的 材料。或者，可使用已知的材料。所述通过上述方法获得的具有靶向特 异性的材料可与所述含锌水溶性金属氧化物纳米颗粒的反应区缀合以 合成所述杂化纳米颗粒，其能检测引起疾病的部位或组织。因此，所述 磁性纳米颗粒标记患病部位并显示MRI信号，从而实现诊断。
包含在本发明的MRI造影剂中并且是人体中必需元素的与锌相关 的蛋白质主要用作酶而在新陈代谢的活化中起到重要的作用。因此，与 基于铁氧体的成像造影剂相似，含锌金属氧化物纳米颗粒是生物相容性 且低毒性的。
水溶性含锌金属氧化物纳米颗粒还可与其它诊断探针相偶联用作 双诊断探针或多诊断探针。
就本发明的MRI造影剂而言，例如放射性同位素、X射线成像造 影剂(例如碘和硫酸钡)和超声成像造影剂(例如微泡)可与含锌水溶 性金属氧化物纳米颗粒键合。所得的MRI造影剂可用于单光子发射计 算机断层成像(SPECT)或正电子断层成像(PET)和计算机断层成像 (CT)。
此外，就本发明的MRI造影剂而言，荧光材料可与含锌水溶性金 属氧化物纳米颗粒键合。该MRI造影剂可用于光学成像和光谱学。
实施例
实施例1：核心大小为15nm并利用二巯基丁二酸包覆的ZnxM1-xFe2O4 (M＝Fe或Mn，x＝0.1、0.2、0.3、0.4和0.8)含锌铁氧体纳米颗粒MRI 造影剂的合成
作为本发明说明书中所述的含有含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI 造影剂的一个实例，通过韩国专利No.10-0604975、10-0652251和 10-0713745；PCT/KR2004/002509；韩国专利No.10-0604975； PCT/KR2004/003088；PCT/KR2007/001001以及韩国专利申请No. 2006-0018921中所公开的方法合成核心大小为15nm的ZnxM1-xFe2O4 (M＝Fe或Mn，x＝0.1、0.2、0.3、0.4和0.8)含锌铁氧体纳米颗粒MRI 造影剂。将ZnCl2、FeCl2或MnCl2和Fe(acac)3(acac＝乙酰丙酮)添加 到其中含有20mmol油酸和油胺的三辛胺溶剂中。使反应在200℃和300 ℃进行2小时以合成15nm的ZnxM1-xFe2O4(M＝Fe或Mn，x＝0.1、0.2、 0.3、0.4和0.8)纳米颗粒。为了控制锌含量比使得x在0.1至0.8的范 围内，利用同一种方法提高或降低作为前体材料的ZnCl2和FeCl2的比 例。利用过量的乙醇沉淀所制备的含锌铁氧体纳米颗粒，并将所分离的 纳米颗粒重新分散在甲苯中以得到胶体溶液。
其后，将其中溶解有过量二巯基丁二酸的DMSO溶液添加到分散在 甲苯中的20mg/ml的纳米颗粒中，然后反应2小时，将纳米颗粒离心， 然后分散在水中。
图1和图2举例说明了通过上述方法得到的、具有15nm大小(粒 径分布σ<10％)的均一球形的ZnxM1-xFe2O4(M＝Fe或Mn，x＝0、0.1、 0.2、0.3、0.4和0.8)。通过高分辨TEM(图1B)和X射线衍射图(XRD) (图1C)可见，纳米颗粒具有尖晶石结构和高结晶度。通过电感耦合 等离子体-质谱(ICP-MS)和X射线的能量分散式的原子发射谱(EDAX) 分析锌含量，证实了可精确控制锌含量(图3)。
根据本发明的纳米颗粒的锌含量、核心大小、所用的水溶性多官能 团配体、磁矩和MRI造影作用显示在表2中编号13～33和57～77中。
实施例2：核心大小为6、9和12nm并利用二巯基丁二酸包覆的 Zn0.4M0.6Fe2O4(M＝Fe或Mn)含锌铁氧体纳米颗粒MRI造影剂的合成
将10mmol油酸和30mmol油胺与ZnCl2、FeCl2或MnCl2和 Fe(acac)3添加到三辛胺溶剂中。将所述溶液在180℃和250℃热分解3 小时以合成6nm的Zn0.4M0.6Fe2O4(M＝Fe或Mn)纳米颗粒。为了合 成9nm和12nm的不同大小的纳米颗粒，将相同量的前体材料添加到 改变油酸和油胺比例的三辛胺溶液中，加热并通过相同方法彼此反应， 然后进行沉淀。
其后，将其中溶解有过量二巯基丁二酸的DMSO溶液添加到分散在 甲苯中的20mg/ml的纳米颗粒中，然后反应2小时，将纳米颗粒离心， 然后分散在水中。
通过上述方法合成的纳米颗粒为球形，并且具有非常均一的粒径， 通过ICP-MS和EDAX分析锌含量。根据本发明的纳米颗粒的锌含量、 核心大小、所用的水溶性多官能团配体和磁化度显示在表2中编号1～12 和34～56中。
实施例3：核心大小为12nm并利用二巯基丁二酸包覆的ZnxM1-xFe2O4 (M＝Co或Ni，x＝0.3和0.4)含锌的钴铁氧体纳米颗粒MRI造影剂 的合成
作为本发明包含含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI造影剂的一个实 例，通过下述方法合成了核心大小为12nm的ZnxM1-xFe2O4(M＝Co或 Ni，x＝0.3和0.4)含锌的铁氧体纳米颗粒MRI造影剂。将20mmol 油酸和油胺与ZnCl2、CoCl2或NiCl2和Fe(acac)3一起添加到三辛胺溶 剂中以合成所述纳米颗粒。将所述溶液在200℃和300℃热分解2小时 以合成12nm大小的Zn0.3M0.7Fe2O4(M＝Co或Ni)纳米颗粒。为了合 成9nm和12nm的不同大小的纳米颗粒，将相同量的前体材料添加到 控制油酸和油胺比例的三辛胺溶液中。
其后，将其中溶解有过量二巯基丁二酸的DMSO溶液添加到分散在 甲苯中的20mg/ml的纳米颗粒中，然后反应2小时，将纳米颗粒离心， 然后分散在水中。
通过上述方法合成的纳米颗粒为球形，并且具有非常均一的粒径， 通过ICP-MS和EDAX分析锌含量。根据本发明的纳米颗粒的锌含量、 核心大小和所用的水溶性多官能团配体显示在表2中编号78～93中。
实施例4：利用四甲基氢氧化铵(TMAOH)包覆的ZnxMyOz(M＝Mn、 Co或Ni)含锌氧化物纳米颗粒MRI造影剂的合成
作为本发明说明书中所述的包含含锌金属氧化物纳米颗粒的 MRI造影剂的一个实例，通过下述方法合成了ZnxMyOz(M＝Mn、Co 或Ni)组成的含锌氧化锰纳米颗粒MRI造影剂。将ZnCl2、MCl2(M＝Mn、 Co或Ni)以0.5mmol和6.5mmol的量分散到其中含有油酸和油胺的 三辛胺溶液中，加热至270℃并维持1小时以合成12nm的ZnxMyOz (M＝Mn、Co或Ni)纳米颗粒。将通过上述方法合成并以50mg/ml 的浓度分散在1ml甲苯中的含锌氧化物纳米颗粒利用过量乙醇进行沉 淀，并重新分散在5ml TMAOH溶液中。所合成的纳米颗粒含有 Zn0.4Mn2.6O4、Zn0.2Co0.8O或Zn0.2Ni0.8O组成并且核心大小为6、7和 10nm。通过ICP-MS和EDAX分析锌含量。根据本发明的纳米颗粒的 锌含量、核心大小和所用的水溶性多官能团配体显示在表2中编号 94～102中。
实施例5：含有不同类型金属添加剂的铁氧化物纳米颗粒基质的饱和磁 化度的比较
为了解哪种类型的金属添加剂能增加纳米颗粒基质的饱和磁化 度，合成了相同大小(15nm)的含有不同类型金属添加剂(Ni、Co、 Mn或Zn)的铁氧化物纳米颗粒并用MPMS超导量子干涉装置 (SQUID)磁量计测量饱和磁化度(Ms)。通过韩国专利No.10-0604975、 10-0652251和10-0713745，PCT/KR2004/002509，韩国专利No. 10-0604975；PCT/KR2004/003088；PCT/KR2007/001001以及韩国专利 申请No.2006-0018921中所公开的方法制备了含有铁氧化物和Ni、Co 以及Mn的铁氧化物纳米颗粒，并根据实施例1制备了含锌金属氧化物 纳米颗粒。结果如图4中所示，与铁氧化物纳米颗粒基质(114emu/g (磁性原子))相比较而言，含Ni和Co的纳米颗粒显示铁氧化物饱和 磁化度降低。在含锰纳米颗粒的情形下，所述饱和磁化度是125emu/g (磁性原子)，与铁氧化物纳米颗粒相比较而言稍微增加。然而，在含 锌铁氧化物纳米颗粒的情形下，Zn0.4Fe2.6O4的饱和磁化度是161emu/g (磁性原子)，Zn0.4Mn0.6Fe2O4的饱和磁化度是175emu/g(磁性原子)， 与铁氧化物基质相比较而言分别增加了47和61emu/g(磁性原子)。
已知T2MRI造影作用与饱和磁化度的平方直接相关(Koenig，S. H.et al.Magn.Reson.Med.1995，34，227-233)。因此，可预计本发明的 含锌纳米颗粒将具有显著增强的MRI造影作用。
实施例6：不含锌的金属铁氧体纳米颗粒(MFe2O4，M＝Mn、Fe、Co 或Ni)和含锌金属铁氧体纳米颗粒(Zn0.3M0.7Fe2O4，M＝Mn、Fe、Co 或Ni)的MRI作用的比较
已经证明随着纳米颗粒基质的改变，当锌被包含在不同类型的纳 米颗粒基质中时含锌金属氧化物纳米颗粒具有更好的MRI造影作用。 为了实现这一点，在实施例1至5中合成了不同类型的含锌金属氧化物 纳米颗粒(Zn0.3M0.7Fe2O4，M＝Mn、Fe、Co或Ni)，还合成了不含锌 的金属氧化物纳米颗粒(MFe2O4，M＝Mn、Fe、Co或Ni)，还相互比 较了所述金属氧化物纳米颗粒的T2自旋回波MRI造影作用。如图5A 和5B中所示，所得的纳米颗粒为球形并且具有15nm的均一大小，所 述纳米颗粒的表面被二巯基丁二酸包覆。
为了证明所得纳米颗粒的磁共振成像的造影作用，测量了快速自 旋回波(FSE)T2MRI。为了测量，使用了配备sense-flex-M线圈的 3T系统(Achieva；Philips Medical Systems，Best，荷兰)。利用T2-FSE 序列得到磁共振成像结果。具体参数如下：分辨率256μm×256μm，切 片厚度1mm，TE＝100毫秒，TR＝4000毫秒，FOV＝10×10cm2，以及2 次激发。
如图5C所示，发现与不含锌的金属铁氧体(MFe2O4)相比较而 言，含锌金属铁氧体(Zn0.3M0.7Fe2O4)的MRI信号(黑色)增加约2 至3倍。在R2弛豫系数(根据浓度改变R2比例)(其为造影作用的一 种度量)的情形下，发现含锌锰铁氧体(Zn0.3Mn0.7Fe2O4)的弛豫系数 为45.9mM-1秒-1，其与不含锌的锰铁氧体(21.8mM-1秒-1)相比较而言 明显增加。对于Zn0.3Fe0.7Fe2O4、Zn0.3Co0.7Fe2O4和Zn0.3Ni0.7Fe2O4而言， 弛豫系数分别为37.4mM-1秒-1、34.4mM-1秒-1和18.7mM-1秒-1，与不 含锌的Fe3O4、CoFe2O4和NiFe2O4(13.6mM-1秒-1、12.4mM-1秒-1和 6.7mM-1秒-1)相比而言增加。
实施例7：ZnxM1-xFe2O4(M＝Fe或Mn，x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4和 0.8)的饱和磁化度的根据锌含量的比较
证实了锌含量对饱和磁化度和MRI造影作用的影响。为了实现这 一点，根据实施例1合成了15nm大小的ZnxM1-xFe2O4(M＝Fe或Mn， x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.8)。利用MPMS SQUID磁量计测量了3 特斯拉的饱和磁化度。
每种ZnxMn1-xFe2O4(x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.8)纳米颗粒 的饱和磁化度(Ms)分别为125、140、154、166、175和137emu/g(磁 性原子)，同样，每种ZnxFe3-xO4(x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.8)的 饱和磁化度(Ms)分别为114、126、140、152、161和115emu/g Zn0.4Fe2.6O4 (磁性原子)。
两种纳米颗粒均显示出在x＝0.4时具有最大的Ms，Zn0.4Fe2.6O4 为161emu/g(磁性原子)，Zn0.4Mn0.6Fe2O4为175emu/g(磁性原子)， 这是迄今所发现的任何金属氧化物中最高的。
实施例8：根据锌含量比较ZnxM1-xFe2O4(M＝Fe或Mn，x＝0、0.1、 0.2、0.3、0.4和0.8)的R2 MR弛豫度
在实施例7中已经证实了改变ZnxM1-xFe2O4的饱和磁化度是否可 增强MRI造影作用。为了实现这一点，利用配备sense-flex-M线圈的 3T MRI系统(Achieva；Philips Medical Systems，Best，荷兰)测量 ZnxM1-xFe2O4(M＝Fe或Mn，x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.8)的MRI 造影作用。利用FSE序列得到磁共振成像结果。具体参数如下：分辨 率256μm×256μm，切片厚度1mm，TE＝100毫秒，TR＝400毫秒， FOV＝10×10cm2，以及2次激发。
如图7A所示，ZnxMn1-xFe2O4和ZnxFe3-xO4的纳米颗粒均显示随 锌含量增加T2MRI信号变成深色(在彩色图片7B中变成蓝色)。已经 证实在相同浓度下(基于金属原子)，ZnxMn1-xFe2O4(x＝0、0.1、0.2、 0.3、0.4和0.8)的R2分别为0.0025、0.0034、0.0041、0.0046、0.0052、 0.0036毫秒-1。以相同方式，ZnxM3-xO4(x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.8) 的R2分别为0.0012、0.0024、0.0031、0.0038、0.0045、0.0016毫秒-1 (图7C)。具体而言，当x＝0.4时，两种纳米颗粒的R2分别为0.0052 和0.0045毫秒-1；与常用的铁氧化物纳米颗粒造影剂Feridex(0.0015 毫秒-1)和CLIO(0.0008毫秒-1)相比较而言，Zn0.4Mn0.6Fe2O4纳米颗 粒的造影作用更强，分别为Feridex和CLIO的约350％和650％；在 Zn0.4Fe2.6O4的情形下，造影作用分别为Feridex和CLIO的约300％和 560％。
实施例9：在水溶液中合成ZnxFe3-xO4(x＝0.2和0.4)组成的含锌铁氧 体纳米颗粒
本发明的包含含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI造影剂并非单单 通过上述相转变法制备的，而是还可通过下述方法制备：
为了在水溶液中合成式ZnxFe3-xO4(x＝0.2和0.4)的含锌铁氧化 物纳米颗粒，将纳米颗粒的前体Zn(acac)2·2H2O 20mg、FeCl2·4H2O 60 mg和FeCl3·6H2O 240mg溶解在10ml水中，然后加入1ml 3.2M NH4OH 溶液，强力搅拌20分钟以得到Zn0.2Fe2.8O4纳米颗粒。为了得到 Zn0.4Fe2.6O4纳米颗粒，在相同条件下使用前体Zn(acac)2·2H2O、 FeCl2·4H2O各40mg。
图8显示了根据上述方法(图8A和8B)合成的ZnxFe3-xO4(x＝0.2 和0.4)纳米颗粒的电子显微镜照片和通过EDAX进行的锌含量分析(图 8C和8D)。证实了可根据上述方法制备含锌纳米颗粒并可控制锌含量。 所合成的纳米颗粒不具有固定的形状，大小为约15nm。
实施例10：含锌铁氧体纳米颗粒的EXAFS分析
为了了解锌在本发明含锌铁氧体纳米颗粒的铁氧体基质中的分 布，测量了EXAFS。图9A至9D显示根据实施例1制备的ZnxFe3-xO4 (x＝0.1、0.2、0.3、0.4)纳米颗粒的锌K边的(Zn K-edged)EXAFS 谱和铁K边的(Fe K-edged)EXAFS谱。在锌K边EXAFS谱中，3.1 埃和6.2埃的峰显示锌分别存在于基质的四面体孔洞(Td)和八面体孔 洞(Oh)中。3.1埃的峰是强峰并且当锌含量比(x)增加时其选择性增 强这一事实表明锌选择性地分布在四面体间隙空洞中。这样的结果是在 有机溶剂中制备纳米颗粒时的突出现象，表明这种制备方法能够比在水 溶液中的制备方法更有效地引入锌。
实施例11：利用BSA(牛血清白蛋白)包覆的含锌金属氧化物纳米颗 粒MRI造影剂的合成
将在实施例1～4中合成并以50mg/ml的浓度分散在1ml甲苯中 的含锌金属氧化物纳米颗粒利用过量的乙醇进行沉淀，并重新分散在 5ml 1M TMAOH溶液中。然后，加入200mg BSA并溶解，在室温下 反应24小时。随后，利用Sephacryl S-500柱(GE Healthcare，USA) 分离反应溶液以除去未与纳米颗粒反应的过量BSA并分离出纳米颗粒。 通过Centricon YM100过滤器(Millipore，USA)将所分离的纳米颗粒 浓缩至5ml。
实施例12：利用羰基葡聚糖包覆的含锌金属氧化物纳米颗粒MRI造影 剂的合成
将200mg羰基葡聚糖添加到5ml根据实施例11的相同方法合成 的TMAOH包覆的纳米颗粒中，然后分散在其中，在室温下进行反应 24小时。随后，利用Sephacryl S-500柱来分离反应溶液以除去未与纳 米颗粒反应的过量羰基葡聚糖并分离出纳米颗粒。通过Centricon YM100过滤器将所分离的纳米颗粒浓缩至5ml。
实施例13：利用羟丙基甲基纤维素(hypromelose)包覆的含锌金属氧 化物纳米颗粒MRI造影剂的合成
将100mg羟丙基甲基纤维素添加到5ml根据实施例11的相同方 法合成的TMAOH包覆的纳米颗粒中并溶解在其中，在室温下反应24 小时。随后，利用Sephacryl S-500柱来分离反应溶液以除去未与纳米 颗粒反应的过量羟丙基甲基纤维素并分离出纳米颗粒。通过Centricon YM100过滤器将所分离的纳米颗粒浓缩至5ml。
实施例14：利用中性抗生物素蛋白包覆的含锌金属氧化物纳米颗粒 MRI造影剂的合成
将100mg中性抗生物素蛋白添加到5ml根据实施例11的相同方 法合成的纳米颗粒中并溶解在其中，在室温下进行反应24小时。随后， 利用Sephacryl S-500柱分离反应溶液以除去过量的未与纳米颗粒反应 的中性抗生物素蛋白并分离出纳米颗粒。通过Centricon YM100过滤器 将所分离的纳米颗粒浓缩至5ml。
实施例15：利用抗体(IgG)包覆的含锌金属氧化物纳米颗粒MRI造 影剂的合成
将100mg抗体添加到5ml根据实施例11的相同方法合成的纳米 颗粒中并溶解在其中，在室温下反应24小时。随后，利用Sephacryl S-500柱来分离反应溶液以除去未与纳米颗粒反应的过量抗体并分离出 纳米颗粒。通过Centricon YM100过滤器将所分离的纳米颗粒浓缩至 5ml。
实施例16：包含含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI造影剂的根据pH和 盐浓度的稳定性的分析
分析了利用多种配体包覆的包含含锌金属氧化物纳米颗粒的 MRI造影剂根据pH和盐浓度的稳定性。如图10A所示，水溶性纳米 颗粒针对浓度为200mM的NaCl是稳定的，尤其是，BSA-Zn0.4Fe2.6O4、 羰基葡聚糖-Zn0.4Fe2.6O4、羟丙基甲基纤维素-Zn0.4Fe2.6O4、中性抗生物 素蛋白-Zn0.4Fe2.6O4以及抗体(IgG)-Zn0.4Fe2.6O4纳米颗粒在浓度为1M 或更高的NaCl中是稳定的。
此外，如图10B所示，所有水溶性纳米颗粒在pH 7～9范围内均 是稳定的，尤其是，BSA-Zn0.4Fe2.6O4和羰基葡聚糖-Zn0.4Fe2.6O4纳米颗 粒在pH 1～11范围内是稳定的。
实施例17：利用包含具有Zn0.4Fe2.6O4的含锌金属氧化物的MRI造影剂 对小鼠肝脏造影
为了证明包含含锌金属氧化物的MRI造影剂的体内MRI造影作 用，将在实施例11中合成的利用BSA包覆的Zn0.4Fe2.6O4纳米颗粒以2 mg/ml的浓度和8mg/kg的剂量通过尾静脉注射给Balb/c小鼠(n＝4)。 在注射纳米颗粒之前和之后每10分钟测量MRI。与此相关联，测量T2 信号强度以证明纳米颗粒的肝脏造影作用。
为了测量MRI，使用配备sense-flex-M线圈的3T系统(Achieva； Philips Medical Systems，Best，荷兰)。利用FSE序列得到磁共振成像 结果。
具体参数如下：分辨率：256μm×256μm，切片厚度1mm，TE＝100 毫秒，TR＝4000毫秒，FOV＝10×10cm2，以及2次激发。
如图11所示，发现注射纳米颗粒之后，肝脏的T2磁共振图像信 号降低至使肝脏变暗。一般而言，将25mg/kg剂量的铁氧化物造影剂 用于小鼠试验。作为比较，在本发明公开的包含含锌金属氧化物的MRI 造影剂的情形下，即使在8mg/kg的剂量(其为常用剂量水平的约1/3) 下仍获得了有效的肝脏造影作用。
实施例18：“含锌金属氧化物纳米颗粒(Zn0.4Mn0.6Fe2O4)-生物/化学活性 物质(赫赛汀(herceptin))”杂化纳米颗粒的合成
图12显示了纳米杂化物的示意性制备方法。将100μl赫赛汀[(10 mg/ml在10mM磷酸缓冲溶液中，pH7.2)，Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA]置于eppendorf管中，向其中加入硫代-SMCC[(N- 马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸3-硫代-N-羟基-琥珀酰亚胺酯，Pierce] 并在室温下反应30分钟，以使马来酰亚胺基取代赫赛汀的赖氨酸基。 使其中赖氨酸基被马来酰亚胺基取代的赫赛汀与含有200μl二巯基丁 二酸包覆的Zn0.4Mn0.6Fe2O4在室温下反应4小时，以制备含锌的锰铁氧 体-赫赛汀纳米杂化颗粒。通过琼脂糖电泳分析所制备的纳米杂化颗粒。 由考马斯亮蓝蛋白质染色结果可见产生了纳米杂化物(图12C，泳道2)。
实施例19：“含锌金属氧化物纳米颗粒(Zn0.4Mn0.6Fe2O4)-生物/化学活性 物质(中性抗生物素蛋白)”杂化纳米颗粒的合成
在将100μl中性抗生物素蛋白[(10mg/ml在10mM磷酸缓冲液 中，pH 7.2)，Sigma]置于eppendorf管中后，向其中加入硫代-SMCC， 在室温下反应30分钟以使马来酰亚胺基取代中性抗生物素蛋白的赖氨 酸基。使马来酰亚胺基取代的中性抗生物素蛋白与含有200μl二巯基丁 二酸包覆的Zn0.4Mn0.6Fe2O4在室温下反应4小时以制备锌锰铁氧体-中 性抗生物素蛋白纳米杂化颗粒。通过琼脂糖电泳分析所制备的纳米杂化 颗粒。由考马斯亮蓝蛋白质染色结果可见产生了纳米杂化物(图12C， 泳道3)。
实施例20：包含含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI造影剂的细胞毒性的 比较
评价了包含含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI造影剂的细胞毒性。 利用不同浓度的15nm大小的二巯基丁二酸处理的Zn0.4Fe2.6O4来处理 2×105HeLa细胞。24小时后，通过台盼蓝法测量细胞活力。如图13A 所示，在Zn0.4Fe2.6O4浓度高达100μg/ml时细胞活力维持在几乎100％ 的活力，表明所述纳米颗粒是生物相容性的。此外，如图13B所示，在 100μg/ml的浓度下，铁氧体和锰铁氧体纳米颗粒显示相似的细胞活力。 当考虑铁氧体已被美国FDA批准用于人用这一事实时，含锌纳米颗粒 具有生物相容性的优点。
实施例21：用于光-MRI双模式诊断的纳米杂化系统
为了开发具有光学性质和磁性的诊断探针，将荧光染料(罗丹明异 氰酸酯，RITC)与利用BSA进行表面稳定化的含锌锰铁氧体纳米颗粒相 连接(图14A)。为了实现这一点，向其中加入摩尔比为存在于牛血清白蛋 白中-NH2的约20倍的过量NHS-FITC。然后，在正常温度下使其在10mM 磷酸盐缓冲液中反应2小时以合成罗丹明-锌锰铁氧体杂化纳米颗粒。结果 如图14所示，所述光-磁杂化颗粒具有荧光性(图14B)和磁共振图像信 号(图14C)。
因此，本发明的一个目的在于提供一种新的金属氧化物纳米颗粒 MRI造影剂，其与现有的金属氧化物纳米颗粒相比具有显著提高的MR 信号增强作用和诊断灵敏度。尽管以前还没有提出用于上述目的的任何 特定金属添加剂，但本发明通过实验发现并表明尤其是通过利用锌代替 金属氧化物纳米颗粒基质中的金属或者通过将锌添加到间隙空洞中，能 诱导改进金属氧化物纳米颗粒的磁矩和MR造影作用。本发明的另一个 目的在于提供在水性介质中具有高的胶体稳定性和生物相容性的含锌 MRI造影剂。
技术方案
为了实现上述目的，本发明提供了包含含锌磁性金属氧化物纳米颗 粒的MRI造影剂，其特征在于锌原子/离子取代金属氧化物纳米颗粒基 质中的金属或者被添加到金属氧化物纳米颗粒基质的间隙空洞中。本文 中的术语“基质”指其中可添加或减除各种原子的无机纳米颗粒核心和 母体结构。所述含锌金属氧化物磁性纳米颗粒与不含锌的金属氧化物纳 米颗粒基质相比较而言特征在于增大的磁矩和增强的MR信号(R2、 R1)。
本发明提供了MRI造影剂，其特征在于所述含锌金属氧化物纳米 颗粒是其中锌原子/离子被添加到金属氧化物基质中以取代基质中的金 属或被引入到间隙空洞中的化合物，
其中所述金属氧化物纳米颗粒基质是具有下述化学式的化合物：
(a)MaOb(0
(b)McM’dOe(0
(c)ZnfMa-fOb(0
其中所述金属氧化物基质是具有下述化学式的化合物：
(e)M”hFeiOj(0
(f)ZnkM”h-kFeiOj(0
其中所述金属氧化物基质是具有下述化学式的化合物：
(g)FelOm(0
(i)ZnqFel-qOm(0
此外，本发明还提供了与生物活性材料(例如抗体和蛋白质)以及 化学材料(例如荧光材料)相结合的用于诊断的含有“含锌金属氧化物 纳米颗粒和生物/化学活性材料的杂化纳米颗粒”的MRI造影剂。
本发明还提供了特征在于与用于正电子发射断层成像(PET)和单 光子发射断层成像(SPECT)的成像造影剂(例如放射性同位素)、X 射线成像造影剂(例如碘和硫酸钡)以及超声成像造影剂(例如微泡) 相结合的MRI造影剂。
有益效果
根据本发明的含锌金属氧化物纳米颗粒和含锌金属氧化物杂化纳 米颗粒在水溶液中是稳定的，并且具有极好的磁性和低毒性，所述磁性 与已知的铁氧化物和氧化锰纳米颗粒相比显著增强，因此显著增加了 MRI灵敏度。根据本发明的含锌金属氧化物纳米颗粒或其与生物材料 相缀合的含锌金属氧化物纳米颗粒可用于显著改善常规的磁共振成像 并且可用在诊断治疗系统中。
附图说明
图1举例说明了包含含锌铁氧体磁性纳米颗粒(Zn0.4Fe2.6O4)的 MRI造影剂的(1A)透射电镜(TEM)图、(1B)高分辨TEM及其快 速傅里叶变换图像以及(1C)X射线衍射模式分析。
图2举例说明了具有不同锌含量的包含含锌铁氧体磁性纳米颗粒的 MRI造影剂的TEM图像：(2A)ZnxMn1-xFe2O4(x＝0、0.1、0.2、0.3、 0.4、0.8)、(2B)ZnxFe3-xO4(x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.8)。
图3举例说明了包含含锌铁氧体磁性纳米颗粒的MRI造影剂的X 射线能量色散分析(EDAX)：(3A)ZnxMn1-xFe2O4(x＝0、0.1、0.2、 0.3、0.4、0.8)、(3B)ZnxFe3-xO4(x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.8)。
图4举例说明了其中各种类型的金属氧化物被掺入到用作基质的 Fe3O4纳米颗粒中时所述纳米颗粒的饱和磁化度的比较。
图5举例说明了各种不含锌的金属铁氧体(MFe2O4，M＝Mn，Fe， Co和Ni)和含锌金属铁氧体(Zn0.3Mn0.7Fe2O4)的MRI造影作用的比 较。图5A举例说明了大小为15nm的不含锌的金属铁氧体纳米颗粒的 TEM图像。图5B举例说明了大小为15nm的含锌金属铁氧体的TEM 图像。图5C举例说明了含有相同浓度的图5A和5B纳米颗粒的水的 T2快自旋回波磁共振图和R2弛豫系数的比较。
图6举例说明了根据锌含量的包含含锌磁性金属铁氧体纳米颗粒的 MRI造影剂的饱和磁化度。
图7举例说明了根据锌含量的包含含锌磁性金属铁氧体纳米颗粒的 MRI造影剂的MRI信号。(7A)ZnxMn1-xFe2O4(x＝0、0.1、0.2、0.3、 0.4和0.8)和ZnxFe3-xO4(x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.8)纳米颗粒和 菲立磁(Feridex)、CLIO(交联铁氧化物)的T2快自旋回波MRI，(7B) 图(7A)的彩色编码图像，(7C)根据锌含量的R2弛豫图。
图8举例说明了在水溶液中合成的含锌铁氧化物纳米颗粒 (ZnxFe3-xO4，x＝0.2、0.4)。(8A，8B)TEM图像，(8C，8D)EDAX 分析。
图9是含锌铁氧体纳米颗粒ZnxFe3-xO4(x＝(9A)0.4，(9B)0.3， (9C)0.2，(9D)0.1)的根据锌含量的扩展X射线吸收精细结构(EXAFS) 谱。
图10举例说明了通过利用水溶性多官能团配体进行表面修饰并分 散在水中的含锌MRI造影剂(Zn0.4Fe2.6O4)的各种含水溶液的稳定性 试验。图10A举例说明了根据盐浓度的含水溶液的稳定性。图10B举 例说明了根据酸度(pH)变化的含水溶液的稳定性。
图11举例说明了其中通过尾静脉注射包含含锌铁氧体磁性纳米颗 粒(Zn0.4Fe2.6O4，核心大小：15nm)的MRI造影剂的小鼠肝脏的MR 图像。图11A举例说明了注射纳米颗粒造影剂之前小鼠肝脏的MR图 像。图11B至11D举例说明了注射纳米颗粒造影剂之后小鼠肝脏的MR 图像：注射后立即(11B)、注射10分钟后(11C)和注射30分钟后(11D)。
图12举例说明了含锌金属氧化物纳米颗粒和生物材料的杂化纳米 颗粒的制备(12A)，其中所述生物材料与所述锌锰铁氧体纳米颗粒相缀 合、(12B)电泳和(12C)蛋白质染色。
图13举例说明了包含含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI造影剂的细 胞毒性。(13A)含锌磁性纳米颗粒造影剂(Zn0.4Fe2.6O4)的细胞活力的 根据处理量的比较，(13B)在100μg/ml的处理量下铁氧化物(Fe3O4) 和含锌磁性纳米颗粒造影剂(Zn0.4Fe2.6O4和Zn0.4Mn0.6Fe2O4)的细胞活 力的比较。
图14举例说明了将锌锰铁氧体纳米颗粒与荧光染料(罗丹明)相 缀合而得到的磁-光双模式纳米颗粒。图14A举例说明了荧光光致发光 谱和荧光图像的结果，图14B举例说明了所述双模式纳米颗粒的R2自 旋-自旋弛豫系数，图14C举例说明了磁共振图像的结果。
发明实施方式
本发明人发现，当锌被包含在含有不同金属添加剂的金属氧化物纳 米颗粒中时，磁性显著增强，他们开发了具有显著增强的磁性和提高的 MRI信号增强作用的包含含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI造影剂。根 据本发明的“含锌金属氧化物纳米颗粒”是其中锌原子/离子被添加到 金属氧化物纳米颗粒基质中以取代金属原子或者被添加到间隙空洞中 的纳米颗粒。所述含锌金属氧化物纳米颗粒具有极好的磁矩和R2、R1 MRI信号增强作用、在水溶液中的高胶体稳定性、以及由于生物相容 性提高而带来的低毒性，并且其易于与具有生物活性和化学活性的材料 相缀合，从而满足作为MRI造影剂的最佳条件。
本发明说明书中所用的“含锌金属氧化物纳米颗粒”意指直径范围 为1nm至1000nm、优选2nm至100nm的纳米级颗粒。它们以1 μg/ml～500mg/ml，优选1μg/ml～50mg/ml的浓度分散在水中。所述纳 米颗粒的流体力学直径为1nm至500μm，优选1nm至50μm。
所述“金属氧化物纳米颗粒基质”意指其中被加入锌的无机纳米材 料母体。用作基质的金属氧化物是具有下述化学式的纳米颗粒：
MaOb(0
ZnfMa-fOb(0
与此相关，术语“含锌”意指将锌原子置于存在于所述金属氧化物 纳米颗粒基质的晶体结构的氧原子间的阳离子间隙孔洞之中的四面体 孔洞或八面体孔洞中。因此，当生长所述含锌水溶性或水分散性的金属 氧化物纳米颗粒时，在作为基质的所述金属氧化物纳米颗粒首先合成 后，存在于基质上的四面体孔洞或八面体孔洞中的金属原子被锌所取 代，或者当生长所述金属氧化物纳米颗粒基质时，金属原子和锌同时被 掺入以合成所述纳米颗粒，使得锌被置于氧原子的阳离子间隙孔洞之中 的四面体孔洞或八面体孔洞中(例如ZnO+Fe2O3→ZnFe2O4)。尤其是， 在四面体孔洞中的锌是重要的，因为它们在增强纳米颗粒的磁矩中发挥 着作用。其中待添加锌的纳米颗粒的金属氧化物的组成可以是非化学计 量的。
与金属氧化物基质相比较而言，本发明的含锌金属氧化物纳米颗粒 具有更好的饱和磁化度(Ms)或MRI造影作用(R2或R1)。本发明的 含锌金属氧化物的饱和磁化度优选是60emu/g(磁性原子)或更高，更 优选为100emu/g(磁性原子)或更高，最优选为125emu/g(磁性原子) 或更高。当颗粒具有上述磁矩时，其能有效用作MRI造影剂。换言之， 与金属氧化物纳米颗粒基质相比较而言，本发明的含锌金属氧化物纳米 颗粒的MRI造影作用(R2或R1)增加了至少10％，更优选增加了至 少40％，甚至更优选增加了100％或更多，最优选增加300％或更多。
本发明中所用的“含锌金属氧化物纳米颗粒”意指其中水溶性多官 能团配体与所述含锌金属氧化物纳米颗粒相键连并围绕在其周围的纳 米颗粒，或者不与特定配体相连接而本身能溶解或分散在水溶液中的纳 米颗粒。
本发明的含锌金属氧化物纳米颗粒可以多种形式提供，所述形式将 取决于选择何种含锌金属氧化物和多官能团配体。
本文中所用的“水溶性多官能团配体”指可与含锌纳米颗粒相键连 以溶解在水中并稳定所述纳米颗粒并且使得所述纳米颗粒能够与生物/ 化学活性材料相键连的配体。
所述水溶性多官能团配体可包括(a)连接区(LI)，还可包括(b) 反应区(LII)、(c)交联区(LIII)或同时包含所述反应区(LII)和所述 交联区(LIII)的反应-交联区(LII-LIII)。下文中将详细描述所述水溶性 多官能团配体。
所述“连接区(LI)”意指所述多官能团配体的一部分，其包含能与 所述纳米颗粒相结合的官能团，优选该官能团的末端部分。因此，优选 所述连接区包含与构成所述纳米颗粒的材料具有高亲和力的官能团。在 此，所述纳米颗粒可通过离子键、共价键、氢键、疏水键或金属-配体 配位共价键与所述连接区相连。因此，可根据构成所述纳米颗粒的材料 来选择所述多官能团配体的多种连接区。例如，利用离子键、共价键、 氢键或金属-配体配位共价键的连接区可包含-COOH、-NH2、-SH、 -CONH2、-PO3H、-OPO4H、-SO3H、-OSO3H、-N3、-NR3OH(R＝CnH2n+1， 0≤n≤16)、OH、-SS-、-NO2、-CHO、-COX(X＝F、Cl、Br或I)、-COOCO-、 -CONH-或-CN，利用疏水键的连接区可包含含有两个或更多个碳原子 的烃链，但不限于这些。
所述“反应区(LII)”意指所述多官能团配体的一部分，其包含能 与所述活性物质相结合的官能团，优选与所述连接区相对的另一末端部 分。所述反应区的官能团可根据所述活性物质及其化学式的种类(见表 1)而改变。在本发明中，所述反应区可包含-SH、-CHO、-COOH、-NH2、 -OH、-PO3H、-OPO4H2、-SO3H、-OSO3H、-NR3+X-(R＝CnHm，0≤n≤16 并且0≤m≤34，X＝OH、Cl、Br)、NR4+X-(R＝CnHm，0≤n≤16，并且 0≤m≤34，X＝OH、Cl、Br)、-N3、-SCOCH3、-SCN、-NCS、-NCO、 -CN、-F、-Cl、-I、-Br、环氧基、-ONO2、-PO(OH)2、-C＝NNH2、-HC＝CH-、 或-C≡C-，但不限于这些。
所述“交联区(LIII)”意指所述多官能团配体的一部分，其包含能 与相邻多官能团进行交联的官能团，优选其核心部分。所述“交联”意 指通过分子间相互作用使多官能团配体与另一个相邻的多官能团配体 相连接。所述分子间相互作用包括疏水相互作用、氢键、共价键(例如 二硫键)、范德华力以及离子键，但不限于这些。因此，可根据分子间 相互作用对所述可交联官能团进行多种选择。所述交联区可包含例如 -SH、-CHO、-COOH、-NH2、-OH、-PO3H、-OPO4H2、-SO3H、-OSO3H、 -NR3+X-(R＝CnHm，0≤n≤16并且0≤m≤34，X＝OH、Cl、Br)、NR4+X- (R＝CnHm，0≤n≤16并且0≤m≤34，X＝OH、Cl、Br)、-N3、-SCOCH3、 -SCN、-NCS、-NCO、-CN、-F、-Cl、-I、-Br、环氧基、-ONO2、-PO(OH)2、 -C＝NNH2、-HC＝CH-或-C≡C-作为官能团。
(表1)
多官能团配体中反应区的示例性官能团
I II III R-NH2 R′-COOH R-NHCO-R′ R-SH R′-SH R-SS-R′ R-OH R′-(环氧基) R-OCH2CH(OH)-R′ R-NH2 R′-(环氧基) R-NHCH2CH(OH)-R′ R-SH R′-(环氧基) R-SCH2CH(OH)-R′ R-NH2 R′-COH R-N＝CH-R′ R-NH2 R′-NCO R-NHCONH-R′ R-NH2 R′-NCS R-NHCSNH-R′ R-SH R′-COCH3 R′-COCH2S-R R-SH R′-O(C＝O)X R-S(C＝O)O-R′ R-(氮丙啶基) R′-SH R-CH2CH(NH2)CH2S-R′ R-CH＝CH2 R′-SH R-CH2CH2S-R′ R-OH R′-NCO R′-NHCOO-R R-SH R′-COCH2X R-SCH2CO-R′ R-NH2 R′-CON3 R-NHCO-R′ R-COOH R′-COOH R-(C＝O)O(C＝O)-R′+H2O R-SH R′-X R-S-R′ R-NH2 R′CH2C(NH2+)OCH3 R-NHC(NH2+)CH2-R′ R-OP(O2-)OH R′-NH2 R-OP(O2-)-NH-R′ R-CONHNH2 R′-COH R-CONHN＝CH-R′ R-NH2 R′-SH R-NHCO(CH2)2SS-R′
(I：多官能团配体中反应区的官能团，II：活性物质，以及III：I和 II反应的示例性键)
在本发明中，本身含有上述官能团的化合物可用作水溶性多官能团 配体，而且通过本领域中公知的化学反应进行修饰或制备使得具有上述 官能团的化合物也可用作水溶性多官能团配体。
对于本发明的含锌水溶性纳米颗粒而言，所述多官能团配体的一个 实例是二巯基丁二酸，因为二巯基丁二酸最初含有连接区、交联区和反 应区。也就是说，二巯基丁二酸官能团一侧的-COOH与纳米颗粒键连， 另一端部分上的COOH和SH起到与活性物质相连接的作用。在-SH的 情形下，其可通过与另一个-SH进行氧化而得的-SS-键用作交联区。除 了二巯基丁二酸以外，其它含有作为连接区(LI)官能团的-COOH、作 为反应区(LII)和交联区(LIII)官能团的-COOH、-SH或-NH2的化合 物也可用作所述多官能团配体。所述化合物的实例包括二巯基马来酸和 二巯基戊二酸，但不限于这些。
在根据本发明的含锌水溶性金属氧化物纳米颗粒中，所述多官能团 配体的其它优选实例包括四甲基氢氧化铵(TMAOH)。TMAOH是合 适的，因为其含有连接区和反应区。换句话说，TMAOH在与金属氧化 物纳米颗粒表面相连接的一侧具有-OH，并且在其末端具有通过离子键 与活性物质相连接的N(CH3)4+。除了TMAOH以外，含有作为连接区 (LI)官能团的-OH和作为反应区(LII)官能团的N(CH3)4+或-N(CH3)3+ 的化合物也可用作优选的多官能团配体。这些化合物的另一个实例包括 四乙基氢氧化铵、三甲基丙醇铵，但不限于这些。
在根据本发明的含锌水溶性金属氧化物纳米颗粒中，所述多官能团 配体的其它优选实例包括肽。肽是由氨基酸组成的低聚体/聚合物。因 为氨基酸在其两端具有-COOH和-NH2官能团，所以肽具有连接区 (attachment region)和反应区。此外，尤其是，包含一个或多个氨基 酸(其具有-SH、-COOH、-NH2和-OH中的一个或多个)作为侧链的 肽可用作优选的水溶性多官能团配体。
对于根据本发明的水溶性纳米颗粒而言，所述优选的多官能团配体 的另一个实例是蛋白质。蛋白质是由比肽更多的氨基酸组成的聚合物， 也就是说，由几百个或几十万个氨基酸组成，其末端含有-COOH或-NH2 官能团，并且含有多个-COOH、-NH2、-SH、-OH、-CONH2等。因为 与上述肽一样，就蛋白质的结构而言，蛋白质可天然地包含连接区、交 联区和反应区，因此其可用作本发明的多官能团配体。优选作为相转移 配体的蛋白质的代表性实例包括结构蛋白、贮存蛋白、转运蛋白、激素 蛋白、受体蛋白、收缩蛋白、防御蛋白和酶蛋白。更具体而言可以是白 蛋白、抗体、第二抗体、抗原、抗生物素蛋白、细胞色素、酪蛋白、肌 球蛋白、大豆球蛋白、胡萝卜素、胶原、球蛋白、光蛋白、链霉抗生物 素蛋白、蛋白质A、蛋白质G、蛋白质S、免疫球蛋白、凝集素、选择 素、血管生成素、抗癌蛋白、抗生素蛋白、激素拮抗剂蛋白、白细胞介 素、干扰素、生长因子蛋白、肿瘤坏死因子蛋白、内毒素蛋白、淋巴毒 素蛋白、组织纤溶酶原激活剂、尿激酶、链激酶、蛋白酶抑制剂、烷基 磷酸胆碱、表面活性剂、心血管药物蛋白、神经药物蛋白和胃肠道药物。
对于根据本发明的水溶性纳米颗粒而言，所述优选的多官能团配体 的另一些实例包括含有疏水区和亲水区的两亲性配体。在有机溶剂中合 成的纳米颗粒的情形下，具有长烷基链的疏水性配体包覆表面。在此时 添加的两亲性配体的疏水区和纳米颗粒表面的疏水性配体通过分子间 相互作用彼此相连接以稳定所述纳米颗粒。此外，所述纳米颗粒的最外 面部分显示出亲水性官能团，从而可制得水溶性纳米颗粒。在此，分子 间相互作用包括疏水相互作用，氢键和范德华力。在此，通过疏水相互 作用与纳米颗粒相连接的部分是连接区(LI)，另外可通过有机化学方 法将反应区(LII)和交联区(LIII)引入其中。此外，为了增加在含水 溶液中的稳定性，可使用具有多个疏水区和多个亲水区的两亲性聚合物 配体。两亲性配体之间的交联还可增加纳米颗粒在水性介质中的胶体稳 定性。两亲性配体的疏水区可以是由含有2个或更多个碳原子的链组成 的直链或支链结构，更优选是烷基官能团，例如乙基、正丙基、异丙基、 正丁基、异丁基、叔丁基、辛基、癸基、十四烷基、十六烷基、二十烷 基、二十四烷基、十二烷基、环戊基和环己基；具有含有碳碳双键的不 饱和碳链的官能团，例如乙炔基、丙烯基、异丙烯基、丁烯基、异丁烯 基、辛烯基、癸烯基和十八碳烯基；以及具有含有碳碳叁键的不饱和碳 链的官能团，例如丙炔基、异丙炔基、丁炔基、异丁炔基、辛炔基和癸 炔基。此外，亲水区的实例包括在特定pH下中性，但在较高或较低的 pH下则带正电荷或负电荷的官能团，例如-SH、-COOH、-NH2、-OH、 -PO3H、-OPO4H2、-SO3H、-OSO3H和-NR3+X-。其优选的实例包括其 中所用单体包括以下成分的聚合物和嵌段共聚物：丙烯酸、烷基丙烯酸、 ataconic acid、马来酸、富马酸、丙烯酰胺基甲基丙磺酸、乙烯磺酸、 乙烯磷酸、乙烯乳酸、苯乙烯磺酸、烯丙基铵、丙烯腈、N-乙烯吡咯烷 酮和N-乙烯甲酰胺，但是不限于这些。
在根据本发明的水溶性纳米颗粒中，所述多官能团配体的优选其它 实例包括单糖、二糖和生物可降解聚合物。所述多官能团配体的优选实 例包括葡萄糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰葡萄糖胺、N-乙酰半乳糖胺、 N-乙酰神经氨酸、果糖、木糖、山梨醇、蔗糖、麦芽糖、糖醛 (glycoaldehyde)、二羟基丙酮、赤藓糖、赤藓酮糖、阿拉伯糖、木酮 糖、乳糖、海藻糖、mellibose、纤维二糖、棉子糖、松三糖、麦芽三糖、 水苏四糖、estrodose、木聚糖、阿拉伯聚糖、己聚糖、果聚糖、半乳聚 糖、甘露聚糖、琼脂胶、藻酸、半纤维素、羟丙基甲基纤维素 (hypromellose)、直链淀粉(amylose)、去氧丙酮、甘油醛、甲壳素、 琼脂糖、葡聚糖、核糖、核酮糖、半乳糖、羧甲基纤维素、糖原葡聚糖 (glycogendextran)、羰基葡聚糖(carbodextran)、多糖、环葡聚糖 (cyclodextran)、支链淀粉(pullulan)、纤维素、淀粉、糖原、碳水化 合物、聚磷腈、聚交酯、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、聚己内酯、聚酸酐、 聚马来酸、聚马来酸衍生物、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚羟基丁酸酯、聚 碳酸酯、聚原酸酯、聚乙二醇、聚-L-赖氨酸、聚羟基乙酸、聚甲基丙 烯酸甲酯、聚乙烯吡咯烷酮等。
另一方面，本发明提供了含锌金属氧化物-生物/化学活性材料的杂 化纳米颗粒，其中具有生物功能特性的化学功能性分子或生物材料与所 述含锌金属氧化物纳米颗粒的反应区相结合。
本文中所用的“含锌金属氧化物纳米颗粒和生物/化学活性物质的杂 化纳米颗粒”意指包含含锌金属氧化物纳米颗粒的纳米颗粒，其中所述 多官能团配体被加帽和溶解。所述生物活性材料(例如抗体、蛋白质、 抗原、肽、核酸、酶和细胞)或化学活性材料(例如单体、聚合物、无 机载体材料、荧光材料和药物)通过共价键、离子键和疏水键与配体的 活性材料相缀合。
在本发明中，“含锌金属氧化物纳米颗粒和生物/化学活性物质的杂 化纳米颗粒”的实例包括其中化学功能性分子与所述含锌金属氧化物相 结合的形式。所述化学功能性分子包括单体、聚合物、无机载体、无机 材料、生物功能材料等。
与此相关，所述单体是各种类型的化学品，单体的实例包括抗癌剂、 抗生素、维生素、含有叶酸的药物、脂肪酸、类固醇、激素、嘌呤、嘧 啶、单糖和二糖。然而，单体的实例不限于这些。
优选的化学功能单体在其末端或侧链上具有选自下述基团中的一 个或多个官能团：-COOH、-NH2、-SH、-SS-、-CONH2、-PO3H、-OPO4H2、 -PO2(OR1)(OR2)(R1、R2＝CsHtNuOwSxPyXz，X＝-F、-Cl、-Br或-I，0≤s≤20， 0≤t≤2(s+u)+1，0≤u≤2s，0≤w≤2s，0≤x≤2s，0≤y≤2s，0≤z≤2s)、-SO3H、 -OSO3H、-NO2、-CHO、-COSH、-COX、-COOCO-、-CORCO-(R＝ClHm， 0≤l≤3，0≤m≤2l+1)、-COOR、-CN、-N3、-N2、-NROH(R＝CsHtNuOwSxPyXz， X＝-F、-Cl、-Br或-I，0≤s≤20，0≤t≤2(s+u)+1，0≤u≤2s，0≤w≤2s，0≤x≤2s， 0≤y≤2s，0≤z≤2s)、-NR1NR2R3(R1，R2，R3＝CsHtNuOwSxPyXz，X＝-F、-Cl、 -Br或-I，0≤s≤20，0≤t≤2(s+u)+1，0≤u≤2s，0≤w≤2s，0≤x≤2s，0≤y≤2s， 0≤z≤2s)、-CONHNR1R2(R1，R2＝CsHtNuOwSxPyXz，X＝-F、-Cl、-Br或 -I，0≤s≤20，0≤t≤2(s+u)+1，0≤u≤2s，0≤w≤2s，0≤x≤2s，0≤y≤2s，0≤z≤2s)、 -NR1R2R3X’(R1，R2，R3＝CsHtNuOwSxPyXz，X＝-F、-Cl、-Br或-I，X’＝-F、 -Cl、-Br或-I，，0≤s≤20，0≤t≤2(s+u)+1，0≤u≤2s，0≤w≤2s，0≤x≤2s，0≤y≤2s， 0≤z≤2s)、-OH、-SCOCH3、-F、-Cl、-Br、-I、-SCN、-NCO、-OCN、 -环氧基、-C＝NNH2、-HC＝CH-以及-C三C-。
聚合物的实例包括葡聚糖、羰基葡聚糖、多糖、环葡聚糖、支链多 糖、纤维素、淀粉、糖原、碳水化合物、单糖、二糖、寡糖、聚磷腈、 聚交酯、聚(乳酸-共-羟基乙酸)、聚己内酯、聚酸酐、聚马来酸、聚马 来酸衍生物、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚羟基丁酸酯、聚碳酸酯、聚原酸 酯、聚乙二醇、聚-L-赖氨酸、聚羟基乙酸、聚甲基丙烯酸甲酯、聚乙 烯吡咯烷酮等。
无机载体的实例包括金属氧化物、金属硫族(charcogenide)化物、 无机陶瓷材料、碳材料、由II族/VI族、III族/V族、以及IV族元素组 成的半导体基质、金属基质及其组合等，优选地，其是二氧化硅(SiO2)、 二氧化钛(TiO2)、铟锡氧化物(ITO)、纳米管、石墨、富勒烯、CdS、 CdSe、CdTe、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe、Si、GaAs、AlAs、Au、Pt、 Ag、Cu。
所述无机材料选自：金属氧化物(由选自第一族和第二族金属元素、 过渡金属元素、第十三族元素、第十四族元素、第十五族元素、镧系元 素和锕系元素中的至少一种元素组成的金属氧化物)；半导体(由选自 第十三族元素、第十二族元素、第十四族元素、第十五族元素和第十六 族元素中至少两种元素组成的半导体)；过渡金属；第十三族元素；第 十四族元素；第十五族元素和第十六族元素，但不限于这些。
本发明的“含锌金属氧化物纳米颗粒和生物/化学活性材料的杂化纳 米颗粒”的一个实例被构建成使得所述含锌金属氧化物纳米颗粒选择性 地与生物功能性分子相缀合。所述生物功能性分子的实例包括蛋白质、 肽、DNA、RNA和生物功能性药物，并且优选组织特异性结合物质， 例如抗原、抗体、半抗原、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白、中性抗 生物素蛋白、蛋白质A、蛋白质G、凝集素和选择素；药物活性物质例 如抗癌剂、抗生素、激素、激素拮抗剂、白细胞介素、干扰素、生长因 子、肿瘤坏死因子、内毒素、淋巴毒素、尿激酶、链激酶、组织纤溶酶 原激活剂、蛋白酶抑制剂、烷基磷酸胆碱、表面活性剂、心血管药物、 胃肠道药物和神经药物；生物活性酶例如水解酶、氧化还原酶、裂合酶、 异构酶和合成酶；酶辅因子以及酶抑制剂，但不限于这些。
下文将详细描述制备本发明的水溶性含锌金属氧化物纳米颗粒的 方法。
本发明的水溶性含锌金属氧化物纳米颗粒可通过利用本领域公知 的气相纳米颗粒合成法或液相(包括含水溶液、有机溶剂或多溶剂体系) 纳米颗粒合成法来制得。
作为制备本发明纳米颗粒的优选方法的一个实例，可通过下述步骤 制备纳米颗粒：(1)在有机溶剂中合成水不溶性纳米颗粒，(2)将所述 水不溶性纳米颗粒溶解在第一溶剂中，并将水溶性多官能团配体溶解在 第二溶剂中，以及(3)将由步骤(2)所得的两种溶液相混合使得所述 多官能团配体缀合在所述水不溶性纳米颗粒表面上，随后通过溶解在含 水溶液中进行分离。
所述方法的步骤(1)涉及用于制备水不溶性纳米颗粒的方法。在 本发明一个实施方案中，可通过包括以下步骤的方法制备水不溶性纳米 颗粒：将纳米颗粒前体引入到含有表面稳定剂的有机溶剂中，在50至 600℃、优选在100至600℃维持一段时间使得所述纳米颗粒前体物质进 行纳米颗粒生长的化学反应，然后分离和纯化以制备所得的水不溶性纳 米颗粒。
作为纳米颗粒前体，可以使用基于金属硝酸盐的化合物、基于金属 硫酸盐的化合物、基于金属乙酰丙酮化物的化合物、基于金属氟乙酰乙 酸盐的化合物、基于金属卤化物的化合物、基于金属高氯酸盐 (perchlororate)的化合物、基于金属氨基磺酸盐的化合物、基于金属 硬脂酸盐的化合物、或基于有机金属的化合物，但不限于这些。
作为有机溶剂，可以使用基于苯的溶剂、烃溶剂、基于醚的溶剂、 聚合物溶剂或离子型液体溶剂，并且优选苯、甲苯、卤代苯、辛烷、壬 烷、癸烷、苄醚、苯醚、烃醚、聚合物溶剂或离子液体溶剂，但不限于 这些。
在所述制备方法的步骤(2)中，将上述制备的纳米颗粒溶解在第 一溶剂中，而将多官能团配体溶解在第二溶剂中。作为第一溶剂，可以 使用基于苯的溶剂、烃溶剂、基于醚的溶剂、卤代烃、醇、基于亚砜的 溶剂、基于酰胺的溶剂等，并且优选苯、甲苯、卤代苯、戊烷、己烷、 壬烷、癸烷、苄醚、苯醚和烃醚、二氯甲烷、溴代甲烷、甲醇和乙醇， 二甲基亚砜、二甲基甲酰胺。作为第二溶剂，可以使用如上所述的第一 溶剂以及水。
在所述制备方法的步骤(3)中，将两种溶液混合，使得水不溶性 纳米颗粒的有机表面稳定剂被水溶性多官能团配体代替。可利用本领域 中公知的方法分离被水溶性多官能团配体代替的纳米颗粒。可通过离心 或过滤来分离被水溶性多官能团配体取代的纳米颗粒。分离后，通过滴 定步骤将pH优选调节至5到10以得到更稳定分散的水溶性纳米颗粒。
根据上述方法制备的含锌金属氧化物纳米颗粒具有均一的粒径分 布(粒径分布(σ)<10％)和高结晶度。此外，利用该方法，可精确控 制纳米颗粒基质中的锌含量。换言之，通过改变锌和其它金属前体材料 的比例，可将纳米颗粒中的锌含量控制在化学计量比为0.001<‘锌/(全 部金属-锌)，<10。尤其是促进锌在四面体孔洞中的沉积，这增加了磁矩。
在一种制备含锌金属氧化物纳米颗粒MRI造影剂的替代方法中， 不必通过如上述方法所述在有机溶剂中合成的纳米颗粒的相转变来制 备水溶性纳米颗粒，而是可通过金属前体水溶液中的化学反应由晶体生 长进行合成。该方法可通过已知的合成水溶性纳米颗粒的方法(其为通 过将锌前体添加到含有多官能团配体的水溶液中来合成水溶性含锌金 属氧化物纳米颗粒的方法)来实施。本发明的含锌金属氧化物磁性纳米 颗粒具有增强的磁性以及MRI信号增强作用，而不限于具体的制备方 法。
所得的水溶性纳米颗粒的实例描述在表2中。
(表2)
制备的含锌纳米颗粒及其性质
编 号 基质 锌含量 (＝锌/ 总金 属-锌) 化学式 核心 大小 (nm) 水溶性多官能 团配体 磁化 度 (emu /g) MRI造 影作用 (R2， 毫秒-1) 1 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 6 二巯基丁二酸 92 2 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 6 四甲基氢氧化铵 92 3 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 6 BSA 92 4 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 6 羰基葡聚糖 92 5 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 9 二巯基丁二酸 108 6 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 9 四甲基氢氧化铵 108 7 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 9 BSA 108 8 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 9 羰基葡聚糖 108 9 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 12 二巯基丁二酸 136 10 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 12 四甲基氢氧化铵 136
11 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 12 BSA 136 1.2 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 12 羰基葡聚糖 136 13 铁氧体 0.034 Zn0.1Fe2.9O4 15 二巯基丁二酸 126 0.0024 14 铁氧体 0.034 Zn0.1Fe2.9O4 15 四甲基氢氧化铵 128 15 铁氧体 0.034 Zn0.1Fe2.9O4 15 BSA 126 16 铁氧体 0.034 Zn0.1Fe2.8O4 15 羰基葡聚糖 126 17 铁氧体 0.071 Zn0.2Fe2.8O4 15 二巯基丁二酸 138 0.0031 18 铁氧体 0.071 Zn0.2Fe2.8O4 15 四甲基氢氧化铵 138 19 铁氧体 0.071 Zn0.2Fe2.8O4 15 BSA 138 20 铁氧体 0.071 Zn0.2Fe2.8O4 15 羰基葡聚糖 138 21 铁氧体 0.111 Zn0.3Fe2.7O4 15 二巯基丁二酸 152 0.0038 22 铁氧体 0.111 Zn0.3Fe2.7O4 15 四甲基氢氧化铵 152 23 铁氧体 0.111 Zn0.3Fe2.7O4 15 BSA 152 24 铁氧体 0.111 Zn0.3Fe2.7O4 15 羰基葡聚糖 152 25 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 15 二巯基丁二酸 161 0.0045 26 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 15 四甲基氢氧化铵 161 27 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 15 BSA 161 28 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 15 羰基葡聚糖 161 29 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 15 羟丙基甲基纤维素 161 30 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 15 中性抗生物素蛋白 161 31 铁氧体 0.154 Zn0.4Fe2.6O4 15 抗体(IgG) 161 32 铁氧体 0.364 Zn0.8Fe2.2O4 15 二巯基丁二酸 115 0.0016 33 铁氧体 0.364 Zn0.8Fe2.2O4 15 四甲基氢氧化铵 115 34 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 6 二巯基丁二酸 107 35 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 6 四甲基氢氧化铵 107 36 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 6 BSA 107
37 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.5Fe2O4 6 羰基葡聚糖 107 38 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 9 二巯基丁二酸 129 39 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 9 四甲基氢氧化铵 129 40 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 9 BSA 129 41 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 9 羰基葡聚糖 129 42 锰铁氧体 0.071 Zn0.2Mn0.6Fe2O4 12 二巯基丁二酸 135 43 锰铁氧体 0.071 Zn0.2Mn0.8Fe2O4 12 四甲基氢氧化铵 135 44 锰铁氧体 0.071 Zn0.2Mn0.8Fe2O4 12 BSA 135 45 锰铁氧体 0.071 Zn0.2Mn0.8Fe2O4 12 羰基葡聚糖 135 46 锰铁氧体 0.111 Zn0.3Mn0.7Fe2O4 12 二巯基丁二酸 146 47 锰铁氧体 0.111 Zn0.3Mn0.7Fe2O4 12 四甲基氢氧化铵 146 48 锰铁氧体 0.111 Zn0.3Mn0.7Fe2O4 12 BSA 146 49 锰铁氧体 0.111 Zn0.3Mn0.7Fe2O4 12 羰基葡聚糖 146 50 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 12 二巯基丁二酸 153 51 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 12 四甲基氢氧化铵 153 52 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 12 BSA 153 53 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.8Fe2O4 12 羰基葡聚糖 153 54 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 12 羟丙基甲基纤维素 153 55 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 12 中性抗生物素蛋白 153 56 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 12 抗体(IgG) 153 57 锰铁氧体 0.034 Zn0.1Mn0.9Fe2O4 15 二巯基丁二酸 140 0.0034 58 锰铁氧体 0.034 Zn0.1Mn0.9Fe2O4 15 四甲基氢氧化铵 140 59 锰铁氧体 0.034 Zn0.1Mn0.9Fe2O4 15 BSA 140 60 锰铁氧体 0.034 Zn0.1Mn0.9Fe2O4 15 羰基葡聚糖 140
61 锰铁氧体 0.071 Zn0.2Mn0.9Fe2O4 15 二巯基丁二酸 154 0.0041 62 锰铁氧体 0.071 Zn0.2Mn0.8Fe2O4 15 四甲基氢氧化铵 154 63 锰铁氧体 0.071 Zn0.2Mn0.8Fe2O4 15 BSA 154 64 锰铁氧体 0.071 Zn0.2Mn0.8Fe2O4 15 羰基葡聚糖 154 65 锰铁氧体 0.111 Zn0.3Mn0.7Fe2O4 15 二巯基丁二酸 166 0.0046 66 锰铁氧体 0.111 Zn03Mn0.7Fe2O4 15 四甲基氢氧化铵 166 67 锰铁氧体 0.111 Zn0.3Mn0.7Fe2O4 15 BSA 166 68 锰铁氧体 0.111 Zn0.3Mn0.7Fe2O4 15 羰基葡聚糖 166 69 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 15 二巯基丁二酸 175 0.0052 70 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 15 四甲基氢氧化铵 175 71 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 15 BSA 175 72 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 15 羰基葡聚糖 175 73 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 15 羟丙基甲基纤维素 175 74 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 15 中性抗生物素蛋白 175 75 锰铁氧体 0.154 Zn0.4Mn0.6Fe2O4 15 抗体(IgG) 175 76 锰铁氧体 0.364 Zn0.8Mn0.2Fe2O4 15 二巯基丁二酸 138 0.0036 77 锰铁氧体 0.364 Zn0.8Mn0.2Fe2O4 15 四甲基氢氧化铵 138 78 钴铁氧体 0.111 Zn0.3Co0.7Fe2O4 12 二巯基丁二酸 79 钴铁氧体 0.111 Zn0.3Co0.7Fe2O4 12 四甲基氢氧化铵 80 钴铁氧体 0.111 Zn0.3Co0.7Fe2O4 12 BSA 81 钴铁氧体 0.111 Zn0.3Co0.7Fe2O4 12 羰基葡聚糖 82 钴铁氧体 0.154 Zn0.4Co0.6Fe2O4 12 二巯基丁二酸 83 钴铁氧体 0.154 Zn0.4Co0.6Fe2O4 12 四甲基氢氧化铵
84 钴铁氧体 0.154 Zn0.4Co0.6Fe2O4 12 BSA 85 钴铁氧体 0.154 Zn0.4Co0.6Fe2O4 12 羰基葡聚糖 86 镍铁氧体 0.111 Zn0.3Ni0.7Fe2O4 12 二巯基丁二酸 87 镍铁氧体 0.111 Zn0.3Ni0.7Fe2O4 12 四甲基氢氧化铵 88 镍铁氧体 0.111 Zn0.3Ni0.7Fe2O4 12 BSA 89 镍铁氧体 0.111 Zn0.3Ni0.7Fe2O4 12 羰基葡聚糖 90 镍铁氧体 0.154 Zn0.4Ni0.6Fe2O4 12 二巯基丁二酸 91 镍铁氧体 0.154 Zn0.4Ni0.6Fe2O4 12 四甲基氢氧化铵 92 镍铁氧体 0.154 Zn0.4Ni0.6Fe2O4 12 BSA 93 镍铁氧体 0.154 Zn0.4Ni0.6Fe2O4 12 羰基葡聚糖 94 氧化锰 0.154 Zn0.4Mn2.6O4 6 四甲基氢氧化铵 95 氧化锰 0.154 Zn0.4Mn2.6O4 6 BSA 96 氧化锰 0.154 Zn0.4Mn2.6O4 6 羰基葡聚糖 97 氧化钴 0.25 Zn0.2Co0.8O 7 四甲基氢氧化铵 98 氧化钴 0.25 Zn0.2Co0.9O 7 BSA 99 氧化钴 0.25 Zn0.2Co0.8O 7 羰基葡聚糖 100 氧化镍 0.25 Zn0.2Ni0.8O 10 四甲基氢氧化铵 101 氧化镍 0.25 Zn0.2Ni0.8O 10 BSA 102 氧化镍 0.25 Zn0.2Ni0.8O 10 羰基葡聚糖
下文中将详细描述包含含锌水溶性金属氧化物纳米材料的MRI造 影剂的应用。
本发明的“含锌金属氧化物纳米颗粒”相比于常规含有金属氧化物 纳米颗粒的MRI造影剂具有更高的磁矩，因此其可实现更高水平的高 灵敏度诊断。此外，与常规MRI造影剂相比较而言，甚至少量的本发 明的“含锌金属氧化物纳米颗粒”也可提供将信号增强至所期望水平的 作用。因此，与常规材料相比，它们可用作具有较低生物学毒性和副作 用的造影剂。
由于含锌水溶性金属氧化物纳米颗粒与常规铁氧化物纳米颗粒相 比较而言具有极好的R2、R1MRI信号增强作用，因此可进行早期疾病 诊断和极少量生物分子的检测。一般而言，在癌细胞、脑血管事件或心 肌梗塞发生部位的表面上具有过度表达的生物标志物。可以通过本领域 中已知的方法获得所述具有靶向特异性并能与所述生物标志物(例如生 物聚合物和化学分子，比如抗体、蛋白质、核酸、酶等)选择性结合的 材料。或者，可使用已知的材料。所述通过上述方法获得的具有靶向特 异性的材料可与所述含锌水溶性金属氧化物纳米颗粒的反应区缀合以 合成所述杂化纳米颗粒，其能检测引起疾病的部位或组织。因此，所述 磁性纳米颗粒标记患病部位并显示MRI信号，从而实现诊断。
包含在本发明的MRI造影剂中并且是人体中必需元素的与锌相关 的蛋白质主要用作酶而在新陈代谢的活化中起到重要的作用。因此，与 基于铁氧体的成像造影剂相似，含锌金属氧化物纳米颗粒是生物相容性 且低毒性的。
水溶性含锌金属氧化物纳米颗粒还可与其它诊断探针相偶联用作 双诊断探针或多诊断探针。
就本发明的MRI造影剂而言，例如放射性同位素、X射线成像造 影剂(例如碘和硫酸钡)和超声成像造影剂(例如微泡)可与含锌水溶 性金属氧化物纳米颗粒键合。所得的MRI造影剂可用于单光子发射计 算机断层成像(SPECT)或正电子断层成像(PET)和计算机断层成像 (CT)。
此外，就本发明的MRI造影剂而言，荧光材料可与含锌水溶性金 属氧化物纳米颗粒键合。该MRI造影剂可用于光学成像和光谱学。
实施例
实施例1：核心大小为15nm并利用二巯基丁二酸包覆的ZnxM1-xFe2O4 (M＝Fe或Mn，x＝0.1、0.2、0.3、0.4和0.8)含锌铁氧体纳米颗粒MRI 造影剂的合成
作为本发明说明书中所述的含有含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI 造影剂的一个实例，通过韩国专利No.10-0604975、10-0652251和 10-0713745；PCT/KR2004/002509；韩国专利No.10-0604975； PCT/KR2004/003088；PCT/KR2007/001001以及韩国专利申请No. 2006-0018921中所公开的方法合成核心大小为15nm的ZnxM1-xFe2O4 (M＝Fe或Mn，x＝0.1、0.2、0.3、0.4和0.8)含锌铁氧体纳米颗粒MRI 造影剂。将ZnCl2、FeCl2或MnCl2和Fe(acac)3(acac＝乙酰丙酮)添加 到其中含有20mmol油酸和油胺的三辛胺溶剂中。使反应在200℃和300 ℃进行2小时以合成15nm的ZnxM1-xFe2O4(M＝Fe或Mn，x＝0.1、0.2、 0.3、0.4和0.8)纳米颗粒。为了控制锌含量比使得x在0.1至0.8的范 围内，利用同一种方法提高或降低作为前体材料的ZnCl2和FeCl2的比 例。利用过量的乙醇沉淀所制备的含锌铁氧体纳米颗粒，并将所分离的 纳米颗粒重新分散在甲苯中以得到胶体溶液。
其后，将其中溶解有过量二巯基丁二酸的DMSO溶液添加到分散在 甲苯中的20mg/ml的纳米颗粒中，然后反应2小时，将纳米颗粒离心， 然后分散在水中。
图1和图2举例说明了通过上述方法得到的、具有15nm大小(粒 径分布σ<10％)的均一球形的ZnxM1-xFe2O4(M＝Fe或Mn，x＝0、0.1、 0.2、0.3、0.4和0.8)。通过高分辨TEM(图1B)和X射线衍射图(XRD) (图1C)可见，纳米颗粒具有尖晶石结构和高结晶度。通过电感耦合 等离子体-质谱(ICP-MS)和X射线的能量分散式的原子发射谱(EDAX) 分析锌含量，证实了可精确控制锌含量(图3)。
根据本发明的纳米颗粒的锌含量、核心大小、所用的水溶性多官能 团配体、磁矩和MRI造影作用显示在表2中编号13～33和57～77中。
实施例2：核心大小为6、9和12nm并利用二巯基丁二酸包覆的 Zn0.4M0.6Fe2O4(M＝Fe或Mn)含锌铁氧体纳米颗粒MRI造影剂的合成
将10mmol油酸和30mmol油胺与ZnCl2、FeCl2或MnCl2和 Fe(acac)3添加到三辛胺溶剂中。将所述溶液在180℃和250℃热分解3 小时以合成6nm的Zn0.4M0.6Fe2O4(M＝Fe或Mn)纳米颗粒。为了合 成9nm和12nm的不同大小的纳米颗粒，将相同量的前体材料添加到 改变油酸和油胺比例的三辛胺溶液中，加热并通过相同方法彼此反应， 然后进行沉淀。
其后，将其中溶解有过量二巯基丁二酸的DMSO溶液添加到分散在 甲苯中的20mg/ml的纳米颗粒中，然后反应2小时，将纳米颗粒离心， 然后分散在水中。
通过上述方法合成的纳米颗粒为球形，并且具有非常均一的粒径， 通过ICP-MS和EDAX分析锌含量。根据本发明的纳米颗粒的锌含量、 核心大小、所用的水溶性多官能团配体和磁化度显示在表2中编号1～12 和34～56中。
实施例3：核心大小为12nm并利用二巯基丁二酸包覆的ZnxM1-xFe2O4 (M＝Co或Ni，x＝0.3和0.4)含锌的钴铁氧体纳米颗粒MRI造影剂 的合成
作为本发明包含含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI造影剂的一个实 例，通过下述方法合成了核心大小为12nm的ZnxM1-xFe2O4(M＝Co或 Ni，x＝0.3和0.4)含锌的铁氧体纳米颗粒MRI造影剂。将20mmol 油酸和油胺与ZnCl2、CoCl2或NiCl2和Fe(acac)3一起添加到三辛胺溶 剂中以合成所述纳米颗粒。将所述溶液在200℃和300℃热分解2小时 以合成12nm大小的Zn0.3M0.7Fe2O4(M＝Co或Ni)纳米颗粒。为了合 成9nm和12nm的不同大小的纳米颗粒，将相同量的前体材料添加到 控制油酸和油胺比例的三辛胺溶液中。
其后，将其中溶解有过量二巯基丁二酸的DMSO溶液添加到分散在 甲苯中的20mg/ml的纳米颗粒中，然后反应2小时，将纳米颗粒离心， 然后分散在水中。
通过上述方法合成的纳米颗粒为球形，并且具有非常均一的粒径， 通过ICP-MS和EDAX分析锌含量。根据本发明的纳米颗粒的锌含量、 核心大小和所用的水溶性多官能团配体显示在表2中编号78～93中。
实施例4：利用四甲基氢氧化铵(TMAOH)包覆的ZnxMyOz(M＝Mn、 Co或Ni)含锌氧化物纳米颗粒MRI造影剂的合成
作为本发明说明书中所述的包含含锌金属氧化物纳米颗粒的 MRI造影剂的一个实例，通过下述方法合成了ZnxMyOz(M＝Mn、Co 或Ni)组成的含锌氧化锰纳米颗粒MRI造影剂。将ZnCl2、MCl2(M＝Mn、 Co或Ni)以0.5mmol和6.5mmol的量分散到其中含有油酸和油胺的 三辛胺溶液中，加热至270℃并维持1小时以合成12nm的ZnxMyOz (M＝Mn、Co或Ni)纳米颗粒。将通过上述方法合成并以50mg/ml 的浓度分散在1ml甲苯中的含锌氧化物纳米颗粒利用过量乙醇进行沉 淀，并重新分散在5ml TMAOH溶液中。所合成的纳米颗粒含有 Zn0.4Mn2.6O4、Zn0.2Co0.8O或Zn0.2Ni0.8O组成并且核心大小为6、7和 10nm。通过ICP-MS和EDAX分析锌含量。根据本发明的纳米颗粒的 锌含量、核心大小和所用的水溶性多官能团配体显示在表2中编号 94～102中。
实施例5：含有不同类型金属添加剂的铁氧化物纳米颗粒基质的饱和磁 化度的比较
为了解哪种类型的金属添加剂能增加纳米颗粒基质的饱和磁化 度，合成了相同大小(15nm)的含有不同类型金属添加剂(Ni、Co、 Mn或Zn)的铁氧化物纳米颗粒并用MPMS超导量子干涉装置 (SQUID)磁量计测量饱和磁化度(Ms)。通过韩国专利No.10-0604975、 10-0652251和10-0713745，PCT/KR2004/002509，韩国专利No. 10-0604975；PCT/KR2004/003088；PCT/KR2007/001001以及韩国专利 申请No.2006-0018921中所公开的方法制备了含有铁氧化物和Ni、Co 以及Mn的铁氧化物纳米颗粒，并根据实施例1制备了含锌金属氧化物 纳米颗粒。结果如图4中所示，与铁氧化物纳米颗粒基质(114emu/g (磁性原子))相比较而言，含Ni和Co的纳米颗粒显示铁氧化物饱和 磁化度降低。在含锰纳米颗粒的情形下，所述饱和磁化度是125emu/g (磁性原子)，与铁氧化物纳米颗粒相比较而言稍微增加。然而，在含 锌铁氧化物纳米颗粒的情形下，Zn0.4Fe2.6O4的饱和磁化度是161emu/g (磁性原子)，Zn0.4Mn0.6Fe2O4的饱和磁化度是175emu/g(磁性原子)， 与铁氧化物基质相比较而言分别增加了47和61emu/g(磁性原子)。
已知T2MRI造影作用与饱和磁化度的平方直接相关(Koenig，S. H.et al.Magn.Reson.Med.1995，34，227-233)。因此，可预计本发明的 含锌纳米颗粒将具有显著增强的MRI造影作用。
实施例6：不含锌的金属铁氧体纳米颗粒(MFe2O4，M＝Mn、Fe、Co 或Ni)和含锌金属铁氧体纳米颗粒(Zn0.3M0.7Fe2O4，M＝Mn、Fe、Co 或Ni)的MRI作用的比较
已经证明随着纳米颗粒基质的改变，当锌被包含在不同类型的纳 米颗粒基质中时含锌金属氧化物纳米颗粒具有更好的MRI造影作用。 为了实现这一点，在实施例1至5中合成了不同类型的含锌金属氧化物 纳米颗粒(Zn0.3M0.7Fe2O4，M＝Mn、Fe、Co或Ni)，还合成了不含锌 的金属氧化物纳米颗粒(MFe2O4，M＝Mn、Fe、Co或Ni)，还相互比 较了所述金属氧化物纳米颗粒的T2自旋回波MRI造影作用。如图5A 和5B中所示，所得的纳米颗粒为球形并且具有15nm的均一大小，所 述纳米颗粒的表面被二巯基丁二酸包覆。
为了证明所得纳米颗粒的磁共振成像的造影作用，测量了快速自 旋回波(FSE)T2MRI。为了测量，使用了配备sense-flex-M线圈的 3T系统(Achieva；Philips Medical Systems，Best，荷兰)。利用T2-FSE 序列得到磁共振成像结果。具体参数如下：分辨率256μm×256μm，切 片厚度1mm，TE＝100毫秒，TR＝4000毫秒，FOV＝10×10cm2，以及2 次激发。
如图5C所示，发现与不含锌的金属铁氧体(MFe2O4)相比较而 言，含锌金属铁氧体(Zn0.3M0.7Fe2O4)的MRI信号(黑色)增加约2 至3倍。在R2弛豫系数(根据浓度改变R2比例)(其为造影作用的一 种度量)的情形下，发现含锌锰铁氧体(Zn0.3Mn0.7Fe2O4)的弛豫系数 为45.9mM-1秒-1，其与不含锌的锰铁氧体(21.8mM-1秒-1)相比较而言 明显增加。对于Zn0.3Fe0.7Fe2O4、Zn0.3Co0.7Fe2O4和Zn0.3Ni0.7Fe2O4而言， 弛豫系数分别为37.4mM-1秒-1、34.4mM-1秒-1和18.7mM-1秒-1，与不 含锌的Fe3O4、CoFe2O4和NiFe2O4(13.6mM-1秒-1、12.4mM-1秒-1和 6.7mM-1秒-1)相比而言增加。
实施例7：ZnxM1-xFe2O4(M＝Fe或Mn，x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4和 0.8)的饱和磁化度的根据锌含量的比较
证实了锌含量对饱和磁化度和MRI造影作用的影响。为了实现这 一点，根据实施例1合成了15nm大小的ZnxM1-xFe2O4(M＝Fe或Mn， x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.8)。利用MPMS SQUID磁量计测量了3 特斯拉的饱和磁化度。
每种ZnxMn1-xFe2O4(x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.8)纳米颗粒 的饱和磁化度(Ms)分别为125、140、154、166、175和137emu/g(磁 性原子)，同样，每种ZnxFe3-xO4(x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.8)的 饱和磁化度(Ms)分别为114、126、140、152、161和115emu/g Zn0.4Fe2.6O4 (磁性原子)。
两种纳米颗粒均显示出在x＝0.4时具有最大的Ms，Zn0.4Fe2.6O4 为161emu/g(磁性原子)，Zn0.4Mn0.6Fe2O4为175emu/g(磁性原子)， 这是迄今所发现的任何金属氧化物中最高的。
实施例8：根据锌含量比较ZnxM1-xFe2O4(M＝Fe或Mn，x＝0、0.1、 0.2、0.3、0.4和0.8)的R2 MR弛豫度
在实施例7中已经证实了改变ZnxM1-xFe2O4的饱和磁化度是否可 增强MRI造影作用。为了实现这一点，利用配备sense-flex-M线圈的 3T MRI系统(Achieva；Philips Medical Systems，Best，荷兰)测量 ZnxM1-xFe2O4(M＝Fe或Mn，x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.8)的MRI 造影作用。利用FSE序列得到磁共振成像结果。具体参数如下：分辨 率256μm×256μm，切片厚度1mm，TE＝100毫秒，TR＝400毫秒， FOV＝10×10cm2，以及2次激发。
如图7A所示，ZnxMn1-xFe2O4和ZnxFe3-xO4的纳米颗粒均显示随 锌含量增加T2MRI信号变成深色(在彩色图片7B中变成蓝色)。已经 证实在相同浓度下(基于金属原子)，ZnxMn1-xFe2O4(x＝0、0.1、0.2、 0.3、0.4和0.8)的R2分别为0.0025、0.0034、0.0041、0.0046、0.0052、 0.0036毫秒-1。以相同方式，ZnxM3-xO4(x＝0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.8) 的R2分别为0.0012、0.0024、0.0031、0.0038、0.0045、0.0016毫秒-1 (图7C)。具体而言，当x＝0.4时，两种纳米颗粒的R2分别为0.0052 和0.0045毫秒-1；与常用的铁氧化物纳米颗粒造影剂Feridex(0.0015 毫秒-1)和CLIO(0.0008毫秒-1)相比较而言，Zn0.4Mn0.6Fe2O4纳米颗 粒的造影作用更强，分别为Feridex和CLIO的约350％和650％；在 Zn0.4Fe2.6O4的情形下，造影作用分别为Feridex和CLIO的约300％和 560％。
实施例9：在水溶液中合成ZnxFe3-xO4(x＝0.2和0.4)组成的含锌铁氧 体纳米颗粒
本发明的包含含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI造影剂并非单单 通过上述相转变法制备的，而是还可通过下述方法制备：
为了在水溶液中合成式ZnxFe3-xO4(x＝0.2和0.4)的含锌铁氧化 物纳米颗粒，将纳米颗粒的前体Zn(acac)2·2H2O 20mg、FeCl2·4H2O 60 mg和FeCl3·6H2O 240mg溶解在10ml水中，然后加入1ml 3.2M NH4OH 溶液，强力搅拌20分钟以得到Zn0.2Fe2.8O4纳米颗粒。为了得到 Zn0.4Fe2.6O4纳米颗粒，在相同条件下使用前体Zn(acac)2·2H2O、 FeCl2·4H2O各40mg。
图8显示了根据上述方法(图8A和8B)合成的ZnxFe3-xO4(x＝0.2 和0.4)纳米颗粒的电子显微镜照片和通过EDAX进行的锌含量分析(图 8C和8D)。证实了可根据上述方法制备含锌纳米颗粒并可控制锌含量。 所合成的纳米颗粒不具有固定的形状，大小为约15nm。
实施例10：含锌铁氧体纳米颗粒的EXAFS分析
为了了解锌在本发明含锌铁氧体纳米颗粒的铁氧体基质中的分 布，测量了EXAFS。图9A至9D显示根据实施例1制备的ZnxFe3-xO4 (x＝0.1、0.2、0.3、0.4)纳米颗粒的锌K边的(Zn K-edged)EXAFS 谱和铁K边的(Fe K-edged)EXAFS谱。在锌K边EXAFS谱中，3.1 埃和6.2埃的峰显示锌分别存在于基质的四面体孔洞(Td)和八面体孔 洞(Oh)中。3.1埃的峰是强峰并且当锌含量比(x)增加时其选择性增 强这一事实表明锌选择性地分布在四面体间隙空洞中。这样的结果是在 有机溶剂中制备纳米颗粒时的突出现象，表明这种制备方法能够比在水 溶液中的制备方法更有效地引入锌。
实施例11：利用BSA(牛血清白蛋白)包覆的含锌金属氧化物纳米颗 粒MRI造影剂的合成
将在实施例1～4中合成并以50mg/ml的浓度分散在1ml甲苯中 的含锌金属氧化物纳米颗粒利用过量的乙醇进行沉淀，并重新分散在 5ml 1M TMAOH溶液中。然后，加入200mg BSA并溶解，在室温下 反应24小时。随后，利用Sephacryl S-500柱(GE Healthcare，USA) 分离反应溶液以除去未与纳米颗粒反应的过量BSA并分离出纳米颗粒。 通过Centricon YM100过滤器(Millipore，USA)将所分离的纳米颗粒 浓缩至5ml。
实施例12：利用羰基葡聚糖包覆的含锌金属氧化物纳米颗粒MRI造影 剂的合成
将200mg羰基葡聚糖添加到5ml根据实施例11的相同方法合成 的TMAOH包覆的纳米颗粒中，然后分散在其中，在室温下进行反应 24小时。随后，利用Sephacryl S-500柱来分离反应溶液以除去未与纳 米颗粒反应的过量羰基葡聚糖并分离出纳米颗粒。通过Centricon YM100过滤器将所分离的纳米颗粒浓缩至5ml。
实施例13：利用羟丙基甲基纤维素(hypromelose)包覆的含锌金属氧 化物纳米颗粒MRI造影剂的合成
将100mg羟丙基甲基纤维素添加到5ml根据实施例11的相同方 法合成的TMAOH包覆的纳米颗粒中并溶解在其中，在室温下反应24 小时。随后，利用Sephacryl S-500柱来分离反应溶液以除去未与纳米 颗粒反应的过量羟丙基甲基纤维素并分离出纳米颗粒。通过Centricon YM100过滤器将所分离的纳米颗粒浓缩至5ml。
实施例14：利用中性抗生物素蛋白包覆的含锌金属氧化物纳米颗粒 MRI造影剂的合成
将100mg中性抗生物素蛋白添加到5ml根据实施例11的相同方 法合成的纳米颗粒中并溶解在其中，在室温下进行反应24小时。随后， 利用Sephacryl S-500柱分离反应溶液以除去过量的未与纳米颗粒反应 的中性抗生物素蛋白并分离出纳米颗粒。通过Centricon YM100过滤器 将所分离的纳米颗粒浓缩至5ml。
实施例15：利用抗体(IgG)包覆的含锌金属氧化物纳米颗粒MRI造 影剂的合成
将100mg抗体添加到5ml根据实施例11的相同方法合成的纳米 颗粒中并溶解在其中，在室温下反应24小时。随后，利用Sephacryl S-500柱来分离反应溶液以除去未与纳米颗粒反应的过量抗体并分离出 纳米颗粒。通过Centricon YM100过滤器将所分离的纳米颗粒浓缩至 5ml。
实施例16：包含含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI造影剂的根据pH和 盐浓度的稳定性的分析
分析了利用多种配体包覆的包含含锌金属氧化物纳米颗粒的 MRI造影剂根据pH和盐浓度的稳定性。如图10A所示，水溶性纳米 颗粒针对浓度为200mM的NaCl是稳定的，尤其是，BSA-Zn0.4Fe2.6O4、 羰基葡聚糖-Zn0.4Fe2.6O4、羟丙基甲基纤维素-Zn0.4Fe2.6O4、中性抗生物 素蛋白-Zn0.4Fe2.6O4以及抗体(IgG)-Zn0.4Fe2.6O4纳米颗粒在浓度为1M 或更高的NaCl中是稳定的。
此外，如图10B所示，所有水溶性纳米颗粒在pH 7～9范围内均 是稳定的，尤其是，BSA-Zn0.4Fe2.6O4和羰基葡聚糖-Zn0.4Fe2.6O4纳米颗 粒在pH 1～11范围内是稳定的。
实施例17：利用包含具有Zn0.4Fe2.6O4的含锌金属氧化物的MRI造影剂 对小鼠肝脏造影
为了证明包含含锌金属氧化物的MRI造影剂的体内MRI造影作 用，将在实施例11中合成的利用BSA包覆的Zn0.4Fe2.6O4纳米颗粒以2 mg/ml的浓度和8mg/kg的剂量通过尾静脉注射给Balb/c小鼠(n＝4)。 在注射纳米颗粒之前和之后每10分钟测量MRI。与此相关联，测量T2 信号强度以证明纳米颗粒的肝脏造影作用。
为了测量MRI，使用配备sense-flex-M线圈的3T系统(Achieva； Philips Medical Systems，Best，荷兰)。利用FSE序列得到磁共振成像 结果。
具体参数如下：分辨率：256μm×256μm，切片厚度1mm，TE＝100 毫秒，TR＝4000毫秒，FOV＝10×10cm2，以及2次激发。
如图11所示，发现注射纳米颗粒之后，肝脏的T2磁共振图像信 号降低至使肝脏变暗。一般而言，将25mg/kg剂量的铁氧化物造影剂 用于小鼠试验。作为比较，在本发明公开的包含含锌金属氧化物的MRI 造影剂的情形下，即使在8mg/kg的剂量(其为常用剂量水平的约1/3) 下仍获得了有效的肝脏造影作用。
实施例18：“含锌金属氧化物纳米颗粒(Zn0.4Mn0.6Fe2O4)-生物/化学活性 物质(赫赛汀(herceptin))”杂化纳米颗粒的合成
图12显示了纳米杂化物的示意性制备方法。将100μl赫赛汀[(10 mg/ml在10mM磷酸缓冲溶液中，pH7.2)，Genentech，Inc.，South San Francisco，CA，USA]置于eppendorf管中，向其中加入硫代-SMCC[(N- 马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸3-硫代-N-羟基-琥珀酰亚胺酯，Pierce] 并在室温下反应30分钟，以使马来酰亚胺基取代赫赛汀的赖氨酸基。 使其中赖氨酸基被马来酰亚胺基取代的赫赛汀与含有200μl二巯基丁 二酸包覆的Zn0.4Mn0.6Fe2O4在室温下反应4小时，以制备含锌的锰铁氧 体-赫赛汀纳米杂化颗粒。通过琼脂糖电泳分析所制备的纳米杂化颗粒。 由考马斯亮蓝蛋白质染色结果可见产生了纳米杂化物(图12C，泳道2)。
实施例19：“含锌金属氧化物纳米颗粒(Zn0.4Mn0.6Fe2O4)-生物/化学活性 物质(中性抗生物素蛋白)”杂化纳米颗粒的合成
在将100μl中性抗生物素蛋白[(10mg/ml在10mM磷酸缓冲液 中，pH 7.2)，Sigma]置于eppendorf管中后，向其中加入硫代-SMCC， 在室温下反应30分钟以使马来酰亚胺基取代中性抗生物素蛋白的赖氨 酸基。使马来酰亚胺基取代的中性抗生物素蛋白与含有200μl二巯基丁 二酸包覆的Zn0.4Mn0.6Fe2O4在室温下反应4小时以制备锌锰铁氧体-中 性抗生物素蛋白纳米杂化颗粒。通过琼脂糖电泳分析所制备的纳米杂化 颗粒。由考马斯亮蓝蛋白质染色结果可见产生了纳米杂化物(图12C， 泳道3)。
实施例20：包含含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI造影剂的细胞毒性的 比较
评价了包含含锌金属氧化物纳米颗粒的MRI造影剂的细胞毒性。 利用不同浓度的15nm大小的二巯基丁二酸处理的Zn0.4Fe2.6O4来处理 2×105HeLa细胞。24小时后，通过台盼蓝法测量细胞活力。如图13A 所示，在Zn0.4Fe2.6O4浓度高达100μg/ml时细胞活力维持在几乎100％ 的活力，表明所述纳米颗粒是生物相容性的。此外，如图13B所示，在 100μg/ml的浓度下，铁氧体和锰铁氧体纳米颗粒显示相似的细胞活力。 当考虑铁氧体已被美国FDA批准用于人用这一事实时，含锌纳米颗粒 具有生物相容性的优点。
实施例21：用于光-MRI双模式诊断的纳米杂化系统
为了开发具有光学性质和磁性的诊断探针，将荧光染料(罗丹明异 氰酸酯，RITC)与利用BSA进行表面稳定化的含锌锰铁氧体纳米颗粒相 连接(图14A)。为了实现这一点，向其中加入摩尔比为存在于牛血清白蛋 白中-NH2的约20倍的过量NHS-FITC。然后，在正常温度下使其在10mM 磷酸盐缓冲液中反应2小时以合成罗丹明-锌锰铁氧体杂化纳米颗粒。结果 如图14所示，所述光-磁杂化颗粒具有荧光性(图14B)和磁共振图像信 号(图14C)。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种物理教学用流体力学演示装置 | 2020-05-13 | 73 |
| 一种流体力学教学实验装置 | 2020-05-13 | 183 |
| 具有电磁流体力学效应的发电机 | 2020-05-13 | 115 |
| 寓教于乐的流体力学教学设备 | 2020-05-12 | 308 |
| 一种基于流体力学的纱布片消毒装置 | 2020-05-12 | 9 |
| 平行流体力学减速传动 | 2020-05-11 | 440 |
| 一种生物流体力学材料分析研究系统 | 2020-05-11 | 239 |
| 一种多用途的流体力学实验装置平台 | 2020-05-12 | 981 |
| 电流体力学印刷和制造 | 2020-05-11 | 255 |
| 一种流体力学演示箱 | 2020-05-14 | 870 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈