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表面处理

阅读：675发布：2020-05-13

专利汇可以提供表面处理专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了处理表面以提供抗菌表面或微尺寸颗粒将粘附于其上的表面的方法。还公开了用于该方法的水分散性硒化物-脂质构建体和聚阳离子-脂质构建体。，下面是表面处理专利的具体信息内容。

权利要求

1.具有以下结构的聚阳离子-脂质构建体：
其中X是-CH2-并且n是整数3、4或5；R1和R2独立地选自无支链且饱和或单不饱和的C14-20酰基；R3是N1-酰化多胺。
2.根据权利要求1所述的构建体，其中R3具有以下结构：
3.具有以下结构的聚阳离子-脂质构建体：
命名为Spm-Ad-DOPE。
4.具有以下结构的硒化物-脂质构建体：
其中：
m是1、2、3或4的整数；优选整数1、2或4；最优选整数2；
n是整数3、4或5；最优选整数4；
p是整数1、2或3；最优选整数2；
q是整数1、2或3；最优选整数1；
M是一价取代基；优选一价取代基CH3或H；最优选一价取代基H；
M'是一价阳离子或取代基；优选一价阳离子H+、K+或Na+；最优选一价阳离子H+；和R1和R2独立地为脂族C14-20酰基、脂族C14-20烯基或脂族C14-20烷基取代基；优选选自下组的取代基：肉豆蔻基、棕榈基、硬脂基、二十烷基、棕榈油酰基、二十碳烯基、油酰基、反油基(elaidyl)、异油基(vaccenyl)和二十碳-11-烯酰基；最优选脂肪族C18烯基取代基油酰基。
5.一种表面处理制剂，其含有权利要求1-4中任一项所述的构建体的水分散体。
6.一种表面处理方法，其包括使表面与权利要求5所述的制剂接触的步骤。

说明书全文

表面处理

技术领域

[0001] 本发明涉及处理表面以提供有利性质例如抗微生物性质的方法，和用于这种方法的脂质构建体。具体而言，本发明涉及使用硒化物-脂质构建体和多胺-脂质构建体处理表面的方法。

背景技术

[0002] 正如Gallo等人(2014)的出版物所述，预期在医学中可植入装置的预计增加将导致与这些病例有关的感染数量自然增加。目前对适于预防感染的抗菌表面处理的知识进行了综述。表面处理模式包括最小化细菌粘附、生物膜形成抑制和杀菌作用。

[0003] Reid等人的出版物公开了包含硒(Se)化合物的杀生物制剂。硒化合物可以沉积在表面上并与其共价或非共价缔合。提议了大量的硒化合物，包括式RSeX的化合物，其中R是脂族基或酚基，x是保护基。

[0004] 阳离子脂质主要被开发用于脂质体基因递送，作为基于病毒的基因递送的替代，但也被鉴定为具有杀菌活性。常见的阳离子脂质类别包括N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基氯化铵(DOTMA)和3β[N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基]胆固醇(DC-胆固醇)。至少部分因为脂质体转染效率低，绝大多数基因处理的临床试验已经使用了替代的基因递送手段。阳离子脂质的进一步发展试图提高脂质转染的效率。

[0005] Behr等人(1989)和Remy等人(1994)的出版物公开了其中脂质是磷脂酰乙醇胺(DOPES和DPPES)的精胺-脂质缀合物。缀合是通过羧基官能化官能化的L-5-羧基精胺衍生物。该缀合物用于制备压实的包被脂多胺的质粒。包被的质粒用于转染程序。

[0006] Byk等人(1989)的出版物公开了被开发用于DNA转移的一系列阳离子脂质之间的结构-活性关系。在这些研究中评估的脂胺中，显示多胺几何形状对转染效率有影响。

[0007] Randazzo等人(2009)的出版物公开了在基因转移和杀菌活性的背景下对阳离子脂质的双重功能性的探索。被证实具有这些活性的阳离子脂质包含甾醇部分作为脂质组分。

[0008] Kato等人(2003)的出版物公开了一种使用生物相容性锚将非粘附细胞以其它方式粘附到表面的方法。

[0009] 本发明的一个目的是提供一种使用脂质构建体处理外科敷料和植入物的表面的方法，脂质构建体有效地减少术后感染的发生。本发明的一个目的是提供处理表面以有效促进微尺寸颗粒粘附到该表面的方法。本发明的一个目的是提供用于这些方法的硒和聚阳离子-脂质构建体。这些目的要与至少在选择这样的方法或构建体时提供有用的选择的目的一起阅读。

发明内容

[0010] 在第一方面，本发明提供了一种抗微生物表面处理方法，包括使物体表面与至少一种功能性脂质构建体的水分散体接触的步骤，其中所述脂质是二酰基、二烯基或二烷基甘油磷脂，构建体的功能部分赋予抗微生物活性。

[0011] 优选地，该物体是外科敷料或植入物。更优选地，该物体是外科植入物。最优选地，表面是不锈钢。

[0012] 优选地，水分散体不含去污剂和有机溶剂。更优选地，水分散体由水和至少一种功能性脂质构建体组成。

[0013] 优选地，脂质是二酰基甘油磷脂。更优选地，脂质是磷脂酰乙醇胺。最优选地，脂质是二油酰基磷脂酰乙醇胺。

[0014] 优选地，功能部分选自硒化物和聚阳离子。更优选地，功能部分选自由氰基硒化物和多胺组成的组。最优选地，功能部分是氰基硒化物或精胺。

[0015] 优选地，抗微生物表面处理是抗菌表面处理。更优选地，抗微生物表面处理是杀菌表面处理。

[0016] 优选地，接触表面是通过将物体浸泡入分散体中足够的时间以提供抗微生物表面处理。更优选地，时间少于60秒。还更优选地，时间少于30秒。最优选地，时间少于10秒。

[0017] 优选地，分散体在物体浸泡的同时进行超声波处理。

[0018] 优选地，分散体中构建体的浓度足以提供抗微生物表面处理。更优选地，浓度小于1mg/mL的构建体。

[0019] 在第一方面的第一实施方案中，本发明提供了一种抗微生物表面处理方法，该方法包括使表面与硒化物-脂质构建体的水分散体接触的步骤，其中脂质是二酰基、二烯基或二烷基甘油磷脂。优选地，脂质是二酰基甘油脂。更优选地，脂质是二酰基甘油磷脂。最优选地，脂质是磷脂酰乙醇胺。

[0020] 在第一方面的第二个实施方案中，本发明提供了处理外科植入物表面的方法，其包括使表面与聚阳离子-脂质构建体的水分散体接触的步骤，其中聚阳离子是N1-酰化多胺，并且脂质是二酰基、二烯基或二烷基甘油磷脂。优选地，脂质是二酰基甘油脂。更优选地，脂质是二酰基甘油磷脂。最优选地，脂质是磷脂酰乙醇胺。

[0021] 在第二个实施方案中，聚阳离子-脂质构建体优选具有以下结构：

[0022]

[0023] 其中M是一价阳离子，n是整数3、4或5，x是二价基团亚甲基(-CH2-)，R1和R2独立地选自C14-20饱和、单-或二-不饱和的、无支链的酰基，并且R3是N1-酰化的多胺。

[0024] 在第二方面，本发明提供了具有如下结构的硒化物-脂质构建体：

[0025]

[0026] 其中：

[0027] m是1、2、3或4的整数；优选整数1、2或4；最优选整数2；

[0028] n是整数3、4或5；最优选整数4；

[0029] p是整数1、2或3；最优选整数2；

[0030] q是整数1、2或3；最优选整数1；

[0031] M是一价取代基；优选一价取代基CH3或H；最优选一价取代基H；

[0032] M′是一价阳离子或取代基；优选一价阳离子H+、K+或Na+；最优选一价阳离子H+；和[0033] R1和R2独立地为脂族C14-20酰基、脂族C14-20烯基或脂族C14-20烷基取代基；优选选自下组的取代基：肉豆蔻基、棕榈基、硬脂基、二十烷基、棕榈油酰基、二十碳烯基、油酰基、反油基(elaidyl)、异油基(vaccenyl)和二十碳-11-烯酰基；最优选脂肪族C18烯基取代基油酰基。

[0034] 在第三方面，本发明提供了具有如下结构的聚阳离子-脂质构建体：

[0035]

[0036] 其中x是-CH2-并且n是整数3、4或5；R1和R2独立地选自下组：脂族C14-20酰基、脂族C14-20烯基或脂族C14-20烷基；R3是N1-酰化多胺。

[0037] 优选地，R1和R2独立地选自无支链和饱和或单不饱和的C14-20酰基。更优选地，R1和R2独立地选自肉豆蔻基、棕榈基、硬脂基、二十烷基、棕榈油酰基、二十碳烯基、油酰基、反油基(elaidyl)、异油基(vaccenyl)和二十碳-11-烯酰基。最优选地，R1和R2是脂肪族C18烯基取代基油酰基。

[0038] 优选地，R3具有以下结构：

[0039]

[0040]

[0041] 在第四方面，本发明提供了一种表面处理制剂，其基本上由本发明第二或第三方面的至少一种构建体在水中的分散体组成。

[0042] 在本申请的说明书和权利要求书中，以下缩略语、术语和短语具有所提供的含义：“脂环族”是指环脂族；“脂肪族”是指烷烃、烯烃或炔烃或它们的衍生物，并用作不具有芳族化合物特殊稳定性的化合物的描述；“烷烃”是指通式CnH2n+2的饱和烃。“烯烃”是指含有一个或多个碳-碳双键的不饱和烃；“炔烃”是指含有一个或多个碳-碳三键的不饱和烃；“芳族”是指含有苯环或具有类似的化学性质；“Boc”是指叔丁氧基羰基；“Boc3Spm”是指(N1，N4，N9-三叔丁氧基羰基)-1，12-二氨基-4，9-二氮杂十二烷；“包括”意指“包含”，“含有”或“特征为”，并且不排除任何另外的要素、成分或步骤；“基本上由...组成”是指排除作为材料限制的任何要素、成分或步骤；“由...组成”是指排除除杂质和其他杂质以外的没有指定的任何要素、成分或步骤；“可分散于水中”是指在不存在有机溶剂或表面活性剂的情况下可分散于25℃的纯去离子水中以提供至少1μmol/mL的浓度的分散体，并且“水分散性”具有相应含义；“DOPE”是指1，2-O-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺；“DSPE”是指1，2-O-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺；“亲水的”是指具有与水混合、溶解于水或被水润湿的倾向，并且“亲水性”具有相应的含义；“疏水的”是指具有排斥水或不能与水混合的倾向，“疏水性”具有相应的含义；“一价阳离子”是指具有单一正电荷的离子，并且包括一价阳离子H+、Na+、K+或(CH3CH2)3N+；“N1-酰化”是指酰基(RCO-)与分子最长链的末端伯胺的连接，“N1-酰化的”具有相应的含义；“多胺”是指包含三个或更多个胺官能团(包括至少两个伯氨基(-NH2)官能团)的无支链有机化合物；和“Spm”(或“spm”)是指精胺。

[0043] 参照在发明和权利要求书中限定的主题的要素、特征或整数或参考本发明的替代实施方案使用时使用的术语“第一”、“第二”、“第三”等并不意图暗示优先顺序。

[0044] 在指定试剂的浓度或比率的情况下，指定的浓度或比率是试剂的初始浓度或比率。如果数值表示为一位或多位小数位，则适用标准四舍五入。例如，1.7包含循环到1.749的范围1.650。

[0045] 在没有进一步限制的情况下，在化合物结构的表示中使用的平键包括化合物的非对映体、对映体及其混合物。在化合物的结构或子结构的表示中，二价基的重复由以下表示：

[0046]

[0047] 其中-x-是重复n次的二价基。当二价基是亚甲基(-CH2-)时，该二价基的重复由下式表示：

[0048]

[0049] 为了便于描述构建体的制备和使用，使用下列命名：

[0050] “-Ad-”表示子结构：

[0051]

[0052] 其中n是整数4；

[0053] “-CMG(m)-”表示子结构：

[0054]

[0055] 其中m是整数1、2、3或4，M是一价取代基；和

[0056] “-DOPE”表示以下结构的取代基：

[0057]

[0058]

[0059] 其中M′是一价阳离子(通常是H+)。

[0060] 现在将参照实施方案或实施例以及附图页的附图来描述本发明。

附图说明

[0061] 图1.命名为NCSeCH2CO-CMG(2)-Ad-DOPE的氰基硒化物-脂质构建体的1H NMR谱。

[0062] 图2.在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)活培养物存在下温育后未处理(A)和处理(B)的试样表面的荧光显微镜检查。

[0063] 图3.在表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermis)活培养物的存在下温育后未处理(A)和处理(B)的试样表面的荧光显微镜检查。

[0064] 图4.用暴露于未处理(A)和处理(B)的试样的金黄色葡萄球菌培养物接种后温育的血琼脂平板的照片。

[0065] 图5.用暴露于未处理(A)和处理(B)的试样的表皮葡萄球菌培养物接种后温育的血琼脂平板的照片。

[0066] 图6.未处理(A)和处理中使用命名为NCSeCH2CO-CMG(2)-Ad-DOPE的构建体的处理(B)的外科敷料的样品的扫描电子显微照片(350×)。

[0067] 图7.未处理(A)和处理中使用命名为NCSeCH2CO-CMG(2)-Ad-DOPE的构建体的处理(B)的外科敷料的样品的扫描电子显微照片(3,500×)。

[0068] 图8.用命名为NCSeCH2CO-CMG(2)-Ad-DOPE(A)的构建体、命名为HA-gar-Ad-DOPE(B)的构建体、命名为Spm-Ad-DOPE(C)的构建体处理的或未处理(D)的并在金黄色葡萄球菌存在下温育的不锈钢方块的表面的扫描电子显微照片(4,500×)。

[0069] 图9.用命名为NCSeCH2CO-CMG(2)-Ad-DOPE(A)的构建体、命名为HA-gar-Ad-DOPE(B)的构建体、命名为Spm-Ad-DOPE(C)的构建体处理的或未处理(D)的并在表皮葡萄球菌存在下温育的不锈钢方块的表面的扫描电子显微照片(4,500×)。

[0070] 图10.在Capture-RTM Ready-Id(A)、Capture-RTMReady-Screen(B)、CT-6(C)、Spm-Ad-DOPE(9a)处理并固定的(D)、Spm-Ad-DOPE(9a)处理并裂解的(E)和未处理的(F)板表面的每幅显微照片中指示的放大率的扫描电子纤维照片。

[0071] 图11.与RBC悬液接触后用PBS(A)或SucT(B)或精胺(C)中的Spm-Ad-DOPE(9a)处理的表面的显微照片(100×)。

[0072] 图12.未处理的(A)和经处理的(B)层压的尼龙网的表面在暴露于由木材燃烧器产生的微粒之后的扫描电子显微照片。

具体实施方式

[0073] 本发明的方法提供了一种由临床医生和外科医生在使用位置和时间处理外科敷料和植入物的便利的生物相容性方法。

[0074] 作为功能性部分的氰基硒化物

[0075] 命名为Mal-(CH2)2CO-CMG(2)-Ad-DOPE和H-CMG(2)-Ad-DOPE的构建体的制备公开于Bovin等人(2008)的出版物中，出于完整性的目的在此重述。丙酮、苯、氯仿、乙酸乙酯、甲醇、甲苯和邻二甲苯来自Chimmed(俄罗斯联邦)。乙腈来自Cryochrom(俄罗斯联邦)。DMSO、DMF、C3F3COOH、Et3N、N，N′-二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺来自Merck(德国)。亚氨基二乙酸二甲酯盐酸盐来自Reakhim(俄罗斯联邦)。Dowex 50X4-400和Sephadex LH-20来自Amersham Biosciences AB(瑞典)。硅胶60来自Merck(德国)。如Litherland等人(1938)所述合成四胺(H2N-CH2)4C×2H2SO4。使用硅胶60F254 铝片(Merck，1.05554)进行薄层色谱，在7％H3PO4浸泡之后通过炭化进行检测。

[0076] {[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸甲酯的制备

[0077] 向搅拌的(甲氧基羰基甲基-氨基)-乙酸甲酯盐酸盐(988mg，5mmol)的DMF(15ml)溶液中加入Boc-GlyGlyNos(3293mg，10mmol)和(CH3CH2)3N(3475μL，25mmol)。将混合物在室温下搅拌过夜，然后用邻二甲苯(70ml)稀释并蒸发。硅胶快速柱(填充甲苯，用乙酸乙酯洗脱)层析得到粗产物。将粗产物溶于氯仿中，依次用水、0.5M NaHCO3和饱和KCl洗涤。将氯仿萃取液蒸发，并将产物在硅胶柱上纯化(填充氯仿，并用15∶1(v/v)氯仿/甲醇洗脱)。蒸发馏分并在真空下干燥残余物，得到无色浓稠的糖浆。产量1785毫克，(95％)。TLC：Rf＝0.49(7∶1(v/v)氯仿/甲醇)。

[0078] 1NMR(500MHz，[D6]DMSO，30℃)δ，ppm：7.826(t，J＝5.1Hz，1H；NHCO)，6.979(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.348和4.095(s，2H；NCH2COO)，3.969(d，J＝5.1Hz，2H；COCH2NH)，3.689和3.621(s，3H；OCH3)，3.559(d，J＝5.9Hz，2H；COCH2NHCOO)，1.380(s，9H；C(CH3)3).[0079] {[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸的制备

[0080] 向搅拌的{[2-(2-叔丁氧羰基氨基-乙酰氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸甲酯(1760mg，4.69mmol)的甲醇(25ml)溶液中加入0.2M NaOH水溶液(23.5ml)，并将该溶液在室温下保持5分钟。然后将溶液用乙酸(0.6ml)酸化并蒸发至干燥。将残余物在硅胶上(填充乙酸乙酯并用2∶3∶1(v/v/v)i-PrOH/乙酸乙酯/水洗脱)进行柱层析，得到回收的{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸甲酯(63mg，3.4％)和目标化合物(1320mg)。然后将该中间产物溶解在甲醇/水/吡啶混合物(20∶10∶1，
30ml)中并通过离子交换柱(Dowex 50X4-400，吡啶形式，5ml)以除去残留的钠阳离子。然后用相同的溶剂混合物洗涤柱，蒸发洗脱剂，将残余物溶于氯仿/苯混合物(1∶1，50ml)中，然后蒸发并真空干燥。10的产量为1250mg(74％)，白色固体。TLC：Rf＝0.47(4∶3∶1(v/v/v)1-PrOH/乙酸乙酯/水)。

[0081] 1NMR(500MHz，[D6]DMSO，30℃)，N-羧甲基甘氨酸单元的顺式-和反式-构象异构体的混合物c.3：1.主要构象异构体；δ，ppm：7.717(t，J＝5Hz，1H；NHCO)，7.024(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.051(s，2H；NCH2COOCH3)，3.928(d，J＝5Hz，2H；COCH2NH)，3.786(s，2H；
NCH2COOH)，3.616(s，3H；OCH3)，3.563(d，J＝5.9Hz，2H；COCH2NHCOO)，1.381(s，9H；C(CH3)3)ppm；次要构象异构体，δ＝7.766(t，J＝5Hz，1H；NHCO)，7.015(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，
4.288(s，2H；NCH2COOCH3)，3.928(d，J＝5Hz，2H；COCH2NH)，3.858(s，2H；NCH2COOH)，3.676(s，3H；OCH3)，3.563(d，J＝5.9Hz，2H；COCH2NHCOO)，1.381(s，9H；C(CH3)3).[0082] {[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸N-氧基琥珀酰亚胺酯(Boc-Gly2(MCMGly)Nos)的制备

[0083] 向冰冷的搅拌的{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸(1200mg，3.32mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(420mg，3.65mmol)在DMF(10ml)中的溶液中加入N，N′-二环己基碳化二亚胺(754mg，3.65mmol)。将混合物在0℃下搅拌30分钟，然后在室温下搅拌2小时。滤出N，N-二环己基脲的沉淀，用DMF(5ml)洗涤，蒸发滤液至最小体积。然后将残余物用(CH3CH2)2O(50ml)搅拌1小时，倾析除去醚萃取物。将残余物真空干燥，得到白色泡沫状活性酯(1400mg，92％)。TLC∶Rf＝0.71(40∶1(v/v)丙酮/乙酸)。

[0084] 1H NMR(500MHz，[D6]DMSO，30℃)，N-羧甲基甘氨酸单元的顺式-和反式-构象异构体的混合物c.3：2。

[0085] 主要构象异构体；δ，ppm：7.896(t，J＝5.1Hz，1H；NHCO)，6.972(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.533(s，2H；NCH2COON)，4.399(s，2H；NCH2COOCH3)，3.997(d，J＝5.1Hz，2H；
COCH2NH)，3.695(s，3H；OCH3)，3.566(d，J＝5.9Hz，2H；COCH2NHCOO)，1.380(s，9H；C(CH3)3)。

[0086] 次要构象异构体；δ，ppm：7.882(t，J＝5.1Hz，1H；NHCO)，6.963(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.924(s，2H；NCH2COON)，4.133(s，2H；NCH2COOCH3)，4.034(d，J＝5.1Hz，2H；
COCH2NH)，3.632(s，3H；OCH3)，3.572(d，J＝5.9Hz，2H；COCH2NHCOO)，1.380(s，9H；C(CH3)3)。

[0087] 将活性酯(1380mg)溶于DMSO中以提供6ml的体积并用作0.5M溶液(储存于-18℃)。

[0088] {[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸甲酯的制备

[0089] 向搅拌的(甲氧基羰基甲基-氨基)-乙酸甲酯盐酸盐(988mg，5mmol)的DMF(15ml)溶液中加入Boc-GlyGlyNos(3293mg，10mmol)和Et3N(3475μl，25mmol)。将混合物在室温(r.t.)下搅拌过夜，然后用邻二甲苯(70ml)稀释并蒸发。硅胶快速柱(填充甲苯，用乙酸乙酯洗脱)层析得到粗产物。将粗产物溶于氯仿中，依次用水、0.5M NaHCO3和饱和KCl洗涤。蒸发氯仿萃取液，产物用硅胶柱(填充氯仿用氯仿/甲醇15∶1洗脱)纯化。蒸发馏分并真空干燥残余物，得到(3)(1785mg，95％)的无色稠浆。TLC∶Rf＝0.49(氯仿/甲醇7∶1)。

[0090] 1H NMR(500MHz，[D6]DMSO，30℃)δ＝7.826(t，J＝5.1Hz，1H；NHCO)，6.979(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.348和4.095(s，2H；NCH2COO)，3.969(d，J＝5.1Hz，2H；COCH2NH)，3.689和3.621(s，3H；OCH3)，3.559(d，J＝5.9Hz，2H；COCH2NHCOO)，1.380(s，9H；CMe3)ppm。

[0091] {[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰氨基)-乙酰基]-乙氧基羰基甲基-氨基}-乙酸的制备

[0092] 向搅拌的{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸甲酯(1760mg，4.69mmol)的甲醇(25ml)溶液中加入0.2M NaOH水溶液(23.5ml)。溶液在室温下保持5分钟，然后用乙酸(0.6ml)酸化并蒸发至干。将残余物在硅胶上(填充在乙酸乙酯中并用iPrOH/乙酸乙酯/水(2∶3∶1)洗脱)进行柱色谱得到回收的(3)(63mg，3.4％)和粗目标化合物(1320mg)。将粗目标化合物溶解于甲醇/水/吡啶混合物(20∶10∶1，30ml)中并通过离子交换柱(Dowex 50X4-400，吡啶形式，5ml)以除去残留的Na阳离子。用相同的混合物洗涤柱，蒸发洗脱剂，溶于氯仿/苯混合物(1∶1，50ml)中，然后蒸发并真空干燥，得到纯的(10)的产量为1250mg(74％)，白色固体。TLC∶Rf＝0.47(iPrOH/乙酸乙酯/水(4∶3∶1))。

[0093] 1H NMR(500MHz，[D6]DMSO，30℃)，N-羧甲基甘氨酸单元的顺式-和反式-构象异构体的混合物c.3：1。

[0094] 主要构象异构体：δ＝7.717(t，J＝5Hz，1H；NHCO)，7.024(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.051(s，2H；NCH2COOMe)，3.928(d，J＝5Hz，2H；COCH2NH)，3.786(s，2H；NCH2COOH)，3.616(s，
3H；OCH3)，3.563(d，J＝5.9Hz，2H；COCH2NHCOO)，1.381(s，9H；CMe3)ppm。

[0095] 次要构象异构体：δ＝7.766(t，J＝5Hz，1H；NHCO)，7.015(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.288(s，2H；NCH2COOMe)，3.928(d，J＝5Hz，2H；COCH2NH)，3.858(s，2H；NCH2COOH)，3.676(s，
3H；OCH3)，3.563(d，J＝5.9Hz，2H；COCH2NHCOO)，1.381(s，9H；CMe3)ppm。

[0096] {[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸N-氧基琥珀酰亚胺酯Boc-Gly2(MCMGly)Nos的制备

[0097] 向冰冷的搅拌的{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸(1200mg，3.32mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(420mg，3.65mmol)在DMF(10ml)中的溶液中加入N，N′-二环己基碳化二亚胺(754mg，3.65mmol)。混合物在0℃搅拌30分钟，然后在室温搅拌2小时。将N，N′-二环己基脲的沉淀滤出，用DMF(5ml)洗涤并将滤液蒸发至最小体积。将残余物用Et2O(50ml)搅拌1小时。倾析除去醚萃取物，真空干燥残余物，得到白色泡沫状目标化合物(1400mg，92％)。TLC∶Rf＝0.71(丙酮/乙酸40∶1)。

[0098] 1H NMR(500MHz，[D6]DMSO，30℃)，N-羧甲基甘氨酸单元的顺式-和反式-构象异构体的混合物c.3：2。

[0099] 主要构象异构体：δ＝7.896(t，J＝5.1Hz，1H；NHCO)，6.972(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.533(s，2H；NCH2COON)，4.399(s，2H；NCH2COOMe)，3.997(d，J＝5.1Hz，2H；
COCH2NH)，3.695(s，3H；OCH3)，3.566(d，J＝5.9Hz，2H；COCH2NHCOO)，1.380(s，9H；CMe3)ppm。

[0100] 次要构象异构体：δ＝7.882(t，J＝5.1Hz，1H；NHCO)，6.963(t，J＝5.9Hz，1H；NHCOO)，4.924(s，2H；NCH2COON)，4.133(s，2H；NCH2COOMe)，4.034(d，J＝5.1Hz，2H；
COCH2NH)，3.632(s，3H；OCH3)，3.572(d，J＝5.9Hz，2H；COCH2NHCOO)，1.380(s，9H；CMe3)ppm。

[0101] 命名为Mal-(CH2)2CO-CMG(2)-Ad-DOPE和H-CMG(2)-Ad-DOPE的构建体的制备[0102] 据Bovin等人(2008)的出版物的方案III，由{[2-(2-叔丁氧基羰基氨基-乙酰氨基)-乙酰基]-甲氧基羰基甲基-氨基}-乙酸N-氧基琥珀酰亚胺酯Boc-Gly2(MCMG1y)制备命名为H-CMG(2)-Ad-DOPE的构建体。根据Bovin等人(2008)的出版物的方案IV的第一步制备命名为Mal-(CH2)2CO-CMG(2)-Ad-DOPE的构建体。简而言之，命名为H-CMG(2)-Ad-DOPE的构建体用5倍过量的3-马来酰亚胺基丙酸氧基苯并三唑酯在i-PrOH-水中处理。在Sephadex LH-20(i-PrOH-水，1∶2)上进行凝胶渗透色谱法后，以40％收率分离马来酰亚胺-脂质构建体。

[0103]

[0104]

[0105]

[0106] NCSeCH2CO-CMG(2)-Ad-DOPE的制备

[0107] 通过命名为Mal-(CH2)2CO-CMG(2)-Ad-DOPE马来酰亚胺-脂质构建体和硒代亚硫酸钾(K2Se8O3)[方案A]、硒酚(PhSeH)[方案B]和硒化氢(H2Se)[方案C]之间的加成反应来制备氰基硒化物-脂质构建体的尝试未获成功。事后看来，根据方案A未能获得稳定的硒-本特(seleno-Bunte)盐，至少部分可以通过在Distler(1967)的出版物中公开的它们的硫类似物化学行为来预测。分别根据方案B和方案C在质子介质中尝试的苯基硒化物和硒化氢的Michael加成均产生具有减少的马来酰亚胺双键的产品，与期望的硒基琥珀酰亚胺相反。定量产率的硒基琥珀酰亚胺的形成已经在Numeo等人(1981)的出版物中公开。然而，所公开的无水乙醚的使用与命名为Mal-(CH2)2CO-CMG(2)-Ad-DOPE的聚阴离子马来酰亚胺-脂质构建体的使用是不相容的。

[0108] 随后发现命名为NCSeCH2CO-CMG(2)-Ad-DOPE的氰基硒化物-脂质构建体可以通过活化的2-硒代氰基乙酸(NC-Se-CH2COOH)成功制备。根据方案D(a)或方案D(b)，活化的NC-Se-CH2COOH与脂质构建体H-CMG(2)-Ad-DOPE反应。将制备的构建体在惰性气氛下避光保存。选择硒氰酸钾作为选择的试剂，因为它容易根据方案D(a)或(b)活化为N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯或根据方案D(c)活化为混合酸酐。根据Klauss(1970)的出版物中公开的方法，由新鲜制备的硒氰酸钾(KSeCN)和溴乙酸钾(BrCH2COOK)的溶液合成硒代氰基乙酸钾(NCSeCH2COOK)。活化前将合成的NCSeCH2COOK在黑暗中储存在真空干燥器的氢氧化钾(KOH)小球上。为了活化，将硒代氰基乙酸钾(156mg，0.77mmol)一次性加入N，N，N′，N′-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)六氟磷酸铀(HSTU)(IRIS，德国)(212毫克，0.59毫摩尔)的1毫升DMF的溶液中，同时经由PTFE毛细管鼓泡通过轻微流动的干燥氩气。如此获得的浆料以这种方式搅拌30分钟，在此期间初始固体变成更致密的结晶沉淀物(KPF6)。超声处理反应混合物1至2分钟，并与溶于1mL 20％IPA接着溶于100μL 1N KHCO3中的命名为H-CMG(2)-Ad-DOPE(110mg，0.06mmol)的构建体合并。立即沉淀的粘性固体(推测为NCSeCH2COOSu)通过超声处理滴加30％IPA(约1.6mL)溶解，并将反应混合物在室温下磁力搅拌3小时，保持pH为8.0-
8.5(TLC对照：溶剂在真空下蒸发，干燥的残余物用3mL乙腈研磨，超声处理，直至形成细浆，然后转移到Eppendorf管(2×2.2mL)中，离心，固体用纯净的IPA和MeCN连续洗涤4次(每次
2mL，短暂超声处理然后离心)。将湿固体溶于3.5mL 30％IPA-水中并冻干至恒重，获得
111mg(92％)命名为NCSeCH2CO-CMG(2)-Ad-DOPE的氰基硒化物-脂质构建体，其为红色无定形粉末。Rf～0.5，CHCl3/甲醇/水2∶6∶1(v/v)；TLC铝片硅胶60F254(Merck 1.05554)。值得注意的是，质谱并未出现适用于该构建体的表征。只可以检测到无Se碎片的峰。在图1中提供了针对构建体确定的1H NMR谱。

[0109] 作为功能部分的阳离子

[0110] 制备聚阳离子脂质构建体9a并作为其三氟乙酸(TFA)盐分离(方案E)。简而言之，根据Geall和Blagbrough(2000)的出版物中公开的方法的修改版本，使用Boc作为保护基，进行多胺精胺[CAS#71-44-3](2)的去对称作用。这将认识到该方法也适用于其他非支化多胺如亚精胺[CAS#124-20-9](1)、四亚乙基五胺[CAS#112-57-2](3)、五亚乙基六胺[CAS#4067-16-7](4)和六亚乙基七胺[4403-32-1](5)的去对称。因此，根据方案E可以获得一系列的聚阳离子脂质构建体。

[0111] 根据方案E，使用同双功能交联剂二琥珀酰亚胺基己二酸酯将Boc保护的、去对称化的中间体N1，N4，N9-三-叔丁氧基羰基)-1，12-二氨基-4，9-二氮杂十二烷(6)与二酰基甘油磷脂1，2-O-二油酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰基乙醇胺[CAS#4004-05-1](DOPE)缀合。应认识到其他二琥珀酰亚胺化合物可以用作同双功能交联剂。这些包括：活化的脂质(7a)酰化N1，N4，N9-三叔丁氧基羰基)-1，12-二氨基-4，9-二氮杂十二烷(6)的末端伯氨基，以提供脂化的、Boc保护的多胺中间体(8a)。再者，将会认识到，根据方案I，其他例如1，2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷脂酰乙醇胺[CAS#](DSPE)的二酰基甘油磷脂可代替DOPE。

[0112] 在方案A的最后一步中，对脂化的多胺中间体(8a)脱保护，并分离出作为其三氟乙酸盐的聚阳离子脂质构建体(9a)。

[0113] 材料和方法

[0114] 氯仿，二氯乙烷，二氯甲烷，甲醇和甲苯从Chimmed(俄罗斯联邦)获得。三氟乙酸，三乙胺，二叔丁基二碳酸三氟乙酸甲酯从Merck(Germany)获得。精胺获自Sigma-Aldrich(USA)。Sephadex LH-20获自Amersham Biosciences AB(瑞典)。硅胶60得自Merck(德国)。在硅胶60F254板(Merck)上进行薄层色谱(TLC)分析。使用茚三酮试剂检测含氨基的化合物。
使用高锰酸钾(KMnO4)的水溶液或通过在8％(w/v)磷酸水溶液中浸泡然后在200℃以上加热来检测含DOPE的化合物。使用溶剂的残留质子的信号作为参考([D]CHCl3，7.270ppm；[D2]H2O，4.750ppm)，使用Bruker BioSpin GmbH 700MHz仪器在30℃下记录1H NMR谱。用Agilent ESI-TOF 6224LC/MS光谱仪记录质谱。

[0115] Boc3Spm(6)的制备

[0116] 在-80℃下，在氮气下，向精胺(2)(1当量，1.34g，6.6mmol)在甲醇(90mL)中的搅拌溶液中经30分钟滴加三氟乙酸甲酯(1.1当量，0.730mL，7.26mmol)的甲醇(1.5mL)溶液。在-80℃继续搅拌30分钟，然后升温至0℃。该反应主要提供单-三氟乙酰胺。在不分离的情况下，剩余的氨基官能团通过在3分钟内逐滴加入过量的二碳酸二叔丁酯(4当量，5.76g，
26.4mmol)的甲醇溶液进行定量保护。然后将反应温热至25℃并再搅拌15小时，得到完全保护的精胺(Rf＝0.33(95∶5(v/v)CHCl3-i-PrOH))。然后通过用浓氨水(浓NH3水溶液)将溶液的pH增加至大于11个pH单位原位除去三氟乙酸酯保护基，然后在25℃下搅拌15小时。将溶液真空浓缩并将残余物经硅胶(95∶5∶1至90∶10∶1(v/v/v)CHCl3-MeOH-浓NH3水溶液)纯化，得到标题化合物(6)为无色均匀油(1.5g，45％)，Rf0.32(83∶16∶1(v/v/v)CHCl3-MeOH-浓NH3水溶液)。MS，m/z：实测值502.3725(M++1)，C25H50N4O6要求M+501.3652。

[0117] 1H-NMR(700MHz，CDCl3，303°K)，δ，ppm：3.4(m，2H，1-CH2)，3.05-3.30(m，8H，3，4，7，8-CH2)，3.01(m，2H，10-CH2)，2.03(m，2H，9-CH2)，1.67(m，2H，2-CH2)，1.50(m，4H，5，6-CH2)，
1.44，1.45，1.46(3s，重叠，27H，3O-C(CH3)3)。

[0118] SuO-Ad-DOPE(7a)和SuO-Ad-DSPE(7b)的制备

[0119] 向己二酸二琥珀酰亚胺酯(70mg，205umol)的干燥N，N-二甲基甲酰胺(1.5ml)溶液中加入DOPE或DSPE(40μl)的氯仿(1.5ml)溶液，然后加入三乙胺(7μl)。混合物在室温下保持2小时，然后用乙酸中和，并部分真空浓缩。残余物经柱色谱法(Sephadex LH-20，1∶1(v/v)氯仿-甲醇，0.2％(w/v)乙酸水溶液)得到SuO-Ad-DOPE(7a)(37mg，95％)作为无色糖浆。TLC(6∶3∶0.5(v/v/v)氯仿-甲醇-水)Rf0.5(SuO-Ad-DOPE(7a))和Rf0.55(SuO-Ad-DOPE(7b))。

[0120] 1H NMR(2∶1(v/v)CDCl3/CD3OD)δ：SuO-Ad-DOPE(7a)-5.5(m，4H，2×(-CH＝CH-)，5.39(m，1H，-OCH2-CHO-CH2O-)，4.58(dd，1H，J＝3.67，J＝11.98，-CCOOHCH-CHO-CH2O-)，
4.34(dd，1H，J＝6.61，J＝11.98，-CCOOHCH-CHO-CH2O-)，4.26(m，2H，PO-CH2-CH2-NH2)，4.18(m，2H，-CH2-OP)，3，62(m，2H，PO-CH2-CH2-NH2)，3.00(s，4H，ONSuc)，2.8(m，2H，-CH2-CO(Ad)，
2.50(m，4H，2×(-CH2-CO)，2.42(m，2H，-CH2-CO(Ad)，2.17(m，8H，2×(-CH2-CH＝CH-CH2-)，
1.93(m，4H，COCH2CH2CH2CH2CO)，1.78(m，4H，2×(COCH2CH2-)，1，43，1.47(2bs，40H，20CH2)，
1.04(m，6H，2CH3)。

[0121] SuO-Ad-DSPE(7b)-5.39(m，1H，-OCH2-CHO-CH2O-)，4.53(dd，1H，J＝3.42，J＝11.98，-CCOOHCH-CHO-CH2O-)，4.33(dd，1H，J＝6.87，J＝11.98，-CCOOHCH-CHO-CH2O-)，4.23(m，2H，PO-CH2-CH2-NH2)，4.15(m，2H，-CH2-OP)，3，61(m，2H，PO-CH2-CH2-NH2)，3.00(s，4H，ONSuc)，2.81(m，2H，-CH2-CO(Ad)，2.48(m，4H，2×(-CH2-CO)，2.42(m，2H，-CH2-CO(Ad)，1.93(m，4H，COCH2CH2CH2CH2CO)，1.78(m，4H，2×(COCH2CH2-)，1，43，1.47(2bs，40H，20CH2)，1.04(m，6H，2CH3)。Boc3Spm-Ad-DOPE(8a)的制备

[0122] 向搅拌的BoC3Spm(6)(552mg，1.1mmol)的二氯乙烷(25ml)溶液中加入三甲胺(1ml，7.2mmol)，随后加入SuO-Ad-DOPE(1066mg，1.1mmol)的二氯乙烷(25ml)溶液。将反应混合物搅拌2小时，然后在37℃减压下除去溶剂。粗产物经硅胶层析纯化，用97∶3至85∶15(v/v)的CHCl3-MeOH洗脱，得到标题化合物(8a)(1.16g，78％)，为粘稠油状物。TLC(10∶6∶0.8(v/v/v)CH2Cl2-EtOH-H2O)Rf0.36。

[0123] 1H NMR(700MHz，CDCl3/CD3OD 1∶1，10mg/mL，303°K)δ，ppm：5.34(m，4H；2CH＝CH)，5.19(m，1H；OCH2CHCH2O)，4.37(dd，Jgem～11.1Hz，1H，POCH2-CH-CHa-O(CO))，4.13(dd，J～
7.2Hz，1H，POCH2-CH-CHb-O(CO))，3.94(m，4H)，3.48(m，2H)，3.05-3.30(m，12H，1，3，4，7，8，
10-CH2)，2.71(m，2H)，2.20-2.42(m，8H)，1.98-2.04(m，8H)，1.64(m，8H，)，1.58(m，4H)，
1.49(m，4H，5，6-CH2)，1.44，1.45，1.46(3s，27H，3O-C(CH3)3)，1.22-1.37(m，40H，20CH2)，
0.88和0.89(2d，J≈7Hz，6H，2CH3)。

[0124] Spm-Ad-DOPE(9a)的制备

[0125] 在25℃下，向搅拌的8a(1.16g，0.85mmol)的CHCl3(10ml)溶液中加入TFA(5ml，95％)。20分钟后，将溶液在35℃下真空浓缩，并将残余物与甲苯(5次，10mL)共蒸发以除去痕量的TFA。为除去任何低分子量杂质，将残余物溶解于1∶1(v/v)CHCl3-MeOH(2mL)中并分两批通过Sephadex LH-20柱(体积330mL，洗脱液1∶1(v/v)CHCl3-MeOH)。将含有纯9a(二-TFA盐)的级分合并并蒸发至干，将残余物溶于水(～100mL)中并冷冻干燥。产量为975mg(89％)。MS，m/z：实测值1056.8063(M++1)，C57H110N5O10P要求值M+1055.779.。

[0126] 1H NMR(700MHz，1∶1(v/v)CDCl3-CD3OD，10mg/mL，303°K)δ，ppm：5.51(m，4H；2CH＝CH)，5.42(m，1H；OCH2CHCH2O)，4.6(dd，Jgem＝12.1Hz，J＝2.81Hz，1H，POCH2-CH-CHa-O(CO))，4.34(dd，J＝7.09Hz，1H，POCH2-CH-CHb-O(CO))，4.14(m，2H，POCH2CH2N)，4.06(m，2H，POCH2-CH-CH2)，3.59(m，2H，OCH2CH2N)，3.49(m，2H，1-CH2)，3.11-3.28(m，10H，3，4，7，8，10-CH2)，
2.42和2.51(2m，8H，4COCH2)，2.26(m，2H，2-CH2)，2.19(m，8H，2CH2CH＝CHCH2)，2.07(m，2H，
9-CH2)，1.99(m，4H，5，6-CH2)，1.79(m，8H，4COCH2CH2)，1.40-1.54(m，40H，20CH2)，1.05和
1.06(2t，J≈7Hz，6H，2CH3)。

[0127] 方案E

[0128]

[0129] 表面处理-抗微生物

[0130] 评估了命名为Spm-Ad-DOPE(9a)的聚阳离子-脂质构建体防止细菌在不锈钢表面上生长的能力。在无菌去离子水中以1mg/mL的浓度制备构建体的分散体。(注意将构建体分散在盐水中的尝试导致构建体沉淀)。将100μL体积的分散体分配到1×1cm不锈钢(SS304)方块的表面上。通过将相同体积的无菌去离子水分配到第二个不锈钢方块的表面上来制备对照。然后将两种样品(测试和对照)在60℃下干燥两小时。使用前将样品在室温下储存。体积为1毫升在21g/LMueller-Hinton肉汤(MHB)中积极生长(对数生长期)的大肠杆菌(ATCC25922)培养物被连续稀释(10-6)以提供每100μL8-10个菌落形成单位(CFU)。将不锈钢方块的单个样品放入无菌12孔培养板的每个孔中，并将100mL连续稀释的培养物分配到每个样品的表面上。允许培养物在室温下与表面接触20分钟，然后用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤每个样品一次以除去细菌的非粘附细胞。然后将每个洗涤的样品浸入10mL的MHB中并在37℃下温育过夜。过夜培养后，如前所述洗涤每个样品并浸入9mL体积的MHB中。采用交替涡旋和超声波处理从样品表面除去细菌。然后将一定体积的连续稀释(10-4)的所得肉汤铺在血琼脂平板上，37℃培养过夜并计数菌落。计算过夜培养物的细胞密度并列于表1中。

[0131]样品 CFU/mL
对照无生长
测试 3x107

[0132] 表1.在接触表面处理(测试)和未处理(对照)的1×1cm不锈钢样品后，过夜培养的大肠杆菌(ATCC25922)的生长。

[0133] 表的结果表明用命名为Spm-Ad-DOPE(9a)的聚阳离子-脂质构建体处理的样品的杀生物作用。

[0134] 评估以下构建体防止临床分离株金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌在不锈钢(SS 316)表面上生长的能力：

[0135] ·如在附随的国际申请PCT/NZ2015/050181[公布号WO 2016/072863]的说明书中描述的命名为NCSeCH2CO-CMG(2)-Ad-DOPE的构建体；

[0136] ·命名为Spm-Ad-DOPE(9a)的构建体；和

[0137] ·如在附随的国际申请PCT/NZ2006/000245[公布号WO 2007/035116]的说明书中描述的命名为HA-gar-Ad-DOPE的构建体。

[0138] 将冻存的葡萄球菌(Staphylococcus sp.)接种物在37℃融化10分钟并涡旋，然后铺在血琼脂上并在37℃下温育18小时。单菌落被用来接种10毫升体积的Mueller-Hinton肉汤(MHB)并在振荡培养箱(200rpm)中在37℃温育18小时。然后使用100μL体积的活性生长培养物接种100mL体积的MHB，并在37℃温育6.5小时。在8倍体积的9mL MHB中将混浊培养悬浮液(OD600＝1.596)连续稀释至10-8。将每个稀释步骤的100μL体积铺在平板计数琼脂(PCA)平板上，并在37℃温育18小时以确认存活细胞数量。在以下步骤中使用稀释至10-7。

[0139] 将每种构建体在水中的100μL体积的分散体分配到不锈钢方块的表面上(5次重复)；

[0140] ·2mg/mL NCSeCH2CO-CMG(2)-Ad-DOPE；

[0141] ·1mg/mL Spm-Ad-DOPE(9a)；和

[0142] ·1mg/mL HA-gar-Ad-DOPE。

[0143] 然后将不锈钢方块在60℃下干燥30分钟，并在使用前保持在室温下。然后将每个处理过的不锈钢方块置于无菌多孔板的各个孔中，并将体积为100μL的稀释至10-7的活性生长葡萄球菌分离株分配到每个孔中。然后在振荡(200rpm)下将平板在37℃温育18小时。然后从各孔中取出不锈钢方块，并以1mL体积的无菌最大回收稀释剂(MRD)洗涤3次，然后置于9mL体积的MRD中，并如前所述连续稀释至10-4。对于每个稀释步骤，将100μL的体积铺在PCA板上，使其干燥，然后在37℃温育18小时，并计数菌落。在用2.5％戊二醛(4℃过夜)固定后，用不断增加浓度的乙醇脱水，干燥并用铂溅射涂覆60秒，然后在5.0kV下4,500×放大，通过SEM检查不锈钢方块的表面。对每个样品计数十个随机选择的区域。随机选择的区域的电子显微照片在图8中提供。

[0144] 采用微量肉汤稀释法测定金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞菌临床分离株对命名为Spm-Ad-DOPE(9a)和NCSeCH2CO-CMG(2)-Ad-DOPE的构建体的易感性。如上所述制备各临床分离株的活性生长培养物以获得具有以下浊度(OD600)的培养物：

[0145] .金黄色葡萄球菌 1.371

[0146] .大肠杆菌(EscherichiaColi) 1.300

[0147] .绿脓假单胞菌 0.906

[0148] 将每种培养物连续稀释至10-6，并用作接种物。将50μL体积的每种稀释液铺在PCA平板上，并在3℃温育18小时。在无菌96孔板中制备两种构建体精胺(2)和亚硒酸(H2SeO3)中的每一种的两倍稀释系列。将50μl体积的接种物分配到含有50μl体积的连续稀释的构建体精胺(2)或亚硒酸(H2SeO3)的孔中。温和混合后，将板在黑暗中在37℃下温育18小时(200rpm)，观察最小抑菌浓度(MIC)，通过从各孔中取等份试样确定最小杀菌浓度(MBC)。观察到两种构建体相比其单独的功能部分(精胺或亚硒酸)都是更有效的抑菌剂(表2)或杀菌剂(表3)。

[0149]

[0150] 表2.通过肉汤微量稀释测定的最小抑制浓度(MIC)。

[0151]

[0152]

[0153] 表3.通过肉汤微量稀释和电镀测定的最小杀菌浓度(MBC)。

[0154] 表面处理-微尺寸颗粒(生物来源)粘附

[0155] 命名为Spm-Ad-DOPE(9a)的构建体的储备溶液以10mg/mL的浓度在甲醇中制备。储备溶液在甲醇中稀释至250μg/mL的浓度并且将25μL稀释的储备溶液分配到多孔微孔板(Corning Inc.)的各个圆底孔中。在用去离子水洗涤孔6次之前使板干燥。对照孔类似地使用单独的甲醇(空白)处理或者如在随附的国际申请PCT/NZ2008/000266[公布号WO 2009/048343])的说明书中描述的那样替换命名为生物素-CGG(2)-Ad-DOPE的构建体。

[0156] 将红细胞(RBC；O组，直至2周龄)洗涤并以1％填充细胞体积(pcv)的浓度重悬于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。将50μL体积的RBC悬液分配到每个孔中并在室温下温育1小时，然后用PBS洗涤6次。通过以2.5％(w/v)的浓度添加50μL体积的戊二醛的PBS溶液并温育10分钟，然后用水洗涤每个孔并使其干燥，来固定RBC。通过加入50μl体积的去离子水溶解RBC并温育10分钟，然后弃去水并使其干燥来裂解RBC。

[0157] 对于扫描电子显微镜成像(SEM)，从板上切下每个孔的底部，并在成像之前用铂溅射涂覆处理表面。图10中提供了根据所描述的方法和用于可商购的平板(Capture-RTM Ready-Id，Capture-RTM Ready-Screen和CT-6；ImmucoRInc.)获得的方法对处理的孔表面以增加的放大率获得的图像。

[0158] 红细胞粘附到根据所述方法处理的孔表面是清晰可见的。进行研究以确定粘附是否归因于使用单独的命名为Spm-Ad-DOPE(9a)的构建体或聚阳离子精胺(2)。以10mg/mL的浓度在甲醇中制备精胺(2)的储备溶液。精胺储备溶液在甲醇或水中稀释至0.2mg/mL的浓度。将命名为Spm-Ad-DOPE(9a)的构建体、精胺(2)的甲醇溶液或精胺水溶液的200μl体积稀释的储备溶液(大约950μM)加入到微孔板的每个第一孔中。然后进行来自每个第一孔的两倍连续稀释。然后将微孔板在真空下干燥，然后用去离子水洗涤微孔板的每个孔，浸泡并丢弃洗涤水4次。干燥后，将50μL体积的在10mM Tris/0.25M蔗糖(SucT)或PBS中浓度为1％pcv的RBC悬液分配到每个孔中。(在命名为Spm-Ad-DOPE(9a)的构建体以29μM或更高的浓度已被添加的孔中的观察到RBC聚集)。将平板在室温下温育1小时，然后用PBS洗涤孔6次。

[0159] 干燥后，倒转平板，通过光学显微镜(100×放大倍数)检查孔底部是否存在均匀的单层RBC。在图11中显示了用单独的命名为Spm-Ad-DOPE(9a)或精胺(2)的构建体的溶液处理的孔的显微照片。在用命名为Spm-Ad-DOPE(9a)的构建体在两种缓冲液(SucT或PBS)的任一种中浓度为14-237μM(0.015至0.25mg/mL)处理的孔中观察到均匀的单层细胞。当单独使用精胺(2)时，细胞的任何附着不均匀或不可重复。没有观察到细胞粘附在含有单独的精胺(2)的水中的孔中的表面上。

[0160] 微尺寸颗粒(非生物来源)粘附

[0161] 将0.05μl(w/v)溴酚蓝和50μM命名为KODE-spm的构建体在水中的100μL溶液分配并散布在层压尼龙网条的表面上。使网条在室温下干燥1小时，然后在使用人造注射器作为“喷烟器”，被暴露于从吸烟香烟或木质燃烧器释放的微粒(暴露约10分钟)。在通过扫描电子显微镜(SEM)(图12)检查之前，将暴露的网条储存在密封的聚乙烯袋中。

[0162] 尽管已经参照实施方案或示例描述了本发明，但是应该理解，可以在不偏离本发明的范围下对这些实施方案或实施例做出变化和修改。在存在特定要素、特征或整数的已知等同物的情况下，这样的等同物如同在本说明书中特别提到的那样被并入。具体而言，除非特别声明，否则包括在所引用的出版物中公开的要素、特征或整数的实施方案或实施例的变化和修改在本发明的范围内。本发明提供的和在说明书中讨论的优点可以替代地或组合地提供在本发明的这些不同的实施方案中。

[0163] 通过引用并入

[0164] 本说明书随附的申请要求通过提交澳大利亚申请号2015901844(2015年5月20日提交)和国际申请号PCT/NZ2015/050181(2015年11月3日提交)的权益。在这些申请中所附的说明书中提供的描述以及在国际申请号PCT/NZ2006/000245[公布号WO 2007/035116]和PCT/NZ2008/000266[公布号WO 2009/048343]随附的说明书中提供的那些描述，在此并入。

[0165] 工业实用性

[0166] 表面处理外科治疗物的方法在体外使用合成的水分散性聚阳离子-脂质构建体离体进行。

[0167] 出版物

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